CN102007140B

CN102007140B - 生物活性肽

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Publication number: CN102007140B
Application number: CN200980114502.4A
Authority: CN
Inventors: 弗里德里希·沙伊夫林格; 米夏埃尔·道卡尔
Original assignee: Baxter Healthcare SA; Baxter International Inc
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2008-04-17
Filing date: 2009-04-16
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2029-04-16
Also published as: US8822638B2; ES2594706T3; CN102007140A; MX2010011397A; TW201443085A; US10287319B2; EP3115370A1; TWI573806B; KR101606248B1; WO2009137256A1; HK1223946A1; EP2279200A1; EP3115370B1; US20120077749A1; JP5977223B2; AU2009244635B2; HK1154255A1; US20190225648A1; KR101434712B1; CA2721694C

Abstract

一种肽或者肽衍生物，其包含：(i)WDLYFEIVW(SEQ？ID？NO：1)或(ii)变体氨基酸序列，其包含在WDLYFEIVW(SEQ？ID？NO：1)中的一个、两个、三个或四个L-氨基酸取代；或(iii)所述(i)部分和(ii)部分之一的肽或者肽衍生物的反倒型变体，其中所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。一种肽或者肽衍生物，其包含：(i)氨基酸序列，其包含imfwydcye；或(ii)变体氨基酸序列，其包含在imfwydcye中的一个、两个、三个或四个、五个或六个氨基酸取代，其中所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。

Description

生物活性肽

本申请要求在2008年4月17日申请的美国临时申请No.61/009,326、以及在2008年11月10日申请的美国临时申请No.61/113,055的优先权，在此将其全部内容并入本文以作为参考。

技术领域

本发明涉及具有促凝血活性的低分子量肽，用于治疗FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的病人。

背景技术

凝血级联涉及一系列丝氨酸蛋白酶(酶原)和蛋白质辅助因子。当需要时，无活性的酶原前体被转化为活性形式，该形式因此转化级联中的下一个酶。凝血级联被分成三个不同的部分：内在路径(接触激活)、外在路径(组织因子)、以及普通路径。

在级联的内在路径中，血友病是最明显的出血病，其导致因子FIX(FIXa)/因子FVIII(FVIIIa)复合体(内在的Tenase复合体)产生的因子Xa不足，因而形成凝血不足。出血可能自然地发生或者在损伤后发生。

已知血友病是遗传性出血病，并且有两个形式的血友病--甲型血友病和乙型血友病。甲型血友病是FVIII不足造成的结果，并且特征为出血进入关节和肌肉。FVIII在血浆中以非常低的浓度进行循环，并且被非共价结合于冯维勒布兰特因子(vWF)上。在止血期间，FVIII被凝血酶活化，从vWF上分离，并且作为辅助因子用于通过增强激活速度进行的被激活的FIXa调节的FX活化。

FVIII少于1％正常值的病人被认为具有严重的血友病，FVIII为1-5％正常值的被认为中等严重的血友病，并且FVIII大于5％但小于40％正常值的病人被认为轻微的血友病。

现在，用于甲型血友病安排的治疗法的选择是使用不同的血浆来源浓缩物或者重组FVIII浓缩物的替代疗法。尽管包括溶剂-洗涤剂处理或者液相热处理的特定的病毒灭活步骤可以用来失活病毒，但在血浆衍生浓缩物中很少表征的试剂(例如朊病毒)的可能的传输仍然是本技术领域讨论的论点。

FVIII还被作为重组体蛋白进行合成，用于出血病症的治疗用途。这样的产品具有降低的病毒污染风险。在市场上有许多重组产物用于甲型血友病的治疗。这些浓缩物之一是FVIII组合物，其在CHO细胞中被生产出来，并且由巴克斯特保健公司制造。在细胞培养工艺、纯化、或该产品的最终配制中没有加入人或动物血浆蛋白。

虽然在过去的十年中FVIII的生产已经取得进展以确保纯度、效力和病毒安全性，但是仍有一些局限性。首先，严重甲型血友病病人频繁地受到抗FVIII抑制剂抗体形成的影响，致使治疗无效。

大约30％的严重HA(甲型血友病)病人发展了能够中和FVIII的同种抗体抑制剂(Hay，血友病.2006；12，增补版6：23-9；Peeriinck和Hermans，血友病.2006；12：579-90)。这些抑制剂典型地是免疫球蛋白G(IgG)，主要是lgG4亚类，其不会固定补体并且不会导致观察到循环免疫复合物的末端器官损伤。该抑制剂出现在幼小年龄(10岁大约50％)，主要出现在具有少于1％FVIII的病人身上。另外，可能会出现获得性血友病，该病是在没有FVIII不足历史的人体内发展的FVIII抗体抑制剂。该状况可能是突发性的(在人身上发生＞50岁)，其可能胶原血管病或者分娩前后期间与有关，或者其可能代表药物反应(例如，对于青霉素的反应)。出于临床目的，抗体反应等级能够通过功能性抑制剂测定的表现被定量，由该测定可以得到Bethesda单位(BU)抑制剂滴度。国际血栓和止血学会(ISTH)的高滴度应答定义是＞5BUs，并且其低滴度应答的定义是在0.5和5BUs之间。

已经试验了用大剂量人类FVIII压制抑制剂的尝试。而且，已经给药具有与人类FVlII抗体低交联反应性的猪FVIII。更频繁地，包括被活化的凝血酶原复合物浓缩物(例如FEIBA(FactorEightInhibitorBypassingAgent，FVIII抑制物旁路试剂)和重组的被活化的因子FVII(FVIIa)在内的FVIII旁路试剂也已被使用。

因为除了抑制剂发展的缺陷之外，治疗性的多肽药物比如FVIII也会被蛋白水解酶快速地降解，所以FVIII需要频繁地进行静脉内给药。考虑到各种FVIII产物在循环中的平均半衰期，这通常能够通过一周提供FVIII两次至三次而实现。因此对于门诊病人群体、尤其是小孩子而言，该治疗法是相当复杂。

因此，目前许多FVIII制造商的目标是开发下一代产品，其具有增强的药效和药物动力学特性，同时保持所有的其他产物特征。因为具有更长循环半衰期的改进的多肽药物将会降低必要的给药数量，多肽药物的化学修饰或酶修饰是实现该目标的优选方法之一。

一个这样的实施例是多肽药物的PEG化，用于保护并提高它们的药效和药物动力学分布型(Harris和Chess，NatRevDrugDiscov.2003；2：214-21)。US6,037,452描述了一种聚(烯化氧)-FVIII或者FIX结合物，其中蛋白质被通过所述FVIII的羰基共价结合于聚(烯化氧)。

即使这些方法降低了抑制剂发展，它们仍然不会废除对静脉注射给药的需要。为了废除上述讨论的血友病治疗的大多数缺陷，最精致的选择将是开发低分子量的化合物比如肽(肽类模拟物)，该化合物有能力改善凝血并且能够通过非静脉注射途径给药。尽管已经讨论了多年(例如Kaufman和Pipe，血友病.1998；4：370-9；Llung，Thromb.Haemost.1999；82：525-30)，但目前没有可购买的或者在临床中开发的这样的试剂。

在凝血中小肽应用的技术的当前状态作为文献记录的例如有下述公开：

DKLiles，DMMonroe和HRRoberts(1997).Blood.Vol90No.10增刊1,463a是一则海报摘要，公开了一种来自FVIII的肽698-712，其能够促进FIXa介导的FX在磷脂表面上活化。然而，在存在FVIIIa的条件下，该肽可抑制FIXa介导的FX在磷脂表面上活化。迄今为止，一直没有这些作者相关述评的公开来证实在这些海报摘要中公开的结果。

Blostein等(2000)，Biochemistry.39：12000-12006公开了两亲性α螺旋能够与FIXaGla结构域相互作用，并且在没有磷脂的情况下提高FX的活化。该肽通过模拟磷脂与氨基酸序列无关地显示其作用。没有建议在治疗中使用这些肽。在标准情况下，被活化的血小板提供支持凝血的脂质[0]表面。因为血小板被凝血酶活化，其在脉管损伤的位点被形成，凝血过程被限制在受损伤位点。极不期望给身体提供作为促凝血脂质的普通替代品的肽，因为该肽或许会引起系统凝血并且最终导致弥漫性血管内凝血(DIC)。因此，被Blostein描述的肽在治疗中不会被使用。

美国专利No.7,109,170和6,624,289公开了FIXa蛋白酶结构域的与FVIIIa相互作用的区域。该肽包含FIXa上的FVIIIa结合位点，并且抑制FIXa与FVIIIa的结合。然而，它们仅被用作用于抑制或者治疗血栓形成的抗凝血剂。

US20010014456A1公开了对于人类FVIII和FVIII样蛋白质的结合性分子。这些多肽结合FVIII和/或FVIII样多肽，并且可用于人类FVIII和/或FVIII样多肽的检测和由溶液比如血液或者条件培养基中纯化。

在美国专利No.7,033,590中，FIX/FIXa活化抗体和抗体衍生物被用于提高FIXa的酰胺水解活性，并且用于治疗凝血机能障碍比如甲型血友病和出血素质。

在美国专利No.7,084,109中，公开了FVIIa拮抗剂。这些拮抗剂是可抑制FVIIa活性的肽，并且是所述的可用于与溶解血栓疗法结合来抑制动脉血栓形成的肽。

在本说明书中的在前公开的文献的列表或讨论将不会必须地被认为是现有技术状态的文件或者是普通的常识。

本技术领域仍极大地需要具有促凝血活性的低分子量肽，用于治疗甲型血友病(FVIII不足)病人。本发明提供了新颖的具有促凝血活性的低分子量肽，其可以用于甲型血友病的非静脉注射治疗。本发明还提供了这些新颖的肽用于治疗FV、FVII、FX和/或FXI不足。

发明内容

本发明的第一个方面提供了一种肽或者肽衍生物，其包含：

(i)WDLYFEIVW(SEQIDNO：1)；或

(ii)变体氨基酸序列，其包含在WDLYFEIVW(SEQIDNO：1)中的一个、两个、三个或四个L-氨基酸取代；或

(iii)所述(i)部分和(ii)部分之一的肽或者肽衍生物的反倒型(retro-inverso)变体，

其中，所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。

因为避免引起疑义，序列WDLYFEIVW(SEQIDNO：1)可以通过使用三个字母的氨基酸代码被表示为L-氨基酸：Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu-Ile-Val-Trp。WDLYFEIVW(SEQIDNO：1)的反倒型变体是wviefyldw，并且包含D-型氨基酸。

本发明的第二个方面提供了一种肽或者肽衍生物，其包含：

(i)氨基酸序列，其包含imfwydcye；或

(ii)变体氨基酸序列，其包含在imfwydcye中的一个、两个、三个或四个、五个或六个氨基酸取代，

其中，所述肽或者肽衍生物具有促凝血活性。

为了避免引起疑义，序列cimfwydcye可以通过使用三个字母的氨基酸代码被表示为D-型氨基酸：ile-met-phe-trp-tyr-asp-cys-tyr-glu。

本发明的第三个方面提供了一种二元肽，其包含本发明的第一个方面或第二个方面的一种肽或者肽衍生物，所述一种肽或者肽衍生物结合于另一种本发明的第一个方面或第二个方面的肽或者肽衍生物，其中，两种肽/衍生物可以彼此相同或不同，并且其中该二元肽具有促凝血活性。

本发明的第四个方面提供了一种药物组合物，其包含本发明的第一个方面或第二个方面的肽或者肽衍生物、或者本发明的第三个方面的二元肽。

本发明的第五个方面提供了一种本发明的第一个方面或第二个方面的肽或者肽衍生物、或者本发明的第三个方面的二元肽用于治疗FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的病人的应用。

本发明的第六个方面提供了一种本发明的第一个方面或第二个方面的肽或者肽衍生物、或者本发明的第三个方面的二元肽在药物制造中的应用，所述药物用于治疗在病人中FV、FVII、FVIlI、FX和/或FXI的不足。

本发明的第七个方面提供一种治疗具有FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的病人的方法，包括给药治疗有效量的第四个方面的药物组合物。

本发明的第八个方面提供了一种具有促凝血活性的肽或者肽衍生物，其中，该肽或者肽衍生物不是FVIII或其片段，并且其中所述促凝血活性是25、50或100μM的肽、肽衍生物或者二元肽的凝血酶产生时间，相当于在限定内在凝血酶产生测定(DefinedIntrinsicThrombinGenerationAssay)中至少100mU/mLFVIII抑制物旁路活性(FEIBA)、优选至少300mU/mLFEIBA、更优选至少900mU/mLFEIBA、最优选至少1200mU/mLFEIBA的促凝血活性。

本发明的第九个方面提供了一种具有促凝血活性的肽或者肽衍生物，其中，该肽或者肽衍生物不是FVIII或其片段，并且其中所述促凝血活性是在限定内在凝血酶产生测定中，25、50或者100μM的肽、肽衍生物或者二元肽在30分钟内、优选在15分钟内、最优选在10分钟内出现峰值的凝血酶产生时间。

本发明的第十个方面提供了一种具有促凝血活性的肽或者肽衍生物，其中，该肽或者肽衍生物不是FVIII或其片段，并且其中当在重型人甲型血友病动物模型中给药时，该肽或者肽衍生物能够至少部分地弥补生物活性FVIII的缺失。

附图说明

图1：在限定二元路径凝血酶产生测定(definedDual-pathwaythrombingenerationassay)中血友病治疗证实了对凝血酶产生峰值以及凝血酶成峰时段的治疗性影响。

图2：A01对FVIII-/-小鼠出血模型的影响-失血。

具体实施方式

在本发明范畴内，术语“氨基酸”包括所有天然产生的L型α-氨基酸。在此使用天然产生的氨基酸的一个字母和三个字母的缩写(Lehninger，生物化学。第2版，Worth出版社，纽约，1995：71-92)。术语“氨基酸”也还包括天然产生氨基酸的立体异构体(例如D-型氨基酸)和修饰体、非蛋白(non-proteinogenic)氨基酸、以及模拟氨基酸的设计结构。

修饰的氨基酸和非蛋白氨基酸一般在Grant的《合成肽：使用指南》(牛津大学出版社，1992)中有描述。

通过导入非天然产生的各种氨基酸，或者通过在此讨论的氨基酸修饰，有可能提供例如改进的稳定性和溶解度、对蛋白酶降解的抗性、以及肽活性。

非蛋白氨基酸可以包括，但不限于：β-丙氨酸(β-Ala)、正缬氨酸(Nva)、正亮氨酸(Nle)、4-氨基丁酸(γ-Abu)、2-氨基异丁酸(Aib)、6-氨基己酸(ε-Ahx)、鸟氨酸(orn)、羟脯氨酸(Hyp)、肌氨酸、瓜氨酸、磺基丙氨酸(Coh)、以及环己基丙氨酸、甲硫氨酸亚砜(Meo)、甲硫氨酸砜(Moo)、高丝氨酸甲酯(Hsm)、炔丙基甘氨酸(Eag)、5-氟色氨酸(5Fw)、6-氟色氨酸(6Fw)、3′，4′-二甲氧苯基丙氨酸(Ear)、3′，4′-二氟苯丙氨酸(Dff)、4′-氟苯基-丙氨酸(Pff)、1-萘基-丙氨酸(1Ni)、1-甲基色氨酸(1Mw)、青霉胺(Pen)、高丝氨酸(HSe)。另外，这样的氨基酸可以包括但不限于：α-氨基异丁酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸(Phg)、苯并噻吩基丙氨酸(Bta)、L-高半胱氨酸(L-Hcys)、N-甲基-苯丙氨酸(NMF)、2-噻吩丙氨酸(Thi)、3，3-二苯基丙氨酸(Ebw)、高苯丙氨酸(Hfe)、s-苯甲基-L-半胱氨酸(Ece)或者环己基丙氨酸(Cha)。这些氨基酸及其他非蛋白原氨基酸可以作为D-型或L-型异构体存在。如果没有给出异构体的指示，则是指L-型异构体。

被设计成模拟氨基酸的结构是这样的化合物：其中氨基酸的氨基和/或羧基被另一种基团替代。非限制性的实施例是并入硫代酰胺、尿素、硫脲、酰基酰肼、酯、链烯烃、磺酰胺、磷酸酰胺、酮、醇类、硼酰胺、苯二氮及其他芳香或非芳香杂环(为了评述，参见M.A.Estiarte、D.H.Rich，《Burgers药物化学》第6版，第1卷，第4部分。JohnWiley&Sons出版社，纽约，2002)。假如这些结构被包含于肽衍生物中，它们通常是通过至少一种上述官能团代替酰胺键与肽衍生物的其余部分(therest)相连接。

对于术语“肽”，我们不仅包括其中氨基酸残基通过肽键(-CO-NH-)连接的分子，而且还包括其中肽键为反向的分子。“反向修饰的”肽是这样一种肽：其由其中氨基酸残基被沿与天然肽相反的方向组装的氨基酸组成，就这点而论，其是反向修饰。如果天然肽包含L-氨基酸，则“反向修饰”的肽将会也包含L-氨基酸。如果，如果天然肽包含D-型氨基酸，则“反向修饰”的肽将会也包含D-型氨基酸。反向肽含有NH-CO键而不是CO-NH肽键。“倒向修饰”肽是这样一种肽：其由其中氨基酸残基被沿着与天然肽相同的方向组装的氨基酸组成，就这点而论，该肽是倒向修饰，但是氨基酸的手性是倒置的。因此，如果天然肽包含L-氨基酸，则“倒向修饰”的肽将会包含D-型氨基酸。如果天然肽包含D-型氨基酸，则“倒向修饰”的肽将会包含L-型氨基酸。倒向肽仍然具有CO-NH肽键。“反倒型修饰”的肽指的是由这样的氨基酸残基组成的肽：其被相对于天然肽沿相反的方向组装并且具有倒置的手性，就这点而论，该肽被反倒型修饰。反倒型同功异质体具有反向末端和反方向的肽键(即NH-CO)，同时大致维持如同在天然肽序列中的侧链的拓扑学。Guichard等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91：9765-9769描述到，反倒型肽模拟了天然的L-型肽IRGERA、但不是D-型和反向肽的结构和抗原活性。这些反倒型拟肽可以使用本技术领域已知的方法制备，该方法比如是Meziere等(1997)在J.Immunol.159，3230-3237中描述的方法，现将其引入本发明作为参考。局部反倒型肽同功异质体是多肽，其中仅部分序列是反向的并且被用对映异构的氨基酸残基替代。用于制备这些同功异质体的方法在文献Pessi，A.，Pinori，M.，Verdini，A.S.和Viscomi，G.C.(1987)“含有反倒型肽键的肽的完全固相合成，使用交联肌氨酸基共聚物作为支持物”、欧洲专利97994-B中有描述。

通常，L-氨基酸通过使用大写体命名，而D-型氨基酸使用小写体命名。本发明的肽和肽衍生物按照它们的优选形式命名，但是并不限制它们为这些优选形式。本发明第一个方面的肽被指定为包含WDLYFEIVW(SEQIDNO：1)或其变体。本发明第一个方面的肽也可以是WDLYFEIVW(SEQIDNO：1)或其变体的反倒型变体，即wviefyldw或其变体。本发明第二个方面的肽被指定为包含cimfwydcye或其变体。

通常，如果氨基酸被通过肽键连接，则肽被表示为N-端氨基出现在左侧并且C-端羧基出现在右侧。根据本发明的肽和肽衍生物被用这样的方式表示。

“肽衍生物”含有一个以上氨基酸残基的修饰或者连接物基团或其他共价连接基团。

衍生物的例子包括：氨基末端或另一种游离氨基的N-酰基衍生物、羧基末端或另一种游离羧基或羟基的酯、羧基末端或另一种游离羧基的酰胺(通过与氨反应或与合适胺类反应而生产)、糖基化衍生物、羟基化衍生物、核苷酸基化衍生物、ADP-核糖基化衍生物、PEG化衍生物、磷酸化衍生物、结合于亲脂性部分的衍生物、以及结合于抗体或其他生物学配体的衍生物。在化学衍生物中还包括那些通过肽键-CO-NH-修饰例如通过还原成-CH₂-NH-或者烷基化成-CO-N(烷基)-而获得的衍生物。

优选的衍生物是C-端酰胺化。肽的C-端酰胺化除去了C-端的负电荷。具有C-端酰胺的肽衍生物用在C-端处“NH₂”表示，例如Ac-(乙酰)WDLYFEIW-NH₂(SEQIDNO：1)。另一种优选的衍生物是N-端乙酰化。这要除去N-端的正电荷。封闭C-端或N-端，比如通过C-端酰胺化或者N-端乙酰化，由于降低了对外部蛋白水解消化(exoproteolyticdigestion)的敏感性，所以可以改进蛋白水解稳定性。

合适的连接物包括柔韧的连接物4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺(Ttds)、甘氨酸、6-氨基己酸、β-丙氨酸、或者Ttds、甘氨酸、6-氨基己酸和β-丙氨酸的组合。

本发明的肽能够通过如下方法制备：化学合成、DNA重组技术、较大分子的生物化学法或酶法分裂、上述方法的组合，或者通过任何其他的方法制备。

肽(至少在氨基酸残基之间含有肽键的那些肽)可以通过下述文献和其中参照文献中描述的Fmoc策略的固相肽合成法合成：《Fmoc固相肽合成-实用的方法》。W.C.Chan，P.D.White编，牛津大学出版社，纽约，2000。通过9-芴基甲氧羰基(Fmoc)基团提供临时N-氨基保护。通过使用在N，N-二甲基甲酰胺中20％哌啶来影响该高度碱基不稳定的保护基的重复性切割。侧链官能团可以被保护为它们的丁基醚(对于丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸的情况)、丁基酯(就谷氨酸和天冬氨酸而言)、丁氧羰基衍生物(就赖氨酸和组氨酸而言)、三苯甲基衍生物(就半胱氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺而言)和4-甲氧基-2，3，6-三甲苯磺酰基衍生物(就精氨酸而言)。固相支持物是基于聚二甲基丙烯酰胺聚合物，该聚合物由三种单体组成：二甲基丙烯酰胺(骨架-单体)、二丙烯酰乙烯二胺(交联剂)和丙烯酰肌氨酸甲酯(功能化试剂)。使用的肽-树脂可裂解的连接试剂是酸不稳定性的4-羟甲基-苯氧基乙酸衍生物，或者在C-端酰胺的情况下是Rink-酰胺连接物。除天门冬酰胺和谷氨酰胺之外，所有氨基酸衍生物被加入作为它们的预成型对称的酸酐衍生物，天门冬酰胺和谷氨酰胺是通过使用反向N，N-二环己基-碳二亚胺/1-羟基苯并三唑介导的偶联工艺被加入的。所有偶联和去保护反应通过使用水合茚三酮、三硝基苯磺酸或者isotin测试步骤进行监控。一旦合成完成，通过用含有50％清除剂混合物的95％三氟乙酸处理，肽就从树脂支持物上解离，伴随除去侧链保护基。常用的清除剂是乙烷二硫醇、苯酚、苯甲醚和水，精确的选择取决于被合成肽的组分氨基酸。通过在真空下蒸发除去三氟乙酸，随后用二乙醚研制，得到粗肽。本发明的任何清除剂都可以通过简单的提取工艺被除去，水相冻干时得到不含清除剂的粗肽。用于肽合成的试剂一般地可以购自Calbiochem-Novabiochem(英国)有限公司，诺丁汉NG72QJ，英国。纯化可能会受到下述技术中的任何一个、或其组合的影响：比如，大小排阻色谱法、离子交换层析、亲和色谱法、差别溶解度法和(主要地)反相高效液相色谱法。通过使用薄层色层分析法、反相高效液相色谱法、酸水解后氨基酸分析并且通过快原子轰击(Fab)质谱分析，可以进行肽的分析。

也可能使用SPOT-合成法，其允许可设定位置，是在连续纤维素膜上肽的化学合成法(R.Frank，Tetrahedron.(1992)48，9217)。

作为固相肽合成技术的替换，也可以通过重组体蛋白表达或者体外翻译系统而产生肽(Sambrook等，《分子克隆：实验手册》。2001，第三版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)。当然，仅是肽含有通过天然产生的肽键连接的可被多核苷酸编码的天然产生的氨基酸残基。就固相肽合成技术而言这些方法是优选的，其中肽尤其是大肽，比如大于50个氨基酸、或者大于100个氨基酸。

一种“变体”氨基酸序列作为相对于本发明的第一个方面的限定，可以包含在WDLYFEIVW(SEQIDNO：1)中的一个、两个、三个或四个L-氨基酸取代。

优选地，变体氨基酸序列包含一种氨基酸序列，其包含X₁X₂X₃YX₄EX₅X₆X₇，其中X₁是W、L或P；X₂是D或S；X₃是L或F；X₄是F、Phg、L、Ebw、Pff、Thi、1Ni、Hfe、Ece或Cha；X₅是I或F；_X6是S、V或G；并且X₇是W或L(SEQIDNO：1)。

更优选地，变体氨基酸序列包含一种氨基酸序列，其包含X₁X₂X₃YX₄EX₅X₆X₇，其中X₁是W或L；X₂是D或S；X₃是L或F；X₄是F、Phg或L；X₅是I或F；X₆是S、V或G；并且X₇是W或L(SEQIDNO：1)。

一种“变体”氨基酸序列作为相对于本发明的第二个方面的限定，可以包含在imfwydcye中的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代。

优选地，在imfwydcye中的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个所述的取代是D-型氨基酸。

在该变体内部的任何取代可以是非保守型的或者保守型的。

对于术语“保守性取代”，我们是指在下组内部的取代：Val、Ile、Leu、Ala、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr、Gly、Ala；Lys、Arg、His；以及Phe、Tyr、Trp。

优选地，本发明第一个方面的肽或者肽衍生物包含RMEFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：2)或RMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：2)；或者一种变体氨基酸序列，其包含在RMEFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：2)或RMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：2)中的一个、两个、三个、四个、五个或六个氨基酸取代。

为了避免引起疑义，序列RMEFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：2)可以通过使用三个字母的氨基酸代码被表示为Arg-Met-Glu-Phe-Asp-Val-Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu-Ile-Val-Trp。RMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：2)可以通过使用三个字母的氨基酸代码被表示为Arg-Met-Lys-Phe-Asp-Val-Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu-Ile-Val-Trp。

更优选地，变体氨基酸序列包含一种氨基酸序列，其包含X₈X₉X₁₀FDVX₁X₂X₃YX₄EX₅X₆X₇，其中X₈是R或P；X₉是M、Nva、Moo、N、Nle、Meo、Q、Eag；X₁₀是E、K或D；X₁是W、L或P；X₂是D或S；X₃是L或F；X₄是F、Phg、L、Ebw、Pff、Thi、1Ni、Hfe、Ece、Cha；X₅是I或F；X₆是S、V或G；并且X₇是W或L(PEQIDNO：2)。

更优选地，变体氨基酸序列包含一种氨基酸序列，其包含X₈X₉X₁₀FDVX₁X₂X₃YX₄EX₅X₆X₇，其中X₈是R或P；X₉是M或Nva；X₁₀是E、K或D；X₁是W或L；X₂是D或S；X₃是L或F；X₄是F、Phg或L；X₅是I或F；X₆是S、V或G；并且X₇是W或L(SEQIDNO：2)。

适当地，本发明第一个方面的肽或者肽衍生物肽是在下表中所示的肽或者肽衍生物，或者包含、或者由在下表1至3中所示的肽或者肽衍生物的氨基酸序列组成：

表1：最优选的肽

	肽	序列
			SEQ ID NO：2	A01	Ac-RMKFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：2	A02	Ac-PMKFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：2	A03	Ac-RMDFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：2	A04	Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：1	A05	Ac-WDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：3	A06	Ac-WDLYFEIVWE
			SEQ ID NO：1	A07	Ac-WDLYFEIVW-ttds-E
SEQ ID NO：2	A08	ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH₂
			SEQ ID NO：4	A09	ERMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：5	A12	ERXEFDVWDLYFEIVW-NH₂ X是Nva
				A13	ttds-RMEFDVWDLYXEIVW-ttds-NH₂ X是Phg
SEQ ID NO：6	A14	Ac-WSLYFEIVWE
			SEQ ID NO：1	A15	Ac-WDLYFEISW-ttds-E
SEQ ID NO：2	A16	PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：6	A17	PEG5000-WSLYFEIVWE
SEQ ID NO：4	A18	PEG5000-ERMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：7	A19	Ac-VWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：8	A21	Ac-FDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：9	A24	EWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：1	A25	E-ttds-WDLYFEIVW-NH₂

	肽	序列
			SEQ ID NO：1	A26	Ac-WDLYFEIVW-ttds-E-NH₂
SEQ ID NO：2	A27	Ac-RMEFDVWDLYFEIVW
			SEQ ID NO：2	A28	RMEFDVWDLYFEIVW
SEQ ID NO：2	A29	Ac-K-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：10	A30	Ac-RMEFDVWDLYFEIVWK
SEQ ID NO：10	A31	Ac-RMEFDVWDLYFEIVWK-NH₂
			SEQ ID NO：2	A32	Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-K-NH₂
SEQ ID NO：11	A33	Ac-WDLYFEISWE
			SEQ ID NO：12	A34	Ac-WDLYLEIVWE
SEQ ID NO：13	A35	Ac-WDLYFEIVLE
			SEQ ID NO：1	A38	WDLYFEIVW
SEQ ID NO：2	A49	RMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：2	A50	Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH₂
SEQ ID NO：14	A52	Ac-KRMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：2	A53	K-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：2	A54	Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-K
			SEQ ID NO：1	A55	Ac-LDLYFEIVW-ttds-E
SEQ ID NO：1	A56	Ac-WDLYFEIVL-ttds-E
			SEQ ID NO：15	A57	E-RMEFDVLDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：16	A58	E-RMEFDVWDLYFEIVL-NH₂
			SEQ ID NO：17	A84	Ac-WDFYFEIVWE
SEQ ID NO：18	A85	Ac-WDLYFEFVWE
			SEQ ID NO：19	A86	Ac-LDLYFEIVWE
SEQ ID NO：20	A87	Ac-WDLYFEIGWE
			SEQ ID NO：21	A89	Ac-WDLYLEISLE
	A90	Ac-WDLYXEIVLE X是Phg
				A91	Ac-WSLYXEIVWE X是Phg
SEQ ID NO：22	A92	Ac-LDLYFEIVLE
			SEQ ID NO：23	A93	Ac-LDLYFEISLE
	A94	Ac-LDLYXEISWE X是Phg
			SEQ ID NO：24	A95	Ac-LSLYFEIVWE
SEQ ID NO：25	A96	Ac-LSLYFEIVLE
			SEQ ID NO：26	A97	Ac-LSLYFEISLE

表2：优选的肽

	肽	序列
			SEQ ID NO：1	A20	Ac-WDLYFEIVW-ttds-K
SEQ ID NO：27	A22	Ac-DVWDLYFEIVW-NH₂
				A23	Ac-wviefyldwvdfkmr-NH₂
SEQ ID NO：1	A37	Ac-WDLYFEIVW
			SEQ ID NO：1	A39	Ac-ttds-WDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：1	A40	ttds-WDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：1	A41	Ac-WDLYFEIVW-ttds-NH₂
SEQ ID NO：1	A42	Ac-ttds-WDLYFEIVW-ttds-NH₂
			SEQ ID NO：1	A43	ttds-WDLYFEIVW-ttds
SEQ ID NO：1	A44	ttds-WDLYFEIVW-ttds-NH₂
			SEQ ID NO：28	A45	Ac-KWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：1	A46	Ac-K-ttds-WDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：29	A47	Ac-WDLYFEIVWK
SEQ ID NO：29	A48	Ac-WDLYFEIVWK-NH₂
				A71	E-R(Moo)EFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：30	A73	E-RNEFDVWDLYFEIVW-NH₂
				A78	ttds-RMEFDVWDLY(Ebw)EIVW-ttds-NH₂
	A83	ttds-RMEFDVWDLY(Pff)EIVW-ttds-NH₂
			SEQ ID NO：31	A88	Ac-PDLYFEIVWE
SEQ ID NO：32	A98	Ac-LSLYLEIVLE
			SEQ ID NO：33	A99	Ac-LSLYLEISLE
	A100	Ac-LSLYXEIVLE X是Phg
			SEQ ID NO：1	A101	Ac-WDLYFEIVW-ttds-K-NH₂

表3：活性肽

	肽	序列
			SEQ ID NO：34	A10	E-PMKFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：2	A11	ttds-RMDFDVWDLYFEIVW-ttds-NH₂
			SEQ ID NO：2	A16	PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：1	A36	WDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：14	A51	KRMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：2	A59	ttds-PMKFDVWDLYFEIVW-ttds-NH₂

在上述各表中，-ttds-是4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺。“N”是天门冬酰胺。“NH₂”是C-端酰胺基。

优选地，本发明第一个方面的肽或者肽衍生物不包含、或者不由下列中所示的肽组成：

AMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：37)，CMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：38)，

DMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：39)，EMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：40)，

FMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：41)，GMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：42)，

HMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：43)，IMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：44)，

KMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：45)，LMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：46)，

MMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：47)，NMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：48)，

QMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：49)，SMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：50)，

TMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：51)，VMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：52)，

WMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：53)，YMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：54)，

RAKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：55)，RCKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：56)，

RDKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：57)，REKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：58)，

RFKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：59)，RGKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：60)，

RHKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：61)，RIKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：62)，

RKKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：63)，RLKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：64)，

RNKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：65)，RPKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：66)，

RQKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：67)，RRKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：68)，

RSKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：69)，RTKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：70)，

RVKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：71)，RWKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：72)，

RYKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：73)，RMAFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：74)，

RMCFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：75)，RMFFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：76)，

RMGFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：77)，RMHFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：78)，

RMIFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：79)，RMLFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：80)，

RMMFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：81)，RMNFDVWDLYFEiVW(SEQIDNO：82)，

RMPFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：83)，RMQFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：84)，

RMRFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：85)，RMSFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：86)，

RMTFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：87)，RMVFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：88)，

RMWFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：89)，RMYFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：90)，

RMKADVWDLYFEIVW(SEQIDNO：91)，RMKCDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：92)，

RMKDDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：93)，RMKEDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：94)，

RMKGDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：95)，RMKHDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：96)，

RMKIDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：97)，RMKKDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：98)，

RMKLDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：99)，RMKMDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：100)，

RMKNDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：101)，RMKPDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：102)，

RMKQDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：103)，RMKRDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：104)，

RMKSDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：105)，RMKTDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：106)，

RMKVDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：107)，RMKWDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：108)，

RMKYDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：109)，RMKFAVWDLYFEIVW(SEQIDNO：110)，

RMKFCVWDLYFEIVW(SEQIDNO：111)，RMKFEVWDLYFEIVW(SEQIDNO：112)，

RMKFFVWDLYFEIVW(SEQIDNO：113)，RMKFGVWDLYFEIVW(SEQIDNO：114)，

RMKFHVWDLYFEIVW(SEQIDNO：115)，RMKFIVWDLYFEIVW(SEQIDNO：116)，

RMKFKVWDLYFEIVW(SEQIDNO：117)，RMKFLVWDLYFEIVW(SEQIDNO：118)，

RMKFMVWDLYFEIVW(SEQIDNO：119)，RMKFNVWDLYFEIVW(SEQIDNO：120)，

RMKFPVWDLYFEIVW(SEQIDNO：121)，RMKFQVWDLYFEIVW(SEQIDNO：122)，

RMKFRVWDLYFEIVW(SEQIDNO：123)，RMKFSVWDLYFEIVW(SEQIDNO：124)，

RMKFTVWDLYFEIVW(SEQIDNO：125)，RMKFVVWDLYFEIVW(SEQIDNO：126)，

RMKFWVWDLYFEIVW(SEQIDNO：127)，RMKFYVWDLYFEIVW(SEQIDNO：128)，

RMKFDAWDLYFEIVW(SEQIDNO：129)，RMKFDCWDLYFEIVW(SEQIDNO：130)，

RMKFDDWDLYFEIVW(SEQIDNO：131)，RMKFDEWDLYFEIVW(SEQIDNO：132)，

RMKFDFWDLYFEIVW(SEQIDNO：133)，RMKFDGWDLYFEIVW(SEQIDNO：134)，

RMKFDHWDLYFEIVW(SEQIDNO：135)，RMKFDIWDLYFEIVW(SEQIDNO：136)，

RMKFDKWDLYFEiVW(SEQIDNO：137)，RMKFDLWDLYFEIVW(SEQIDNO：138)，

RMKFDMWDLYFEIVW(SEQIDNO：139)，RMKFDNWDLYFEIVW(SEQIDNO：140)，

RMKFDPWDLYFEIVW(SEQIDNO：141)，RMKFDQWDLYFEIVW(SEQIDNO：142)，

RMKFDRWDLYFEIVW(SEQIDNO：143)，RMKFDSWDLYFEIVW(SEQIDNO：144)，

RMKFDTWDLYFEIVW(SEQIDNO：145)，RMKFDWWDLYFEIVW(SEQIDNO：146)，

RMKFDYWDLYFEIVW(SEQIDNO：147)，RMKFDVADLYFEIVW(SEQIDNO：148)，

RMKFDVCDLYFEIVW(SEQIDNO：149)，RMKFDVDDLYFEIVW(SEQIDNO：150)，

RMKFDVEDLYFEIVW(SEQIDNO：151)，RMKFDVFDLYFEIVW(SEQIDNO：152)，

RMKFDVGDLYFEIVW(SEQIDNO：153)，RMKFDVHDLYFEIVW(SEQIDNO：154)，

RMKFDVIDLYFEIVW(SEQIDNO：155)，RMKFDVKDLYFEIVW(SEQIDNO：156)，

RMKFDVLDLYFEIVW(SEQIDNO：157)，RMKFDVMDLYFEIVW(SEQIDNO：158)，

RMKFDVNDLYFEIVW(SEQIDNO：159)，RMKFDVPDLYFEIVW(SEQIDNO：160)，

RMKFDVQDLYFEIVW(SEQIDNO：161)，RMKFDVRDLYFEIVW(SEQIDNO：162)，

RMKFDVSDLYFEIVW(SEQIDNO：163)，RMKFDVTDLYFEIVW(SEQIDNO：164)，

RMKFDWDLYFEIVW(SEQIDNO：165)，RMKFDVYDLYFEIVW(SEQIDNO：166)，

RMKFDVWALYFEIVW(SEQIDNO：167)，RMKFDVWCLYFEIVW(SEQIDNO：168)，

RMKFDVWELYFEIVW(SEQIDNO：169)，RMKFDVWFLYFEIVW(SEQIDNO：170)，

RMKFDVWGLYFEIVW(SEQIDNO：171)，RMKFDVWHLYFEIVW(SEQIDNO：172)，

RMKFDVWILYFEIVW(SEQIDNO：173)，RMKFDVWKLYFEIVW(SEQIDNO：174)，

RMKFDVWLLYFEIVW(SEQIDNO：175)，RMKFDVWMLYFEIVW(SEQIDNO：176)，

RMKFDVWNLYFEIVW(SEQIDNO：177)，RMKFDVWPLYFEIVW(SEQIDNO：178)，

RMKFDVWQLYFEIVW(SEQIDNO：179)，RMKFDVWRLYFEIVW(SEQIDNO：180)，

RMKFDVWSLYFEIVW(SEQIDNO：181)，RMKFDVWTLYFEIVW(SEQIDNO：182)，

RMKFDVWVLYFEIVW(SEQIDNO：183)，RMKFDVWWLYFEIVW(SEQIDNO：184)，

RMKFDVWYLYFEIVW(SEQIDNO：185)，RMKFDVWDAYFEIVW(SEQIDNO：186)，

RMKFDVWDCYFEIVW(SEQIDNO：187)，RMKFDVWDDYFEIVW(SEQIDNO：188)，

RMKFDVWDEYFEIVW(SEQIDNO：189)，RMKFDVWDFYFEIVW(SEQIDNO：190)，

RMKFDVWDGYFEIVW(SEQIDNO：191)，RMKFDVWDHYFEIVW(SEQIDNO：192)，

RMKFDVWDiYFEIVW(SEQIDNO：193)，RMKFDVWDKYFEIVW(SEQIDNO：194)，

RMKFDVWDMYFEIVW(SEQIDNO：195)，RMKFDVWDNYFEIVW(SEQIDNO：196)，

RMKFDVWDPYFEIVW(SEQIDNO：197)，RMKFDVWDQYFEIVW(SEQIDNO：198)，

RMKFDVWDRYFEIVW(SEQIDNO：199)，RMKFDVWDSYFEIVW(SEQIDNO：200)，

RMKFDVWDTYFEIVW(SEQIDNO：201)，RMKFDVWDVYFEIVW(SEQIDNO：202)，

RMKFDVWDWYFEIVW(SEQIDNO：203)，RMKFDVWDYYFEIVW(SEQIDNO：204)，

RMKFDVWDLAFEIVW(SEQIDNO：205)，RMKFDVWDLCFEIVW(SEQIDNO：206)，

RMKFDVWDLDFEIVW(SEQIDNO：207)，RMKFDVWDLEFEIVW(SEQIDNO：208)，

RMKFDVWDLFFEIVW(SEQIDNO：209)，RMKFDVWDLGFEIVW(SEQIDNO：210)，

RMKFDVWDLHFEIVW(SEQIDNO：211)，RMKFDVWDLIFEIVW(SEQIDNO：212)，

RMKFDVWDLKFEIVW(SEQIDNO：213)，RMKFDVWDLLFEIVW(SEQIDNO：214)，

RMKFDVWDLMFEIVW(SEQIDNO：215)，RMKFDVWDLNFEIVW(SEQIDNO：216)，

RMKFDVWDLPFEIVW(SEQIDNO：217)，RMKFDVWDLQFEIVW(SEQIDNO：218)，

RMKFDVWDLRFEIVW(SEQIDNO：219)，RMKFDVWDLSFEIVW(SEQIDNO：220)，

RMKFDVWDLTFEIVW(SEQIDNO：221)，RMKFDVWDLVFEIVW(SEQIDNO：222)，

RMKFDVWDLWFEIVW(SEQIDNO：223)，RMKFDVWDLYAEIVW(SEQIDNO：224)，

RMKFDVWDLYCEIVW(SEQIDNO：225)，RMKFDVWDLYDEIVW(SEQIDNO：226)，

RMKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：227)，RMKFDVWDLYGEIVW(SEQIDNO：228)，

RMKFDVWDLYHEIVW(SEQIDNO：229)，RMKFDVWDLYIEIVW(SEQIDNO：230)，

RMKFDVWDLYKEIVW(SEQIDNO：231)，RMKFDVWDLYLEIVW(SEQIDNO：232)，

RMKFDVWDLYMEIVW(SEQIDNO：233)，RMKFDVWDLYNEIVW(SEQIDNO：234)，

RMKFDVWDLYPEIVW(SEQIDNO：235)，RMKFDVWDLYQEIVW(SEQIDNO：236)，

RMKFDVWDLYREIVW(SEQIDNO：237)，RMKFDVWDLYSEIVW(SEQIDNO：238)，

RMKFDVWDLYTEIVW(SEQIDNO：239)，RMKFDVWDLYVEIVW(SEQIDNO：240)，

RMKFDVWDLYWEIVW(SEQIDNO：241)，RMKFDVWDLYYEIVW(SEQIDNO：242)，

RMKFDVWDLYFAIVW(SEQIDNO：243)，RMKFDVWDLYFCIVW(SEQIDNO：244)，

RMKFDVWDLYFDIVW(SEQIDNO：245)，RMKFDVWDLYFFIVW(SEQIDNO：246)，

RMKFDVWDLYFGIVW(SEQIDNO：247)，RMKFDVWDLYFHIVW(SEQIDNO：248)，

RMKFDVWDLYFIIVW(SEQIDNO：249)，RMKFDVWDLYFKIVW(SEQIDNO：250)，

RMKFDVWDLYFLIVW(SEQIDNO：251)，RMKFDVWDLYFMIVW(SEQIDNO：252)，

RMKFDVWDLYFNIVW(SEQIDNO：253)，RMKFDVWDLYFPIVW(SEQIDNO：254)，

RMKFDVWDLYFQIVW(SEQIDNO：255)，RMKFDVWDLYFRIVW(SEQIDNO：256)，

RMKFDVWDLYFSIVW(SEQIDNO：257)，RMKFDVWDLYFTIVW(SEQIDNO：258)，

RMKFDVWDLYFVIVW(SEQIDNO：259)，RMKFDVWDLYFWIVW(SEQIDNO：260)，

RMKFDVWDLYFYFVW(SEQIDNO：261)，RMKFDVWDLYFEAVW(SEQIDNO：262)，

RMKFDVWDLYFECVW(SEQIDNO：263)，RMKFDVWDLYFEDVW(SEQIDNO：264)，

RMKFDVWDLYFEEVW(SEQIDNO：265)，RMKFDVWDLYFEFVW(SEQIDNO：266)，

RMKFDVWDLYFEGVW(SEQIDNO：267)，RMKFDVWDLYFEHVW(SEQIDNO：268)，

RMKFDVWDLYFEKVW(SEQIDNO：269)，RMKFDVWDLYFELVW(SEQIDNO：270)，

RMKFDVWDLYFEMVW(SEQIDNO：271)，RMKFDVWDLYFENVW(SEQIDNO：272)，

RMKFDVWDLYFEPVW(SEQIDNO：273)，RMKFDVWDLYFEQVW(SEQIDNO：274)，

RMKFDVWDLYFERVW(SEQIDNO：275)，RMKFDVWDLYFESVW(SEQIDNO：276)，

RMKFDVWDLYFETVW(SEQIDNO：277)，RMKFDVWDLYFEVVW(SEQIDNO：278)，

RMKFDVWDLYFEWVW(SEQIDNO：279)，RMKFDVWDLYFEYVW(SEQIDNO：280)，

RMKFDVWDLYFEIAW(SEQIDNO：281)，RMKFDVWDLYFEICW(SEQIDNO：282)，

RMKFDVWDLYFEIDW(SEQIDNO：283)，RMKFDVWDLYFEIEW(SEQIDNO：284)，

RMKFDVWDLYFEIFW(SEQIDNO：285)，RMKFDVWDLYFEIGW(SEQIDNO：286)，

RMKFDVWDLYFEIHW(SEQIDNO：287)，RMKFDVWDLYFEIIW(SEQIDNO：288)，

RMKFDVWDLYFEIKW(SEQIDNO：289)，RMKFDVWDLYFEILW(SEQIDNO：290)，

RMKFDVWDLYFEIMW(SEQIDNO：291)，RMKFDVWDLYFEINW(SEQIDNO：292)，

RMKFDVWDLYFEIPW(SEQIDNO：293)，RMKFDVWDLYFEIQW(SEQIDNO：294)，

RMKFDVWDLYFEIRW(SEQIDNO：295)，RMKFDVWDLYFEISW(SEQIDNO：296)，

RMKFDVWDLYFEITW(SEQIDNO：297)，RMKFDVWDLYFEIWW(SEQIDNO：298)，

RMKFDVWDLYFEIYW(SEQIDNO：299)，RMKFDVWDLYFEIVA(SEQIDNO：300)，

RMKFDVWDLYFEIVC(SEQIDNO：301)，RMKFDVWDLYFEIVD(SEQIDNO：302)，

RMKFDVWDLYFEIVE(SEQIDNO：303)，RMKFDVWDLYFEIVF(SEQIDNO：304)，

RMKFDVWDLYFEIVG(SEQIDNO：305)，RMKFDVWDLYFEIVH(SEQIDNO：306)，

RMKFDVWDLYFEIVI(SEQIDNO：307)，RMKFDVWDLYFEIVK(SEQIDNO：308)，

RMKFDVWDLYFEIVL(SEQIDNO：309)，RMKFDVWDLYFEIVM(SEQIDNO：310)，

RMKFDVWDLYFEIVN(SEQIDNO：311)，RMKFDVWDLYFEIVP(SEQIDNO：312)，

RMKFDVWDLYFEIVQ(SEQIDNO：313)，RMKFDVWDLYFEIVR(SEQIDNO：314)，

RMKFDVWDLYFEIVS(SEQIDNO：315)，RMKFDVWDLYFEIVT(SEQIDNO：316)，

RMKFDVWDLYFEIW(SEQIDNO：317)，RMKFDVWDLYFEYFY(SEQIDNO：318)，

MKFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：319)，KFDVWDLYFEIVW(SEQIDNO：320).

优选地，本发明第二个方面的肽或者肽衍生物包含：

(i)氨基酸序列，其包含cimfwydcye；或

(ii)变体氨基酸序列，其包含在cimfwydcye中的一个、两个、三个或四个、五个、六个或七个氨基酸取代。

优选地，在cimfwydcye中的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个所述的取代是D-型氨基酸。

优选地，本发明第二个方面的肽或者肽衍生物包含：一种氨基酸序列，其包含X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀，其中X₁，当存在时，是c、s、y、i、D-Pen、C、t、D-Nva、D-Nle或k；X₂是i、y、w或d；X₃是c或m；X₄是f、t、v或c；X₅是w或c；X₆是y或c；X₇是d、e或f；X₈是c、e、f、y或d；X₉是y或w；并且X₁₀是e或i，其与cimfwydcye相比具有不超过七个氨基酸取代。

优选地，肽或者肽衍生物包含一种氨基酸序列，其包含X₁X₂X₃X₄wydX₈ye，其中，X₁是c、C、D-Pen或s；X₂是i、y或w；X₃是c或m；X₄是f、t、或v；并且X₈是c或e。

优选地，该肽或者肽衍生物包含一种氨基酸序列，其包含X₁X₂mX₄wydX₈ye，其中，X₁是c、C、或D-Pen；X₂是i或y；X₄是f、t、或v；并且X₈是c或e。

适当地，本发明第二个方面的肽或者肽衍生物是在下表中所示的肽或者肽衍生物，或者包含、或者由在下表4至6中所示的肽或者肽衍生物的氨基酸序列组成：

表4：最优选的肽

肽	序列
		B03	Ac-cimfwydeye-NH₂
B04	二硫-二聚(Ac-cimfwydeye-NH₂)₂
		B05	Ac-TTDS-(cymfwydc)-ye-NH₂
B06	K-TTDS-(cymfwydc)-ye-NH₂
		B14	Ac-(cimtwydc)-ye-NH₂
B15	Ac-(cimvwydc)-ye-NH₂
		B17	(cymfwydc)-ye
B18	Ac-(cymfwydc)-yeG-NH₂
		B19	Ac-(D-Pen)imfwydeye-NH₂
B23	O(CH₂-CH₂-O-CH₂-CO-imfwydeye-NH₂)₂
		B24	吡啶-3(SEQ ID NO：1)，5-(CO-imfwydeye-NH₂)₂
B34	H₂N-E-TTDS-(cymfwydc)-ye-NH₂
		B35	Ac-(cymfwydc)-yeK
B37	Ac-(cymfwydc)-ye-TTDS-K

在一种优选的实施方式中，肽B05、B06、B14、B15、B17、B18、B34、B35和B37是环状肽。

表5：优选的肽

肽	序列
		B07	Ac-simfwydeye-NH₂
B07	Ac-simfwydeye-NH₂
		B09	Ac-ydmcwcefyi-NH₂
B10	Ac-idmccyfywe-NH₂
		B16	Ac-cimfwyddye-NH₂
B26	Ac-(cymfwydc)-ye
		B27	Ac-(cymfwydc)-ye-TTDS-NH₂
B28	Ac-TTDS-(cymfwydc)-ye-TTDS-NH₂
		B30	K-(cymfwydc)-ye-NH₂
B31	Ac-K-(cymfwydc)-ye-NH₂
		B32	E-(cymfwydc)-ye-NH₂
B33	Ac-K-TTDS-(cymfwydc)-ye-NH₂
		B36	Ac-(cymfwydc)-yeK-NH₂
B38	Ac-(cymfwydc)-ye-TTDS-K-NH₂
		B39	Ac-(cymfwydc)-ye-TTDS-E-NH₂
B41	Ac-timfwydeye-NH₂

在一种优选的实施方式中，肽B26、B27、B28、B30、B31、B32、B33、B36、B38和B39是环状肽。

表6：活性肽

肽	序列
		B01	Ac-(cimfwydc)-ye-NH₂
B02	Ac-(cymfwydc)-ye-NH₂
		B11	Ac-(cwmfwydc)-ye-NH₂
B13	Ac-cicfwydcye-NH₂
		B20	Ac-(D-Nva)imfwydeye-NH₂
B21	Ac-(D-Nle)imfwydeye-NH₂
		B22	Ac-(Cys)imfwydeye-NH₂
B25	(cymfwydc)-ye-NH₂
		B29	TTDS-(cymfwydc)-ye-TTDS-NH₂
B40	Ac-kimfwydeye-NH₂

在一种优选的实施方式中，肽B01、B02、B11、B25和B29是环状肽。

在上述各表中，-TTDS-是4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺。“NH₂”是C-端酰胺基。

在上述各表中，B08被删除，因为其与B01相同。在上述各表中，B12被删除，因为其与B02相同。

feiycwdcym，ywcfiymced，dmwceyfcyi，ceicwyfdym，ccwfiemdyy，cemdwycyfi，aimfwydcye，

dimfwydcye，eimfwydcye，fimfwydcye，himfwydcye，iimfwydcye，kimfwydcye，Iimfwydcye，

mimfwydcye，nimfwydcye，pimfwydcye，qimfwydcye，rimfwydcye，simfwydcye，timfwydcye，

vimfwydcye，wimfwydcye，yimfwydcye，camfwydcye，ccmfwydsye，cdmfwydcye，cemfwydcye，

cfmfwydcye，chmfwydcye，ckmfwydcye，eimfwydcye，cmmfwydcye，cnmfwydcye，

cpmfwydcye，cqmfwydcye，eimfwydcye，csmfwydcye，ctmfwydcye，cvmfwydcye，ciafwydcye，

cidfwydcye，ciefwydcye，ciffwydcye，cihfwydcye，ciifwydcye，cikfwydcye，cilfwydcye，

cinfwydcye，cipfwydcye，ciqfwydcye，cirfwydeye，cisfwydcye，citfwydcye，civfwydcye，

ciwfwydcye，ciyfwydcye，cimawydcye，cimcwydsye，cimdwydcye，cimewydcye，cimhwydcye，

cimiwydcye，cimkwydcye，cimlwydcye，cimmwydcye，cimnwydcye，cimpwydcye，cimqwydcye，

cimrwydcye，cimswydcye，cimwwydcye，cimywydcye，cimfaydcye，cimfcydsye，cimfdydcye，

cimfeydcye，cimffydcye，cimfhydcye，cimfiydcye，cimfkydcye，cimflydcye，cimfmydcye，

cimfnydcye，cimfpydcye，cimfqydcye，cimfrydcye，cimfsydcye，cimftydcye，cimfvydcye，

cimfyydcye，cimfwadcye，cimfwcdsye，cimfwddcye，cimfwedcye，cimfwfdcye，cimfwhdcye，

cimfwidcye，cimfwkdcye，cimfwldcye，cimfwmdcye，cimfwndcye，cimfwpdcye，cimfwqdcye，

cimfwrdcye，cimfwsdcye，cimfwtdcye，cimfwvdcye，cimfwwdcye，cimfwyacye，cimfwycsye，

cimfwyecye，cimfwyfcye，cimfwyhcye，cimfwyicye，cimfwykcye，cimfwylcye，cimfwymcye，

cimfwyncye，cimfwypcye，cimfwyqcye，cimfwyrcye，cimfwyscye，cimfwytcye，cimfwyvcye，

cimfwywcye，cimfwyycye，cimfwydaye，cimfwydfye，cimfwydhye，cimfwydiye，cimfwydkye，

cimfwydlye，cimfwydmye，cimfwydnye，cimfwydpye，cimfwydqye，cimfwydrye，cimfwydsye，

cimfwydtye，cimfwydvye，cimfwydwye，cimfwydyye，cimfwydcae，cimfwydsce，cimfwydcde，

cimfwydcee，cimfwydcfe，cimfwydche，cimfwydcie，cimfwydcke，cimfwydcie，cimfwydcme，

cimfwydcne，cimfwydcpe，cimfwydcqe，cimfwydcre，cimfwydcse，cimfwydcte，cimfwydcve，

cimfwydcwe，cimfwydcya，cimfwydsye，cimfwydcyd，cimfwydcyf，cimfwydcyh，cimfwydcyi，

cimfwydcyk，cimfwydcyi，cimfwydcym，cimfwydcyn，cimfwydcyp，cimfwydcyq，cimfwydcyr，

cimfwydcys，cimfwydcyt，cimfwydcyv，cimfwydcyw，cimfwydcyy.

优选地，本发明第二个方面的肽或者肽衍生物是环状肽。第一个方面的肽或者肽衍生物也可以是环状的。

在此使用的术语“环状肽”指的是肽的环状衍生物，其上例如经常在羧基末端和在氨基末端已经添加了两个以上附加的适合环化的基团。合适的基团包括氨基酸残基。环状肽可能或者含有分子内的二硫键即-S-S-、在两个加入的残基之间的分子内酰胺键即-CONH-或-NHCO-；或者含有分子内的S-烷基键即-S-(CH₂)n-CONH-或-NH-CO(CH₂)n-S-，其中，n是1、2或更多并且优选不大于6。也可以通过在Scharn，D.等(2001)J.Org.Chem.66；507中例举的三嗪化学技术进行环化。环状肽序列用在肽序列前面的词头“环”表示，而序列的环部分被并入括号中并且另外通过连字符与序列的其余部分分离。

本发明的第一个方面或第二个方面的肽或者肽衍生物可以通过结合于聚乙二醇(PEG)而被修饰。合适的PEG化方法在美国专利No.5,122,614(Zalipsky；Enzon公司)和5,539,063(Hakimi等；Hoffmann-La罗氏公司)中公开，将其所有PEG化方法引入本发明作为参考。可以使用各种分子量的PEG，适当地为从5000至40000kD。优选的分子量是5000kD。优选PEG是单分散的，意思指在PEG分子之间分子量有很少变化。PEG化可以改进的溶解性和肽的血浆半衰期。

本发明的第三个方面提供了一种二元肽，其包含本发明第一个方面或第二个方面的一种肽或者肽衍生物，所述一种肽或者肽衍生物结合于另一种本发明第一个方面或第二个方面的肽或者肽衍生物，其中，所述一种肽或者肽衍生物可以与所述另一种肽或者肽衍生物相同或者不同，并且其中该二元肽具有促凝血活性。

该二元肽可以包含两个相同的彼此共价连接的本发明第一个方面或第二个方面的肽或者肽衍生物，或者两个不同的彼此共价连接的肽或者肽衍生物。该共价连接或者是通过柔韧的连接物，其可能是肽、拟肽或非肽；或者是通过构象约束连接物，其可能包含构象上被约束的肽、拟肽或非肽的构件例如三嗪部分；或者是通过本技术领域已知的任何其他可能的方法。

优选地，本发明第一个方面和第二个方面的肽或者肽衍生物和本发明第三个方面的二元肽的分子量在0.5和3.5kD之间。对于术语“分子量”，我们是指肽或者肽衍生物的单体的理论质量，不包括任何反离子或加合物在内。对于PEG化肽，分子量定义为单体分子的质量，不包括任何反离子或加合物在内，并且不包括PEG部分在内。在0.5kD和3.5kD之间的肽、肽衍生物和二元肽比更大的肽更容易合成，具有降低的免疫原性风险，并且一般容易给药于病人。小于0.5kD的肽可能容易合成并给药，并且很少会是免疫原性的，但是可能不具有所要求的促凝血活性。尽管如此，如果它们具有适当的活性，小于0.5kD和大于3.5kD的肽、肽衍生物和二元肽也被包括在本发明的范围内。

本发明第一个方面和第二个方面的肽和肽衍生物和本发明第三个方面的二元肽具有促凝血活性。

对于术语“促凝血活性”，我们是指在合适的测试体系中促进凝血酶产生和/或纤维蛋白沉积的能力。

优选不同的测定法可以用来确定促凝血活性。实际上，有不同类型的促凝血活性。肽和肽衍生物可以促进在FV、FVII、FVIII、FX或FXI减少的血浆中的凝血。在一种优选实施方式中，本发明的肽或者肽衍生物促进在其中FVIII减少或缺失的血浆中的凝血酶产生和/或纤维蛋白沉积。该活性类型被认为是凝血FVIII活性。如果血浆是来自缺乏FVIII的个体，则该活性典型地被称作FVIII当量活性。如果血浆含有抗FVIII的抑制剂，则该活性典型地被称作FVIII抑制剂旁路当量活性。其他的促凝血活性包括FV活性、FVII活性、FX活性和FXI活性。

单个的肽和肽衍生物在不同类型的测定法之间的相对效力可以改变。因此，即使肽或者肽衍生物在特定的测定中显示具有低效力，然而其也可以在另一种测定中具有适当高水平的促凝血活性。

确定促凝血活性的合适测定法是如下所述的限定内在凝血酶产生测定。在该测定中，如果一种化合物能够以25、50或100μm的浓度在60分钟内、并且优选在50、40、30、20或10分钟内刺激产生5nM凝血酶，则该化合物被认为具有促凝血活性。优选其能够在60分钟内、并且更优选在50、40、30、20或10分钟内刺激产生10nM凝血酶。另一个可选的测定法是如下所述的限定二元路径凝血酶产生测定(DefinedDual-PathwayThrombinGenerationAssay)。在该测定中，如果一种化合物能够以25、50或100μM的浓度在70分钟、优选60、50、40、30或20分钟内刺激产生5nM凝血酶，则其被认为具有促凝血活性。优选其能够在70分钟、并且更优选60、50、40、30或20分钟内刺激产生10nM凝血酶。对于确定凝血FVIII活性，上述的测定法尤其有用，因为它们可以在FVIII减少或受抑制的血浆存在的条件下进行。然而，通过合适减少或抑制的血浆代替FVIII减少或受抑制的血浆，它们能够被容易地适合于对其他类型促凝血活性的测试。

适当地，促凝血活性是在限定内在凝血酶产生测定中25、50或100μM的化合物的凝血酶产生时间，相当于至少100mU/mLFVIII抑制物旁路活性(FEIBA)、优选至少300mU/mLFEIBA、更优选至少600mU/mLFEIBA并且最优选至少1200mU/mLFEIBA。凝血酶产生时间或成峰时段是在如下所述测定中从将预温血浆添加至其他成分中到凝血酶波峰最大值时间的时间间隔。

可选地，促凝血活性是在限定二元路径凝血酶产生测定(DDPTGA)中25、50或100μM化合物的凝血酶波峰最大值，相当于至少1mU/mLFVIII抑制物旁路活性(FEIBA)、优选至少5mU/mLFEIBA、最优选至少10mU/mLFEIBA。凝血酶波峰最大值，也称作峰值IIa，是在测定期间产生的最大凝血酶浓度。如果用合适的因子减少血浆取代FVIII缺乏或受抑制的血浆，则限定二元路径凝血酶产生测定法能够被用于确定除FVIII活性之外的凝血活性。如果与没有肽存在的情况下的刺激相比，本发明的肽、肽衍生物或者二元肽以25、50或100μM的浓度在分别使用FV、FVII、FX或FXI缺乏的血浆的DDPTGA中在120分钟期间内能够刺激更多的凝血酶产生，则本发明的肽、肽衍生物或者二元肽被认为具有FV、FVII、FX或FXI活性。

适当地，促凝血活性是在限定内在凝血酶产生测定中，25、50或100μM化合物在30分钟内、优选在15分钟内、最优选在10分钟内出现峰值的凝血酶产生时间。[0]可选地，促凝血活性是在限定二元路径凝血酶产生测定中，25、50或100μM化合物在50分钟内、优选在45分钟内并且最优选在30分钟内出现峰值的凝血酶产生时间。

肽或者肽衍生物或者二元肽对凝血酶产生的影响可以按照在FVIII免疫抑制、FVIII免疫减少、FVIII抑制剂病人或甲型血友病病人的血浆或者其他类型凝血因子缺乏的血浆中而被确定。例如通过连续地监控在如下所述的黑色96孔微型板(Cliniplate，ThermoLabsystems)中凝血酶特异性荧光底物1-1140(Bachem)的缓慢裂解而进行。在凝血酶产生测定中能够被用于测量以确定肽或者肽衍生物的影响的参数是在成峰时段的凝血酶浓度；在峰值凝血酶处的凝血酶产生时间；凝血酶产生曲线增殖阶段的斜率和凝血酶产生的延迟时间(起始阶段)。

在通过包括FXIa和磷脂的凝血酶产生测定中，可以测定凝血酶产生的内在路径。在这样的测定中，与活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime，aPTT)测试相似，凝血酶产生是单独地直接通过内在路径，并且是FVIII依赖性的。合适的测定法是如下所述的限定内在凝血酶产生测定。作为另一种选择，通过使用低浓度的TF和磷脂而不是FXIa和磷脂，凝血酶通过外在路径(组织因子)和内在路径而产生。这种形式的凝血酶产生测定是更具生理学的一种形式，因为两种凝血酶产生路径都被涉及；其是部分FVIII依赖性的。合适的测定是限定二元路径凝血酶产生测定。

限定内在凝血酶产生测定按如下方法进行。人血浆的FVIII活性通过40μl的人类正常血浆与10μl在山羊中产生的热失活(600BU/mL，56℃孵育6小时)的抗人类FVIII血浆一起孵育(2小时、37℃)而被抑制。将FXIa(16.67nM)(EnzymeResearchLaboratories)与磷脂(磷脂酰胆碱/磷脂酰基-丝氨酸：60％/40％，120μm)(AvantiPolarLipids)的15μl混合物、3.33mM1-1140与50mMCaCl₂和10μl肽溶液(不同浓度)的15μl混合物加至10μl2xHNa/HSA5(50mMHEPES、350mMNaCl、pH7.35、10mg/mLHSA)中。在6分钟37℃保温后，通过添加50μl预温(37℃)的FVIII抑制血浆，开始凝血酶产生。能够使用FVIII抑制剂病人血浆或几种FVIII减少的血浆，代替FVIII抑制血浆。立即将微型板放入GENiosPlus(Tecan)或Safire2(Tecan)荧光阅读器中，并且通过每21秒钟读取微型板，得到动态的荧光信号(ex340nM/em440nM)。通过使原始荧光数据偏离通过使用凝血酶的浓度范围所构建的标准曲线，计算出产生的凝血酶含量。

为了计算的活性当量单位，用FVIII抑制物旁路试剂(FEIBA、巴克斯特公司)、Immunate(人类FVIII，提纯血浆衍生物)参考标准(巴克斯特公司)或者Recombinate标准(人类FVIII，提纯重组体，巴克斯特公司)的稀释液进行实验。画出FEIBA(FVIII)浓度的对数的线性拟合值对在峰值凝血酶处的凝血酶产生时间的曲线，得到标准曲线。使用该曲线，计算出限定肽浓度的FEIBA(FVIII)当量活性。

如果在此给出肽浓度，应当理解，其不是在最终测定体积中的肽的浓度，而是作为校正血浆体积的浓度。在最终测定体积中的浓度是校正浓度除以2.5。因此，如果给出的浓度是100μM，在最终测定体积中的实际浓度是40μM。类似地，对于血浆体积，也校正FEIBA当量活性。因此，如果声称100μM的肽具有的活性相当于在DITGA中100mU/mLFEIBA，则在最终测定体积中肽的浓度是40μM，并且在对照测定中FEIBA的当量浓度是40mU/mLFEIBA。

限定二元路径凝血酶产生测定使用商用试验试剂盒(TechnothrombinTGA，TechnocloneGmbH，维也纳，奥地利)，按如下所述方法进行。简言之，将40μl1.25mM荧光底物(Z-GGR-AMC)18.75mMCaCl₂、10μlTGA试剂B(含有17.9pM重组人组织因子的磷脂囊泡磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸80％/20％(3.2μM)；TechnocloneGmbH)或10μLTGA试剂C高(含有71.6pM重组人组织因子的磷脂囊泡磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸80％/20％(32μM)；TechnocloneGmbH)和10μl肽稀释液的混合物、FEIBA参考标准或FVIIa标准稀释液(EnzymeResearchLaboratories，SouthBend，地安那州，美国)在37℃下孵育4分钟。优选使用试剂C高(ReagentChigh)。通过添加40μl的几种类型人血浆之一，开始凝血酶产生(37℃)。荧光底物被凝血酶转化，接着立即将微型板投入预热(37℃)的微孔板荧光阅读器(TecanSafire2，ex360nm/em460nm)中动态地每30秒钟读板。通过使原始荧光数据偏离通过使用凝血酶的浓度范围所构建的标准曲线，计算出产生的凝血酶含量。画出因子VIIa或FEIBA浓度的非线性回归分析对在凝血酶产生曲线峰值处的凝血酶或者到达凝血酶峰值的时间的曲线，得到标准曲线。使用这些曲线，能够计算出限定肽浓度的因子VIIa或FEIBA当量活性。如同关于DITGA所述的那样，如果在此给出与DDPTGA有关的肽浓度，应当理解，其不是在最终测定体积中的肽的浓度，而是作为校正血浆体积的浓度。在最终测定体积中的浓度是被校正的浓度除以2.5。对于血浆体积，FEIBA当量活性也通过应用相同的校正因数而被校正。

另一种合适的用于确定促凝血活性、并且尤其是FVIII当量活性或FVIII抑制剂旁路活性的测定法是如下所述的限定纤维蛋白沉积测定(DefinedFibrinDepositionAssay)。适当地，在限定纤维蛋白沉积测定中25μM受测化合物样品的促凝血活性相当于至少30mU/mLFVIII抑制物旁路活性(FEIBA)、优选至少80mU/mLFEIBA、最优选至少200mU/mLFEIBA。对于确定凝血FVIII活性，该测定法尤其有用，因为其可以在FVIII减少或受抑制的血浆存在的条件下进行。

限定纤维蛋白沉积测定按如下进行。人类枸橼酸钠血浆(巴克斯特公司)的FVIII活性首先通过100μl人类正常血浆与25μl热失活(300BU/mL，在56℃下孵育6小时)的在山羊中产生的抗人类FVIII血浆一起孵育(2小时，37℃)而被抑制。对于每个待测试的样品，125μl该FVIII被抑制的人类正常血浆被转移至预温的比色杯中，并且加入75μl受测化合物或FEIBA参考标准(巴克斯特公司)的稀释液。该受测化合物或FEIBA参考标准的稀释液含有50mM咪唑、100mMNaCl和10mg/mL人血清白蛋白(Sigma)pH7.4。作为引发剂并且用于提供促凝血表面，包括100μl的人类因子XIa(3.13nM，EnzymeResearchLaboratories)与在50mM咪唑中磷脂(PL)囊泡(磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸60％/40％、30μm；AvantiPolarLipids)、100mMNaCl、10mg/mL人血清白蛋白(Sigma)pH7.4的混合物。在37℃下孵育3分钟后，通过加入100μl的25mMCaCl₂开始凝固反应。通过血凝度计(KC10A，Amelung，德国)监控凝血形成。简言之，每个比色杯在磁探测装置上慢慢地旋转，并且含有小的磁性金属球。在血浆成分保持在溶液中的同时，金属球位于比色杯的底部。随时间的过去，凝血开始形成，以使得随着在旋转的比色杯中凝血发展，金属球开始转动。“凝固时间”被记录并且被定义为从添加的CaCl₂的时间到发展的凝血开始转动金属球的时间。通过FEIBA浓度的对数(x轴)对于凝固时间(y轴)的线性回归，计算出FEIBA参考标准稀释液的标准曲线。基于每个化合物浓度的凝固时间，依据该标准曲线计算出FEIBA当量活性。

如果在此给出与限定纤维蛋白沉积测定有关的肽浓度，应当理解，其不是在最终测定体积中的肽的浓度，而是作为校正血浆体积的浓度。在最终测定体积中的浓度是校正浓度除以4。因此，如果给出浓度是100μM，则在最终测定体积中的实际浓度是25μM。类似地，对于血浆体积，也校正FEIBA当量活性。因此，如果声称100μM的肽具有相当于在限定纤维蛋白沉积测定中100mU/mLFEIBA的活性，则在最终测定体积中肽的浓度是25μM，并且在对照测试中FEIBA的当量浓度是25mU/mLFEIBA。

优选地，当在重型人甲型血友病动物模型中给药时，本发明第一个方面和第二个方面的肽和肽衍生物和本发明第三个方面的二元肽能够至少部分地弥补生物活性FVIII的缺失。例如，它们可以在控制FVIII缺乏的小鼠出血中具有活性，比如被Bi等(Nat.Genet.1995；10：119-21)详细描述的小鼠品种，其中FVIII的外显子17或外显子16被破坏。外显子16FVIII-/-小鼠可以购自杰克逊实验室，600MainStreet，BarHarbor，缅因州04609美国(小鼠品种名称：B6：129S4-F8 ^tmlKaz /J)。

用于测试化合物控制出血的能力的合适测定法是尾部剪裁测定(tailclipassay)。将肽、肽衍生物或者二元肽在合适的载体中给药于小鼠，典型地为静脉内注射(i.v.)、腹腔注射(i.p.)或者皮下注射(s.c.)。可以将不同剂量的每个肽或者肽衍生物给药于不同组的小鼠以便确定剂量依赖性。小鼠组，典型地为8-16个雄性和雌性具有严重血友病的外显子17FVIII敲除小鼠，接受单一的静脉内注射(尾部静脉)、腹腔注射或者皮下弹丸注射(10ml/kg体重)。在尾部剪裁之前两分钟，通过腹腔注射施用100mg/kg开他敏和5mg/kg甲苯噻嗪使动物麻醉。在静脉内注射肽或者肽衍生物制剂5分钟后和在腹腔注射或皮下注射60分钟后，除去0.5厘米的尾部尖端。从伤口滴落的血液收集在含有5.0mL0.04％NH3的试管中保持限定的时间期间比如0-2分钟、2-4分钟、4-6分钟、6-8、8-10、10-12、12-14、14-16、16-20、20-24、24-28、28-32、32-42、42-52和52-62分钟。破坏每个试管中的血细胞，并且通过在室温下3个小时保温期、接着超声处理来提取血红蛋白。在微型滴定板中确定提取物在414nm和620nm处的吸光度。620nm是参考波长，并且从A414读数中减去A620读数。由通过已知的来自野生型对照小鼠比如C57/BI6小鼠的血液含量所产生的标准曲线，计算出相当于被减去的读数的在提取物中的血液含量。待被记录的小鼠的出血特征参数是总失血、出血速度、出血时间、1h、2h、3h、4h、24h和48h存活率。通过总计每个时间期间的血液量计算出累积失血。一个组的动物的数据被平均，并且画出对出血时间的曲线。在每个时间点，通过Student′st测验来分析用于治疗和载体对照组的数据组用于统计显著性。

优选地，在尾部剪裁测定中被给药肽、肽衍生物或者二元肽的小鼠，在尾部剪裁62分钟时的失血量是被单独给药载体的小鼠的失血量的不超过70％、更优选不超过60％、并且最优选不超过50％。

优选地，在上述测定中被给药肽、肽衍生物或者二元肽的小鼠存活率是在尾部剪裁2小时后存活率的至少40％、更优选至少60％、并且最优选至少80％。优选在尾部剪裁测定中被给药肽或者肽衍生物的小鼠存活率是在尾部剪裁24小时后存活率的至少20％、更优选至少30％、并且最优选至少40％。

优选地，本发明第一个方面和第二个方面的肽或者肽衍生物或者本发明的第三个方面的二元肽在人类血浆中在30分钟时的稳定性是至少50％、优选至少70％、更优选至少80％、并且最优选至少90％。用于确定在人类血浆中稳定性的合适测定法是实施例中所述的方法。

优选地，本发明第一个方面和第二个方面的肽或者肽衍生物或者本发明第三个方面的二元肽在磷酸盐缓冲盐水pH7.4中在25℃下的水溶性是至少25μM、优选至少60μM、并且最优选至少100μM。用于确定在磷酸盐缓冲盐水pH7.4中在25℃下水溶性的合适测定法是实施例中所述的方法。

在此，术语“因子VIII”或者“FVIII”指的是任何可显示出与天然FVIII有关的生物活性的FVIII部分。FVIII的序列能够作为NCBI入藏登记号NP_000123或UniProtKB/Swiss-ProtentryP00451找到。

在此使用的术语“源于血浆的FVIII”包括在从哺乳动物获得的血液中发现的所有形式的具有激活凝血路径特性的蛋白质。

在此使用的术语“rFVIII”表示经由DNA重组技术得到的FVIII。

本发明的第四个方面提供了一种药物组合物，其包含本发明第一个方面或第二个方面的肽或者肽衍生物、或者本发明第三个方面的二元肽。肽、肽衍生物和二元肽可以呈药学可接受的盐、溶剂化物或水合物形式。适当地，药物组合物包含药学可接受的载体。该载体可以优选是液体剂型，并且优选是缓冲液、等渗液、水溶液。适当地，药物组合物具有生理学的、或接近生理学的pH。适当地，其具有生理学的或接近生理学的渗透压度和盐度。其可以含有氯化钠和/或醋酸钠。本发明的肽、肽衍生物和二元肽能够在没有显著致热原性的情况下进行制备，致热原性可能发生在生物处理的生产中。这一点可能很重要，尤其是对于静脉注射剂型而言，该剂型中仅仅能够容忍低水平的内毒素存在。优选皮下注射、腹内注射剂型、口含剂型、静脉注射剂型及其肠胃外剂型是无菌的并且无内毒素。

药学可接受的载体还可以包括赋形剂比如稀释剂等、以及添加剂比如稳定剂、防腐剂、增溶剂等。本发明的肽也可以呈任何药学可接受的盐形式。

在此使用的术语“药学可接受的”是指经美国或欧洲或其他国家政府的管理机构批准的、或者列在美国药典或其他普遍认可的药典中用于人类的。

组合物可能是例如悬浮液、乳化液、持续释放剂型、膏剂、凝胶或粉末。该组合物可能被用传统的粘合剂和载体比如甘油三酯配制为栓剂。

虽然静脉注射释放本发明的肽、肽衍生物和二元肽是可能的，但优选非静脉注射途径、尤其是皮下注射释药、鼻腔释药、口含释药、口服释药或者肺部释药。也可以使用腹腔注射(i.p.)释药。

药物组合物可以另外包含例如：一种以上水、缓冲液(例如，中性缓冲盐水或者磷酸盐缓冲盐水)、乙醇、矿物油、植物油、二甲亚砜、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或者葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、佐剂、多肽或者氨基酸比如甘氨酸、抗氧化剂、螯合剂比如EDTA或谷胱甘肽、和/或防腐剂。另外，一个种以上其他的活性成分可以(但是不必)被包含于在此提供的药物组合物中。

药物组合物可以被配制成任何适当的给药方式，包括，例如：局部给药(例如，透皮给药或者眼睛给药)、口服、口腔内给药、鼻腔给药、阴道给药、直肠给药或者肠胃外给药。在此使用的术语“肠胃外”包括皮下注射、皮内、血管内(例如，静脉注射)、肌内注射、脊髓、颅内、鞘内、眼内、眼周、眶内、滑膜内和腹膜内注射，以及任何相似的注射或者输液技术。适合使用的口服形式包括：例如，药片、锭剂、糖锭、水性悬浮液或油性悬浮液、可分散性粉剂或颗粒、乳化液、硬胶囊或软胶囊、或糖浆或酏剂。在此提供的组合物可以被配制为冻干剂。

水悬浮液在混合物中含有活性成分，混合物中的赋形剂适合制造水悬浮液。这些赋形剂包括：悬浮剂(例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(hydropropylmethylcellulose)、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍树胶和阿拉伯树胶)；以及分散剂或润湿剂(例如，天然产生的磷脂比如卵磷脂、烯化氧与脂肪酸的缩合产物例如聚氧化乙烯硬脂酸酯、环氧乙烷与长链脂族醇的缩合产物比如七-癸乙烯氧十六烷醇(heptadecaethyleneoxycetanol)、环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇衍生的偏酯的缩合产物比如聚氧化乙烯山梨糖醇一油酸酯、或环氧乙烷与由脂肪酸和己糖醇酸酐衍生的偏酯的缩合产物比如聚乙烯单油酸山梨醇酐酯)。水悬浮液还可以包含一种以上防腐剂，例如对羟基苯甲酸乙酯或正丙酯、一种以上着色剂、一种以上增味剂、以及一种以上甜味剂比如蔗糖或者糖精。

肽或者肽衍生物可以配制成局部给药或者表面给药，比如局部施用至皮肤、创口或者粘膜，比如在眼睛中给药。用于局部给药的剂型典型地包含局部载体与活性试剂相组合，有或者没有附加的任选成分。合适的局部载体和附加成分为本领域技术人员所熟知，并且显然，载体的选择将取决于特定的物理形式和释药模式。局部载体包括：水；有机溶剂比如醇类(例如，乙醇或异丙醇)或甘油；二元醇(例如，丁二醇、异戊二醇或丙二醇)；脂族醇(例如，羊毛脂)；水和有机溶剂的混合物、以及有机溶剂比如醇类和甘油的混合物；脂质基材料比如脂肪酸、甘油酯(包括油类，比如矿物油、以及天然或者合成来源的脂肪)、磷酸甘油酯、鞘脂类和蜡；蛋白质基材料比如胶原和明胶；硅酮基材料(非易失性的和挥发性的)以及基于碳氢化合物的材料比如微海绵和聚合物基质。组合物可以进一步包括一种以上适合于改进所应用剂型的稳定性或效果的成分，比如稳定剂、悬浮剂、乳化剂、粘度调节剂、胶凝剂、防腐剂、抗氧化剂、皮肤渗透性增强剂、润湿剂和缓释材料。这样的成分的例子在Martindale-TheExtraPharmacopoeia(药学出版社，伦敦1993)和Martin(编)，Remington′sPharmaceuticalSciences中有描述。剂型可以包含微胶囊，比如羟甲基纤维素微胶囊或明胶微胶囊、脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒或纳米胶囊剂。

药物组合物可以被配制为吸入剂型，包括喷雾剂、合剂、或气雾剂。对于吸入剂型，在此提供的化合物可以经由任何已为本领域技术人员所熟知的吸入方法释放。这些吸入方法和装置包括，但不限于，具有推进剂比如CFC或HFA或者生理学可接受并且环境可接受的的推进剂的计量式药剂吸入器。其他合适的装置是呼吸操纵吸入器、多剂量干粉吸入器和气雾剂喷雾器。用于主题方法的气雾剂剂型典型地包括推进剂、表面活性剂和共溶剂，并且可以被填入普通的被合适的计量阀封闭的喷雾剂容器中。

吸入剂组合物可以包含含有适合于雾化和支气管内使用的活性成分的液体组合物或粉末组合物、或者经由气溶胶单位分配性计量的药剂给药的气雾剂组合物。合适的液体组合物包含在水、药学可接受的吸入剂溶剂例如等渗盐水或抑菌水中的活性成分。溶液通过利用泵或挤压驱动雾化的喷雾分配器、或者通过任何其他的传统方法而被给药，所述传统方法用于引起或者使必需剂量含量的液体组合物能够被吸进病人的肺中。其中载体是液体的用于给药的合适剂型，例如鼻喷入剂型或滴鼻剂，包括活性成分的水溶液或油质溶液。

适用于鼻腔给药的其中载体是固体的剂型或组合物包括粗粉，所述粗粉的颗粒尺寸是例如在20至500微米范围内，其以鼻吸药给药的方式被给药(即，通过从紧贴鼻子的粉末容器经过鼻部通道快速吸入)。举例来说，合适的粉末组合物包括活性成分的粉末制品，所述活性成分与乳糖或其他适用于支气管内给药的惰性粉末充分混合。该粉末组合物能够经由气溶胶分配器或者包裹入易破的胶囊给药，所述胶囊可以被病人插入可刺穿包膜并且以适合于吸入的稳定气流将粉末吹出的装置中。

药物组合物可以被配制为持续释放剂型(即，在给药后影响调节剂缓释的剂型比如胶囊)。这样的剂型一般可以通过使用众所周知的技术制备，并且通过例如口服、直肠或皮下注射植入、或者通过在期望靶位点处植入而给药。用于在这样的剂型内部使用的载体是生物相容的，并且还可以是可生物降解的；优选该剂型提供一种相对恒定水平的调节剂释放。包含在持续释放剂型内部的调节剂含量取决于例如植入的位点、释放速度和预期持续以及待被治疗或预防的状况的性质。

药物组合物可以用提高生物利用率的试剂比如有机溶剂配制。例如，Cremophor(产品编号00647/1/63；BASF公司，Aktiengesellschaft，德国)是聚乙氧基蓖麻油，其通过使35摩尔的环氧乙烷与每摩尔的蓖麻油反应而制备。其可以用于稳定在含水体系中非极性材料的乳化液。作为另一种选择，肽、肽衍生物或者二元肽可以被合并入或者结合于蛋白质微颗粒或者纳米颗粒，用于改进生物利用率。合适的微颗粒和纳米颗粒在US5,439,686(Desai等；Vivorx制药公司，加利福尼亚州)和US5,498,421(Grinstaff等；Vivorx制药公司，加利福尼亚州)中有描述。适当地，蛋白质纳米颗粒包含人血清白蛋白、尤其是人血清白蛋白或其重组体形式。WO2007/077561(Gabbai；Do-Coop技术有限公司，以色列)描述了另一种合适的载体，其包含纳米结构和液体，称为Neowater^TM。

为了口服给药和肠胃外给药予病人包括人类病人，本发明的肽、肽衍生物或者二元肽以单个剂量或分批剂量给药的每天剂量水平通常是每成年人2至2000mg(即，大约0.03至30mg/kg)。

因此，例如，本发明的肽、肽衍生物或者二元肽的药片或胶囊可以含有2mg到2000mg的活性化合物用于单次、或在某时两次以上地给药，视情况而定。无论如何医师将确定最适合于任何单个病人的实际剂量，并且将随年龄、重量和特定病人的反应而变。上述剂量是平均情况的示例。当然可能会有个别的情况，其中更高或更低剂量范围是有益的，并且这都在本发明的范围内。

因为兽用，本发明的肽、肽衍生物或者二元肽根据正常的兽医实践作为可适合接受的剂型被给药，并且兽医将确定最适合于特定动物的给药方案和给药途径。

在此公开的肽、肽衍生物和二元肽可以用于药物应用和畜牧业或者兽医应用。典型地，该产品用于人类。术语“病人”表示哺乳动物个体，并且在说明书全文和权利要求中如此使用。

本发明的第五个方面提供了一种本发明第一个方面或第二个方面的肽或者肽衍生物、或者本发明第三个方面的二元肽用于治疗FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足的病人的应用。

本发明的第六个方面提供了一种本发明第一个方面或第二个方面的肽或者肽衍生物、或者本发明第三个方面的二元肽在药物制造中的应用，所述药物用于治疗在病人中FV、FVII、FVIlI、FX和/或FXI不足。

本发明的肽、肽衍生物和二元肽可以用于治疗FV、FVII、FVIII、FX和/或FXI不足，既用于预防、也用于治疗急性出血。FVIII缺乏(甲型血友病)的病人经常发展FVIII的抑制剂抗体。(FIX的)抑制剂发展在FIX缺乏(血友病B)中也是已知的。因为FV、FVII、FXI和FX不足是非常稀有的先天性紊乱，很少知道抑制剂发展，虽然具有这些紊乱的病人或许可以发展抑制剂是可行的。抑制剂病人的治疗是第五、第六和第七方面的优选实施方式。这些抑制剂病人可以具有或者大于5BU的高滴度反应或者在0.5和5BU之间的低滴度反应。典型地，该抑制剂是直接对抗FVIII的，并且病人具有甲型血友病。

对FVIII的抗体反应等级能够通过使用功能性抑制剂测定法被定量，比如在下述中有描述：[0]KasperCK等(1975)会议论文集：一种更均一的因子VIII抑制剂测量法。ThrombDiathHaemorrh34(2)：612。FXI抑制剂可能按照Kasper描述的方法通过aPTT测定而被定量。FV、FVII和FX的抑制剂可能按照Kasper所述的程序通过基于PT的测定而被定量。

根据本发明的第八、第九或第十个方面的肽或者肽衍生物不是FVIII或其片段。典型地，其不包含任何FVIII蛋白的氨基酸序列或者由其组成，不论是否是人类、哺乳动物或脊椎动物来源。也不包含FVIII蛋白的片段。典型地，其包含FVIII蛋白比如人类FVIII蛋白中少于50个、少于20个、少于10个、少于5个连续的氨基酸。优选的肽和肽衍生物是本发明第一个方面和第二个方面的肽和肽衍生物、或者本发明第三个方面的二元肽。可替代的肽和肽衍生物可以按照与例举的肽和肽衍生物有关的描述的方法被人工合成和测试促凝血活性。

本发明第八、第九或第十个方面的肽和肽衍生物可以被配制为药物组合物，如上所述，并且可以被用于如上所述的药物中。

以下用实施例进一步阐明本发明，但并不是对本发明作任何限制。

实施例1：具有凝血酶产生活性的化合物的合成和鉴定

通过使用“限定内在凝血酶产生测定”筛选化合物，其中凝血酶产生在因子XIa和磷脂囊泡存在的条件下在FVIII被抑制的人血浆中被体外定量。按照具体实施方式中描述的方法，在上述测定中、以及在使用组织因子和磷脂代替因子XIa和磷脂的“限定二元路径凝血酶产生测定”中筛选别的化合物。

肽和肽衍生物类化合物通过标准的固相肽合成或SPOT合成以50-100nmol肽每斑点被人工合成，该合成法允许可设定位置地在连续的纤维素膜上化学合成肽。将肽溶于10％或50％二甲亚砜水溶液中。

按如下所述进行肽和肽衍生物的PEG化。在溶液中将PEG5000NHS-酯偶联于经高效液体色谱提纯的肽的N-端。如果赖氨酸存在于该肽序列中，该氨基酸被用ivDde保护基保护起来以便避免在ε-氨基处PEG化。在PEG5000偶联于N-端后，ivDde保护基被二甲基甲酰胺中3％水合肼解离，接着通过高效液体色谱再纯化最终产品。

确定被认为可促进凝血酶产生的化合物，如表7和8中所示。

表7：以A01为基础的化合物

	肽	序列
			SEQ ID NO：2	A01	Ac-RMKFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：2	A02	Ac-PMKFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：2	A03	Ac-RMDFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：2	A04	Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：1	A05	Ac-WDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：3	A06	Ac-WDLYFEIVWE
			SEQ ID NO：1	A07	Ac-WDLYFEIVW-O-E
SEQ ID NO：2	A08	O-RMEFDVWDLYFEIVW-O-NH₂
			SEQ ID NO：4	A09	ERMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：34	A10	EPMKFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：2	A11	O-RMDFDVWDLYFEIVW-O-NH₂
SEQ ID NO：5	A12	ERXEFDVWDLYFEIVW-NH₂ X是Nva
				A13	O-RMEFDVWDLYXEIVW-O-NH₂ X是Phg
SEQ ID NO：6	A14	Ac-WSLYFEIVWE
			SEQ ID NO：1	A15	Ac-WDLYFEISW-O-E
SEQ ID NO：2	A16	PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：6	A17	PEG5000-WSLYFEIVWE
SEQ ID NO：4	A18	PEG5000-ERMEFDVWDLYFEIVW-NH₂
			SEQ ID NO：7	A19	Ac-VWDLYFEIVW-NH₂
SEQ ID NO：1	A20	Ac-WDLYFEIVW-O-K

在上述各表中，O-是4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺(ttds)

表8：以B01为基础的化合物

肽	序列
		B01	Ac-(cimfwydc)-ye-NH₂
B02	Ac-(cymfwydc)-ye-NH₂
		B03	Ac-cimfwydeye-NH₂
B04	二硫-二聚(Ac-cimfwydeye-NH₂)₂
		B05	Ac-O-(cymfwydc)-ye-NH₂
B06	K-O-(cymfwydc)-ye-NH₂
		B07	Ac-simfwydeye-NH₂

在上述各表中，-O-是4，7，10-三氧杂-1，13-十三烷二胺(ttds)。在该研究中使用的命名为B01、B02、B05和B06的实际的肽是环状的。

实施例2：在内在路径凝血酶产生测定和二元路径凝血酶产生测定中的化合物测试

不同浓度的每种肽在使用人类FVIII被抑制的血浆的限定内在凝血酶产生测定中被测试。结果提供于下表中。

表9：在限定内在凝血酶产生测定(被FXIa引发)中肽化合物的活性。给出凝血酶成峰时段，作为基于FEIBA标准校准曲线计算的FEIBA当量活性(mU/mL)。

基于Z-GGR-AMC裂解以释放荧光团AMC的体外凝血酶产生测定通过使用正常人血浆被开发，即限定二元路径凝血酶产生测定。峰值凝血酶产生的组织因子依赖性和凝血酶成峰时段在含有固定浓度磷脂(即3.2μM)的组合物中被表征。磷脂依赖性在含有固定浓度组织因子(即7.2pM)的组合物中被表征。成峰时段(到达凝血酶产生峰值的时间)取决于磷脂或组织因子的浓度。该测定的最后版本如同在具体实施方式中描述的那样，其中10μL含有(32μM磷脂和71.6pM组织因子)的试剂C高以100μL的总体积被使用。

通过使用3.2μM磷脂和7.2pM组织因子在FVIII缺乏或受抑制的血浆中进行进一步的研究，以便表征各种凝血因子制品对峰值凝血酶产生和凝血酶成峰时段的影响。这些研究提供了一种基础，其可在测定中比较化合物的效力。简言之，在FVIII缺乏的血浆中以0、5、10、20、40和80mU/mL测试rFVIII(来自巴克斯特的FVIII)。在FVIII受抑制的血浆中以0、8、16、31、63和125mU/mL测试FEIBA。在FVIII受抑制的血浆中以0、0.1、0.4、1.6、6.3和25nM测试FVIIa。结果如图1所示。对于在FVIII缺乏的血浆中的重组FVIII和对于在FVIII免疫抑制的血浆中的FEIBA和FVIIa，观察到凝血酶产生参数的浓度依赖性提高。峰值凝血酶提高了，并且延迟时间和凝血酶成峰时段降低了。

在这种使用试剂C高(Technoclone)用于引发凝血酶产生的限定二元路径凝血酶产生测定(DDPTGA)中测试化合物。结果提供于下表中。尽管该测定对于FVIII样活性的敏感性小于限定内在凝血酶产生测定(DITGA)，但数种化合物具有可检测的活性。

表10：概括结果

“峰值IIa”是在凝血酶产生曲线的峰值处产生的凝血酶含量。“成峰时段”是从凝血酶产生反应开始到产生最大含量时的时间。BLS＝最低标准以下(belowloweststandard)。

在这些测定中甚至在没有加入肽的情况下仍然会产生凝血酶。因此，如果峰值IIa是在特定肽浓度下的“BLS”，仍然会有凝血酶峰值，但是其低于被最低标准浓度取得的峰值，该最低标准浓度是5mU/mLFVIII、8mU/mLFEIBA或0.1nMFVII。类似地，当成峰时段是“BLS”时，所述到达峰值凝血酶产生的时间大于最低标准浓度取得的成峰时段。肽可能对成峰时段而非峰值IIa具有显著的影响，或者反之亦然。然而，优选肽对成峰时段和峰值IIa都有影响。B03、B04和A15积极地影响凝血酶产生的两个方面。在一些肽的情况中，对凝血酶产生的影响的浓度依赖性在高肽浓度下未被发现，这或许可以通过非特异性的相互作用而被解释。

实施例3：在使用几个减少型血浆的凝血酶产生测定中的化合物测试

以在具体实施方式中描述的裂解Z-GGR-AMC以便释放荧光团AMC为基础的体外凝血酶产生测定，即限定二元路径凝血酶产生测定被用于表征在几个减少型人血浆中化合物的影响。在这些实验中，每个100μl反应含有10μL试剂B，其包含磷脂囊泡磷脂酰胆碱/磷脂酰丝氨酸80％/20％(3.2μM)和17.9pM重组人组织因子。按照在具体实施方式中描述的方法，使用10μL肽稀释液、40μLTGA底物和40μL血浆。

在实验中使用的血浆被新鲜冷冻，并且因子V、因子VII/VIIa、因子VIII、因子X或因子XL不足(GeorgeKingBio-Medical公司)。不足型血浆的残留的凝血因子水平被限定为小于1％。

对于在实验中使用的每个减少型血浆，在两个浓度即50μM和80、90或100μM处测试化合物。使用阴性对照，其中未包括受测化合物。结果总结于下表中。

表11：在各种减少型血浆中化合物对凝血酶产生的影响的概括结果

刺激凝血酶产生：“+”意味着产生了刺激；“-”意味着未刺激。在对照试验中，没有肽被包括。

测试的所有减少型血浆显示，在没有肽的情况下没有或者非常低的凝血酶产生，这表明在使用的组织因子浓度下，所有凝血因子的相互作用对于凝血酶产生都是重要的。数种肽在所有的酶原减少型血浆(FVII、FX或者FXI)中刺激了凝血酶产生，相反在FV减少的血浆中凝血酶产生较低，这表明普通的路径对于受肽刺激的凝血酶产生很重要。

实施例4：在限定纤维蛋白沉积测定中化合物的活性

按照在具体实施方式中描述的方法，在限定纤维蛋白沉积测定中测试各种肽刺激纤维蛋白沉积的能力。结果显示于下表中。

表12：在限定纤维蛋白沉积测定中的化合物表征

化合物	浓度(μM)	FEIBA EU (mU/ml)
			A01	100	145
A01	50	127
			A01	25	80
B01	100	94
			B01	50	47
B01	25	31
			A05	50	219
A05	25	193
			A05	10	119
B03	25	325
			B03	12.5	291
B03	6.3	264
			A06	25	168
A06	12.5	232
			A06	6.3	251
A07	50	199
			A07	25	246
A07	12.5	268

所有的受测化合物都缩短了FVIII被抑制的血浆的凝固时间和纤维蛋白形成。结合凝血酶产生实验，这证实了受测化合物的促凝血活性。大部分化合物以浓度依赖性方式发挥了作用，虽然少数化合物在更高浓度下具有降低的活性，这可以归因于非特异性相互作用。

实施例5：用于化合物表征的体外测定

不仅在凝血酶产生测定中表征化合物的活性，而且表征其药物动力学、溶解度、HERG抑制和分子量。

药物动力学(PK)研究

峰研究被要求用于体内效力研究的设计和解释。血浆蛋白质结合性、血浆稳定性和微粒体稳定性全部被包括在范畴内。

1.血浆蛋白结合性

在96孔微型平衡透析封闭系统(HDT-96；HTDialysis，LLC，GalesFerry，康涅狄格州)中确定化合物结合被称作基质的人血浆(Bioreclamation，Hicksville，纽约州)、小鼠血浆(LampireLaboratory，Pipersville，宾夕法尼亚州)或小鼠血清白蛋白(Sigma，圣路易斯市，密苏里州)的程度。简言之，该体系的每个单元包含被半透膜分开的供体腔室和受体腔室。实验的原理是，蛋白质(和与该蛋白质结合的化合物)被保持在供体腔室中，并且不能跨越薄膜。游离的化合物可能在两个腔室之间经由薄膜扩散并且在实验期间达到平衡。在这些实验中，半透膜由再生纤维素组成，并且具有12-14kD的分子量截流(目录编号1101，HTDialysis，LLC)。

购自Sigma的蛋白酶抑制剂混合物(P2714-1BTL)被包含于测定中，以便抑制受测化合物的蛋白水解。其是蒸馏水中以50倍保藏液新近制备的。小鼠血清白蛋白是在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中新近制备的，浓度为40g/L。该PBS购自Invitrogen(Carlsbad，加利福尼亚州)，并且在使用前将其调节到pH7.4。血浆在不稀释的情况下使用。将蛋白酶抑制剂保藏液以最终1倍的浓度加至每个基质(即，在PBS中的小鼠血清白蛋白)中。用对照化合物华法令在二甲亚砜中制备每个受测化合物的保藏溶液。华法令是高度蛋白结合性化合物，其被包含于每个保藏液中以确保在实验期间薄膜的完整性。将一等分保藏液加至每个基质中，从而得到终浓度是5μM的受测化合物的和10μM的华法令。二甲亚砜的终浓度是0.72％(v/v)。通过添加其他成分的基质稀释可以被忽略(小于4％)。该薄膜条带在蒸馏水中被水化1小时；薄膜被浸在30％乙醇水溶液中20分钟，然后用蒸馏水清洗薄膜两次。在清洗后，薄膜被置于PBS中并且可随时使用。按照制造商的方案组装渗析部件。在组装后，将150μL一等分的每个基质/受测化合物加至分开的供体腔室，并且将150μL的PBS加至在薄膜的另一侧对应的受体腔室。将剩余的每个基质/受测化合物在-80℃下储藏，用于进一步分析。测量受测化合物和华法令在这些基质中的浓度，并且在回收率计算中使用这些数值。然后将96孔渗析部件置于密封的加热的摇臂中，其被预温至37℃，并且允许保温6小时。在保温后，两侧取样。通过LC/MS/MS分析测量受测化合物、以及华法令的浓度。

按如下所述公式计算出回收率和蛋白质结合性数值：

％回收率＝[(在供体中的浓度+在受体中的浓度)/(在基质中测量的浓度)]x100％(1)

％结合＝[(在供体中的浓度-在受体中的浓度)/(在供体中的浓度)]x100％(2)

“％回收率”是测定加入到基质中的化合物有多少是可从供体腔室和受体腔室收回的。

如果回收率小于100％，则化合物的比例可以已经结合于薄膜或者腔室的塑料表面，或者其可以已经降解。“％结合”是测定有多少化合物已经结合于基质，并且因此不能在供体腔室和受体腔室之间平衡。

A01和华法令(对照)的结果显示于下表中。

表13：在测试基质中A01的蛋白质结合性

表14：在测试基质中华法令的蛋白质结合性

2.血浆稳定性

化合物在人或小鼠血浆中的半衰期、或者化合物在人或者小鼠血浆中保温后的保持百分率按如下所述确定。在实验工序中，受测化合物浓度是5μM，由在二甲亚砜中10mM的受测化合物保藏液制备。普鲁本辛被用作标准。为了制备试样，在50％乙腈/50％H₂O中制备受测化合物保藏液在二甲亚砜中的1/20稀释液，然后在1.5mLEppendorf管中按1/100稀释于预温(37℃)的血浆(5μL化合物[1/20稀释液]+495μL血浆)中。在1.5mLEppendorf管中，标准化合物2mM普鲁本辛被按1/4稀释于二甲亚砜中，随后按1/100稀释于预温的血浆(5μL化合物[1/4稀释液]+495μL血浆)中。所有的样品在37℃水浴保温。在化合物、或普鲁本辛标准已经与血浆混合后即刻(称为t＝0分钟)加入500μL乙腈。在选择的保温期间(一般在t＝60分钟)后，将每个样品与另外500μL乙腈混合。样品在涡动混合器上混合30s，并且放置于冰冻上10min，收集离心。样品在4℃下20000g离心10min。将500μL上清液转移入新的1.5mLEppendorf管中，并且加入等体积的乙腈。使用涡动混合器再次混合样品30s。在第二个离心步骤(20000g，10min，4℃)后，将250μL上清液转移入高效液体色谱玻璃小瓶中，用于HPLC-MS分析。进行高效液体色谱的条件如下所述：将进样体积设定为20μL。将温度设定为25℃。线性梯度为从95∶5至5∶95的水∶乙腈，两者都含有0.05％三氟乙酸(TFA)(v/v)，以0.3ml/min的流速应用该线性梯度10min。PDA检测器是210-400nm扫描。该离子阱安装有ESI源，温度为280℃，以50-2000amu全扫描模式进行质量扫描，接着进行1.5V碰撞能量的动态排除MS²实验(105作为母离子的分钟计数)。由曲线下面积(AUC)比计算出百分比稳定性，在60分钟保温时间(或选择时间)对0分钟保温时间处以全扫描方式监控在总离子流(tic)中靶化合物的质子化了的分子的质量离子。

结果显示于下表中。化合物浓度随时间下降或许应归因于蛋白水解降解和/或化学修饰。

表15：化合物的血浆稳定性

肽	人血浆中％残留(30min)
		A01	58
A19	99
		A07	117
A20	95
		A06	98
A02	84
		A03	92
A08	70
		A09	67
B07	89
		B06	93
B05	112
		A05	93

3.微粒体稳定性

测试用于确定化合物在人或动物来源的微粒体制品中的稳定性。或者在Cerep提供的测定(法国，目录参照号900-8h)中或者通过如下所述的方案测量微粒体稳定性。在100％二甲亚砜中制备的化合物溶液10mM/5mM(受测化合物，标准异搏定、丙咪嗪、以及特非那定)。它们用蒸馏的H₂O/MeOH稀释，得到在测定中的终浓度1μM，在最终的混合物中小于0.4％二甲亚砜(v/v)。在10mlFalcontube(总体积4.4mL)：3414μL蒸馏水、440μl500mM的NaPO4-缓冲液pH7.4、440μlNADP(10mM)、22μLGlc-6-P(1M)、17.6μL1U/ml的Glc-6-P-DH溶液、66μL肝微粒体(大鼠或小鼠，在测定中终浓度300μg/mL)中制备用于稳定性测定的MasterMix。MasterMix在水浴中37℃下预保温10分钟。在96孔U型板(PP-Nunc)中每孔加入5μL的60μM化合物溶液和300μl的反应混合物(预保温MasterMix)。所有的孔必须小心地混合，以确保在下一步前是均一的悬浮液。每个化合物在t＝0分钟取出75μl样品(一式两份)。孔板被密封并且和使返回到水浴/Thermomixer保持30分钟。通过添加200μL甲醇提取受测化合物/标准物、也包括内标。内标是“Pep770”(JeriniAg，柏林，德国)并且在6.25ng/ml的终浓度下使用。在4℃和1300g下离心样品10分钟。将200μL的上清液转移入具有10μL二甲亚砜每孔的96孔板中。通过HPLC-MS分析(一式三份)测量化合物稳定性。在30分钟后重复相同的工艺。计算出平均值“AUCt＝0分钟”和“AUCt＝30分钟”的比率，并且确定在30分钟后保持的化合物含量的百分比。所有峰值的信号噪音比必须是5∶1或者更好。必须使用在不同时间点处的比率AUC_analyte∶AUC_standard。计算的对照化合物的稳定性必须落入特定的范围以验证该测定。

结果显示于下表中。

表16：在小鼠体微粒体中的化合物的稳定性

肽	30分钟后的稳定性[％]，一式两份
		A01	27/32
A02	44/45
		A06	51/47
A07	39/28
		A09	22/23
特非那定	63/68

溶解度

或者在Cerep提供的测定(法国，目录参照号900-11a)中或者通过如下所述的方案在pH7.4的PBS中测量水溶性。该工艺的目的是通过使用HPLC估计候选药物在缓冲液中的饱和浓度，确定候选药物(分析物)在缓冲液中的溶解度。候选药物于有机溶剂中的已知浓度被用作标准。作为初始步骤，必须制备受测化合物在二甲亚砜中的保藏液。取决于化合物的最大溶解度，应该达到在二甲亚砜中50mM的浓度。用二甲亚砜(100％参照溶液)和缓冲液(测试溶液)DMSO保藏液被稀释至50μM的终浓度，从而提供每个500μL的最小体积。两种溶液都在Eppendorf“Thermomixercomfort”中于25℃下950rpm摇动至少60分钟。悬浮液在22330g下离心至少2分钟，并且将100μL上清液转移入被置于玻璃小瓶中的聚丙烯内插管中，并且被卡口瓶盖封闭。作为另一种选择，能够在微孔板中用一半前述开始溶剂体积制备溶液。为了测定溶解度，通过HPLC一式三份分析了所有的样品。进样体积是至少10μL。通过“Chemstation软件”(AGILENT，Waldbronn，德国)分析了得到的数据。来自有机溶液分析的峰值被积分，并且报告了算术平均作为“AUC1”(HPLC进样的已知量的参比面积)。相同的工艺应用于由缓冲溶液分析得到的光谱，给出“AUC2”(溶于缓冲液的未知含量的化合物的面积)。一般来讲，AUC必须大于20个面积单位，并且信噪比(峰值高度)必须好于3。计算出平均“AUC2”和“AUC1”的比率，并且因此得到了在缓冲液中化合物的溶解量的百分比，并且能够以μM报告溶解度。

结果显示于下表中。

表17：化合物在PBS中的溶解度

化合物	在PBS中的溶解度[μM]
		A09	63
B03	114
		B07	195
B06	48
		B05	174
A01	9
		A08	11
A05	6
		A19	14
A07	165
		A20	166
A06	164
		A02	35
A03	110
		A16	＞200

HERG抑制

通过膜片钳(patch-clamp)技术或Rb⁺流出(Rb⁺efflux)测量的HERG抑制，评估QT延长。

Rb+流出法(Cerep，法国，目录参照900-36rb)用于初始筛选。对于Rb+流出测定，与受测化合物并行地测试参考化合物(阿司咪唑)，以便评估测定适合性。其在10μM下测试，并且将数据与Cerep确定的历史记录值相比较。

为了HERG抑制的精确表征，应用膜片钳测定(Cerep，法国，目录参照900-36)。普通的效价等级体系采用Roche等，2002，Chem.Bio.Chem.3：455-459的等级体系。为了确保在测定中出现没有灵敏度变化，使用10nME-4031(Wako，目录编号052-06523)，单独分开的实验在相同的细胞(克隆)批次上进行，产生的结果(56.7±1.8％抑制，平均值±SEM，n＝3)可与在Cerep历史上得到的数据(58.4±2.0％抑制，平均值±SEM，n＝3)相比较。将受测化合物(10mM保藏液)溶于二甲亚砜(DMSO)。该溶液在1μM处含有0.01％二甲亚砜。含有高达1％二甲亚砜的池中溶液对HERG编码的尾流没有显著影响。

通过在10μM下的Rb+流出法筛选几个化合物显示，没有HERG通道活性的抑制。在更敏感的膜片钳测定中，化合物A01、A05和A16能够被分类为低效价HERG通道阻断剂，而B03被鉴定为高效价HERG通道阻断剂。结果提供于下表中。

表18：HERG抑制结果

分子量

分子量定义为单体分子的理论质量，不包括任何反离子或者加合物。化合物的分子量如下表中所示。

表19：化合物的分子量

化合物	分子量(g/mol)
		A09	2175
B03	1439
		B07	1423
B06	1849
		B05	1763
A01	2087
		A08	2175
A05	1311
		A19	1410
A07	1743
		A20	1742
A06	1741
		A02	2028
A03	2074
		A16	2087

实施例6：ADME-Tox

按照在实施例5中描述的方法进行各种化合物的ADME-Tox(ADME毒性)分析。概括结果显示于下表中。

表20：总结ADME-Tox数据

简言之，在PBSpH7.4中测试水溶性。结果以μM给出。在人类血浆中测试蛋白水解稳定性30分钟。各个结果以％稳定性给出。在小鼠微粒体制品中测试微粒体稳定性30分钟。结果以％稳定性给出。使用其中肽或者肽衍生物为1μM的膜片钳法测试HERG通道抑制性，并且以％抑制性给出。

实施例7：动物模型

在动物中进行下面的测定。

1.急性毒理学

毒理学研究涉及监控由于在施药后即刻和每日两次的毒性效果引起的姿态变化；监控体重；脑、心脏、肾、肝脏、肺的组织病理学。实验在C57BI/6小鼠中进行。

2.药物动力学

在C57BI/6小鼠或Wistar大鼠中以1-30mg/kg测试化合物的药物动力学。以适当的间隔使用LC-MS监控血流中的化合物浓度。

3.循环分析

监控血压和心率，并且读取C57BI/6小鼠的心电图。

4.动物疾病模型

在FVIII-/-(E17)小鼠、FIX-/-小鼠和C57BI/6对照小鼠中使用尾部剪裁模型。定量的参数是总失血、出血时间、出血速度和存活率。

实施例8：急性毒理学

重18-20g的C57BI/6小鼠被用在合适载体中的化合物以10ml/kg通过尾部静脉内注射或腹腔注射或皮下注射给药。给药的化合物量在0.075-125mg/kg(i.v.)、15-125mg/kg(i.p.)和125mg/kg(s.c.)的范围内。每组有四个小鼠。在化合物给药后即刻和此后60分钟监控由于毒性效果产生的姿态变化。在给药后五天监控体重。在给药后第5天，杀死小鼠并且进行尸体解剖。脑、心脏、肾、肝脏、肺和脾被活检。结果描述如下。

表21：在不同的化合物剂量下由于毒性效果产生的姿态变化

在上述各表中，报道了在给药后整个60分钟期间测试最大的剂量导致没有检出毒性、一些毒性或严重毒性。“没有检出毒性”显示没有观察到急性毒性。“一些毒性”表明记录到不协调或全身僵硬，但是没有动物死亡。“严重毒性”表明在化合物施用1小时内动物之一死亡。

总之，大多数化合物被很好地耐受。在药物动力学、循环分析或者给药所通过途径的动物疾病模型中未测试当通过特定的途径被给药时会导致严重毒性的化合物剂量。

对于大多数化合物，甚至在最高剂量处，在从存活的小鼠在第5天收集的活检样品中也没有观察到宏观病理发现，这表明化合物是可很好地忍受的。在任何动物中鉴定出的仅有的病变是在肝脏、肾、肺或心脏中微小的变态。这些是在个别的动物中自然的观察结果，可能是由于非化合物相关的轻度感染或者由于杀死造成的。

对于每个受测化合物，没有记录到对的存活下来的小鼠平均体重的影响，表明阴性反应。

实施例9：化合物的药物动力学

进行药物动力学研究以便监控在静脉内注射、腹腔注射或者皮下注射给药后血浆中的化合物浓度。研究在重约20g的C57BI/6小鼠中进行。

对于每个肽，相同的剂型用于所有的给药途经，并且如下所述：A01是在5％二甲亚砜、5％CremophorEL(Sigma-Aldrich)、0.5％吐温80中配制；A02和A09各自是在5％二甲亚砜、30％PEG400(聚乙二醇)50mM磷酸钠pH7.4中配制；A05是在5％二甲亚砜、20mM甘氨酸pH9.0中配制；A06和A07各自是在5％二甲亚砜、0.9％NaCl、50mM磷酸钠pH7.4中配制。

通过HPLC-MS在与配备有ESI源的质谱仪LCQclassic或Advantage(全部为ThermoElectron，美国)相结合的SurveyorHPLC上分析血浆中的肽浓度。所有HPLC实验是在PhenomenexC-18柱(50mmx2.0mm，5μL进样体积)上进行，采用的线性梯度为：洗脱液A--水中0.05％三氟醋酸(TFA)；洗脱液B--乙腈中0.05％三氟醋酸；在10min内流速0.3ml/min。通过PDA记录220-400nm的UV光谱。制备内标为在100％甲醇中0.1μg/ml的溶液。50μL血浆和50μL内标被混合。加入100μL甲醇，并且充分混合。在30分钟冰上保温后，小瓶于4℃下被(20820g)离心15分钟。将150μL的上清液转移入HPLC小瓶中。

静脉内注射或者腹腔注射给药后的结果显示于下表中。简言之，在静脉内注射给药后肽从血浆清除经历了一个大致为对数的过程。在腹腔注射给药后，在40和60分钟之间达到了Cmax。此后化合物浓度降低。该分布型对于腹腔注射或者皮下注射给药是典型的。

表22：在药物动力学分析中得到的数据

[min]i.p.	5	20	40	60	80	100
							A02	0.273	0.315	0.289	0.612	0.099	0.176
A05	0.119	0.165	0.185	0.130	0.049	0.050
							A06	6.442	7.773	0.547	5.800	4.057	3.024
A07	2.444	2.627	3.180	3.869	2.202	1.678
							A09	0.034	0.067	0.060	0.129	0.074	0.068

实施例10：在A01给药后的循环分析

监控平均动脉血压和心率并且读取三个C57BI/6小鼠组的心电图，每组三个雄性和三个雌性，每只重约20g。这些组被指定为：接受10ml/kgNaCl静脉内注射的“对照”；接受10ml/kg静脉内注射的“载体”；或者以20mg/kg静脉内注射接受载体中A01的“化合物”。“载体”是用于注射的二甲亚砜5％、CremophorEL(Sigma-Aldrich)5％、水中吐温800.05％。

对于每个小鼠，充满盐水/肝素的导管被固定到颈部大动脉上。导管经由传感器被连接至血压Plugsys模块(HugoSachsElectronik-Harvard装置有限公司，德国(HSE))。ECG电极经皮下注射被植入，并且经由ECGPlugsys模块(HSE)被连接至PC。由ECG计算出心率。在至少十分钟稳定循环参数的期限后，视情况而定，盐水、载体或化合物经由与颈静脉相连接的导管被给药。在给药60分钟以后，监控并记录循环参数。对于每个动物，通过使用采用线性梯形法则的曲线下面积(AUC)，估计在给药所研究的药物后观察期内的平均动脉血压中的时间过程和心率。将单个的AUCs(A0120mg/kg，静脉内注射)与载体(10ml/kg，静脉内注射)和盐水(10ml/kg，静脉内注射)的AUCs相比较。使用精确的Wilcoxon秩和检验，评估零假设(在化合物与载体或盐水之间没有差异)。计算出未调节的和调节的用于多重比较的两侧p值。使用Bonferroni-Holm方法进行多重性调节。将显著性水平设定为5％。所有统计分析用R版2.4.0进行。针对两侧可选性，测试没有差异的零假设。结果显示于下表中。

表23：循环分析的统计结果

在给药所研究药物之后60分钟内，在平均动脉血压的AUC中在A0120mg/kg静脉内注射和盐水10ml/kg静脉内注射之间、以及在A0120mg/kg静脉内注射和载体10ml/kg静脉内注射之间没有统计学上的显著性(在5％水平)差异。在给药所研究药物之后60分钟内，在心率的AUC中在A0120mg/kg静脉内注射和盐水10ml/kg静脉内注射之间、以及在A0120mg/kg静脉内注射和载体10ml/kg静脉内注射之间没有统计学上的显著性(在5％水平)差异。

实施例11：动物疾病模型-对照试验

进行实验来开展小鼠尾部剪裁测定，从而表征FVIII(E17)-/-、FIX-/-(LinHF，Blood.1997；90：3962-6)和野生型C57BI/6小鼠中的出血参数以及它们对凝血因子制品的反应。

测试的凝血因子制品是和是rFVIII制品(巴克斯特公司，奥地利)。是提纯的血浆FIX制品(巴克斯特公司，奥地利)。

按照在具体实施方式中描述的方法，在尾部剪裁以后，在尾部剪裁测定中监控失血62分钟。FVIII-/-小鼠被用rFVIII以25、50或100U/kg静脉内注射或者单独用载体给药。载体是Advate剂型缓冲液，其为38mg/ml甘露醇、10mg/ml海藻糖、108mEq/L钠、12mM组氨酸、12mMTris、1.9mM钙、0.17mg/ml聚山梨酸酯-80、0.1mg/ml谷胱甘肽。作为对照，C57BI/6小鼠被单独给药载体。给药rFVIII导致在整个62分钟期间依赖剂量的失血减少。实验的存活数据被显示于下表中。

表24：在尾部剪裁实验中用FVIII处理的FVIII-/-小鼠的存活率

在用FIX以50、100或200U/kg静脉内注射或者单独用载体给药的FIX-/-小鼠的尾部剪裁后，监控失血62分钟。作为对照，C57BI/6小鼠被单独给药载体。给药FIX导致在整个62分钟期间依赖剂量的失血减少。实验的存活数据被显示于下表中。

表25：在尾部剪裁实验中用FIX-/-处理的FIX-/-小鼠的存活率

数据显示，在FVIII-/-模型中，25-100U/kg的FVIII剂量依赖性地改进了出血参数和存活率。在FIX-/-模型中，50-200U/kg的FIX剂量依赖性地改进了出血参数和存活率。因此，FVIII-/-模型是用于测试先导化合物的凝血FVIII活性的合适的模型。FIX-/-模型是用于测试化合物的凝血FIX活性的合适的模型。

实施例12：动物疾病模型-A01的效力

在具体实施方式中描述的尾部剪裁模型中测试被给药的A01对出血参数和FVIII-/-小鼠的存活率的影响。在FIX-/-小鼠中进行类似的实验。

在尾部剪裁之前五分钟静脉内注射给药20mg/kg的A01的8雄8雌FVIII-/-小鼠组的尾部剪裁后的失血平均体积在大多数时间点与单独给药载体的对照组小鼠的失血的平均体积相比显著地不同(p＜0.05)。载体是用于注射的水中5％二甲亚砜、5％CremopnorEL、0.05％吐温80。在尾部剪裁后52分钟和62分钟，差异是显著的，p＜0.01。数据如图2和下表所示。用于在该实验中相比较的小鼠残存曲线的对数秩检验显示，A0120mg/kg静脉内注射的存活率统计上显著地比载体对照的存活率长(p值＝0.0028)。

表26：在尾部剪裁实验中用A01处理的FVIII-/-小鼠的存活率

重复上述实验，以便提供其再现性的指示。结果显示于下表中。尽管在这两个独立进行的实验内观察到变化，但用A01处理的动物出血较少并且存活更长。

表27：在尾部剪裁实验中用A01处理的FVIII-/-小鼠的存活率

通过使用相同的模型，得到了进一步的数据，虽然尾部剪裁是1厘米而非0.5厘米，并且小鼠根据性别被分组。试剂经静脉内注射给药。在该实验中，显然A01在雌性小鼠中比在雄性小鼠中更有效。结果显示于下表中。

表28：在尾部剪断实验中在FVIII-/-小鼠中A01的性别影响

各组含有相同数量的雄性和雌性小鼠，除非另有说明。

在尾部剪裁之前五分钟静脉内注射给药20mg/kg的A01的16只FIX-/-小鼠组的尾部剪裁后的失血平均体积在任何时间点都与单独给药载体的对照组小鼠的失血的平均体积相比并没有显著不同(p＜0.05)。在给药A01的小鼠存活率和单独给药载体的小鼠存活率方面没有显著差异。

这些结果证明，A01能够通过降低失血并提高在尾部剪裁后的存活率而至少部分地弥补在FVIII-/-小鼠中FVIII的不足，但是在FIX-/-小鼠中没有效果。A01被认为是最优选的肽，因为其已经在血友病模型中显示了效力。

实施例13：在FVIII-/-小鼠尾部剪裁模型中化合物测试的结果

通过在FVIII-/-尾部剪裁模型中腹腔注射给药，采用0.5厘米尾部剪裁，进一步测试A01。数据总结于下表中。

表29：在尾部剪裁实验中用A01处理的FVIII-/-小鼠的存活率

与用载体10ml/kg腹腔注射给药的雌性小鼠相比，用A0120mg/kg给药的雌性小鼠具有统计上显著更长的存活率(5％水平)(两侧的p值p＝0.0073；对数秩检验)。在用A0120mg/kg腹腔注射给药的雄性小鼠的存活曲线与用载体10ml/kg腹腔注射给药的雄性小鼠的存活曲线之间没有统计上显著的差异(5％的水平)。在该实验中，在对照组中的雄性似乎存活得比在对照组中的雌性更好。

实施例14：表征先导化合物的实验总结

下面的化合物在限定内在凝血酶产生测定中具有活性：A01、A03、A05、A19、B01、A02、B03、B05、B06、A06、A20、A07、A08、A09和B07。其中，A03、A02、B03、A08和A09在100μM处具有至少1200mU/mLFEIBA的凝血酶产生活性。

下面的化合物在限定二元路径凝血酶产生测定中具有活性：A02、A03、A08、A09、A18、B03、B04、A07、A15、A06和A17。其中，A09在50μM处具有至少10mU/mLFEIBA的峰值IIa活性。B03、B04和A15在50或100μM处具有至少10mU/mLFEIBA的峰值IIa活性。

下面的化合物在限定纤维蛋白沉积测定中具有活性：A01、B01、A05、B03、A06和A07。

下面的化合物在人类血浆中保温30分钟后具有至少50％的稳定性：A01、A19、A07、A20、A06、A02、A03、A08、A09、B07、B06、B05和A05。

下面的化合物在PBSpH7.4中具有至少25μM的溶解度：A09、B03、B07、B06、B05、A07、A20、A06、A02、A03和A16。其中，B03、B07、B05、A07、A20、A06、A03和A16在PBSpH7.4中具有至少100μM的溶解度。

A01、A05和A16被鉴定为低效价的HERG-通道阻断剂。

A01被鉴定在FVIII-/-小鼠中在尾部剪裁测定中具有活性。

实施例15：在一个成年受试人类个体中的甲型血友病治疗

在大剂量FVIII治疗后，甲型血友病病人发展针对FVIII的同种抗体抑制剂是有代表性的。在典型的方案中，临床医生监控在由病人血浆制备的血清中这样的抗体的存在。当抗体反应的滴度不期望地变高、比如高约5BU时，临床医生可以决定停止在病人体内注入FVIII，并且开始给药本发明的肽比如肽A01。

肽可以按照US5,439,686中描述的方法而被配制为在白蛋白壳中直径约10μM的微粒，悬浮于水介质中。病人可以通过使用喷雾器吸入而自我给药该剂型。可以吸入每日或者每日两次的5或10mg剂量。临床医生可以在开始肽治疗之后不久测试部分促凝血酶原激酶时间，以便确认效力。取决于结果，剂量能够相应地被改变。如果有必要实质上提高剂量，能够使用更小的微粒，典型地为约5μM直径，并且它们能够被静脉内给药。

Claims

1.一种肽，其由下述氨基酸序列组成：

WDLYFEIVW（SEQIDNO：322）。

2.一种肽，其由下述氨基酸序列组成：

（1）RMEFDVWDLYFEIVW（SEQIDNO：325）；或

（2）RMKFDVWDLYFEIVW（SEQIDNO：326）；或

（3）PMKFDVWDLYFEIVW（SEQIDNO：330）；或

（4）RMDFDVWDLYFEIVW（SEQIDNO:331）；或

（5）WDLYFEIVWE（SEQIDNO:334）；或

（6）ERMEFDVWDLYFEIVW（SEQIDNO:4）；或

（7）WSLYFEIVWE（SEQIDNO:6）；或

（8）VWDLYFEIVW（SEQIDNO:7)。

3.如权利要求1或2所述的肽，其特征在于，该肽在N-端处被乙酰化、在C-端处被酰胺化、被连接于ttds、并且/或者在两个末端之一处被PEG化。

4.由如下物质组成的肽：

Ac-RMKFDVWDLYFEIVW-NH₂(SEQIDNO:329)；或

Ac-WDLYFEIVW-NH₂(SEQIDNO:333)；或

Ac-WDLYFEIVW-ttds-E(SEQIDNO:335)；或

ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH₂(SEQIDNO:336)；或

ERMEFDVWDLYFEIVW-NH₂(SEQIDNO:337)；或

Ac-WSLYFEIVWE(SEQIDNO:340)；或

Ac-WDLYFEISW-ttds-E(SEQIDNO:341)；或

PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH₂(SEQIDNO:342)；或

PEG5000-WSLYFEIVWE(SEQIDNO:343)；或

PEG5000-ERMEFDVWDLYFEIVW-NH₂(SEQIDNO:344)；或

Ac-VWDLYFEIVW-NH₂(SEQIDNO:345)；或

Ac-WDLYFEIVW-ttds-K(SEQIDNO:380)。

5.如权利要求1-4中任一项所述的肽，其特征在于下述各项之一或更多项：

i）所述肽的分子量在0.5和3.5kD之间；

ii）所述肽具有促凝血活性，所述促凝血活性是25、50或100μM的肽的凝血酶产生时间，相当于在限定内在凝血酶产生测定中至少100mU/mLFVIII抑制物旁路活性的促凝血活性；

iii）所述肽具有促凝血活性，所述促凝血活性是在限定内在凝血酶产生测定中，25、50或100μM的肽在30分钟内出现峰值的凝血酶产生时间；

iv）当给药于重型人甲型血友病动物模型中时，其能够至少部分地弥补生物活性FVIII的缺失；

v）其在人类血浆中在30分钟时的稳定性是至少50%；以及

vi）其在磷酸盐缓冲盐水pH7.4中的水溶性是至少25μM。

6.如权利要求5所述的肽，其特征在于下述各项之一或更多项：

a）所述促凝血活性是25μM的肽的凝血酶产生时间，相当于在限定内在凝血酶产生测定中至少100mU/mLFVIII抑制物旁路活性的促凝血活性；

b）所述促凝血活性是在限定内在凝血酶产生测定中，25μM的肽在30分钟内出现峰值的凝血酶产生时间；

c）其在人类血浆中在30分钟时的稳定性是至少70%；以及

d）其在磷酸盐缓冲盐水pH7.4中的水溶性是至少60μM。

7.如权利要求5所述的肽，其特征在于下述各项之一或更多项：

a）所述促凝血活性是50μM的肽的凝血酶产生时间，相当于在限定内在凝血酶产生测定中至少100mU/mLFVIII抑制物旁路活性的促凝血活性；

b）所述促凝血活性是在限定内在凝血酶产生测定中，25μM的肽在15分钟内出现峰值的凝血酶产生时间；

c）其在人类血浆中在30分钟时的稳定性是至少80%；以及

d）其在磷酸盐缓冲盐水pH7.4中的水溶性是至少100μM。

8.一种药物组合物，其包含如权利要求1至7中任一项所述的肽和一种以上药学可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物适合于皮下注射、鼻腔、口腔、口服或肺部给药。

10.如权利要求1至7中任一项所述的肽在药物制造中的应用，所述药物用于治疗FVIII不足的病人。

11.如权利要求10所述的应用，其特征在于，所述病人具有抗FVIII的抑制剂抗体。

12.一种通过固相合成制备如权利要求1至7中任一项所述的肽的方法。