MXPA04002142A - Oxintomodulina para prevenir o tratar el peso en exceso. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones y metodos para utilizarse en la prevencion o tratamiento del peso en exceso en un mamifero. Las composiciones comprenden oxintomodulina la cual se muestra que reduce la toma alimenticia.

Description

OXINTO ODULINA PARA PREVE NIR O TRATAR EL PESO EN EXCESO La presente invención se refiere a las composiciones y los métodos para utilizar en la pérdida de peso en animales mamíferos. Una de las enfermedades con la incidencia más alta pero que carece de tratamiento eficaz es la obesidad. Es una condición debilitante que reduce la calidad de vida y sustancialmente aumenta el riesgo de otras enfermedades. En los EUA el 25% de la población adulta ahora se considera que es clínicamente obesa. Se ha estimado que $45 billones de US de costos de cuidado de salud, u 8% por año del gasto de cuidado de salud total, es un resultado directo de obesidad. En Europa, el problema está creciendo. Se ha pronosticado que sin nuevos procedimientos más allá del 20% de la población UK será clínicamente obesa para el 2005. El hecho de que la obesidad es una enfermedad metabólica, se está reconociendo en aumento por las autoridades de la salud y profesión médica. Sin embargo, existe una escasez de fármacos seguros y eficaces que puedan utilizarse junto con la dieta y el ejercicio para el manejo a largo plazo de la obesidad. Un objeto de la presente invención es proporcionar tales fármacos y también proporcionar los medios para identificar y desarrollar más de tales fármacos. El preproglucagon es un polipéptido de 160 aminoácidos que se divide en una manera específica de tejido mediante convertasa 1 y 2 de prohormona dando aumento a un número de productos con una variedad de funciones tanto en el sistema nervioso central (SNC) como en tejidos periféricos. En el intestino y en el SNC, los productos post-translacionales principales de la división de preproglucagon son peptido 1 como glucagon (GLP-1 ), peptido 2 como glucagon (GLP-2), glicentina y oxintomodulina (OXM) según se muestra en la Figura 2. A la fecha, no se ha demostrado el papel en el SNC para OXM. Mientras que se han mostrado que GLP-1 y GLP-2 inhiben la toma alimenticia, no se ha demostrado tal papel para el peptido distinto OXM. La importancia de OXM como un peptido biológicamente activo no se ha demostrado. Sorprendentemente se ha encontrado que contrario a las expectaciones, el peptido OXM puede inhibir la toma alimenticia y reducir peso. De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona, de acuerdo a un primer aspecto, una composición que comprende OXM, para utilizarse en la prevención o tratamiento de peso en exceso en un mamífero. En este texto, el término "oxintomodulina" es el mismo que "OXM" y se refiere a cualquier composición que incluye una secuencia de peptido OXM o un análogo del mismo como sigue: Las secuencias de OXM se conocen bien y se documentan en la materia. La presente invención se refiere a todas las secuencias citadas en la presente incluyendo, en particular, la secuencia humana de OXM (la cual es la misma que la secuencia de OXM de rata, hámster y bovino), como sigue: His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn He Ala, la secuencia de OXM de alacrán marino, como sigue: His Ser Glu Gly Thr Phe Ser Asn Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Asp Arg Lys Ala Gln Glu Phe Val Arg Trp Leu Met Asn Asn Lys Arg Ser Gly Val Ala Glu, y la secuencia de OXM de anguila como sigue: His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Asn Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Glu Thr Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Ser Lys Arg Ser Gly Gly Pro Thr El término OXM utilizado en este texto también cubre cualquier análogo de la secuencia OXM anterior, en donde el residuo de histidina en la posición 1 se mantiene o se reemplaza por una porción aromática que lleva una carga positiva o un derivado de la misma, preferentemente en donde la porción es un aminoácido, más preferentemente en donde es un derivado de histidina, mientras que 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , o 22 de los otros aminoácidos en la secuencia de OXM anterior pueden reemplazarse independientemente por cualquier otro aminoácido independientemente seleccionado, con la excepción de histidina en la posición 1 . Cualquiera o más (a 22) del otro residuo de aminoácido alfa en la secuencia puede reemplazarse independientemente por cualquier otro residuo de aminoácido alfa. Preferentemente, cualquier residuo de aminoácido diferente a la histidina se reemplaza con un reemplazo conservador según se conoce bien en la materia, es decir, reemplazando un aminoácido con uno de un tipo químico similar tal como reemplazando un aminoácido hidrofóbico con otro. Según se discute anteriormente, pueden reemplazarse 1 a 22 de los aminoácidos. Además de la opción de reemplazo anterior, este puede ser mediante una forma isomérica o modificada o no esencial de un aminoácido. Por ejemplo, 1 a 22 aminoácidos pueden reemplazarse por una forma isomérica (por ejemplo, un aminoácido D), o un aminoácido modificado, por ejemplo, un no aminoácido (tal como norleucina o norvalina) o un aminoácido no esencial (tal como taurina). Además, pueden reemplazarse 1 a 22 aminoácidos por un aminoácido diferente o correspondiente unido por medio de su cadena lateral (por ejemplo, ácido glutámico unido por gamma). Para cada uno de los reemplazos anteriormente discutidos, el residuo de histidina en la posición 1 no se altera o se define anteriormente. Además, 1 , 2, 3, 4 o 5 de los residuos de aminoácido pueden removerse de la secuencia de OXM con la excepción de histidina en la posición 1 (o según se define anteriormente). Los residuos retardados pueden ser cualquiera de 2, 3, 4 o 5 residuos contiguos o residuos completamente separados. La terminal C de la secuencia de OXM puede modificarse para agregar más residuos de aminoácido u otras porciones. La OXM anterior puede proporcionarse como la sal correspondiente de la misma. Los ejemplos de sales farmacéuticamente aceptables de OXM y sus análogos incluyen aquellas derivadas de ácidos orgánicos tales como ácido metanosulfónico, ácido bencenosulfónico y ácido p-toluenosulfónico, ácidos minerales tales como ácido sulfúrico e hidroclórico y lo similar, dando metanosulfonato, bencenosulfonato, p-toluenosulfonato, hidrocloruro y sulfato, y lo similar, respectivamente o aquellos derivados de bases tales como bases inorgánicas y orgánicas. Los ejemplos de bases inorgánicas adecuadas para la formación de sales de los compuestos para esta invención incluyen los hidróxidos, carbonatos, y bicarbonatos de amonio, litio, sodio, calcio, potasio, aluminio, hierro, magnesio, zinc y lo similar. Las sales también pueden formarse con bases orgánicas adecuadas. Tales bases adecuadas para la formación de sales de adición de base farmacéuticamente aceptables con compuestos de la presente invención incluyen bases orgánicas que son no tóxicas y lo suficientemente fuertes para formar sales. Tales bases orgánicas ya se conocen bien en la materia y pueden incluir aminoácidos tales como arginina y lisina, mono-, di-, o trihidroxialquilaminas, tales como mono-, di-, y trietanolamina, colina, mono-, di-, y trialquilaminas, tales como metilamina, dimetilamina, y trimetilamina, guanidina; N-metilglucosamina; N-metilpiperazina; morfolina; etilenodiamina; N-bencilfenetilamina; tris(hidroximetil)aminometano; y lo similar.

Las sales pueden prepararse en una manera convencional utilizando los métodos bien conocidos en la materia. Las sales de adición acidas de dichos compuestos básicos pueden prepararse al disolver los compuestos de base libre en solución acuosa o de alcohol acuoso u otros solventes adecuados que contienen el ácido requerido. En donde OXM contiene una función acídica, puede prepararse una sal base de dicho compuesto al reaccionar dicho compuesto con una base adecuada. La sal base o ácida puede separarse directamente o puede obtenerse al concentrar la solución por ejemplo, por evaporación. La OXM también puede existir en formas hidratadas o solvatadas. La OXM de la presente invención puede conjugarse a uno o más grupos tales como lípido, azúcar, proteína o polipéptido. La OXM puede conjugarse al unirse al grupo (por ejemplo, por medio de un enlace iónico o covalente) o puede asociarse con el mismo. El enlace conjugado preferentemente no es a través del aminoácido de terminal N o C, cuando la OXM se une al grupo. La OXM puede conjugarse para un polímero tal como glicol de polietileno, polivinilpirrolidona, polivinilalcohol, copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno, polisacáridos tales como celulosa, derivados de celulosa, quitosan, goma acacia, goma karaya, goma guár, goma xantano, tragacanto, ácido algínico, musgo de Irlanda, agarosa y furcelaranos, dextrano, almidón, derivados de almidón, ácido hialurónico, poliésteres, poliamidas, políanhídridos, y ésteres poliorto. La OXM puede modificarse químicamente. En particular, las cadenas laterales de aminoácido, la terminal N y/o la terminal de ácido C de OXM pueden modificarse. Por ejemplo, la OXM puede superar uno o más de alquilación, formación de disulfuro, complejación de metal, acilación, esterificación, amidaeión, nitración, tratamiento con ácido, tratamiento con base, oxidación o reducción. Los métodos para llevar a cabo estos procesos se conocen bien en la materia. En particular, la OXM se proporciona como un éster de alquilo inferior, una amida de alquilo inferior, una amida de dialquilo inferior, una sal de adición ácida, una sal de carboxilato o una sal de adición álcali de la misma. En particular, las terminales carboxílicas o de amino de la OXM pueden derivarse por ejemplo, por esterificación, amidaeión, acilación, oxidación o reducción. En particular, la terminal carboxílica de la OXM puede derivarse para formar una porción amida. La OXM puede tratarse con metales, en particular, con metales divalentes. Para los propósitos de esta invención, la OXM por lo tanto, puede proporcionarse en la presencia de uno o más de los siguientes metales, zinc, calcio, magnesio, cobre, manganeso, cobalto, molibdeno o hierro. La OXM puede proporcionarse en combinación con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y/o diluyentes adecuados se conocen bien en la materia e incluyen almidón de grado farmacéutico, manitol, lactosa, estearato de magnesio, sacarina de sodio, talco, celulosa, glucosa, sucrosa, (u otro azúcar), carbonato de magnesio, gelatina, aceite, alcohol, detergentes, emulsificadores o agua (preferentemente estéril). La composición puede ser una preparación mezclada de una composición o puede ser una preparación combinada para uso secuencial, separado o simultáneo (incluyendo la administración).

La OXM puede proporcionarse como un sólido cristalino, un polvo, una solución acuosa, una suspensión o en aceite. Las composiciones de acuerdo a la invención para utilizarse en las indicaciones anteriormente mencionadas pueden administrarse mediante cualquier método conveniente, por ejemplo, mediante administración oral (incluyendo por inhalación), parenteral, mucosal (por ejemplo, bucal, sublingual, nasal), rectal, subcutánea o transdérmica y las composiciones adaptarse de acuerdo con lo anterior. Para la administración oral, la composición puede formularse como líquidos o sólidos, por ejemplo, soluciones, jarabes, suspensiones o emulsiones, tabletas, cápsulas y pastillas. Una formulación líquida generalmente consistirá de una suspensión o solución del compuesto o sal fisiológicamente aceptable en un (os) vehículo (s) líquido (s) no acuoso (s) por ejemplo, agua, etanol, glicerina, glicol de polietileno o un aceite. La formulación también puede contener un agente de suspensión, conservador, agente de coloración o saborizante. Una composición en la forma de una tableta puede prepararse utilizando cualquier (a de los) vehículo (s) farmacéutico (s) adecuado (s) rutinariamente utilizados para preparar las formulaciones sólidas. Los ejemplos de tales vehículos incluyen~estearato de magnesio, almidón, lactosa, sucrosa y celulosa microcristalina. Una composición en la forma de una cápsula puede prepararse utilizando procedimientos de encapsulación rutinaria. Por ejemplo, los polvos, gránulos o pastillas que contienen el ingrediente activo pueden prepararse utilizando vehículos estándares y después rellenarse en una cápsula de gelatina dura; alternativamente, una dispersión o suspensión puede prepararse utilizando cualquier (a de los) vehículo (s) farmacéutico (s) adecuado (s), por ejemplo, gomas acuosas, celulosa, silicatos o aceites y la dispersión o suspensión se rellena así en una cápsula de gelatina suave. Las composiciones para la administración oral pueden diseñarse para proteger el ingrediente activo contra la degradación a medida que pasa a través del tracto alimenticio, por ejemplo, por un revestimiento externo de la formulación sobre una tableta o cápsula. Las composiciones parenterales típicas consisten de una solución o suspensión del compuesto o sal fisiológicamente aceptable en un vehículo no acuoso o acuoso estéril o aceite parenteralmente aceptable, por ejemplo, glicol de polietileno, pirrolidona de polivinilo, lecitina, aceite de ajonjolí y aceite de cacahuate. Alternativamente, la solución puede liofilizarse y después reconstituirse con un solvente adecuado justo antes de la administración. Las composiciones para la administración oral o nasal pueden formularse convenientemente como aerosoles, gotas, geles y polvos. Las formulaciones de aerosol típicamente comprenden una solución o suspensión fina de la sustancia activa en un solvente no acuoso o acuoso fisiológicamente aceptable y se presentan usualmente en cantidades de múltiples dosis o únicas en forma estéril en un contenedor sellado, el cual puede tomar la forma de un cartucho o relleno para utilizarse con un dispositivo atomizador. Alternativamente, el contenedor sellado puede ser un dispositivo distribuidor unitario tal como un inhalador nasal de dosis única o un distribuidor de aerosol relleno con una válvula de medición la cual se pretende para la eliminación por única vez de los contenidos del contenedor que se han exhaustado. En donde la forma de dosis comprende un distribuidor de aerosol, contendrá un propelante farmacéuticamente aceptable. Las formas de dosis de aerosol también pueden tomar la forma de un atomizador de bomba. Las composiciones adecuadas para la administración sublingual o bucal incluyen tabletas, pildoras y pastillas, en donde el ingrediente activo se formula con un vehículo tal como azúcar y acacia, tragacanto, o gelatina y glicerina. Las composiciones para la administración vaginal o rectal se encuentran convenientemente en la forma de supositorios (que contienen una base de supositorio convencional tal como manteca de coco), pesarios, tabletas vaginales, espumas o enemas. Las composiciones adecuadas para la administración transdérmica incluyen ungüentos, geles, parches e inyecciones que incluyen inyecciones de polvo. Convenientemente, la composición se encuentra en forma de dosis de unidad tal como una tableta, cápsula o ampolleta. La OX puede utilizarse como una profilaxis para prevenir la ganancia de peso en exceso o puede utilizarse como un terapéutico para perder peso en exceso. El peso en exceso es típicamente la obesidad, a pesar de que el mamífero no se certificará como clínicamente obeso a fin de estar padeciendo de peso en exceso. La OXM puede ser en forma semi-sólida, sólida o líquida. En la sociedad de hoy en día, la prevención o tratamiento de peso en exceso en un mamífero es una verdadera necesidad. Preferentemente, el mamífero es un humano, a pesar de que también puede incluir otros animales mamíferos, tales como caballos, animales caninos (en particular, animales caninos domésticos), animales felinos (en particular, animales felinos domésticos) así como también los mamíferos que se producen para carne, tales como animales de ovino, bovino y porcino. La presente invención puede utilizarse para prevenir el peso en exceso en tales animales a fin de maximizar la producción de carne delgada. A lo largo de este texto, el término "prevención" significa cualquier efecto que mitigue cualquier exceso en peso, a cualquier grado. A lo largo de este texto, el término "tratamiento" significa la mejora del peso en exceso, a cualquier grado. De acuerdo a un segundo aspecto, la presente invención proporciona un método para la prevención o tratamiento de peso en exceso en un mamífero, el método comprendiendo administrar una composición que comprende OXM a un mamífero. El mamífero es probable que se encuentre en necesidad de la prevención o el tratamiento del peso en exceso. La pérdida de peso puede ser cosmética. La composición que comprende OXM se administrará en una concentración eficaz. Todas las características preferidas del primer aspecto de la invención, también aplican al segundo.

Un tercer aspecto de la presente invención proporciona un método para la pérdida de peso cosmética en un mamífero, el método comprendiendo administrar una composición que comprende OXM a un mamífero. En esta circunstancia, la pérdida de peso es puramente para los propósitos de apariencia cosmética. Todas las características preferidas de los aspectos, primero y segundo, también aplican al tercero. Sin ligarse a esta teoría, se entiende qué la presente invención proporciona la prevención o el tratamiento del peso en exceso mediante la administración de OXM la cual actúa como un inhibidor para la toma alimenticia al cuerpo mamífero. Tal toma alimenticia reducida da como resultado la prevención o el tratamiento del peso en exceso en un mamífero. En este texto, el término "alimento" incluye una sustancia que se ingiere y que tiene valor calorífico. Un cuarto aspecto a la presente invención proporciona el uso de OXM en la elaboración de un medicamento para la prevención o tratamiento del peso en exceso. Todas las características preferidas de los aspectos, primero y tercero, también aplican al cuarto. Los aspectos de la invención, primero, segundo y cuarto, se refieren a medicamentos, el régimen de dosis en particular para lo cual se determinará por último por el médico y se tendrá en consideración tales factores a medida que se utiliza la OXM, el tipo de animal, la edad, el peso, la severidad de los síntomas y/o la severidad del tratamiento a aplicar, el método de administración del medicamento, las contra indicaciones y/o reacción adversa. Los rangos de dosis definidos específicos pueden determinarse por ensayos clínicos diseñados estándares con el avance del paciente y monitoreándose completamente la recuperación. Tales ensayos pueden utilizar un diseño de dosis escalonada utilizando un bajo porcentaje de la dosis máxima tolerada en animales como la dosis de inicio en el hombre. El quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso de OXM para identificar un agente que inhibe la toma alimenticia en un mamífero. Este aspecto de la invención proporciona un medio para identificar y desarrollar medicamentos más adecuados para la prevención o tratamiento del peso en exceso. El uso de OXM puede incluir el uso del peptido por sí mismo o puede incluir el uso de características modelo o teóricas de OXM. Las características estructurales o funcionales de OXM utilizadas pueden ser de un peptido por sí mismo o pueden ser de un modelo generado por computadora, un modelo de dos o tres dimensiones físico o una estructura primaria, secundaria o terciaria eléctrica generada (por ejemplo, computadora generadora), así como también el farmacoforo (mapa de densidad electrónica de tres dimensiones) o su estructura de cristal de rayos X. Las características estructurales pueden permitir la identificación de agentes potenciales que pueden interactuar con OXM afectando de tal modo su función. La identificación puede ser mediante modelado de computadora y/o diseño de fármaco racional.

Las características preferidas de cada aspecto de la invención son como para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis. La presente invención ahora se describe a manera de ejemplo solamente y con referencia a las siguientes figuras, en donde: La Figura A es una representación gráfica de preproglucagon y sus partes componentes; La Figura 1 es una comparación de los efectos de los productos relacionados y derivados de proglucagon ICV e iPVN en la toma alimenticia de las ratas en ayuno. La Figura 1A ilustra la toma alimenticia acumulativa (g) hasta 8 h después de la inyección de ICV de GLP-1 , OXM, glucagon, o glicentina (todos 3 nmol) hacia los animales en ayuno. *, P<0.05 vs. control de salina. La Figura 1 B ilustra la toma alimenticia acumulativa (g) hasta 24 h después de una inyección de iPVN aguda de GLP-1 , OXM (ambos 1 nmol), o exendin-4 (0.03 nmol) hacia los animales en ayuno. *, P<0.01 vs. control de salina para todos los grupos en 1 , 2, y 4 h. *, P<0.05 vs. control de salina para exendin-4 solamente en 8 h; La Figura 2 muestra dos gráficas de los efectos de OXM ICV e ¡PVN en toma alimenticia en ratas en ayuno. La Figura 2A, la toma alimenticia acumulativa (g) hasta 8 h después de una inyección de ICV aguda de OXM (0.3, 1 , 3, o 1 0 nmol). La Figura 2B, la toma alimenticia acumulativa (g) hasta 8 h después de una inyección de iPVN aguda de OXM (0.1 , 0.3, o 1 .0 nmol) hacia animales en ayuno. *, P<0.05 vs. control de salina; La Figura 3 muestra dos gráficas de barras del efecto de OXM ICV en el comienzo de la fase obscura. Las ratas saciadas recibieron una inyección ICV de OXM, GLP-1 (3 nmol), o salina en el comienzo de la fase obscura. La toma alimenticia (gramos; A) y comportamientos (B) en la 1 h de postinyección se determinaron. *, P<0/05 vs. control de salina; La Figura 4 muestra dos gráficas de barras de la inhibición de los efectos de OXM y GLP-1 en la toma alimenticia por exendin-(9-39). La Figura 4A, ia toma alimenticia 1 h después de una inyección de ICV aguda de GLP-1 (3 nmol), GLP-1 más exendin-(9-39) (30 nmol), OXM (3 nmol), OXM y exendin-(9-39) (30 nmol), o exendin-(9-39) solo (30 nmol). La Figura 4B, la toma alimenticia después de una inyección de iPVN aguda de GLP-1 (1 nmol), GLP-1 y exendin-(9-39) (10 nmol), OXM (1 nmol), OXM y exendin-(9-39) (10 nmol), o exendin-(9-39) solo (10 nmol) hacia los animales en ayuno. **, P<0.005 vs. control de salina; La Figura 5 es una gráfica de la competencia de la unión de [i 25l] GLP-1 en las membranas hipotalámicas de rata por GLP-1 y OXM; La Figura 6 ilustra el efecto de a) OXM IP (30, 100 y 300 nmol/kg en 500 µ? de salina) o salina en la toma alimenticia acumulativa (g) en 24 horas de ratas en ayuno inyectadas durante la fase obscura temprana (cuadros cerrados = salina, círculos abiertos = OXM 30 nmol/kg, triángulos cerrados = OXM 100 nmol/kg, triángulos abiertos = OXM 300 nmol/kg); y b) OXM IP (30 y 100 nmol/kg en 500 µ? de salina) o salina en la toma alimenticia acumulativa en ratas no en ayuno inyectadas antes del comienzo de la fase obscura (cuadros cerrados = salina, círculos abiertos = OXM 30 nmol/kg, triángulos cerrados = OXM 100 nmol/kg). *P<0.05 vs. salina; La Figura 7 ilustra el efecto de inyecciones IP dos veces diarias de OXM (50 nmol/kg) o salina por siete días en a) la toma alimenticia acumulativa (g); y b) ganancia de peso corporal (g). *P<0.05, **P<0.01 , ***P<0.005 vs. salina; La Figura 8 ilustra el efecto de OXM IP (50 nmol/kg), salina o un control positivo (1 hora = GLP-1 (50 nmol/kg); 2 horas = CCK (1 5 nmol/kg)) en vaciamiento gástrico en ratas de 36 horas en ayuno. Los contenidos (peso seco) del estómago se expresaron como un porcentaje de la toma alimenticia durante el período de alimentación de 30 minutos. **P<0.01 vs. salina; La Figura 9 ilustra el efecto de dosis en aumento de OXM (0.01 - 1 .0 nmol) en 1 hora de toma alimenticia cuando se administra hacia el núcleo arqueado de 24 horas de ratas en ayuno. *P<0.05, **P<0.01 , ***P<0.05 vs. salina; La Figura 10 ilustra el efecto de la administración de iARC de exendin 9-39 (5 nmoles) o salina inyectada 15 minutos antes de la administración IP de OXM (30 nmol/kg), GLP-1 (30 nmol/kg) o salina en 1 hora de toma alimenticia (g). (S = salina, G = GLP-1 (30 nmol/kg), Ox = OXM (30 nmol/kg), Ex = exendin 9-39 (5 nmoles)); La Figura 1 1 a ilustra la expresión de la inmunoreactividad similar a fos en respuesta a A) salina IP o B) OXM IP (50 nmol/kg) en el núcleo arqueado del hipotálamo (x40 de magnitud). ***P<0.005 vs. salina; y La Figura 1 1 b ilustra la expresión de la inmunoreactividad similar a fos en respuesta a A) salina IP, B) OXM IP (50 nmol/kg) o C) CCK IP (15 nmol/kg) en el NTS y AP del tronco cerebral.

Ejemplos A - OXM origina una reducción potente en la realimentación inducida por ayuno cuando se inyectan tanto ICV como iPVN. Péptidos y Químicos GLP-1 , glicentina, glucagon, y SP-1 se adquirieron de Península Laboratories, Inc. (St. Helens, UK). La OXM se adquirió de lAF BioChem Pharma (Laval, Canadá). Exendin-4 y exend¡n-(9-39) se sintetizaron en el Consejo de Investigación Médica, Unidad de Hemostasis, Centro de Ciencias Clínico, Hospital Hammersmith, Londres, UK utilizando ia química F-moc sobre un sintetizador de péptidos de 396 MPS (Advanced ChemTech, Inc.) y se purificaron por HPLC de fase inversa sobre una columna C8 (Phenomex, Macclesfield, UK). El peso molecular correcto se confirmó por espectrometría de masa. Todos los químicos fueron compras de Merck & Co. (Lutterworth, Leicester, UK) al menos que se establezca de otra forma. Animales Las ratas Wistar macho adulto (ICSM, Hammersmith Hospital) se mantuvieron en cajas individuales bajo condiciones controladas de temperatura (21 -23°C) y luz (12 h de luz, 12 h de obscuridad) con un acceso a voluntad al alimento (dieta RM1 , Special Diet Services UK Ltd. , Witham, UK) y agua corriente. Los animales manejaron diariamente después de la recuperación de la cirugía hasta completarse los estudios. Todos los procedimientos de animales sometidos se aprobaron por British Home Office Animáis (Procedimientos Científicos) Acta 1986 (Licencia de Proyecto PIL 90/1077). Canulación ICV e ¡PVN e infusiones de los compuestos de prueba Los animales tuvieron cánulas de guía de acero inoxidable permanentes (Plastics One, Roanoke, VA) estereotacticalmente implantados ICV o ¡PVN. Todos los estudios se llevaron a cabo en la fase de luz temprana, entre 0900-1 100 h, después de un ayuno de 24 h, y la toma alimenticia se midió 1 , 2, 4, 8, y 24 h de postinyección. Protocolos de estudio de alimentación Comparación del efecto de los péptidos relacionados y productos derivados de proglucagon en la toma alimenticia. En el estudio 1 a, las ratas se inyectaron con ICV con 10 µ? de salina, GLP-1 (13 nmol), OXM (3 nmol), glucagon (3 nmol) o glicentina (3 nmol; n=8/grupo). En todos los estudios, la OXM humana con la siguiente secuencia se utilizó: His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asp Thr Lys Arg Asn Lys Asn Asn He Ala GLP-1 humano con la siguiente secuencia se utilizó: His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe lie Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg En el estudio 1 b, las ratas se inyectaron con iPVN con / de salina, GLP-1 (1 .0 nmol), OXM (1 .0 nmol), glicentina (1 .0 nmol), glucagon (1.0 nmol), o SP-1 (3.0 nmol; n = 12-15/grupo). Exendin-4, cuando se inyecta ICV, inhibe la toma alimenticia más potentemente que GLP-1 . Por lo tanto, exendin-4 se inyectó con iPVN en una dosis de 0.03 nmol. Investigación del efecto de dosis en aumento de OXM en la toma alimenticia. En el estudio 2a, las ratas se inyectaron con ICV con salina, GLP-1 (3 nmol), o OXM (0.3, 1 ,3 o 10 nmol; n=8/grupo). En el estudio 2b, las ratas se inyectaron con iPVN con salina, GLP-1 (1.0 nmol), o OXM (0.1 , 0.3, o 1 .0 nmol; n-12-15/grupo). Para valorar si la OXM actúa por medio del receptor GLP-1 , se realizó un estudio que utiliza el antagonista exendin-(9-39) de receptor GLP-1 . Alimentación a la hora de dormir y análisis de comportamiento. Estudio 3. Es posible que OXM inhiba la toma alimenticia por medio de la aversión al sabor no específico, y que no sea un factor de saciedad verdadero. Por lo tanto, a las ratas canuladas por ICV se les administró GLP-1 (3 nmol), OXM (3 nmol), o salina (n=6/grupo) al comienzo de la fase obscura. La toma alimenticia se midió a 1 h de post inyección (estudio 3a), y el comportamiento se valoró (estudio 3b). Las ratas fueron observadas por 1 h de la post inyección utilizando una hoja de registro de comportamiento. En el estudio 4a, las ratas se inyectaron con ICV con salina, GLP-1 (3 nmol), GLP-1 (3 nmol) más exendin-(9-39) (30 nmol), OXM (3 nmol), OXM (3 nmol) más exendin-(9-39) (30 nmol), o exendin-(9-39) solo (30 nmol). En el estudio 4b, las ratas se inyectaron con iPVN con salina, GLP-1 (1 nmol), GLP-1 (1 nmol) más exendin-(9-39) (1 0 nmol), OXM (1 nmol), OXM (1 nmol) más exendin-(9-39) (10 nmol), o exendin-(9-39) solo (10 nmol; n= 10-12/grupo). Ensayos de unión del receptor. Estudio 5. Los ensayos de unión del receptor se realizaron en un volumen final de 0.5 mi de membranas hipotalámicas de rata (200 µ?} de proteína), 500 Bq (1 00 pM) [125I]GLP-1 , y péptidos competidores no marcados (GLP-1 y OXM) según se especifica . Las membranas se incubaron a temperatura ambiente por 90 min . La radioactividad libre y unida se separaron por centrifugación (2 min, 4°C). Las membranas en forma de pastillas se lavaron con regulador de ensayo (0.5 mi, hielo frío) y las membranas se centrifugaron según se describe anteriormente. El sobrenadante se removió, y la radioactividad en la pastilla se contó utilizando un contador ?. La unión específica (saturable) se calculó como la diferencia entre la cantidad de [ 25I]GLP-1 unido en la ausencia (unión total) y la presencia de 1 µ?? de GLP-1 u OXM (unión no saturable). Todas las curvas se construyeron con puntos en triplicado. Los valores IC5o se calcularon utilizando el programa Prism 3 (GraphPad Software, Inc. , San Diego, CA). Estadísticas Para los análisis de toma alimenticia, los datos se presentan como el promedio + SEM. Las diferencias estadísticas entre los grupos experimentales se determinaron por ANOVA, seguido por una prueba de diferencia menos significante post-hoc (Systat 8.0, Evanston , IL). Para los análisis de comportamiento, los datos se expresan como el número promedio de casos de cada comportamiento y el rango. Las comparaciones entre los grupos se hicieron utilizando la prueba U Mann-Whitney (Systat 8.0). En todos los casos, P<0.05 se consideró estadísticamente significante. Resultados Comparación de los efectos de los péptidos relacionados y los productos derivados de proglucagon en la toma alimenticia Administración de ICV. En el estudio 1 a, OXM y GLP-1 (3 nmol) significativamente redujeron la realimentación. Esta inhibición de la toma alimenticia duró hasta 4 h de post inyección (Fig. 1A). Glucagon y glicentina (3 nmol) fallaron en afectar la toma alimenticia en cualquier punto de tiempo (Fig. 1 A). Administración de iPVN. En el estudio 1 b, OXM, GLP-1 (3 nmol) y exendin-4 (0.03 nmol) también inhibieron la realimentación cuando se inyectó iPVN. Esta inhibición duró al menos 8 h de post inyección, más que cuando se inyectó ICV (Fig. 1 B). Glicentina, glucagon (1 nmol), y SP-1 (3 nmol) fallaron en afectar la toma alimenticia en cualquier punto de tiempo cuando se inyectó iPVN. Efectos de dosis en aumento de OXM en la toma alimenticia Administración de ICV. En el estudio 2a, cuando se inyectó ICV, la OXM redujo la realimentación en una manera dependiente de dosis, alcanzando un efecto máximo a una dosis de 3 nmol, 1 , 2, y 4 h de post inyección (Fig. 2A). Administración de iPVN. En el estudio 2b, la toma alimenticia se redujo significativamente por GLP-1 inyectado por iPVN y OXM (ambos 1 nmol) hasta 8 h de post inyección (Fig. 2B). Efecto de OXM en ratas saciadas canuladas por ICV al comienzo de la fase obscura. La fase obscura es el tiempo de alimentación natural de las ratas. Por lo tanto, la valoración del efecto de un factor de saciedad putativo en animales no en ayuno en este momento podría representar un efecto más fisiológico. Efecto de OXM en la toma alimenticia. En el estudio 3a, cuando se inyecta en la fase obscura temprana, tanto GLP-1 como OXM (3 nmol) redujeron significativamente la toma alimenticia en comparación con aquella de animales tratados con salina 1 h de post inyección [Fig. 3A]. Observación del comportamiento después de la inyección de ICV de OXM. La administración de ICV de OXM (3 nmol) en la fase obscura temprana condujo a una reducción significante en episodios de alimentación (estudio 3a) y un aumento en el comportamiento de crianza (estudio 3b) [Fig. 3B]. No hubo cambio en los episodios de crianza, estables, con la cabeza hacia abajo, prospección o locomoción. Para valorar si OXM actúa por medio de GLP-1 R, se realizó un estudio que utiliza el antagonista GLP-1 R, exendin-(9-39).

Administración de ICV. Estudio 4. La coadministración de ICV del antagonista exendin-(9-39) de receptor GLP-1 con GLP-1 en una relación de 10:1 (antagonista/combatiente) bloqueó los efectos anoréxicos de GLP-1 [Fig. 4A]. Además, la coadministración de exendin-(9-39) con OXM dio como resultado la atenuación del efecto anoréxico de OXM [Fig. 4A]. Administración de iPVN. De igual forma, cuando se inyectó iPVN, los efectos anoréxicos tanto de GLP-1 como OXM se bloquearon cuando se coinyectaron con exendin-(9-39) [Fig. 4B]. Ensayos de unión del receptor. Estudio 5. La afinidad (IC5o) de GLP-1 para el receptor GLP en las preparaciones de membrana hipotalámica de rata fue 0.16 nM (Fig. 5). La afinidad de OXM para el receptor GLP-1 en las mismas preparaciones de membrana fue 8.2 nM (Fig. 5), que es aproximadamente 2 órdenes de magnitud más débiles que aquel de GLP-1 . Discusión. La OXM origina una reducción potente en la realimentación inducida por ayuno cuando se inyectaron tanto ICV como iPVN. El efecto se sostuvo hasta 8 h (iPVN) o 4 h (ICV) de post inyección. El efecto de OXM es aproximadamente de la misma magnitud y curso de tiempo como aquel de GLP-1 cuando se administra ICV e iPVN en dosis equimoiares. Además, la OXM inhibe la toma alimenticia en ratas no en ayuno al comienzo de la fase obscura, y en ese momento no mostraron señales de comportamiento aversivo.

Se ha sugerido que existe un sitio de unión específico de OXM en mucosa gástrica. Sin embargo, no se ha identificado tal sitio de unión en el SNC. Por lo tanto, se propuso que OXM medie sus efectos por medio de GLP-1 R hipotalamico, a medida que GLP-1 y OXM tienen potencia similar en los estudios de alimentación. Se ha mostrado que OXM tiene una afinidad nanomolar para GLP-1 R (IC5o=8.2 nM). Esta afinidad es aproximadamente 2 órdenes de magnitud más débiles que aquella de GLP-1 (IC5o=0.16 nM). Todavía a pesar de esta afinidad reducida para el GLP-1 R, OXM reduce la toma alimenticia a la misma magnitud. Una explicación para esto es que OXM podría actuar a través tanto de GLP-1 R como su propio receptor en el hipotálamo. De esta manera, OXM podría producir una respuesta comparable a aquella de GLP-1 en lugar de su afinidad inferior para el GLP-1 R. Exendin-(9-39), un fragmento del combatiente exedin-4 de GLP-1 R, es un antagonista selectivo y potente en el GLP-1 R. Cuando GLP-1 y exendin-(9-39) se coinyectaron, las acciones anoréxicas de GLP-1 se bloquean. Cuando se coinyecta OXM con exendin-(9-39), los efectos anoréxicos de OXM también se bloquean completamente. Esto podría reforzar el argumento de que OXM se encuentra mediando sus efectos por medio de GLP-1 R. Investigamos los efectos de glicentina, y glucagon después de una inyección de ICV aguda en ratas en ayuno. No se observó ningún efecto sobre la toma alimenticia inducida por ayuno después de la administración de estos péptidos. Además, no hubo efecto de estos péptidos cuando se administraron con iPVN. Cuando SP- , la estructura activa mínima de OXM, se inyectó con iPVN, no se observó la inhibición de la toma alimenticia. Por lo tanto, el efecto observado por OXM es específico. B - La administración Periférica de OXM también reduce la toma alimenticia y la ganancia de peso corporal. OXM se adquirió de IAF BioChem Pharma (Laval, Canadá). GLP-1 se adquirió de Península Laboratories Inc. (St. Helens, UK). Exendin 9-39 se sintetizó en el Consejo de Investigación Médica, Unidad de Hemostasis, Centro de Ciencias Clínicas, Hospital Hammersmith, Londres, UK utilizando la química F-moc sobre un sintetizador de péptidos 396 MPS (Advanced ChemTech Inc., Louisville, KY) y se purificaron por HPLC de fase inversa sobre una columna C8 (Phenomex, Macclesfield, UK) utilizando un gradiente de acetonitrilo en 0.1 % de ácido trifluoroacético. El peso molecular correcto se confirmó por espectrometría de masa. Todos los químicos fueron compras de Merck Eurolab Ltd. (Lutterworth, Leícestershire, UK), al menos que se establezca de otra forma. Animales Las ratas Wistar macho adulto (180 - 200 g) se mantuvieron en cajas individuales bajo condiciones controladas de temperatura (21 -23°C) y luz (12 horas de luz, 12 horas de oscuridad) con acceso a voluntad a comida de rata estándar (dieta RM1 , Special Diet Services UK Ltd., Witham, Essex, UK) y agua. Todos los procedimientos sometidos se aprobaron por British Home Office Animáis (Procedimientos Científicos) Acta 1986 (Licencias de Proyecto PPL: 90/1077, 70/5281 y 70/5516). Canulación de núcleo intra-arqueado Los animales tuvieron cánulas de guía de acero inoxidable, unilaterales, residentes, permanentes (Plastics One, Roanoke, VA) esterotacticalmente implantadas hacia el núcleo arqueado del hipotálamo, utilizando un protocolo de canulación que utiliza cánulas colocadas 3.3 mm posteriores a y 0.3 mm laterales a bregma y 9.0 mm abajo de superficie externa del cráneo. Inyecciones Intra-perinoteales (IP) Todas las inyecciones IP se suministraron utilizando una jeringa de 1 mi y una aguja de sonda 25. El volumen máximo de inyección fue 500 µ?, y se ajustó de acuerdo al peso del animal individual. Todos los péptidos se disolvieron en salina. En estos estudios, la OXM humana y GLP-1 humana se utilizaron con las secuencias proporcionadas en las páginas 15 y 16 anteriores. Protocolos in vivo 1 . Investigación del efecto de respuesta de dosis de la administración periférica de OXM en la toma alimenticia en animales en ayuno: Los animales ayunaron por 24 horas antes del estudio. Durante la fase de luz temprana (09.00-10.00 hr), a las ratas se les dio una inyección IP única de salina, GLP-1 (30 nmol/kg de peso corporal como un control positivo) u OXM (10-300 nmol/kg de peso corporal) (n=12 por grupo) en un volumen de 500 µ\. Siguiendo la inyección, los animales regresaron a sus cajas hogar y se proporcionaron con una cantidad pre-pesada de comida. La toma alimenticia se midió 1 , 2, 4, 8 y 24 horas de post inyección. 2. Investigación dei efecto de la administración periférica de OXM en la toma alimenticia en animales no en ayuno durante la fase obscura: La fase obscura es el tiempo de alimentación "normal" para ratas. Por lo tanto, cualquier inhibición de la toma alimenticia en este momento podría considerarse que es más fisiológica que las alteraciones a la realimentación que sigue un ayuno. Los animales recibieron una inyección IP única de salina u ÓXM (3-100 nmol/kg de peso corporal) (n=12 por grupo) antes de apagarse la luz (18.00-19.00 hr). La toma alimenticia se midió 1 , 2, 4, 8 y 12 horas después de apagarse la luz. 3. El efecto de inyección IP repetidas de OXM 45 animales se seleccionaron al azar en peso en tres grupos (n=15 por grupo): 1 ) se trataron con salina con acceso a voluntad al alimento, 2) se trataron con OXM (50 nmol/kg de peso corporal por inyección - una dosis en base al experimento de respuesta de dosis previa) con acceso a voluntad al alimento, 3) se trataron con salina, pero el alimento se restringió a la toma alimenticia de fase obscura y luz media del grupo tratado con OXM. Los animales se inyectaron dos veces diarias (07.00 y 18.00 hr) por siete días. La toma alimenticia (g), peso corporal (g) y toma de agua (mi) se midieron diariamente. En el día octavo, los animales se mataron por decapitación. El tejido adiposo blanco epididimal (WAT) y el tejido adiposo café interscapular (BAT) se removieron y se pesaron como una valoración de adiposidad corporal. 4. Investigación del efecto de la administración periférica de OXM en vaciamiento gástrico Los animales ayunaron por 36 horas para asegurar que el estómago se vacío. Durante la fase de luz temprana (09:00-10:00) se dejó acceso a voluntad a una cantidad pre-pesada de comida de rata estándar por treinta minutos. Después de ese tiempo, el alimento se removió y se volvió a pesar. Los animales se inyectaron así IP con salina, OXM (50 nmol/kg de peso corporal) o CCK-8 (15 nmol/kg de peso corporal). Las ratas se mataron después en los mismos tiempos que aquellos utilizados en los estudios de alimentación previa: 1 , 2, 4, u 8 horas de post-alimentación (n=12 por grupo por punto de tiempo). El grupo CCK-8 se utilizó como un control positivo para el experimento en el punto de tiempo de dos horas solamente. Los animales se mataron por asfixia de dióxido de carbono. Se realizó rápidamente una laparotomía y el estómago se expuso. La articulación pilórica se ligó (2.0 Mersilk, Johnson & Johnson, Bélgica), seguido por la ligación de la articulación gastro-oesofogeal y el estómago se removió. Los contenidos gástricos se removieron así, se colocaron en un bote de peso pre-pesado y se dejaron secar por aire por 48 horas. Una vez secos, los contenidos se pesaron y el porcentaje del comida ingerido durante el período de realimentación de media hora restante en el estómago por rata se calculó así utilizando la siguiente fórmula: % de alimento restante en el estóm ago = peso seco de contenido del estóm ago x 100 peso de al imento ingerido 5. Investigación del efecto de dosis en aumento de OXM intra-arqueada Las ratas canuladas intra-arqueadas (Intra-ARC (iARC)) (n=12-15 por grupo) se seleccionaron al azar en peso en 6 grupos. Durante la fase de luz temprana (0900-1000), las ratas en ayuno de 24 horas recibieron una inyección de iARC de salina, OXM (0.01 , 0.03, 0.1 , 0.3 o 1 .0 nmoles). La toma alimenticia se midió 1 , 2, 4, 8 y 24 horas de post inyección. 6. Investigación de si la OXM periféricamente administrada se encuentra actuando directamente por medio de receptores GLP-1 de núcleo arqueado. Las ratas canuladas en el núcleo arqueado se seleccionaron al azar en 6 grupos (n = 10-12 por grupo). Durante la fase de luz temprana (0900-1000) las ratas en ayuno de 24 horas recibieron una inyección de iARC de salina o exendin9-39 (5 nmoles) seguido por una inyección IP de salina, OXM (30 nmoles/kg de peso corporal) o GLP-1 (30 nmoles/kg de peso corporal) 15 minutos después. Los detalles de la inyección se describen en la Tabla 1 de abajo. Grupo Inyección intra-ARC Inyección IP 1 Salina Salina 2 Salina OXM (30 nmoles/kg) 3 Salina GLP-1 (30 nmoles/kg) 4 Exendin 9-39 (5 nmoles) Salina 5 Exendin 9-39 (5 nmoles) OXM (30 nmoles/kg) 6 Exendin 9-39 (5 nmoles) GLP-1 (30 nmoles/kg) Tabla 1 Inmunohistoquímica 90 minutos después de una inyección IP de OXM (50 nmol/kg), CCK (15 nmol/kg) o salina, las ratas se anestesiaron terminalmente, se prefusionaron transcardialmente con 0.1 M de salina regulada por fosfato (PBS) seguido por 4% de PB-formalin (PBF). Los cerebros se removieron y se post-fijaron durante la noche en PBF y se transfirieron así PB-sucrosa (20% p/v) durante la noche. Las secciones coronales de 40 µ?? de cerebro y tronco cerebral se cortaron sobre un micrótomo congelante y se colorearon por inmunoreactividad similar a fos (FLI) mediante el método de avitin-biotina-peroxidasa. Las secciones se montaron así sobre pedazos revestidos de poli-L-lisina, se deshidrataron en concentraciones en aumento de etanof (50-100%), se depilaron en xileno y se cubrieron con objetos utilizando DPX ascendente. Los pedazos se examinaron para núcleos positivos FLI utilizando un microscopio de luz (Nikon Eclipse E-800) y las imágenes se capturaron utilizando un microimager (Microlmager Xillix). Los números de núcleos positivos FLI en el hipotálamo y tronco cerebral se contaron por un miembro independiente del equipo de investigación quien estuvo cubierto hacia los grupos experimentales. El número promedio de núcleos positivos FLI por sección se calculó y se expresó como un entero para cada animal. Incubación estática de explante hipotalámico Se presentó un sistema de incubación estática. Las ratas Wistar macho se mataron por decapitación y el cerebro completo se removió inmediatamente. El cerebro se montó, en la parte más alta de la superficie ventral, y se colocó en un micrótomo de vibración (Microfield Scientific Ltd. , Dartmouth, UK). Un pedazo de 1 .7 mm se tomó del hipotálamo basal, se bloqueó lateral al Círculo de Willis y se incubó en cámaras que contienen 1 mi de fluido cerebroespinal artificial que se equilibró con 95% de 02 y 5% de C02. El pedazo hipotalámico comprendió el área pre-óptica media, PVN (núcleo hipotalámico paraventricular), núcleo dorosomedial, núcleo ventromedial, hipotálamo lateral y ARC. Los tubos se colocaron sobre una plataforma en un baño de agua mantenido a 37°C. Después de un período de equilibrio de 2 horas inicial, cada explante se incubó por 45 minutos en 600 µ? de aCSF (período basal) antes de someterse con un período de prueba. OXM 100 nM se utilizó como una dosis que representa una concentración diez veces aquella de su IC50 para el receptor GLP-1 . La viabilidad del tejido se confirmó por una exposición de 45 minutos final a aCSF que contiene 56 mM de KCl. Al final de cada período experimental, el aCSF se removió y se almacenó a -20°C hasta la medición de ctMSH-inmunoreactividad. Radioinmunoensayo para medir MSH-lR Alfa-MSH se midió utilizando un radioinmunoensayo en casa, se desarrolló utilizando un anticuerpo de Chemicon International Inc. Análisis Estadístico Los datos de los estudios de alimentación iARC e IP se analizaron por ANOVA con la prueba LSD post-hoc (diferencia menos significante). Los pesos de la almohadilla gruesa de diferentes grupos de tratamiento se analizaron utilizando una prueba t desigual. Los datos del estudio de incubación de explante hipotalámico, en donde cada explante se comparó con su propio período basal, se analizaron por la prueba t igual. En todos los casos, P<0.05 se consideró que era estadísticamente significante. Resultados 1 . El efecto de la administración periférica de OXM en animales en ayuno: La administración intraperitoneal de OXM (100 nmol/kg y 300 nmol/kg) originó una inhibición significante en la realimentación en animales en ayuno de 24 horas a una hora de la post inyección, se comparó con controles de salina (1 hora: OXM 100 nmol/kg, 5.4 + 0.2 g (P<0.05), 300 nmol/kg, 4.5 + 0.2 g (P<0.05) vs. salina, 6.3 + 0.2 g). La reducción en la toma alimenticia originada por 100 nmol/kg se sostuvo hasta 8 horas de la post inyección. Sin embargo, la dosis más alta de OXM (300 nmol/kg) continuó inhibiendo significativamente la toma alimenticia 24 horas a la post inyección (24 horas: OXM, 300 nmol/kg, 9.5 + 0.6 g vs. salina, 17.5 + 0.7 g; P<0.05) (Figura 6a). Los 30 nmol/kg y 10 nmol/kg fallaron en alterar la toma alimenticia en cualquier punto de tiempo investigado. 2. El efecto de la administración periférica de OXM en animales no en ayuno en la toma alimenticia de fase obscura: OXM, 3 y 10 nmol/kg, fallaron en afectar la toma alimenticia en cualquier punto de tiempo investigado en la ratas de alimentación nocturna inyectadas inmediatamente antes de la fase obscura. Sin embargo, OXM, 30 nmol/kg, inhibió significativamente la toma alimenticia hasta 2 horas a la post inyección (2 horas: OXM, 30 nmol/kg, 4.5 + 0.4 g vs. salina, 5.8 + 0.4 g; P<0.05). La toma alimenticia se redujo 4 horas a la post inyección, pero esta no fue significante. OXM, 1 00 nmol/kg, inhibió significativamente la toma alimenticia a lo largo de la fase obscura (8 horas: OXM, 100 nmol/kg, 14.1 + 0.8 g vs. salina, 16.9 + 0.5 g; P<0.05) (Figura 6b) . 3. El efecto de la administración IP repetida de OXM Las inyecciones IP dos veces diarias de OXM (50 nmol/kg) por siete días originaron una reducción significante en la toma alimenticia diaria acumulativa, en comparación con los animales de control tratados con salina (día de toma alimenticia acumulativa 7: OXM, 50 nmol/kg, 1 68 + 4.6 g vs. salina , 1 80 ±. 4.3 g; P<0.01 ) (Figura 7a). Además, los animales tratados con OXM ganaron peso significativamente más lentamente que los controles de salina (día de ganancia de peso acumulativo 7: OXM, 50 nmol/kg, 21 .0 + 1 .5 g vs. salina, 37.6 + 1 .9 g, P<0.005). Además, los animales "alimentados por igual" restringidos de alimentos no ganaron peso tan lentamente como los animales tratados con OXM, en lugar de recibir la misma toma alimenticia (Día 7: alimentados por igual, 33.5 + 2.0 g; P=NS vs. salina (a voluntad alimentado), P<0.05 vs. OXM) (Figura 7b). Además, la OXM crónica originó una reducción en la adiposidad que no se observó en animales alimentados por igual inyectados con salina (Tabla 2). La toma de agua se redujo significativamente en animales tratados con OXM en los días 1 y 2 del experimento (Día 1 : OXM, 24.1 + 1 .28 mi vs. salina, 28.1 + 1 .33 mi; P<0.05). En días subsecuentes, hubo un aumento en la toma de agua diaria en comparación con los animales tratados con salina (días 3-6). Sin embargo, para el día 7, no hubo diferencia en la toma de agua entre salina y los grupos tratados con OXM (no mostrados).

Tejido/hormona Salina OXM Alimentados por igual WAT 0.69 + 0.02 0.51 + 0.01 a 0.61 + 0.02° BAT 0.16 + 0.01 0.12 + 0.01 a 0.15 + 0.01 ü Tabla 2: El efecto de la administración IP dos veces diarias de salina u OXM (50 nmol/kg) por siete días sobre ei peso de WAT epididimal y BAT interscapular en ratas alimentadas a voluntad y restringidas de alimentos. 4. El papel del vaciamiento gástrico retardado sobre el efecto anoréxico de OXM: Una hora después de la alimentación se presentó para las ratas en ayuno de 36 horas, el peso seco de los contenidos de los estómagos (como un porcentaje del alimento consumido durante el período de alimentación de 30 minutos) de los animales tratados con GLP-1 fueron significativamente mayores que los animales tratados con salina (1 hora: GLP-1 , 50 nmol/kg, 76.9 + 2.7 g vs. salina, 65.8 + 1 .6 g; P<0.01 ), sugiriendo que GLP-1 originó una reducción significante en vaciamiento gástrico. Los contenidos de los estómagos de los animales tratados con OXM fueron mayores que aquellos de los controles tratados con salina, a pesar de que no fue estadísticamente significante (1 hora: OXM , 50 nmol/kg, 72.0 + 1.4 g vs. salina 65.8 + 1 .6 g; P=0.07). Dos horas a la post alimentación, la OXM no afectó los contenidos del estómago, en comparación con los animales tratados con salina. Sin embargo, los animales inyectados con el control positivo para este punto de tiempo, CCK (15 nmol/kg), tuvieron un contenido de estómago significativamente mayor (2 horas: CCK, 15 nmol/kg, 64.7 + 6.4 g vs. salina, 38.5 g; P<0.01), sugiriendo que CCK originó una reducción significante en la velocidad de vaciamiento gástrico. No hubo efecto de OXM sobre los contenidos del estómago, en comparación con los animales tratados con salina, a las 4 u 8 horas de la post alimentación (Figura 8). 5. Investigación del efecto de las dosis en aumento del núcleo intra-arqueado inyectado con OXM La toma alimenticia se inhibió significativamente por todas las dosis (excepto 0.01 nmoies) de iARC administrado con OXM durante la 1a hora de realimentación siguiendo un ayuno de 24 horas (1 hora: OXM 0.03 nmoies, 6.1 + 0.5 g (P<0.05); 0.1 nmoies, 5.6 + 0.4 g (P<0.05); 0.3 nmoies, 5.1 + 0.6 g (P<0.01); 1.0 nmole; 3.6 + 0.5 g (P<0.005) todos vs. salina, 7.7 + 0.2 g) (Figura 9). OXM 0.3 y 1.0 nmoies continuaron inhibiendo significativamente la toma alimenticia hasta 8 horas a la post inyección. A 24 horas de la post inyección, la toma alimenticia se inhibió por OXM 1.0 nmoies, a pesar de que no fue significante (24 horas: OXM, 1.0 nmol, 37.8 + 3.0 g vs. salina, 40.8 + 1.6 g; P=NS). 6. Investigación de si la OXM periféricamente administrada se encuentra actuando por medio de los receptores GLP-1 de núcleo arqueado La administración intraperitoneal tanto de GLP-1 (30 nmol/kg) como OXM (30 nmol/kg) originó una inhibición significante de la toma alimenticia una hora en la fase obscura (1 hora: GLP-1, 5.0 ±0.6 g, OXM, 5.1 + 0.4 g vs. salina, 9.2 + 0.3 g). Sin embargo, ia anorexia causada por la administración IP de OXM se bloqueó por la administración anterior del antagonista de receptor GLP-1 , exendin 9-39 (300 nmol/kg), inyectado directamente hacia el ARC (Tabla 3 & Figura 10). La inhibición de la toma alimenticia por IP GLP-1 no se afectó por la administración iARC anterior del exendin 9-39.

Tabla 3: El efecto de la administración iARC de exendin 9- 39 (5 nmoles) o salina inyectada 15 minutos antes de la administración IP de OXM (30 nmol/kg), GLP-1 (30 nmol/kg) o salina en 1 hora de toma alimenticia (g). (S=salina, G=GLP-1 (30 nmol/kg), Ox=OXM (30 nmol/kg), Ex=exendin 9-39 (5 nmoles)). 7. Mapeo de la expresión de FLI en el hipotálamo en respuesta de OXM IP: Después de la administración de OXM IP (50 nmol/kg) se encontró la coloración densa de FLI casi exclusivamente en el núcleo arqueado hipotalámico (Figura 1 1 a). Ningún otro núcleo hipotalámico (PVN (núcleo hipotalámico paraventricular), DMH (núcleo hipotalámico dorsomedial, VMH (núcleo hipotalámico ventromedial)) demostraron la coloración c-fos específica. En el tronco cerebral, IP CCK (15 nmol/kg) originó la coloración densa de FLI, más notablemente en la NTS (solitaria de tracto de núcleo) y el postrema del área Figura 6b). Sin embargo, ni la salina IP ni OXM IP (50 nmol/kg) originaron un aumento específico en la expresión c-fos en el mismo núcleo de tronco cerebral investigado (Figura 1 1 b). 8. Cambios en la liberación de alfa-MSH de los explantes hipotalámicos cuando se incubaron con OXM La incubación de OXM (100 nM) que fue de explantes hipotalámicos, originó un aumento significante en la liberación de oc-MSH, en comparación con la liberación basal (a-MSH; OXM, 100 nM, 4.1 + 0.6 fmol/explante vs. 2.6 + 0.5 fmol/explante; P<0.005). La viabilidad de explante se valoró por incubación con 56 mM de KCI, y la viabilidad se confirmó en >80% de explantes. Aquellos explantes que no fueron viables se excluyeron del análisis. Discusión La administración periférica de OXM origina una reducción en la toma alimenticia en ratas. Esto se observo siguiendo un ayuno en la fase de luz y durante la fase de alimentación nocturna. El efecto anoréxico fue potente y se sostuvo por períodos de hasta 24 horas. La administración IP dos veces diarias de OXM por siete días originó una reducción en la toma alimenticia diaria en comparación con aquellos tratados con salina, sin taquifilaxis. Los animales tratados con OXM ganaron significativamente menos peso que los animales alimentados por igual, en lugar de los dos grupo que reciben toma calórica diaria idéntica. La administración intraperitoneal de OX redujo transitoriamente la toma de agua a pesar de que esta no se sostuvo, sugiriendo que la reducción en la velocidad de la ganancia de peso corporal no fue debido a la deshidratación. En conclusión del estudio crónico, WAT epididimal y BAT interscapular se removieron y se pesaron. Se encontró que hubo una reducción en los pesos de todas las almohadillas gruesas en los animales tratados con OXM en comparación con los animales alimentados por igual, en lugar de la toma alimenticia idéntica. Por lo tanto, parece que la administración OXM periférica también está afectando otros parámetros metabólicos. Un principal contribuidor a la saciedad es el vaciamiento gástrico retardado por medio de mecanismo mediado de manera vagal que conduce a la activación de tronco cerebral. Tanto GLP-1 como OXM fueron inhibidores potentes de vaciamiento gástrico en roedores y humanos y en el caso de GLP-1 , se considera que es el mecanismo dominante a través del cual se promueve la saciedad. Señalamos como hipótesis que OXM estaba actuando en ia misma manera, y que sus efectos sobre el vaciamiento gástrico fueron el origen de la anorexia sostenida. Sin embargo, a pesar de la administración periférica de OXM conducida a un retardo ligero en el vaciamiento gástrico en la primer hora después de la re-introducción del alimento, no hubo importancia y el efecto fue de corta vida. Esto sugirió que OXM disminuye el vaciamiento gástrico, pero que es probable que sea responsable de la inhibición sostenida y robusta de la toma alimenticia. Reportamos aquí que la administración periférica de OXM aumenta la FLI en casi exclusivamente en el ARC. Además, encontramos que la incubación del explante hipotalámico con OXM originó un aumento significante en la liberación del producto derivado de POMC (pro-opiomelanocortina), aMSH de los explantes hipotalámicos. OXM IP no afectó la expresión de FLI en las áreas AP y NTS conocidas por ser importantes en la integración de la información mediada de manera vagal , además del refuerzo de la noción de que OXM no se encuentra actuando por medio de estas vías. Se considera que los núcleos en el tronco cerebral son el sitio primario de la acción GLP-1 , y la información se reemplazaron subsecuentemente al PVN hipotalámico, en donde se median sus efectos anoréxicos. La inyección directa de OXM en el ARC, aún en dosis muy bajas originó una inhibición sostenida y robusta de la toma alimenticia, además de soportar la hipótesis de que el ARC es el sitio de acciones de la OXM. Los efectos anoréxicos originados por la administración periférica de OXM se bloquearon por la administración anterior de exend¡n9 -39 hacia el ARC. Sin embargo, de manera interesante, las acciones anoréxicas de GLP-1 periféricamente administrado no estaban. Este descubrimiento indica fuertemente que la OXM se encuentra actuando por medio de los receptores GLP-1 en el ARC. Además, se han identificado distintas trayectorias que median las acciones de GLP-1 y OXM. Tomados juntos, estos datos demuestran que la OXM es potencialmente importante tanto en la regulación a corto como a largo plazo de la toma alimenticia y mantenimiento de peso corporal. En lugar de reducir el apetito por medio de las vías de saciedad "tradicionales", incluyendo la disminución del vaciamiento gástrico y la activación de los núcleos de tronco cerebral, la OXM circulante se encuentra mediando sus efectos anoréxicos por medio de la interacción directa con el ARC, potencialmente al activar las neuronas POMC (pro-opiomelanocortina) dentro del núcleo. Por lo tanto, la OXM puede ser útil en el tratamiento o prevención del peso en exceso tal como la obesidad en animales, y además representa un nuevo objetivo para el desarrollo de agentes terapéuticos en el tratamiento del peso en exceso tal como la obesidad en los mamíferos.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Una composición que comprende oxintomodulina, para utilizarse en la prevención o tratamiento del peso en exceso en un mamífero. 2. Una composición que comprende oxintomodulina, para utilizarse según la reivindicación 1 , caracterizada porque el peso en exceso es la obesidad. 3. Una composición que comprende oxintomodulina, para utilizarse según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable. 4. Una composición que comprende oxintomodulina, para utilizarse según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en forma líquida, sólida o semi-sólida. 5. Una composición que comprende oxintomodulina, para utilizarse según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque el mamífero es un humano. 6. Un método para la prevención o tratamiento del peso en exceso en un mamífero, el método comprendiendo administrar una composición que comprende oxintomodulina a un mamífero. 7. Un método, según la reivindicación 6, caracterizado porque el peso en exceso es la obesidad. 8. Un método para la pérdida de peso cosmética en un mamífero, el método comprendiendo administrar una composición que comprende la oxintomodulina a un mamífero. 9. Un método, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado porque la composición comprende oxintomodulina y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. 10. Un método, según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, caracterizado porque la pérdida de peso es un resultado de la toma alimenticia reducida. 1 1 . El uso de oxintomodulina, en la elaboración de un medicamento para la prevención o tratamiento de la pérdida en exceso. 12. El uso de oxintomodulina para identificar un agente que inhibe la toma alimenticia en un mamífero. 13. El uso, según la reivindicación 12, caracterizado porque es de las características funcionales y/o estructurales de la oxintomodulina. 14. El uso, según la reivindicación 12 o la reivindicación 13, caracterizado porque es de un modelo eléctricamente generado de la oxintomodulina. 15. El uso, según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, caracterizado porque la característica de oxintomodulina es su farmacoforo de estructura primaria, secundaria, terciaria y/o la estructura de cristal de rayos X. 16. Una composición que comprende oxintomodulina, para utilizarse en la prevención o tratamiento del peso en exceso en un mamífero según se anteriormente en los ejemplos. 17. Un método para la prevención o tratamiento del peso en exceso en un mamífero, el método según se describe con referencia a los ejemplos. RESUME N La presente invención se refiere a composiciones y métodos para utilizarse en la prevención o tratamiento del peso en exceso en un mamífero. Las composiciones comprenden oxintomodulina la cual se muestra que reduce la toma alimenticia.