COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS DE AGENTE FIBRINOLITICO Campo de la Invención La presente invención se relaciona a las composiciones farmacéuticas novedosas de un agente fibrinolítico. Más específicamente, la presente invención se relaciona a composiciones líquidas congeladas y liofilizadas de fibrolasa y, separadamente, de "un agente trombolítico de actuación novedosa" (NAT) , así como también métodos para la producción y uso de los mismos. Antecedente de la Invención En general, los polipéptidos son estables marginalmente en el estado acuoso y sufren degradación química y física lo cual resulta en una pérdida de actividad biológica durante el procesamiento y almacenamiento. Otro problema encontrado en la solución acuosa en particular es la hidrólisis, tal como la desamidación y la escisión del enlace peptídico. Estos efectos representan un serio problema para los polipéptidos activos terapéuticamente los cuales son propuestos para ser administrados a humanos dentro de un intervalo de dosis definido en la actividad biológica. Para reducir la degradación de los polipéptidos, las composiciones farmacéuticas a base de agua se mantienen generalmente refrigeradas o congeladas hasta que estén listas para uso. Como una alternativa, se emplea con REF: 137085
^¿^ "te- *- -"J" frecuencia el proceso del secado por congelamiento para estabilizar los polipéptidos para almacenamiento a largo plazo, particularmente cuando el polipéptido es relativamente inestable en composiciones líquidas. Un ciclo de liofilización está usualmente compuesto de tres etapas: congelamiento, secado primario, y secado secundario; Williams and Polli, Journal of Parental Science and Technology, Volumen 38, Número 2, páginas 48-59 (1984). En la etapa de congelamiento, se enfría la solución hasta que esté adecuadamente congelada. El volumen de agua en la solución forma hielo en esta etapa. El hielo se sublima en la etapa de secado primario, la cual se realiza por reducir la presión de la cámara abajo de la presión de vapor del hielo, usando vacío. Finalmente, se elimina el agua adsorbida o enlazada en la etapa de secado secundario bajo presión reducida de la cámara y una autotemperatura elevada. El proceso produce un material conocido como un pastel liofilizado. Después de esto el pastel puede ser reconstituido antes del uso. La práctica de reconstitución estándar para el material liofilizado es agregar de nuevo un volumen de agua pura (típicamente equivalente al volumen eliminado durante la liofilización) , aunque se usan algunas veces las soluciones diluidas de los agentes antibacterianos en la producción de farmacéuticos para administración parental; Chen, Drug Development and Industrial Pharmacy, Volumen 18, Números 11 y 12, páginas 1311-1354 (1992) . La liofilización es considerada una de las mejores formas para eliminar el exceso de agua a partir de soluciones de polipéptido. El proceso de secado por congelamiento puede producir productos que son estables y adecuados para manejar en almacenamiento de largo plazo. Los productos liofilizados pueden ser almacenados a temperatura ambiente y son por lo tanto más fáciles de manejar y distribuir a un mercado geográfico más amplio, tal como mercados extranjeros donde no esté disponible la refrigeración. Se ha notado en algunos casos que los excipientes actúan como estabilizantes para productos secados por congelamiento; Carpenter et al., Developments in Biological Standardization, Volumen 74, páginas 225-239 (1991) . Por ejemplo, los excipientes conocidos incluyen los polioles (incluyendo el manitol, sorbitol y glicerol); azúcares (los cuales incluyen la glucosa y la sacarosa) ; y aminoácidos (los cuales incluyen alanina, glicina y ácido glutámico) . Además, los polioles y azúcares son también con frecuencia usados para proteger los polipéptidos del daño por congelamiento e inducido por secado y para incrementar la estabilidad durante el almacenamiento en el estado seco. En general, los azúcares, en particular los disacáridos, son efectivos en tanto el proceso de secado por congelamiento y durante el almacenamiento. Otras clases de moléculas, las cuales incluyen mono y disacáridos y polímeros tales como PVP, han sido también reportados como estabilizantes de productos liofilizados. Sumario de la Invención La presente invención se relaciona a composiciones farmacéuticas estables de fibrolasa y "un agente trombolítico de actuación novedosa" (NAT) , algunas de las cuales son composiciones líquidas adecuadas para almacenamiento en el estado congelado, y otras las cuales son adecuadas para liofilización. Debido a las propiedades fibrinolíticas de la fibrolasa y NAT, las composiciones de esta invención son útiles para usar coágulos sanguíneos in vivo y pueden ser administradas terapéuticamente para tal propósito. Para propósitos de esta invención, el término "NAT" se refiere a la metaloproteinasa la cual tiene actividad fibrínolítica la cual se caracteriza por la SEQ ID NO:l. El polipéptido NAT se codifica por la molécula ADNc de la SEQ ID NO: 2, aunque cualquier molécula de ADNc de la secuencia variante que codifica el mismo polipéptido puede ser usada para expresión y manufactura de acuerdo con los métodos los cuales son referidos posteriormente en la presente. La fibrolasa es una metaloproteinasa conocida la cual se ha descrito en la literatura científica y de patentes; véase Randolph et al., Protein Science, Cambridge University Press (1992), páginas 590-600, y la Solicitud de Patente Europea No. 0 323 722 (Valenzuela et al.), publicada el 12 de Julio de 1989. Típicamente, la fibrolasa empleada en las composiciones de esta invención será de la SEQ ID NO: 3, la cual es codificada por la molécula ADNc de la SEQ ID NO: 4 (o variantes de la misma que codifican la misma secuencia de aminoácidos) . La fibrilosa y NAT serán distinguidas de otros agentes terapéuticos por el tratamiento de coágulos sanguíneos in vivo, tales como la uroquinasa, estreptoquinasa, y tPA los cuales son activadores de plasminógeno. A diferencia de estos otros agentes, la fibrolasa y NAT actúan directamente en el coágulo para degradar tanto la fibrina y el fibrinógeno. Las composiciones farmacéuticas de esta invención contendrán, además de una cantidad terapéuticamente efectiva de fibrolasa o NAT, un estabilizador de zinc y, opcionalmente, un agente de volumen con o sin otros excipientes en un amortiguador farmacéuticamente aceptable los cuales, en combinación, proporcionan un producto estable, congelado o liofilizado que puede ser almacenado por un periodo prolongado de tiempo. En uno de sus aspectos, la presente invención proporciona una composición medicinal líquida congelable la cual comprende fibrolasa o NAT, una sal de zinc soluble en agua, un amortiguador de ácido cítrico, opcionalmente un estabilizador adicional seleccionado del grupo que consiste de sales de calcio solubles en agua, y opcionalmente un agente de volumen (por ejemplo, manitol) . Puede también ser agregado, un tensioactivo, tal como Tween 80 (BASF, Gurnee, Illinois) para incrementar la estabilidad al congelado descongelado. Puede ser agregado el amortiguador Tris (Sigma, St. Louis, Missouri) u otro amortiguador con una capacidad de amortiguación arriba del pH 7.0 para estabilizar el pH en o arriba del pH 7.4. En otro aspecto de la presente invención, la composición farmacéutica puede ser una composición farmacéutica liofilizable o liofilizada la cual comprende fibrolasa o NAT, un estabilizante de zinc (por ejemplo, sal de zinc soluble en agua) , y un amortiguador de ácido cítrico, con o sin otros excipientes (por ejemplo, un agente de volumen tal como manitol, glicina, o similares) . La composición liofilizada puede también contener un azúcar disacárido, tal como sacarosa o trehalosa, como un
lioprotector. Puede ser agregado un tensioactivo, tal como Tween 80, para proteger contra las tensiones de la liofilización en la metaloproteinasa (fibrolasa o NAT) . El pH será mantenido idealmente en pH 8.0 + 0.5, usando un 5 amortiguador adecuado con una pKa en este intervalo (por ejemplo, Tris) . La invención también comprende un método para preparar una composición liofilizada, la cual comprende las etapas de (i) mezclar fibrolasa o NAT con un amortiguador y
10 una sal de zinc soluble en agua, así como también cualesquiera ingredientes opcionales deseados, y (ii) liofilizar esta mezcla. Además, la invención proporciona un equipo para preparar una composición farmacéutica acuosa, el cual
15 comprende un primer recipiente el cual tiene la composición liofilizada mencionada anteriormente y un segundo recipiente el cual tiene un solvente fisiológicamente aceptable para la misma. Todavía otro aspecto de esta invención comprende un
20 método el cual comprende las etapas de reconstituir la composición liofilizada y administrar la composición reconstituida a un paciente en necesidad de lisis de los coágulos sanguíneos.
?¡ iii 11 iiiiirtii-iiííii iim i ? ? - - - Descripción detallada de la Invención Puede ser utilizada una variedad de sistemas de huéspes vector para expresar la secuencia de codificación para la fibrolsa o el polipéptido NAT de acuerdo con los métodos estándar para la expresión recombinante los cuales son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica, y por lo mismo obtener el polipéptido activo fibrinolíticamente para las composiciones. Tales sistemas incluyen, pero no se limitan a, los sistemas de células eucarióticas tales como los sistemas de células mamíferas infectados con virus (por ejemplo, virus vaccinia, adenovirus, etc.); sistemas de células de insectos infectados con virus (por ejemplo, baculovirus) ; microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de levaduras; o sistemas de células procarióticas tales como bacterias (por ejemplo, E. coli) transformadas con el ADN de bacteriófago, ADN de plásmido o ADN de cósmido. Los elementos de expresión de estos vectores varían en sus resistencias y especificidades. Dependiendo del sistema huésped vector utilizado, pueden ser usados cualquiera de un número de elementos de transcripción y traducción adecuados. Preferentemente, se emplea un sistema de expresión de levadura (por ejemplo, Pichia pastoris) para la expresión recombinante debido a su mayor eficiencia. Puede ser
¿¿¡^gai-i encontrada una descripción detallada de tal sistema en la Patente de los Estados Unidos No. 4,855,231 (Stroman et al.), Patente de los Estados Unidos No. 4,812,405 (Lair et al.), Patente de los Estados Unidos No. 4,818,700 (Cregg et al.), Patente de los Estados Unidos No. 4,885,242 (Cregg), y la Patente de los Estados Unidos NO. 4,837,148 (Cregg), las descripciones de las cuales se incorporan en la presente para referencia. La expresión de la fibrinolasa en tal sistema típicamente implicará una molécula de ADN de SEQ ID NO: 5, la cual codifica una secuencia "prepro" (nucleótidos 1-783) además del polipéptido "maduro" (nucleótidos 784-1392) . La expresión de NAT en tal sistema típicamente implicará una molécula de ADN de SEQ ID NO: 6, la cual codifica una secuencia "prepro" (nucleótidos 1-783) además del polipéptido "maduro" (nucleótidos 784-1386) . Detalles adicionales con respecto a NAT y métodos para su preparación pueden ser encontrados en la solicitud de patente copendiente comúnmente asignada no. de serie (referencia del apoderado A-596) , presentada concurrentemente con la presente, la cual se incorpora en la presente para referencia. Una vez que ha sido preparado el polipéptido (fibrolasa o NAT), purificado, y después ensayado para actividad (usando procedimientos para los agentes
íyá.yá, i* lá yi .yAyy*tr*.yA A L --.,. -.»«. . —. - - . . ... .. . . - --»».«*-»•-«m»-»-.» ..*...», -„, ~> Aj i i -i.
fibrinolíticos conocidos por aquellos expertos en la técnica) , puede ser formulado en composiciones farmacéuticas de acuerdo con esta invención. En las composiciones presentes (ya sea si están congeladas o liofilizadas) , se agrega un estabilizador (el cual puede también ser referido como un "aditivo que forma vidrio") para evitar o reducir la precipitación y degradación química de la fibrolasa o NAT, cualquiera que sea el caso. Una solución nebulosa o túrbida en temperatura ambiente indica que ha precipitado el polipéptido. El término "estabilizador" significa un excipiente capaz de evitar la agregación u otra degradación física, así como también la degradación química (por ejemplo, autólisis, desamidación, oxidación, etc.) de la fibrolasa o NAT en un medio acuoso. Se ha descubierto que la incorporación de un estabilizante de zinc, y más específicamente una sal de zinc soluble en agua, incrementa la estabilidad de la metaloproteinasa (fibrolasa o NAT) en cada tipo de composición, como se compara con las formulaciones en las cuales se usan compuestos inorgánicos u otros tipos de compuestos orgánicos para evitar la agregación y/o descomposición del polipéptido. Específicamente, las concentraciones de zinc arriba de 0.01 milimolares (mM) estabilizarán la metaloproteinasa, con la condición de que
ÍA..llt*iÍ * L.b?H.i,y? ^y Ja.Ay..yy. ,. -»..„. ,y y . ^A. ~~. » , - " ' ' '"«—^ *«"" ^ -'^*^^ las concentraciones de zinc arriba de 1 mM limitan significativamente la solubilidad de la fibrolasa o NAT. De esta forma, se aconseja un intervalo de aproximadamente 0.01 mM a aproximadamente 1 M. Ejemplos de sales de zinc adecuadas son acetato de zinc, sulfato de zinc, y cloruro de zinc. Las composiciones líquidas congeladas de acuerdo con esta invención, en particular, pueden también opcionalmente (pero no necesariamente) incluir una sal de calcio soluble en agua como un estabilizador adicional. Los ejemplos son acetato de calcio, sulfato de calcio o cloruro de calcio, los cuales están preferentemente presentes en una concentración de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.02 mM, y más preferentemente en una concentración de aproximadamente 0.01 + 0.002 mM. Si se desea, pueden ser usados otros estabilizantes que sean empleados convencionalmente en las composiciones farmacéuticas, tales como sacarosa, trehalosa o glicina, además de los mencionados anteriormente. Típicamente, tales estabilizantes serán agregados en cantidades menores en el intervalo de, por ejemplo, aproximadamente 0.1% a aproximadamente 0.5% (p/v). Pueden ser agregados también estabilizantes de tensioactivos, tales como Tween 20 o Tween 80 (BASF), en cantidades convencionales.
ítj.yíHL?.? á*ÍAáAÍ**>myA*m * Si se desea, las composiciones líquidas congeladas y liofilizadas pueden también incluir un agente de regulación de volumen/osmolaridad. Preferentemente, se incorpora el manitol en una concentración de aproximadamente 2% a aproximadamente 8% en peso en volumen (p/v) , y usualmente en una concentración de aproximadamente 5% (p/v) . Se ha descubierto también que la elección de un amortiguador farmacéuticamente aceptable y pH afectan la estabilidad de las composiciones presentes. La fibrolasa o NAT es más estable arriba de un pH neutral (7.0). La precipitación significativa de cualquier metaloproteinasa ocurre en un pH abajo de 7.0 cuando la composición congelada es descongelada o se reconstituye la composición liofilizada. El sistema amortiguador presente en las composiciones se selecciona para ser fisiológicamente compatible y para mantener un pH deseado en la solución reconstituida así como también en la solución antes a la liofilización. Preferentemente, los amortiguadores tienen una capacidad de amortiguamiento del pH en el intervalo de aproximadamente el pH de 7.0 a aproximadamente el pH de 8.5. Específicamente, los amortiguadores de ácido cítrico (es decir, ácido cítrico o sal de ácido cítrico) son preferentemente incorporados en una concentración de aproximadamente 20 mM a aproximadamente 110 mM, y más
preferentemente en aproximadamente 100 mM en la composición líquida congelada y aproximadamente 20 mM en la composición liofilizada. Las sales del ácido cítrico se usan tanto como agentes de amortiguamiento y agentes de estabilización en las composiciones de esta invención. Ya sea si se usa una misma forma acida o una sal del mismo, el amortiguador del ácido cítrico será elegido para ajustar el pH de la composición a un valor dentro del intervalo deseado como se indica anteriormente (en el caso de la composición liofilizada, después de la reconstitución) . Pueden ser agregados agentes de amortiguamiento adicionales, tales como Tris, en cantidades adecuadamente efectivas para mantener una capacidad de amortiguamiento adecuada arriba del pH 7.0. Una composición líquida preferida a ser congelada contendrá, además de la fibrolasa solubilizada o NAT, acetato de zinc en una concentración de aproximadamente 0.08 mM a aproximadamente 0.12 mM, acetato de calcio en una concentración de aproximadamente 0.008 mM a aproximadamente 0.012 mM, y ácido cítrico (o citrato de sodio) en una concentración de aproximadamente 95 mM a aproximadamente 105 mM, en aproximadamente un pH de 7.4. Otra composición líquida preferida contendrá fibrolasa o NAT, acetato de zinc en una concentración de aproximadamente 0.08 mM, aproximadamente 0.12 mM, ácido cítrico (o citrato de sodio) en una
concentración de aproximadamente 18 mM a aproximadamente 22 mM, Tris en una concentración de aproximadamente 0.02 mM a aproximadamente 0.06 mM, manitol en una concentración de aproximadamente 3% a aproximadamente 6% (p/v) , y Tween 80 en una concentración de aproximadamente 0.008% a aproximadamente 0.012% (p/v), en un pH de aproximadamente 8.0. Una composición liofilizable preferida contendrá, además de la fibrolasa o NAT, sulfato de zinc en una concentración de aproximadamente 0.08 mM a aproximadamente 0.12 mM, ácido cítrico (o citrato de sodio) en una concentración de aproximadamente 18 mM a aproximadamente 22 mM, Tris en una concentración de aproximadamente 3 mM a aproximadamente 6 mM, manitol en una concentración de aproximadamente 3% a aproximadamente 6% (p/v) , y Tween 80 en una concentración de aproximadamente 0.008% a aproximadamente 0.012% (p/v), en un pH de aproximadamente 8.0. Para todas las composiciones de acuerdo con esta invención, la fibrolasa o NAT está presente en una concentración de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, preferentemente, con una concentración de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 40 mg/ml que es más preferida, y una concentración de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml que es la más preferida. Las proporciones relativas de los excipientes en
,&&teg& estas composiciones dependerá de varios factores. Por ejemplo, la cantidad de la metaloproteinasa y el agente de volumen (por ejemplo, manitol) tiene un efecto en la cantidad del zinc (y calcio, si está presente) necesario para estabilizar la composición. La cantidad del estabilizante usado en las composiciones dependerá de la cantidad necesaria para mantener la integridad estructural de la fibrolasa o NAT durante la liofilización u otro procesamiento o ante el almacenamiento . Todavía otros excipientes conocidos en la técnica también serán incluidos en la composición, con la condición de que sean compatibles fisiológicamente y no sean nocivos para la fibrolasa o NAT. Por ejemplo, la composición puede contener cantidades menores de aditivos, tales como conservadores, agentes de ajuste de la tonicidad, antioxidantes, u otros polímeros (por ejemplo, agentes de ajuste de viscosidad o extensores) . Aquellos expertos en la técnica pueden determinar fácilmente los reactivos apropiados que pueden ser farmacéuticamente útiles, en base al conocimiento y la experiencia con otras composiciones farmacéuticas. Véase, por ejemplo, Remington A Pharmaceutical Sciences (última edición) , Mack Publishing Company, Easton, PA. Se espera que las composiciones sean estables por al menos dos años en -30°C para la composición congelada, y dos años en 2°C a 8°C para la composición liofilizada. Esta estabilidad a largo plazo es benéfica para extender la vida media del producto farmacéutico y para transportación de larga distancia. En otro aspecto, la presente invención también proporciona un método para preparar r una composición liofilizada el cual comprende las etapas de: (a) ajustar el pH de una mezcla que contiene los ingredientes de la composición sin fibrolasa o NAT entre el pH 7.6 y el pH de 8.2, (b) intercambiar con amortiguador una solución que contiene fibrolasa o NAT en la solución de composición de la etapa (a) y después agregar una cantidad efectiva de tensioactivo, y (c) liofilizar la mezcla de la etapa (b) . Se mezclan la fibrolasa o NAT y cantidades efectivas de los excipientes bajo condiciones efectivas para reducir la agregación de la fibrolasa seca o polipéptido de NAT ante la reconstitución con el medio de reconstitución, por ejemplo, un solvente el cual es compatible con la ruta de administración seleccionada y no interfiere negativamente con la metaloproteinasa, tal como agua estéril, solución salina fisiológica, solución de glucosa u otros solventes acuosos
l¿A .á .ii«-?A.t -*i- Í-: (por ejemplo, alcoholes tales como etílico, n-propílico o isopropílico, alcohol butílico o mezclas de los mismos) y, opcionalmente, otros componentes tales como los agentes antibacterianos . Los excipientes pueden ser mezclados con la metaloproteinasa en un tiempo adecuado antes a la liofilización. El tiempo tomado para mezclar los excipientes y metaloproteinasa debe ser por un periodo suficiente para preparar una mezcla adecuada; preferentemente, el mezclado será realizado de aproximadamente uno a aproximadamente treinta minutos. Después de esto, la metaloproteinasa formulada puede ser liofilizada, almacenada y reconstituida usando métodos estándar; véase Pikal, supra. Las condiciones específicas bajo las cuales se seca por congelamiento y reconstituye la fibrolasa o NAT no son particularmente críticas, con la condición de que las condiciones seleccionadas no degraden la metaloproteinasa y no sean nocivas para el estabilizante. Un ciclo de liofilización preferido comprende congelar la composición a -40 °C, templar la muestra congelada a -12°C, y realizar el secado primario en 30 °C a -35 °C por veinte a cincuenta horas y secado secundario en 20°C por veinte a cuarenta horas. Generalmente, la composición reconstituida será usada pronto después de la reconstitución. Tanto el NAT y la fibrolasa son suministrados mejor localmente al sitio del coágulo para tratamiento más efectivo. Como la fibrolasa, el NAT se une covalentemente por 5 la a2 macroglobulina en la circulación general. Mientras que forma complejo con la a2 macroglobulina, ni la fibrolasa ni NAT pueden entrar al substrato objetivo (es decir, fibrina o fibrinógeno) y son bastante inefectivos a menos que y hasta que los niveles innatos máximos de la a2 macroglobulina estén 10 excedidos. De esta forma, se prefiere que las composiciones de esta invención sean administradas directamente al coágulo sanguíneo via cateterización intraarterial o intravenosa. Descripción de las modalidades especificas Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la 15 presente invención. Se produce NAT recombinante (SEQ ID NO: 1) usado en los Ejemplos 1-3 por la expresión en P. pastoris . Pueden ser encontrados los detalles con respecto a un sistema de expresión adecuado y método en Stroman et al., Lair et al., 20 Cregg et al. y patentes de Cregg referidas anteriormente. Todos los químicos son tanto grado analítico o USP. Ejemplo 1 Preparación de la composición liquida congelada Se prepara una solución acuosa la cual contiene 100
mM de ácido cítrico, 0.01 mM de acetato de calcio y 0.1 mM de sulfato de zinc por mezcla de los ingredientes, con el pH ajustado a 7.4. Una solución que contiene NAT es intercambiada con amortiguador en la solución por diálisis (alternativamente, puede ser usada la ultracentrifugación) . La solución de NAT resultante es concentrada a 10 mg/ml y se congela para almacenamiento en una temperatura de -30 °C hasta que esté lista para uso. Ejemplo 2 Preparación de la composición liofilizada Preparación de la composición liofilizada. Se prepara una solución acuosa que contiene 5 mM de Tris, 20 mM de ácido cítrico, 5% (p/v) de manitol, 0.5% (p/v) de sacarosa y 0.1 mM de sulfato de zinc por mezcla de los ingredientes, con el pH ajustado a 8.0. Una solución que contiene NAT es intercambiada por amortiguador en la solución de composición por diálisis (puede ser usada en su lugar la ultracentrifugación) . Se concentra la solución de NAT resultante a 10 a 12 mg/ml. Se agrega Tween 80 a una concentración final de 0.01% (p/v). Se almacena la solución a una temperatura de 2-8 °C hasta que esté lista para liofilización. Ciclo de secado por congelamiento para el producto liofilizado. Se congela primero la composición preparada
l«Jto anteriormente en una temperatura de -40°C en el liofilizador. Se fija la temperatura de templado a -12 °C; la temperatura de secado primario se fija en -30°C; y la temperatura del secado secundario se fija a 20°C. El pastel secado por congelamiento resultante muestra buena morfología y contiene menos de 3% de agua, como se detecta por el método de titulación de Karl Fischer; véase Fischer, Angew Chemie, Volumen 48, página 394 (1935) . Después de que termina el proceso de secado por congelamiento, se coloca el pastel liofilizado en viales y las tapas de caucho se sellan completamente bajo vacío por presionar hacia abajo las cubiertas de metal superior en el liofilizador. Los viales se pliegan entonces con sellos de aluminio de presión de 13 mm y se colocan en incubadores fijados a diferentes temperaturas. Ejemplo 3 Análisis de muestras liofilizadas reconstituidas Análisis de puntos de tiempo de muestreo. Se extraen viales de muestra a partir de los incubadores en intervalos de tiempo predeterminado para el análisis de puntos de tiempo. El pastel de muestra liofilizado es primero reconstituido por 0.9 ml de agua estéril, es decir, "agua para inyección" (McGaw Inc., Irvine, CA) . Se examina visualmente la claridad de las soluciones de muestra reconstituidas. Se analiza la solución filtrada por HPLC, espectroscopia de UV-Vis y actividad enzimática con el fin de cuantificar el NAT soluble restante en estas muestras liofilizadas . En base a los análisis anteriores, se recupera más del 90% de NAT después de la reconstitución del producto liofilizado. Absorbencia UV/Vis . Se carga 150-200 µl de solución de NAT en una ultra microcelda de 1 cm de longitud de parche suprasil de vidrio de cuarzo. Se mide la absorbencia UV/Vis en un espectrofotómetro de arreglo de diodos HP 8452A (Hewlett-Packard Co., Wilmington, DE). Se determinan las concentraciones de NAT usando A°'1%=1.05 a 280 nm, en base al cálculo a partir de la composición de aminoácidos; para referencia, véase Edelhoch, Biochemistry, volumen 6, páginas 1948-1954 (1967) . Después de la rehidratación del producto liofilizado, no se observa turbidez detectable cuando se mide la absorbencia en 350 nanómetros (nm) . Cromatografia de líquidos de alta resolución. Los análisis de HPLC de muestras de NAT son realizados usando un sistema de cromatografía de líquidos HP 1050 equipado con un Chemstation HP 3D para adquisición de datos (Hewlett-Packard Co.). Se detectan especies de NAT por absorbencia en 280 nm y 214 nm usando un detector de arreglo de diodos HP. Para la HPLC de fase inversa (RP-HPLC) , se inyectan
I-A í. ?? las muestras en una columna Zorbax 300SB-C8 (4.6 X 250 mm) (Hewlett-Packard Co.) en una fase móvil que consiste de 51.5% de amortiguador (2% de isopropanol, 0.1% TFA) y 48.5% de amortiguador B (90% acetonitrilo, 2% isopropanol, 0.1% TFA) en una velocidad de flujo de 0.6 ml/min. Se mantiene el amortiguador B por seis minutos y después se incrementa en rampas a 51% sobre veinte minutos. Se mantiene esta concentración por un minuto, seguido por una rampa de ocho minutos y se mantiene cinco minutos en 90%. Finalmente, se hace una rampa de regreso del amortiguador B a 48.5% sobre un periodo de tres minutos. La recuperación del NAT después de la liofilización como se detecta por este método es mayor de 92%. Para la HPLC de intercambio de iones (IEX-HPLC) , se inyectan las muestras en una columna Tosohaas DEAE-5PW (7.5 x 75 mm) (Tosohaas, Montgomeryville, Alabama) en una fase móvil que consiste de 90% amortiguador A (Tris 20 mM, pH 8.5) y 10% amortiguador B (Tris 20 mM, NaCl 250 mM, pH 8.5) en una velocidad de flujo de 0.5 ml/min. Después se aplica un gradiente, incrementando de 10% del amortiguador B a 75% del amortiguador B en 20 minutos, después de 75% de B a 90% del amortiguador B en un minuto. Se mantiene entonces el amortiguador B por cinco minutos, seguido por una rampa de 10% de amortiguador B en cuatro minutos. La recuperación de
l*i*A.?«? ?A yitA** t-^ W¿tJMj"1- ' -"" " NAT después de la liofilización como se detecta por este método es mayor de 90%. Para la HPLC de exclusión de tamaño (SEC-HPLC) , se cargan las muestras en una columna Tosohaas G-2000SWXL (300 x 7.8 mm) . Se aplica la elusión isocrática en una velocidad de flujo de 0.8 ml/min usando un amortiguador que contiene fosfato de sodio 15 mM, pH 7.0, y cloruro de sodio 0.140 M. La recuperación de NAT después de la liofilización como se detecta por este método es mayor de 95%. Bioensayo. Se tamizan las muestras para actividad contra los coágulos de fibrina. Se cargan alícuotas pequeñas de una dilución en serie de NAT en el intervalo de 0.01 a 1.0 mg/ml en los coágulos de fibrina preformados en placas de 96 pozos. Se incuban las muestras por dieciocho horas, y se cuantifica la lisis del coágulo por absorbencia en 500 nm. Se compara una gráfica de absorbencia contra concentración de NAT para varias formulaciones con un estándar de NAT preparado para actividad relativa. No hay diferencia medible en la actividad fibrinolítica del NAT después de la liofilización, con relación a la muestra de control (no liofilizada) . Se obtienen resultados de prueba similares con la composición líquida congelada también, después de que la última se descongela en 4°C y se prueba usando estos mismos protocolos . La invención mencionada anteriormente ha sido descrita en algún detalle para propósitos de claridad y entendimiento. Será también obvio que pueden hacerse varias otras combinaciones en forma y detalle sin alejarse del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones anexas. Ejemplo 4 Se repiten los procedimientos de los Ejemplos 1 y 2 con fibrolasa recombinante en lugar de NAT para producir composiciones farmacéuticas líquidas congeladas y liofilizadas similares.
ENLISTADO DE SECUENCIA <110> Amgen Inc. <120> COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS DE AGENTE FIBRINOLITICO <130> A-578 <140> N/A <141> 1999-10-01 <160> 6 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 201 <212> PRT <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: NAT (análogo de la fibrolasa de Agkistrodon Contortrix) <400> 1 Ser Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val lie Val Ala Asp His Arg 1 5 10 15 Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys lie Arg Gln Trp Val 20 25 30 His Gln lie Val Asn Thr lie Asn Glu lie Tyr Arg Pro Leu Asn lie 35 40 45 Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu lie Trp Ser Asn Gln Asp Leu lie 50 55 60
Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly Asn Trp
65 70 75 80
Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala Gln Leu 85 90 95 Leu Thr Ala lie Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala Tyr Val 100 105 110 Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val lie Gln Asp His 115 120 125 Ser Ala lie Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu Leu Gly 130 135 140 His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys Gly Ala
145 150 155 160
Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser Lys Leu 165 170 175 Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr Val Asn 180 185 190 Asn Pro Gln Cys lie Leu Asn Lys Pro 195 200 <210> 2 <211> 603 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: codifica NAT
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(análogo de la fibrolasa) <400> 2 tctttcccac aaagatacgt acagctggtt atcgttgctg accaccgtat gaacactaaa 60 tacaacggtg actctgacaa aatccgtcaa tgggtgcacc aaatcgtcaa caccattaac 120 gaaatctaca gaccactgaa catccaattc actttggttg gtttggaaat ctggtccaac 180 caagatttga tcaccgttac ctctgtatcc cacgacactc tggcatcctt cggtaactgg 240 cgtgaaaccg acctgctgcg tcgccaacgt catgataacg ctcaactgct gaccgctatc 300 gacttcgacg gtgatactgt tggtctggct tacgttggtg gcatgtgtca actgaaacat 360 tctaccggcg ttatccagga ccactccgct attaacctgc tggttgctct gaccatggca 420 cacgaactgg gtcataacct gggtatgaac cacgatggca accagtgtca ctgcggtgca 480 aactcctgtg ttatggctgc tatgctgtcc gatcaaccat ccaaactgtt ctccgactgc 540 tctaagaaag actaccagac cttcctgacc gttaacaacc cgcagtgtat cctgaacaaa 600 ccg 603
<210> 3 <211> 203 <212> PRT <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> fibrolasa nativa de Agkistrodon Contortrix <400> 3 Gln Gln Arg Phe Pro Gln Arg Tyr Val Gln Leu Val He Val Ala Asp
1 5 10 15
His Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asn Gly Asp Ser Asp Lys He Arg Gln
20 25 30 Trp Val His Gln He Val Asn Thr He Asn Glu He Tyr Arg Pro Leu
35 40 45 Asn He Gln Phe Thr Leu Val Gly Leu Glu He Trp Ser Asn Gln Asp
50 55 60 Leu He Thr Val Thr Ser Val Ser His Asp Thr Leu Ala Ser Phe Gly 65 70 75 80 Asn Trp Arg Glu Thr Asp Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Asp Asn Ala 85 90 95 Gln Leu Leu Thr Ala He Asp Phe Asp Gly Asp Thr Val Gly Leu Ala 100 105 110 Tyr Val Gly Gly Met Cys Gln Leu Lys His Ser Thr Gly Val He Gln 115 120 125 Asp His Ser Ala He Asn Leu Leu Val Ala Leu Thr Met Ala His Glu
130 135 140 Leu Gly His Asn Leu Gly Met Asn His Asp Gly Asn Gln Cys His Cys 145 150 155 160
Gly Ala Asn Ser Cys Val Met Ala Ala Met Leu Ser Asp Gln Pro Ser 165 170 175 Lys Leu Phe Ser Asp Cys Ser Lys Lys Asp Tyr Gln Thr Phe Leu Thr 180 185 190 Val Asn Asn Pro Gln Cys He Leu Asn Lys Pro 195 200 <210> 4 <211> 609 <212> DNA <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> codifica la fibrolasa nativa de Agkistrodon Contortrix) <400> 4 ce.acaaagat tcccacaaag atacgtacag ctggttatcg ttgctgacca ccgtatgaac 60 actaaataca acggtgactc tgacaaaatc cgtcaatggg tgcaccaaat cgtcaacacc 120 at aacgaaa tctacagacc actgaacatc caattcactt tggttggttt ggaaatctgg 180 tccaaccaag atttgatcac cgttacttct gtatcccacg acactctggc atccttcggt 240 aectggcgtg aaaccgacct gctgcgtcgc caacgtcatg ataacgctca actgctgacc 300 gctatcgact tcgacggtga tactgttggt ctggcttacg ttggtggcat gtgtcaactg 360 aaacattcta ctggtgttat ccaggaccac tccgctatta acctgctggt tgctctgacc 420 atggcacacg aac gggtca taacctgggt atgaaccacg atggcaacca gtgtcactgc 480 gc gcaaact cctgtgttat ggctgctatg ctgtccgatc aaccatccaa actgttctcc 540 gectgctcta agaaagacta ccagaccttc ctgaccgtta acaacccgca gtgtatcctg 600 aacaaaccg 609
<210> 5 <211> 1392 <212> ADN <213> Agkistrodon contortrix <220> <223> fibrolasa nativa de Agkistrodon Contortrix) <400> 5 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tc ctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300 gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tg caacca 360 aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420 ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480 ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540 gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600 aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660 gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720 acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780 agacaacaaa gattcccaca aagatacgta cagctggtta tcgttgctga ccaccgtatg 840 aacactaaat acaacggtga ctctgacaaa atccgtcaat gggtgcacca aatcgtcaac 900 accattaacg aaatctacag accactgaac atccaattca ctttggttgg tttggaaatc 960 tggtccaacc aagatttgat caccgttact tctgtatccc acgacactct ggcatccttc 1020 ggtaactggc gtgaaaccga cctgctgcgt cgccaacgtc atgataacgc tcaactgctg 1080 accgctaccg acttcgacgg tgatactgtt ggtctggctt acgttggtgg catgtgtcaa 1140 ctgaaacatt ctactggtgt tatccaggac cactccgcta ttaacctgct ggttgctctg 1200 accatggcac acgaactggg tcataacctg ggtatgaacc acgatggcaa ccagtgtcac 1260 tgcggtgcaa actcctgtgt tatggctgct atgctgtccg atcaaccatc caaactgttc 1320 tccgactgct ctaagaaaga ctaccagacc ttcctgaccg ttaacaaccc gcagtgtatc 1380 ctgaacaaac cg 1392
tatA]tAi. ¡? .i A. *?*+ , , .t-AÍ-kyi..
<210> 6 <211> 1386 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: proNAT (análogo de la fibrolasa de Agkistrodon Contortrix) <400> 6 atgagatttc cttcaatttt tactgctgtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60 ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120 tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180 aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240 tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttct tctattatct tggaatctgg taacgttaac 300 gattacgaag ttgtttatcc aagaaaggtc actccagttc ctaggggtgc tgttcaacca 360 aagtacgaag atgccatgca atacgaattc aaggttaaca gtgaaccagt tgtcttgcac 420 ttggaaaaaa acaaaggttt gttctctgaa gattactctg aaactcatta ctccccagat 480 ggtagagaaa ttactactta cccattgggt gaagatcact gttactacca tggtagaatc 540 gaaaacgatg ctgactccac tgcttctatc tctgcttgta acggtttgaa gggtcatttc 600 aagttgcaag gtgaaatgta cttgattgaa ccattggaat tgtccgactc tgaagcccat 660 gctgtctaca agtacgaaaa cgtcgaaaag gaagatgaag ccccaaagat gtgtggtgtt 720 acccaaaact gggaatcata tgaaccaatc aagaaggcct tccaattaaa cttgactaag 780 agatctttcc cacaaagata cgtacagctg gttatcgttg ctgaccaccg tatgaacact 840 aaatacaacg gtgactctga caaaatccgt caatgggtgc accaaatcgt caacaccatt 900 aacgaaatct acagaccact gaacatccaa ttcactttgg ttggtttgga aatctggtcc 960 aaccaagatt tgatcaccgt tacttctgta tcccacgaca ctctggcatc cttcggtaac 1020 tggcgtgaaa ccgacc gc gcgtcgccaa cgtcatgata acgctcaact gctgaccgct 1080 atcgacttcg acggtgatac tgttggtctg gcttacgttg gtggcatgtg tcaactgaaa 1140 cattctactg gtgttatcca ggaccactcc gctattaacc tgctggttgc tctgaccatg 1200 gcacacgaac tgggtcataa cctgggtatg aaccacgatg gcaaccagtg tcactgcggt 1260 gcaaactcct gtgttatggc tgctatgctg tccgatcaac catccaaact gttctccgac 1320 gctc aaga aagactacca gaccttcctg accgttaaca acccgcagtg tatcctgaac 1380 aaaccg 1386
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
tal.L.i.A?.at A.? .AíALií..y. ... y.yíyy.¿c- ... . y?¡ &. i iA,?yi