ES2594706T3 - Péptidos biológicamente activos - Google Patents
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Abstract
Un péptido o derivado peptídico que comprende: (i) WDLYFEIVW; o (ii) una secuencia de aminoácidos variante que comprende una, dos, tres o cuatro sustituciones de Laminoácidos en WDLYFEIVW; en el que la secuencia de aminoácidos variante comprende X1X2X3YX4EX5X6X7, en la que X1 es W, L o P, X2 es D o S, X3 es L o F, X4 es F, Phg, L, Ebw, Pff, Thi, 1 Ni, Hfe, Ece o Cha, X5 es I o F, X6 es S, V o G y X7 es W o L, o (iii) la variante retro inversa del péptido o derivado peptídico de una de las partes (i) y (ii), en el que dicho péptido o derivado peptídico tiene actividad procoagulante.
Description
cromatografía de afinidad, solubilidad diferencial y (principalmente) cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa. Puede llevarse a cabo análisis de péptidos usando cromatografía de capa fina, cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa, análisis de aminoácidos después de hidrólisis ácida y por análisis espectrométrico de masas de bombardeo atómico rápido (FAB).
También puede usarse síntesis de SPOT, que permite la síntesis química direccionable posicional de los péptidos en membranas de celulosa continuas (R Frank Tetrahedron (1992) 48, 9217).
Como alternativa a las técnicas de síntesis peptídicas de fase sólida, los péptidos también pueden producirse por expresión de proteína recombinante o sistemas de traducción in vitro (Sambrook y col., "Molecular cloning: A laboratory manual", 2001, 3ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Por supuesto, solamente los péptidos que contengan restos de aminoácidos de origen natural unidos por enlaces peptídicos de origen natural son codificables por un polinucleótido. Dichos procedimientos se prefieren frente a técnicas de síntesis peptídica de fase sólida en las que el péptido es particularmente grande, tal como mayor de 50 aminoácidos, o mayor de 100 aminoácidos.
Una secuencia de aminoácidos "variante" como se define en relación con el primer aspecto de la invención puede comprender una, dos, tres o cuatro sustituciones de L-aminoácidos en WDLYFEIVW (SEQ ID NO: 1).
Preferentemente, la secuencia de aminoácidos variante comprende una secuencia de aminoácidos que comprende X1X2X3YX4EX5X6X7 en la que X1 es W, L o P, X2 es D o S, X3 es L o F, X4 es F, Phg, L, Ebw, Pff, Thi, 1 Ni, Hfe, Ece
o Cha, X5es I o F, X6es S, V o G y X7esW o L (SEQ ID NO: 1).
Más preferentemente, la secuencia de aminoácidos variante comprende una secuencia de aminoácidos que comprende X1X2X3YX4EX5X6X7 en la que X1 es W o L, X2 es D o S, X3 es L o F, X4 es F, Phg o L, X5 es I o F, X6 es S, V o G y X7 es W o L (SEQ ID NO: 1).
Una secuencia de aminoácidos "variante" como se desvela en el presente documento puede comprender una, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones de aminoácidos en imfwydcye.
Al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de dichas sustituciones en imfwydcye pueden ser D-aminoácidos.
Cualquier sustitución dentro de la variante puede ser no conservativa o conservativa.
Por "sustituciones conservativas" se entiende sustituciones dentro de los siguientes grupos: Val, Ile, Leu, Ala, Met; Asp, Glu; Asn, Gln; Ser, Thr, Gly, Ala; Lys, Arg, His; y Phe, Tyr, Trp.
Preferentemente, el péptido o derivado peptídico del primer aspecto de la invención comprende RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 2) o RMKFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 2); o una secuencia de aminoácidos variante que comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones de aminoácidos RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 2) o RMKFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 2).
Para evitar las dudas, la secuencia RMEFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 2) puede representarse como Arg-Met-Glu-Phe-Asp-Val-Trp-Asp-Leu-Tyr-Phe-Glu-Ile-Val-Trp usando el código de tres letras para aminoácidos. RMKFDVWDLYFEIVW (SEQ ID NO: 2) puede representarse como Arg-Met-Lys-Phe-Asp-Val-Trp-Asp-Leu-Tyr -Phe-Glu-IIe-Val-Trp usando el código de tres letras para aminoácidos.
Más preferentemente, la secuencia de aminoácidos variante comprende una secuencia de aminoácidos que comprende X8X9X10FDVX1X2X3YX4EX5X6X7 en la que X8 es R o P, X9 es M, Nva, Moo, N, Nle, Meo, Q, Eag, X10 es E, K o D, X! es W, L o P, X2 es D o S, X3 es L o F, X4 es F, Phg, L, Ebw, Pff, Thi, 1Ni, Hfe, Ece, Cha, X5 es I o F, X6 es S, V o G y X7 es W o L (SEQ ID NO: 2).
Más preferentemente, la secuencia de aminoácidos variante comprende una secuencia de aminoácidos que comprende X8X9X10FDVX1X2X3YX4EX5X6X7 en la que X8 es R o P, X9 es M o Nva, X10 es E, K o D, X1 es W o L, X2 es D o S, X3 es L o F, X4es F, Phg o L, X5es I o F, X6es S, V o G y X7 es W o L (SEQ ID NO: 2).
Convenientemente, el péptido o derivado peptídico del primer aspecto de la invención es un péptido o derivado peptídico como se representa en la tabla posterior, o comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de un péptido o derivado peptídico como se representa en las Tablas 1 a 3 posteriores:
Tabla 1: péptidos más preferidos
- Péptido
- Secuencia
- SEQ ID NO: 2
- A01 Ac-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A02 Ac-PMKFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A03 Ac-RMDFDVWDLYFEIVW-NH2
7
(continuación)
- Péptido
- Secuencia
- SEQ ID NO: 2
- A04 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A05 Ac-WDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 3
- A06 Ac-WDLYFEIVWE
- SEQ ID NO: 1
- A07 Ac-WDLYFEIVW-ttds-E
- SEQ ID NO: 2
- A08 ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 4
- A09 ERMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 5
- A12 ERXEFDVWDLYFEIVW-NH2 X es Nva
- A13
- ttds-RMEFDVWDLYXEIVW-ttds-NH2 X es Phg
- SEQ ID NO: 6
- A14 Ac-WSLYFEIVWE
- SEQ ID NO: 1
- A15 Ac-WDLYFEISW-ttds-E
- SEQ ID NO: 2
- A16 PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 6
- A17 PEG5000-WSLYFEIVWE
- SEQ ID NO: 4
- A18 PEG5000-ERMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 7
- A19 Ac-VW DLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 8
- A21 Ac-FDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 9
- A24 EWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A25 E-ttds-WDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A26 Ac-WDLYFEIVW-ttds-E-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A27 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW
- SEQ ID NO: 2
- A28 RMEFDVWDLYFEIVW
- SEQ ID NO: 2
- A29 Ac-K-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 10
- A30 Ac-RMEFDVWDLYFEIVWK
- SEQ ID NO: 10
- A31 Ac-RMEFDVWDLYFEIVWK-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A32 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-K-NH2
- SEQ ID NO: 11
- A33 Ac-WDLYFEISWE
- SEQ ID NO: 12
- A34 Ac-WDLYLEIVWE
- SEQ ID NO: 13
- A35 Ac-WDLYFEIVLE
- SEQ ID NO: 1
- A38 WDLYFEIVW
- SEQ ID NO: 2
- A49 RMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A50 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 14
- A52 Ac-KRMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A53 K-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A54 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-K
- SEQ ID NO: 1
- A55 Ac-LDLYFEIVW-ttds-E
- SEQ ID NO: 1
- A56 Ac-W DLYFEIVL-ttds-E
- SEQ ID NO: 15
- A57 E-RMEFDVLDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 16
- A58 E-RMEFDVWDLYFEIVL-NH2
8
(continuación)
- Péptido
- Secuencia
- SEQ ID NO: 17
- A84 Ac-WDFYFEIVWE
- SEQ ID NO: 18
- A85 Ac-WDLYFEFVWE
- SEQ ID NO: 19
- A86 Ac-LDLYFEIVWE
- SEQ ID NO: 20
- A87 Ac-WDLYFEIGWE
- SEQ ID NO: 21
- A89 Ac-WDLYLEISLE
- A90
- Ac-WDLYXEIVLE X es Phg
- A91
- Ac-WSLYXEIVWE X es Phg
- SEQ !D NO: 22
- A92 Ac-LDLYFEIVLE
- SEQ ID NO: 23
- A93 Ac-LDLYFEISLE
- A94
- Ac-LDLYXEISWE X es Phg
- SEQ ID NO: 24
- A95 Ac-LSLYFEIVWE
- SEQ ID NO: 25
- A96 Ac-LSLYFEIVLE
- SEQ ID NO: 26
- A97 Ac-LSLYFEISLE
Tabla 2: péptidos preferidos
- Péptido
- Secuencia
- SEQ ID NO: 1
- A20 Ac-WDLYFEIVW-ttds-K
- SEQ ID NO: 27
- A22 Ac-DVWDLYFEIVW-NH2
- A23
- Ac-wviefyldwvdfkmr-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A37 Ac-WDLYFEIVW
- SEQ ID NO: 1
- A39 Ac-ttds-WDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A40 ttds-WDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A41 Ac-WDLYFEIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A42 Ac-ttds-WDLYFEIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A43 ttds-WDLYFEIVW-ttds
- SEQ ID NO: 1
- A44 ttds-WDLYFEIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 28
- A45 Ac-KWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A46 Ac-K-ttds-WDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 29
- A47 Ac-WDLYFEIVWK
- SEQ ID NO: 29
- A48 Ac-WDLYFEIVWK-NH2
- A71
- E-R(Moo)EFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 30
- A73 E-RNEFDVWDLYFEIVW-NH2
- A78
- ttds-RMEFDVWDLY(Ebw)EIVW-ttds-NH2
- A83
- ttds-RMEFDVWDLY(Pff)EIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 31
- A88 Ac-PDLYFEIVWE
- SECT ID NO: 32
- A98 Ac-LSLYLEIVLE
- SEQ ID NO: 33
- A99 Ac-LSLYLEISLE
9
(continuación)
- Péptido
- Secuencia
- A100
- Ac-LSLYXEIVLE X es Phg
- SEQ ID NO: 1
- A101 Ac-WDLYFEIVW-ttds-K-NH2
Tabla 3: péptidos activos
- Péptido
- Secuencia
- SEQ ID NO: 34
- A10 E-PMKFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A11 ttds-RMDFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A16 PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A36 WDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 14
- A51 KRMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A59 ttds-PMKFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 35
- A60 E-RMDFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A61 (Coh)-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A62 Glucosil-aminooxiacetil-ttds-RMEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
- A63
- Ac-P(Moo)KFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A64 Ac-P(Nle)KFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A65 Ac-PNKFDVWDLYFEIVW-NH2
- A66
- Ac-R(Moo)DFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A67 Ac-R(Nle)DFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A68 Ac-RNDFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A69 ttds-R(Nle)EFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A70 ttds-RNEFDVWDLYFEIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 321
- A72 E-R(Nle)EFDVWDLYFEIVW-NH2
- A74
- E-R(Meo)EFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 36
- A75 E-R(Gln)EFDVWDLYFEIVW-NH2
- A76
- E-R(Eag)EFDVWDLYFEIVW-NH2
- A77
- ttds-RMEFDVWDLY(Thi)EIVW-ttds-NH2
- A79
- ttds-RMEFDVWDLY(1Ni)EIVW -ttds-NH2
- A80
- ttds-RMEFDVWDLY(Hfe)EIVW-ttds-NH2
- A81
- ttds-RMEFDVWDLY(Ece)EIVW-ttds-NH2
- A82
- ttds-RMEFDVWDLY(Cha)EIVW-ttds-NH2
- SEQ ID NO: 28
- A102 KWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A103 K-ttds-WDLYFEIVW-NH2
- En las tablas anteriores, -ttds-es 4, 7, 10-trioxa-1,13-tridecanodiamina. "N" es asparagina. "NH2" es un grupo amida C-terminal.
Preferentemente, el péptido o derivado peptídico del primer aspecto de la invención no comprende o consiste en un péptido representado en la lista a continuación:
10
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
Cuando se proporciona una concentración peptídica en el presente documento en relación con el ensayo de deposición de fibrina definido, debe entenderse que no es la concentración del péptido en el volumen de ensayo final, sino la concentración corregida con respecto al volumen de plasma. La concentración en el volumen de ensayo final es la concentración corregida dividida por 4. Por tanto, cuando se proporciona una concentración de 100 μM, la concentración real en el volumen de ensayo final es de 25 μM. De forma similar, la actividad equivalente de FEIBA también se corrige con respecto a volumen de plasma. Por lo tanto, si se indica que a 100 μM un péptido tiene una actividad equivalente a 100 mU/ml de FEIBA en el ensayo de deposición de fibrina definido, la concentración de péptido en el volumen de ensayo final es de 25 μM y la concentración equivalente de FEIBA en el ensayo de control es de 25 mU/ml de FEIBA.
Preferentemente, los péptidos y derivados peptídicos del primer aspecto de la invención y el péptido doble del segundo aspecto de la invención pueden compensar al menos parcialmente la ausencia de FVIII biológicamente activo cuando se administran en un modelo animal de hemofilia A humana grave. Por ejemplo, pueden estar activos en el control de la hemorragia en ratones deficientes en FVIII, tales como las cepas descritas en detalle en Bi y col. (Nat Genet. 1995;10: 119-21), en las que el exón 17 o exón 16 de FVIII está alterado. Están disponibles ratones exón 16 de FVIII -/-de Jackson Laboratory, 600 Main Street, Bar Harbor, Maine 04609 Estados Unidos (nombre de cepa: B6;12954-F8tm1Kaz/J).
Un ensayo adecuado para ensayar la capacidad de un compuesto para controlar la hemorragia es el ensayo de corte de la cola. Se administran péptidos, derivados peptídicos o péptidos dobles a ratones en un vehículo adecuado, típicamente i.v., i.p. o s.c. Pueden administrarse diferentes dosis de cada péptido o derivado peptídico a diferentes grupos de ratones para determinar la dependencia de la dosis. Los grupos de ratones, típicamente 8 -16 ratones con supresión de exón 17 de FVIII machos y hembras con diátesis hemorrágica grave, reciben una única inyección de embolada i.v. (vena de la cola) o s.c. (10 ml/kg de peso corporal). Dos minutos antes del corte de la cola los animales se anestesian mediante la aplicación i.p. de ketamina 100 mg/kg y xilacina 5 mg/kg. Cinco minutos después de la administración de péptido o derivado peptídico i.v. y 60 minutos después de i.p. o s.c. se cortan 0,5 cm de la punta de la cola. Se recoge sangre que gotea de la herida en tubos que contienen 5,0 ml de NH3 0,04 % durante periodos de tiempo definidos tal como 0-2 minutos, 2-4 minutos, 4-6 minutos, 6-8, 8-10, 10-12, 1214, 14-16, 16-20, 20-24, 24-28, 28-32, 32-42, 42-52 y 52-62 minutos. Las células sanguíneas en cada tubo se rompen y se extrae la hemoglobina durante un periodo de incubación de tres horas a temperatura ambiente seguido de tratamiento con ultrasonidos. Se determina la absorbancia a 414 nm y 620 nm de los extractos en placas de micro titulación. 620 nm es una longitud de onda de referencia y la lectura de A620 se resta de la lectura de A414. La cantidad de sangre en el extracto correspondiente a la lectura restada se calcula a partir de una curva patrón creada por cantidades conocidas de sangre de ratones de control de tipo silvestre, tales como ratones C57/BI6. Los parámetros de las características de hemorragia de los ratones para registrar son pérdida de sangre total, velocidad de hemorragia, tiempo de hemorragia, supervivencia a las 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 24 h y 48 h. La pérdida de sangre acumulada se calcula sumando las cantidades de sangre para cada periodo de tiempo. Se promedian los datos para los animales de un grupo y se representan frente al tiempo de hemorragia. En cada punto temporal se analizan conjuntos de datos para grupos de tratamiento y de control de vehículo mediante ensayo de t de Student con respecto a significación estadística.
Preferentemente, los ratones a los que se ha administrado el péptido, derivado peptídico o péptido doble tienen una pérdida de sangre en el ensayo de corte de la cola a los 62 minutos desde el corte de la cola de no más del 70 % de la pérdida de sangre de ratones a los que se ha administrado el vehículo solamente, más preferentemente no más del 60 % y más preferentemente no más del 50 % de la pérdida de sangre de ratones a los que se ha administrado el vehículo solamente.
Preferentemente, la supervivencia de ratones a los que se ha administrado el péptido, derivado peptídico o péptido doble en el ensayo anterior es de al menos 40 %, más preferentemente al menos 60 % y más preferentemente al menos 80 % a las 2 horas después del corte de la cola. Preferentemente, la supervivencia de ratones a los que se ha administrado el péptido o derivado peptídico en el ensayo de corte de la cola es de al menos 20 %, más preferentemente al menos 30 % y más preferentemente al menos 40 % a las 24 horas después del corte de la cola.
Preferentemente, el péptido o derivado peptídico del primer aspecto de la invención o el péptido doble del segundo aspecto de la invención tiene una estabilidad en plasma humano a los 30 minutos de al menos 50 %, preferentemente al menos 70 %, más preferentemente al menos 80 % y más preferentemente al menos 90 %. Se describe en los ejemplos un ensayo adecuado para determinar la estabilidad en el plasma humano.
Preferentemente, el péptido o derivado peptídico del primer aspecto de la invención o el péptido doble del segundo aspecto de la invención tiene una solubilidad acuosa en solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 a 25 °C de al menos 25 μM, preferentemente al menos 60 μM y más preferentemente al menos 100 μM. Se describe en los ejemplos un ensayo adecuado para determinar la solubilidad acuosa en solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 a 25°C.
En el presente documento, la expresión "factor VIII" o "FVIII" se refiere a cualquier resto de FVIII que muestre actividad local que esté asociado con FVIII nativo. La secuencia de FVIII puede encontrarse como el número de referencia NCBI NP_000123 o la entrada de UniProtKB/Swiss-Prot P00451.
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Como se usa en el presente documento, "FVIII derivado de plasma" incluye todas las formas de la proteína halladas en sangre obtenida de un mamífero que tiene la propiedad de activar la ruta de coagulación.
Como se usa en el presente documento, "rFVIII" indica FVIII obtenido mediante tecnología de ADN recombinante.
Un tercer aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el péptido o derivado peptídico del primer aspecto de la invención o el péptido doble del segundo aspecto de la invención. Los péptidos, derivados peptídicos y péptidos dobles pueden estar en forma de sales, solvatos o hidratos farmacéuticamente aceptables. Convenientemente, la composición farmacéutica comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable. El vehículo puede ser preferentemente una formulación líquida y es preferentemente una solución tamponada, isotónica, acuosa. Convenientemente, la composición farmacéutica tiene un pH que es fisiológico o cercano al fisiológico. Convenientemente tiene osmolaridad y salinidad fisiológicas o cercanas a las fisiológicas. Puede contener cloruro sódico y/o acetato sódico. Los péptidos, derivados peptídicos y péptidos dobles de la invención pueden prepararse sin pirogenicidad significativa que podría aparecer en la producción de tratamientos biológicos. Esto puede ser importante, especialmente para formulaciones intravenosas en las que solamente pueden tolerarse bajos niveles de endotoxina. Se prefiere que las formulaciones subcutáneas, intraperitoneales, bucales, intravenosas y otras parenterales sean estériles y sin endotoxinas.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables también incluyen excipientes, tales como diluyentes y similares, y aditivos, tales como agentes estabilizantes, conservantes, agentes solubilizantes, y similares. Los péptidos de la presente invención también pueden estar en forma de cualquier sal farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa aprobado por una agencia reguladora de los Estados Unidos o la Unión Europea u otro gobierno o enumerado en la farmacopea de Estados Unidos u otra farmacopea reconocida en general para su uso en seres humanos.
La composición también puede ser por ejemplo una suspensión, emulsión, formulación de liberación sostenida, crema, gel o polvo. La composición puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y vehículos tradicionales tales como triglicéridos.
Aunque es posible el suministro intravenoso de los péptidos, derivados peptídicos y péptidos dobles de la presente invención, se prefiere una vía no intravenosa, particularmente suministro subcutáneo, nasal, bucal, oral o pulmonar. También puede usarse suministro intraperitoneal (i.p.).
Las composiciones farmacéuticas pueden comprender adicionalmente, por ejemplo, uno o más de agua, tampones, (por ejemplo, solución salina tamponada neutra o solución salina tamponada con fosfato), etanol, aceite mineral, aceite vegetal, dimetilsulfóxido, carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa o dextranos), manitol, proteínas, adyuvantes, polipéptidos o aminoácidos tales como glicina, antioxidantes, agentes quelantes tales como EDTA o glutatión y/o conservantes. Además, pueden incluirse (aunque no es necesario) uno o más principios activos adicionales en las composiciones farmacéuticas proporcionadas en el presente documento.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse para cualquier modo apropiado de administración incluyendo, por ejemplo, administración tópica (por ejemplo, transdérmica u ocular), oral, bucal, nasal, vaginal, rectal o parenteral. El término parenteral como se usa en el presente documento incluye inyección subcutánea, intradérmica, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, espinal, intracraneal, intratraqueal, intraocular, periocular, intraorbital, intrasinovial e intraperitoneal, así como cualquier técnica de inyección o infusión similar. Las formas adecuadas para uso oral incluyen, por ejemplo, comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las composiciones proporcionadas en el presente documento pueden formularse como un liofilizado.
Las suspensiones acuosas contienen el principio o los principios activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes incluyen agentes de suspensión (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidropropilmetilcelulosa, alginato sódico, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma arábiga); y agentes de dispersión o humectantes (por ejemplo, fosfátidos de origen natural tales como lecitina, productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos tales como polioxietilenestearato, productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga tales como heptadecaetilenoxicetanol, productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como polioxietilensorbitol monooleato, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol tales como polietilensorbitan monooleato). Las suspensiones acuosas también pueden comprender uno o más conservantes, por ejemplo etil o npropil p-hidroxibenzoato, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saporíferos y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.
Los péptidos o derivados peptídicos pueden formularse para administración local o tópica, tales como para aplicación tópica a la piel, heridas o membranas mucosas, tal como en el ojo. Las formulaciones para administración tópica típicamente comprenden un vehículo tópico combinado con un agente o agentes activos, con o sin componentes adicionales opcionales. Se conocen bien en la técnica vehículos tópicos adecuados y componentes adicionales, y resultará evidente que la elección de un vehículo dependerá de la forma física particular y el modo de
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suministro. Los vehículos tópicos incluyen agua, disolventes orgánicos tales como alcoholes (por ejemplo, etanol o alcohol isopropílico) o glicerina; glicoles (por ejemplo, butilen, isopren o propilenglicol); alcoholes alifáticos (por ejemplo, lanolina); mezclas de agua y disolventes orgánicos y mezclas de disolventes orgánicos tales como alcohol y glicerina; materiales basados en lípidos tales como ácidos grasos, acilgliceroles (incluyendo aceites, tales como aceite mineral, y grasas de origen natural o sintético), fosfoglicéridos, esfingolípidos y ceras; materiales basados en proteínas tales como colágeno y gelatina; materiales basados en silicona (tanto volátiles como no volátiles); y materiales basados en hidrocarburos tales como microesponjas y matrices poliméricas. Una composición puede incluir además uno o más componentes adaptados para mejorar la estabilidad o eficacia de la formulación aplicada, tales como agentes estabilizantes, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, reguladores de la viscosidad, agentes gelificantes, conservantes, antioxidantes, potenciadores de la penetración cutánea, humectantes y materiales de liberación sostenida. Se describen ejemplos de dichos componentes en Martindale -The Extra Pharmacopoeia (Pharmaceutical Press, Londres 1993) y Martin (ed.), Remington’s Pharmaceutical Sciences. Las formulaciones pueden comprender microcápsulas, tales como hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas o nanocápsulas.
Una composición farmacéutica puede formularse como formulaciones inhaladas, incluyendo pulverizaciones, nebulizaciones o aerosoles. Para formulaciones de inhalación, los compuestos proporcionados en el presente documento pueden suministrarse mediante cualquier procedimiento de inhalación conocido por los expertos en la materia. Dichos procedimientos y dispositivos de inhalación incluyen, pero sin limitación, inhaladores de dosis medida con propulsores tales como CFC o HFA o propulsores que son fisiológica y ambientalmente aceptables. Otros dispositivos adecuados son inhaladores accionados por respiración, inhaladores de polvo seco multidosis y nebulizadores en aerosol. Las formulaciones de aerosol para uso en el procedimiento objeto típicamente incluyen propulsores, tensioactivos y codisolventes y pueden cargarse en recipientes de aerosol convencionales que se cierran por una válvula de medición adecuada.
Las composiciones inhalantes pueden comprender composiciones líquidas o en polvo que contienen el principio activo que son adecuadas para nebulización y uso intrabronquial, o composiciones de aerosol administradas mediante una unidad de aerosol que dosifica dosis medidas. Las composiciones líquidas adecuadas comprenden el principio activo en un disolvente inhalante acuoso, farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina isotónica o agua bacteriostática. Las soluciones se administran por medio de una bomba o dosificador de pulverización nebulizada accionado por presión, o mediante cualquier otro medio convencional para provocar o permitir la inhalación de la cantidad de dosificación requerida de la composición líquida en los pulmones del paciente. Las formulaciones adecuadas, en las que el vehículo es un líquido, para administración, como por ejemplo, una pulverización nasal o como gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleosas del principio activo.
Las formulaciones o composiciones adecuadas para administración nasal, en las que el vehículo es un sólido, incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 micrómetros que se administra de la misma manera que se administra el rapé (es decir, mediante inhalación rápida a través del orificio nasal desde un recipiente del polvo mantenido cerca de la nariz). Las composiciones de polvo adecuadas incluyen, como ilustración, preparaciones en polvo del principio activo entremezclado exhaustivamente con lactosa u otros polvos inertes aceptables para administración intrabronquial. Las composiciones en polvo pueden administrarse mediante un dosificador en aerosol o encerrarse en una cápsula rompible que puede insertarse por el paciente en un dispositivo que perfora la cápsula y expulsa el aire en un torrente continuo adecuado para inhalación.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse como formulaciones de liberación sostenida (es decir, una formulación tal como una cápsula que efectúa una liberación lenta del modulador después de la administración). Dichas formulaciones pueden en general prepararse usando tecnología bien conocida y administrarse, por ejemplo, mediante implantación oral, rectal o subcutánea, o mediante implantación en el sitio diana deseado. Los vehículos para el uso dentro de dichas formulaciones son biocompatibles y también pueden ser biodegradables; preferentemente la formulación proporciona un nivel relativamente constante de liberación de modulador. La cantidad de modulador contenida dentro de una formulación de liberación sostenida depende, por ejemplo, del sitio de implantación, la velocidad y duración esperada de liberación y la naturaleza de la afección para tratar o prevenir.
Pueden formularse composiciones farmacéuticas con un agente para mejorar la biodisponibilidad, tal como un disolvente orgánico. Por ejemplo, Cremophor EL® (Producto n.º 00647/1/63; BASF Aktiengesellschaft, Alemania) es un aceite de ricino polietoxilado que se prepara haciendo reaccionar 35 moles de óxido de etileno con cada mol de aceite de ricino. Puede usarse para estabilizar emulsiones de materiales no polares en sistemas acuosos. Como alternativa, el péptido, derivado peptídico o péptido doble puede incorporarse dentro de, o unido a, una micro o nanopartícula proteica para una biodisponibilidad mejorada. Se describen micro y nanopartículas adecuadas en el documento US 5.439.686 (Desai y col.; Vivorx Pharmaceuticals, Inc., CA) y documento US 5.498.421 (Grinstaff y col.; Vivorx Pharmaceuticals, Inc., CA). Convenientemente, las nanopartícula proteica comprende albúmina de suero humano, particularmente albúmina de suero humano o una forma recombinante de la misma. El documento WO 2007/077561 (Gabbai; Do-Coop Technologies Ltd., Israel) describe otro vehículo adecuado que comprende nanoestructuras y un líquido, denominado en el mismo Neowater™.
Para administración oral y parenteral a pacientes, incluyendo pacientes humanos, el nivel de dosificación diario del péptido, derivado peptídico o péptido doble de la invención será habitualmente de 2 a 2000 mg por adulto (es decir
20
amina. Después de acoplar el PEG5000 al extremo N terminal, se separó por escisión el grupo protector de ivDde mediante hidrato de hidracina 3 % en dimetilformamida seguido de repurificación del producto final por HPLC.
Se identificaron compuestos que se consideraba que promovían la generación de trombina, como se indica en las Tablas 7 y 8 posteriores.
Tabla 7: compuestos basados en A01
- Péptido
- Secuencia
- SEQ ID NO: 2
- A01 Ac-RMKFDVWOLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A02 Ac-PMKFDVW DLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A03 Ac-RMDFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A04 Ac-RMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A05 Ac-WDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 3
- A06 Ac-WDLYFEIVWE
- SEQ ID NO: 1
- A07 Ac-WDLYFEIVW-O-E
- SEQ ID NO: 2
- A08 O-RMEFDVWDLYFEIVW-O-NH2
- SEQ ID NO: 4
- A09 ERMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 34
- A10 EPMKFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 2
- A11 O-RMDFDVWDLYFEIVW-O-NH2
- SEQ ID NO: 5
- A12 ERXEFDVWDLYFEIVW-NH2 X es Nva
- A13
- O-RMEFDVWDLYXEIVW-O-NH2 X es Phg
- SEQ ID NO: 6
- A14 Ac-WSLYFEIVWE
- SEQ ID NO: 1
- A15 Ac-WDLYFEISW-O-E
- SEQ ID NO: 2
- A16 PEG5000-RMKFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 6
- A17 PEG5000-WSLYFEIVWE
- SEQ ID NO: 4
- A18 PEG5000-ERMEFDVWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 7
- A19 Ac-VWDLYFEIVW-NH2
- SEQ ID NO: 1
- A20 Ac-WDLYFEIVW-O-K
- En la tabla anterior, O-es 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (ttds)
Tabla 8: Compuestos basados en B01
- Péptido
- Secuencia
- B01
- Ac-(ci mfwydc)-ye-NH2
- B02
- Ac-(cymfwyd c)-ye-NH2
- B03
- Ac-cimfwydeye-NH2
- B04
- Disulfuro-Dímero (Ac-cimfwydeye-NH2)2
- B05
- Ac-O-(cymfwydc)-ye-NH2
- B06
- K-O-(cymfwydc)-ye-NH2
- B07
- Ac-simfwydeye-NH2
- En la tabla anterior, -O-es 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanodiamina (ttds). Los péptidos reales usados en este estudio, designados B01, B02, B05 y B06, fueron cíclicos.
22
(continuación)
- Plasma inhibido para FVIII de DDPTGA
- Plasma deficiente en FVIII de DDPTGA
- Péptido
- Conc [μm] Tiempo pico FEIBA EU (mU/ml) Pico IIa FEIBA EU (mU/ml) Tiempo pico FVIIa EU (nM) Pico IIa FVIIa EU (nM) Tiempo pico FVIII EU (mU/ml) Pico IIa FVIII EU (mU/ml)
- A03
- 100 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A03
- 50 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A05
- 100 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A05
- 50 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A08
- 50 9,1 BLS 0,4 BLS BLS BLS
- A09
- 50 BLS 8,6 BLS BLS 27,2 BLS
- A09
- 25 7,9 BLS 0,2 BLS 15,6 BLS
- A18
- 100 BLS BLS BLS BLS 17,1 BLS
- A18
- 50 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A01
- 90 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A01
- 50 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A16
- 100 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A16
- 50 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- B03
- 100 BLS 12,3 BLS 0,6 7,5 5,3
- B03
- 40 BLS 7,2 BLS 0,2 8,7 4,8
- B04
- 100 BLS 13,3 BLS 0,7 1,6 5,0
- B04
- 40 BLS 12,8 BLS 0,6 7,3 4,8
- B04
- 16 BLS BLS BLS 0,1 4,1 4,4
- A07
- 100 BLS BLS BLS 0,1 BLS BLS
- A07
- 50 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A15
- 100 BLS 13,6 BLS 0,7 12,7 5,0
- A15
- 50 BLS BLS BLS BLS 14,4 4,3
- A06
- 100 BLS BLS 0,4 BLS BLS BLS
- A06
- 50 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A14
- 100 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A14
- 50 BLS BLS BLS BLS BLS BLS
- A17
- 100 BLS BLS 0,1 BLS 5,9 BLS
- A17
- 50 BLS BLS BLS BLS 5,1 BLS
El "pico Ila" es la cantidad de trombina generada en el pico de la curva de generación de trombina. El “tiempo pico” es el tiempo desde el inicio de la reacción de generación de trombina hasta cuando se genera la cantidad máxima. 5 BLS = por debajo del patrón más bajo.
Aún se genera trombina en este ensayo incluso en ausencia de péptido añadido. Por lo tanto, cuando el pico IIa es "BLS" a una concentración de péptido particular, aún hay un pico de trombina, pero es menor que el conseguido por la concentración más baja de patrón, que es FVIII 5 mU/ml, 8 mU/ml de FEIBA o FVII 0,1 nM. De forma similar, cuando el tiempo pico es "BLS", el tiempo hasta la generación de trombina pico es mayor que el tiempo pico 10 obtenido por la concentración más baja de patrón. Un péptido puede tener un efecto significativo en el tiempo pico
24
pero no el pico IIa, o viceversa. Sin embargo, se prefiere que un péptido tenga un efecto tanto en el tiempo pico como en el pico IIa. B03, B04 y A15 afectaron positivamente a ambos aspectos de la generación de trombina. En el caso de algunos péptidos, la dependencia de la concentración de un efecto en la generación de trombina no se vio a alta concentración de péptido, lo que podría explicarse por interacciones no específicas.
5 Ejemplo 3: Ensayos de compuestos en ensayos de generación de trombina con varios plasmasempobrecidos
El ensayo de generación de trombina in vitro basado en la escisión de Z-GGR-AMC para liberar el fluoróforo AMC, descrito en la descripción específica, es decir el ensayo de generación de trombina de ruta doble definido se usó para caracterizar el efecto de los compuestos en varios plasmas humanos empobrecidos. En estos experimentos,
10 cada reacción de 100 μl contenía 10 μl de reactivo B, que comprende vesículas fosfolipídicas de fosfatidilcolina / fosfatidilserina 80 % / 20 % (3,2 μM) y factor tisular humano recombinante 17,9 pM. 10 μl de dilución de péptido, 40 μl de sustrato de TGA y 40 μl de plasma se usaron como se describe en la descripción específica.
Los plasmas usados en los experimentos fueron congelados nuevos y eran deficientes en factor V, factor VII / VIla, factor VIII, factor X o factor XI (George King Bio-Medical, Inc.). Los niveles de factor de coagulación residual de
15 plasmas deficientes se especificaron como menos del 1 %.
Para cada plasma empobrecido usado en los experimentos, los compuestos se ensayaron a dos concentraciones, concretamente 50 μM y 80, 90 o 100 μM. Se usó un control negativo, en el que no se incluyó ningún compuesto de ensayo. Los resultados se resumen en la tabla posterior.
Tabla 11: Sumario de resultados del efecto de compuestos en la generación de trombina en diversos plasmas 20 empobrecidos
- Plasma empobrecido
- Compuestos
- Control
- A01 A02 A05 B03 A06 A07 A08 A09
- FV
- - - - - - + - -
- FVII
- - + + + + + + +
- FVIII
- - + + + + + + + +
- FX
- - - + + + + + +
- FXI
- - + + + + + + +
- Estimulación de generación de trombina: "+" significa que estimula; "-" significa que no estimula. En experimentos de control, no se incluyó péptido.
Todos los plasmas empobrecidos ensayados mostraron ninguna o muy poca generación de trombina en ausencia de péptidos, lo que indica que a la concentración de factor tisular usada la interacción de todos los factores de coagulación es importante para la generación de trombina. Varios péptidos estimularon la generación de trombina en
25 todos los plasmas empobrecidos para zimógeno (FVII, FX o FXI) mientras que la generación de trombina en plasmas empobrecidos para FV es baja, lo que indica que la ruta común es importante para la generación de trombina estimulada por péptido.
Ejemplo 4: actividad de compuestos en ensayo de deposición de fibrina definido
Se ensayaron diversos péptidos con respecto a la capacidad para estimular la deposición de fibrinas en ensayo de
30 deposición de fibrina definido como se describe en la descripción específica. Los resultados se muestran en la tabla posterior.
Tabla 12: caracterización de compuestos en el ensayo de deposición de fibrina definido
- Compuesto
- Concentración (μM) FEIBA EU (mU/ml)
- A01
- 100 145
- A01
- 50 127
- A01
- 25 80
- B01
- 100 94
25
- 3.
- Análisis de circulación
Se supervisó la presión sanguínea y la frecuencia cardiaca y se tomó un electrocardiograma en ratones C57BI/6.
- 4.
- Modelo de enfermedad animal
Se usó un modelo de corte de la cola en ratones FVIII -/-(E17), ratones FIX -/-y ratones de control C57BI/6. Los 5 parámetros cuantificados fueron pérdida de sangre total, tiempo de hemorragia, velocidad de la hemorragia y supervivencia.
Ejemplo 8: toxicología aguda
Se administraron a ratones C57BI/6 que pesaban 18-20 g compuestos en un vehículo adecuado i.v. en la vena de la cola o i.p. o s.c. a 10 ml/kg. Las cantidades de los compuestos administrados estuvieron en el intervalo de 0,075 a
10 125 mg/kg (i.v.), 15-125 mg/kg (i.p.) y 125 mg/kg (s.c.). Hubo cuatro ratones por grupo. Se supervisaron los cambios de actitud debido a efectos tóxicos inmediatamente después de la administración del compuesto y durante 60 minutos a continuación. Se supervisó el peso corporal durante cinco días después de la administración. El día 5 después de la administración, los ratones se sacrificaron y se realizó una autopsia. Se tomaron biopsias del cerebro, corazón, riñón, pulmón, hígado y bazo. Los resultados se describen a continuación.
15 Tabla 21: cambios de actitud debido a efectos tóxicos en diferentes dosis de compuesto
- Compuesto
- Vía Dosis máxima (mg/kg) dentro de la categoría de toxicidad
- Sin toxicidad detectada
- Algo de toxicidad Toxicidad grave
- A01
- i.v. 20
- i.p.
- 20
- A02
- i.v. 25
- i.p.
- 25
- A05
- i.v. 1,5 15
- i.p.
- 15
- B03
- i.v. 1,5 15
- i.p.
- 15
- A06
- i.v. 1 5 25
- i.p.
- 25
- A07
- i.v. 1 5 25
- i.p.
- 25
- A09
- i.v. 15
- i.p.
- 15
- A16
- i.v. 82
- i.p.
- 82
- A17
- i.v. 125
- i.p.
- 125
- s.c.
- 125
En la tabla anterior, se indica la dosis máxima ensayada que da lugar a ausencia de toxicidad detectada, alguna toxicidad o toxicidad grave durante el periodo de 60 minutos después de la administración. La “ausencia de toxicidad detectada” indica que no hay observaciones tóxicas agudas. “Algo de toxicidad” indica que se ha registrado ataxia o catalepsia, pero no murió ningún animal. La “toxicidad grave” indica que uno de los animales murió en un periodo de
20 una hora desde la aplicación del compuesto.
En resumen, la mayoría de los compuestos se toleraron bien. Las dosis de compuestos que dieron como resultado toxicidad grave cuando se administraron por una vía particular no se ensayaron en farmacocinética, análisis de
32
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-
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