MX2010013415A - Celula recombinante productora de acido 2-hidroxiisobutirico. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una célula que ha sido genéticamente modificada de tal forma que es capaz de formar más ácido 2-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobutírico, caracterizada en que la formación de ácido 2-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobutírico toma lugar a través de la acetoacetil coenzima A como un producto intermediario y 3-hidroxibutiril coenzima A como un producto preliminar.

Description

CELULA RECOMBINANTE PRODUCTORA DE ACIDO 2 -HIDROXIISOBUTIRICO Campo de la Invención El tema de la invención es una célula que ha sido genéticamente modificada para así ser capaz de producir más ácido 2 -hidroxiisobutírico y más polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monoméros de ácido 2 -hidroxiisobutírico que su tipo silvestre, caracterizado en que el ácido 2-2-hidroxiisobutírico o los polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico se producen a través de la acetoaceil -coenzima A como intermediario y 3 -hidroxibutiril -coenzima A como precursor.

Antecedentes de la Invención El ácido metacrílico, sus ésteres y polímeros se utilizan ampliamente para producir cristales, productos moldeados por inyección, recubrimientos y muchos otros productos .

Se ha descrito una pluralidad de procedimientos para producir ácido metacrílico. Sin embargo, la producción más comercial a nivel mundial se basa en un procedimiento químico para hidrolizar sulfatos de metacrilamida producidos de 2-hidroxinitrilos correspondientes, con aproximadamente 1.6 kg de ácido sulfúrico requerido para producir 1 kg de ácido metacrílico.

US 3,666,805 y US 5,225,594 describen la conversión Ref. 216095 química del ácido 2 -hidroxiisobutírico (2-HIB) a ácido metacrílico con rendimientos de hasta 96%.

Un procedimiento alternativo para producir ácido metacrílico involucra hidrolizar 2 -hidroxinitrilos para dar ácido 2-hidroxiisobutírico con el uso de enzimas hidrolizantes de nitrilo, lo anterior siendo nitrilasa o una combinación de hidratasa y amidasa de nitrilo (A. Banerjee, R. Sharrna, U. C. Banerjee, 2002, "The nitrile-degrading enzymes : current status and future prospects" , Appl . Microbiol. Biotechnol . , 60:33-44 y US 6,582,943). Una desventaja seria de este método es la inestabilidad de los nitrilos a un intervalo de pH neutral que es necesario para una eficiente actividad enzimática hidrolizante del nitrilo. La degradación del nitrilo en la mezcla de reacción da como resultado la acumulación de cetonas y cianuro, ambos exhibiendo actividades enzimáticas hidrolizantes del nitrilo.

Una desventaja general de ambos procedimientos, es decir, del procedimiento actualmente dominante con base en sulfatos de amida y del procedimiento hidrolizante de nitrilo enzimático, es la necesidad de 2-hidroxinitrilos que primero deben prepararse de reactivos ambientalmente dañinos, principalmente cetonas y cianuro.

CA 2,510,657 describe un procedimiento alternativo para proporcionar ácido 2-hidroxiisobutírico a través de una trayectoria metabólica enzimática a través de la cual se degrada el alcohol ter-butílico .

PCT/EP2007/052830 describe otro procedimiento enzimático para proporcionar ácido 2-hidroxiisobutírico . Este involucra invertir el precursor 3 - hidroxibut i ri 1 - coenz ima A (3-HBCoA) en ácido 2 - hidroxi i sobut írico con la ayuda de una mutasa. En la práctica, tal procedimiento tiene las siguientes desventajas. Es un procedimiento por lotes, el reactivo de ácido 3 -hidroxibu í rico (3-HB) se adiciona exógenamente , y las condiciones del procedimiento demandan gas inerte. Los grados de conversión son de alrededor del 20%.

Los procedimientos para preparar ácido 2-hidroxiisobut í rico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobut í rico, que superen las desventajas descritas, por consiguiente serían ventajosos.

En consecuencia, es un objeto de la invención proporcionar un procedimiento para producir ácido 2-hidroxii sobut í rico, que cumple con la demanda para precursores de ácido 2 -hidroxi i sobutí rico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxi i sobut í rico , que pueden procesarse adic ionalmente para dar ácido metacrílico, sus ésteres y polímeros.

Breve Descripción de la Invención Sorprendentemente, se encontró que la producción de ácido 2 -hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico a través de acetoacetil-coenzima A como intermediario y 3-hidroxibutiril -coenzima A como precursor contribuyen a lograr los objetos antes mencionados.

El término "precursor" como se utiliza en la presente, define un compuesto químico que puede convertirse enzimáticamente en el producto deseado utilizando solamente una enzima, mientras el término "intermediario" define un compuesto químico que puede convertirse enzimáticamente en el producto deseado utilizando por lo menos dos enzimas; los compuestos con o sin la funcionalidad de la coenzima A deberán de ser referidos como "compuestos químicos" equivalentes, y las enzimas que forman el tioéster o dividen el tioéster por consiguiente no se incluyen.

La invención por consiguiente se refiere a una célula que ha sido genéticamente modificada para así ser capaz de producir más ácido 2 -hidroxiisobutírico o más polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico que su tipo silvestre, caracterizado en que el ácido 2 -hidroxiisobutírico o los polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico se producen a través de acetoacetil -coenzima A como intermediario y 3-hidroxibutiril-conezima A como precursor. La invención además se refiere a un procedimiento para preparar la célula de conformidad con la invención y un procedimiento para preparar ácido 2-hidroxiisobutírico utilizando una célula de acuerdo con la invención y también a un procedimiento para preparar ácido metacrílico .

Una ventaja de la invención es la posibilidad de preparar ácido 2 -hidroxiisobutírico y ácido metacrílico, respectivamente, ambos de recursos renovables, por ejemplo, de carbohidratos y/o glicerol, pero también de materias primas derivadas de combustibles de fósiles tales como metanol por ejemplo, por lo tanto evitando los problemas de la disponibilidad variable de los recursos de fósil. Otra ventaja de la invención es la posibilidad de obtener ácido metacrílico a través de un procedimiento térmicamente menos estresante y usualmente con menores pasos del proceso de la invención. Aún otra ventaja de la invención consiste en evitar la multiplicidad de sustancias tóxicas o agresivas según producidas en procedimientos químicos convencionales para preparar ácido 2 -hidroxiisobutírico .

La invención se describirá a manera de ejemplo a continuación pero no pretende limitarse a estas modalidades ilustrativas .

A menos que se indique lo contrario, todos los porcentajes (%) se dan en porciento por masa.

El término "ácido 2 -hidroxiisobutírico" , como se utiliza en la presente, siempre describe el ácido carboxílico de C4 correspondiente en la forma presente, dependiendo del pH, después de ser producido a través de microorganismos correspondientes. En consecuencia, el término siempre abarca la forma ácida pura (ácido 2 -hidroxiisobutírico) , la forma básica pura (2-hidroxiisobutirato) y mezclas de forma protonada y desprotonada del ácido. Además, el término "3-hidroxibutiril-coenzima A" comprende en principio ambos, el estereoisómero (R) y el estereoisómero (S) , con preferencia particular dada al estereoisómero (R) .

La frase "para así ser capaz de producir más ácido 2 -hidroxiisobutírico y más polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico que su tipo silvestre" también se refiere al caso en donde el tipo silvestre de la célula genéticamente modificada no es capaz de producir ningún ácido 2 -hidroxiisobutírico, o ningún polihidroxialcanoato que contiene unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico para nada o por lo menos cualquier cantidad detectable de estos compuestos, y cantidades detectables de sus compuestos pueden producirse solamente después de la modificación genética.

Un "tipo silvestre" preferiblemente se refiere a una célula cuyo genoma ha sido generado naturalmente a través de la evolución. El término se utiliza tanto para la célula como para genes completos individuales. En consecuencia, el término "tipo silvestre" específicamente no incluye las células y genes cuyas secuencias genéticas han sido modificadas por lo menos parcialmente a través de humanos por medio de procesos recombinantes .

El ácido metacrílico después puede producirse de ácido 2-hidroxiisobutírico en una ligera reacción de deshidratación . En el caso de polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobutírico, el gránulo presente en las células, que se carga con los polihidroxialcanoatos, puede aislarse, y posteriormente los polímeros pueden dividirse para dar ácido 2-hidroxiisobutírico que después puede deshidratarse para dar ácido metacrílico.

De acuerdo con la invención, se da preferencia en la presente a la célula genéticamente modificada para así producir por lo menos 2 veces, particularmente preferiblemente al menos 10 veces, adicionalmente de preferencia por lo menos 100 veces, aún adicionalmente más preferible por lo menos 1000 y más de preferencia por lo menos 10000 veces, más ácido 2-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobutírico que la célula de tipo silvestre dentro de un intervalo de tiempo definido, preferiblemente de 2 horas, aún más preferiblemente de 8 horas y más preferiblemente de 24 horas. El aumento en la formación del producto puede determinarse, por ejemplo, cultivando la célula de acuerdo con la invención y la célula de tipo silvestre en cada caso de manera separada bajo las mismas condiciones (misma densidad celular, mismo medio nutriente, en las mismas condiciones de cultivo) en un medio de nutriente adecuado durante un intervalo de tiempo particular y después determinar la cantidad de producto objetivo (ácido 2 -hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico) , en el caso de ácido 2-hidroxiisobutírico, en el sobrenadante de la célula o, en el caso de polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobutírico, en las células.

Las células de la invención pueden ser procariotas o eucariotas y pueden ser células de mamífero (tales como las células de humano) , células de planta o microorganismos tales como levaduras, hongos o bacterias, con preferencia particular dada a los microorganismos y con más preferencia dada a las bacterias y levaduras. Las bacterias, levaduras u hongos adecuados son en particular aquellas bacterias, levaduras u hongos depositados en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ) [Colección Alemana de microorganismos y cultivos celulares] , Brunswick, Alemania, en la forma de cepas de bacterias, levaduras u hongos. La bacteria adecuada de acuerdo con la invención pertenece al género enumerado htt : //www . dsmz . de/species/bacteria . htm, levaduras adecuadas de acuerdo con la invención que pertenecen al género enumeradas en http : //www . dsmz . de/species/yeasts . htm y los hongos adecuados de acuerdo con la invención son los enumerados en http : //www . dsmz . de/species/fungí . htm .

Las células preferidas de la invención son aquellas del género Aspergillus, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Alcaligenes, Lactobacillus, Paracoccus, Lactococcus, Candida, Pichia, Hansenula, Kluyveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Rhodospirillum, Rhodobacter, Burkholderia, Clostridium y Cupriavidus con particular preferencia dada a Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Alcaligenes latus, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymomonas mobilis, Yarrowia lipolytica, Hansenula polymorpha, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha , en particular Ralstonia eutropha H16, Rhodospirillum rubru , Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus versutus, Pseudo onas aeruginosa, Pseudo onas putida, Acinetobacter calcoaceticus y Pichia pastoris .

La célula de acuerdo con la invención que es capaz de producir más ácido 2 -hidroxiisobutírico y más polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico que su tipo silvestre a través de acetoacetil-coenzima A como intermediario y 3 -hidroxibutiril -coenzima A como precursor por consiguiente tiene una actividad de una enzima Ex que cataliza la conversión del acetoacetil-coenzima A en 3-hidroxibutiril-coenzima A.

La enzima Ei es preferiblemente una enzima selecciona del grupo que comprende: una 3 -hidroxiacil-CoA deshidrogenasa (EC 1.1.1.35) , una acetoacetil-coenzima A reductasa (EC 1.1.1.36) , una 3-hidroxiacil-CoA deshidrogenasa de cadena larga ( (EC 1.1.1.211) y una 3-hidroxibutiril-coenzima A deshidrogenasa (EC 1.1.1.157) .

Tal enzima preferiblemente se codifica a través de genes seleccionados del grupo que consiste de phaB, phbB, fabG, phbNl , phbB2 , particularmente de preferencia phaB, phbB. Las secuencias de nucleótido de tales genes pueden encontrarse, por ejemplo, en "Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (base de datos KEGG) , la base de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) o la base de datos de secuencia de nucleótido de European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania and Cambridge, UK) .

Puede ser ventajoso para la célula de acuerdo con la invención tener una actividad de Ei enzimática incrementada comparada con su tipo silvestre, cuya enzima cataliza la conversión de acetoacetil-coenzima A a 3-hidroxibutiril -coenzima A.

El término "actividad enzimática incrementada" como se utiliza anteriormente en conexión con la enzima Ei y en los comentarios a continuación en conexión con las enzimas E2, etc., preferiblemente significa una actividad intracelular incrementada.

Los siguientes comentarios sobre el incremento en la actividad enzimática en las células se aplica a ambos, el aumento en la actividad de la enzima Ex y las otras enzimas mencionadas a continuación cuya actividad puede aumentarse, cuando es apropiado.

Un aumento en la actividad enzimática puede lograrse en principio aumentando el número de copias de la secuencia genética o las secuencias genéticas que codifican la enzima, mediante uso de un promotor fuerte, a través de la alteración del uso del codón del gen, a través del incremento de la vida media del ARNm, o la enzima en diferentes formas, a través de la modificación de la regulación de la expresión del gen o a través del uso de un gen o un alelo que codifica una enzima correspondiente que tiene una actividad incrementada y a través de la combinación de estas medidas, cuando es apropiado. Las células genéticamente modificadas de la . invención son generadas, por ejemplo, a través transformación, transducción, conjugación o una combinación de estos métodos, utilizando un vector que contiene el gen deseado, un alelo del gen o una de sus partes o un promotor que permite que el gen se exprese. La expresión heteróloga se logra en particular a través de la integración del gen o los alelos en el cromosoma de la célula o en un vector de replicación extra-cromosómico .

Una visión general de las posibilidades de aumentar la actividad de las enzimas en las células se da, por ejemplo, de piruvato carboxilasa, en DE-A-100 31 999, que se incorpora por referencia y cuya descripción sobre las posibilidades de aumentar la actividad de las enzimas en las células es parte de la descripción de la presente invención.

La expresión de las enzimas o genes mencionados anteriormente y de todas las enzimas o genes mencionados a continuación puede detectarse con la ayuda de fraccionamiento en gel proteico uni- y bi-dimensional y la posterior identificación óptica de la concentración de proteína en el gel a través del software de evaluación apropiado. Si el aumento en la actividad enzimática se basa solamente en un aumento en la expresión de gen correspondiente, el incremento en la actividad enzimática puede cuantificarse simplemente a través de la comparación de fraccionamientos proteicos uni- o bi -dimensionales del tipo silvestre y de la célula genéticamente modificada. Un método común para preparar geles de proteína para la bacteria coryneform e identificar tales proteínas es el procedimiento descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)). La concentración de la proteína puede igualmente analizarse a través de hibridación Western blot con un anticuerpo específico para la proteína a ser detectada (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2a" Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) y la posterior evaluación óptica utilizando un software para la determinación de la concentración apropiada (Lohaus and Meyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647). La actividad de las proteínas de unión a AND puede medirse por medio de ensayos de intercambio de banda de AND (también referidos como retardo de gel) (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155) . La acción de las proteínas de unión a AND en la expresión de otros genes puede detectarse a través de varios métodos de ensayo de genes reporteros bien descritos (Sambrook. et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2a' Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) . Las actividades enzimáticas intracelulares pueden determinarse a través de varios métodos descritos (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8) : 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3) : 816-823) . Cuando los comentarios siguientes no indican ningún método específico para la determinar la actividad de una enzima particular, el aumento en la actividad enzimática y también la reducción de una actividad enzimática preferiblemente se determinan a través de los métodos descritos en Hermann et al., Electophoresis , 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999) y Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001).

Si el aumento en la actividad enzimática se logra a través de la mutación del gen endógeno, tales mutaciones pueden generarse ya sea no específicamente a través de métodos clásicos, por ejemplo, a través de irradiación UV o químicos mutagénicos, o específicamente por medio de métodos de ingeniería genética tales como eliminación (s) , inserción (s) y/o sustitución (s) de nucleótido. Las mutaciones producen células alteradas. Las enzimas mutantes particularmente preferidas son en particular también aquellas enzimas que no pueden inhibirse más a través de retroalimentación o solamente a un grado limitado comparado con la enzima de tipo silvestre.

Cuando el incremento en la actividad enzimática se logra aumentando la síntesis enzimática, esto involucra por ejemplo aumentar el número de copias de los genes correspondientes o mutar el promotor y las regiones reguladoras o el sitio de unión ribosómico localizado en corriente arriba del gen estructural. Los casetes de expresión insertados en corriente arriba del gen estructural tienen el mismo efecto. Además, los promotores inducibles que permiten que la expresión se aumente en cualquier momento. Además, sin embargo, los "potenciadores" que también aumentan la expresión del gen a manera de interacción incrementada entre la polimerasa de ARN y ADN también pueden asignarse como secuencias reguladoras al gen enzimático. Las mediciones de prolongar la vida media del ARNm también pueden mejorar la expresión. Además, la actividad enzimática también se mejora evitando la degradación de la proteína enzimática. Aquí, los genes o constructos de gen se localizan ya sea en los plásmidos con diferentes números de copias o se integran y amplifican en el cromosoma. Alternativamente, los genes en cuestión además pueden sobre-expresarse alterando las composiciones de los medios y procedimientos de cultivo. Las instrucciones para esto pueden encontrarse por el experto en la técnica inter alia en Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), en Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya and Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), en EP-A-0 472 869, en US 4,601,893, en Schwarzer and Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), en Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en WO-A- 96/15246 , en Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993), en JP-A-10-229891 , en Jensen and Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998) ) y en libros de texto de genética y biología molecular conocidos. Al igual que las mutaciones, las mediciones descritas anteriormente dan como resultado células genéticamente modificadas.

La expresión de genes particulares se aumenta utilizando plásmidos episomales, por ejemplo. Los plásmidos y vectores adecuados son en principio todas las modalidades disponibles para el experto en la técnica para este propósito. Los plásmidos y vectores pueden encontrarse, por ejemplo, en folletos de Novagen, Promega, New England Biolabs, Clontech o Gibco BRL . Otros plásmidos y vectores preferidos pueden encontrarse en: Glover, D. M. (1985), DNA cloning: a practical approach, vol . I-III, IRL Press Ltd., Oxford; Rodríguez, R.L. and Denhardt, D. T (eds) (1988) , Vectors : a survey of molecular cloning vectors and their uses, 179-204, Butterworth, Stoneham; Goeddel, D. V. (1990), Systems for heterologous gene expression, Methods Enzymol . 185, 3-7; Sambrook, J. ; Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2a ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

El vector de plásmido que contiene el gen a ser amplificado después se transfiere a través de conjugación o transformación a la cepa deseada. El método de conjugación se describe, por ejemplo, en Scháfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60: 756-759 (1994). Los métodos de transformación se describen, por ejemplo, en Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988) , Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) y Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123: 343-347 (1994) . Después de la recombinación homologa por medio de un evento transversal, la cepa resultante contiene por lo menos dos copias del gen en cuestión. La frase "actividad de Ex enzimática superior que su tipo silvestre" utilizada anteriormente y en los comentarios siguientes siempre significa preferiblemente una actividad de la enzima Ex particular, que ha sido aumentada a través de un factor de al menos 2, particularmente de preferencia de al menos 10, adicionalmente de preferencia de al menos 100, adicionalmente aún más de preferencia de al menos 1000 y más preferiblemente de al menos 10000. La célula de acuerdo con la invención tiene una "actividad de Ex enzimática superior que su tipo silvestre", además comprende más específicamente también una célula cuyo tipo silvestre que no tiene o por lo menos no tiene una actividad detectable de la enzima Ex y que exhibe una actividad detectable de la enzima Ex solamente después de que la actividad de la enzima se ha aumentado, por ejemplo, a través de sobre-expresión. En este contexto, el término "sobre-expresión" o la frase "aumento en la expresión" utilizado en los comentarios siguientes también comprende el caso en donde una célula de partida, por ejemplo, una célula de tipo silvestre, no tiene o tiene al menos expresión no detectable y la síntesis detectable de la enzima Ex solamente a través de procedimientos recombinantes . Por consiguiente, la frase "actividad de Ex enzimática inferior" utilizada a continuación preferiblemente significa una actividad que ha sido reducida por un factor de al menos 0.5, particularmente de preferencia de al menos 0.1, adicionalmente de preferencia de al menos 0.01, adicionalmente aún más de preferencia de al menos 0.001 y más preferiblemente de al menos 0.0001. La frase "actividad inferior" también incluye actividad no detectable ("actividad cero") . La actividad de una enzima particular puede reducirse, por ejemplo, a través de la mutación específica, a través de la adición de inhibidores competitivos o no competitivos o a través de otras medidas de reducción de actividad de una enzima particular que son conocidas para el experto en la técnica.

Preferiblemente, la célula de acuerdo con la invención que es capaz de producir más ácido 2-hidroxiisobutírico o más polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico a través de acetoacetil-coenzima A como intermediario y 3-hidroxibutiril-coenzima A como precursor que su tipo silvestre pueden utilizar carbohidratos, glicerol, aceites y grasas, dióxido de carbono, ácidos carboxílicos , o metanol como fuente de carbono .

Además, la célula de acuerdo con la invención que es capaz de producir ácido 2 -hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico a través de acetoacetil-coenzima A como intermediario y 3 -hidroxibutiril -coenzima A como precursor preferiblemente tienen, cuando es apropiado además de la actividad de la enzima Ei, una actividad en la enzima E2, que es preferiblemente superior que su tipo silvestre y cataliza la conversión de dos moléculas de acetoacetil-coenzima A a acetoacetil-coenzima A.

La enzima E2 es preferiblemente una acetil-Coa C-acetiltransferasa (EC 2.3.1.9) . Esta enzima preferiblemente se codifica a través de los genes seleccionados del grupo que consiste de acatl, acat2, loc484063, loc489421, mgc69098, mgc81403, mgc81256, mgc83664, kat-1, erglO, ygeF, atoB, fadAx, phbA-1, phbA-2, atoB-2, pcaF, pcaF-2, phb-A, bktB, phaA, tioL, thlA, fadA, paaJ, phbAf, pimB, mmgA, yhfS, thl , vraB, thl, mvaC, thiL, paaJ, fadA3, fadA4, fadA5, fadA6, cgll2392, catF, sc8f4.03, thiLl, thiL2, acaBl, acaB2 , acaB3 o acaB4 , con particular preferencia dada a acatl, acat2, atoB, thlA, thlB, phaA y phbA, particularmente de preferencia phaA y phbA.

Las secuencias de nucleótido de estos genes pueden encontrarse, por ejemplo, en "Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (base de datos KEGG) , las bases de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Library of Medicine (Bethesda, MD, USA) o en la base de datos de secuencia de nucleótido de European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania and Cambridge, UK) .

La célula de acuerdo con la invención tiene preferiblemente al menos una actividad de una enzima E3, que es preferiblemente superior que la de su tipo Silvestre y que cataliza la conversión de 3-hidroxibutiril-coenzima A a 2-hidroxiisobutiril-coenzima A. La enzima E3 es preferiblemente una hidroxil-isobutiril-CoA mutasa, una isobutiril -CoA mutasa (EC 5.4.99.13) o una metilmalonil-CoA mutasa (EC 5.4.99.2), en cada caso preferiblemente una coenzima B-12 dependiente de mutasa.

La enzima E3 puede aislarse preferiblemente de los microorganismos Aquincola tertiaricarbonis L108, DSM18028, DSM18512, MethyliJbium petroleip ilum PM1, Methylibium sp. R8 , Xanthobacter autotrophicus Py2 , Rhodobacter sphaeroides (ATCC 17029), Nocardioides sp . JS614, Marinobacter algicola DG893, Sinorhizobium medicae SM419, Roseovarius sp. 211, Pyrococcus furiosus DSM 3638 y es particularmente preferible la coenzima B-12 dependiente de mutasa descrita en PCT/EP2007/052830 , y también una de las enzimas cuya secuencias están al menos una parte en al menos 60%, preferiblemente al menos 80%, particularmente de preferencia al menos 95%, muy particularmente de preferencia al menos 99% idéntica al nivel del aminoácido de la secuencia de aminoácido de la subunidad pequeña o grande de la mutasa descrita en PCT/EP2007/052830 (número de acceso DQ436457.1 y DQ436456.1), como se determina por el algoritmo blastp con un umbral esperado de 10, un tamaño de palabra de 3, una matriz blosum62 con un costo de hueco de existencia: 11 y extensión: 1 y un ajuste de matriz de puntuación de composición condicional.

En una modalidad preferida de la célula de acuerdo con la invención capaz de producir ácido 2 -hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico a través de acetoacetil -coenzima A como intermediario y 3 -hidroxibutiril-coenzima A como precursor, la célula de acuerdo con la invención en su forma de tipo silvestre tiene una activad de una enzima E4, preferiblemente una actividad inferior de al menos una enzima E4 que su tipo silvestre, cuya enzima cataliza la conversión de 3 -hidroxibutiril-coenzima A a polihidroxibutirato .

La enzima E4 es preferiblemente un polihidroxialcanoato sintasa, particularmente de preferencia polihidroxibutirato sintasa. Esta enzima preferiblemente se codifica a través de los genes phbC y phaC, con particular preferencia con particular preferencia dada a phaC .

En una modalidad preferida, adicional de la célula de acuerdo con la invención capaz de producir ácido 2-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobutírico a través de acetoacetil-coenzima A como intermediario y 3-hidroxibutiril-coenzima A como precursor, la célula de acuerdo con la invención en su forma de tipo silvestre tiene una actividad de una enzima E5, preferiblemente una actividad menor de una enzima E5, que su tipo silvestre, cuya enzima cataliza la conversión de 3-hidroxibutiril-coenzima A a crotonil-coenzima A.

La enzima E5 es preferiblemente una crotonasa (EC 4.2.1.55) o una ( 3R) -3 -hidroxibutanoil-CoA deshidratase (EC 4.2.1.17) . Esta enzima preferiblemente se codifica por los genes seleccionados del grupo que consiste de crt, crtl, crt2, fadB, paaF, con preferencia dada a crt y el gen correspondiente de clostridia y particular preferiblemente dada a Clostridium acetobutylicum crt.

En aún otra modalidad preferida de la célula de acuerdo con la invención capaz de producir ácido 2-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico a través de acetoacetil -coenzima A como intermediario y 3-hidroxibutiril -coenzima A como precursor, la célula de acuerdo con la invención tiene una actividad de una enzima E6, preferiblemente una actividad inferior de una enzima E6 que su tipo silvestre, cuya enzima cataliza la conversión de R-3-hidroxibutiril-coenzima A a S-3 -hidroxibutiril-coenzima A.

La enzima E6 es preferiblemente una 3-hidroxibutiril-CoA epimerasa (EC 5.1.2.3). Esta enzima preferiblemente se codifica por los genes seleccionados del grupo que consiste de fadB, fadBl, fadB2, fadJ, fabJ-1, faoA, yfcX, con preferencia dada a fadB, fadJ, yfcX y particular preferencia dada a fadB, fadJ.

Además, la célula de acuerdo con la invención capaz de producir ácido 2 -hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico a través de acetoacetil -coenzima A como intermediario y 3 -hidroxibutiril-coenzima A como precursor preferiblemente tiene una actividad inferior de al menos una enzima E7 que su tipo silvestre, cuya enzima acepta 3 -hidroxibutiril-coenzima A como sustrato.

Otra contribución para lograr los objetos declarados al principio se hacen a través de un procedimiento para preparar ácido 2-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobutírico, que comprende los pasos de: a) poner en contacto una célula de acuerdo con la invención con un medio nutriente que incluye una fuente de carbono bajo condiciones en donde el ácido 2-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contiene unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobutírico se producen de la fuente de carbono, y cuando es apropiado, b) purificar el ácido 2-hidroxiisobutírico del medio nutriente o polihidroxialcanoatos que contiene unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobutírico de las células.

Los ejemplos de fuentes de carbono que pueden utilizarse son carbohidratos [tales como, por ejemplo, monosacáridos (por ejemplo, glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa, xilosa) , oligosacáridos (por ejemplo, maltosa, sacarosa, lactosa) , y polisacáridos (por ejemplo, almidón, almidón hidrolizado, celulosa, celulosa hidrolizada, hemicelulosa , hemicelulosa hidrolizada)], y sus productos de reacción tales como por ejemplo, alcoholes de azúcar y ácidos polihidroxi; dióxido de carbono; ácidos mono-, di- y tricarboxílieos orgánicos opcionalmente llevando 1 o más, por ejemplo, 1, 2, 3 ó 4, grupos hidroxilo, por ejemplo, ácido acético, ácido tartárico, ácido iracónico, ácido succínico, ácido propiónico, ácido láctico, ácido 3 -hidroxipropiónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido 2 , 5-furandincarboxílico, ácido glutárico, ácido laevulínico, ácido glucónico, ácido aconítico, ácido succínico y ácido diaminopimélico, ácido cítrico; lípidos ; aceites o grasas tales como, por ejemplo, aceite de linaza, aceite de soya, aceite de palma, aceite de girasol, aceite de cacahuate y aceite de coco; ácidos grasos saturados e insaturados, preferiblemente con de 10 a 22 carbonos, por ejemplo ácido ? linoleico, ácido dihomo-? linoleico, ácido araquidónico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido linoleico, ácido eicosapentanoico y ácido docosahexanoico; hidrocarburos tales como metano; alcoholes, por ejemplo con de 1 a 22 carbonos, por ejemplo butanol, metano, etanol; dioles, preferiblemente con de 3 a 8 carbonos, por ejemplo, propandiol y butandiol; alcoholes polihídricos (también referidos como superiores) con 3 o más, por ejemplo, 3, 4, 5 ó 6, grupos OH, por ejemplo, glicerol, sorbitol, manitol, xilitol y arabinitol ; cetonas, preferiblemente con de 3 a 10 carbonos y, cuando es apropiado, 1 o más grupos hidroxilo, por ejemplo acetona y acetoina; lactonas, por ejemplo, ?-butirolactona, ciclodextrinas , biopolímeros , por ejemplo, polihidroxiacetato, poliésteres, por ejemplo, polilactida, polisacáridos , poliisoprenoides, poliamidas; compuestos aromáticos, por ejemplo, aminas aromáticas, vainilla e índigo; proteínas, por ejemplo, enzimas tales como amilasas, pectinasas, celulasas ácidas híbridas o neutrales, estearasas tales como lipasas, pancreasas, proteasas, xilanasas y oxidoreductasas tales como lacasa, catalasa y peroxidasa, glucanasas, fitasas; carotenoides , por ejemplo, licopeno E-caroteno, astaxantina, zeaxantina y cantaxantina; aminoácidos proteinogénicos y no proteinogénicos , por ejemplo, lisina, glutamato, metionina, fenilalanina, ácido aspártico, triptófano y treonina; base de purina y pirimidina; nucleósidos y nucleótidos, por ejemplo, nicotinamida-adenina dinucleótido (NAD) y 51 -monofosfato de adenosina (AMP) ; y también precursores y derivados, por ejemplo, sales de los ácidos mencionados, y de de los compuestos mencionados anteriormente.

Estas sustancias pueden utilizarse individualmente o como una mezcla.

Se da preferencia particular a utilizar carbohidratos, en particular monosacáridos , oligosacáridos o polisacáridos , como se describe en US 6,136,576 por ejemplo azúcares de C5 o glicerol.

Un alcohol preferido a ser utilizado es metanol , ya que puede prepararse de muchas diferentes tales como, por ejemplo, biogas, biomasa, gas natural o carbón.

Las fuentes de carbono pueden utilizarse en diferentes formas (pura o en solución/suspensión) y en diferentes composiciones (purificada o como producto crudo) de diferentes etapas de procesamiento (por ejemplo, jugo de caña de azúcar, jarabe, melazas, azúcar sin refinar, cristales de azúcar refinada; granos de maíz, harina, almidón, dextrina, glucosa) , antes o después del tratamiento (explosión de vapor, pre-tratamiento con ácido, pre-tratamiento con enzima) En una modalidad alternativa, preferida, la fuente de carbono comprende CO2 o CO, en particular gas de síntesis. Las células de acuerdo con la invención utilizadas en esta conexión son células acetogénicas tales como, por ejemplo, las especies del género Acetojbacterium, tal como A. woodii y Clostridium aceticum. Más específicamente, tales células acetogénicas se seleccionan del grupo que comprende Thermoanaerobacter kivui , Acetobacterium woodii, Acetoanaerobium notera, Clostridium aceticum, Butyribacterium methylotrophicum, Clostridium acetobutylicum, Moorella thermoacetica, Eubacterium limosum, Peptostreptococcus productus, Clostridium ljungdahlii y Clostridium carboxidivorans. Una célula particularmente adecuada en esta conexión es Clostridium carboxidivorans, en particular las cepas tales como "p7" y "pll" . Las células se describen en US 2007/0275447 y US 2008/0057554, por ejemplo. Otra célula que es particularmente adecuada en esta conexión es Clostridium ljungdahlii , en particular cepas seleccionadas del grupo que comprende Clostridium ljungdahlii PETC, Clostridium ljungdahlii ERI2, Clostridium ljungdahlii COI y Clostridium ljungdahlii 0-52, como se describe en WO 98/00558 y WO 00/68407.

Las células genéticamente modificadas de acuerdo con la invención pueden ponerse en contacto con el medio nutriente y de esta forma cultivarse en un procedimiento continuo o en un procedimiento por lotes (cultivo por lote) o en un procedimiento de alimentación por lotes o procedimiento de alimentación por lotes repetido con el propósito de producir 2 -hidroxiisobutirato o polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico . Un procedimiento semi-continuo, como se describe en GB-A-1009370 por ejemplo, también es concebible. Una revisión de otros métodos de cultivo conocidos se describe en el libro de texto de Chmiel {"Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik" [Bioprocessing 1. Introduction to bioprocessing] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, Alemania, 1991)) o en el libro de texto de Storhas ( "Bioreaktoren und periphere Einrichtungen" [Bioreactors and peripheral equipment] , Vieweg Verlag, Brunswick/ iesbaden, Alemania, 1994) .

El medio de cultivo a ser utilizado debe ser adecuado a los requerimientos de las cepas particulares. El medio de cultivo para ver los microorganismos se describe en el "Manual of Methods for General Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington D. C, USA, 1981) .

Las fuentes de nitrógeno que pueden utilizarse son compuestos orgánicos que contienen nitrógeno, tales como peptonas, extracto de levadura, extracto de carne, extracto de malta, licor de residuo de maíz, harina de soya, y compuestos de urea o inorgánicos tales como sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio. Las fuentes de nitrógeno pueden utilizarse individualmente o como una mezcla.

Las fuentes de fósforo que pueden utilizarse con ácido fosfórico, fosfato diácido de potasio o fosfato ácido dipotásico o las sales de sodio correspondientes. El medio de cultivo además deberá contener sales metálicas tales como, por ejemplo, sulfato de magnesio o sulfato de hierro, que son requeridas para el crecimiento. Finalmente, las sustancias de crecimiento esenciales tales como aminoácidos y vitaminas pueden utilizarse además de las sustancias mencionadas anteriormente. Además, pueden adicionarse precursores adecuados al medio de cultivo. Las sustancias para utilizarse pueden introducirse en el cultivo en una sola adición o alimentarse en una forma adecuada durante el cultivo.

El pH de los cultivos se controla mediante el uso de compuestos básicos tales como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, amonio o amonio acuoso, o compuestos ácidos tales como ácido fosfórico o ácido sulfúrico en una forma adecuada. La espumación puede controlarse mediante el uso de antiespumantes tales como ésteres de poliglicol de ácido graso, por ejemplo. La estabilidad del plásmido puede mantenerse a través de la adición a los agentes selectivos adecuados del medio tales como antibióticos, por ejemplo. Las condiciones aeróbicas se mantienen introduciendo en el cultivo oxígeno o mezclas de gas que contiene oxígeno tales como aire, por ejemplo. La temperatura del cultivo es usualmente de 20°C a 45°C, y preferiblemente de 25°C a 40°C. Se da preferencia al uso de células tales como las descritas en US 6,803,218, en particular si las células son capaces de convertir glicerol como sustrato. En este caso las células pueden cultivarse a temperaturas en el intervalo de 40 a 100°C.

La purificación del ácido 2 -hidroxiisobutírico de la solución nutriente preferiblemente se lleva a cabo continuamente, siendo además preferido en este contexto también para producir ácido 2-hidroxiisobutírico a través de fermentación en una forma continua, de tal forma que el procedimiento completo de la producción del ácido 2-hidroxiisobutírico hasta su purificación del caldo de fermentación puede llevarse a cabo continuamente. Por purificación continua de la preparación de ácido 2-hidroxiisobutírico del caldo de fermentación, lo anterior continuamente se hace pasar a través del dispositivo para eliminar los microorganismos utilizados durante la fermentación, preferiblemente a través de un filtro con un recorte en el intervalo de 20 a 200 kDa, en donde toma lugar la separación de sólido/líquido. También es más factible utilizar una centrifuga, un dispositivo de sedimentación adecuado o una combinación de estos dispositivos, siendo especialmente preferido primero separar por lo menos parte de los microorganismos a través de sedimentación y posteriormente alimentar el caldo de fermentación, que ha sido parcialmente liberado de los microorganismos, para ultrafiltración o a un dispositivo de centrifugación.

Después de que se han removido los microorganismos, el producto de fermentación que se enriquece con respecto a su contenido de ácido 2-hidroxiisobutírico, se alimenta un sistema de separación, preferiblemente a un sistema de separación de multi -etapas . Este sistema de separación proporciona una pluralidad de pasos de separación que se conectan en serie, a partir de lo cual los pasos en cada caso regresan líneas que se desplazan lejos y hacia atrás del tanque de fermentación. Además, las tuberías de salida conducen al exterior de los pasos de separación respectivos. Los pasos de separación individuales pueden operar a través de electrodiálisis , osmosis inversa, ultrafiltración o el principio de nanofiltración . Como una regla, los pasos de separación individuales comprenden dispositivos de separación de membrana. Los pasos de separación individuales se seleccionan debido a la naturaleza y el grado de fermentación de sub-productos y sustratos residuales.

Además de removerse por medio de electrodiálisis, osmosis inversa, ultrafiltración o nanofiltración, cuando el producto final obtenido es una solución de ácido 2-hidroxiisobutírico acuoso, el ácido 2-hidroxiisobutírico también puede eliminarse a través de métodos de extracción de la solución de fermentación que ha sido liberada de los microorganismos, en cuyo caso el ácido 2-hidroxiisobutírico puro puede finalmente obtenerse. El ácido 2-hidroxiisobutírico puede eliminarse a través de extracción mediante la adición a la solución de fermentación, por ejemplo, compuestos de amonio o aminas para producir una sal de amino de ácido 2-hidroxiisobutírico. Esta sal de amonio después puede eliminarse de la solución de fermentación mediante la adición de un extractante orgánico y posteriormente calentando la mezcla resultante, mientras la sal de amonio se concentra en la fase orgánica. El ácido 2-hidroxiisobutírico después puede aislarse de esta fase, por ejemplo, a través de pasos de extracción adicionales, para dar ácido 2-hidroxiisobutírico puro. Mas detalles con respecto al método de separación pueden encontrarse en O-A-02/090312, cuya descripción con respecto a la separación de ácidos hidroxicarboxílicos de las soluciones de fermentación se incorpora por referencia y forma parte de la descripción de la presente solicitud.

Dependiendo de la forma en la cual el ácido 2-hidroxiisobutírico se elimina de la solución de fermentación, ya sea una solución acuosa de ácido 2-hidroxiisobutírico que comprende de 2 a 90% en peso, preferiblemente de 7.5 a 50% en peso y particularmente de preferencia de 10 a 25% en peso, de ácido 2-hidroxiisobutírico, o cualquier ácido 2- hidroxiisobutírico puro se obtiene.

Con concentraciones en aumento de ácido 2-hidroxiisobutírico se tienden a formar su dímero cíclico (tetrametilglicolida , TMG) . Este dímero puede tratarse similarmente al ácido 2 -hidroxiisobutírico en el paso de deshidratación del procedimiento de acuerdo con la invención y por consiguiente este paso del procedimiento siempre se incluirá en el término "ácido 2 -hidroxiisobutírico" siguiente .

Además, el ácido 2 -hidroxiisobutírico preparado a través a través del procedimiento de acuerdo con la invención también puede neutralizarse antes, durante o después de la purificación, para cuyo propósito por ejemplo pueden utilizarse bases tales como hidróxidos de metal alcalino o hidróxidos de metal alcalinotérreo, por ejemplo, de hidróxido de calcio o hidróxido de sodio o cualquier NH3 o NH4OH por ej emplo .

Una contribución para lograr los objetos declarados al inicio se hacen en particular también a través de un procedimiento para preparar ácido metacrílico, o ésteres metacrílicos , que compren los pasos de: IA) preparar ácido 2 -hidroxiisobutírico a través del procedimiento descrito anteriormente y, cuando es apropiado, purificar y/o neutralizar el ácido 2-hidroxiisobutírico.

IB) deshidratar el ácido 2 -hidroxiisobutírico con la producción de ácido metacrílico y, cuando es apropiado, esterificar el metacrilato o el ácido metacrílico.

De acuerdo con el paso IB) , el ácido 2-hidroxiisobutírico se deshidrata con la formación de ácido metacrílico, para el cual la reacción es posible ya sea para utilizar el ácido 2 -hidroxiisobutírico puro aislado de la solución de fermentación u otra solución acuosa de ácido 2-hidroxiisobutírico, que ha sido aislada durante el desarrollo de la solución de fermentación y, cuando es apropiado, también se concentra, por ejemplo, por medio de destilación, cuando es apropiado en la presencia de un portador adecuado, antes del paso de deshidratación .

El paso de deshidratación puede llevarse a cabo en principio en la fase líquida o en la fase de gas. Además, se da preferencia de acuerdo con la invención a llevar a cabo el paso de deshidratación en la presencia de un catalizador, el tipo del cual depende de si la reacción se lleva a cabo en la fase de gas o en la fase líquida.

Los catalizadores de deshidratación adecuados son ambos, catalizadores ácidos y alcalinos. Los catalizadores ácidos son preferidos, en particular debido a su baja tendencia a formar oligómeros. El catalizador de deshidratación puede utilizarse tanto como un catalizador homogéneo como heterogéneo. Si el catalizador de deshidratación es un catalizador heterogéneo, se da preferencia al catalizador de deshidratación que está en contacto con un soporte x. Los soportes x apropiados son todos los sólidos considerándose adecuados por el experto en la técnica. En este contexto, se da preferencia a los sólidos que tienen volúmenes de poro adecuados que son bien adecuados para unión y la absorción del catalizador de deshidratación. Además, se da preferencia a volúmenes de poro totales, como se especifica por DIN 66133, en el intervalo de 0.01 a 3 ml/g, con particular preferencia dada a un volumen de poro total en el intervalo de 0.1 a 1.5 ml/g. Además, los sólidos adecuados como soporte x preferiblemente tienen un área de superficie en el intervalo de 0.001 a 1000 m2/g, preferiblemente en el intervalo de 0.005 a 450 m2/g y adicionalmente de preferencia en el intervalo de 0.01 a 300 m2/g, según determinado por una prueba BET de acuerdo con DIN 66131. Un primer soporte que puede utilizarse para el catalizador de deshidratación es un material en volumen con un diámetro de particular medio en el intervalo de 0.1 a 40 mm, preferiblemente en el intervalo de 1 a 10 mm, y adicionalmente de preferencia en el intervalo de 1.5 a 5 mm. La pared del reactor de deshidratación también puede servir como soporte. Además, el soporte puede ser ácido o básico per se, u otro catalizador de deshidratación ácido o básico puede aplicarse a un soporte inerte. Las técnicas de aplicación que pueden mencionarse en particular son inmersión o impregnación o incorporación en una matriz de soporte.

Los soportes x adecuados, que también pueden representar las propiedades de catálisis de deshidratación son, en particular, silicatos naturales o sintéticos tales como, en particular, mordenita, montmorilonita, zeolitas ácidas; soportes que están recubiertos con ácidos inorgánicos monobásicos, dibásicos o polibásicos, en particular ácido fosfórico o con sales ácidas de ácidos inorgánicos, tales como sustancias del tipo óxido o silicato, por ejemplo Al203, Ti02; óxidos y óxidos mixtos tales, por ejemplo, los óxidos mixtos ?-??203 y ZnO-Al203 de los heteropoliácidos .

De acuerdo con una modalidad de acuerdo con la invención, el soporte x consiste por lo menos en parte de un compuesto del tipo óxido. Tales compuestos de tipo óxido deberán representar por lo menos uno de los elementos seleccionados de entre Si, Ti, Zr, Al, P o una combinación de por lo menos dos de estos. Los soportes también pueden actuar como catalizadores de deshidratación por sí mismos, debido a sus propiedades ácidas o básicas. Una clase de compuestos preferidos que actúan tanto como soporte por medio de x y como catalizador de deshidratación comprenden óxidos de silicón/aluminio/fósforo . Las sustancias básicas preferidas que actúan tanto como catalizador de deshidratación como soporte x comprenden metales alcalinos, metales alcalinotérreos , lantano, lantanoides o una combinación de por lo menos dos de estos en la forma de sus óxidos . Los catalizadores de deshidratación ácidos o básicos están comercialmente disponibles de Evonik Degussa GmbH y de Südchemie AG. Una clase más son intercambiadores de ion que también ser básicos o ácidos.

Los catalizadores de deshidratación homogéneos adecuados son, en particular, ácidos inorgánicos, preferiblemente ácidos que contienen fósforo y adicionalmente de preferencia ácido fosfórico. Estos ácidos inorgánicos pueden inmovilizarse en el soporte x a través de inmersión o impregnación .

El uso de catalizadores heterogéneos ha probado particularmente ser ventajoso en particular en el caso de la deshidratación de la fase gaseosa. En el caso de la deshidratación de fase líquida, sin embargo, ambos catalizadores de deshidratación homogéneos y heterogéneos se utilizan .

Además, se da preferencia al procedimiento de acuerdo con la invención que involucra el uso de un catalizador de deshidratación con un valor HO en el intervalo de +1 a -10, preferiblemente en el intervalo de +2 a -8.2 y adicionalmente de preferencia, con la deshidratación de la fase líquida, en el intervalo de +2 a -3 y la deshidratación de la fase gaseosa en el intervalo de -3 a -8.2. El valor HO corresponde a la función ácida como se define por Hámmert y puede determinarse a través de lo que se conoce como titulación de amina y el uso de indicadores, o a través de absorción de una base gaseosa (ver, "Studies in Surface Science and Catalytics", vol . 51, 1989: "New solid Acids and Bases, their catalytic Properties" , K. Tannabe et al).

De acuerdo con una modalidad particular del procedimiento de acuerdo con la invención, el catalizador sólido ácido utilizado es una estructura de soporte porosa que ha sido puesta en contacto con un ácido inorgánico, preferiblemente con ácido fosfórico o con súper ácidos tales como, por ejemplo, óxido de zirconio sulfatado o fosfatado y que está basado preferiblemente a un grado de al menos 90% en peso, adicionalmente de preferencia por lo menos 95% en peso y más preferiblemente al menos 99% en peso en un óxido de silicio, preferiblemente, Si02. La estructura de soporte porosa se pone en contacto con el ácido inorgánico preferiblemente a través de la impregnación de la estructura de soporte con el ácido, con la cantidad anterior siendo preferiblemente en el intervalo de 10 a 70% en peso, particularmente de preferencia en el intervalo de 20 a 60% en peso y adicionalmente de preferencia en el intervalo de 30 a 50% en peso, con base en el peso de la estructura de soporte seguido por el secado del ácido. Después del secado, el ácido inorgánico se fija calentando la estructura de soporte, preferiblemente a una temperatura en el intervalo de 300 a 500°C, adicionalmente de preferencia en el intervalo de 400 a 500°C.

De acuerdo con una modalidad particular del procedimiento de acuerdo con la invención, el paso de deshidratación se lleva a cabo en la fase gaseosa. Es posible aquí utilizar aparatos convencionales conocidos por el experto en la técnica en el campo de la reacción de la fase gaseosa, por ejemplo, rectores tubulares. Se da particular preferencia al uso de intercambiadores de calor de coraza y tubo y de reactores que comprenden termoplacas como intercambiadores de calor.

De acuerdo con una modalidad de la reacción de deshidratación de la fase gaseosa, se introduce ácido 2-hidroxiisobutírico puro en un reactor que comprende uno de los catalizadores de lecho fijo antes mencionado. De acuerdo con otra modalidad, se introduce ácido 2 -hidroxiisobutírico en el reactor en la forma de una solución acuosa que comprende de 2 a 80% en peso, particularmente de preferencia de 5 a 50% en peso y adicionalmente de preferencia de 10 a 25% en peso de ácido 2 -hidroxiisobutírico, en cada caso con base en el peso total de la solución acuosa. Las condiciones de presión y temperatura dentro del reactor se seleccionan de tal forma que el ácido 2 -hidroxiisobutírico o la solución acuosa, está en la forma gaseosa cuando entran al reactor. La deshidratación en la fase gaseosa preferiblemente se lleva a cabo a temperaturas en el intervalo de entre 200 y 400°C, particularmente de preferencia entre 250 y 350°C. La presión dentro del reactor para la deshidratación de la fase gaseosa está preferiblemente en el intervalo de 0.1 a 50 bar, particularmente preferible en el intervalo de 0.2 a 10 bar y más preferiblemente en el intervalo de 0.5 a 5 bar.

Para la deshidratación de la fase gaseosa, la cantidad de ácido 2-hidroxiisobutírico introducido en el reactor está preferiblemente en un intervalo de 10 a 100% en volumen, particularmente de preferencia en el intervalo de 20 a 100% en volumen y más preferiblemente en el intervalo de 30 a 100% en volumen.

De acuerdo con otra modalidad particular del procedimiento de acuerdo con la invención, el paso de deshidratación se lleva a cabo en la fase líquida. La deshidratación de la fase líquida también puede llevarse a cabo en cualquier aparato conocido por el experto en la técnica, que permite que un fluido se caliente a una temperatura de reacción deseada, siendo posible para el aparato presurizarse lo suficiente para así mantener los componentes de reacción en el estado líquido bajo las condiciones de temperatura deseadas.

De acuerdo con una modalidad en particular del procedimiento de acuerdo con la invención, el procedimiento de deshidratación de la fase líquida comprende un primer paso, en donde el ácido 2-hidroxiisobutírico puro o una solución acuosa que comprende de 5 a 100% en peso, especialmente de preferencia de 20 a 100% y más de preferencia de 50 a 100% en peso, de ácido 2-hidroxiisobutírico, con base en el peso total de la solución acuosa, se introduce en un reactor. Las condiciones de presión y temperatura dentro del reactor se seleccionan de tal forma que el ácido 2-hidroxiisobutírico, o la solución acuosa, están en forma líquida cuando entra en el reactor.

De acuerdo con una modalidad particular del procedimiento de acuerdo con la invención en donde se lleva a cabo un paso de deshidratación en la fase líquida, el ácido 2-hidroxiisobutírico, o la solución acuosa, se hacen pasar sobre un lecho catalizador fijo dentro del reactor de deshidratación en tal forma que la fase líquida chorrea sobre la superficie de las partículas del catalizador. Tal procedimiento puede llevarse a cabo por ejemplo, en un reactor de lecho de destilación.

La deshidratación en la fase líquida se lleva a cabo a temperaturas preferiblemente en los intervalos de entre 200 y 350°C, particularmente de preferencia entre 200 y 300°C. La presión dentro del reactor para la deshidratación de la fase líquida está preferiblemente en un intervalo de 1 a 50 bar, particularmente de preferencia en un intervalo de 2 a 25 bar y más de preferencia en un intervalo de 3 a 10 bar.

La catálisis de ambas la deshidratación de fase gaseosa y la deshidratación de la fase líquida pueden llevarse a cabo homogénea o heterogéneamente.

En el caso de canalización homogénea, el catalizador que en la presente preferiblemente toma la forma de un ácido orgánico tal como, por ejemplo, ácido fosfórico o ácido sulfúrico primero se pone en contacto con ácido 2-hidroxiisobutírico puro o con la solución acuosa que comprende ácido 2 -hidroxiisobutírico . A continuación, la composición resultante se introduce en el reactor y se convierte en ácido metacrílico bajo las condiciones de presión y temperatura deseadas. También es factible introducir el ácido inorgánico en el reactor independientemente del ácido 2 -hidroxiisobutírico o la solución acuosa. En este caso, el reactor exhibe al menos dos líneas de alimentación, una para el ácido 2-hidroxiisobutírico o la solución acuosa que comprende ácido 2-hidroxiisobutírico, y una para el catalizador. Si la reacción de deshidratación se lleva a cabo en la fase líquida en un reactor de lecho de destilación, se da preferencia a la introducción del catalizador junto con el ácido 2-hidroxiisobutírico, o la solución acuosa que comprende ácido 2-hidroxiisobutírico, en la parte superior del reactor.

En el caso de catálisis heterogénea, el catalizador está en la forma de un sustrato sólido localizado en el espacio de la reacción, por ejemplo en la forma de un lecho fijo, en la forma de placas recubiertas con el catalizador, preferiblemente termoplacas, que se arreglan dentro del reactor, u otro en la forma de paredes del reactor recubiertas con catalizador. Los reactores posibles se describen en DE-A-198 48 208, DE-A-100 19 381 y EP-A-I 234 612, por ejemplo. En el caso de catálisis heterogénea, los catalizadores preferidos son estructuras de soporte puestas en contacto con ácidos inorgánicos, preferiblemente estructuras de soporte porosas impregnadas. El ácido 2-hidroxiisobutírico, o la solución acuosa que comprende ácido 2-hidroxiisobutírico, después se pone en contacto con la superficie del material catalizador sólido, ya sea en la forma de un vapor o en la forma de un líquido.

De acuerdo con una modalidad particularmente preferida del procedimiento de acuerdo con la invención, la deshidratación del ácido 2-hidroxiisobutírico se lleva a cabo en fase líquida a una presión en el intervalo de200 a 500 mbar, a una temperatura en el intervalo de 160 a 300°C, preferiblemente de 200 a 240°C y en la presencia de iones de metal alcalino como el catalizador.

Bajo las presentes condiciones de reacción, el ácido metacrílico producido puede destilarse en la forma gaseosa junto con agua y después condensarse en la forma de una solución acuosa para posiblemente dar una solución de ácido metacrílico acuosa que no contiene ningún componente catalizador .

De acuerdo con una modalidad particular del procedimiento de la invención, la solución de ácido metacrílico obtenida en esta forma puede esterificarse sin además desarrollarse, cuando es apropiado. Esto involucra poner la solución de ácido metacrílico en contacto con alcoholes apropiados y catalizadores de esterificación adecuados conocidos por el experto en la técnica, tales como ácidos concentrados, con calentamiento, por lo tanto convirtiendo el ácido metacrílico en los ésteres correspondientes .

Los alcoholes preferidos son, inter alia, alcoholes que en cada caso tiene por lo menos un átomo de carbono, preferiblemente de 2 a 12, y particularmente de preferencia de 4 a 9 átomos de carbono. La estructura de los alcoholes puede ser lineal, ramificada o cíclica. Los alcoholes además pueden comprender grupos aromáticos o sustituyentes , por ejemplo átomos de halógeno. Los alcoholes preferidos son en particular metanol , etanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, 1-metilpropanol , 2 -metilpropanol , ter-butanol, n-pentanol, 1-metilbutanol , 2 -metilbutanol , 3 -metilbutanol , 2 , 2 -dimetilpropanol , n-hexanol, 1-metilpentanol , 2-metilpentanol , 3 -metilpentanol , 4 -metilpentanol , 1,1- dimetilbutanol , 2 ( 2 -dimetilbutanol , 3 , 3 -dimetilbutanol , 1,2-dimetilbutanol , n-heptanol, 1-metilhexanol , 2-metilhexanol , 3 -metilhexanol , 4 -metilhexanol , 1 , 2 -dimetilpentanol , 1,3 dimetilpentanol , 1 , 1-dimetilpentanol , 1,1,2,2 tetrametilpropanol , alcohol bencílico, n-octanol, 2 etilhexanol, n-nonanol, 1-metiloctanol , 2 -metiloctanol , n decanol, n-undecanol, 1-metildecanol , 2-metildecanol , n dodecanol, 2,4-dietiloctanol, ciclopentanol, ciclohexanol , 4 ter-butilciclohexanol , cicloheptanol , ciclododecanol , 2 (dimetilamino) etanol , 3 - (dimetilamino) propanol , 4 (dimetilamino) butanol , 5- (dimetilamino) pentanol , 6 (dimetilamino) hexanol , 8 - (dimetilamino) octanol , 10 (dimetilamino) decanol , 12- (dimetilamino) dodecanol, 2 (dietilamino) etanol , 3- (dietilamino) propanol , 4 (dietilamino) butanol , 5 - (dietilamino) pentanol , 6 (dietilamino) hexanol , 8- (dietilamino) octanol , 10 (dietilamino) decanol, 12- (dietilamino) dodecanol , 2 (diisopropilamino) etanol , 3 - (diisopropilamino) propanol , 4 (diisopropilamino) butanol , 5- (diisopropilamino) pentanol , 6 (diisopropilamino) hexanol , 8- (diisopropilamino) octanol , 10 (diisopropilamino) decanol , 12 - (diisopropilamino) dodecanol , 2 (dibutilamino) etanol , 3 - (dibutilamino) propanol , 4 (dibutilamino) butanol , 5 - (dibutilamino) pentanol , 6 (dibutilamino) hexanol , 8- (dibutilamino) octanol , 10 (dibutilamino) decanol , 12 - (dibutilamino) dodecanol , 2 (dihexilamino) etanol , 3- (dihexilamino) ropanol , 4- (dihexilamino) butanol , 5- (dihexilamino) pentanol , 6- (dihexilamino) hexanol , 8 - (dihexilamino) octanol , 10- (dihexilamino) decanol , 12- (dihexilamino) dodecanol, 2-(metiletilamino) etil , 2- (metilpropilamino) etanol , 2- (metilisopropilamino) etano 1, 2 - (metilbutilamino) etanol , 2- (metilhexilamino) etanol, 2 - (metiloctilamino) etanol , 2- (etilpropilamino) etanol , 2- (etilisopropilamino) etanol , 2- (etilbutilamino) etanol , 2- (etilhexilamino) etanol , 2-(etiloctilamino) etanol , 3- (metiletilamino) propanol , 3- (metilpropilamino) propanol , 3- (metilisopropilamino) propanol , 3 - (metilbutilamino) ropanol , 3 - (metilhexilamino) propanol , 3- (metiloctilamino) propanol , 3 - (etilpropilamino) propanol , 3- (etilisopropilamino) propanol , 3 - (etilbutilamino) propanol , 3- (etilhexilamino) propanol , 3 - (etiloctilamino) ropanol , 4- (metiletilamino) butanol , 4 - (metilpropilamino) butanol , 4- (metilisopropilamino) butanol , 4- (metilbutilamino) butanol , 4- (metilhexilamino) butanol , 4 - (metiloctilamino) butanol , 4- (etilpropilamino) butanol , 4 - (etilisopropilamino) butanol , 4- (etilbutilamino) butanol , 4- (etilhexilamino) butanol , (etiloctilamino) butanol , 2- (N- piperidinil) etanol , 3 piperidinil ) propanol , 4- (N-piperidinil ) butanol , 5 piperidinil ) pentanol , 6- (N-piperidinil ) hexanol , 8 piperidinil ) octanol , 10- (N-piperidinil) decanol , 12 piperidinil ) dodecanol , 2- (N-pirrolidinil) etanol , 3 pirrolidinil ) ropanol , 4 - (N-pirrolidinil) butanol , 5- (N-pirrolidinil) pentil- ( 6 - (N-pirrolidinil ) hexanol , 8- (N-pirrolidinil) octanol , 10- (N-pirrolidinil) decanol , 12- (N-pirrolidinil) dodecanol , 2- (N-morfolino) etanol , 3-(N-morfolino) propanol , 4 - (N-morfolino) butanol , 5-(N-morfolino) entanol , 6 - (N-morfolino) hexanol , 8- (N-morfolino) octanol , 10- (N-morfolino) decanol , 12- (N-morfolino) dodecanol , 2- (?' -metil-N-piperazinil) etanol, 3-(N'-metil-N-piperazinil) propanol, 4 - ( ' -metil-N-piperazinil ) butanol , 5- (N ' -metil-N-piperazinil) pentanol , 6- (?' -metil -N-piperazinil) hexanol , 8- ( ' -metil-N-piperazinil ) octanol , 10- (N 1 -metil-N-piperazinil) decanol , 12- (?' -metil-N-piperazinil) dodecanol, 2- (N1 -etil-N-piperazinil) etanol , 3 - (N 1 -etil -N-piperazinil ) propanol , 4-(N'-etil-N-piperazinil) butanol, 5 - (N 1 -etil-N-piperazinil ) pentanol , 6- (N1 -etil-N-piperazinil ) hexanol , 8- (?' -etil-N-piperazinil) octanol , 10- (?' -etil-N-piperazinil) decanol , 12- (?' -etil-N-piperazinil) dodecanol , 2 - (N 1 -isopropil-N-piperazinil ) etanol , 3 - ( ' - isopropil-N-piperazinil) propanol , 4- (?' -isopropil-N-piperazinil)butanol, 5- (?' -isopropil-N-piperazinil) pentanol, 6- ( 1 -isopropil-N-piperazinil) hexanol , 8- (N 1 -isopropil-N-piperazinil) octanol , 10- (N1 -isopropil-N-piperazinil) decanol, 12- (?' - isopropil-N-piperazinil ) dodecanol , 3 -oxabutanol , 3 -oxapentanol , 2,2-dimetil -4 -oxapentanol , 3 , 6-dioxaheptanol , 3 , 6-dioxaoctanol , 3 , 6 , 9- trioxadecanol , 3 , 6 , 9-trioxaundecanol , 4 -oxapentanol , 4-oxahexanol, 4 -oxaheptanol , 4 , 8-dioxanonanol , 4,8-dioxadecanol , 4 , 8-dioxaundecanol , 5-oxahexanol y 5,10-dioxaundecanol .

Además es posible utilizar como solventes alcoholes etoxilados y/o propoxilados y también alcoholes mixtos etoxilados/propoxilados , en particular Ra- (0-CH2-CH2) x-OH o Ra-(0-CH(CH3) -CH2)x-0H, o Ra- (0-CH2-CH (CH3) ) x-OH, en donde Ra es alquilo de Ci-C2o y x es un número entero entre 10 y 20, o aminoalcoholes etoxilados y/o propoxilados, por ejemplo, Rb2N(-CH2-CH2-0)y-H o Rb2N ( -CH (CH3) -CH2-0) y-H o Rb2N ( -CH2CH (CH3) -0)y-H, en donde y es un número entero entre 1 a 4. Rb es un grupo alquilo que tiene 1-6 átomos de carbono, con el nitrógeno siendo capaz de formar junto con los sustituyentes Rb un anillo de 5 a 6 miembros. Cuando es apropiado, el anillo además puede sustituirse por uno o más grupos alquilo de cadena corta, por ejemplo metilo, etilo o propilo.

Sin embargo, puede ser ventajoso adicionalmente purificar el ácido metacrilico antes de la esterificación, siendo posible utilizar, en principio, cualquier método de purificación conocido por el experto en la técnica que normalmente se aplica para purificar ácido (met ) acrílico contaminado obtenido a través de la oxidación de la fase gaseosa catalítica de propileno.

Si la reacción de deshidratación se lleva a cabo en la fase gaseosa, será preferencia primero a condensar el ácido metacrílico para dar una solución de ácido metacrílico acuosa. Aquí, cualquier proceso de condensación conocido por el experto en la técnica puede utilizarse en principio, por ejemplo, condensación en fracciones como se describe en WO-A-2004/035514, WO-A-03/014172 o EP-A-EP 1 163 201 o a través de condensación total como se describe en EP-A-0 695 736. También es factible adicionar solventes adicionales, en particular agua, durante el procedimiento de condensación con el fin de absorber el ácido metacrílico completamente como sea posible.

La solución de ácido metacrílico acuosa obtenida después de la condensación, o la otra solución de ácido metacrílico acuosa obtenida con la deshidratación de la fase líquida, después puede liberarse del agua y otros contaminantes en pasos de purificación adicionales. Aquí, es posible primero eliminar el agua a través de destilación azeótropa en la presencia de un portador como se describe, por ejemplo, en DE-A-198 53 064. También es factible utilizar solventes orgánicos de alta ebullición para absorber el ácido metacrílico, como se describe por ejemplo en EP-A-0 974 574. Además de estos métodos de destilación, también es posible utilizar membranas para deshidratación, como se propone por ejemplo en DE-A-44 01 405. Además es factible utilizar métodos de cristalización para purificar la solución de ácido metacrílico acuosa recupera en el caso de la deshidratación de la fase líquida u obtenida a través de condensación.

El ácido metacrílico obtenido después de la deshidratación puede purificarse aún adicionalmente en pasos de procedimiento adicionales. De esta forma es posible remover los contaminantes de alta ebullición que aún están presentes a través de pasos de destilación adicionales. Sin embargo, se da particular referencia a una purificación adicional del ácido metacrílico obtenido después de la deshidratación a través del uso de métodos de cristalización, como se describe por ejemplo en DE-A-101 49 353.

El ácido metacrílico purificado obtenido en esta forma después puede esterificarse, cuando es apropiado.

Una contribución para lograr los objetos declarados en el inicio además se hace a través un procedimiento para preparar ácido metacrílico o ésteres metacrílieos , que comprenden los pasos de: IIA) preparar polihidroxialcanoatos que contiene unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico a través del procedimiento descrito anteriormente, IIB) dividir los polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico con la producción de ácido 2-hidroxiisobutírico y, cuando es apropiado neutralizar el ácido 2-hidroxiisobutírico y/o purificar el ácido 2-hidroxiisobutírico, IIC) deshidratar el ácido 2 -hidroxiisobutírico con la producción de ácido metacrílico y, cuando es apropiado esterificar el metacrilato el ácido metacrílico.

Una contribución para lograr los objetos declarados en el inicio también se hacen a través de un procedimiento para preparar ácido poli (metacrílico) o ésteres poli (metacrílico) , que comprende los pasos de: IIIA) preparar ácido metacrílico a través del procedimiento descrito anteriormente, IIIB) polimerización de radical libre del ácido metacrílico, en donde, cuando es apropiado, los grupos carboxilo del ácido metacrílico pueden esterificarse al menos parcialmente antes de o después de la polimerización del radical libre.

La presente invención se describe a manera de ejemplo en los ejemplos siguientes y no pretende limitarse a las modalidades mencionadas en tales ejemplos que están en intervalo de aplicaciones que surgen de la completa descripción y las reivindicaciones. Las siguientes figuras son parte de los ejemplos: Figura 1: plásmido híbrido pET10l/D-TOPO : : icmA-icmB ; Figura 2: plásmido híbrido pBBRlMCS-2 : : icmA-icmB Figuras 3A a 3B: ácido 2 -hidroxiisobutírico en la muestra IM-86 se cuantificó después de neutralizar la muestra con ácido 2-hidroxiisobutírico. El pico del metil lactato (Tr. 7.16 min) se utilizó como estándar interno. La figura describe las secciones del cromatografo GC-MS de las muestras neutralizada y original; Figuras 4A a 4B : adición de ácido 2-hidroxiisobutírico en la muestra IM-89. La figura describe secciones del espectro NMR de la muestra original (A) y de la muestra neutralizada (B) .

Ej emplos 1. Aislamiento de ADN genómico y amplificación de los fragmentos icmA e icmB El ADN genómico se aisló de la cepa Aquincola tertiaricarbonis (A. tertiaricarjonis DSMZ 18512) utilizando el kit de Sangre y Tejido DNeasy (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) de acuerdo con la información del fabricante y se utilizó como plantilla en una PCR para la amplificación de los fragmentos icmA (1.7 kbp; DQ436456) e icmB (0.4 kbp; DQ436457) que codifican para una enzima E3. Los oligonucleótidos Aqt-icmA_fw 5 ' -CACCATGACCTGGCTTGAGCCGCAG-3 ' (iniciador progresivo; el codón de inicio está subrayado) y Aqt - icmA-Hind_rev 5 ' -AAAAAAGCTTCCTGCTCAGAAGACCGGCGTCTCGCG-3 ' (iniciador inverso; el codón de detención y sitio de división HindIII están subrayados) se utilizaron para la amplificación de icmA, y los oligonucleótidos Aqt-icmB-Hind_fw 5'- AAAAAAGCTTCCCACCATGGACCAAATCCCGATCCGC-3 ' ( iniciador progresivo; el codón de inicio y el sitio de división están subrayados) y Aqt-icmB_rev 5 ' -TCAGCGGGCGCCGCGCGCGGCGAC-3 ' (iniciador inverso; codón de detención subrayado) se utilizaron para la amplificación de icmB.

La reacción en cadena de polimerasa (PCR, de acuerdo con SAIKI et al., 1985, Enzymatic amplification of ß-globin genomic sequences y restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 230:1350-1354.) mixture included the Pfu polymerase (Promega, Madison, USA). La PCR se llevó a cabo por medio de 35 ciclos, en cada caso de 60 segundos a 95°C, 30 segundos a 65°C y 4 minutos a 72°C en un ciclador térmico (Primus 96 advanced; PEQLAB Biotechnologie GMBH, Erlangen, Alemania) .

Los fragmentos se purificaron utilizando el Kit de Purificación de PCR QIAquick (Qiagen GmbH, Hilden) de acuerdo con la información del fabricante y después se restringieron por HindIII. Ambas mezclas se ligaron a través del sitio de división HindIII.

El producto de la ligación ic A-icmB (2.1 kbp) se utilizó como plantilla para una Pfu-PCR utilizando los oligonucleótidos Aqt-icmA_fw 5 ' -CACCATGACCTGGCTTGAGCCGCAG-3 ' (iniciador progresivo; el codón de inicio está subrayado) y Aqt-icmB_rev 5 ' -TCAGCGGGCGCCGCGCGCGGCGAC-3 ' (iniciador inverso; codón de detención subrayado) (35 ciclos de, en cada caso 60 segundos a 95 °C, 30 segundos a 65°C y 4.5 minutos a 72 °C) . El producto de la PCR resultante del tamaño correspondiente se purificó utilizando el Kit de Purificación de PCR QIAquick (Qiagen GmbH, Hilden) de acuerdo con la información del fabricante. 2. Preparación de un vector de expresión de Ralstonia eutropha El fragmento de la PCR purificado ic A-icmB (2.1 kbp) se ligó en el vector pET10l/D-TOPO (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Alemania) de acuerdo con la información del fabricante. El plásmido híbrido resultante pET101/D-TOPO :: icmA-icmB (figura 1, Sec . ID No. 1) se transfirió en células DH5a E. coli competente (New England Biolabs, Frankfurt, Alemania) y se verificó por restricción y secuenciación .

Para obtener la expresión en cepas R. eutropha, los tipos silvestres los cuales tienen actividades de enzima Ei, E2 y E4, el constructo tuvo que clonarse en un vector hospedero de amplio intervalo. El vector utilizado es pBBRlMCS-2, descrito en KOVACH et al. (1995) . Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRIMCS carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene, 166 : 175-176.

Para este propósito, los plásmidos pET10l/D-TOPO : : icmA-icmB y pBBRlMCS-2 se restringieron mediante las enzimas Xbal y SacI y el fragmento icmA-icmB se ligó en el vector objetivo pBBRlMCS-2 r, y las células DH5OÍ E. coli competentes (New England Biolabs, Frankfurt) se transformaron con el plásmido híbrido resultante/ pBBRlMCS-2 :: icmA-icmB (figura 2, Sec . ID No. 2) .

El plásmido se verificó por restricción y secuenciación y se transfirió en células S17-1 E. coli competentes, una cepa que hace posible la transferencia conjugada de plásmidos en, ínter alia, las cepas Ralstonia eutrop a. Con este propósito, se llevó a cabo la conjugación de comparación de manchas (como se describe en FRIEDRICH et al., 1981, Naturally occurring genetic transfer of hydrogen-oxidizing ability between strains of Alcaligenes eutrophus. J Bacteriol 147:198-205) , con células S17-1 pBBRlMCS-2 : : icmA-icmB de E. coli como donadoras y R. eutropha H16 (re-clasificada como Cupriavidus necator, DSMZ 428) y R. eutropha PHB-4 (re-clasificada como Cupriavidus necator, DSMZ 541) como receptor.

Se obtuvieron los trans-conjugados los cuales hospedaron el plásmido pBBRlMCS-2 : : icmA-icmB. 3. Producción de ácido 2-hidroxiisobutírico en células R. eutropha recombinantes La producción de ácido 2 -hidroxiisobutírico se estudio mediante el cultivo de las cepas R. eutropha que hospedan el plásmido descritas en el ejemplo 2 en 50 mi de medio Vollbrecht-MSM ((NH4)2HP04, 2.0 g; KH2P04, 2.1g; MgS04«7 H20, 0.2 g; FeCl3»6 H20, 6 mg; CaCl2»2 H20, 10 mg; solución de elemento de rastreo (Pfennig y Lippert, 1966), 0.1 mi) . Adicionalmente , el medio se complementó con gluconato sódico (15 g/1) , kanamicina (50 ug/ml) y coenzima B12 (60 ]ig/ml) . Las células se incubaron en un agitador termo regulado a 30 °C y 160 rpm. Después de 30 horas, se alimentó más gluconato sódico (1.5%, w/v) y coenzima B12 [60 ug/ml] . El cultivo se cosechó por centrifugación a 5000 rpm (4°C) después de 52 h. El sobrenadante del cultivo se almacenó a -20°C hasta el análisis .

La detección y la cuantificación del ácido 2-hidroxiisobutírico se llevaron a cabo por medio de espectrometría 1H-NMR cuantitativa. Las muestras se concentraron cuantitativamente. El espectro 1H-NMR del residuo se registró y el contenido se calculó con base en TSP (ácido trisililpropiónico) como estándar interno. El espectro del ácido 2-hidroxiisobutírico describe un singlete a aproximadamente 1.36 ppm, y se agregó ácido 2-hidroxiisobutírico puro al residuo para validación (figura 3A a 3B) .

Las concentraciones del 2 -Hidroxiisobutírico de hasta 0.72 mmol/kg se detectaron en las muestras analizadas. En contraste, no se detectó nada de ácido 2-hidroxiisobutírico en las mezclas de control correspondientes que contiene plásmido vacío. Las mediciones NMR se confirmaron cuantitativa y cualitativamente por medio de GC-MS y la adición del ácido 2-hidroxiisobutírico puro (figura 4A a 4B) . En este caso, se llevó a cabo la separación cromatográfica en una columna capilar Rtx-1701 de 30 m (Fisher Scientific, Pittsburgh, USA). Después de la liofilización, las muestras se volvieron a suspender utilizando el reactivo de derivatización "Methelute" (Pierce, Rockford, USA). Se aplicaron 0.5 µ? de esta solución directamente a través de un inyector de división/sin división. Los picos del ácido 2-hidroxiisobutírico se identificaron mediante la comparación del espectro de masa con el espectro de la base de datos. El contenido de ácido 2-hidroxiisobutírico se estimó neutralizando las muestras con una cantidad definida de la sustancia comparativa, ácido 2-hidroxiisobutírico . Se detectaron concentraciones de hasta 44 ug/ml en las muestras analizadas. No se detectó ácido 2-hidroxiisobutírico en las muestras de control conteniendo plásmido vacío. Similarmente, fue posible detectar ácido 2-hidroxiisobutírico sintetizado partiendo de fructosa como la fuente de carbono (1.5%, p/v) . 4. Deshidratación de ácido 2-hidroxiisobutírico para dar metacrilato A 5 mi de una solución de ácido 2-hidroxiisobutírico (0.2 g/1) producido de acuerdo con el ejemplo 3, se agregó NaOH (0.06 mg) con agitación. La solución se incubó con agitación y se enfrió con reflujo a 185-195°C bajo presión reducida (300 torr) . Se agregaron 0.5 mg más de ácido 2-hidroxiisobutírico en 5 mi cada hora durante un período de 5 horas, la solución conteniendo 0.4 por ciento en peso de p-metoxifenol para evitar la polimerización del metacrilato. La reacción se detuvo después de 24 horas de incubación. Más del 90% del ácido 2-hidroxiisobutírico se convirtió en metacrilato. El ácido metacrílico se eliminó por destilación de la mezcla de reacción .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (13)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1.- Una célula que ha sido genéticamente modificada para así ser capaz de producir más ácido 2-hidroxiisobutírico o más polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico que su tipo silvestre, caracterizada porque el ácido 2-hidroxiisobutírico o los polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2-hidroxiisobutírico se producen a través de acetoacetil-coenzima A como intermediario y 3 -hidroxibutiril -coenzima A como precursor.

2. - La célula de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque tiene por lo menos una actividad de una enzima E3, que cataliza la conversión de 3-hidroxibutiril-coenzima A a 2-hidroxiisobutiril-coenzima A.

3. - La célula de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque tiene una actividad enzimática superior de E3 que su tipo silvestre.

. - La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque su forma de tipo silvestre tiene una actividad de una enzima E4 que cataliza la conversión de 3-hidroxibutiril-coenzima A en polihidroxibutirato .

5.- La célula de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque tiene una actividad inferior de enzima E4 que su tipo silvestre.

6. - La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque su forma de tipo Silvestre tiene una actividad de enzima E5 que cataliza la conversión de 3 -hidroxibutiril-coenzima A a crotonil coenzima A.

7. - La célula de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque tiene una actividad enzimática inferior de E5 que su tipo silvestre.

8. - La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque su forma de tipo silvestre tiene una actividad de una enzima E6 que cataliza la conversión de -3-hidroxibutiril-coenzima A a S-3-hidroxibutiril-coenzima A.

9. - La célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque tiene por lo menos una actividad inferior que su tipo silvestre de por lo menos una enzima E7 que acepta 3 -hidroxibutiril-coenzima A como sustrato.

10.- El procedimiento para preparar ácido 2-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contiene unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico caracterizado porque comprende los pasos: a) poner en contacto una célula de conformidad con por lo menos cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 con un medio nutriente que incluye una fuente de carbono bajo condiciones en donde el ácido 2 -hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos que contiene unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico se producen de la fuente de carbono, y cuando es apropiado, b) purificar el ácido 2 -hidroxiisobutírico del medio nutriente o polihidroxialcanoatos que contiene unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico de las células.

11. - El procedimiento para prepara ácido metacrílico o ásteres metacrílieos , caracterizado porque comprende los pasos de : IA) preparar ácido 2 -hidroxiisobutírico a través del procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, y cuando es apropiado, purificar y/o neutralizar el ácido 2-hidroxiisobutírico . IB) deshidratar el ácido 2-hidroxiisobutírico con la producción de ácido metacrílico y, cuando es apropiado, esterificar el metacrilato o el ácido metacrílico.

12. - El procedimiento para preparar ácido metacrílico o ésteres metacrílieos , caracterizado porque comprende los pasos de : IIA) preparar polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico a través del procedimiento de conformidad con la reivindicación 10, IIB) dividir los polihidroxialcanoatos que contienen unidades de monómero de ácido 2 -hidroxiisobutírico con la producción de ácido 2 -hidroxiisobutírico y, cuando es apropiado, neutralizar el ácido 2 -hidroxiisobutírico y/o purificar el ácido 2-hidroxiisobutírico, IIC) deshidratar el ácido 2-hidroxiisobutírico con la producción de ácido metacrílico y, cuando es apropiado esterificar el metacrilato el ácido metacrílico.

13. - Procedimiento para preparar ácido poli (metacrílico) o ásteres poli (metacrílicos) , caracterizado porque comprende los pasos : IIIA) preparar ácido metacrílico a través del procedimiento de conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13, IIIB) polimerización de radical libre del ácido metacrílico, en donde, cuando es apropiado, los grupos carboxilo del ácido metacrílico pueden esterificarse al menos parcialmente antes de o después de la polimerización del radical libre.