LT4018B

LT4018B - Protein, biologically active hormone, method for protein production, pharmaceutical preparation

Info

Publication number: LT4018B
Application number: LTIP1652A
Authority: LT
Inventors: Giuseppe Arpaia; Serenella Serani; Antonino Sirna; Stefano Villa
Original assignee: Serono Cesare Ist Ricerca
Priority date: 1987-06-26
Filing date: 1993-12-21
Publication date: 1996-08-26
Also published as: EP0322438B1; FI890893A0; FI890893L; FI96608C; ES2009948A6; CN1069062C; US5128453A; CN1031714C; JP2523843B2; FI96608B; AR243241A1; GR880100418A; DE3852383T2; NO890805D0; RU2059412C1; HK143195A; DK89989D0; LT3999B; AU615930B2; WO1988010270A1

Description

Šis išradimas skirtas iš šlapimo išskirtam folikulus stimuliuojančiam hormonui bei jį turinčioms vaistinėms kompozicijoms ir jo valymo būdui.

Folikulus stimuliuojantis hormonas (FSH), kaip žinoma, naudojamas gydant nevaisingumą. Šį hormoną turintys preparatai naudojami išsaugant nėštumą in vivo ir in vitro. Žmogaus FSH išskirtas iš žmogaus hipofizio ir iš poklimaksinio periodo moters šlapimo. Neseniai FSH gautas panaudojant rekombinantines DNR metodiką.

Pirmo komercinio preparato, turinčio FSH, sudėtyje buvo (pavyzdžiui, Fergonal® Serono) žmogaus menopauzės gonadotropinas (ŽMG), ekstrahuotas iš poklimaksinio šlapimo. Tai buvo FSH, liuteinizuojančio hormono (LH) bei kitų šlapimo baltymų mišinys. Tiek moksliniams, tiek ir terapiniams tikslams stengiamasi gauti išvalytus FSH preparatus. Šiuo metu parduodamas produktas Metrodin® (Serono) yra iš šlapimo išskirtas FSH preparatas, turintis ir kitų šlapimo baltymų, tačiau LH kiekis jame minimalus, ir jis naudojamas gydant nevaisingumą. Šis produktas ypač naudotinas tais atvejais, kai nepageidautina drauge su FSH įvesti ir egzogeninį LH, pavyzdžiui, esant kiaušidžių polikistozės sindromui (KPS).

Iki šiol gydymo tikslais FSH buvo naudojamas injekcijų į raumenis pavidalų. Kadangi šias injekcijas daro gydytojai ar kiti profesionalūs medikai, ligoniams tenka lankytis reguliariai chirurgo kabinete ar ligoninėje tam, kad gautų gydymą. Tai sudaro tam tikrus sunkumus. Be to, ligoniai dažnai išreiškia nepasitenkinimą ryšium su tuo, kad gydymas užsitęsia keletą savaičių ar net mėnesių ir visą tą laikotarpį reikia gaišti laiką vaistinių preparatų įvedimui.

Poodinės injekcijos suteiktų galimybę ligoniui pačiam susileisti vaistus ir jis pats labiau galėtų dalyvauti gydyme.

Žmogaus menopauzės gonadotropino (ŽMG) poodinės injekcijos jau aprašytos (Nakamura ir kt., Vaisingumas ir nevaisingumas, 46 (i), p.46-54, 1985) moters nevaisingumo gydymo metu peristaltinio poodinio siurbliuko pagalba pulsuojančiai įvedant ŽMG. Poodines injekcijas gali lydėti vietinės alergijos reakcijos, sukeltos preparate esančių priemaišų, ir gali tekti nutraukti gydymą.

P. Ruz (Žmogaus folikulus stimuliuojantis hormonas,

Actą Endocrinologica Supplementum, 131, 1968) aprašė ir apibūdino hipofizio ir šlapimo FSH išgrynintus preparatus, išskirtus atitinkamai iš užšaldytų hipofizių ir poklimaksinio šlapimo koncentrato. Hipofizio FSH biologinis aktyvumas buvo apie 14000 tarptautinių vienetų/1 mg, o šlapimo FSH - 780 tarptautinių vienetų / 1 mg. Tikimasi, kad daugumoje aktyvių hipofizio ir šlapimo preparatų LH priemaiša sudaro apytikriai 0,1 % masės. Preparato valymui naudojama viena ar daugiau sekančių metodikų, kaip antai chromatografija dietilaminoetilceliuliozėje, Sefadekso G-100 gel-filtracija, hidroksilapatitinė chromatografija, elektroforeze poliakrilamido gelyje ir pan.

Donini ir kt. (Klimaksinio šlapimo FSH išvalymas ir dalinis fizikocheminis ištyrimas Gonadotropinai ir kiaušidžių vystymasis. Dviejų darbinių susitikimų medžiaga, E. ir C. Livingston, Edinburgas ir Londonas, 1970) aprašė vieną iš labiausiai išvalytų FSH preparatų, kuris turėjo 1255,6 tarptautinių vienetų / 1 mg biologinį aktyvumą, o LH priemaiša sudarė iki 3,2 tarptautinių vienetų / 1 mg. Šiam atvejui pradine medžiaga pasitarnavo žmogaus klimaksinis gonadotropinas (ZKG) preparato Pergonal® pavidalu, kuris, kaip buvo nurodyta aukščiau, yra FSH, LH bei kitų šlapimo baltymų mišinys. Galutinis. rezultatas buvo pasiektas periodiškai valant pradinį ZKG dietilaminoetilceliuliozės kolonėlėje, gel-filtruojant Sefadekse G-100 ir paskutinėje stadijoje panaudojant preparatyvinę poliakrilamido gelioelektroforezę.

Dar didesnio efektyvumo pasiekė H. van Heli ir kt. (Žmogaus šlapimo FSH ir LH valymas ir kai kurie ypatumai, Gonadotropinai, I tarptautinio simpoziumo gonadotropinu klausimu medžiaga, 1971, Uili, Intersaiens, Niujorkas) prie tradicinių chromatografinio valymo metodų pridėjęs dar papildomas imunochromatografijos ir gel-filtracijos stadijas. Imunochromatografija atlikta panaudojant pririštus prie Sefarozės antikūnus žmogaus chorioniniam gonadotropinui, tam, kad būtų iš dalinai išvalyto FSH pašalintos LH. Labiausiai išvalytos FSH frakcijos FSH aktyvumas buvo 4720 tarptautinių vienetų / 1 mg, o LH aktyvumas tesudarė tik 15 tarptautinių vienetų / 1 mg, išmatuojant radioimunoanalizės būdu.

Donini ir kt. aprašė imunochromatografinį valymo būdą (FSH ir LH išvalymas ir išskyrimas iš ZKG, Actą Endocrinologica, 52, p. 186-198, 1966), kuomet dar 1966 m. gavo FSH preparatą, kurio aktyvumas buvo 329,7 tarptautiniai vienetai / 1 mg ir LH - 2,4 tarptautiniai vienetai / 1 mg. Kadangi preparato, pasižymėjusio FSH aktyvumu 329,7 tarptautiniai vienetai / 1 mg, jokia radioimunoanalizė nebuvo daryta, todėl galima prielaida pagal analogiją su H. van Helo rezultatais (žr. aukščiau), kad galbūt radioimunoanalizės (RIA) metu būtų galima aptikti pėdsakinius LH kiekius.

Donini ir kt. parodė net minimalių LH priemaišų fiziologinį svarbumą (Naujas liuteinizuojančio hormono biologinio nustatymo metodas, Actą Endocrinologica, 58, p.463-472, 1968), pasiūlę naują kiekybinį LH biologinio aktyvumo nustatymo būdą nesubrendusioms intaktinėms pelėms įvedant pastovią fiziologiškai švaraus FSH preparato dozę su vis didėjančia LH priemaiša ir po to išmatuojant gimdos masę, kaip atsaką proporcingą LH aktyvumui. Pagal gautus duomenis nustatyta, kad įvedus drauge su FSH 4,4 tarptautiniais vienetais viso labo tik LH 0,068 tarptautinius vienetus, pastarųjų pakanka, kad padidėtų gimdos masė.

Iš šių duomenų seka, kad pageidautina turėti absoliučiai išvalytą FSH preparatą, kuomet gydymui reikalingas FSH aktyvumas ir visiškai nereikia LH.

Kaip aukščiau paminėta, šiuo metu prekyboje esantis produktas Metrodinas® (Serono) yra išvalytas FSH preparatas, gautas metodu praktiškai identišku tam, kuris aprašytas Donini ir kt. aukščiau nurodytame darbe (Actą Endocrinologica, 52, p.186-198, 1986). Kokybės kontrolės techniniai reikalavimai atitinkamai su pateiktu nurodyto preparato biologiniu grynumu yra LH 0,7 tarptautinio vieneto /FSH 75 tarptautiniams vienetams, tai yra beveik aktyvumo biologinio mėginio jautrumo riba. Tačiau kai kurioms terapinėms priemonėms pageidautina, kad absoliučiai nebūtų LH aktyvumo. Be to, Metrodine® be žmogaus FSH dar yra pakankamas kiekis kitų šlapimo baltymų, tai reiškia, kad tai ne chemiškai grynas FSH preparatas.

Didžiosios Britanijos patento paraiškoje Nr. 2173803 siūlomas dar vienas hipofizio glikoproteininių hormonų, tarp kurių yra ir FSH, išgryninimo būdas. Šis būdas grindžiamas hormono komplekso su imobilizuotais antikūniais susidarymu ir po to sekančiu hormono išplovimu tam tikslui panaudojant rūgštų vandeninį buferį, kurio pH nuo 3 iki 4. Gautas gerai. išvalytas FSH turi tačiau tam tikrą kiekį priemaišų: 0,1 % masės sudaro LH priemaiša ir 0,5 % masės tireostimuliuojantis hormonas (TSH).

Apžvalginiame straipsnyje Skotas K. Čapelas ir kt.

(Endokrininės apžvalgos, 4(2), p.179-211, 1983) aprašė FSH mikroheterogeniškumą ir FSH lydinčių molekulių angliavandeninių dalių fiziologinę reikšmę. Galima prielaida, kad kai kurios modifikacijos vyksta metabolizmo metu iki pat šlapimo sekrecijos. Cheminėfizinė diferenciacija parodyta eksperimente, lyginant labai išvalytą FSH, išskirtą iš šlapimo pagal šį išradimą, su labai išvalytu FSH preparatu, išskirtu iš hipofizio.

Iki- ir po- transliacinės modifikacijos, matyt, ir sudaro FSH mikroheterogeniškumo pagrindą, FSH- tai glikoproteidas, sudarytas iš dviejų skirtingų glikozilintų nekovalentiškai sujungtų polipeptidinių grandinių, žinomų kaip alfa ir beta subvienetai. Betasubvienetas sąlygoja molekulės biologinį specifiškumą.

Be visa kita, šis straipsnis bando paaiškinti esminį skirtumą, stebimą lyginant biologinį aktyvumą / mg labai išvalytų FSH, išskirtų iš šlapimo ir iš hipofizio. Galima prielaida, ' kad tai sąlygoja angliavandeninės dalys, o konkrečiai, sialo rūgšties galinės liekanos.

Tenka pažymėti, kad, nežiūrint to, kad tiek hipofizio FSH, tiek ir šlapimo FSH vadinami FSH, tačiau nėra tvirto įrodymo, kad šios molekulės, išskirtos iš skirtingų dviejų šaltinių yra cheminiu požiūriu vienodos ir ekvivalentiškos.

Išradimo aprašymas

Šiuo metu žinoma, kad iš poklimaksinio šlapino koncentrato galima išskirti labai išvalytą žmogaus šlapimo FSH, neturintį net pėdsakinių kiekių LH ar kitųxšlapimo baltymų. Be to, atlikus išskirto pagal šį išradimą šlapimo FSH aminorūgščių analizę, netikėtai išaiškintas naujas FSH beta- subvienetas, susidedantis iš 111 aminorūgščių, vietoje 118 ar 108, kaip tai buvo nurodyta anksčiau (žr. pvz., Skotas ir kt. aukščiau) apibūdinant žinomą FSH beta- subvienetą. Šis išradimas siūlo naują FSH beta- subvieneto aminorūgščių seką:

Asn Ser Cys

Glu

Leu Thr Asn 20

Ile Thr Ile Ala Ile Glu

Lys

Glu

Cys

Arg

Phe

Cys

Ile

Ser

Ile

Asn

Thr

30

Trp

Cys

Ala

Gly

Tyr

Cys

Tyr

Thr

Arg

Asp

Leu

Vai

Tyr

40

50

Lys

Asp

Pro

Ala

Arg

Pro

Lys

Ile

Gln

Lys

Thr

Cys

Thr

60

Phe

Lys

Glu

Leu

Vai

Tyr

Glu

Thr

Vai

Arg

Vai

Pro

Gly

70

cys

Ala

His

Ala

Asp

Ser

Leu

Tyr

Thr

Tyr

Pro

Vai

80

90

Ala

Thr

Gln

Cys

His

Cys

Gly

Lys

Cys

Asp

Ser

Asp

Ser

100

Thr

Asp

Cys

Thr

Vai

Arg

Gly

Leu

Gly

Pro

Ser

Tyr

Cys

110

Ser

Phe

Gly

Glu

Met

Lys

Glu

o taip

pat

naują baltymą,

turintį

naują gonadotropino

alfa-subvienetą ir beta-subvienetą, susidedantį iš 111 aukščiau išvardintų aminorūgščių. Baltymas pasižymi folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) biologiniu aktyvumu. Jis dažniausiai sutinkamas glikozilintoje formoje. Jo didžiausias privalumas, kad jis neturi liuteinizuojančio hormono ir kitų šlapimo baltymų priemaišų pėdsakų.

Šio išradimo realizacijos kitas variantas yra farmacinė 5 kompozicija turinti pagal išradimą išvalytą baltymų ir farmaciniu požiūriu tinkamą užpildą. Tinkamiausia jai forma yra poodinės injekcijos. Po oda įšvirkšti šie vaistai nesukelia alerginių reakcijų, būdingų vartojant žinomus FSH preparatus.

¹⁰

Pagal šio išradimo kitą variantą siūlomas naujo ir labai išvalyto FSH gavimo būdas. Būdas grindžiamas imunovalymo stadijos ir atvirkščių fazių aukšto slėgio skysčių chromatografijos kombinacija. Imunovalymo stadijoje naudojami imobilizuoti monokloniniai antikūniai lygiai taip, kaip tai aprašyta aukščiau paminėto patento (Didžioji Britanija Nr. 2173803A) paraiškoje, su vieninteliu esminiu skirtumu, kad FSH iš imunokomplekso eliuojamas esant aukštesnėms pH reikšmėms.

Pagal šiame išradime pateikiamą būdą eliucijai patogu naudoti vandeninį tirpalą, kurio pH apytikriai 10 ir moliaringumas - apytikriai 0,5. Pateikėjų atlikti eksperimentai parodė, kad esant tokioms sąlygoms, imobilizuoti antikūniai neinaktyvuojami. Tai prieštarauja aukščiau paminėtos patento paraiškos (Didžioji Britanija) (1 psl., 36-37 eilutės) doktrinai, skelbiančiai Eliuentu, turinčių tokias aukštas pH reikšmes, panaudojimas praktikoje neįmanomas, kadangi tai sukelia greitą antikūnių inaktyvaciją .

Šį skirtumą gali sąlygoti metodų, naudotų antikūnio surišimui su polimeru, skirtumai.

Pagal šį išradimą eliuento geresnis pH aukščiau 11, o geriausias yra intervale nuo 11,3 iki 11,7.

Moliaringumo reikšmė geresnė daugiau 0,8 ir geriausia apie 1.

Pagal išradimą tinkami eliuentai yra amoniakas, dietilaminas ir tokie buferiai kaip TRIS-buferis, glicinas-NaOH ir pan.

Sekanti atvirkščių fazių aukšto slėgio skysčių chromatografijos stadija leidžia pašalinti bet kurį iš priemaišinių baltymų. Imunovalymo stadijos vienos nepakanka tokiam išvalymui pasiekti, tai pripažįstama ir Didžiosios Britanijos patento paraiškos tekste. Panaudota papildoma aukščiau paminėta valymo stadija ne tik efektyviai išvalo preparatą nuo priemaišų pėdsakų, bet taip pat išsaugo pilną FSH aktyvumą. Pastarasis rezultatas yra visai netikėtas P. Chalino ir S.A. Chano straipsnio šviesoje (J. Liq. Chromat., 9/13, p, 28552868/1986), kuriame skelbiama, kad jaučio FSH ir žmogaus FSH (ZKG standartas) praranda biologinį aktyvumą skysčių chromatografijos su atvirkščiomis fazėmis metu. Kita vertus, tame pačiame straipsnyje parodomas patenkinamas biologinio aktyvumo atstatymas, tačiau pasiekiamas tik dalinis išvalymas, kuomet žmogaus šlapimo preparatas, turintis tiek FSH, tiek ir LH, valomas aukščiau nurodytu būdu.

Po atvirkščių fazių aukšto slėgio skystinės chromatografijos stadijos FSH atstatomas panaudojant gradiento metodikas. Produktą galima liofilizuoti saugojimo ir/arba manipuliavimo tikslu. Produkto koncentracijai, stabilizacijai ar kitam apdorojimui numatomos kitos tam tikslui tinkamos metodikos.

Be abejo, poklimaksinis šlapimas yra žymiai prieinamesnė medžiaga negu žmogaus hipofizis. Ši aplinkybė suteikia šiam išradimui ryškų privalumą.

FSH-specifinius monokloninius antikūnius, naudojamus pagal šį išradimą gavimo būdui, galima gauti panaudojant žinomas metodikas.

Tipišku atveju hibridomos 9/14 linijos ląstelės skrininguojamos optimalaus afiniškumo FSH atžvilgiu Kembridžo Universitete. Ląstelės kultivuojamos ir monokloniniai antikūnai produkuojami į supernatanto terpę, iš kurios jie išskiriami panaudojant 50% amonio sulfatą (skaičiuojant svorį tūriui). Po to naudojama atvirkščių fazių joninė chromatografija ir aukšto slėgio skystinė chromatografinė gel-filtracija ir dializė.

Ląstelių 9/14 linijos produkuojami ir nurodytu aukščiau būdu išvalyti monokloniniai antikūniai atitinka šiuos techninius reikalavimus:

a) baltymo švarumas ne mažiau 90%;

b) imunoglobulino klasė: IgG 1;

c) afiniškumo konstanta; 3,5 χ 10⁸ l.mol'¹;

d) specifiškumas:

Antigenas % kryžminės reakcijos

FSH 100

ChGH 1

ChGH-beta-subvienetas 1

LH 1

TSH 1

e) susijungimo su FSH tarptautinių vienetų FSH 1 geba tirpale: mg MoAK.

apie 1000

FSH-specifiniai monokloniniai antikūniai chemiškai surišami su Sefaroze 4B panaudojant divinilsulfoną pagal metodą, kuri, aprašė Dž. Poratas Methods in Enzymology: 34, p.13-30, 1974.

Tipiškame pavyzdyje 1 litras Sefarozės 4B praplaunamas porėtame stikliniame šviesofiltre iš pradžių 5 litrais distiliuoto vandens, o po to 5 litrais 1 M natrio karbohidrato tirpalo, pH 11. Išplauta sefarozė suspenduojama 1 litre 1 M natrio karbonato tirpalo (pH 11). Nuolat maišant, lašais pridedama 200 ml divinilsulfono. Reakcija pabaigiama per 70 min kambario temperatūroje ir nutraukiama pridedant 1 N HCI tirpalo (pH iki 7,0).

Aktyvuota smala suspenduojama 1 litre 0,25 M natrio bikarbonato tirpalo (pH 9,0), turinčio 2 g anti-FSH monokloninių antikūnių, gaunant didesnį negu 90% antikūnių susirišimą su aktyvuota derva. Gauta imunoderva saugoma 4°C temperatūroje.

pavyzdyje pateikiamos šio išradimo dvi valymo būdo stadijos, tinkamos komerciniam ZKH, t. y. Pergonalo® preparato (Serono) aktyviam ingradientui.

Reikia suprasti, kad nors ZKH yra geresnė išeitinė medžiaga šio išradimo būdui, tačiau visa tai tinka ir kitoms mažiau išvalytoms medžiagoms tokioms kaip poklimaksinio šlapimo koncentratai ir panašioms. Geri rezultatai gauti naudojant kaip išeitinę medžiagą šlapimo koncentratą, turintį tik 1 tarptautini vienetą FSH / 1 mg.

Kiti šio išradimo variantai ir privalumai bus akivaizdūs susipažinus su sekančiais pavyzdžiais, kuriais išradimas neapsiriboja.

n pavyzdys: Labai išvalyto šlapimo FSH gavima?

stadija: Imunovalymas panaudojant anti-FSH MoAK-DVS5 Sefarozę.

ZKG naudojamas kaip išeitinė medžiaga.

Imunoderva anti-FSH MoAK-DVS-Sefarozė inkubuojama su

0,1 M. Tris-HCl, 0,3 M NaCl buferyje, pH 7,54°C temperatūroje. Į kolonėlę įvedama tam tikrą SH kiekį tarptautiniais vienetais (RIA), atitinkantį 80-90% bendros FSH rišančios gebos.

Laisvi baltymai eliuojami buferiu tol, kol eliuato optinis tankis apie 280 nm (oD 280) nebus mažiau 0,02.

Absorbuotas šlapimo FSH eliuojamas iš imunodervos 1 M amoniako tirpalu 4°C temperatūroje. Amoniakiniai eliuatai, atitinkantys apytikriai 4- kartinį imunodervos tūrį, yra grupuojami, pH pasiekiamas iki 9,0 kaip galima greičiau 4°C temperatūroje pridedant ledinės acto rūgšties. Po to tirpalas ultrafiltruojamas Amikon aparate (membrana C.0.10000 daltonų) ir koncentruojamas iki mažo tūrio.

stadija. Atvirkščių fazių aukšto slėgio chromatografija

Gauto tirpalo pH privedamas iki 5,6, po to jis įvedamas į kolonėlę C18 su atvirkščiomis fazėmis (Pre Pak waters), kuri prieš tai buvo supusiausvyrinta 0,05 M buferiniu amonio acetato tirpalu kambario temperatūroje. Tirpiklio fronto judėjimo greitis - 100 ml/min. Eliuatas matuojamas ties 280 nm.

Valymui naudojamas aparatas Prep 500 A (Waters), turintis UV-detektorių ir preparatyvaus gradiento generatorių.

Biologiškai aktyvus labai išvalytas šlapimo FSH eliuojamas izopropanolio gradientu iki 50 % judrios fazės. Frakcijos tikrinamos panaudojant analitinę gelchromatografiją ir radioimunoanalizę.

Organinis tirpiklis pašalinamas distiliuojant vakuume 40°C temperatūroje. Po to tirpalas užšaldomas ir liofilizuojamas.

pavyzdys: FSH tyrimas

Pagal šį išradimą gautą labai išvalytą šlapimo FSH preparatą tiria keliais cheminiais-fiziniais, biologiniais ir imunologiniais metodais tam, kad gautų jo pilną charakteristiką. Kaip nurodyta žemiau, dauguma tyrimų atlikta lyginant su labai išvalytu FSH preparatu, išskirtu iš hipofizio, gautu pagal žemiau aprašytą metodą.

Išeitine medžiaga panaudotas neišvalytas žmogaus hipofizio ekstraktas, gautas kaip pašalinis produktas ekstrahuojant žmogaus augimo hormoną.

Metodika susideda iš sekančių stadijų:

1) Neišvalyto žmogaus hipofizio ekstrakto pirminis išvalymas ekstrahuojant 40% etanoliu, turinčiu 6% amonio acetato, pH 5,6, precipituojant supernatantą 96% šaltu etanoliu.

2) Tolimesnis valymas panaudojant joninę chromatografiją dietilaminoetilceliuliozėje su 0,15 M natrio acetato tirpalu, pH 7,0 kaip eliuentu, ir po to precipituojant 96% šaltu etanoliu.

3) FSH frakcijos tolimesnis valymas gel-filtracijos Sefadekse S 100 būdu, panaudojant kaip buferį 0,05 M amonio bikarbonatą.

4) FSH valymo paskutinė stadija, panaudojant joninę chromatografiją kolonėlėje SP Sefadeksas S 50. Labai išvalytas hipofizio FSH eliuojamas 0,1 M fosfatiniu buferiniu tirpalu pH 6,2 ir po to liofilizuojamas.

Kaip buvo nustatyta, hipofizio FSH biologinis santykinis aktyvumas in vivo (Stilmano-Rolei testas; tarptautinis vienetas antrojo IRP-NMS) sudaro 4770 tarptautinių FSH vienetų 1 mg liofilizuotų miltelių. Šiam nustatymui naudota metodika, aprašyta žemiau po antrašte Biologinio aktyvumo kiekybinis nustatymas.

Atliekami sekantys tyrimai:

Kontaminacija LH

Šis testas atliekamas panaudojant specifinę LH (liuteinizuojantis hormonas) radioimunoanalizę su LH standarto pagalba graduoto pagal antrąjį IRP-ZKH P¹²⁵fLH kaip žymėtą atomą, naudojant trigubą KIT (kodas 10204, pagamintą Biodata® kompanijos. Kaip antiserumas naudotas ožkos anti-ChGH (žmogaus choriono, gonadotropinas) antiserumas, kurį gavo pareiškėjas. Šis antiserumas rodė 100 % kryžminę reakciją su LH ir mažiau negu 0,1 % su FSH.

Radioimunoanalizės metodas būtinas patikrinant, ar gautas pagal 1 pavyzdį labai išvalytas šlapimo FSH nėra užterštas liuteinizuojančiu hormonu.

Aukščiau pateikti rezultatai patvirtinti panaudojant kitą jautresnį metodą DELFIA (disociacija-pagerinta lautanid-fluoro-imunoanalizė), kuriam įrangą pateikia firma LKB-Farmacija.

Elektroforezė poliakrilamido gelyje su natrio dodecilsulfatu

Blokinė elektroforezė plokščiame gelyje su natrio dodecilsulfatu vykdoma redukcinėmis sąlygomis 13,5 % poliakrilamido gelyje, pH 8,8 pagal metodą aprašytą Lemli žurnale Nature, 227, p.680-685 (1970).

Dažoma briliantiniu Kumasi mėliu R-250, 0,25 % 25 % metanolio /75 % acto rūgšties.

Šiuo metodu tiriamas tiek labai išvalyto FSH preparatas, gautas pagal šį išradimą, tiek ir labai išvalytas hipofizio FSH, gautas kaip aprašyta aukščiau. Bandymo rezultatai parodyti Fig. 1, kur parodytos tiek šlapimo, tiek hipofizio FSH preparatų juostos drauge su molekulinės masės markeriais (M.M.).

Abiejuose FSH preparatuose pagrindinė didžioji juosta, būdinga glikoproteidams, sutinkama vienos ir tos pačios molekulės masės, apytikriai 20000 daltonų, kas atitinka literatūrinius duomenis. Dėl žinomo glikoproteidų elgesio šios elektroforezės sąlygomis gautas dydis yra šiek tiek didesnis nei iš tikrųjų.

Mainų chromatografija

Labai išvalyti preparatai, išskirti iš šlapimo ir iš hipofizio, analizuojami kolonėlėje TKG 2000 SW naudojant 0,1 M buferinį fosfatinį tirpalą, pH 6,8 +

0,2 M NaCl kaip eliuentą. Tirpiklio fronto judėjimo greitis 0,7 ml/min, matuojama ties 230 nm.

Fig. 2 pateikiami duomenys, kurie rodo įprastus pagrindinius šlapimo ir hipofizio FSH pi\us, kurių laikai panašūs (atitinkamai 13,37 ir 13,35 min).

Izoelektrofokusavimas

Izoelektrofokusavimas atliekamas 5 % plonasluoksniame poliakrilamidiniame gelyje (Anfolin, LKB®, pH 3,5-9,5), fiksuojama 11,5 % (masės) trichloracto rūgštimi ir 3,5 % (masės) sulfosalicilo rūgštimi, dažoma sidabru iŠ BIO-RED? rinkinio.

Fig. 3 pateikti duomenys apie labai išvalytus FSH preparatus, išskirtus iš šlapimo ir hipofizio, įskaitant ir izoelektrinio taško markerius. Kaip matyti iš paveikslėlio, abu preparatai rodo keletą juostų, tačiau jų piešinys skiriasi. Šlapimo FSH pagrindinės juostos yra pH intervale mažiau kaip 4,8, kai tuo tarpu hipofizio FSH pagrindinės juostos pasireiškia aukštesniame pH intervale.

Šie bandymai rodo, kad šlapimo ir hipofizio FSH nėra identiškos molekulės ir kad jų skirtumus sąlygoja angliavandenilių, o gal ir pačių baltyminių dalių skirtumai.

Biologinio aktyvumo kiekybinis nustatymas

Labai išvalyto šlapimo FSH preparato biologini aktyvumą in vivo nustato Stilmano- Rolėj metodu (Endokrinologija, 53, p.604-616, 1953) naudodami kaip etaloną ZKH-Haus etaloną pagal 2-ąj i Tarptautinį Etaloninį Preparatą ZKH, skirtą biologinio aktyvumo kiekybiniam nustatymui. Šią analizę priėmė visos pagrindinės Farmakopėjos ir Tarptautinių Vienetų nustatymo Sveikatos apsaugos Tarnybos FSH biologinio aktyvumo nustatymui.

Nustatyta, kad labai išvalytas šlapimo FSH preparatas, gautas pagal aukščiau pateiktą pavyzdį, pasižymi santykiniu aktyvumu lygiu 6200 T.V. FSH / 1 mg liofilizuotų miltelių, tai didžiausias kada nors aprašytas iš šlapimo išskirto FSH aktyvumas.

Aminorūgščių sekos nustatymas

a) Šlapimo FSH subvienetų išskyrimas

Šlapimo FSH subvienetai išskiriami panaudojant aukšto slėgio skysčių chromatografijos sistemą Waters, turinčią kolonėlę Akvapor RP-300, 200 x 4,6 mm, 7 ųm (Braunli Lebs). Eliuentai sekantys: A=0,l % TFA (trifluoracto rūgštis, Iners), B=0,055% TFA acetonitrile. Tirpiklio fronto judėjimo greitis - 1 ml/min prie 35°C. Pradinis režimas - 15 %. B per 20 min gradientas padidinamas 40% B. UV-detektorius dirba ties 229 nm. Įvedama analizinė serija - 20 μ 0,5 mg/ml FSH tirpalo ir 0,5 % TFA. Pradinė inkubacija TFA tirpale nebūtina. Preparatyviai išskiriama toje pačioje kolonėlėje. Gaunama gera skiriamoji geba, kuomet Įvedama 0,5 mg labai išvalyto žmogaus šlapimo FSH (serija Nr. 032), ištirpinto A buferyje. Frakcijos renkamos rankiniu būdu ir džiovinamos koncentratoriuje Spid. Vak. Subvienetai ištirpinami vandenyje, analizuojami aukšto slėgio skysčių chromatografija ir saugomi minus 20°C temperatūroje.

Beta-subvienetas eliuojamas apytikriai po 10,5 min kaip platus pikas, alfa-subvienetas eliuojamas per 15 min kaip smailus pikas. Kiekvienas pikas identifikuojamas kaip alfa- ir beta-subvienetas radioimuninės analizės būdu. Paprastai redukuojama apie 50% subvieneto, kai tuo tarpu alfa-subvieneto redukuojama daugiau kaip 90%.

b) Alfa- ir beta-subvienetų redukavimas ir karboksimetilinimas

Išskirtų, kaip aprašyta a) dalyje, subvienetų redukavimas atliekamas panaudojant 0,5 % Tris, 0,1 % EDTA, 6 M guanidin-HCl, pH 8,5 2 vai bėgyje 37°C temperatūroje pridėjus DTT (ditiotreitolio, Servą) 15kartų didesniu moliaringumu negu cisteino. Po to į reakcijos mišinį pridedama natrio jodacetato (2,1 moliaringumo negu DTT) ir paliekama 30 min tamsoje. Reakcija sustabdoma pridėjus 1% merkaptoetanolio ir TFA. Karboksimetilintus subvienetus valo aukšto slėgio skysčių chromatografija. Beta-karboksimetilintas subvienetas blogai tirpsta vandenyje, todėl galutinė išeiga nereikšminga.

c) Beta-subvieneto redukavimas, piridiletilinimas ir poveikis tripsinu.

Išskirto kaip aprašyta a) dalyje, beta-subvieneto redukavimas atliekamas kambario temperatūroje 2 vai bėgyje šiuo būdu: 0,1 mg beta-subvieneto inkubuojama su 0,5 ml 0,5 M Tris tirpalo, 0,1 % EDTA, 6 M guanidinHCl, pH 8,5, 2,7 mg ditiotreitolio. Piridiletilinama pridėjus 0,02 ml 4-vinilpiridino prie aukščiau paminėto tirpalo. Reakcija vyksta 2 vai kambario temperatūroje. Pagaliau, reakcijos mišinys patalpinamas į S4-patroną (Beiker), su 0,1 % TFA. Patronas praplaunamas 0,1 % TFA ir piridiletilintas beta-subvienetas eliuojamas 40% acetonitrilu, 0,1 % TFA. Eliuotas frakcijos džiovinamos ir valomos aukšto slėgio skysčių chromatografija kaip tai aprašyta aukščiau. Išvalytas piridiletilintas betasubvienetas ištirpinamas 1 % NH4HCO3 tirpale, pH 8.

d) Alfa-subvieneto sekvenavimas

Alfa-subvieneto, karboksimetilinto alfa-subvieneto arba viso labai išvalyto šlapimo FSH sekvenavimas (aminorūgščių liekanų sekos nustatymas) atliekamas panaudojant 5 nmolius ar mažiau į baltymini sekvenseri, (470 A, Eplaid Biosistem) ir panaudojant standartinę programą 03PRTH, pateiktą Eplaid Biosistem, arba specialią programą, kurioje ciklai, skaldantys P o arba Cly, pakeisti specialiu ciklu 03CPPO. Pradedant nuo molekulės NH2 galo identifikuojama pirmos 45 liekanos, šie rezultatai patvirtina seką,žinomą iš literatūros (J. Biol. Chem., 250, p. 6735/1975). Asn 52 padėtyje ir 78 padėtyje žinomoje sekoje prasidedančioje Ala, ir yra tos aminorūgštys, kur vyksta glikozilinimas. NH2 gale visada yra nevienodumas ir jis visada toks pats visuose sekvenuotuose mėginiuose. Visa molekulė (t.y. prasidedanti Ala) būna 65 % grandinių, molekulė, neturinti pirmųjų dviejų aminorūgščių (t.y. prasidedanti Asp), pasitaiko 5% molekulių, o neturinti pirmųjų trijų aminorūgščių (t.y. prasidedanti Vai) pasitaiko 30% atvejų.

	1			5
65%	grandinių Ala	Pro Asp	Vai	Glu...
5%	grandinių	Asp	Vai	Glu...
30%	grandinių		Vai	Glu·.

Alfa-subvieneto nevienodumas

e) Beta-subvieneto sekvenavimas

Atliekamos kelios sekvenavimo serijos, panaudojant beta-subvienetus, karboksimetilintus beta-subvienetus, visą labai išvalytą žmogaus šlapimo FSH ir piridiletilinto beta-subvieneto tripsinizuotus peptidus. Mėginiai sudedami į baltymų sekvenseri (470 A9 Eplaid Biosistem) ir panaudojama programa 03PPTH, pateikta Eplaid Biosistem. Duomenys rodo kad šis subvienetas turi 111 aminorūgščių ilgį ir sekančią seką:

Asn

Ser

Cys

Glu

Leu

Thr

Asn

10 Ile

Thr

Ile

Ala

Ile

Glu

Lys

Glu

Cys

Arg

Phe

20 Cys

Ile

Ser

Ile

Asn

Thr

Trp

Cys

Ala

30 Gly

Tyr

Cys

Tyr

Thr

Arg

Asp

Leu

Vai

Tyr

40 Lys

Asp

Pro

Ala

Arg

Pro

Lys

Ile

Gln

Lys

50 Thr

Cys

Thr

Phe

Lys

Glu

Leu

Vai

Tyr

Glu

60 Thr

Vai

Arg

Vai

Pro

Gly

Thr

Asp

Cys

Thr

Vai

Arg

Gly

Leu

100 Gly

Pro

Ser

Tyr

Cys

Ser

Phe

Gly

Glu

Met

no Lys

Glu

Asn 7 ir 24 padėtyje, pradedant nuo Asn 1 padėtyje, yra tos aminorūgštys, kur vyksta glikozilinimas.

Beta-subvieneto NH2 gale visada vienodas visuose sekvenuotuose molekulė (t.y. prasidedanti nuo grandinių, molekulė, neturinti nevienodumas, kuris mėginiuose. Pilna

Asn) pasitaiko 35% pirmos aminorūgšties (t.y. prasidedanti Ser) pasitaiko 15%, o molekulė, neturinti pirmųjų dviejų aminorūgščių (t.y. prasidedanti Cys) pasitaiko 50%.

5

35%	undinių,, Asn	Ser Cys’·’	Glu	‘^eu...
15%	grandinių	Ser Cys	Glu	Leu...
30%	grandinių		Glu	Leu...

Beta-subvieneto nevienodumas pavyzdys: Vaistiniai preparatai

Farmacinių vaisto formų, turinčių labai išvalytą šlapimo FSH, gautą pagal šį išradimą, gavimas nesudaro sunkumų. Kadangi medžiaga išlaiko savo biologinį aktyvumą po liofilizacijos, pastaroji talkina gaunant formą, tinkamą injekuojamiems preparatams.

Liofilizuotas preparatas, turintis labai išvalytą šlapimo FSH, tirpinamas fiziologiniame tirpale ir/ar kitokiame tinkamame skiediklyje ir gaunamas švirkščiamas tirpalas.

Kai kurie užpildai gali būti panaudoti kompozicijoje kaip jos dalis, pavyzdžiui, manitas, laktozė, glicinas, gliukozė, sacharozė ir jų mišiniai. Galima naudoti ir kitus tradicinius užpildus ar jų mišinius.

Bandymuose, atliktuose pagal išradimą, švirkščiamiems preparatams kaip užpildas panaudota laktozė.

Gaminant injekcinius preparatus, pasirinktinai gali keisti pH iki tam tikros reikšmės, pridedant tradicinių rūgštinių ar šarminių medžiagų. Kaip rūgštinė medžiaga gali būti naudojama acto rūgštis ir pan. Iš šarminių medžiagų naudojamas natrio šarmas ir pan. Galima naudoti mišinius.

Šio išradimo rėmuose galima panaudoti vieną ar daugiau stabilizatorių, pavyzdžiui, albuminą ir pan.

20000 ampulių, kurių kiekviena turi 75 tarptautinių vienetų FSH, partijos vaistų gamybos pavyzdys atrodo sekančiai:

Liofilizuotų FSH miltelių paskaičiuotas kiekis (biologinio aktyvumo vienetais) ištirpinamas 700 ml Šalto apirogeninio vandens, skirto injekcijoms. Jeigu reikalinga, pH pasiekiamas intervale nuo 6,2, iki 6,8 tam tikslui panaudojant acto rūgštį ar natrio šarmą. Po to tirpalas sterilinamas filtruojant per filtrą, kurio poros 0,2 pm dydžio.

200 g laktozės ištirpinama 2 litruose apirogeninio vandens, skirto injekcijoms, sterilizuoja kaip aprašyta aukščiau ir prideda prie FSH tirpalo.

Apirogeninis vanduo injekcijoms pridedamas tam, kad būtų pasiektas galutinis 15 litrų tūris. Po to tirpalas išpilstomas į ampules (po 0,75 ml kiekviena) ir liofilizuojama steriliame liofilizatoriuje. Gaunamos ampulės, kurių kiekviena turi po 75 tarptautinius vienetus FSH ir 10 mg laktozės.

Geresniame variante kiekviena ampulė gali turėti 150 tarptautinių vienetų FSH ir 10 mg laktozės.

Pagal kitą vaistinio preparato pavyzdį gaunamos ampulės, turinčios be laktozės kaip užpildo dar po 1 mg albumino kaip stabilizatoriaus.

Nors šis išradimas iliustruojamas specifiniais pavyzdžiais reikia suprasti, kad įvairūs variantai gali būti papildomai realizuoti šio išradimo apimties ir esmės ribose.

Claims

1. Baltymas, turintis alfa- ir beta-subvienetus, kurio alfa-subvienetas yra gonadotropino alfa-subvienetas ir beta-subvienetas turi sekančią aminorūgščių seką:

Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu Ala 20 Asn Thr Thr Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Trp 40 Cys 30 Cys Tyr Gly Tyr Thr Arg Asp Leu 50 Vai Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys Thr cys Thr 60 Phe Lys Glu Leu Vai Tyr Glu Thr Vai Arg Vai Pro Gly 70 Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Vai 80 90 Ala Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser 100 Thr Asp Cys Thr Vai Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys 110 Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu 2. Baltymas pagal 1 punktą, b e s i s k i r i a n t i s tuo, kad 1 turi beta-subvienetą, susidedantį iš 110

aminorūgščių ir turintį jų seką, nustatytą pagal 1 punktą, tačiau be pradinio Asn (1 padėtis).

3. Baltymas pagal 2 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi beta-subvienetą, susidedantį iš 109 aminorūgščių ir turintį jų seką, nustatytą pagal 1 punktą, tačiau be pradinių Asn ir Ser (2 padėtis).

4. Baltymas pagal 1 punktą, besiskiriantis tuo, kad gonadotropino alfa-subvienetas turi sekančią aminorūgščių seką:

Ala Pro Asp Vai Gln Asp Cys Pro Glu 10 Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser 20 Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met 30 Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr 40 Pro Ley Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Vai 50 Gln Lys Asn Vai Thr Ser Glu Ser Thr Cys 60 Cys Vai Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Vai Thr 70 Vai Met Gly Gly Phe Lys Vai Glu Asn His 80 Thr Ala cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr 90 His Lys Ser Asp Cys Thr Vai Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys

5. Baltymas pagal bet kurį iš 1-4 punktų, besiskiriantis tuo, kad turi alfa-subvienetą, susidedanti iš 90 aminorūgščių ir turintį jų seką, nustatytą pagal 4 punktą, tačiau be pradinių Ala ir Pro (2 padėtis).

6. Baltymas pagal bet kurį iš 1-5 punktų, besiskiriantis tuo, kad turi alfa-subvienetą, susidedantį iš 89 aminorūgščių ir turinti jų seką, nustatytą‘'pagal^^unktą, tačiau £>e pradinių Ala ir Pro (2 padėtis) ir Asp (3 padėtis).

7. Baltymas pagal bet kurį iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad yra glikozilintoje formoje.

8. Baltymas pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad glikozilinami beta-subvieneto (betasubvienetų) Asn 7 ir 24 padėtyse ir alfa-subvieneto (alfa-subvienetų) Asn 52 ir 78 padėtyse.

9. Baltymas pagal 7 punktą, besiskiriantis tuo, kad pasižymi folikulus stimuliuojančio hormono (FSH) aktyvumu.

10. Baltymas pagal bet kurį iš 1-6 punktų, besiskiriantis tuo, kad neturi liuteinizuojančio hormono ir kitų šlapimo baltymų priemaišų pėdsakų.

11. Baltymas pagal 10 punktą, besiskiriantis tuo, kad jį ekstrahuoja iš žmogaus klimaksinio šlapimo.

12. Biologiškai aktyvus iš šlapimo išskirtas folikulus stimuliuojantis hormonas, neturintis liuteinizuojančio hormono ir kitų šlapimo baltymų priemaišų pėdsakų.

13. Biologiškai aktyvus hormonas pagal 12 punktą, b esiskiriantis tuo, kad turi gonadotropino alfa-subvienetą ir beta-subvienetą, kurio aminorugščių seka apibrėžta 1 punkte.

14. Baltymas pagal 9 ar 12 punktus, besiskiriantis tuo, kad pasižymi santykiniu aktyvumu, ne mažesniu kaip 6200 tarptautinių vienetų FSH 1 mg liofilizuotų miltelių.

15. Baltymo pagal bet kurį iš 1-14 punktų gavimo būdas, besiskiriantis tuo, kad poklimaksinio šlapimo koncentratą valo imuniniu būdu, panaudojant specifinius FSH imobilizuotus monokloninius antikūnus, po to eliuoja FSH, iš kurio išvalo bet kokius pėdsakinius priemaišų kiekius tam tikslui panaudojant atvirkščių fazių aukšto slėgio skysčių chromatografiją.

16. Būdas pagal 15 punktą, besiskiriantis 5 tuo, kad išeitine medžiaga panaudojamas žmogaus klimaksinis gonadotropinas.

17. Būdas pagal 15 arba 16 punktą, besiskiriantis tuo, kad iš imunokomplekso eliminuojant FSH

10 kaip eliuentą panaudoja vandeninį tirpalą, kurio pH aukštesnis negu 10, ir moliaringumas aukštesnis negu 0,5.

18. Būdas pagal 17 punktą, besiskiriantis

15 tuo, kad eliuento pH yra nuo 11,3 iki 11,7 ir moliaringumas apie 1.

19. Būdas pagal 18 punktą, besiskiriantis tuo, kad eliuentas yra 1M amoniakas.

20. Vaistinis preparatas, besiskiriantis tuo, kad turi baltymo pagal bet kurį iš 1-14 punktų terapiškai efektyvų kiekį.

25

21. Vaistinis preparatas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi tinkamą užpildą.

22. Vaistinis preparatas pagal 21 punktą, besiskiriantis tuo, kad užpildas yra laktozė.

23. Vaistinis preparatas pagal bet kurį iš 20-22 punktų, besiskirian-tis tuo, kad yra liofilizuotoje injekcijoms skirtoje formoje.

35

24. Vaistinis preparatas pagal bet kurį iš 20-23 punktų, besiskiriantis tuo, kad skirtas poodiniam įšvirkštimui.

25. Vaistinis preparatas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi 75 tarptautinius vienetus FSH ampulėje.

26. Vaistinis preparatas pagal 20 punktą, besiskiriantis tuo, kad turi 150 tarptautinius vienetus FSH ampulėje.

10

27. Vaistinis preparatas pagal bet kurį iš 20-26 punktu, besiskiriantis tuo, kad turi žmogaus albuminą kaip stabilizatorių.

28. Baltymo pagal bet kurį iš 1-14 punktų panaudojimas vaistinio preparato pagal 20 punktą gamybai.