JP2012513196A - 突然変異ペニシリンgアシラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、突然変異ペニシリンアシラーゼと、β−ラクタム核が突然変異ペニシリンアシラーゼの存在下で活性側鎖を介してアシル化されたβ−ラクタム抗生物質を調製するための方法とに関する。
抗生物質のβ−ラクタムファミリーは、臨床用途における抗菌化合物の最も重要なクラスである。天然β−ラクタム抗生物質の狭い殺菌スペクトル、その低い酸安定性および耐性問題の増大は、半合成ペニシリン(SSP)および半合成セファロスポリン(SSC)などの半合成抗生物質(SSA)の開発の誘因となっている。一般に、半合成β−ラクタム抗生物質の化学合成は、高い下流処理費用および環境破壊的なプロセスの原因となる、反応中間体および有機溶媒を低温で使用する厳しい条件下で行われる。したがって、半合成β−ラクタム抗生物質のより持続可能な生産を得るため、従来の化学プロセスを酵素的変換によって代替する努力がなされている。
第1の態様では、本発明は、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌(Escherichia coli)ペニシリンGアシラーゼのアミノ酸番号付けにより、アミノ酸位置A3、A77、A90、A144、A192、B24、B109、B148、B313、B460およびB488からなる群から選択される1つもしくは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、野生型ペニシリンGアシラーゼ由来の突然変異原核生物のペニシリンGアシラーゼを提供し、それは次に示される。
[アシラーゼ突然変異体の調製]
野生型および突然変異ペニシリンGアシラーゼの生成、単離および精製は、国際公開第96/05318号パンフレットおよび国際公開第03/055998号パンフレットに記載のように行ってもよい。あるいは、突然変異ペニシリンGアシラーゼをコードする遺伝子は、遺伝子合成によって得てもよい。
アシラーゼ濃度が、Svedasら、1977年、Bioorg.Khimya[Russ.]3、546−553頁およびAlkemaら、1999年、Anal.Biochem 275、47−53頁によって記載されるように、フェニルメチルスルホニルフッ化物(PMSF)を用いて活性部位滴定を行うことによって測定された。活性部位滴定時の初期活性および残留活性が、基質としてNIPABを用いて測定された。次いで、NIPABの加水分解が、5−アミノ−2−ニトロ安息香酸の放出による、405nmでの吸光度の増大を測定することにより、0.1M MOPS緩衝液(pH=7.4)中、37℃で行われる。あるいは、活性部位滴定後の残留活性は、セファレキシンの合成を用いて測定してもよい(下記参照)。
国際公開第97/04086号パンフレットおよび欧州特許第0222462号明細書において開示される方法に従い、様々なアシラーゼが固定化された。
Fujii法に従い、セファレキシンおよびセフラジンなどのセファロスポリンの検出が行われた(Fujiiら、1976年、Process Biochemistry、21−24頁)。本方法は、高スループットフォーマットスクリーニングに容易に変換可能である。
D−フェニルグリシンメチルエステル(PGM)および7−ADCAからのセファレキシンの形成を測定するための標準アッセイが、次の方法で行われた。すなわち、10μlのペニシリンGアシラーゼ溶液が、50g/lのPGMおよび50g/lの7−ADCAからなる130μlの基質混合物に添加された(この溶液の調製については下記参照)。その後、反応画分が密封され、蒸発が阻止された。室温で2時間のインキュベーション時間後、140μlの1M NaOHが添加されて反応が停止され、カラム展開が開始された。十分に混合することにより、沈殿が阻止される。密封された画分中、室温で2時間のインキュベーション後、490nmでの吸光度が測定された。ブランク実験においては、水が酵素の代わりに添加された。初期代謝回転速度の測定の場合、酵素濃度は最終変換が1〜10%の間であるように行われた。変換の制御を目的として酵素濃度を変化させるのではなく、その代わり反応時間を調整することで、所望される変換が得られうる。形成されるセファレキシンの絶対量は、(既知の量のセファレキシンを含有する試料の場合に測定された)セファレキシン濃度に対して、490nmでODをプロットする場合に得られる較正ラインから判定可能である。
D−2,5−ジヒドロフェニルグリシンメチルエステル(DHPGM)および7−ADCAからのセフラジンの形成を測定するための標準アッセイが、セファレキシンについての上記のように、次の方法で行われた。D−2,5−ジヒドロフェニルグリシンメチルエステルのメタンスルホン酸塩(DHPGM.MSA)のみが、PGM.MSAの代わりに使用された。
β−ラクタム抗生物質の合成におけるPenGアシラーゼのS/H比を測定するため、変換は時間の関数として測定された。試料が異なる時点で採取され、変換混合物の組成が測定された。反応は、pHを2.7に低下させることによって停止された。試料は、形成されるアシル化抗生物質、抗生物質核、加水分解側鎖前駆体および側鎖前駆体の濃度を測定するため、UPLC(超高性能液体クロマトグラフィー)によって分析された。
ACQUITY−Pump :バイナリ溶媒マネージャー
ACQUITY−Autosampler:試料マネージャーおよび試料オルガナイザー
ACQUITY−UV検出器 :PDA検出器(80ヘルツ)
UPLC BEHフェニル、1.7μm、2.1×50mm(カタログ番号186002884)
流量 :0.9ml/分
注入容量 :2μl(部分ループ)
移動相A :50mMリン酸塩緩衝液(pH6.0)
移動相B :100%アセトニトリル
カラム温度 :60℃
トレー温度 :10℃
波長 :210および260nm
稼動時間 :1分
140μmの孔を有する篩底(sieve bottom)および撹拌装置を装備した2Lのステンレス鋼製反応器は、HPGMと6−APAとの共役を触媒するのに使用される固定化酸素で満たされた。容量は、水の添加により、1000mlに調節された。内容物は10℃に冷却され、反応器内容物は、蠕動ポンプにより、篩底上で循環された。
6−APA :6−アミノペニシラン酸
7−ADCA :7−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸
AMPI :アンピシリン
CEX :セファレキシン
DHPG :D−2,5−ジヒドロフェニルグリシン
DHPGM.MSA :D−2,5−ジヒドロフェニルグリシンメチルエステルメタンスルホン酸塩
EDTA :エチレンジアミン四酢酸
HPGM :D−p−ヒドロキシフェニルグリシンメチルエステル
PG :D−フェニルグリシン
PGA :D−フェニルグリシンアミド
PGM :D−フェニルグリシンメチルエステル
PGM.HCL :D−フェニルグリシンメチルエステルHCI塩
PGM.MSA :D−フェニルグリシンメチルエステルメタンスルホン酸塩
用語「相同性」または「パーセント同一性」は、本明細書中で交換可能に使用される。本発明の目的として、2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列のパーセント相同性を判定するため、配列が最適な比較目的で整列されることが本明細書で規定される。2つの配列の間のアラインメントを最適化するため、比較される2つの配列のいずれかに、ギャップを導入してもよい。かかるアラインメントは、比較される配列の完全長にわたって行ってもよい。あるいは、アラインメントは、より短い長さ、例えば約20、約50、約100もしくはそれ以上の核酸/塩基またはアミノ酸にわたって行ってもよい。同一性は、報告される整列領域にわたる2つの配列間の同一マッチ(identical match)の百分率である。
相同性または同一性は、任意のギャップを含む全整列領域にわたる2つの配列間の同一マッチの百分率である。2つの整列配列間の相同性または同一性は、次のように計算される。すなわち、アラインメントにおける対応位置の数は、両配列内の同一のアミノ酸を、ギャップを含むアラインメントの全長によって除したものを示す。本明細書で定義される同一性は、NEEDLEから得てもよく、プログラムの出力において「IDENTITY」と称される。
2つの整列配列間の相同性または同一性は、次のように計算される。すなわち、アラインメントにおける対応位置の数は、両配列における同一のアミノ酸を、アラインメントにおけるギャップの全数を差し引いた後、アラインメントの全長によって除したものを示す。本明細書で定義される同一性は、NOBRIEFオプションの使用によってNEEDLEから得てもよく、プログラムの出力において「最長の同一性」と称される。
[実施例1]
[改善されたセファレキシン合成活性を有するペニシリンGアシラーゼ突然変異体の選択]
PenGアシラーゼ突然変異体の活性を改善されたS/H比によって改善する、アミノ酸の位置および突然変異を見出すため、既に次の2つの突然変異体、すなわちB:F24AおよびB:V148L(以降、対照と称される)をタンパク質レベルで有する大腸菌(Escherichia coli)のペニシリンGアシラーゼをコードする遺伝子の変異性突然変異誘発により、突然変異体ライブラリーを生成した。このようにして得られた突然変異体ライブラリーに対して、対照に対して改善されたセファレキシンの生産性を示す突然変異体についての高スループットスクリーニングを実施した。fujii法によって形成されるセファレキシンの検出のアッセイおよび方法については、材料および方法の項において記載されている。高スループットにおいては、生産性という用語は、特定の期間内に一定量の無細胞抽出物(CVE)によって合成されるセファレキシンの量を示す。全部で約7000のクローンを試験した。
[アンピシリンの合成において改善されたアンピシリン/6−APAを有するペニシリンGアシラーゼ突然変異体の選択]
上記の突然変異体ライブラリーからの約6000のクローンを、アンピシリンの合成について試験した。大腸菌(Escherichia coli)クローンを成長させた後、無細胞抽出物を上記のように調製した。次いで、20μLの無細胞抽出物を、12mM PGM、4mM 6−APAおよび10mMアンピシリンを含有する80μLの0.05M MOPS緩衝液(pH=6.9)に移す。PGMを、遊離塩基として調製する。すべての溶液を、毎日新しく調製する。反応は、室温で行い、PMSFで停止させる。次いで、試料をUPLCクロマトグラフィーによって分析する。
カラム:Waters Acquity UPLC BEHフェニル、50×2.1mm、粒子サイズ1.7μm
溶媒A:50mM酢酸アンモニウム、pH=5.8
溶媒B:60%アセトニトリル+40%ミリQ水
弱洗浄(Weak wash):5%アセトニトリル+95%ミリQ水
強洗浄(Strong wash):95%アセトニトリル+5%ミリQ水
[改善されたセファレキシンの生産性について選択されるペニシリンGアシラーゼ突然変異体のセファレキシン・エン・セフラジンの合成活性]
実施例1の選択された突然変異体である突然変異体1〜突然変異体4の活性(表3)は、同様の生成宿主の成長時に、ほぼ同様のペニシリンGアシラーゼの発現が得られる(同様のOD490nm〜細胞密度)という仮説に基づく。突然変異体の発現レベルにおける任意の差異について訂正するため、無細胞抽出物中のペニシリンアシラーゼの濃度を、材料および方法において記載されるPMSF滴定を用いて測定した。PMSF滴定に基づき、活性ペニシリンGアシラーゼ含量はさらに精製することなく測定可能であることから、(単位/mgのアシラーゼでの)比活性は、より正確に測定できる。セファレキシンおよびセフラジンの合成における初期合成活性を測定するため、変換後、材料および方法に記載のようにUPLCを行った。結果を表5に示す。
[改善されたセファレキシンの生産性について選択されるペニシリンGアシラーゼ突然変異体のS/H比]
選択される突然変異体1〜4のS/H比は、材料および方法に記載のように測定した。セファレキシンの合成の間、進行曲線を記録した。セファレキシンの合成およびPGMの加水分解におけるS/H比を、これらの進行曲線から判定した。同じ突然変異体について、セフラジンの合成の間、進行曲線を記録した。セフラジンの合成およびジヒドロフェニルグリシンメチルエステルの加水分解におけるS/H比を判定した。結果を表6に示す。
[位置B460の修飾はペニシリンGアシラーゼの合成の生産性を高めるのに重要である]
突然変異体5および12は、突然変異体1に基づいて設計した。突然変異体5は、位置B460でのフェニルアラニンがロイシンによってさらに置換された対照である。突然変異体5と同様、突然変異体12では、位置B460でのフェニルアラニンがロイシンによってさらに置換されているが、ここでは位置B24でのアラニンが、多数の野生型ペニシリンGアシラーゼにおけるこの位置で認められるように、フェニルアラニンにさらに置換された。上記のように、突然変異体5および12をコードする遺伝子を、遺伝子合成によって得て、大腸菌(Escherichia coli)に形質転換し、またそこで発現させた。発酵後、大腸菌(Escherichia coli)細胞を、細胞からペニシリン−Gアシラーゼを放出するため、超音波処理によって処理した。遠心分離によって細胞残渣を除去後、上清中の活性タンパク質の濃度を、PMSF滴定によって測定した。
[セファレキシンおよびセフラジンの合成における様々なコンビナントの性能]
突然変異体1および7は、突然変異アシラーゼをPGM、6−APAおよびアンピシリンの混合物に暴露する場合での、改善されたアンピシリン/6−APA比についてのスクリーニングから選択した。突然変異体1はまた、セファレキシンの合成における改善された生産性についてのスクリーニングから選択した。突然変異体1および突然変異体7において認められる突然変異は、異なる方法で組み合わせてもよい。突然変異体6および8〜11は、かかる組み合わせの例である。上記のように、突然変異体は、大腸菌(Escherichia coli)における遺伝子合成、形質転換および発現によって得てもよい。これらの突然変異体の一部の試験結果を表8に示す。
[6−APAおよびHPGメチルエステルからのアモキシシリンの生成]
140μmの孔を有する篩底および撹拌装置を装備した2Lのステンレス鋼製反応器を、表中に示される固定化酸素で満たした。容量を、水の添加により、1000mlに調節した。内容物を10℃に冷却し、反応器内容物を、蠕動ポンプにより、篩底上で循環させた。
[D−フェニルグリシン−メチルエステル(PGM)溶液の合成]
D−フェニルグリシン−メチルエステル(PGM)溶液の合成を、本質的に国際公開第2008/110527号パンフレット中に記載のように行った。
[セファレキシンの酵素合成]
175μmの篩底を有する反応器を、指定量の異なる固定化アシラーゼで満たし、それにより、固定化(immob)粒子のタンパク質負荷は、試験したすべてのアシラーゼと同様であった。次いで、21.4gの7−ADCAおよび95gの水を25℃で添加し、pHを25%アンモニアで7.0に調整した。実施例8において得られた38gのPGM溶液を、反応器に、120分以内に一定速度で投入した。pHをアンモニアで7.0に維持した。温度を25℃に保持した。30分後、0.25gの固体セファレキシン(シード)を添加した。セファレキシンの結晶化が、45分後に開始された。120〜150分の間に、pHを25%硫酸で7.0に保持した。次いで、pHを25%硫酸で5.7に低下させた。
[7−ADCAおよびHPGメチルエステルからのセファドロキシルの生産]
175μmの篩底を有する反応器を、指定量の異なる固定化アシラーゼで満たした。次いで、17.7gの7−ADCA、15.6gのHPGM、0.02gのEDTAおよび123gの水を10℃で添加し、pHを25%アンモニアで7.2に調整した。酵素反応を10℃で行い、pHをギ酸で7.2に保持した。
[セフラジンの酵素合成]
175μmの篩底を有する反応器を、指定量の異なる固定化アシラーゼで満たした。次いで、14.82gの7−ADCAおよび50gの水を20℃で添加し、pHを25%アンモニアで6.9に調整した。
Claims (18)
- 配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌(Escherichia coli)ペニシリンGアシラーゼのアミノ酸番号付けにより、アミノ酸位置A3、A77、A90、A144、A192、B24、B109、B148、B313、B460およびB488からなる群から選択される1つもしくは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、野生型ペニシリンGアシラーゼ由来の突然変異原核生物のペニシリンGアシラーゼ。
- 前記突然変異体が、位置B24に少なくとも1つのアミノ酸置換、ならびにA3、A77、A90、A192、B148、B313、B460およびB488からなる群から選択される位置に1つもしくは複数のアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項1に記載の突然変異原核生物のペニシリンGアシラーゼ。
- 前記突然変異体が、位置B460に少なくとも1つのアミノ酸置換、ならびにA3、A77、A90、A192、B24、B148、B313およびB488からなる群から選択される位置に1つもしくは複数のアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項1に記載の突然変異原核生物のペニシリンGアシラーゼ。
- 前記突然変異体が、位置B24に少なくとも1つのアミノ酸置換、位置B460に少なくとも1つのアミノ酸置換、ならびに場合によってA3、A77、A90、A192、B148、B313およびB488からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項2および3に記載の突然変異原核生物のペニシリンGアシラーゼ。
- 前記突然変異体が、位置B24に少なくとも1つのアミノ酸置換、ならびに位置B460に少なくとも1つのアミノ酸置換を有し、かつ、位置B148に少なくとも1つのアミノ酸置換、ならびに場合によってA3、A77、A90、A192、B313およびB488からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有していることを特徴とする、請求項4に記載の突然変異原核生物のペニシリンGアシラーゼ。
- 前記野生型ペニシリンGアシラーゼは、配列番号1で示されるアミノ酸配列を有する大腸菌(Escherichia coli)ペニシリンGアシラーゼおよび配列番号1に対して少なくとも30%相同なペニシリンGアシラーゼからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか一項に記載の突然変異原核生物のペニシリンGアシラーゼ。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の、突然変異ペニシリンGアシラーゼをコードする核酸配列。
- 請求項7に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
- 請求項8に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の、突然変異ペニシリンGアシラーゼを生成するための方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の突然変異原核生物のペニシリンGアシラーゼの使用によって特徴づけられる、活性側鎖とβ−ラクタム核との酵素共役を含む、半合成β−ラクタム抗生物質を生成するための方法。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載の突然変異原核生物のペニシリンGアシラーゼの使用によって特徴づけられる、活性側鎖とβ−ラクタム核との酵素共役を含む、半合成β−ラクタム抗生物質を生成するための方法。
- 前記半合成β−ラクタム抗生物質は、半合成ペニシリンおよび半合成セファロスポリンからなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
- 前記半合成ペニシリンは、アモキシシリンまたはアンピシリンである、請求項13に記載の方法。
- 前記半合成セファロスポリンは、セファレキシン、セファドロキシルまたはセフラジンである、請求項13に記載の方法。
- 活性型のHPGと6−APAとの共役を触媒する酵素の存在下でアモキシシリンを生成するための方法であって、6−APAに対する、前記活性HPG、好ましくはメチル−およびエチルエステルからなる群から選択されるエステルのモル比が、3.0以下、好ましくは2.5以下、より好ましくは2.0以下、およびより好ましくは1.5以下であり、かつ、前記酵素共役反応後に測定される、6−APAを基準とするアモキシシリンの収率(モル/モル)が、90%以上、好ましくは91%以上、好ましくは92%以上、好ましくは93%以上、好ましくは94%以上、およびより好ましくは95以上である、方法。
- 前記酵素は、500mモル/LのHPGMおよび530mモル/Lの6−APAからアモキシシリンを生成する(すなわち、変換)特性を有し、かつ、試験Aに記載の条件下で行われる前記変換の終了時、5mモル/L未満の6−APAを生成する、アシラーゼである、請求項17に記載の方法。
- 前記アシラーゼは、請求項1〜6のいずれか一項において規定されたものである、請求項18に記載の方法。
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