ME00616B - Antitijela visokog afiniteta prema humanom il-4 receptoru - Google Patents

Abstract

Izolovano humano antitijelo ili njegov fragment antitijela koje se vezuju za humaniinterleukin-4 receptor alfa (hIL-4Rα) sa konstantom afiniteta (KO) od manje od 200 pM, mjereno površinskom plazmon rezonancom.

Description

Interleukin-4 (IL-4, isto tako poznat kao stimulišući faktor B ćelija ili BSF-1) je prvobitno označen svojom sposobnošću da stimuiiše rast B ćelija kao odgovor na niske koncentracije antitela koja su usmerena na površinu imunoglobulina. Pokazalo se da IL-4 poseduje širok spektar bioloških aktivnosti, uključujući stimulaciju rasta T ćelija, mast ćelija, granulocita, megakariocita i eritrocita. IL-4 indukuje ekspresiju klase II molekula glavnog histokompatibilnog kompleksa u mirnim B ćelijama i, uvećava sekreciju IgE i IgGl izotipova iz stimulisanih B ćelija.

Biološke aktivnosti IL-4 su posredovane specifičnim receptorima za IL-4 na površini ćelije. Humani IL-4 receptor alfa (hlL-4R) (SEQ ID NO: 1) je opisan u, na primer, U. S. patentima br. 5, 599, 905, 5, 767, 065 i, 5, 840, 869. Antitela protiv hIL-4R su opisana u U. S. patentu br. 5, 717, 072.

Biološke aktivnosti IL-4 su posredovane specifičnim receptorima za IL-4. Humani IL-4 receptor alfa (hIL-4R) (SEQ ID NO: l) je opisan u, na primer, U. S. patentima br. 5, 599, 905, 5, 767, 065 i, 5, 840, 869. Antitela protiv hIL-4R su opisana u U. S. patentu br. 5, 717, 072 i 7, 186, 809.

Postupci za proizvodnju antitela koja se koriste kao humani terapeutici obuhvataju stvaranje himeričkih antitela i humanizovanih antitela (vidi, na primer, US 6, 949, 245). Vidi, na primer, WO 94/02602 (Abgenix) i US 6, 596, 541 (Regeneron Pharmaceuticals) (oba ovde specifično uvrštena kao reference) koji opisuju postupke stvaranja nehumanih transgenskih miševa, koji mogu proizvoditi humana antitela.

Postupci za upotrebu antitela protiv hIL-4R su opisana u U. S. patentima br. 5, 714, 146; 5, 985, 280; i 6, 716, 587.4

SAŽETO IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA

U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje humana antitela, poželjno re kombi nan. tna humana antitela, koja se specifično vezuju za humani interleukin-4 receptor (hIL-4R). Humana antitela se karakterišu vezivanjem za hIL-4R sa visokim afinitetom i mogućnošću neutralizacije hIL-4 aktivnosti. U specifičnim ostvarenjima, humana antitela mogu blokirati hIL-13/hIL-13R1 kompleks vezujući se za hIL-4R i tako

inhibirajući signaliziranje koje vrši hIL-13. Antitela mogu biti u punoj dužini (na primer, IgGl ili IgG4 antitelo) ili mogu imati samo deo koji se vezuje za antigen (na primer, Fab, F(ab'); ili scFv fragment) i, mogu biti modifikovana da bi se delovalo na funkcionalnost, npr., da se otklone zaostale efektorne funkcije (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164: 1925-1933).

U jednom ostvarenju, pronalazak obezbeđuje antitelo ili, njegov fragment koji se vezuje za antigen, koje se specifično vezuje za HIL-4R (SEQ ID NO: l) sa Kt od oko 200 pM ili manjom, mereno površinskom plazmon rezonancom. U preciznijem ostvarenju, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment ispoljava KD, manju od 150 pM ili, manju od oko 50 pM ili, manju od 20 pM. U raznim ostvarenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment blokira hIL-4 aktivnost sa ICsc od 200 pM ili manjom, mereno STAT6 biotestom sa luciferazom. U preciznijim ostvarenjima, antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment pokazuje IC50 od oko 150 pM ili manje ili, čak oko 50 pM ili manje, mereno biotestom sa luciferazom. U raznim ostvarenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment blokira hIL-13 aktivnost sa IC50 od oko 100 pM ili manje, mereno STAT6 biotestom sa luciferazom. U specifičnijim ostvarenjima, antitelo ili antigen-vezujući fragment pokazuje IC50, od oko 75 pM ili manje ili, oko 50 pM ili manje ili, čak oko 20 pM ili manje.

U drugom aspektu, antitelo pronalaska obuhvata varijabilni region teškog lanca (HCVR) koji je izdvojen iz grupe, koja se sastoji od SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371, 387, 391, 395, 399, 403, 407, 411, 415, 419, 423, 427, 431, 435, 439, 443, 447, 451, 455, 459, 463, 467, 471, 475, 479, 483, 487, 491, 495, 499, 503, 507, 511, 515, 519, 523, 527, 531, 535, 539, 543, 547, 551, 555, 559, 563, 567, 571, 575, 579 i 581 ili, njihove suštinski slične sekvence.

U trećem aspektu, antitelo pronalaska obuhvata varijabilni region lakog lanca (LCVR) koji je izdvojen iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 130, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379, 389, 393, 397, 401, 405, 409, 413, 417, 421, 425, 429, 433, 437, 441, 445, 449, 453, 457, 461, 465, 469, 473, 477, 481, 485, 489, 493, 497, 501, 505, 509, 513, 517, 521, 625, 529, 533, 537, 541, 545, 549, 553, 557, 561, 565, 569, 573 i 577 ili, njihove suštinski slične sekvence.

U jednom ostvarenju, antitelo ili fragment antitela pronalaska obuhvataju HCVR i LCVR (HCVR/LCVR) koji su odabrani iz grupe, koja se sastoji od SEQ ID NO: 3/11, 19/27, 35/43, 51/59, 67/75, 83/91, 99/107,

115/123, 131/139, 147/155, 163/171, 179/187, 195/203, 211/219, 227/235, 243/251, 259/267, 275/283, 291/299, 307/315, 323/331, 339/347, 355/363, 371/379, 387/389, 391/393, 395/397, 399/401, 403/405, 407/409, 411/413, 415/417, 419/421, 423/425, 427/429, 431/433, 435/437, 439/441, 443/445, 447/449, 451/453, 455/457, 459/461, 463/465, 467/469, 471/473, 475/477, 479/481, 483/485, 487/489, 491/493, 495/497, 499/501, 503/505, 507/509, 511/513, 515/517, 519/521, 523/525, 527/529, 531/533, 535/537, 539/541, 543/545, 547/549, 551/553, 555/557, 559/561, 563/565, 567/569, 571/573, 575/577, 579/59 i 581/59. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili fragment antitela obuhvataju HCVR/LCVR koji su odabrani od SEQ ID NO: 51/59, 259/267, 275/283, 291/299, 579/59 ili 581/59.

U četvrtom aspektu, pronalazak obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju HCVR, gde je nukleinsko kiselinski molekul nukleotidna sekvenca, odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370, 386, 390, 394, 398, 402, 406, 410, 414, 418, 422, 426, 430, 434, 438, 442, 446, 450, 454, 458, 462, 466, 470, 474, 478, 482, 486, 490, 494, 498, 502, 506, 510, 514, 518, 522, 526, 530, 534, 538, 542, 546, 550, 554, 558, 562, 566, 570, 574, 578 i 580 ili, njihove suštinski iste sekvence, koje imaju najmanje 95% njihove homologije.

U petom aspektu, pronalazak obezbeđuje nukleinsko kiselinski molekul koji kodira LCVR, gde je nukleinsko kiselinski molekul nukleotidna sekvenca, izdvojena iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 129, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378, 388, 392, 396, 400, 404, 408, 412, 416, 420, 424, 428, 432, 436, 440, 444, 448, 452, 456, 460, 464, 468, 472, 476, 480, 484, 488, 492, 496, 500, 504, 508, 512, 516, 520, 524, 528, 532, 536, 540, 544, 548, 552, 556, 560, 564, 568, 572 i 576 ili, njihove suštinski iste sekvence, koje imaju 95% njihove homologi j e.

U jednom ostvarenju, antitelo pronalaska obuhvata HCVR i LCVR koje kodiraju parovi nukleotidne sekvence, koji su izdvojeni iz grupe, koja se sastoji od SEQ IĐ NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378, 386/388, 390/392, 394/396, 398/400, 402/404, 406/408, 410/412, 414/416, 418/420, 422/424, 426/428, 430/432, 434/436, 438/440, 442/444, 446/448, 450/452, 454/456, 458/460, 462/464, 466/468, 470/472, 474/476, 478/480, 482/484, 486/488, 490/492, 494/496, 498/500, 502/504, 506/508, 510/512, 514/516, 518/520, 522/524, 526/528, 530/532, 534/536,

538/540, 542/544, 546/548, 550/552, 554/556, 558/560, 562/564, 566/568, 570/572, 574/576, 578/59 i 580/59. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili fragment antitela obuhvataju HCVR/LCVR koje kodiraju nukleotidne sekvence odabrane od SEQ ID NO: 50/58, 258/266, 274/282, 290/298,

578/58 ili 580/58.

U šestom aspektu, pronalazak uobličava antitelo ili antigen-vezujući fragment antitela koji specifično vezuje hIL-4R, koje obuhvata komplementarno određujuće regione (CDR) tri teška i tri laka lanca, gde

CDR1 teškog lanca obuhvata amino kiselinsku sekvencu formule

X1-X2-X3-X4-X5-X6: -X7-X8 (SEQ ID NO: 582) u kojoj je : X1 =Gly; X2=Tyr ili

Phe; X =Thr ili I; X4=Phe; X5=Asn ili Arg; X8=Ser; X7=Tyr; i X6=Gly;

CDR2 teškog lanca obuhvata amino kiselinsku sekvencu formule

X1-X2-X3-X4-X5-X6: -X7-X8 (SEQ ID NO: 583) u kojoj je : X1 = Ile, X2 =Ser ili

Arg, X3=Thr ili Tyr, X4=Tyr ili Asp, X5 =Asn ili Gly, X6=Gly ili Ser,

X7 =Lys ili Asn, i X8=Thr;

CDR3 teškog lanca obuhvata amino kiselinsku sekvencu formule

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-Xl2-X13-X14-X15-X16-X17-X18-Xl9-X20-X21 (SEQ ID NO: 584), gde: X3=Ala ili Val, X3=Arg ili Lys, X3=Asp ili Glu, X4=Gly ili Glu, X5=Ala ili Arg, X6=Arg ili Ser, X7=Ile ili Gly, X8=Val ili Ser,

X8=Vai ili Trp, X10=Ala ili Phe, X11=Gly ili Asp, X12=Thr ili Pro, X13=Thr ili nije prisutno, X14=Pro ili nije prisutno, X15=Tyr ili nije prisutno, X16=Tyr ili nije prisutno, X17=Tyr ili nije prisutno, Xl8=Gly ili nije prisutno, X19=Met ili nije prisutno, X20=Asp ili nije prisutno i X21=Val ili nije prisutno;

CDR1 lakog lanca obuhvata amino kiselinsku sekvencu formule

X1-X2-X3-X4-X5-X6 (SEQ ID NO: 585) u kojoj je: X1=Gln, X2=Asp ili Ala, X3=Ile, X4=Ser ili Asn, X5=Asn ili Ile i, X6=Trp ili Phe;

CDR2 lakog lanca obuhvata amino kiselinsku sekvencu formule

X1-X2-X3 (SEQ ID NO: 586) u kojoj je: X1 =Ala ili Val, X2=Ala ili Thr i, X3=Ser; i

CDR3 lakog lanca obuhvata amino kiselinsku sekvencu formule

X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (SEQ ID NO: 587) u kojoj je: X1=Gln, X2=Gln, X3=Ala ili Tyr, X4=Asn, X5=Ser, X6= Phe ili His, X7=Pro, X8=Ile ili Trp i, X9=Thr.

U sedmom aspektu, pronalazak uobličava antitelo ili antigen-vezujući fragment, koji obuhvata teški lanac CDR3 i laki lanac CDR3,

gde je CDR3 domen teškog lanca odabran iz grupe, koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217,

233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361 i 377; i CDR3 domen lakog

lanca je odabran iz grupe, koja se sastoji od SEQ ID NO: 17, 33, 49,

65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289,

305, 321, 337, 353, 369 i 385. U poželjnom ostvarenju, CDR3 teškog lanca i lakog lanca su odabrani od parova sekvenci SEQ ID NO: 57 i 65; 265 i 273; 281 i 289; i 297 i 305.

U sledećem ostvarenju, pronalazak uobličava humano antitelo ili fragment antitela koje obuhvata: CDR1 domen teškog lanca koji je odabran iz grupe, koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 34 1, 357 i 373 ili, njihovih suštinski sličnih sekvenci; CDR2 domen teškog lanca koji je odabran iz grupe, koja se sastoji od SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359 i 375 ili, njihovih suštinski sličnih sekvenci; CDR3 domen teškog lanca odabran iz grupe, koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361 i 377 ili, njihovih suštinski sličnih sekvenci; CDR1 domen lakog lanca koji je odabran iz grupe, koja se sastoji od SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365 i 381 ili, njihovih suštinski sličnih sekvenci; CDR2 domen lakog lanca koji je odabran iz grupe, koja se sastoji od SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 14 3, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367 i 383 ili, njihovih suštinski sličnih sekvenci; i CDR3 domen lakog lanca je odabran iz grupe, koja se sastoji od SEQ ID NO: 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369 i 385 ili, njihovih suštinski sličnih sekvenci. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili antigen-vezujući fragment obuhvataju: CDRe teškog lanca SEQ ID NO: 53, 55, 57 i CDRe lakog lanca SEQ ID NO: 61, 63, 65; CDRe teškog lanca SEQ ID NO: 261, 263, 265 i CDRe lakog lanca SEQ ID NO: 269, 271, 273; CDRe teškog lanca SEQ ID NO: 277, 279, 281 i CDRe lakog lanca SEQ ID NO: 285, 287, 289; i CDRe teškog lanca SEQ ID NO: 293, 295, 297 i CDRe lakog lanca SEQ ID NO: 301, 303, 305.

U osmom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo ili antigen-vezujući fragment koji obuhvata tri CDRa iz HCVR i tri CDRa iz LCVR, gde su HCVR/LCVR odabrani iz grupe, koja se sastoji od: 51/59, 579/59, 581/59, 259/267, 275/283 i, 291/299.

U jednom ostvarenju, pronalazak uobličava humano antitelo ili fragment antitela koje obuhvata CDR3 teškog lanca i lakog lanca, gde CDR3 teškog lanca kodira nukleotidna sekvenca, odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 i 376; i CDR3 lakog lanca kodira nukleotidna sekvenca, odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 i 384.

U sledećem ostvarenju, pronalazak uobličava humano antitelc ili fragment antitela koje obuhvata CDR1 domen teškog lanca kog kodira nukleotidna sekvenca, odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228,

244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356 i 372 ili, njihovih suštinski

istih sekvenci koje imaju najmanje 95% homologije sa njima; CDR2 domen teškog lanca kog kodira nukleotidna sekvenca, odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166,

182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 i 374 ili,

njihovih suštinski istih sekvenci koje imaju najmanje 95% homologije sa njima; CDR3 domen teškog lanca kog kodira nukleotidna sekvenca,

odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312,

328, 344, 360 i 376 ili, njihovih suštinski istih sekvenci koje imaju

najmanje 95% homologije sa njima; CDR1 domen lakog lanca kog kodira nukleotidna sekvenca, odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236,

252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 i 380 ili, njihovih suštinski

istih sekvenci koje imaju najmanje 95% homologije sa njima; CDR2 domen lakog lanca kog kodira nukleotidna sekvenca, odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174,

206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 i 382 ili,

njihovih suštinski istih sekvenci koje imaju najmanje 95% homologije sa

njima; i CDR3 domen lakog lanca kog kodira nukleotidna sekvenca, odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96,

112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320,

336, 352, 368 i 384 ili, njihovih suštinski istih sekvenci koje imaju

najmanje 95% homologije sa njima. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili antigen-vezujući fragment obuhvataju CDRe teškog lanca, kodirane nukleotidnim sekvencama SEQ ID NO: 52, 54, 56 i CDRe lakog lanca, kodirane nukleotidnim sekvencama SEQ ID NO: 60, 62, 64; CDRe teškog lanca, kodirane nukleotidnim sekvencama SEQ ID NO: 260, 262, 264 i CDRe lakog lanca, kodirane nukleotidnim sekvencama SEQ ID NO: 268, 270, 272; CDRe teškog lanca, kodirane nukleotidnim sekvencama SEQ ID NO: 276, 278, 280 i CDRe lakog lanca, kodirane nukleotidnim sekvencama SEQ ID NO: 284, 286, 288; i CDRe teškog lanca, kodirane nukleotidnim

sekvencama SEQ ID NO: 292, 294, 296 i CDRe lakog lanca, kodirane

nukleotidnim sekvencama SEQ ID NO: 300, 302, 304.

Pronalazak obuhvata anti-hIL-4R antitela koja imaju izmenjen put glikozilacije. Za neke primene, izmene u smislu uklanjanja neželjenih položaja glikozilacije mogu biti od koristi ili, antitelo koje je bez dela fukoze na oligosaharidnom lancu, na primer, da bi se povećala ćelijska funkcija citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) (vidi Shield et al. (2002) JBC 277: 26733). Za druge primene, može se napraviti izmena galaktozilacije sa ciljem da se izmeni citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC).

U devetom aspektu, pronalazak obezbeđuje rekombinantne vektore ekspresije koji nose molekule nukleinske kiseline pronalaska i, ćelije domaćina u koje se takvi vektori unose, kao što su postupci proizvodnje antitela ili antigen-vezujućih fragmenata pronalaska koji se dobijaju iz kulture ćelija domaćina pronalaska. Ćelija domaćina može biti prokariotska ili eukariotska ćelija, poželjno, ćelija domaćina je ćelija E. coli ili ćelija sisara, kao što je CHO ćelija.

U desetom aspektu, pronalazak uobličava smešu koja obuhvata rekombinantno humano antitelo koje se specifično vezuje za hIL-4R i prihvatljiv nosač.

U jedanaestom aspektu, pronalazak uobličava postupke za inhibisanje aktivnosti humanog IL-4 upotrebom antitela ili, njegovog antigen-vezujućeg dela pronalaska. U posebnom ostvarenju, antitela pronalaska, takođe, blokiraju hIL-13/hIL-13Rl kompleks koji se vezuje za hIL-4R. U jednom ostvarenju, postupak obuhvata dovođenje u kontakt hIL-4R sa antitelom pronalaska ili, njegovim antigen-vezujučim delcm, tako da se inhibiše hIL-4 ili hIL-4/hIL-13 aktivnost. U drugom ostvarenju, postupak obuhvata primenjivanje antitela pronalaska ili, njegovog antigen-vezujućeg dela, ljudima koji pate od poremećaja koji se popravlja inhibicijom aktivnosti hIL-4 ili hIL-4/hIL-13. Poremećaj koji se leći može biti svaka bolest ili stanje koje se poboljšava, popravlja, inhibira ili sprečava uklanjanjem, inhibisanjem ili smanjivanjem hIL-4 ili hIL-4/hIL-13 aktivnosti.

Dalje je pronalaskom obuhvaćeno korišćenje antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela, u skladu sa ma kojim od patentnih zahteva 1 do 9, u proizvodnji leka za upotrebu za slabljenje ili inhibiranje bolesti ili poremećaja kod ljudi koje su posredovane sa IL-4.

IL-4 posredovani ili srodni poremećaji, koji se leće antitelima ili fragmentima antitela pronalaska uključuju, na primer: artritis (uključujući septički artritis), herpetiformis, hroničnu idiopatsku urtikariju, sklerodermu, hipertrofično ožiljavanje, Whippleovu bolest, benignu hiperplaziju prostate, plućne poremećaje,

kao što je blaga, umerena ili ozbiljna astma, zapaljenske poremećaje, kao što je zapaljenska crevna bolest, alergijske reakcije, Kawasakijevu bolest, bolest srpastih ćelija, Churg-Straussov sindrom, Graveovu bolest, pre-eklampsiju, Sjogrenov sindrom, autoimuni

1imfoproliferativni sindrom, autoimunu hemolitičku anemiju, Barrettov ezofagus, autoimuni uveitis, tuberkulozu i nefrozu.

Drugi ciljevi i koristi biće jasni iz pregleda detaljnog opisa koji sledi.

KRATAK OPIS SLIKA

Slika 1 (A-C). Procenjivanje profila vezivanja antitela

proizvedeno sa testom sekvencijalnog vezivanja baziranom na OCTET^-u. Slika 1(A) je štapićasti grafik koji prikazuje rezultate dobijene kada je prvo antitelo izloženo vezanom antigenu kontrolno antitelo. Slika 1(B) prvo antitelo izloženo vezanom antigenu je VAB16F3-1, Slika 1(C) prvo antitelo izloženo vezanom antigenu je VAK5H4-4. Drugo antitelo: l=kontrola; 2=VX4E7-9; 3=VX3F7-6; 4=VAB16G-1; 5=VAB16F3-1; 6=VAB15C8-

17; 7=VAB11G8-1; 8=VAB10Cl-5; 9=VAB10G8-19; 10=VAB8G10-1; ll=VAB7B9-3;

i 2=VAB 6C10-14; 13=VAB5C5-11; 14=VAB3B4-10; 15=VAB4D5-3; i6=VABlHl-2;

17=VAK5H4-4; 18=VAK7G8-5; 19=VAK8G11-13; 20=VAK9C6-11; 21=VAK10G6-7;

22=VAK11D4-1; 23=VAK12B11-9; i 24=VAK10G12-5. Prazni štapići pokazuju

nivo vezivanja prvog antitela dok, puni štapići pokazuju dodatno vezivanje drugim antiteiom.

DETALJAN OPIS

Pre nego što se opišu ovi postupci, treba razjasniti da ovaj pronalazak nije ograničen na opisane naročite postupke i eksperimentalne uslove jer ovi postupci i uslovi mogu varirati. Isto tako, treba razjasniti da je ovde korišćena terminologija samo u svrhu opisivanja naročitih ostvarenja i nije namenjena ograničavanju, jer će smisao ovog pronalaska biti ograničen samo priključenim patentnim zahtevima.

Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji su ovde korišćeni imaju ista značenja koja su uobičajeno razumljiva stručnim licima kojima je ovaj pronalazak i namenjen. Iako se ma koji postupak ili materijali, slični ili jednaki onima koji su ovde opisani, mogu upotrebiti u praksi ili testiranju ovog pronalaska, poželjni postupci i materijali su opisani u nastavku.

Definicije

Izraz "humani IL4R" (hIL-4R), kako je ovde korišćen, treba da se odnosi na humani receptor citokina koji specifično vezuje interleukin-4 (IL— 4), IL-4Ra (SEQ ID N0: 1). Izraz "humani interleukin-13" (hIL-13) se odnosi na citokin koji se specifično vezuje za IL-13 receptor, a "hIL-13/hIL-13Rl kompleks" se odnosi na kompleks koji se obrazuje vezivanjem hIL-13 za hIL-13Rl kompleks, pri čemu se kompleks vezuje za hIL-4 receptor kako bi započeo biološku aktivnost.

Izraz "antitelo", kako je ovde korišćen, treba da se odnosi na molekule imunoglobulina koji sadrže četiri polipeptidna lanca, dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, koji su međusobno povezani disulfidnim vezama. Svaki teški lanac obuhvata varijabilni region teškog lanca (ovde skraćen kao HCVR ili VH) i konstantni region teškog lanca. Konstantni region teškog lanca obuhvata tri domena: CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac obuhvata varijabilni region lakog lanca (ovde skraćen kao LCVR ili VL) i konstantni region lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena (CL1). VH i VL regioni se dalje mogu podeliti u regione hipervarijabilnosti, nazvanim komplementarni determinišući regioni (CDR), koji su prošarani sa više očuvanim regionima, nazvanim građevinski regioni (FR). Svaki VH i VL je sastavljen od tri CDR-a i četiri FR-a, uređenih od amino-krajeva ka karboksi-krajevima sledećim redom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Izraz "antigen-vezujući deo" antitela (ili, jednostavno "deo antitela" ili "fragment antitela"), kako je ovde korišćen, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržava sposobnost da se specifično veže za antigen (npr., hIL-4R). Dokazano je da se antigen-vezujuća funkcija antitela može izvesti fragmentima antitela pune dužine. Primeri vezivanja fragmenata obuhvaćeni su izrazom "antigen-vezujući deo" antitela i uključuju: (i) Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL, VH, CL1 i CH1 domena; (ii) F(ab' ); fragment, dvovalentni fragment koji se sastoji od dva F(ab)' fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; (iii) Fd fragment, koji se sastoji od VH i CH1 domena; (iv) Fv fragment, koji se sastoji od VL i VH domena jednog kraka antitela; (v) dAb fragment (Ward et al. (1989) Nature 241: 544-546), koji se sastoji od VH domena; i (vi) izolovani komplementarni determinišući region (CDR). Sem toga, iako se dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodiraju odvojenim genima, oni se mogu spojiti korišćenjem rekombinantnih postupaka, sintetskim povezivačem koji im tako omogućava da formiraju jedan zajednički lanac u kome su VL i VH regioni par koji obrazuje monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scrv); vidi npr., Bird et al. (1988)Science 242: 423-426; kao i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883. Ova jednolančana antitela su, takođe, obuhvaćena izrazom "antigen-vezujući deo" antitela. Isto tako su obuhvaćeni i drugi oblici jednolančanih antitela, kao što su diatela (vidi npr., Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444-6448).

"Neutrališuće" ili "blokirajuće" antitelo, kako je ovde korišćeno, treba da se odnosi na antitelo čije vezivanje za hIL-4R dovodi do inhibicije ili blokiranja aktivnosti hIL-4 i/ili hIL-13. Ova inhibicija biološke aktivnosti hIL-4 i/ili IL-13 može se proceniti merenjem jednog ili više poznatih indikatora aktivnosti hIL-4 i/ili hIL-13, kao što je ćelijska aktivacija indukovana sa hIL-4 i/ili IL-13 i vezivanje hIL-4 za hIL-4R (vdi primere u nastavku).

”CDR" ili komplementarno determinišući region je region hipervarijabilnosti prošaran regionima koji su više očuvani, nazvanim "građevinski regioni" (FR). U različitim ostvarenjima anti-hIL-4R antitelo ili fragment pronalaska, FR-i mogu biti identični sa sekvencama humane zametne linije ili mogu biti prirodno ili veštački i zmenj eni.

Izraz "površinska plazmon rezonanca", kako je ovde korišćen, odnosi se na optički fenomen koji omogućava analiziranje pravog vremena interakcija detekcijom promena u koncentracijama proteina unutar matriksa biosenzora, na primer, upotrebom BIAcore™ sistema (Pharmacia Biosensor AB).

Izraz "epitop" je antigena determinanta koja reaguje sa specifičnim mestom za vezivanje antigena u varijabilnom regionu molekula antitela, koji je poznat kao paratop. Jedan antigen može imati više cd jednog epitopa. Epitopi mogu biti ili konformacioni ili linearni. Konformacioni epitop nastaje prostornim postavljanjem jedne uz drugu amino kiselina sa različitih segmenata linearnog polipeptidnog lanca. Linearni epitop je onaj koji nastaje od susednih amino kiselinskih ostataka u polipeptidnom lancu. U izvesnim slučajevima, epitop može obuhvatiti delove saharida, fosforil grupe ili sulfonil grupe na antigenu.

Izraz "suštinski identitet" ili "suštinski identičan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, ukazuje da, kada je optimalno poredan sa odgovarajućim nukleotidnim umetcima ili delecijama sa drugom nukieinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identitet nukleinske sekvence koji je najmanje oko 95%, a poželjnije najmanje oko 96%, 97%, 98% ili 99% baza nukleotida, mereno ma kojim dobro-poznatim algoritmom identiteta sekvence, kao što su FASTA, BLAST ili Gap, kao što je raspravljeno u nastavku.

Kako je primenjen na polipeptide, izraz "suštinska sličnost" ili "suštinski sličan" znači da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poredane, kao pomoću programa Gap ili BESTFIT, koristeći zadati manjak težina, dele najmanje 95% identiteta sekvence, čak poželjnije, najmanje 98% ili 99% identiteta sekvence. Poželjno, položaji ostataka koji nisu identični, razlikuju se po konzervativnim amino kiselinskim supstitucijama. "Konzervativna amino kiselinska supstitucija" je ona u kojoj je amino kiselinski ostatak supstituisan drugim amino kiselinskim ostatkom, koji ima bočni lanac (R grupu) sa sličnim hemijskim svojstvima (n. pr., naelektrisanj e ili hidrof običnost). Uopšteno, ' konzervativna amino kiselinska supstitucija neće bitno izmeniti funkcionalna svojstva proteina. U slučajevima kada se dve ili više amino kiselinskih sekvenci razlikuju jedna od druge konzervativnim supstitucijama, procenat identiteta sekvence ili stepen sličnosti, može se podesiti prema gore kako bi se ispravilo u korist konzervativne prirode supstitucije. Načini za izvođenje ovog podešavanja su dobro poznati stručnim licima. Vidi, npr., Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Primeri grupa amino kiselina koji imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju: 1) alifatični bočni lanci: glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; 2) aiifatični-hidroksil bočni lanci: serin i treonin; 3) bočni lanci koji sadrže amid: asparagin i glutamin; 4) aromatični bočni lanci: fenilalanin, tirozin i triptofan; 5) bazni bočni lanci: lizin, arginin i histidin; 6) kiseli bočni lanci: aspartat i giutamat i, 7) bočni lanci sa sumporom: cistein i metionin. Poželjne grupe konzervativne amino kiselinske supstitucije su: va1in-1eucin-izoleucin, fenilalanin-tirozin, 1 izin-arginin, alanin-valin, glutamat-aspartat i, asparagin-glutamin. Alternativno, konzervativna zamena je svaka izmena sa pozitivnom vrednošću u PAM250 tablici verovatnoće matriksa, opisanoj u Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. "Umerena konzervativna" zamena je svaka izmena koja ima

vrednost koja nije negativna u PAM250 tablici verovatnoće matriksa.

Sličnost sekvence za polipeptide, koja se, isto tako, označava kao identitet sekvence, obično se meri upotrebom softvera analize sekvence. Softver analize proteina sparuje slične sekvence korišćenjem metenja sličnosti pripadanja raznim supstitucijama, deiecijama i drugim modifikacijama, uključujući konzervativne amino kiselinske

supstitucije. Na primer, GCG softver sadrži programe kao što su Gap i Betstfit, koji se mogu upotrebiti sa zadatim parametrima za određivanje homologije sekvence ili identiteta sekvence između blisko srodnih

polipeptida, kao što su homologi polipeptidi iz različitih vrsta organizama ili između divljeg tipa proteina i njegovog muteina. Vidi, npr., GCG Version 6. 1. Polipeptidne sekvence, takođe se mogu uporediti upotrebom FASTA, koji koristi zadate ili preporučene parametre, program u GCG Version 6. 1. FASTA (npr., FASTA2 i FASTA3) omogućava razvrstavanje i procenat identiteta sekvence regiona najboljeg naleganja između nepoznatih i traženih sekvenci (Pearson (2000) supra). Drugi poželjan algoritam, kada se poredi sekvenca pronalaska sa bazom podataka koja sadrži veliki broj sekvenci iz različitih organizama je kompjuterski program BLAST, posebno BLASTP ili TBLASTN, koji koristi zadate parametre. Vidi, npr., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 402.

Proizvodnja humanih antitela

Postupci za stvaranje humanih antitela obuhvataju, na primer, Velocimmune” (Regeneron Pharmaceuticals), XenoMouse” tehnologiju (Green et al. (1994) Nature Genetics 7: 13-21; Abgenix), "minilocus" pristup i, izlaganje faga (i vidi, na primer, US 5, 545, 807, US 6, 787, 637). Velocimmune™ tehnologija (US 6, 596, 541) obuhvata postupak stvaranja visoko specifičnih potpuno humanih antitela za odabrani antigen.

Glodari se mogu imunizovati bilo kojim postupkom, poznatim u struci (vidi, na primer, Harlow and Lane (1988) supra; Malik and Lillehoj (1994) Antibody techniques: Academic Press, CA). U poželjnom ostvarenju, hIL-4R antigen se primenjuje direktno miševima koji sadrže DNK lokuse koji kodiraju i varijabilni region teškog lanca humanog Ig-a i varijabilni region Kappa lakog lanca (Velocimmune™, Regeneron Pharmaceuticals, Ine.; US 6, 596, 541) sa adjuvansom, kako bi se stimulisao imuni odgovor, na primer, kompletan i nekompletan Freundov adjuvans, MPL+TDM adjuvantni sistem (Sigmaj ili, RIBI (muramii dipeptidi) (vidi 0'Hagan (2000) Vaccine Adjuvant, Human Press, NJ). Adjuvans može sprečiti brzo rasprostiranje polipeptida sekvestracijom antigena u lokalni depo i, može imati faktore koji mogu stimulisati imuni odgovor domaćina. Velocimmune™ tehnologija uključuje stvaranje transgenskih miševa, koji imaju genom koji sadrži humane varijabilne regione teškog i lakog lanca, koji su operativno povezani sa endogenim mišijim lokusom konstantnog regiona, tako da miš proizvodi antitelo koje sadrži humani varijabilni region i misiji konstantni region u odgovoru na stimulaciju antigenom. DNK, koja kodira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela se izoluje i operativno povezuje sa DNK koja kodira humane konstantne regione teškog i lakog lanca. Onda se DNK

ekspresuje u ćeliji koja može da ekspresuje celokupno humano antitelo. U specifičnom ostvarenju, ćelija je CHO ćelija.

Antitela mogu biti terapijski korisna za blokiranje interakcije ligand-receptor ili inhibiciju receptorske komponente interakcije, pre nego ubijanjem ćelija putem fiksacije komplementa (komplement-zavisna citotoksičnost)(CDC) i učešćem u antitelo-zavisnoj citotoksičnosti koja je ćelijski posredovana (ADCC). Konstantni region antitela je važan u sposobnosti antitela da fiksira komplement i za ćelijski posredovanu citotoksičnost. Tako se izoptip antitela može izdvojiti na osnovu toga da li se želi da antitelo posreduje citotoksičnost.

Humani imunoglobulini mogu postojati u dva oblika koja su udružena sa zglobnom heterogenošću. U jednom obliku, molekul imunoglobulina sadrži stabilnu četvcrolančanu konstrukciju od otprilike 150-160 kDa u kojoj se dimeri drže zajedno unutarlančanom disulfidnom vezom teškog lanca. U drugom obliku, dimeri nisu povezani preko unutarlančanih disulfidnih veza i, formirani molekul od oko 75-80 kDa je sastavljen od kovalentno kuplovanih lakog i teškog lanca (pola-antiteia). Ove oblike je izuzetno teško razdvojiti, čak i nakon afinitetnog prečišćavanja. Učestalost pojavljivanja drugog oblika u raznim intaktnim IgG izotipovima posledica je, ali nije ograničena na istu, strukturnih razlika udruženih sa zglobnim regionom izotipa antitela. Ustvari, jedna araino kiselinska supstitucija u zglobnom regionu zgloba humanog IgG4 može značajno smanjiti pojavljivanje drugog oblika (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30: 105) do nivoa koji se obično primećuju kod humanog IgGl zgloba. Ovaj pronalazak obuhvata antitela koja imaju jednu ili više mutacija u zglobu, CH2 ili CH3 regionu, koje mogu biti željene, na primer, u proizvodnji, kako bi se poboljšao prinos željenog oblika antitela.

Antitela pronalaska se poželjno proizvode upotrebom VelocimmuneT” tehnologije. Transgenski miš, kod kog su varijabilni regioni teškog i lakog lanca endogenog imunoglobulina zamenjeni sa odgovarajućim humanim varijabilnim regionima, stimuliše se antigenom od interesa i, od miša koji ekspresuje antitela se sakupe limfatične ćelije (kao što su B-ćelije). Limfatične ćelije se mogu stopiti sa mijeioma ćelijskom linijom da bi se pripremile besmrtne hibridoma ćelijske linije i, takve hibridoma ćelijske linije se skriniraju i izdvajaju kako bi se napravio izbor hibridoma ćelijskih linija koje proizvode antitela specifična za antigen od interesa. DNK koja kodira varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca mogu se izolovati i povezati sa željenim izotipskim konstantnim regionima teškog lanca i lakog lanca. Takav protein antitela može biti proizveden u ćeliji, kac što je CHO ćelija. Alternativno, DNK koja kodira antigen-specifična himerična antitela ili varijabilne domene lakih i teških lanaca, može se izolovati direktno iz antigen-specifičnih limfocita.

U jednom ostvarenju, transgenski miš sadrži do 18 funkcionalnih humanih gena promenljivog teškog lanca i 12 funkcionalnih humanih gena varijabilnog kappa lakog lanca. U drugom ostvarenju, transgenski miš sadrži do 39 humanih gena promenljivog teškog lanca i 30 humanih gena promenljivog kappa lakog lanca. U opet još jednom ostvarenju, transgenski miš sadrži do 80 humanih gena promenljivog teškog lanca i 40 humanih gena promenljivog kappa lakog lanca.

Uopšteno, antitela ovog pronalaska poseduju veoma visoke afinitete, obično imajući KDs od otprilike 1O-9 do oko 10-12 M, kada se mere vezivanjem za antigen koji je ili imobilisan na čvrstoj fazi ili mereno u rastvoru.

Početno, izoluju se himerična antitela visokog afiniteta sa humanim promenljivim regionom i mišijim konstantnim regionom. Kako je kasnije opisano, antitela se karakterišu i izdvajaju zbog željenih karakteristika, koje obuhvataju: afinitet vezivanja za hIL-4R, mogućnost blokiranja vezivanja hIL-4 za hIL-4R i/ili selektivnost za humani protein. Konstantni regioni miša se zamenjuju sa željenim humanim konstantnim regionima da bi se stvorila kompletna humana antitela pronalaska, na primer, divlji tip modifikovanog IgG4 ili IgGl (na primer, SEQ ID NO: 588, 589, 590). Dok odabrani konstantni region može da varira prema specifičnoj nameni, vezivanje za antigen visokog afiniteta i ciljne karakteristike specifičnosti ostaju u varijabilnom regionu.

Mapiranje epitopa i srodne tehnologije

Za ispitivanje koja antitela vezuju naročiti epitop može se izvesti rutinski test unakrsnog blokiranja, kao što je onaj, opisan u Ancibodies: A Laboratocy Manual 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane, eds. Ostali postupci obuhvataju alanin skeniranje mutanata, peptidni blot (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63) ili analizu otcepljivanja peptida. Sem toga, mogu se upotrebiti postupci, kao što je isecanje epitopa, ekstrakcija epitopa i hemijska modifikacija antigena (Torner (2000) Protein Science: 9: 487-496).

Modifi kacijom-potpomognuto profilisanje (MAP), takođe, poznato kao Profilisanje antitela na osnovu antigenske strukture (ASAP), jeste postupak kojim se kategorizuje veliki broj monoklonskih antitela (mAbs) usmerenih protiv istog antigena, a u skladu sa sličnostima profila

vezivanja svakog antitela za hemijski ili enzimatski modi f i kovane antigene površine (US Patentna prijava publikovana pod br. 2004/0101920). Svaka kategorija može reflektovati jedinstven epitop koji je ili jasno različit ili se delimično preklapa sa epitopom predstavljenim drugom kategorijom. Ova tehnologija omogućava brzo filtriranje genetski identičnih antitela tako da se karakteri zacija može fokusirati na genetski jasna antitela. Kada se primenjuje na skriniranje hibridoma, MAP može olakšati određivanje retkih hibridoma klonova sa željenim karakteristikama. MAP se može upotrebiti za sortiranje hIL-4R antitela pronalaska u grupe antitela koje se vezuju za različite epitope.

Sredstva korisna za menjanje strukture imobilisanog antigena su enzimi, kao, na primer, proteolitički enzimi i hemijska sredstva. Antigenski protein se može imobi1 izovati ili na površine biosenzorncg čipa ili na polistirenska zrnca. Ova posljednja se mogu staviti u postupak u, na primer, test kao što je multipleks LuminexTM test otkrivanja (Luminex Corp., TX). S obzirom na kapacitet LuminexTM-a da izvede višestruke analize sa do 100 različitih vrsta zrnaca, Luminez" obezbeđuje praktično neograničene antigenske površine sa raznovrsnim modifikacijama što dodvodi do savršenije rezolucije profilisanja epitopa antitela nad testom sa biosenzorom.

Terapijsko primenjivanje i formulisanje

Primenjivanje terapijskih entiteta u skladu sa pronalaskom može biti postignuto sa prikladnim nosačima, podlogama i drugim agensima koji se ugrađuju u formulacije da bi obezbedili bolji transfer, oslobađanje, toleranciju i slično. Mnoštvo odgovarajućih formulacija se može naći u formularu poznatom svim farmacutskim hemičarima: Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2003, 20th ed, Lippincott Williams&Wilkins). Ove formulacije obuhvataju, na primer: praškove, paste, masti, gelove, voskove, ulja, lipide, vezikule koje sadrže lipid (katjonski ili anjonski) (kao Lipofectin™), DNK konjugate, anhidrovane absorpcione paste, ulje-u-vodi i vođa-u-ulju emulzije, emulzije karbovoskova (polietilen glikoli raznih molekulskih težina), polu-čvrste gelove i polu-čvrste mešavine koje sadrže karbovoskove. Svaka od gore pomenutih mešavina može odgovarati za tretmane i terapije u skladu sa ovim pronalaskom, omogućavajući da se aktivni sastojak u formulaciji ne inaktivira u formulaciji i da je formulacija fiziološki kompatibilna i podnošljiva sa putem primenjivanja. Vidi, isto tako Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol. 52: 238-311 i tamošnje katjone za dodatne informacije u vezi sa podlogama i nosačima koji su dobro poznati farmaceutskim hemičarima.

Terapijski molekuli pronalaska se mogu primeniti pacijentu na način koji odgovara indikaciji, na primer, parenteralno, površinski ili inhalacijom. Ukoliko se ubrizgavaju, može se primeniti antagonist, na primer, putem intra-artikularno, intravenski, intramuskularno, intralezidnal. no, intraperitoneaino ili subkutanim putem, bolusnim injekcijama ili kontinuiranom infuzijom. Razmatra se lokali zovanc primenjivanje na mestu bolesti ili povrede, kao što je transdermalno oslobađanje i postepeno oslobađanje iz implanata. Oslobađanje inhalacijom obuhvata, na primer, nazalnu ili oralnu inhalaciju, upotrebu raspršivača, inhalaciju antagonista u obliku aerosola i slično. Druge mogućnosti uključuju kapi za oči; oralne preparate koji obuhvaćaju pilule, sirupe, lozenge ili žvakaće gume; i površinske preparate, kao što su losioni, gelovi, sprejevi i masti.

Specifično doziranje i učestalost primenjivanja mogu varirati u skladu sa takvim faktorima kao što su: put primenjivanja, priroda i ozbiljnost bolesti koja će se lečiti, da li je stanje akutno ili hronično i, veličine i opšteg stanja pacijenta. Odgovarajuće doziranje se može odrediti postupcima poznatim u struci, npr., u kliničkim studijama koje mogu uključiti ispitivanja povećavanja doze. Terapijski molekuli pronalaska se mogu dati jednom ili se ponavljati. U posebnim ostvarenjima, antitelo ili fragment antitela se primenjuje u periodu od najmanje mesec ili duže, npr., tokom jednog, dva ili tri meseca ili, čak neograničeno. Za lečenje hroničnih stanja, generalno je najefikasniji dugotrajni tretman. Ipak, za lečenje akutnih stanja, može biti dovoljno primenjivanje u kraćem periodu, npr., od jedne do šest nedelja. Uopšteno, terapeutik se primenjuje dok pacijent ispoljava medicinski relevantan stepen poboljšanja u odnosu na početno za odabrani indikator ili indikatore. Nivo IL-4 se može pratiti u toku i/ili nakon tretmana sa terapijskim molekulom pronalaska. Postupci za merenje serumskih nivoa IL-4 su poznati u struci, na primer, ELISA i td.

Terapijska upotreba i kombmovane terapije

Antitela i fragmenti antitela pronalaska su korisna za lečenje bolesti i poremećaja koji se poboljšavaju, inhibišu ili popravljaju smanjivanjem aktivnosti IL-4. Ovi poremećaji uključuju one, koji su opisani abnormalnim viškom ekspresije IL-4 ili, abnormalnim odgovorom domaćina na produkciju IL-4. Poremećaji povezani sa IL-4, koji se leče antitelima ili fragmentima antitela uključuju, na primer: artritis

(uključujući septički artritis), herpetiformis, hroničnu idiopatsku urtikariju, sklerođermu, hipertrofično ožiljavanje, Whippleovu bolest, benignu hiperplaziju prostate, plućne poremećaje, kao što je astma (blaga, umerena ili ozbiljna), zapaljenske poremećaje, kao što je zapalj enska erevna bolest, alergijske reakcije, Kawasakijevu bolest, bolest srpastih ćelija, Churg-Straussov sindrom, Graveovu bolest, pre-eklampsiju, Sjogrenov sindrom, autoimuni limfoproliferativni sindrom, autoimunu hemolitičku anemiju, Barrettov ezofagus, autoimuni uveitis, tuberkulozu, atopijski dermatitis, ulcerativni kolitis, fibrozu i nefrozu (vidi U. S. 7, 186, 809).

Pronalazak obuhvata kombinaciju terapija u kojoj se anti-IL-4R antitelo ili fragment antitela primenjuje u kombinaciji sa drugim terapeutskim sredstvom. Ko-ađir. inist raci j a i kombinovana terapija nisu ograničene na istovremeno primenjivanje već obuhvataju režime lečenja u kojima se primenjuje anti-IL-4R antitelo ili fragment antitela najmanje jednom u toku tretmana, koji uključuje primenjivanje najmanje jednog drugog sredstva pacijentu. Drugo terapeutsko sredstvo može biti drugi IL-4 antagonist, kao što je drugo antitelo/fragment antitela ili, rastvorljiv receptor citokina, IgE antagonist, medikacija protiv astme (kortikosteroidi, ne-steroidna sredstva, beta-agonisti, antagonisti leukotriena, ksantini, fiutikazon, salmeterol, albuterol) koja se može oslobađati inhalacijom ili drugim odgovarajućim putem. U specifičnom ostvarenju, anti-IL-4R antitelo ili fragment antitela pronalaska se može primeniti sa IL-1 antagonistom, kao što je rilonacept ili, IL-13 antagonistom. Drugo sredstvo može uključivati jedan ili više antagonista receptora leukotriena za lečenje poremećaja, kao što su alergijske upalne bolesti, npr., astma i alergije. Primeri antagonista receptora leukotriena obuhvataju, ali nisu njima ograničeni, montelukast, pranlukast i zafirlukast. Drugo sredstvo može uključiti inhibitor citokina, kao što je jedan ili više antagonista: TNF-a (etanercept, ENBREL™), IL-9, IL-5 ili IL-17.

PRIMERI

Sledeći primeri su upotrebljeni tako da omoguće stručnim licima kompletno izlaganje i opis kako da izvedu i upotrebe postupke i smeše pronalaska i, nemaju namenu ograničavanja smisla onoga što pronalazači smatraju pod svojim pronalaskom. Napravljen je napor da se obezbedi pouzdanost u smislu korišćenih brojeva (npr., količine, temperatura i td. ) ali treba računati sa nekim eksperimentalnim greškama ili odstupanjima. Sem ukoliko nije drugačije naznačeno, deiovi su težinski deiovi, molekulska težina je srednja molekularna težina, temperatura je u stepenima Celzijusa i pritisak je atmosferski ili blizu atmosferskog.

Primer 1. Proizvodnja humanih antitela protiv humanog IL-4 receptora.

Miševi koji sadrže DNK lokus koji kodira i varijabilni region teškog lanca i promenljivi region kappa lakog lanca humanog Ig (Velocimmune™, Regeneron Pharmaceuticals, Ine.; US Patent br. 6, 596, 541) su imunizovani sa humanim IL-4R (hIL-4R, SEQ ID N0: 1). hlL-4R je primenjen direktnom injekcijom prečišćenog antigena u adjuvansu ili indirektno, obezbeđujući DNK sekvencu hIL-4R u DNK plazmidu koji sadrži hIL-4R gen i ekspresuje hIL-4R upotrebom mašinerije ekspresije proteina u ćeliji domaćina kako bi in vivo proizveo antigenski polipeptid. Kako bi se dobio optimalni imuni odgovor, životinje su podsticane svake 3-4 nedelje i krv je dobijana 10 nakon svakog podsticanja radi ispitivanja progresije anti-antigenskog odgovora.

Kada miševi dostignu svoj maksimalni imuni odgovor, antitelo koje ekspresuju B ćelije se sakuplja i spaja sa mijeloma ćelijama miša da bi se obrazovali hibridomi. Funkcionalno željena monoklonska antitela su odabrana pomoću skrininga kondicioniranog medijuma

hibridoma ili transfektovanih ćelija na specifičnost, afinitet

vezivanja antigena i, moć blokiranja hIL-4 vezivanja za hIL-4R (opisano u nastavku).

Odabrana antitela, koja su pokazivala željeni afinitet antigenskog vezivanja, potenciju i/ili sposobnost blokiranja hIL-4 vezivanja za hIL-4R su uključivala (HCVR/LCVR): VX4E7-9 (SEQ ID NO: 3/11; 387/389; 391/393); VX3F7-6 (SEQ ID NO: 19/27; 395/397;

399/401); VAB16G-1 (SEQ ID NO: 35/43; 403/405; 407/409); VAB16F3-1 (SEQ

ID NO: 51/59, 411/413, 415/417, 579/59 i 581/59); VAB15C8-17 (SEQ ID NO:

67/75, 419/421, 423/425); VAB13A1-6 (SEQ ID NO: 83/91, 427/429,

431/433); VAB11G8-1 (SEQ ID NO: 99/107, 435/437, 439/441); VAB10G8-19

(SEQ ID NO: 115/123, 443/445, 447/449); VAB10C1-5 (SEQ ID NO: 131/139,

451/453, 455/457); VAB8G10-1 (SEQ ID NO: 147/155, 459/461, 463/465) VAB7B9-3 (SEQ ID NO: 163/171, 467/469, 471/473); =VAB6C10-14 (SEQ ID NO: 179/187, 475/477, 479/481); VAB5C5-11 (SEQ ID NO: 195/203, 483/485,

487/489); VAB3B4-10 (SEQ ID NO: 211/219, 491/493, 495/497); VAB4D5-3

(SEQ ID NO: 2 2 7/2 3 5, 4 99/501, 503/505); VAB1H1-2 (SEQ ID NO: 243/251,

507/509, 511/513); VAK5H4-4 (SEQ ID NO: 259/267, 515/517, 519/521);

VAK7G8-5 (SEQ ID NO: 275/283, 523/525, 527/529); VAK8G11-13 (SEQ ID

NO: 291/299, 531/533, 535/537); VAK9C6-11 (SEQ ID NO: 307/315, 539/541,

543/545); VAK10G6-7 (SEQ ID NO: 323/331, 547/549, 551/553); VAK11D4-1

(SEQ ID NO: 339/347, 555/557, 559/561); VAK12B11-9 (SEQ ID NO: 355/363,

563/565, 567/569); VAK10G12-5 (SEQ ID NO: 371/379, 571/573, 575/577).

Primer 2. Određivanje afiniteta vezivanja za antigen.

Afinitet vezivanja (KD) odabranih antitela u odnosu na hIL-4R je određen pomoću testa površinske plazmon rezonance na biosenzoru u realnom vremenu (BIAcore'm2000}. Ukratko, antitelo je zarobljeno na površini kozijeg anti-mišjeg (GAM) IgG poliklonskog antitela, koje je stvoreno putem direktnog hemijskog kuplovanja GAM IgG za BIAcore™ čip kako bi se formirala površina zarobljenog antitela. Razne koncentracije (opsega od 12. 5 nM do 0. 625 nM) monomernog hIL-4R (R&D Systems) ili dimernog hIL-4R-hFc su injektovane preko površine zarobljenog antitela. Vezivanje antigena za antitelo i disocijacija vezanog kompleksa su praćeni u realnom vremenu. Ravnotežne konstante disocijacije (Kp) i konstante brzine disocijacije su ustanovljene izvođenjem kinetičke analize upotrebom BIA softvera za ispitivanje. BIA softver za ispitivanje je, isto tako, upotrebljen i za izračunavanje polu-vremena disocijacije antigen/antitelo kompleksa (T1/2). Rezultati su prikazani u Tabeli 1. Kontrola: potpuno humano anti-IL-4R antitelo (U. S. Patent br. 1, 186, 809; SEQ ID NO: 10 i 12). Rezultati kinetičke analize su otkrili da su odabrana antitela uključila antitela visokog afiniteta, koja su bila sposobna da se vežu za dimerni receptor sa KDs ispod 1 nM. Takođe je testiran i afinitet vezivanja anti-hIL-4R antitela za bilo mišje, bilo majmunske (Macaca fascicularis) IL-4R. Odabrana antitela (1) nisu unakrsno reagovala sa mišijim IL-4R; i (2) bilo da se nisu vezala za majmunski IL-4R ili da su se vezala za majmunski IL-4R sa veoma niskim afinitetom.

Tabela 1

Afinitet antitelo-antigen vezivanja je, takođe, ispitan upotrebom testa kompeticije u rastvoru na bazi ELISA-e. Ukratko, antitela (prečišćeni proteini pri 1 ili 3. 3 ng/ml) su prvo poraešana sa serijom razblaženja antigenog proteina (monomernog ili dimernog) u opsegu od 0 do 10 ^ig/ml. Rastvori mešavine antitela i antigena su zatim inkubirani dva sata na sobnoj temperaturi da bi se postigla ravnoteža. Slobodno antitelo u mešavinama je onda mereno upotrebom kvantitativnog sendvič ELISA testa. Ukratko, Maxisorp™ ploče sa 96-mesta (VWR, West Chester, PA) su oblagane sa 2 μg/ml hIL-4R-hFc proteina u PBS preko noći na 4°C, a zatim, blokirane nespecifičnim vezivanjem sa BSA. Rastvori mešavine antitelo-antigen su onda preneti u obložene MaxisorbTK ploče, a zatim je sledila inkubacija od jednog sata. Ploče su zatim isprane sa puferom za ispiranje, a antitela koja su se vezala za ploču su detektovana sa reagensom koji sadrži HRP-konjugovana kozija anti-mišija IgG poliklonska antitela (Jackson Immuno Research) ili sa reagensom koji sadrži HRP-konjugovana kozija anti-humana IgG poliklonska antitela (Jackson Immuno Research) za kontrolu antitela i razvijena upotrebom kolorimetrijskih supstrata kao BD OptEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Nakon zaustavljanja reakcije sa 1 M fosfornom ili sumpornom kiselinom, zabeležene su apsorbance na 450 nm i podaci analizirani upotrebom GraphPad™ Prism softvera. Zavisnost signala od koncentraci ja antigena u rastvoru je analizirana četvoro-parametarskom analizom i prikazana je kao IC50, koncentracija antigena zahteva da se postigne 50% sniženje signala u uzorcima antitela a bez prisustva antigena u rastvoru. IC50, su određene kako je gore opisano i zbirno su prikazane u Tabeli 2. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili fragment antitela pronalaska ispoljava IC50 za dimerne hIL-4R od oko 20 pM ili manje, a IC50 za monomerne hIL-4R od oko 150 pM ili manje, ili otprilike 100 pM ili manje, mereno ELISA testom kompeticije u rastvoru.

Tabela 2

Primer 3. Inhibicija hIL-4 i hIL-4R interakcije

Sposobnost odabranih antitela da blokiraju hIL-4 vezivanje za hIL-4R su ispitana BIAcore™ testom blokiranja hIL-4 i potencija je merena kvantitativnim imunotestom hIL-4 blokiranja, kao što je opisane ispod. Rezultati su zbirno prikazani u Tabeli 3.

Sposobnost antitela da blokiraju vezivanje hIL-4 za hIL-4 receptor je određena upotrebom površinske plazmon rezonance. Prečišćeni hIL-4R-hFc molekuli su vezani pomoću kozijih anti-humanih IgG poliklonskih antitela, koja su imobilisana na CM-5 do gustine od 260 RU, da bi se pripremila površina obložena receptorom. Zatim je injektovan humani IL-4 (0. 25 ml pri 50 nM) preko površine obložene receptorom i zabeležena je količina vezanog hIL-4 (prva injekcija hlL-4). Vezani hIL-4 je onda uklonjen ritmom od 3 M MgCl_ koji je sledio kondicioni pufer. Zatim su injektovana prečišćena anti-hIL-4R antitela preko receptorske površine, a potom, druga injekcija hIL-4 u istoj koncentraciji (druga injekcija hIL-4). Procenat sniženja vezivanja hlL-4, koji je posledica stvorenog kompleksa antitela sa receptorom, prikazan je u Tabeli 3.

Da bi se dalje ispitivala mogućnost blokiranja bIL-4 vezivanja za hIL-4R, izveden je kvantitativni imunotest. Ukratko, rastvori od 25 pM hIL-4R-Fc su prethodno pomešani sa proteinom antitela u opsegu od -50 nM do 0 nM u serijalu razblaženja, što sledi jedan sat inkubacije na sobnoj temperaturi. Koncentracija slobodnog hIL-4R-Fc (bez vezanog antitela) je određena upotrebom hlL-4R-specifičnog senvič ELISA testa.

Detekcione ploče za hIL-4R su pripremljene vezivanjem biotinizovanog hIL-4 (0. 5 μg/ml) na pločama sa 96 mesta, koja su obložena streptavidinom. Uzorci prethodno vezanog antitelo-antigena su preneseni u detekcionu ploču obloženu sa hIL-4. Posle jednog sata inkubacije na sobnoj temperaturi, detekciona ploča je isprana i vezani hlL-4R-hFc na ploči je detektovan upotrebom HRP konjugovanih kozijih anti-hFc poiikionskih antitela i razvijena upotrebom kolorimetrijskih supstrata, kao BD OptEIA™ (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA). Nakon zaustavljanja reakcije sa 1 M fosfornom ili sumpornom kiselinom, zabeležene su apsorbance na 450 nm i podaci analizirani upotrebom GraphPad™ Prism softvera. IC su određene kao količina zahtevanog antitela da snizi 50% IL-4R-hFc detektabilnog na ploči vezanog hIL-4. U poželjnom ostvarenju, antitelo ili fragment antitela pronalaska ispoljava ICF- za blokiranje 25 pM hIL-4R od manje od oko 50 pM ili manje od oko 40 pM, ili manje od oko 30 pM ili manje od oko 20 pM, mereno ELISA testom.

Tabela 3

Primer 4. Neutralizacija biološkog degstva hIL-4 in vitro

IL-4 posredovan signalni transdukcioni put je široko dokumentovan u literaturi (na primer, vidi pregled Hebenstreit et al. 2006 Cytokine Growth Factor Rev. 17 (3): 173-88, 2006). IL-4 može stimulisati dva receptorska kompleksa, tip I i tip II. Receptorski

kompleksi tip I se formiraju vezivanjem IL-4 za IL-4R i sledstvenom heterodimerizacijom sa uobičajenim gama lancem. Alternativno, IL4/IL4R kompleks može heterodimerizovati sa IL-13 receptorom 1 kako obrazuje receptorski kompleks tip II. Oba kompleksa i, tip I i, tip II signaliziraju pre svega preko STAT6. Zato je ispitivana sposobnost odabranih antitela da blokiraju signaliziranje preko STAT6, kako je opisano u nastavku.

Ustanovljena je ćelijska linija sa visokom osetljivošću za hIL-4 i hIL-13. HEK293 ćelije su stabilno transfektovane sa humanim STAT6 i STAT6 luciferaza reporter plazmidom i, održavane su u medijumu za rast (DMEM, 10% FBS, L-glutamin, penicilin, streptomicin). Snažan odgovor posredovan IL-4 receptorom je postignut kada je dodato 10 pM h. IL-4 u medijum za rast STAT6-transfektovanih HEK293 ćelija. Za biotest na hIL-4 odgovor, ćelije su isprane jednom u test medijumu (Optimem I (Gibco) plus 0. 1% FBS) i držane u ploči (ploča sa 96 mesta) pri 1 x 1O4 ćelija/mestu u 80 µl test medijuma. Prečišćena antitela su serijski razblažena u test medijumu (konačne koncentracije u opsegu od 20 nM do 0) i 10 u. I svakog test antitela je dodato u ćelije zajedno sa 10 μl hIL-4 (10 pM konstantna konačna koncentracija). Ćelije su onda inkubirane na 37'c, 5% CO2 tokom 6 sati. Veličina ćelijskog odgovora je izmerena u testu luciferaze (Promega Biotech). Rezultati su prikazani u Tabeli 4.

Inhibicija IL-4 zavisne biološke aktivnosti in vitco je isto tako potvrđena upotrebom bilo humane eritroblastne ćelijske linije, TF1 ili, modifi kovane, IL-13Rα TF1 ćelijske linije, koja je prekomernc ekspresujuća (TF1/A12). U ovom biotestu, 20, 000 ćelija je zasejano u svako mesto na ploči sa 96 mesta u RPMI 1640 medijumu koji sadrži 10% FBS, 2 mM L-glutamina i penicilin i streptomicin. Dvadeset pet μl prečišćenih antitela u opsegu od 0 do 50 nM (konačne koncentracije) je dodato zajedno sa 25 μl hIL-4 re kombinantnog proteina do konačne koncentracije od bilo 50 pM za ćelijsku liniju TF1 ili 20 pM za ćelijsku liniju TF1/A12. Ćelije su zatim, ostavljene da rastu u toku 3 dana na 37 C i konačni ćelijski broj je meren upotrebom CCK8 kit-a (Dojindo, Japan). Sposobnost antitela da blokira TF-1 ćelijski rast je prikazana u Tabeli 4 kao koncentracija antitela neophodna da se postigne 50% smanjenje ćelijske proliferacije.

Tabela 4

Primer 5. Neutralizacija biološkog dejstva hIL-13 in vi. tro

Kako se pokazalo da je IL-4R modulator IL-13 aktivnosti putem njegovog vezivanja za IL-13/IL-13R kompleks, odabrana antitela su testirana na sposobnost da blokiraju IL-13 aktivnost modifikacijom HEK293 STAT6 luciferaza testa, koji je gore opisan, sa modifikacijom koja je zamena 10 pM IL-4 sa 40 pM hIL-13. Antitela su, isto tako, ispitana na mogućnost blokiranja hIL-13 aktivnosti u gore opisanom testu sa TF-1 ćelijskom linijom, sa hIL-13 pri 150 pM u prisustvu 0-50 nM antitela. Rezultati su prikazani u Tabeli 5.

Tabela 5

Primer 6. Određivanje profila vezivanja antitela

Profil vezivanja antitela se može ustanoviti određivanjem dejstva koje antitelo (vezano sa svoj antigen) može imati na sposobnost panela različitih antitela prema sledstvenom vezivanju istog antigena. Na primer, antigen može biti imobilisan na nosaču kako bi se obrazovala površina obmotana antigenom, površina obmotana antigenom može biti zasićena sa antitelom i, onda, površina obmotana antigenom zasićena sa antitelom se može izložiti panelu drugih antitela. Količina vezivanja panela drugih antitela za antigenu površinu zasićenu antitelom obezbeđuje profil vezivanja antitela. Upotrebljeni su testovi sekvencijelnog vezivanja na bazi OCTETTM-a kako bi se stvorio profil vezivanja antitela. Ukratko, grupa od 24 streptavidin visoko vezujućih FA biosenzora (ForteBio, Ine., Menlo Park, CA) su prvo inkubirani sa antigenom, biotin-hIL-4R-hFc, pri 2 μg/ml u toku 10 min na 30°C, kako bi se postiglo zasićenje i, količina vezanog antigena je izmerena kao promena u gustini (nm) biološkog sloja zahvaljujući vezanom proteinu, koji je direktno meren pomeranjem talasne dužine. Biotin-hIL-4R-hFc-vezani biosenzori su zatim inkubirani sa prvim antitelom (kontrolno antitelo) pri 50 μg/ml u toku 15 min, na 30°C kako bi se postigla saturacija i količina vezanog kontrolnog antitela je izmerena kao promena u gustini (nm) biološkog sloja. Svaki kontrolni senzor vezan za antitelo je onda inkubiran sa jednim od panela od 24 različita anti-hIL-4R antitela (drugo antitelo) pri 50, μg/ml tokom 15 min na 30°C i, količina drugog vezanog antitela je izmerena kao promena u gustini biološkog sloja. Isti test je ponovljen upotrebom ili VAB16F3—1 ili VAK5H4-4 anti-hIL-4R antitela, kao prvog antitela. Rezultati su prikazani na SI. 1A-C.

Odabrana anti-hIL-4R antitela su, takođe, određena Western blotom (podaci nisu prikazani). Ukratko, hIL-4R monomer (200 ng po prolazu)i mfIL-4R His-tagovan monomer (200 ng po prolazu) su podvrgnuti elektroforezi na SDS-PAGE gelovima upotrebom i redukcionog i ne-redukcionog pufera za uzorke. Četiri razdvojena gela su, svaki, preneseni na PVDF membranu i svaka membrana je izložena jednom od

četiri primarna antiteia: anti-His mAb (Qiagen), VAB 16F3-1, VAK 5H4-4 ili kontrolnom anti-hIL-4R antitelu, sa bilo HRP-konjugovanim kozijim anti-mlgG ili anti-hlgG (Pierce) kao drugim antitelom. Sva tri anti-hIL-4R antiteia su prepoznala ne-redukovani oblik hIL-4R. Samo VAB 16F3-1 i VAK 5H4-4 otkrivaju redukovani oblik hIL-4R. Nijedno od anti-hIL-4R antiteia ne detektuje majmunski IL-4R.

Claims (15)

1. Antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, koji se specifično vezuje za hIL-4R (SEQ ID N0: 1) sa KD od otprilike 200 pM ili manjom, mereno površinskom plazmon rezonancom, koje sadrži CDRe HCVR i LCVR sekvence, pri čemu su HCVR/LCVR sekvence odabrane od 579/59 i 581/59.

2. Antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao u patentnom zahtevu 1, koje ispoljava K-, za hIL-4R (SEQ ID NO: l) koja je manja od 150 pM.

3. Antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao u patentnom zahtevu 1, koje ispoljava Kn za hIL-4R (SEQ ID NO: l) koja je manja od 50 pM.

4. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo ili antigen vezujući fragment, kao u bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

5. Vektor, koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline, kao u patentnom zahtevu 4.

6. Sistem domaćin-vektor za proizvodnju antitela ili antigen vezujućeg fragmenta antitela koje specifično vezuje IL-4 receptor, koji sadrži vektor, kao u patentnom zahtevu 5, u pogodnoj ćeliji domaćina.

7. Sistem domaćin-vektor, kao u patentnom zahtevu 6, u kome je ćelija domaćina prokariotska ili eukariotska ćelija, odabrana od jedne od E. coli ili CHO ćelije.

8. Postupak za proizvodnju anti-IL-4R antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta, koji obuhvata uzgajanje ćelija sistema domaćin-vektor, kao u patentnom zahtevu 6 ili 7, u uslovima koji omogućavaju proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta i vađenje tako proizvedenog antitela ili fragmenta.

9. Upotreba antitela ili antigen-vezujućeg fragmenta antitela, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, u proizvodnji leka za upotrebu za umanjivanje ili inhibiranje bolesti ili poremećaja kod ljudi, posredovanih sa IL-4.

10. Antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, za upotrebu u postupku za lečenje bolesti ili poremećaja kod ljudi, pri čemu se bolest ili poremećaj popravljaju, poboljšavaju ili inhibiraju uklanjanjem, inhibicijom ili smanjivanjem aktivnosti humanog interleukina-4 (hIL-4R).

11. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 9, gde se bolest ili poremećaj izdvaja od: artritisa, herpetiformisa, hronične idiopatske urtikarije, skleroderme, hipertrofičnog ožiljavanja, Whippleove bolesti, benigne hiperplazije prostate, plućnih poremećaja, zapaljenskih poremećaja, alergijskih reakcija, Kawasakijeve bolesti, bolesti srpastih ćelija, Churg-Straussovog sindroma, Graveove bolesti, pre-eklampsije, Sjogrenovog sindroma, autoimunog limfoproliterativnog sindroma, autoimune hemolitičke anemije, Barrettovog ezofagusa, autoimunog uveitisa, tuberkuloze, atopijskog dermatitisa, ulcerativnog kolitisa, fibroze i nefroze.

12. Upotreba, kao u patentnom zahtevu 11, gde je pomenuti poremećaj pluća astma, pomenuti zapaljenski poremećaj je zapaljenska bolest creva ili, pomenuti artritis je septički artritis.

13. Antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao u patentnom zahtevu 10, gde se bolest ili poremećaj izdvaja od: artritisa, herpetiformisa, hronične idiopatske urtikarije, skleroderme, hipertrofičnog ožiljavanja, Whippleove bolesti, benigne hiperplazije prostate, plućnih poremećaja, zapaljenskih poremećaja, alergijskih reakcija, Kawasakijeve bolesti, bolesti srpastih ćelija, Churg-Straussovog sindroma, Graveove bolesti, pre-eklampsije, Sjogrenovog sindroma, autoimunog limfoproliferativnog sindroma, autoimune hemolitičke anemije, Barrettovog ezofagusa, autoimunog uveitisa, tuberkuloze, atopijskog dermatitisa, ulcerativnog kolitisa, fibroze i nefroze.

14. Antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao u patentnom zahtevu 13, gde je pomenuti poremećaj pluća astma, pomenuti zapaljenski poremećaj je zapaljenska bolest creva ili, pomenuti artritis je septički artritis.

15. Smeša koja sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment, kao u ma kom od patentnih zahteva 1 do 3, i prihvatljivi nosač.