MX2011006802A - Acilasas de penicilina g mutante. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con una acilasa de penicilina G procariótica mutante derivada de una acilasa de penicilina G tipo natural caracterizada porque el mutante tiene una sustitución de aminoácido en una o más posiciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de posiciones de aminoácido A3, A77, A90, A144 A192, B24, B109, B148, B313, B460 y B488 de acuerdo con la numeración de aminoácido de la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli que tiene la secuencia de aminoácido descrita en la SEQ ID No: 1.

Description

ACILASAS DE PENICILINA G MUTANTE CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con una acilasa de penicilina mutada y un proceso para la preparación de un antibiótico ß-lactama en donde un núcleo ß-lactama se acila con la ayuda de una cadena lateral activada en la presencia de una acilasa de penicilina mutada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia ß-lactama de antibióticos es la clase más importante de compuestos antibacterianos en aplicación clínica. El espectro bactericida estrecho de los antibióticos ß-lactama de ocurrencia natural, su baja estabilidad de ácido y los problemas de resistencia incrementada han activado el desarrollo de antibióticos semisintéticos (SSA) tal como las penicilinas semisintéticas (SSP) y las cefalosporinas semisintéticas (SSC) . En general, la síntesis química de los antibióticos ß-lactama semisintéticos se desarrolla bajo condiciones muy duras utilizando intermedios reactivos y disolventes orgánicos a bajas temperaturas, originando altos costos de procesamiento corriente abajo y procesos que no son amigables con el medio ambiente. Por lo tanto, existe un esfuerzo continuo para reemplazar los procesos químicos tradicionales mediante conversión enzimática, con el fin de obtener una producción más sostenible de los antibióticos ß-lactama semisintéticos .

Las ß-lactamas naturales consisten típicamente de núcleos ß-lactama (por ejemplo ácido 6-amino-penicilánico (6-APA), ácido 7 -amino-desacetoxi-cefalosporánico (7-ADCA) y otros) y una así llamada cadena lateral, que se conecta al núcleo por medio de un enlace amida. La acilasa de penicilina G (EC 3.5.1.11) es una enzima hidrolítica que se utiliza ampliamente para remover la cadena lateral de la penicilina G (PenG) , cefalosporina G (CefG) y antibióticos relacionados para producir el núcleo desacilado correspondiente 6 -APA y 7-ADCA respectivamente junto con la cadena lateral liberada (ácido fenilacético (PAA) en el caso de PenG y CefG) . Estos intermedios ß-lactama desacilados son los bloques de construcción de SSA tal como ampicilina, amoxicilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, cefalexina, cefadroxilo, cefradina, cefaclor, cefprozil, cefatoxima y otros. Para revisiones recientes en acilasas PenG ver Rajendhran J, y Gunasekaran P., J Biosci. Bioeng. (2004), 97, 1-13, Arroyo M et al., Appl Microbiol Biotechnol. (2003) 60, 507-14, Sio CF y Quax WJ. Curr Opin Biotechnol. (2004) , 15, 349-55, Chande1, A.K. et al. Enzyme and Microbial Technology (2008), 42, pp. 199-207.

Aparte de desacilar los compuestos ß-lactama, se ha encontrado que también se pueden utilizar la acilasa PenG y las hidrolasas de éster amino para sintetizar los antibióticos ß-lactama. En este proceso, la acilasa PenG cataliza la condensación de una cadena lateral activada con un intermedio ß-lactama desacilado (tal como 6 -APA, 7-ADCA, 7-ACA y otros) . La síntesis catalizada por la enzima de los antibióticos ß-lactama se puede llevar a cabo en un proceso de conversión cinéticamente controlado o controlado por equilibrio. Bajo condiciones de una conversión controlada por equilibrio, el nivel de acumulación de producto que se puede alcanzar se gobierna mediante el equilibrio termodinámico de la reacción, que no es favorable en el caso de la síntesis de los antibióticos semisintéticos , en particular cuando la reacción se lleva a cabo en medio acuoso. En una conversión cinéticamente controlada la enzima cataliza la transferencia del grupo acilo de la cadena lateral activada, es decir el donante acilo, al núcleo ß-lactama, es decir receptor nucleófilo. Para la preparación de penicilinas semisintéticas , la cadena lateral activada puede ser el derivado de amida o el metiléster de un ácido carboxílico aromático. En este caso, se puede obtener transitoriamente el nivel de acumulación de producto se gobierna por las propiedades catalíticas de la enzima y la concentración sin alto equilibrio del producto de transferencia de acilo.

Ejemplos de cadena lateral utilizados en la síntesis de SSA son fenilglicina activada, hidroxifenilglicina activada, dihidro-fenilglicina activada y otros.

La acilasa PenG cataliza la hidrólisis de amidas y ásteres por medio de un intermedio de enzima-acilo en el que la serina de terminal N de la subunidad ß se esterifica en el grupo acilo. En el caso de la hidrólisis, el agua ataca la enzima acilo y dirige la hidrólisis a terminación. Cuando está presente un grupo amino de un nucleófilo externo agregado (por ejemplo 6 -APA, 7-ADCA) , el nucleófilo y el agua pueden atacar la enzima acilo, produciendo el producto de transferencia acilo deseado (antibiótico) y el donante acilo hidrolizado indeseado, respectivamente.

La capacidad de la acilasa PenG para actuar como una transferasa acilo, es decir para sintetizar SSA, ya se explota en una escala industrial en la producción enzimática de varios antibióticos ß-lactama semisintéticos . Sin embargo, en la producción de SSA, la reacción de hidrólisis mediante al agua reduce la eficiencia de la reacción de transferencia, debido a la pérdida de cadenas laterales de precursor activado. La relación entre el índice de síntesis (S) y el índice de hidrólisis (H) es un parámetro importante para evaluar el desempeño sintético de una acilasa PenG. La relación S/H es igual a la relación molar del producto sintetizado (SSA) comparado con el producto de hidrólisis en condiciones definidas durante la reacción de acilación enzimática. El producto sintetizado se define aquí como el antibiótico ß-lactama formada de la cadena lateral activada y el núcleo ß-lactama. El producto de hidrólisis se define aquí como el ácido correspondiente de la cadena lateral activada. Para un proceso económicamente atractivo, es deseable que sea alta la relación S/H, mientras que al mismo tiempo, la actividad enzimática preferiblemente también es suficientemente alta.

La relación S/H que se observa en una conversión es dependiente de los reactivos, las condiciones de reacción y el progreso de la conversión. Youshko et al. muestra que el valor inicial de la relación S/H es dependiente de las propiedades cinéticas de la enzima y la concentración del nucleófilo receptor (por ejemplo 6 -APA) ver Youshko, M.I. y Svedas, V.K., Biochemistry (Moscow) (2000), 65, 1367-1375 y Youshko, M.I. et al. Biochimica et Biophysica Acta Proteins and Proteomics (2002), 1599, 134-140. En condiciones fijas y la concentración de nucleófilo, se puede utilizar la relación inicial S/H para comparar el desempeño de diferentes acilasas PenG y/o diferentes mutantes de acilasa PenG. Adicionalmente , el desempeño de diferentes acilasas PenG se puede comparar al medir la síntesis y la hidrólisis durante la conversión como función de tiempo, que permite el cálculo de la relación S/H en diferentes etapas de la conversión. La actividad sintética (= el índice en que se forma el producto de síntesis = índice de síntesis = índice de producción) de una acilasa PenG en una reacción de acilación se refiere a la cantidad de antibiótico ß-lactama formado en la reacción de acilación por tiempo unitario en condiciones definidas. Preferiblemente, se determina la actividad inicial. La actividad enzimática inicial se puede determinar al llevar a cabo la reacción de acilación y luego construir una gráfica de la cantidad de producto sintetizado versus el tiempo de reacción, una así llamada curva de progreso. En general, al inicio de la conversión, el índice de formación de producto es relativamente constante y la actividad se puede derivar directamente de la pendiente de la curva de progreso. En el caso que la actividad sintética ya inicie a declinar al inicio de la conversión el índice inicial se debe obtener mediante extrapolación de la curva de progreso y el cálculo de la pendiente t=0. Con el fin de comparar la actividad de diferentes acilasas PenG la actividad sintética se debe normalizar en la misma cantidad de proteína. En la misma forma como para el índice inicial de síntesis se puede determinar el índice inicial de hidrólisis a partir de una gráfica de la cantidad de la cadena lateral activada hidrolizada versus el tiempo de reacción.

Las acilasas PenG han sido objeto de varios estudios que involucran los mutantes acilasa PenG. Una lista extensiva de mutaciones publicadas se da en Rajendhran and Gunasekara (2004) supre vide. Más recientemente, se publican estudios adicionales por Gabor, E.M. y Janssen, D.B., Protein Engineering, Design and Selection (2004), 17, 571-579; Jager, S.A.W. et al. Journal of Biotechnology (2008), 133, 18-26; Wang, J., et al. Applied Microbiology and Biotechnology (2007) , 74, 1023-1030.

La Solicitud de Patente Internacional WO96/05318 de Gist-brocades enseña cómo la especificidad de las acilasas PenG se puede modificar al mutar el sitio de unión a sustrato en una o más posiciones de aminoácido. Se muestra que la relación S/H de las acilasas PenG también se puede ajustar en esta forma.

Adicionalmente , las Solicitudes de Patente internacional WO98/20120 (de Bristol-Meyers Squibb) , WO03/055998 (de Gist-brocades) y la Solicitud de Patente China CN101177688 (del Instituto de Shanghai para las Ciencias Biológicas) describe un proceso para la preparación enzimática de un antibiótico ß-lactama de un núcleo ß-lactama y una cadena lateral activada con la ayuda de un mutante de acilasa PenG. La WO98/20120 describe mutaciones en las posiciones de aminoácido 142 y 146 en la subunidad y en las posiciones de aminoácido 24, 56 o 177 en la subunidad ß de la acilasa PenG Escherichia coli. Particularmente, la variante de acilasa PenG con una mutación en la posición ß24 (Gß24?) , por la que se reemplaza fenilalanina por alanina, parece producir una producción significativamente mayor en la síntesis de penicilinas y cefalosporinas . Sin embargo, en la WO03/055998 se muestra que en los procesos en donde, en lugar de un precursor éster, un precursor amida, se utiliza en combinación con dicho mutante ?ß24?, la relación S/H aún es alta, pero la actividad enzimática es tan baja que el uso se este mutante es económicamente mucho menos atractivo. En su lugar, se muestra en la O03/055998 que un mutante de acilasa PenG en donde la arginina en la posición 145 en la subunidad a se reemplaza por leucina (ROÍ145L), cisteína (Ro¡145C) o lisina (Rcxl45K), también muestra una relación S/H mejorada pero, adicionalmente , ha retenido un mayor nivel de actividad sintética, especialmente con precursores de amida. No obstante, la actividad sintética de todos estos mutantes es menor que la actividad sintética de la acilasa PenG tipo natural .

La CN101177688 describe que también los mutantes de la acilasa PenG de Bacillus megaterium, una mejora de la relación S/H se acompaña por una reducción de la actividad sintética .

La EP-1418230 de TUHH-Technologie GmbH, describe acilasas PenG de Alcaligenes faecalis para las que la maduración post-traduccional de la subunidad a es incompleta que resulta en una actividad hidrolítica mayor para la penicilina G y el ácido 6-nitro-3-fenilacetamida benzoico (denominado adicionalmente como NIPAB) . El procesamiento incompleto de dicha subunidad a se invoca por las sustituciones de aminoácido en la así llamada región ligadora entre la subunidad a y ß. No se describe si o no tales mutaciones también pueden incrementar la actividad sintética.

La técnica anterior discutida anteriormente muestra que, aunque es posible incrementar la relación S/H de varios mutantes de la acilasa PenG, tales mejoras en la relación S/H se acompañan por una reducción de la actividad sintética comparado con la acilasa PenG tipo natural. Por lo tanto, la desventaja de estos mutantes es que se necesitan tiempos de conversión largos o muy alta concentración de las acilasas PenG mutantes en tal conversión, que hace aplicaciones industriales de tales mutantes económicamente no atractivos si no es imposible.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es el propósito de la presente invención proporcionar acilasas PenG mutantes que han incrementado la relación S/H mientras que se mantiene o más preferiblemente se incrementa la actividad sintética comparado con la enzima tipo natural con el fin de ser adecuado para procesos industriales.

En un primer aspecto, la invención proporciona una acilasa de penicilina G procariótica mutante derivada de una acilasa de penicilina G tipo natural caracterizado porque el mutante tiene una sustitución de aminoácido en una o más posiciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de posiciones de aminoácido A3 , A77, A90, A144, A192, B24, B109, B148, B313, B460 y B488 de acuerdo con la numeración de aminoácido de la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli que tiene la secuencia de aminoácido descrita en la SEQ ID No: 1 y que se describe adelante: MK RNRMIV CVTASLMYYWSLPALAEQSSSEIKIVRDEYGMPHIYA DTWHLFY GYGYWAQDRLFQMEMARRS TQGTVAEVLGKDFVKFDKDIRRNY PDAIRAQIAALSPEDMSILQGYADGMNAWI DKVNTNPETLLPKQFNTFGF TPKR EPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALKDKYGVSQGMAVFNQLK LVNPSAPTTIAVQESNYPL KFNQQNSQTAALLPRYDLPAPMLDRPAKGADGALLALTAGKNRETIAAQFAQGGA NGLAGYPTTSNMWVIGKSKA QDAKAIMVNGPQFGWYAPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLVFGHNGVISWG STAGFGDDVDIFAERLSAEK PGYYLHNGKWVKMLSREETITVKNGQAETFTV RTVHGNILQTDQTTQTAYAKSR AWDGKEVASLLA THQMKAK NWQEWTQQAAKQALTINWYYADVNG IGYVHTGAYPDRQSGHDPRLPVPGTGKWD WKGLLPFEMNPKVYNPQSGY IANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRVTEIDRLLEQKPRLTADQAWDVIRQTSR QDLNLRLFLPTLQAATSGLT QSDPRRQLVETLTRWDGINLLNDDGKTWQQPGSAILNVWLTSMLKRTWAAVPMP FDKWYSASGYETTQDGPTGS LNISVGAKILYEAVQGDKSPIPQAVDLFAGKPQQEWLAALEDTWETLSKRYGNN VSNWKTPAMALTFRANNFFG VPQAAAEETRHQAEYQNRGTENDMIVFSPTTSDRPVLAWDWAPGQSGFIAPDGT VDKHYEDQLKMYENFGRKSL WLTKQDVEAHKESQEVLHVQR La cadena de polipéptido completa codificada por el gen consiste de un péptido señal (26 aminoácidos parte subrayada única) , la subunidad a (209 aminoácidos) , el péptido de conexión (54 aminoácidos parte subrayada doble) y la subunidad ß (557 aminoácidos) . El péptido de señal así como también el péptido de conexión se remueven durante maduración post- traduccional produciendo así una acilasa de penicilina G enzimáticamente activa compuesto de la subunidad a- y ß. En la subunidad OÍ los aminoácidos se enumeran A1-A209, en la subunidad ß de Bl a B557.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una acilasa de penicilina G tipo natural se define aquí como una acilasa de penicilina G de ocurrencia natural. La acilasa de penicilina G tipo natural puede ser cualquier acilasa de penicilina G tipo natural adecuado y preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli que tiene la secuencia de aminoácido descrita en la SEQ ID No: 1 y las acilasas de penicilina G que son por lo menos 30% homologas a la SEQ ID No: 1. Preferiblemente, la acilasa de penicilina G tipo natural se selecciona del grupo que consiste de la acilasa de penicilina G 19 resumida en la Tabla 1 y que presenta una homología de 30% o más con la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli.

Tabla 1 IV 15 Acinetobacter_baumannii_AYE 39 B0V5B7_ACIBY IV 16 Acinetobacter_baumannii_ACICU 38 B2I261_ACIBC IV 17 Acinetobacter_baumannii_ATCC_17978 38 A3M5T4_ACIBT IV 18 Bacillus_megaterium 34 PAC_BACME IV 19 Bacillus_badius 34 Q45TR7_BACBA IV 20 Arthrobacter_viscosus 33 PAC_ARTVI Fuente de Proteína Universal ( ht tp : / /www .uniprot.org/) Son más preferidas las acilasas de penicilina G que son 40%-100% homologas a la SEQ ID No: 1 (por ejemplo las acilasas de penicilina G que pertenecen al Grupo I-III) se prefieren aún más las acilasas de penicilina G que son 50%-100% homologas a la SEQ ID No: 1 (por ejemplo las acilasas de penicilina G que pertenecen al Grupo I-II) y se prefieren aún más las acilasas de penicilina G que son 80%-100% homologas a la SEQ ID No: 1 (por ejemplo las acilasas de penicilina G que pertenecen al Grupo I) . Se prefiere más la acilasa de penicilina G tipo natural de Escherichia coli que tiene la secuencia de aminoácido de la SEQ ID No: 1.

Una acilasa de penicilina G procariótica mutante preferida tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición B24 y sustituciones de aminoácido en una o más posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A144, A192, B109, B148, B313, B460 y B488. Las mutaciones en la posición B24 se conocen en la técnica. La WO96/05318 describe el reemplazo de Phe de ocurrencia natural en B24 en la acilasa penicilina G de Alcaligenes feacalis mediante la lisina o arginina de aminoácido cargado positivamente. Especialmente el mutante B:F24K que muestra una capacidad mejorada para dividir el sustrato fenilacetil-leucina liberando por lo tanto leucina y permitiendo crecer cepa E- coli deficiente de leucina, transformada con el gen que codifica la acilasa de penicilina G mutante de Alcaligenes feacalis. La WO98/20120 muestra todas las posibles mutaciones en la posición B24 de la acilasa penicilina G de Escherichia coli. En particular el reemplazo del Phe de ocurrencia natural en B24 mediante Ala da una mejora sustancial en la relación S/H durante la síntesis de Cefadroxilo .

Ahora se ha encontrado sorprendentemente que la combinación de una mutación en B24 con una o más mutaciones en una posición seleccionada del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A144, A192, B148, B109, B313, B460 y B488 puede resultar en imitantes de acilasa de penicilina con una actividad sintética incrementada y, opcionalmente una relación S/H mejorada adicional durante las reacciones de síntesis de varias cefalosporinas semisintéticas así como también penicilinas semisintéticas comparado con mutantes de acilasa de penicilina con una mutación sola en la posición B24. Los combinantes preferidos (combinante se define aquí como una enzima mutante que comprende por lo menos dos mutaciones comparado con la enzima tipo natural) comprende mutaciones en las posiciones [B24+A144] o en la posiciones [B24+B109] o en las posiciones [B24+B460] o en las posiciones [B24+A144+B109] o en las posiciones [B24+B109+B460] o en las posiciones [B24+B144+B460] o en las posiciones [B24+B109+B144+B460] . Otros combinantes preferidos comprenden mutaciones en las posiciones [B24+B460+A3+A192] o en las posiciones [B24+B460+A90] o en las posiciones [B24+ B148+B460] o en las posiciones [B24+ B148+B460+A3+A192] o en las posiciones [B24+ B148+B460+A90] .

Otra acilasa de penicilina G procariótica mutante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición B460 y opcionalmente una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A144, A192, B24 , B148, B109, B313 y B488. Los combinantes preferidos de la posición B460 con por lo menos la posición B24 se han listado anteriormente. Otros combinantes preferidos comprenden mutaciones en las posiciones [B460+A90] o en las posiciones [B460+B109] o en las posiciones [B460+A144] o en las posiciones [B460+A90+B109] o en las posiciones [B460+A90+A144] o en las posiciones [B460+B109+A144] o en las posiciones [B460+A90+B109+A144] . Otros combinantes preferidos comprenden mutaciones en las posiciones [B460+A192] o en las posiciones [B460+A3] o en las posiciones [B460+A192+A3] .

Una acilasa de penicilina G procariótica mutante altamente preferida es la acilasa penicilina G de Escherichia coli que tiene la secuencia de aminoácido de acuerdo con SEQ ID No. 1 y que tiene sustituciones de aminoácido en las posiciones [B24+A144] o en las posiciones [B24+B109] o en las posiciones [B24+B460] o en las posiciones [B24+A144+B109] o en las posiciones [B24+B109+B460] o en las posiciones [B24+B144+B460] o en las posiciones [B24+B109+B144+B460] opcionalmente combinado con una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A192, B148, B313 y B488.

Otra acilasa de penicilina G procariótica mutante altamente preferida es la acilasa penicilina G de Kluyveromyces cryocrescens y que tiene sustituciones de aminoácido en las posiciones [B24+A144] o en las posiciones [B24+B109] o en las posiciones [B24+B460] o en las posiciones [B24+A144+B109] o en las posiciones [B24+B109+B460] o en las posiciones [B24+B144+B460] o en las posiciones [B24+B109+B144+B460] opcionalmente combinado con una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A192, B148, B313 y B488.

La posición A3 en las acilasas de penicilina tipo natural pueden albergar diferentes tipos de aminoácidos. La enzima tipo natural de Escherichia coli tiene una serina. Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural por leucina, isoleucina, alanina o por treonina. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende A:S3A o A:S3L.

La posición A77 en las acilasas de penicilina tipo natural puede albergar diferentes tipos de aminoácidos, por ejemplo residuos cargados positivamente (R, K) y negativamente (D,E) así como también otros polares (S, N, Q) . La enzima tipo natural de Escherichia coli tiene una alanina. Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural mediante treonina. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende A: A77T.

Tabla 2. Ocurrencia de aminoácidos en las posiciones A3, A77, A90, A144, A192, B24 , B109, B148, B313, B460 y B488 en 20 acilasas de penicilina G tipo natural.

La posición A90 en las acilasas de penicilina tipo natural puede albergar diferentes tipos de aminoácidos, pero otros predominantemente cargados positivamente (R,K) . La enzima tipo natural de Escherichia coli tiene una metionina. Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural que no alberga una lisina, comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural mediante lisina. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende A:M90K.

La posición A144 en las acilasas de penicilina tipo natural muestra la mayoría de asparagina. Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural mediante treonina. En adición a tirosina o fenilalanina o triptofan de aminoácidos aromáticos se prefieren los aminoácidos en la posición que corresponde a A144 en acilasa de penicilina G de Escherichia coli. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende A:N144S.

La posición A192 en las acilasas de penicilina tipo natural puede albergar diferentes tipos de aminoácidos. La enzima tipo natural de Escherichia coli tiene una valina. Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural mediante un aminoácido más polar tal como serina o treonina, preferiblemente aún aminoácido cargado tal como ácido aspártico, ácido glutámico, lisina o arginina. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende A:V192E.

La posición B24 es altamente conservada entre las acilasas de penicilina G tipo natural. En la acilasa de penicilina G de E . coli y muchas otras enzimas tipo natural, se encuentra la fenilalanina. Las enzimas tipo natural restantes también tienen residuos hidrófobos (M,V) o otra polar (Q) . Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural mediante alanina o leucina. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende B:F24A o B:F24L.

La posición ,B109 muestra los aminoácidos lisina o arginina predominantemente cargados positivamente. En la acilasa de penicilina G de E . coli se encuentra lisina. Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural que no alberga una lisina, comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural mediante arginina. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende B:K109R.

La posición B148 en las acilasas de penicilina tipo natural puede albergar diferentes tipos pero residuos hidrófobos predominantemente pequeños (V, L, I, A) . En la acilasa de penicilina G de E . coli se encuentra valina. Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural que no alberga una leucina, comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural mediante leucina. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende B:V148L.

La posición B313 en las acilasas de penicilina tipo natural puede albergar diferentes tipos pero residuos cargados negativamente o predominantemente polares (S, N, D, Q, H, T, E) . En la acilasa de penicilina G de E. coli se encuentra serina. Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural que no alberga asparagina o ácido aspártico, comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural mediante asparagina o ácido aspártico. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende B:S313N.

La posición B460 es menos conservada entre las 20 acilasas de penicilina G tipo natural. La mayoría de enzimas tipo natural tienen un residuo hidrófobo (F, L, A, V, I) . En la acilasa de penicilina G de E. coli se encuentra fenilalanin . Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural que no tienen una leucina de ocurrencia natural se reemplaza por el aminoácido de ocurrencia natural mediante leucina o comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural mediante treonina, valina o isoleucina. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende B:F460L. En la acilasa de penicilina que tiene una leucina en la posición que corresponde a acilasa de penicilina G de Escherichia coli B:F460, la leucina se puede reemplazar por alanina, treonina, valina o isoleucina. En particular cuando se combina con una mutación en la posición correspondiente a la acilasa de penicilina G de Escherichia coli B:F24.

La posición B488 es altamente conservada entre las acilasas de penicilina G tipo natural. En la acilasa de penicilina G de E. coli se encuentra fenilalanina . Una mutación preferida en las acilasas de penicilina tipo natural que no alberga una leucina o metionina, comprende el reemplazo del aminoácido de ocurrencia natural mediante leucina o metionina. Una mutación altamente preferida en la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli comprende B:F488L.

En un segundo aspecto, la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica la acilasa de penicilina G mutante del primero aspecto de la invención.

En un tercer aspecto, la invención proporciona un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico del segundo aspecto de la invención.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona una célula anfitriona que comprende el vector de expresión del tercer aspecto de la invención.

En un quinto aspecto, la invención proporciona un proceso para producir la acilasa de penicilina G mutante del primer aspecto de la invención.

En un sexto aspecto, la invención proporciona un proceso para la producción de un antibiótico ß-lactama semisintético que comprende un acoplamiento enzimático de una cadena lateral activada en un núcleo ß-lactama caracterizado al utilizar la acilasa de penicilina G procariótica mutante del primer aspecto de la invención. Los antibióticos ß-lactama semisintéticos preferidos se seleccionan del grupo que consiste de penicilinas semisintéticas y cefalosporinas semisintéticas . Ejemplos de penicilinas semisintéticas preferidas son amoxicilina y ampicilina. La amoxicilina se puede producir mediante el acoplamiento enzimático de HPG activado (por ejemplo como la amida o éster, preferiblemente el metil éster o el etil éster) en 6-APA, mientras que la ampicilina se puede producir mediante el acoplamiento enzimático del PG activado (por ejemplo como la amida o éster, preferiblemente el metil éster o el etil éster) en 6-APA. Ejemplos de cefalosporinas semisintéticas preferidas son cefadroxilo, cefalexina y cefradina. El cefadroxilo se puede producir mediante el acoplamiento enzimático del HPG activado (por ejemplo como la amida o éster, preferiblemente el metil éster o el etil éster) en 7-ADCA, mientras que la cefalexina se puede producir mediante el acoplamiento enzimático del PG activado (por ejemplo como la amida o éster, preferiblemente el metil éster o el etil éster) en 7-ADCA y la cefradina se puede producir mediante el acoplamiento enzimático del DHPG activado (por ejemplo como la amida o éster, preferiblemente el metil éster o el etil éster) en 7-ADCA.

En una realización preferida, el proceso de la invención para la producción de un antibiótico ß-lactama semisintético comprende utilizar una acilasa de penicilina G procariótica mutante que comprende una posición de aminoácido de mutación B24 con una o más mutaciones en una posición seleccionada del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A144, A192, B148, B109, B313, B460 y B488. Las acilasas de penicilina G procarióticas mutantes preferidas comprenden mutaciones en las posiciones [B24+A144] o en las posiciones [B24+B109] o en las posiciones [B24+B460] o en las posiciones [B24+A144+B109] o en las posiciones [B24+B109+B460] o en las posiciones [B24+B144+B460] o en las posiciones [B24+B109+B144+B460] . Otros combinantes preferidos comprenden mutaciones en las posiciones [B24+B460+A3+A192] o en las posiciones [B24+B460+A90] o en las posiciones [B24+ B148+B460] o en las posiciones [B24+ B148+B460+A3+A192] o en las posiciones [B24+ B148+B460+A90] . En otra realización preferida, el proceso de la invención para la producción de un antibiótico ß-lactama semisintético comprende utilizar una acilasa de penicilina G procariótica mutante que comprende una posición de aminoácido de mutación B460 y opcionalmente una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A144, A192, B24, B148, B109, B313 y B488. Los combinantes preferidos de la posición B460 con por lo menos la posición B24 se han listado anteriormente. Otros combinantes preferidos comprenden mutaciones en las posiciones [B460+A90] o en las posiciones [B460+B109] o en las posiciones [B460+A144] o en las posiciones [B460+A90+B109] o en las posiciones [B460+A90+A144] o en las posiciones [B460+B109+A144] o en las posiciones [B460+A90+B109+A144] . Otros combinantes preferidos comprenden mutaciones en las posiciones [B460+A192] o en las posiciones [B460+A3] o en las posiciones [B460+A192+A3] . Las realizaciones altamente preferidas comprenden utilizar una acilasa de penicilina G procariótica mutante de Escherichia coli que tiene la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID No. 1 y que tiene las sustituciones de aminoácido en las posiciones [B24+A144] o en las posiciones [B24+B109] o en las posiciones [B24+B460] o en las posiciones [B24+A144+B109] o en las posiciones [B24+B109+B460] o en las posiciones [B24+B144+B460] o en las posiciones [B24+B109+B144+B460] opcionalmente combinado con una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A192, B148, B313 y B488 o una acilasa de penicilina G procariotica mutante de Kluyveromyces cryocrescens y que tiene sustituciones de aminoácido en las posiciones [B24+A144] o en las posiciones [B24+B109] o en las posiciones [B24+B460] o en las posiciones [B24+A144+B109] o en las posiciones [B24+B109+B460] o en las posiciones [B24+B144+B460] o en las posiciones [B24+B109+B144+B460] opcionalmente combinado con una o más sustituciones de amiríoácido en las posiciones seleccionadas' del grupo que consiste de A3 , ,A77, A90, A192, B148, B313 y B488.

La ventaja del proceso de la presente invención al utilizar la acilasa de penicilina G procariotica mutante de la invención es que, como un resultado para mantener, más preferiblemente, incrementar la actividad sintética y las relaciones S/H mayores de la acilasa de penicilina G procariotica mutante comparado con la enzima tipo natural, son muy eficientes los procesos de producción para la producción de un antibiótico ß-lactama semisintético . Los antibióticos ß-lactama semisintéticos se producen en altas producciones (por ejemplo [mol producto] / [mol de núcleo ß-lactama agregado] , mientras que es baja la hidrólisis de las cadenas laterales activadas. Otra ventaja es que los procesos se pueden llevar a cabo con relaciones [cadena lateral activada] / [núcleo ß-lactama] que son menores que aquellos reportados en la técnica anterior hasta la fecha.

La invención también proporciona un proceso para la producción de amoxicilina en la presencia de una enzima que cataliza el acoplamiento de HPG con 6 -APA en donde la relación molar del HPG activado, preferiblemente el éster seleccionado del grupo que consiste de metil- y etiléster en 6-APA es =3.0, más preferiblemente =2.5, más preferiblemente =2.0, más preferiblemente <1. 5, más preferiblemente <1.4, más preferiblemente <1.3, más preferiblemente <1 .2, más preferiblemente <1.1, más preferiblemente <1. 09, más preferiblemente <1.08, más preferiblemente <1. 07, más preferiblemente <1.06, más preferiblemente <1. 05, más preferiblemente <1.04, más preferiblemente <1.03 y más preferiblemente =1.02 y la producción de amoxicilina con base en 6-APA (mol/mol) y se mide después que la reacción de acoplamiento enzimática es 90%, preferiblemente =91%, preferiblemente =92%, preferiblemente =93%, preferiblemente =94%, preferiblemente =95% preferiblemente =96% preferiblemente =97% preferiblemente =98% y más preferiblemente =99%.

Preferiblemente la enzima en el proceso para la producción de amoxicilina es una acilasa, preferiblemente una acilasas de penicilina-G, que posee la propiedad de producir amoxicilina de 500 mmol por litro HPGM y 530 mmol por litro 6-APA (es decir la conversión) y al final de la conversión, realizado bajo las condiciones como se describe en la Prueba A como se describe aquí, que resulta en menos de 5 mmol por litro 6-APA. Ninguna de las acilasas de penicilina G tipo natural de ocurrencia natural en la Tabla 2? Posee esta propiedad. Las acilasas de penicilina G tipo natural adecuadas se pueden encontrar mediante detección o, más preferiblemente, se pueden obtener al sustituir uno o más aminoácidos.

En una realización preferida del proceso de la invención, se puede producir amoxicilina al utilizar la acilasa de penicilina G procariótica mutante de la invención. Una acilasa de penicilina G procariótica mutante altamente preferida que se puede utilizar es la acilasa penicilina G de Escherichia coli que tiene la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID No. 1 o la acilasa penicilina G de Kluyveromyces cryocrescens y que tiene las sustituciones de aminoácido en las posiciones [B24+B109] o [B24+B460] o [B109+B460] o [B24+B109+B460 [ O [B24+B148+B460] , opcionalmente combinado con una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A144, A192, B148, B313 y B488. Se prefiere más la acilasa penicilina G de Escherichia coli que tiene la secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEQ ID No. 1 y que tiene las sustituciones de aminoácido en las posiciones [B24+B109] o [B24+B460] o [B109+B460] o [B24+B109+B460] .

MATERIALES Y MÉTODOS Preparación de los mutantes de acilasa La producción, aislamiento y purificación de las ACILASAS DE PENICILINA G mutante y tipo natural se puede llevar a cabo como se describe en la WO96/05318 y WO03/055998. Alternativamente, los genes que codifican las ACILASAS DE PENICILINA G mutante se pueden obtener mediante la síntesis de gen.

La producción de la acilasa de penicilina G mutante se puede obtener mediante la clonación de genes que codifican las ACILASAS DE PENICILINA G mutante dentro de un vector de expresión apropiado, transformar un anfitrión adecuado tal como E.coli con dicho vector y cultivar el anfitrión transformado bajo condiciones adecuadas para la producción de las ACILASAS DE PENICILINA G mutante. La recuperación y purificación de los mutantes se lleva a cabo como se describe en la WO9605318. Adicionalmente , un sistema Ákta Purifier 10, equipado con una columna de filtración de gel Superdex200 así como también un sistema HPLC equipado con una columna TSKgel 3000S xl se utilizan para purificar las acilasas. Ambos sistemas se hacen correr en amortiguador de fosfato al 0.1M a pH7.0 en un índice de flujo de 1 ml/min.

Determinación de la concentración de acilasa Se determina la concentración de acilasa al realizar titulación de sitio activo con fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) como se describe por Svedas et al. 1977, Bioorg. Khimya [Russ . ] 3, 546-553 y Alkema et al. 1999, Anal.Biochem 275, 47-53. Las actividades iniciales y las actividades residuales luego de titulación de sitio activo se miden utilizando NIPAB como un sustrato. La hidrólisis de NIPAB se sigue a 37°C en 0.1M de amortiguador MOPS pH=7.4 al medir el incremento en la absorbancia a 405 nm debido a la liberación de ácido 5-amino-2-nitrobenzoico . Alternativamente, las actividades residuales después de una titulación de sitio activo se pueden medir utilizando la síntesis de cefalexina (ver adelante) .

Inmovilización de acilasas Se inmovilizan las varias acilasas de acuerdo con el método descrito en la WO97/04086 y EP0222462.

Detección de cefalosporinas La detección de cefalosporinas tal como cefalexina y cefradina se lleva a cabo de acuerdo con el método Fujii (Fujii et al., 1976, Process Biochemistr , 21-24) . El método se puede convertir fácilmente en una detección de formato de alto rendimiento.

Detección de cefalexina Se lleva a cabo el ensayo estándar para medir la formación de cefalexina de D-fenilglicina metiléster (PGM) y 7-ADCA en la siguiente formar: ??µ? de una solución de acilasas de penicilina G se agrega a 130µ1 de una mezcla de sustrato que consiste de 50 g/1 de PGM y 50 g/1 de 7-ADCA ver adelante para la preparación de esta solución. Posteriormente el compartimiento de la reacción se sella para evitar la evaporación. Después del tiempo de incubación de 2 horas a temperatura ambiente, se agrega 140µ1 de 1M de NaOH para detener la reacción e iniciar el desarrollo del color. La mezcla vigorosa evita que se precipite. Después de 2 horas de incubación a temperatura ambiente en compartimientos sellados se mide la absorbancia a 490 nm. Para el experimento blanco, se agrega agua en lugar de enzima. En el caso de la determinación de índices de rotación iniciales las concentraciones de enzima son de tal manera que la concentración final está entre 1 y 10%. En lugar de variar las concentraciones de enzima con el fin de controlar la conversión, alternativamente se puede adaptar el tiempo de reacción para obtener la conversión deseada. La cantidad absoluta de la cefalexina formada se puede determinar de una línea de calibración obtenida cuando se gráfica el OD en490 nm versus la concentración de cefalexina (determinada con muestras que contienen una cantidad conocida de cefalexina) .

Con el fin de preparar la mezcla de sustrato PGM/7-ADCA, 50 g de PGM. SA (PGM.MSA es la sal de ácido metano sulfónico (MSA) de PGM) y 50 g de 7-ADCA se agregan a 900 mi de 0.1M de amortiguador MOPS pH=6.9. Bajo agitación continúa, se reajusta el pH a 6.9 utilizando una solución de 4M de NaOH. Se ajusta el volumen a 1 litro con amortiguador y se ajusta el pH de nuevo. Para cada experimento, se puede hacer una solución fresca debido a que el PGM se degrada espontáneamente en agua. Para preparar el amortiguador MOPS se disuelve 20.9 g de MOPS (Sigma M-1254) en aproximadamente 900 mi de agua MilliQ. Se ajusta el pH a 6.9 utilizando 4M de solución NaOH y se ajusta el volumen a 1 L con agua MilliQ.

Detección de cefradina El ensayo estándar para medir la formación de cefradina de D-2 , 5-metiléster de dihidrofenilglicina (DHPGM) y 7-ADCA se lleva a cabo en la siguiente forma como se describió anteriormente para cefalexina. Solo se utiliza la sal de ácido metano sulfónico de D-2 , 5-metiléster de dihidrofenilglicina (DHPGM. SA) en lugar de PGM.MSA.

Determinación de la relación S/H Con el fin de determinar la relación S/H de una acilasa PenG en la síntesis de los antibióticos ß-lactama, la conversión se mide como una función de tiempo. Se toman muestras en diferentes puntos de tiempo para determinar la composición de la mezcla de conversión. La reacción se detiene al bajar el pH a 2.7. Las muestras se analizan mediante UPLC (Cromatografía Líquida de Ultra Desempeño) con el fin de determinar. la concentración del antibiótico acilado formado, el núcleo de antibiótico, el precursor de cadena lateral hidrolizada y el precursor de cadena lateral.

La actividad sintética se determina de la pendiente de la curva obtenida al graficar la cantidad de producto versus el tiempo de reacción preferiblemente entre 0 y 10% de conversión, en el que la formación del producto de la reacción es usualmente más o menos lineal en tiempo. En el caso que la actividad sintética se declina rápidamente durante el índice inicial de reacción se puede obtener mediante extrapolación de la curva de progreso y el cálculo de la pendiente a t=0.

Se determina la actividad de hidrólisis de la pendiente de la curva obtenida al graficar la cantidad del precursor de cadena lateral hidrolizado versus el tiempo de reacción preferiblemente entre 0 y 10% de hidrólisis, en que la formación del precursor de la cadena lateral hidrolizada es usualmente más o menos lineal en tiempo. La relación S/H se alcula al dividir la pendiente de la actividad smt ediante la pendiente de la actividad hidrolítica .

Bomba ACQUITY- Gerencia de disolvente primario Automuestreador Gerente de muestras y organizador de ACQUITY- muestras Detector UV Detector PDA (80 hertz) ACQUITY UPLC BEH fenilo 1.7 pm 2.1 x 50 mm, (cat. no.

Columna 186002884) Flujo 0.9 ml/min Volumen de 2 µ? (bucle parcial) inyección Fase móvil A 50 mM de amortiguador de fosfato (pH 6.0) Fase móvil B 100% de acetonitrilo Temperatura de 60 °C columna Temperatura de 10 °C bandeja Longitud de onda 210 y 260 nm Tiempo de serie 1 minuto La medición de la relación S/H para cefalexina se lleva a cabo en una mezcla de reacción que contiene 10g/l de PGM.MSA y 10g/l de 7-ADCA y para cefradina en una mezcla de reacción que contiene 10g/l de DHPGM.MSA y 10g/l de 7-ADCA.

Se agrega acilasa de penicilina G de tal manera que después de 4 horas se obtiene 70-90% de conversión. Se toman muestras de 20µ1 en varios puntos de tiempo y se diluyen inmediatamente con 800µ1 de 50mM de ácido fosfórico pH=2.7 para detener la reacción.

Se detectan las cantidades de DHPGM, DHPG, PMSF, PGM y PG a 210 nm y de 7-ADCA, cefalexina y Cefradina a 260 nm durante cromatografía UPLC, que se lleva a cabo de acuerdo con el siguiente protocolo: Perfil de gradiente: Prueba A - Producción de amoxicilina de 6-APA y metil éster HPG Un reactor en acero inoxidable de 2 1, equipado con un tamiz de fondo con poros de 140 µp? y un agitador, se llena con la enzima inmovilizada utilizada para catalizar el acoplamiento de HPGM a 6-APA. El volumen se ajusta a 1000 mi mediante la adición de agua. Los contenidos se enfrían a 10°C, y los contenidos del reactor se circulan en un tamiz de fondo por medio de una bomba peristáltica.

Se agrega 162.2 g de ácido 6 -aminopenicilánico seguido por la adición de 144 g de HPGM. El volumen se ajusta a 1500 mi mediante la adición de agua. La mezcla se agita y se hace circular sobre el tamiz. La temperatura se mantiene a 10 °C. Se monitorea el pH . Inicialmente el pH es aproximadamente 6.3 y después de algún tiempo se incrementa a aproximadamente 7, y posteriormente se reduce. En el punto que el pH es menor de pH=6.3, la reacción casi se completa. En este punto (aproximadamente 2 h después de la adición de HPGM) se toma una muestra de la línea de recirculación filtrada y analizada del contenido 6 -APA residual mediante HPLC .

Lista de abreviaturas 6-APA : ácido 6-aminopenicilánico 7-ADCA : ácido 7-aminodesacetoxicefalosporánico AMPI : ampieilina CEX : cefalexina DHPG : D-2 , 5-Dihidrofenilglicina DHPGM.MSA : sal de metil éster de ácido D-2,5- Dihidrofenilglicina metanosulfónico EDTA : ácido etilenodiaminetetraacético HPGM : metil éster de D-p-hidroxifenilglicina PG : D-fenilglicina PGA - : D-fenilglicina amida PGM : D-Fenilglicina metil' éster PGM. HCL : sal HCl de metil éster de D- fenilglicina PGM.MSA : sal de metil éster de ácido D- fenilglicina metanosulfónico NOMENCLATURA DE LOS AMINOÁCIDOS Aminoácido abreviatura de 3 -letras abreviatura de l letra L-alanina Ala L-cisteína Cys Ácido L-asparagínico Asp D Ácido L-glutamínico Glu L- fenilalanina Phe L-glicina Gly L-histidina His L- isoleucina Ile I L- lisina L- leucina Leu L L-metionina Met M L-asparagina Asn L-prolina Pro P glutamina Gl Q L-arginina Arg R L- serina Ser S L-treonina Thr T L-tirosina Tyr L-valina Val V L-triptofan Trp HOMOLOGÍA & IDENTIDAD Los términos "homología" o "porcentaje de identidad" se utilizan intercambiablemente aquí. Para los propósitos de esta invención, se define aquí que con el fin de determinar el porcentaje de homología de dos secuencias de aminoácido o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima. Con el fin de optimizar la alineación entre los dos espacios de secuencia se puede introducir en cualquiera de las dos secuencias que se comparan. Tal alineación se puede llevar a cabo sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Alternativamente, la alineación se puede llevar a cabo sobre una longitud corta, por ejemplo sobre aproximadamente 20, aproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/basados o aminoácidos. La identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias sobre la región alineada reportada.

Una comparación de las secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre las dos secuencias se puede llevar a cabo utilizando un algoritmo matemático. La persona experta será consciente del hecho que están disponibles varios programas de computador diferentes para alinear las dos secuencias y determinar la homología entre las dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff y J. B. Kruskal, (ed.), Time warps, string edits and macromolcules : the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley) . El porcentaje de identidad entre las dos secuencias de aminoácido se puede determinar utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch para la alineación de las dos secuencias. (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol . 48, 443-453) . El algoritmo puede alinear ambas secuencias de aminoácido y las secuencias de nucleótido. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha implementado en el programa de computador NEEDLE. Para el propósito de esta invención se utiliza el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2.8.0 o mayor, EMBOSS : The European Molcular Biology Open Software Suite (2000) Rice, P. Longden,I. y Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) pp276-277, http ; //emboss . bioinformatics . ni/ ) . Para las secuencias de proteína, se utiliza EBLOSUM62 para la matriz de sustitución. Para las secuencias de nucléotido, se utiliza EDNAFULL. Se pueden especificar otros. Los parámetros opcionales utilizados son una penalidad de espacio abierto de 10 y una penalidad de extensión de abertura de 0.5. La persona experta apreciará que todos estos diferentes parámetros producirán ligeramente diferentes resultados pero que el porcentaje de identidad general de las dos secuencias no se altera significativamente cuando se utilizan diferentes algoritmos .

Definición de homología Global La homología o identidad es el porcentaje de coincidencias idénticas entre las dos secuencias sobre la región alineada total que incluye cualesquier aberturas. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: Número de posiciones correspondientes en la alineación que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total de la alineación que incluye las aberturas. La identidad como se define aquí se puede obtener de NEEDLE y se marca en la salida del programa como "IDENTITY" .

Definición de Identidad Mayor La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: Número de posiciones correspondientes en la alineación que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total de la alineación después de la sustracción del número total de aberturas en la alineación. La identidad como se define aquí se puede obtener de NEEDLE al utilizar la opción NOBRIEF y se marca en la salida del programa como "identidad mayor" .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Selección de mutantes de acilasa de penicilina G que tienen actividad sintetizante de cefalaxina mejorada Con el fin de encontrar posiciones de aminoácido y mutaciones que mejoren la actividad de un mutante de acilasa PenG con una relación S/H mejorada, se genera una colección de mutantes mediante mutagenie propenso a error del gen que codifica la acilasa de penicilina G de Escherichia coli que ya contiene las siguientes dos mutaciones en el nivel de proteína: B:F24A y B:V148L (posteriormente designado como control) . La colección de mutante así obtenida se somete a detección de alto rendimiento para mutantes que exhiben productividad de cefalexina mejorada comparado con el control. El ensayo y el método de detección de la cefalexina formada por el método fujii se han descrito en la sección de Materiales y Métodos. Para el alto rendimiento el término productividad se refiere a la cantidad de cefalexina sintetizada mediante una cantidad fija de extracto libre de célula (CVE) en un cierto tiempo. En total se prueban aproximadamente 7000 clones.

Luego se hacen crecer como se describe las células recombinantes de Escherichia coli que expresan los mutantes de interés y las acilasas de penicilina de control. Los matraces de agitación con valores similares OD60onm se toman y los cultivos se centrifugan y se congelan a -20°C. Con el fin de preparar un extracto libre de célula, los glóbulos se resuspenden en amortiguador de extracción, 0.05M de MOPS, pH=6.9 que contiene 0.1 mg/ml de DNasa y 2mg/ml de Lisozima y se incuban. Después de 30 minutos el extracto se centrifuga y el sobrenadante que contiene la actividad acilasa se utiliza para la prueba de síntesis de cefalexina. Después de 2 horas se detiene la conversión y la cantidad de cefalexina formada se determina como se describe en Materiales y Métodos y se expresa como OD a 490nm.

Los mutantes que se seleccionan de la colección de mutantes mediante detección para la producción de cefalexina mejorada comparado con el control se resumen en la Tabla 3: 1-4 mutantes S/H tienen una actividad mayor.

Tabla 3. El número de gen representa la posición de aminoácido consecutiva como se codifica por la secuencia de cADN e incluye el péptido de señal (26 aminoácidos) , la subunidad (209 aminoácidos) , el péptido de conexión (54 aminoácidos) y la subunidad ß (557 aminoácidos) . El número de proteína representa la posición de aminoácido en el péptido de señal, subunidad a, el péptido de conexión y la subunidad ß de la secuencia de polipéptido respectivamente. El tipo natural AA representa el aminoácido en la posición respectiva en la acilasa penicilina G de Escherichia coli. El control AA representa el aminoácido de un mutante que lleva mutaciones B:F24A y B:V148L en la acilasa penicilina G de Escherichia coli. Las dos columnas derechas muestran la productividad de cefalexina para el mutante 1 al mutante 4 como se observa en la detección de colección. Se da la productividad absoluta así como también la productividad relativa comparado con el control.

Ejemplo 2 Selección de mutantes de acilasa de penicilina G que tienen una ampicilinae/6-??? mejorada en la síntesis de ampicilina A partir de la colección de mutantes descritos anteriormente se prueban aproximadamente 6000 clones para la síntesis de ampicilina. Después de hacer crecer los clones de Escherichia coli, se preparan extractos libres de célula como se describió anteriormente. Posteriormente se transfieren 20 microlitros de extracto libre de célula a 80 microlitros de 0.05 M de amortiguador MOPS pH=6.9 que contiene 12mM de PGM, 4mM de 6 -APA y lOmM de ampicilina. Se preparan el PGM como la base libre. Todas las soluciones se preparan frescas cada día. Las reacciones se llevan a cabo a temperaturas ambiente y se detienen con PMSF. Posteriormente las muestras se analizan mediante cromatografía UPLC.

Columna: Waters Acquity UPLC BEH Fenilo, 50 x 2.1 mm, tamaño de partícula 1.7 pm.

Disolvente A: 50 mM de Acetato de amonio pH = 5.8 Disolvente B: 60% de acetonitrilo + 40% de agua Milli-Q Lavado débil: 5% acetonitrilo + 95% de agua Milli- Q Lavado fuerte: 95% de acetonitrilo agua Milli-Q Tabla de gradiente: Se hace la identificación y cuantificación de los compuestos eluídos mediante espectrometría de masa utilizando un Espectrómetro de Masa Waters Micromass ZQ 2000 LC y mediante medición UV en el rango de 190-400nm utilizando un Detector de Disposición de Fotodiodo Waters ACQUITY UPLC (PDA) . Se hace la calibración utilizando los estándares apropiados .

Los clones se clasifican de acuerdo con la relación de ampicilina/6APA. Los clones que muestran una relación mayor comparado con el control se vuelven a probar varias veces. Finalmente se secuencian los dos clones que muestran mejoramiento consistente en la relación de ampieilina/6 -APA con respecto al control. Los resultados típicos para los dos mutantes se muestran en la tabla 4. La secuencia de los clones se muestra en la tabla 3.

Tabla 4: Conversión enzimática de 6 -APA a ¦ ampicilina como una función de tiempo.

Se obtienen 5-6 y 8-12 mutantes al combinar las mutaciones, que se identifican en la detección de la colección propensa a error. Los resultados para probar estos mutantes se describirán en los ejemplos adelante.

Ejemplo 3 Actividad sintetizante de cefalexina en Cefradina de mutantes de acilasa de penicilina G seleccionados en la productividad de cefalexina mejorada Las actividades de los mutantes seleccionados de mutante 1 a mutante 4 del Ejemplo 1 (Tabla 3) son con base en presumir que en el crecimiento similar del anfitrión de producción se obtiene más o menos similar a la expresión de acilasa de penicilina G (similar OD49onm ~ densidades celulares) . Con el fin de corregir cualesquier diferencias en el nivel de expresión de los mutantes, la concentración de la acilasa de penicilina en los extractos libres de célula se determina utilizando la titulación PMSF como se describe en Materiales y Métodos. Con base en la titulación PMSF el contenido activo de acilasa de penicilina G se puede determinar sin purificación adicional de tal manera que las actividades específicas (en unidades por mg de acilasa) se pueden determinar más exactamente. Con el fin de determinar la actividad sintética inicial en la síntesis de cefalexina y cefradina, la conversión se sigue por UPLC como se describe en los Materiales y Métodos. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

Tabla 5. Actividades específicas de los mutantes seleccionados de acilasa de penicilina del Ejemplo 1 para la síntesis de cefalexina, cefradina y la hidrólisis de NIPAB (ver Materiales y Métodos para las condiciones del ensayo) expresada en Unidades Arbitrarias por mg de acilasa y como IF = factor de mejoramiento; el IF del control es 1 por definición.

Hidrólisis Síntesis de Síntesis de de NIPAB cefalexina Cefradina AU/mg IF AU/mg IF AU/mg IF Control 31903 1.0 134 1.0 1.7 1.0 mutante 1 60362 1.9 559 3.0 3.6 2.3 mutante 2 52869 1.7 373 2.5 3.0 1.9 mutante 3 40307 1.3 223 1.5 1.9 1.2 mutante 4 32235 1.0 244 1.6 1.3 0.8 Ejemplo 4 Relaciones S/H de los mutantes de acilasa de penicilina G seleccionados en productividad de cefalexina mejorada La relación S/H de los mutantes seleccionados 1-4 se mide como se describe en los Materiales y Métodos. Durante la síntesis de se registran las curvas de progreso de cefalexina. La relación S/H para la síntesis de cefalexina y la hidrólisis de PGM se determina a partir de estas curvas de progreso. Se registran las mismas curvas de progreso mutantes durante la síntesis de cefradina. Se determina la relación S/H para la síntesis de cefradina y la hidrólisis de metiléster de dihidrofenilglicina . Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6. Relación S/H de los mutantes de acilasa penicilina seleccionados 1-4 comparado con el control durante la síntesis de cefalexina y cefradina.

Ejemplo 5 La modificación de la posición B460 es crucial para mejorar la productividad sintética de las acilasas de penicilina G.

Se diseñan los mutantes 5 y 12 con base en el mutante 1. El mutante 5 es el control en adición a fenilalanina en la posición B460 reemplazado mediante una leucina. Como el mutante 5, en el mutante 12 la fenilalanina en la posición B460 también se ha reemplazado por leucina pero ahora en adición la alanina en la posición B24 se reversa a fenilalanina como se observa en esta posición muchas acilasas de penicilina G. Los genes que codifican los mutantes 5 y 12 se obtienen mediante la síntesis de gen y se transforman a y se expresan en Escherichia coli como se describió anteriormente. Después de fermentación las células de Escherichia coli se tratan mediante sonificación con el fin de liberar la acilasa de penicilina G de las células. Después de remover residuos celulares mediante centrifugación la concentración de la proteína activa en el sobrenadante se determina por medio de titulación PMSF.

Se aplican los mutantes 5 y 12 en la síntesis de cefalexina mientras que la acilasa tipo natural (SEQ 1) , la acilasa de control y el mutante 1 se incluyen como controles. Los resultados se muestran adelante .

Tabla 7 Los mutantes 1, 5 y 12 tienen en común que la fenilalanina en la posición B460 se ha reemplazado por leucina. Para todos los tres mutantes esta modificación incrementa la actividad sintética sin el decline drástico de la relación S/H. En la mayoría de los casos aún se mejora la relación S/H.

Ejemplo 6 Desempeño de varios combinantes en la síntesis de cefalexina y cefradina Los mutantes 1 y 7 se seleccionan de la detección para la relación de ampicilina/6 -APA mejorada cuando se somete el mutante acilasa a una mezcla de PGM, 6 -APA y ampicilina. El mutante 1 también se selecciona de la detección para la productividad mejorada en la síntesis de cefalexina. Las mutaciones observadas en el mutante 1 y el mutante 7 se pueden combinar en diferentes formas. Los mutantes 6 y 8-11 son ejemplos de tales combinaciones. Los mutantes se pueden obtener mediante la síntesis de gen, la transformación y expresión en Escherichia coli como se describió anteriormente. Los resultados para probar algunos de estos mutantes se muestran en la tabla 8.

Tabla 8. Desempeño de los combinantes de mutante 6 y mutante 8 en la síntesis de cefalexina y cefradina comparado con sus progenitores mutante 1 y mutante 7.

Actividad Síntesis Actividad S/H de de S/H de la inicial s íntes i s para la síntesis para la Ac i lasa de síntesis de síntesis cefalexin de cef radina de a IF cefalexin IF (U/Mg) cefradina (U/Mg) a control 1.0 9.3 1.0 1.3 Mutante 1 3.8 10,1 5.2 2 , 0 Mutante 7 2.6 9, 8 2.9 1,9 Mutante 6 3.8 6 , 9 6.0 1,8 Mutante 8 4.2 6,4 7.0 2 , 1 Los combinantes que resultan de combinar las mutaciones del mutante 1 y el mutante 7 muestran que en ciertos aspectos tales híbridos pueden superar el desempeño de sus progenitores .

Ejemplo 7 Producción de amoxicilina de 6 -APA y metil éster HPG Un reactor en acero inoxidable de 2 1, equipado con un tamiz de fondo con poros de 140 y un agitador, se llena con la enzima inmovilizada indicada en la tabla. El volumen se ajusta a 1000 mi mediante la adición de agua. Los contenidos se enfrían a 10 °C, y los contenidos del reactor se hacen circular sobre el tamiz de fondo por medio de una bomba peristáltica .

Se agrega 162.2 g de ácido 6 -aminopenicilánico seguido por la adición de HPGM (ver tabla) . El volumen se ajusta a 1500 mi mediante la adición de agua. La mezcla se agita y se hace circular sobre el tamiz. La temperatura se mantiene a 10 °C. Se monitorea el pH. Inicialmente el pH es aproximadamente 6.3 y después de algún tiempo se incrementa a aproximadamente 7, y posteriormente se reduce. En el punto que el pH es menor de pH=6.3, la reacción casi se completa. En este punto (aproximadamente 2 h después de la adición de HPGM) se toma una muestra de la línea de recirculación se filtra y se analiza mediante HPLC. Los resultados de los varios experimentos se presentan en la tabla 9.

La mezcla de reacción con el mutante 1 y 1.06 equivalentes de HPGM (conversión 10 en la tabla) se somete a procesamiento adicional. La mezcla de reacción se toma del tamiz hasta que la enzima immob casi bloquea el tamiz. Posteriormente se agrega agua a la mezcla en el reactor de acero inoxidable, y la mezcla se toma simultáneamente del tamiz hasta que la suspensión total recolectada tiene un volumen de 3000 mi.

Se repite la conversión 10 tres veces más al agregar las mismas cantidades de 6 -APA y HPGM mientras que se utiliza la misma enzima ya presente en el reactor. Las suspensiones de estas 4 conversiones consecutivas 10 se combinan y se someten a recristalización. La suspensión se calienta a 25°C, y la mezcla se introduce en una serie de 5 recipientes agitados de 30 mi cada uno. La mezcla se transfiere de un recipiente agitado al siguiente mediante sobreflujo de gravedad. El flujo de suspensión es 3000 ml/h. Al mismo tiempo se agrega 35% de HC1 al primer recipiente en tal un índice que el precipitado en la suspensión justo se disuelve en la serie de 5 recipientes agitados. La solución acídica se filtra en línea sobre un filtro de 10 µp?, y se introduce en un cristalizador. En este cristalizador, el pH se mantiene a pH=3.7 mediante la adición de 25% de NaOH, la temperatura se mantiene a 20°C. El volumen se mantiene a 2250 mi mediante sobrefujo de gravedad en un segundo cristalizador. En este cristalizador el pH se mantiene a pH=5.0 mediante la adición de 25% de NaOH a 20°C. El volumen en el segundo cristalizador se mantiene a 750 mi mediante sobrefujo de gravedad en un recipiente agitado. Los contenidos de este recipiente se enfrían a 3°C. El tiempo de residencia en este recipiente es 4 h. La suspensión del cristal se filtra, se lava con agua (1.5 1/kg de producto) y se seca en almacén de ventilación a 35°C hasta peso constante. La producción de trihidrato de amoxicilina (calculado en 6-APA agregado) es 91% (mol/mol) .

Tabla 9 * Equivalentes molares de HPGM con respecto a 6-APA Ejemplo 8 Síntesis de una solución de D- fenilglicina-metiléster (PGM) La síntesis de la solución de D- fenilglicina-metiléster (PGM) se lleva a cabo esencialmente como se describe en la WO2008/110527.

Se suspende 90 g de PG en 170 mi de metanol y se agrega 73.2 g de ácido sulfúrico concentrado. La mezcla se mantiene en reflujo durante 2 horas en aproximadamente 73 °C y se concentra en presión reducida (p = 20 mm Hg, T = 75-80°C) . Se agrega 170 mi de metanol y la mezcla se mantiene de nuevo en reflujo durante 2 horas y se concentra en presión reducida. De nuevo, se agrega 170 mi de metanol y la mezcla se mantiene en reflujo durante 2 horas y se concentra en presión reducida. Finalmente, se agrega 125 mi de metanol. La solución se dosifica en un segundo reactor, que se ha precargado con 20 mi de metanol, en 1 hora a 20°C. El pH se mantiene a 3.5 con amoniaco. Se forma un sólido, que se remueve mediante filtración. El licor madre resultante se diluye con 25 mi de agua y se concentra a presión reducida (p = 20 mm Hg, T = 40-45°C) . Finalmente se obtienen 207.5 g de solución PGM.

Ejemplo 9 Síntesis enzimática de cefalexina Un reactor con un tamiz de fondo de 175 µt? se llena con las cantidades indicadas de diferentes acilasas inmovilizadas por lo que la carga de proteína de las partículas inmovilizadas es la misma para todas las acilasas probadas. Posteriormente se agregan 21.4 g de 7-ADCA y 95 g de agua a 25°C y el pH se ajusta a 7.0 con 25 % de amoniaco. Se dosifica 38 g de solución PGM como se obtienen en el Ejemplo 8 en el reactor en un índice constante en 120 min. El pH se mantiene a 7.0 con amoniaco. La temperatura se mantiene a 25°C. Después de 30 min, se agrega 0.25 g de cefalexina sólida (semilla) . La cristalización de la cefalexina inicia a 45 min. De 120 a 150 min, el pH se mantiene a 7.0 con 25% de ácido sulfúrico. Posteriormente, el pH se reduce a 5.7 con 25% de ácido sulfúrico.

El reactor se descarga a través de un tamiz de fondo con agitación ascendente. La suspensión de cefalexina resultante se filtra a través de un filtro de vidrio. El licor madre resultante se transfiere dentro del reactor. Esta secuencia de etapas se repite cinco veces. Posteriormente, la enzima se lava con 2 x 10 mi de agua. En esta forma, se separa >98% de cefalexina del biocatalizador sólido.

Se combinan la torta húmeda de cefalexina, el licor madre y el agua de lavado, y la temperatura se mantiene a 2°C. El pH de la torta húmeda combinada y los licores madre se reducen a 1.5 con ácido sulfúrico concentrado y la solución resultante se filtra a través de un filtro de 0.45 Se llena un reactor de cristalización con 20 g de agua y 1.0 g de cefalexina (semilla) . La solución de cefalexina acídica mencionada anteriormente se dosifica dentro del reactor de cristalización en 80 minutos a 30°C. El pH se mantiene a 5.0 con amoniaco. Posteriormente, la suspensión se agita a 20°C durante otros 30 min. La suspensión se filtra a través de un filtro de vidrio y la torta húmeda se lava con 2 x 15 mi de agua y 2 x 15 mi de acetona.

Tabla 10 no se determina; n . a . = no se aplica Ejemplo 10 Producción de cef adroxilo de 7-ADCA y metil éster HPG Se llena un reactor con un tamiz de fondo de 175 µt? con las cantidades indicadas de diferentes acilasas inmovilizadas. Posteriormente 17.7 g de 7-ADCA, 15.6 g de HPG , 0.02 g de EDTA y 123 g de agua se agregan a 10°C y el pH se ajusta a 7.2 con 25 % de amoniaco. La reacción enzimática se corre a 10°C y el pH se mantiene a 7.2 con ácido fórmico.

Tabla 11 Ejemplo 11 Síntesis enzimática de cefradina Un reactor con un tamiz de fondo 175 µp? se llena con las cantidades indicadas de diferentes acilasas inmovilizadas. Posteriormente 14.82 g de 7-ADCA y 50 g de agua se agregan a 20°C y el pH se ajusta a 6.9 con 25 % de amoniaco .

Se disuelve 18.5 g de DHPGM.MSA en 20 mi de agua y la solución se dosifica en el reactor en un índice constante en 150 min. El pH se mantiene a 7.0 con amoniaco. La temperatura se mantiene a 20°C. Después de 30 min, se agrega 0.25 g de cefradina sólida (semilla). El pH se reduce a 5.7 con 25% de ácido sulfúrico a 460 min. Debido a la inexactitud de la medición de DHPG, el S/H no se puede determinar con exactitud suficiente.

Tabla 12 Re lac ión S/H Ac i lasa indi ce final de Experimento Ac i lasa inmovilizada de la (g) reacción reacc ión (180 min ) Control 20.5 Igual 25 1 Mutante 8.2 Igual 22 1

Claims (18)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una acilasa de penicilina G procariótica mutante derivada de una acilasa de penicilina G tipo natural caracterizada porque el mutante tiene una sustitución de aminoácido en una o más posiciones de aminoácido seleccionadas del grupo que consiste de las posiciones de aminoácido A3 , A77, A90, A144, A192, B24, B109, B148, B313, B460 y B488 de acuerdo con la numeración de aminoácido de la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli que tiene la secuencia de aminoácido descrita en la SEQ ID No: 1.

2. La acilasa de penicilina G procariótica mutante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el mutante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición B24 y una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A192, B148, B313, B460 y B488.

3. La acilasa de penicilina G procariótica mutante de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque el mutante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición B460 y una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A192, B24 , B148, B313 y B488.

4. La acilasa de penicilina G procariotica mutante de acuerdo con las reivindicaciones 2 y 3, caracterizada porque el mutante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición B24 y por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición B460 y opcionalmente una sustitución de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A192, B148, B313 y B488.

5. La acilasa de penicilina G procariotica mutante de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizada porque el mutante tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición B24 y por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición B460 y que tiene por lo menos una sustitución de aminoácido en la posición B148 y opcionalmente una sustitución de aminoácido en las posiciones seleccionadas del grupo que consiste de A3 , A77, A90, A192, B313 y B488.

6. La acilasa de penicilina G procariotica mutante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones previas, caracterizada porque la acilasa de penicilina G tipo natural se selecciona del grupo que consiste de la acilasa de penicilina G de Escherichia Coli que tiene la secuencia de aminoácido descrita en la SEQ ID No : 1 y las acilasas de penicilina G que son por lo menos 30% homologas a la SEQ ID No : 1.

7. Una secuencia de ácido nucleico que codifica la acilasa de penicilina G mutante de cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. Un vector de expresión que comprende la secuencia de ácido nucleico de la reivindicación 7.

9. Una célula anfitriona que comprende el vector de expresión de la reivindicación 8.

10. Un proceso para producir la acilasa de penicilina G mutante de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

11. Un proceso para la producción de un antibiótico ß-lactama semisintético que comprende un acoplamiento enzimático de una cadena lateral activada en un núcleo ß-lactama caracterizado porque utiliza la acilasa de penicilina G procariótica mutante de cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

12. Un proceso para la producción de un antibiótico ß-lactama semisintético que comprende un acoplamiento enzimático de una cadena lateral activada en un núcleo ß-lactama caracterizado porque utiliza la acilasa de penicilina G procariótica mutante de cualquiera de las reivindicaciones 1-6

13. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque el antibiótico ß-lactama semisintético se selecciona del grupo que consiste de penicilinas semisintéticas y cefalosporinas semisintéticas .

14. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la penicilina semisintética es amoxicilina o ampicilina .

15. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 13, caracterizado porque la cefalosporina semisintética es cefalexina, cefadroxilo o cefradina.

16. Un proceso para la producción de amoxicilina en la presencia de una enzima que cataliza el acoplamiento de HPG en forma activada a 6 -APA, caracterizado porque la relación molar del HPG activado, preferiblemente el éster seleccionado del grupo que consiste de metil- y etiléster, a 6-APA es = 3.0, preferiblemente = 2.5, más preferiblemente = 2.0 y más preferiblemente = 1.5 y la producción de amoxicilina con base en 6-APA (mol/mol) y medida después que la reacción de acoplamiento enzimático es =90%, preferiblemente =91%, preferiblemente =92%, preferiblemente =93%, preferiblemente =94% y más preferiblemente 95.

17. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque la enzima es una acilasa, que posee la propiedad de producir amoxicilina de 500 mmol por litro de HPGM y 530 mmol por litro de 6-APA (es decir la conversión) y al final de la conversión, realizado bajo las condiciones como se describe en la Prueba A, que resulta en menos de 5 mmol por litro de 6 -APA.

18. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizado porque la acilasa es como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-6.