LU502017B1 - Nested PCR detection primer set and method for identifying African swine fever gene deletion strain - Google Patents

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Claims (10)

Revendications
1. Un ensemble d'amorces de détection PCR nichée pour identifier la souche de délétion du gène de peste porcine africaine est caractérisé en ce que, visant la souche de délétion du gène pDP71L, la séquence nucléotidique de l'amorce externe est représentée par SEQ ID NO.1 et SEQ ID NO.2, et la séquence nucléotidique de l'amorce interne est représentée par SEQ ID NO.3 et SEQ ID NO.4; en ce qui concerne la souche de délétion du gène DP96R, la séquence nucléotidique de l'amorce externe est présentée dans SEQ ID NO.5 et SEQ ID NO.6, et la séquence nucléotidique de l'amorce interne est présentée dans SEQ ID NO.7 et SEQ ID NO.8 ; en ce qui concerne la souche de délétion du gène A276R, la séquence nucléotidique de l'amorce externe est présentée dans SEQ ID NO.9 et SEQ ID NO.10, et la séquence nucléotidique de l'amorce interne est présentée dans SEQ ID NO.11 et SEQ ID NO.12 ; en ce qui concerne la souche de délétion du gene MGF360-12L, la séquence nucléotidique de l'amorce externe est présentée dans SEQ ID NO.13 et SEQ ID NO.14, et la séquence nucléotidique de l'amorce interne est montrée dans SEQ ID NO.15 et SEQ ID NO.16.
2. Un kit de détection par PCR nichée pour identifier les souches de délétion du gène de la peste porcine africaine est caractérisé en ce que le kit comprend le jeu d'amorces de la revendication 1.
3. Le kit, selon la revendication 2, est caractérisé en ce que le kit comprend en outre un réactif d'amplification PCR.
4 Le kit, selon la revendication 3, est caractérisé en ce que le réactif d'amplification PCR comprend 5U/uL TaKaRaEx Taq, 20mM 10xEx Taq Buffer, dNTP, amorce externe ou amorce interne et matrice.
5. Le kit, selon la revendication 2, est caractérisé en ce que le kit comprend en outre une substance de référence positive et une substance de référence négative.
6. Le kit, selon la revendication 5, est caractérisé en ce que la substance de référence positive contient de l'ADN plasmidique du virus de la peste porcine africaine pDP71L ou du virus de la peste porcine africaine DP96R ou du virus de la peste porcine africaine A276R ou de la souche de suppression du gène du virus de la peste porcine africaine MGF360-12L .
7. Une méthode de détection par PCR nichée pour identifier les souches de délétion 502017 du gène de la peste porcine africaine à des fins de diagnostic non pathologique est caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : S1, extraire l'acide nucléique viral d'un échantillon ; S2, en prenant l'acide nucléique viral de S1 comme matrice, et en réalisant la première réaction d'amplification PCR avec l'amorce externe de la revendication 1 pour obtenir un produit d'amplification A ; S3, en prenant le produit d'amplification A de S2 comme matrice, et en réalisant une seconde réaction d'amplification PCR avec l'amorce interne de la revendication 1 pour obtenir un produit d'amplification B ; S4, réalisation d'une analyse par électrophorèse sur gel d'agarose sur le produit d'amplification B décrit en S3, et observation des résultats sous un système d'imagerie sur gel pour déterminer le type de virus.
8. Procédé de détection selon la revendication 7 caractérisé en ce que la bande spécifique de la seconde amplification PCR est : la bande spécifique du fragment de souche de délétion du gène pDP71L est de 118bp ; le fragment de bande spécifique de la souche de délétion du gène DP96R est de 174 pb ; le fragment de bande spécifique de la souche de délétion du gène A276R est de 228 pb ; le fragment de bande spécifique de la souche de délétion du gène MGF 360-12L est de 187 pb.
9. Le procédé de détection, selon la revendication 7, est caractérisé en ce que les conditions de la première réaction d'amplification PCR de S2 comprennent: une pré-dénaturation à 98°C pendant 4-6 min; dénaturation à 98°C pendant 10 s, recuit à 55°C pendant 35 s, et étirement à 72°C pendant 45 s, un total de 35 cycles ; enfin, étirement à 72°C pendant 4 min.
10.La méthode de détection, selon la revendication 7, est caractérisée en ce que les conditions de la deuxième réaction d'amplification PCR de S3 comprennent: une pré-dénaturation à 95 °C pendant 5 min; dénaturation à 98°C pendant 10 s, recuit à 57°C pendant 35 s et étirement à 72°C pendant 45 s, un total de 35 cycles; enfin, étirement à 72°C pendant 4 min.
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