CN102000022A - 注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂及其制备方法,它是由重组双功能纤溶酶原液和甘露醇、Tris缓冲液、吐温80、氯化锌和无菌注射水配制而成。将甘露醇、Tris缓冲液、吐温80和氯化锌分别用注射水配制成稀释液,再将重组双功能纤溶酶原液调整至浓度100mg/ml;将其按比例混合后用微孔滤膜过滤,分装成瓶,冷冻干燥后即成为粉块状成品制剂。该成品制剂在2-8℃条件下保存,其活性成分的保存期可达到30个月。本发明的优点在于性能稳定,同时具有溶栓和抑制血小板凝集双重功能。在55℃下加速3个月、37℃下加速6个月和室温下能长期保存,纤溶酶含量、溶解度保持基本不变,无明显降解,活性保持80%以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物制药领域,尤其是涉及一种注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂及其制备方法。
背景技术
Fibrolase是来自美国南方铜头蝮蛇(Agkistrodon contortrix
contortrix)的一种锌金属蛋白酶,具有纤溶活性,无出血活性。是一条由203个氨基酸残基组成的多肽链,分子量为23kD,N-端为环化的谷丙酰胺残基。1mol Fibrolase蛋白中结合1mol锌原子,失去锌将会导致其快速失活(Ahmed NK,et al.Haemostasis.1990,20(3):147-154)。
Fibrolase能特异性的降解纤维蛋白原纤维蛋白(原),使之成为45kDa和22.5kDa碎片。研究表明,Fibrolase的溶栓机制与现在临床上应用的溶剂t-PA和链激酶等完全不同,它直接作用于血栓,专一地裂解纤维蛋白(原)Aα-链的lys413-leu414键,因此也不受丝氨酸蛋白酶的抑制(Ahmed NK,et al.Haemostasis,1990,20(6):334-340)。决定其裂解位点的是序列决定性,而非键决定性,至少与lys413-leu414周围的八个氨基酸顺序有关。另外Fibrolase对纤溶酶原无活化作用,也不水解其它凝血因子及血小板膜。所以Fibrolase是一种比血纤溶酶底物特异性更专一的纤溶酶。
Fibrolase无论在体内还是体外,均能直接溶解纤维蛋白凝块。Guan等应用动物静脉血栓模型对Fibrolase的溶栓活力进行了研究,注射Fibrolase的6只兔子髂静脉中的48h老龄血块全部被溶解,动物全部存活,副反应很少(Guan AL,et al.Arch Biochem Biophys,1991,289(2):197-207)。
在凝血过程中,血小板粘附和聚集是一个重要步骤,而含RGD序列的整合素受体配基(纤维蛋白原)同其受体(GPIIbIIIa)的作用,又是血小板粘附所必不可少,而纤维蛋白原通过其γ链C端的RGD序列与GPIIbIIIa等受体相互识别并发挥其功能的。在发现具有RGD序列的去整合素能与血小板糖蛋白GPIIbIIIa结合、有效抑制血小板聚集后,为了更好的研究RGD序列的活性构象,人们合成了各种的含RGD序列的小肽,如RGDS、RGDW、GRGDS等。它们均具有抑制纤维蛋白原与血小板的结合和抑制血栓形成等作用。但其抑制活性比含同样序列的天然蛋白要低的多,且半衰期较短。随后又有各种环化的RGD肽被相继合成,通过不同形式的环化后,可以提高其抑制活性。这可能是由于线状肽中的天冬氨酸(Asp)容易被降解,而环化肽的刚性保证了天冬氨酸(Asp)的稳定性;环化可以束缚含RGD序列的片段,以形成局域构象,同时RGD残基形成一个突出的环状loop,这使它能够更容易插入到整合素GPIIbIIIa,所以具有比较强的抑制血小板聚集作用。
由于GPIIbIIIa在凝血过程中的作用,基于GPIIbIIIa的拮抗剂有可能成为治疗因不同病因导致的血栓疾病的有效药物。存在于纤维蛋白原(Fg)、纤维粘联蛋白等分子中的RGD肽序是GPⅡbⅢa结合基序,Fg与活化血小板的GPⅡbⅢa结合是血小板聚集的前提,因此外源RGD肽序通过与Fg竞争结合活化血小板表面的GPⅡbⅢa,可以抑制活化血小板聚集,从而抑制血栓的形成(Plow EF,et al.Biochem pharmacol,1987,36(23):4035-4041)。多个实验都表明,Fibrolase具有强烈而快速的纤溶活性且没有出血性,在体内和体外都能有效的溶解血栓,具有很好的应用前景,但却没有抗血小板凝集的功能,所以如果能通过一些手段引入这种性质,可能更有利于开发和利用。郭蔼光等在对纤溶酶fibrolase的结构与功能分析的基础上,通过计算机计算和结构预测,选取合适位点插入能竞争性地抑制纤维蛋白原与GPIIb-IIIa结合的RGD序列构建而成的双功能溶栓药物Bi-fibro通过大肠杆菌表达,包涵体复性和纯化后,得到了高纯度的目的蛋白,体外活性测定表明:双功能溶栓药物Bi-fibro在保留了fibrolase纤溶活力的同时,又具有了RGD 抗血小板聚集功能。但目前将此高纯度且具有溶栓和抑制血小板凝集双重功能的目的蛋白用在治疗血栓性疾病的药物组合物方面还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂,本发明还提供了该制剂的制备方法。
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂,它是由含有双功能纤溶酶RGD-Fibrolase的重组双功能纤溶酶原液以及辅料赋形剂、缓冲液、表面活性剂、稳定剂和无菌注射水配制而成;所述的赋形剂为甘露醇;所述的缓冲液为Tris缓冲液;所述的表面活性剂为吐温80;所述的稳定剂为氯化锌。
所述重组双功能纤溶酶原液由双功能纤溶酶RGD-Fibrolase通过基因工程方法在大肠杆菌或酵母等表达系统中表达,再经过离子交换、分子筛等进行纯化,并用分子筛脱盐后即可得到重组双功能纤溶酶原液。
本发明所述的注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂的制备方法,它包括下述步骤:
第一步,将辅料甘露醇赋形剂、Tris缓冲液、表面活性剂吐温80和氯化锌稳定剂分别用无菌注射水配制成稀释液备用,稀释后各辅料的浓度分别为赋形剂甘露醇20%、Tris溶液100mmol/L、氯化锌溶液50mmol/L、吐温80溶液1%;将重组双功能纤溶酶原液调整至浓度100mg/ml的溶液备用;
第二步,将第一步得到的稀释液按下述比例混合:依次在容器中加入50份甘露醇溶液、4份氯化锌溶液、40份Tris缓冲液和3份吐温80溶液,最后再加入重组双功能纤溶酶溶液40份,充分混合后用0.22um的微孔滤膜过滤,分装成瓶,冷冻干燥后即成为含水量不超过3%的粉块状成品制剂。
该成品制剂在2-8℃条件下保存,其活性成分的保存期可达到30个月。
本发明的优点在于性能稳定,可长期保存,同时具有溶栓和抑制血小板凝集双重功能。通过加速实验:本制剂在55℃下加速3个月、37℃下加速6个月和室温下能长期保存,且纤溶酶含量、溶解度保持基本不变,无明显降解,活性保持80%以上。使用前用注射水溶解即可。
所述双功能纤溶酶RGD-Fibrolase的氨基酸序列为:
EQRFPQRYVQLVIVADHRMNTKYNGDSDKIRQWVHQIVNTINEIYRPLNIQFTLVGLEIWSNQDLITVGPRGDWRMLGTLASFGNWRETDLLRRQRHDNAQLLTAIDFDGDTVGLAYVGGMCQLKHSTGVIQDHSAINLLVALTMAHELGHNLGMNHDGNQCHCGANSCVMAAMLSDQPSKLFSDCSKKDYQTFLTVNNPQCILNKP。
所述双功能纤溶酶RGD-Fibrolase的核苷酸序列为:
GAACAGCGTTTCCCGCAGCGTTACGTGCAGCTTGTGATCGTTGCGGATCACCGTATGAACACGAAATACAACGGTGATTCTGACAAAATCCGTCAATGGGTGCACCAGATTGTCAACACTATCAATGAAATTTACCGCCCTTTGAACATTCAGTTCACCTTAGTTGGCTTAGAAATTTGGTCCAACCAGGATTTGATTACCGTGGGACCAAGAGGTGATTGGAGAATGTTCGGTACTTTGGCCTCATTTGGTAACTGGCGTGAAACCGACTTGTTACGCCGCCAACGTCACGATAACGCCCAGTTATTAACGGCCATTGACTTTGATGGTGACACTGTAGGCTTGGCTTATGTGGGCGGTATGTGCCAGTTAAAGCACTCTACCGGTGTTATCCAGGATCATAGCGCAATCAATCTTTTGGTTGCACTTACAATGGCCCACGAGCTGGGTCATAACTTAGGCATGAATCACGATGGTAACCAGTGTCATTGCGGTGCTAACTCGTGCGTGATGGCCGCAATGCTAAGCGATCAACCTTCCAAATTATTCAGCGATTGTAGTAAGAAAGACTATCAGACGTTTCTTACCGTTAACAACCCACAATGCATTTTAAATAAA
CCG。
附图说明
图1是本发明制剂在2-8℃存储条件下的稳定性分析。
图2是本发明制剂在2-8℃存储条件下的生物活性分析。
具体实施方式
本发明所述的注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂,它是由含有双功能纤溶酶RGD-Fibrolase的重组双功能纤溶酶原液以及辅料甘露醇、Tris缓冲液、吐温80、氯化锌和无菌注射水配制而成。
本发明注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂的制备方法,它包括下述步骤:
一、配制母液
按重量体积比计,将辅料甘露醇赋形剂、Tris缓冲液、表面活性剂吐温80和氯化锌稳定剂分别用无菌注射水配制成稀释液备用,稀释后各辅料的浓度分别为赋形剂甘露醇20%、Tris溶液100mmol/L、氯化锌溶液50mmol/L、吐温80溶液1%;
二、配制重组双功能纤溶酶原液
将双功能纤溶酶RGD-Fibrolase通过基因工程的方法,在大肠杆菌或酵母等表达系统中表达。以大肠杆菌表达为例:(1)包涵体洗涤和溶解12000rpm离心1min收获菌体,菌液沉淀用1/5体积破菌缓冲液(20mmol/LTris•Cl,50mmol/LNaCl,PH7.5)重悬,采用超声裂解菌体,超声条件:宁波新芝超声细胞破碎仪,功率400W,超5秒,间隔5秒,重复100次。菌体充分破碎后离心,收集沉淀;将沉淀用包涵体洗涤液Ⅰ洗涤2次,再用包涵体洗涤液Ⅱ洗涤2次,每次10min;4℃,10000rpm离心15min,收集沉淀,最后用PH7.5的20mmol/L Tris•Cl再洗一次。2)包涵体溶解以1g包涵体加2ml超纯水的比例将包涵体均匀悬浮,分别取20ml不同的变性液,分别加入不同浓度的DTT、β-ME,再以100ml变性液加入1g包涵体的比例加入包涵体。分别于37℃水浴45min、2h,并不断搅拌,观察溶解现象。水浴完毕,室温、14000rpm,离心20min。测沉淀量,上清稀释10倍,测蛋白浓度。3)包涵体纯化和脱还原剂Superdex G-75柱(Φ10mm×400mm)用Buffer B缓冲液平衡后,将浓度约为10~20mg/mL的1mL变性蛋白液样品在4℃~20℃环境中过柱,用Buffer B洗脱,流速为0.5ml/min,收集的目标蛋白峰。(4)用恒流泵以20μL/min左右的恒定流速将2 ml变性液(含6 mol/L盐酸胍、20mmol/L
Tris)连续流加至100ml复性液Buffer A+1.5mol/L盐酸胍中,缓慢搅拌。流加结束后,在室温下继续缓慢搅拌24h。(5)离子交换纯化选用的缓冲液为Buffer C,选用1ml的Hi Trap Q Sepharose FF离子交换层析柱。层析柱先用Buffer C缓冲液平衡后,RGD-fibrolase复性溶液进样,目的蛋白挂在柱上后,用Buffer C平衡缓冲液洗至基线平,再用Buffer C淋洗10个柱体积,然后用10个柱体积进行线性梯度洗脱,缓冲液为Buffer D,梯度范围从0-100%,收集含正确折叠体的洗脱峰。再根据梯度结果确定阶跃洗脱条件,流速为1mL/min。(6)分子筛脱盐选用Superdex G-25柱(Φ10mm×400mm)脱盐,缓冲液为Buffer C,收集活性峰,得到重组双功能纤溶酶原液。同理,双功能纤溶酶RGD-Fibrolase也可以在酵母中表达、纯化得到其原液;
三、配制重组双功能纤溶酶混合液
将前述通过基因工程的方法,在大肠杆菌或酵母等表达系统中表达、纯化得到的重组双功能纤溶酶原液调整至浓度100mg/ml的溶液后备用;
将上述配制好的母液按下述比例混合:在容器中依次加入250ml甘露醇溶液、50ml氯化锌溶液、200ml Tris缓冲液和15ml吐温80溶液,最后再加入100mg/ml的重组双功能纤溶酶溶液200ml,充分混合;
四、定容
采用高效液相色谱测定上述溶液浓度,并校正溶液中重组双功能纤溶酶含量为20mg/ml并定容至1L;
五、分装、冻干
上述溶液经0.22um微孔滤膜除菌过滤后,分装于西林瓶中,每瓶分装1ml,加丁基胶塞,药液置于冻干箱内,温度下降到-40度,保持3-4小时,抽真空,温度升至-20度,保持6小时,再升至25度,保持6小时,轧盖即可。
本制剂成品为粉块状,含水量不超过3%。
使用前用注射水溶解即可。
用1ml注射用水溶解1瓶冻干制剂,其中重组双功能纤溶酶的质量浓度为10-30mg/ml;甘露醇的质量百分浓度为3%--8%;Tris缓冲液的浓度为10mmol/L-30 mmol/L(pH值为7.5—8.5);吐温80的质量百分浓度为0.01 %-0.02 %;氯化锌的浓度为0.1 mmol/L-2 mmol/L。
本发明所述重组双功能纤溶酶成品制剂的稳定性实验
通过加速实验来判断本制剂的稳定性:55℃下加速3个月、37℃下加速6个月和室温下能长期保存,通过SDS-PAGE等手段测定制剂中Bifibro蛋白含量、溶解度等指标,如图1所示,于0、4、8、12、16、20、24个月后进行稳定性分析,结论为双功能纤溶酶冻干制剂中纤溶酶含量、溶解度保持基本不变。
本发明所述重组双功能纤溶酶成品制剂的活性测定
(1)纤维平板法纤溶活性测定
取2 %琼脂溶液(pH7.4,含0.15mol/LNaCl,50mmo1/LTris•Cl)5m1,铺板前加入1ml含10单位凝血酶溶液,在45℃~50℃水浴中与0.4%纤维蛋白原溶液(pH7.4,含0.15mol/LNaCl,50mmo1/LTris•C1)5m1,混合后倒入无菌培养皿中,室温凝固。在平板上打直径3mm的小孔,每孔加样10μL,置37℃保温18h,取出观察结果。
血小板聚集实验使用富血浆血小板(PRP)和贫血浆血小板(PPP)进行测定。取新鲜的鼠血以9:1(v:v)加入3.8%的柠檬酸钠做抗凝剂,缓慢颠倒混均。800rpm离心10分钟,小心吸取上层富含血小板的悬液,即为PRP(Platelet Rich Plasma)。剩余部分再以3000rpm离心10分钟,吸出上层液体,即为PPP(Platelet Pool Plasma)。将300ul的PRP按100:1的比例与待测样品或对照缓冲液混合,在37℃保温3分钟,用PPP调节零点,加入诱导剂ADP(终浓度10umol/L),记录3分钟内的聚集波形,血小板聚集的抑制率=(对照的最大聚集—样品的最大聚集率)/对照的最大聚集率。
结论如图2所示:于0、4、8、12、16、20、24个月后进行活性分析(A、B、C、D、E、F、G分别为本组合存储0、4、8、12、16、20、24个月时的活性),活性保持80%以上。
Claims (3)
1.一种注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂,其特征在于:它是由含有双功能纤溶酶RGD-Fibrolase的重组双功能纤溶酶原液以及辅料赋形剂、缓冲液、表面活性剂、稳定剂和无菌注射水配制而成;所述的赋形剂为甘露醇;所述的缓冲液为Tris缓冲液;所述的表面活性剂为吐温80;所述的稳定剂为氯化锌。
2.根据权利要求1所述的注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂,其特征在于:所述重组双功能纤溶酶原液由双功能纤溶酶RGD-Fibrolase在大肠杆菌或酵母等表达系统中表达,再经过离子交换、分子筛等进行纯化,并用分子筛脱盐后即可得到重组双功能纤溶酶原液。
3.根据权利要求1或2所述的注射用重组双功能纤溶酶冻干制剂的制备方法,其特征在于:它包括下述步骤:
第一步,将辅料甘露醇赋形剂、Tris缓冲液、表面活性剂吐温80和氯化锌稳定剂分别用无菌注射水配制成稀释液备用,稀释后各辅料的浓度分别为赋形剂甘露醇20%、Tris溶液100mmol/L、氯化锌溶液50mmol/L、吐温80溶液1%;将重组双功能纤溶酶原液调整浓度至100mg/ml溶液备用;
第二步,将第一步得到的稀释液按下述比例混合:依次加入50份甘露醇溶液、4份氯化锌溶液、40份Tris缓冲液和3份吐温80溶液,最后再加入重组双功能纤溶酶溶液40份,充分混合后用0.22um的微孔滤膜过滤,分装成瓶,冷冻干燥后即成为含水量不超过3%的粉块状成品制剂。
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