RU2105012C1 - Очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг), фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической композиции - Google Patents
Очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг), фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической композиции Download PDFInfo
- Publication number
- RU2105012C1 RU2105012C1 SU4743338/13A SU4743338A RU2105012C1 RU 2105012 C1 RU2105012 C1 RU 2105012C1 SU 4743338/13 A SU4743338/13 A SU 4743338/13A SU 4743338 A SU4743338 A SU 4743338A RU 2105012 C1 RU2105012 C1 RU 2105012C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- fsh
- subunit
- pharmaceutical composition
- urinary
- hormone
- Prior art date
Links
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 title claims abstract description 106
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 title claims abstract description 106
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 title claims abstract description 106
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 8
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 15
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims abstract description 8
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims abstract description 7
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 claims abstract description 6
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 claims abstract description 6
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims abstract description 6
- 239000008176 lyophilized powder Substances 0.000 claims abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 7
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 7
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 3
- 239000003708 ampul Substances 0.000 claims description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 6
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 16
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 14
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 7
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 7
- 108010057021 Menotropins Proteins 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 5
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZDRRIRUAESZNIH-BZGUUIOASA-N (2s)-1-[(4r,7s,10s,13s,16s,19r)-19-amino-7-(2-amino-2-oxoethyl)-13-[(2s)-butan-2-yl]-10-[(1r)-1-hydroxyethyl]-16-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-6,9,12,15,18-pentaoxo-1,2-dithia-5,8,11,14,17-pentazacycloicosane-4-carbonyl]-n-[(2s)-1-[(2-amino-2-oxoethyl)amino]- Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)[C@@H](C)O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZDRRIRUAESZNIH-BZGUUIOASA-N 0.000 description 2
- JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 2-(4-fluorophenyl)-1,3-dioxoisoindole-5-carboxylic acid Chemical compound O=C1C2=CC(C(=O)O)=CC=C2C(=O)N1C1=CC=C(F)C=C1 JVIPLYCGEZUBIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 229920001425 Diethylaminoethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 2
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 108010047196 Urofollitropin Proteins 0.000 description 2
- 206010062662 Uterine mass Diseases 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N divinyl sulfone Chemical compound C=CS(=O)(=O)C=C AFOSIXZFDONLBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 229940094892 gonadotropins Drugs 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003317 immunochromatography Methods 0.000 description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 2
- WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 2-[[6-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]-2-methylpyrimidin-4-yl]amino]-n-(2-methyl-6-sulfanylphenyl)-1,3-thiazole-5-carboxamide;hydrate Chemical compound O.C=1C(N2CCN(CCO)CC2)=NC(C)=NC=1NC(S1)=NC=C1C(=O)NC1=C(C)C=CC=C1S WXHLLJAMBQLULT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 4-ethenylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=NC=C1 KFDVPJUYSDEJTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 1
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 208000007984 Female Infertility Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000015872 Human beta Subunit Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010010590 Human beta Subunit Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010021928 Infertility female Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 102000035824 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010081485 beta Subunit Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- BJQHLKABXJIVAM-UHFFFAOYSA-N bis(2-ethylhexyl) phthalate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCC(CC)CCCC BJQHLKABXJIVAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 230000035071 co-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000012050 conventional carrier Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229910003460 diamond Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 1
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 230000006408 female gonad development Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M sodium;2-iodoacetate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)CI AGDSCTQQXMDDCV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- -1 starting with Cys ) Chemical class 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005292 vacuum distillation Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/02—Drugs for disorders of the urinary system of urine or of the urinary tract, e.g. urine acidifiers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
- A61P15/08—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives for gonadal disorders or for enhancing fertility, e.g. inducers of ovulation or of spermatogenesis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/26—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against hormones ; against hormone releasing or inhibiting factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S930/00—Peptide or protein sequence
- Y10S930/01—Peptide or protein sequence
- Y10S930/11—Gonadotropin; related peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Crystals, And After-Treatments Of Crystals (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), имеющий α-субъединицу гонадотропина и β-субъединицу из 111 аминокислот, выделен из климактерической мочи. ФСГ свободен от лютеинирующего гормона, имеет активность не менее 6200 международных единиц ФСГ на мг лиофилизиpованного порошка, гликозилирован. Выделенный ФСГ использован в фармацевтической композиции, пригодной для подкожного введения. 3 с. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 1 ил.
Description
Настоящее изобретение относится к мочевому фолликулостимулирующему гормону и фармацевтической композиции, содержащей его.
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), как известно, применяется при лечении бесплодия. Препараты, содержащие данный гормон, используются для поддержания беременности с использованием методик in vivo и in vitro. Человеческий ФСГ выделен из гипофиза и постклимактерической мочи человека. Совсем недавно ФСГ получен методом рекомбинантной ДНК.
Первые коммерчески доступные препараты, включающие человеческий ФСГ (например, Пергонал(R) Сероно), содержали ЧМГ, то есть человеческий менопаузный гонадотропин, представляющий собой смесь ФСГ, лютеинизирующего гормона (ЛГ) и других мочевых белков. Между тем были сделаны попытки получить чистые ФСГ-препараты как для научных, так и для терапевтических целей. Продукт Метродин(R) (Сероно), в настоящее время имеющийся в продаже, представляет собой препарат мочевого ФСГ, содержащий другие мочевые белки, однако минимальные количества ЛГ, и используется для лечения бесплодия. Применение данного продукта особенно благоприятно, когда нежелательно вводить экзогенный ЛГ вместе с ФСГ, например, при синдроме поликистоза яичников (СПЯ).
До сих пор введение ФСГ для терапевтических целей осуществляли, и успешно, исключительно путем внутримышечной инъекции. Поскольку внутримышечные инъекции, как правило, осуществляют врачи или люди из числа профессиональных медиков, пациенту приходится регулярно посещать хирургический кабинет или больницу. Это означает значительное неудобство. Кроме того, время, необходимое для осуществления данного типа введения лекарственных веществ, обычно растягивается на несколько недель или даже месяцев.
Введение путем подкожной инъекции могло бы обеспечить возможность самовведения препарат пациентом.
Подкожное введение человеческого менопаузного гонадотропина (ЧМГ) уже было описано (Nakamura Y. et al., Fertility and Sterility 46 (1), стр. 46-54, 1985) в связи с лечением женского бесплодия путем пульсирующего введения его подкожным перистальтическим насосом. Подкожное введение ЧМТ может иметь такой недостаток, как местная аллергия, вызываемая примесями в используемом продукте.
P. Roos (Acta Endocrinologica Supplementum, 131, 1968) описал и охарактеризовал высокоочищенные препараты гипофизарных и мочевых ФСГ, полученные из замороженных гипофизов и из постклимактерического мочевого концентрата, соответственно. Биологические активности составляют около 14000 международных единиц активности на мг для гипофизарного ФСГ и 780 международных единиц активности на мг мочевого ФСГ. Содержание примесей ЛГ в большинстве активных гипофизарных и мочевых препаратов соответствует приблизительно 0,1% по массе. Методики очистки включают один или более таких способов, как хроматография на диэтиламиноэтилцеллюлозе, гель-фильтрация на Сефадекс G-100, гидроксилапатитовая хроматография, электрофорез в полиакриламидном геле и подобное.
Один из наиболее очищенных препаратов ФСГ был описан Donini et al. (in: Gonadotrophins and Ovarian Development, Proceeding of two workshop meetings, Edinburg and London, 1970) и имел биологическую активность 1255,6 международных единиц ФСГ на мг при контаминации ЛГ до 3,2 международных единиц ЛГ на мг. В данном случае исходным материалом являлся человеческий климактерический гонадотропин (ЧКГ) в виде препарата Пергонал(R), который, как указано выше, представляет собой смесь ФСГ и ЛГ, а также других мочевых белков. Этот результат был получен путем повторных очисток на DEAE-целлюлозе, последующей гель-фильтрации на сефадексе G-100 и препаративного гель- электрофореза.
Даже более высокие активности были получены H. Van Hell et al. (Gonadotropins. Proceedings of Int. I Symposium on Gonadotropins, 1971, New York) путем введения дополнительных стадий иммунохроматографии и гель-фильтрации в традиционный метод хроматографической очистки (ближайший аналог). Имуннохроматографию осуществляли с использованием "анти-хорионический гонадотропин человека (анти-ХГЧ)"-антител, связанных с Сефарозой для направленного удаления ЛГ из частично очищенных фракций ФСГ. Наиболее очищенная фракция ФСГ содержала 4720 международных единиц ФСГ на мг, а контаминация ЛГ составила всего 15 международных единиц ЛГ на мг (при испытании радиоиммуноанализом).
Иммунохроматографический подход уже описан Donini et al. (Acta Endocrinologica, 52, стр. 186-198, 1966), которые еще в 1966 году получили препарат ФСГ, имеющий активность 329,7 международных единиц ФСГ на мг и необнаруживаемые биологически количества примесного ЛГ. В другом эксперименте были получены фракции ФСГ с активностью 148,3 международных единиц ФСГ на мг и 2,4 международных единиц ЛГ на мг. Поскольку радиоиммунологического исследования препарата с активностью 329,7 международных единиц ФСГ на мг проведено не было, по аналогии с результатами H. Van Hell (см. выше) можно предположить, что имеются следовые количества ЛГ.
Физиологическая релевантность даже минимальных количеств примесей ЛГ была показана Donini et al. (Acta Endocrinologica, 58, стр. 463-472, 1968), где предложено новое количественное определение биологической активности ЛГ, состоящее во введении антиктным незрелым мышам постоянной дозы биологически чистого препарата ФСГ при возрастающих количествах ЛГ с последующим изменением повышения массы матки как ответа, пропорционального активности ЛГ. При данном методе всего 0,068 международных единиц ЛГ способны увеличивать массу матки при введении вместе с ФСГ в количестве 4,44 международных единиц.
Поэтому очевидно, что для лечения, требующего активности ФСГ при полном отсутствии активности ЛГ, желательно иметь абсолютно чистый препарат ФСГ.
Как упомянуто выше, поставляемый в настоящее время на рынок продукт Метродин(R) (Сероно) представляет собой очищенный препарат ФСГ, который получен методом, по существу, идентичным тому, который описан Donini et al. (Acta Endocrinologica, 52, стр. 186-198, 1966), и, следовательно, содержит примерно 0,7 международных единиц ЛГ на 75 международных единиц ФСГ, тогда как в некоторых терапевтических применениях желательно абсолютное отсутствие ЛГ. Кроме того, в Метродине(R) человеческий ФСГ загрязнен значительными количества других мочевых белков.
Заявка на патент Великобритании N 2173803 A предлагает еще один подход к очистке гипофизарных гликопротеидных гормонов, в том числе и ФСГ. Этот подход состоит в образовании комплекса гормона с иммобилизованными моноклональными антителами с последующим элюированием гормона кислотным водным буфером, имеющим pH от 3 до 4. Что касается ФСГ, то полученный высокоочищенный гормон все же загрязнен (0,1 мас.%) ЛГ и (0,5 мас.%) тиреостимулирующим гормоном (ТСГ).
Scott C. Chappel et al. описали в обзорной статье (Endocrine Reviews, 4/2/, стр. 179-211, 1983) микронеоднородность ФСГ и физиологическую природу углеводородных частей, сопровождающих молекулу ФСГ. Можно предположить, что некоторые модификации осуществляются в процессе метаболизма вплоть до конечной мочевой секреции, что может быть связано с химико-физическими различиями, продемонстрированными в экспериментах, проведенных заявителем, между высокоочищенным препаратом мочевого ФСГ (вомФСГ) в соответствии с настоящим изобретением и высокоочищенным препаратом гипофизарного ФСГ, использованным для целей сравнения.
Ко- или пост-трансляционные модификации, по-видимому, лежат в основе микрогетерогенного разнообразия ФСГ-гликопротеида, состоящего из двух различных, гликозилированных, не ковалентно связанных полипептидных цепей, известных как альфа и бета-субъединица. Бета-субъединица наделяет молекулу ее биологической специфичностью.
Следует отметить, что хотя и гипофизарный, и мочевой гормоны называются ФСГ, еще не получено неопровержимого доказательства того, что молекулы, выделенные из этих двух источников, являются одинаковыми или химически эквивалентными.
Настоящим изобретением показано, что человеческий ФСГ может быть выделен из концентрата постклимактерической мочи с такой степенью чистоты, что является совершенно свободным даже от следовых количеств ЛГ и других мочевых белков. Кроме того, аминокислотный анализ мочевого ФСГ в соответствии с настоящим изобретением выявил новую бета-субъединицу ФСГ из 111 аминокислот вместо 118 или 108, как следует из уровня техники (см., например, Scott C. Chappel et al., выше) для известной бета-субъединицы ФСГ.
Аминокислотная последовательность β-субъединицы имеет следующий вид:
.
Таким образом, настоящее изобретение предлагает новый белок, содержащий альфа-субъединицу гонадотропина и бета-субъединицу с последовательностью из 111 аминокислот, приведенной выше. Белок имеет биологическую активность фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Предпочтительно, он находится в гликозилированной форме.
Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая очищенный ФСГ по изобретению и фармацевтически приемлемый наполнитель.
Наиболее предпочтительным является нахождение предлагаемой композиции в форме, пригодной для подкожного введения. Обнаружено, что подкожное введение фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением не приводит к возникновению тех аллергических реакций, которые обычно сопровождают применение известных препаратов ФСГ.
В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения предлагается способ получения нового и высокоочищенного ФСГ в соответствии с настоящим изобретением. Способ получения ФСГ по изобретению в основном базируется на комбинации стадии иммуноочистки с жидкостной хроматографией высокого давления с обращенной фазой. Стадия иммуноочистки использует иммобилизованные моноклональные антитела, как это описано в вышеупомянутой заявке на патент Великобритании N 2173803A, однако имеет фундаментальное отличие, заключающееся в том, что элюирование ФСГ из иммунокомплекса осуществляют при более высоких значениях pH. В частности, элюирование удобно осуществлять с использованием водного раствора, имеющего pH выше 10 и молярность выше 0,5. Эксперименты, проведенные заявителем, показали, что при таких условиях иммобилизованное антитело почти не инактивируется. Это не согласуется с положением, высказанным в заявке на патент Великобритании, согласно которой (на стр. 1, строки 36-37) "использование элюентов, имеющих такие высокие значения pH, не представляется возможным на практике, поскольку это ведет к быстрой инактивации антитела".
Установленное различие может зависеть от различий в методах, применяемых для связывания антитела с полимером.
Согласно настоящему изобретению предпочтительным для элюирования является интервал от 11,3 до 11,7.
Наиболее пригодными элюэнтами являются аммиак, диэтиламин и такие буферы, как ТРИС-буфер, глицин - NaOH и подобные им, с полярностью, превышающей 0,8, предпочтительно около 1.
Последующая стадия жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой (ЖХВД) позволяет достичь полного удаления любых загрязняющих белков, которого не удается добиться только стадией иммуноочистки. То, что стадия ЖХВД не только эффективно удаляет следовые количества загрязняющих белков, но сохраняет при этом полную биологическую активность ФСГ, является неожиданностью в свете статьи, написанной P. Hablin and S.A. Khan (J. Lig. Chromat. , 9(13), стр. 2855-2868, 1986), которая показывает потерю биологической активности бычьим ФСГ и человеческим ФСГ (стандарт ЧКГ) после ЖХВД с обращенной фазой. С другой стороны, в той же статье показано удовлетворительное восстановление биологической активности, при частичном разделении, когда ЖХВД подвергают человеческий мочевой препарат (то есть содержащий как ФСГ, так и ЛГ).
После стадии жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой ФСГ восстанавливают с использованием традиционных методик. Для целей хранения и/или манипулирования продукт может быть лиофилизирован. Возможны также и другие операции, осуществляемые с целью концентрирования, стабилизации или другой обработки продукта.
Очевидно, что доступность постклимактерической мочи намного выше, чем доступность человеческого гипофиза. Это обстоятельство придает заявленному изобретению еще большую привлекательность.
ФСГ-специфическое моноклональное антитело для использования в способе настоящего изобретения может быть получено с применением известных приемов.
В типичном примере линия клеток гибридомы 9/14 подвергалась скринингу на оптимальное сродство к ФСГ (в Кембриджском университете). Моноклональные антитела продуцируют в среде методами культивирования клеток и очищают при помощи фракционирования 50%-ным (в отношении массы к объему) сульфатом аммония с последующей ионообменной хроматографией с обращенной фазой, ЖХВД гель-фильтрацией и диализом.
Моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток 9/14 и очищенное, как описано выше, имеет следующие технические показатели:
а) чистота белка: не менее, чем 90%
б) класс иммуноглобулина: IgG 1
в) константа сродства: 3,5•108 л.моль-1
г) специфичность:
Антиген - % перекрестной реакции
ФСГ - 100
ХГГ - 1
ХГГ-бета-субъединица - 1
ЛГ - 1
ТСГ - 1
д) связывающая способность с ФСГ в растворе: около 1000 международных единиц ФСГ на мг McAb.
а) чистота белка: не менее, чем 90%
б) класс иммуноглобулина: IgG 1
в) константа сродства: 3,5•108 л.моль-1
г) специфичность:
Антиген - % перекрестной реакции
ФСГ - 100
ХГГ - 1
ХГГ-бета-субъединица - 1
ЛГ - 1
ТСГ - 1
д) связывающая способность с ФСГ в растворе: около 1000 международных единиц ФСГ на мг McAb.
ФСГ-специфичные моноклональные антитела химически связываются с Сефарозой 4B посредством дивинилсульфона в соответствии с методом, описанным J. Porath (Methods in Enzymology, 34, стр. 13-30, 1974).
В типичном примере 1 л Сефарозы 4B промывают на фильтре из пористого стекла вначале 5 л свежедистиллированной воды, а затем 5 л 1 M раствора карбоната натрия, pH 11. Промытую Сефарозу суспендируют в 1 литре 1 M раствора карбоната натрия (pH 11). При непрерывном перемешивании по каплям прибавляют 200 мл дивинилсульфона. Реакцию завершают в течение 70 мин при комнатной температуре, а затем прекращают путем прибавления 1 н раствора HCl (до pH 7,0).
Активированную смолу суспендируют в 1 л 0,25 M раствора бикарбоната натрия (pH 9,0), содержащего 2 г анти-ФСГ моноклонального антитела, с получением более чем 90% связывания антитела с активированной смолой. Полученную иммуносмолу хранят при температуре 4oC.
Следующий пример 1 иллюстрирует две стадии очистки способа по изобретению, примененные к коммерческому ЧКГ, являющемуся активным ингредиентом препарата Пергонал(R), Сероно.
Следует, однако, заметить, что хотя ЧКГ является предпочтительным исходным материалов в способе настоящего изобретения, последний также приемлем и для менее очищенных материалов, таких, как постклимактерические мочевые концентраты и тому подобное. Хорошие результаты получены с использованием в качестве исходного материала мочевого концентрата, содержащего всего 1 международную единицу ФСГ на мг.
Другие варианты и преимущества настоящего изобретения станут очевидными после рассмотрения следующих примеров, которые не ограничивают изобретение.
Пример 1. Получение высокоочищенного мочевого ФСГ (вом ФСГ)
Стадия 1. Иммуноочистка анти-ФСГ McAb-DVS-Сефарозы
В качестве исходного материала используют ЧКГ.
Стадия 1. Иммуноочистка анти-ФСГ McAb-DVS-Сефарозы
В качестве исходного материала используют ЧКГ.
Иммуносмолу (анти-ФСГ McAb-DVS-Сефарозу) уравновешивают 0,1 M Трис-HCl, 0,3 M NaCl-буфером, pH 7,5 при температуре 4oC. Колонку загружают определенным количеством международных единиц ФСГ (РИА), соответствующим 80-90% общей связывающей способности ФСГ.
Неудерживаемые смолой белки элюируют уравновешивающим буфером до тех пор, пока OD 280 элюата не станет ниже, чем 0,02.
Абсорбированный мочевой ФСГ элюируют с иммуносмолы 1 M раствором аммиака при температуре 4oC. Аммиачные элюаты, соответствующие приблизительно 4-кратному объему иммуносмолы, объединяют, pH по возможности быстро доводят до 9,0 при температуре 4oC путем прибавления ледяной уксусной кислоты, раствор ультрафильтруют в аппарате Амикон (мембрана C.0.10000 дальтон) и концентрируют до малого объема.
Стадия 2. Жидкостная хроматография высокого давления с обращенной фазой
Полученный раствор, доведенный до pH 5,6, загружают в колонку C18 с обращенной фазой (Pre Pak waters), которую предварительно уравновешивают 0,05 M буферным раствором уксуснокислого аммония при комнатной температуре. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 100 мл/мин, регистрацию ведут при 280 нм.
Полученный раствор, доведенный до pH 5,6, загружают в колонку C18 с обращенной фазой (Pre Pak waters), которую предварительно уравновешивают 0,05 M буферным раствором уксуснокислого аммония при комнатной температуре. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 100 мл/мин, регистрацию ведут при 280 нм.
Очистку ЖХВД осуществляют с помощью аппарата Prep 500 A (waters), оборудованного УФ-детектором и генератором препаративного градиента.
Биологически активный, высокоочищенный мочевой ФСГ элюируют повышением концентрации изопропанола до 50% от подвижной фазы. Фракции проверяют аналитической гель-проникающей хроматографией и радиоиммуноанализом.
Органический растворитель удаляют дистилляцией в вакууме при температуре 40oC, после чего раствор замораживают и лиофилизируют.
Пример 2. Исследование ФСГ
Высокоочищенный препарат мочевого ФСГ настоящего изобретения подвергают химико-физическим, биологическим и иммунологическим испытаниям с тем, чтобы получить его полную характеристику. Как указано ниже, большинство испытаний осуществляют в сравнении с высокоочищенным препаратом гипофизарного ФСГ, полученным в соответствии с методом, описываемым ниже.
Высокоочищенный препарат мочевого ФСГ настоящего изобретения подвергают химико-физическим, биологическим и иммунологическим испытаниям с тем, чтобы получить его полную характеристику. Как указано ниже, большинство испытаний осуществляют в сравнении с высокоочищенным препаратом гипофизарного ФСГ, полученным в соответствии с методом, описываемым ниже.
В качестве исходного материала используют неочищенный человеческий гипофизарный экстракт (HPG), побочный продукт, получаемый при экстракции человеческого гормона роста.
Методика очистки HPG включала следующие стадии:
1. Предварительную очистку сырого HPG путем экстракции 40%-ным этанолом, содержащим 6% уксуснокислого аммония, pH 5,6 и преципитацию супернатанта с помощью холодного 96%-ного этанола.
1. Предварительную очистку сырого HPG путем экстракции 40%-ным этанолом, содержащим 6% уксуснокислого аммония, pH 5,6 и преципитацию супернатанта с помощью холодного 96%-ного этанола.
2. Дальнейшую очистку HPG ионообменной хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе с использованием 0,15 M раствора ацетата натрия, pH 7,0, в качестве элюента с последующей преципитацией 96%-ным холодным этанолом.
3. Дальнейшую очистку фракции ФСГ гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 с использованием 0,05 M бикарбоната аммония в качестве буфера.
4. Окончательную очистку ФСГ ионообменной хроматографией на колонке SP Сефадекс C 50. Высокоочищенный гипофизарный ФСГ элюируют 0,1 M фосфатным буферным раствором, pH 6,2, и лиофилизируют.
Было определено, что биологическая удельная активность in vivo гипофизарного ФСГ (тест Стилмана-Ролей; международная единица второго IRP-HMG) составляет 4770 международных единиц ФСГ на мг лиофилизованного порошка. Для этого определения использовали методику, описанную ниже под заголовком "Количественное определение биологической активности".
Для характеристики ФСГ по изобретению проводились следующие испытания.
Контаминация ЛГ
Данный тест осуществляют при помощи специфического радиоиммуноанализа для ЛГ (лютеинизирующего гормона) с использованием стандарта ЛГ, градуированного с помощью тройного К1Т для ЛГ (код 10204), доставляемого в настоящее время на рынок компанией Биодата(R). В качестве антисыворотки используют овечью анти-ХГГ (хорионический гонадотропин человека) антисыворотку, полученную заявителем, которая имеет 100%-ную перекрестную реакцию с ЛГ и менее чем 0,01% с ФСГ.
Данный тест осуществляют при помощи специфического радиоиммуноанализа для ЛГ (лютеинизирующего гормона) с использованием стандарта ЛГ, градуированного с помощью тройного К1Т для ЛГ (код 10204), доставляемого в настоящее время на рынок компанией Биодата(R). В качестве антисыворотки используют овечью анти-ХГГ (хорионический гонадотропин человека) антисыворотку, полученную заявителем, которая имеет 100%-ную перекрестную реакцию с ЛГ и менее чем 0,01% с ФСГ.
Метод радиоиммуноанализа проводили в полном соответствии с наставлениями изготовителя, чтобы избежать даже незначительного загрязнения ЛГ, проявляющегося в высокоочищенном препарате мочевого ФСГ, полученном в соответствии с примером 1.
Вышеприведенные результаты подтверждают с использованием более чувствительного анализа, называемого DEL FIA (диссоциация - улучшенный лантанид-фтор-иммуноанализ), оборудование для проведения которого поставляется фирмой ЛКБ-фармация.
SDS-ПААГ
Электрофорез в пластине геля в присутствии додецилсульфата натрия осуществляют в восстановительных условиях на 13,5%-ном полиакриламидном геле, pH 8,8, в соответствии с методикой, описанной Лаеммли в Nature, 277, стр. 680-685 (1970).
Электрофорез в пластине геля в присутствии додецилсульфата натрия осуществляют в восстановительных условиях на 13,5%-ном полиакриламидном геле, pH 8,8, в соответствии с методикой, описанной Лаеммли в Nature, 277, стр. 680-685 (1970).
Окрашивание осуществляют кумасси бриллиантовым синим R-250, 0,25% в смеси 25% метанола/75% уксусная кислота.
Данному испытанию подвергают как препарат вомФСГ в соответствии с настоящим изобретением, так и высокоочищенный препарат гипофизарного ФСГ (вогФСГ), полученный, как описано выше.
В обоих препаратах (мФСГ и гФСГ) основная большая полоса, типичная для гликопротеинов, обнаруживается при одной и той же молекулярной массе, соответствующей примерно 20000 дальтон, что совпадает с литературными данными. Вследствие известного "поведения" гликопротеидов в SDS-ПААГ, это значение слегка преувеличено.
Вытеснительная хроматография
Анализы как вомФСГ, так и вогФСГ осуществляют на колонке TSK G2000 SW фирмы ЛКБ с использованием 0,1 M фосфатного буфера, pH 6,8+0,2 M NaCl в качестве элюента. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 0,7 мл/мин; регистрацию проводят при длине волны 230 нм.
Анализы как вомФСГ, так и вогФСГ осуществляют на колонке TSK G2000 SW фирмы ЛКБ с использованием 0,1 M фосфатного буфера, pH 6,8+0,2 M NaCl в качестве элюента. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 0,7 мл/мин; регистрацию проводят при длине волны 230 нм.
Результаты приведены на чертеже, который показывает одинарные основные пики для мФСГ и гФСГ, по существу, с одинаковым временем удерживания (13,37 и 13,55 мин, соответственно).
Изоэлектрофокусирование
Изоэлектрофокусирование осуществляют на 5%-ном тонкослойном полиакриламидном геле (Амфолин ЛКБ(R), pH 3,5-9,5), фиксированном 11,5%-ной (мас.) трихлоруксусной кислотой и 3,5%-ной (мас.) сульфосалициловой кислотой, и проводят окрашивание серебром с помощью набора БИО-РЭД(R).
Изоэлектрофокусирование осуществляют на 5%-ном тонкослойном полиакриламидном геле (Амфолин ЛКБ(R), pH 3,5-9,5), фиксированном 11,5%-ной (мас.) трихлоруксусной кислотой и 3,5%-ной (мас.) сульфосалициловой кислотой, и проводят окрашивание серебром с помощью набора БИО-РЭД(R).
И мочевой, и гипофизарный ФСГ обнаруживают несколько полос, давая при этом совершенно различные картины их расположения, в частности, основные полосы мочевого ФСГ находятся в интервале pH ниже, чем 4,8, тогда как основные полосы гипофизарного ФСГ расположены в более высоком интервале pH.
Данное испытание показывает, что мочевые и гипофизарные ФСГ не являются идентичными молекулами, а также то, что различия заключаются, по крайней мере, в их углеводородных, если не в самих белковых, частях.
Количественное определение биологической активности
Биологическую активность высокоочищенного мочевого ФСГ in vivo определяют методом Стилмана-Ролей (Steelman-Rohiey, Endocrinolody, 53, стр. 604-616, 1953) с использованием в качестве эталонного вещества Хаус Эталон ЧКГ, градуированный по 2-му международному эталонному препарату ЧКГ для количественного определения биологической активности. Данный анализ принят всеми основными фармакопеями и службами здравоохранения для определения Международных единиц (1. v.) биологической активности ФСГ.
Биологическую активность высокоочищенного мочевого ФСГ in vivo определяют методом Стилмана-Ролей (Steelman-Rohiey, Endocrinolody, 53, стр. 604-616, 1953) с использованием в качестве эталонного вещества Хаус Эталон ЧКГ, градуированный по 2-му международному эталонному препарату ЧКГ для количественного определения биологической активности. Данный анализ принят всеми основными фармакопеями и службами здравоохранения для определения Международных единиц (1. v.) биологической активности ФСГ.
Показано, что вомФСГ-препарат, полученный в соответствии с описанием, приведенным выше, имеет удельную активность, равную 6200 1.V. ФСГ на мг лиофилизированного порошка, то есть наиболее высокую удельную активность, когда-либо описанную для мочевого препарата ФСГ.
Определение аминокислотной последовательности
а) Выделение субъединиц мочевого ФСГ
Выделение субъединиц мочевого ФСГ осуществляют с использованием системы ЖХВД Waters, оборудованной колонкой Аквапор RP-300, 200 х 4,6 мм, 7 мкм (Браунли Лэбз). Элюентами являются A=0,1% TFA (трифторуксусная кислота, классификация ЖХВД, Пиерс), B=0,055% TFA в ацетонитриле. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 1 мл/мин при температуре 35oC, а начальный режим представляет собой 15% B. Градиент предусматривает повышение до 40% B в течение 20 мин. Уф-детектор устанавливают на 229 нм. Обычно проводят аналитические серии (20 мкл раствора 0,5 мг/мл вомФСГ и 0,5% TFA). Предварительная инкубация в растворе TFA необязательна. Препаративное разделение осуществляют с использованием той же колонки. Хорошее разрешение достигают путем ввода 0,5 мг высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ (серия N032), растворенного в буфере A. Фракции собирают вручную и сушат с использованием концентратора Спид Вак. Субъединицы растворяют в воде, анализируют ЖХВД и хранят при температуре -20oC.
а) Выделение субъединиц мочевого ФСГ
Выделение субъединиц мочевого ФСГ осуществляют с использованием системы ЖХВД Waters, оборудованной колонкой Аквапор RP-300, 200 х 4,6 мм, 7 мкм (Браунли Лэбз). Элюентами являются A=0,1% TFA (трифторуксусная кислота, классификация ЖХВД, Пиерс), B=0,055% TFA в ацетонитриле. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 1 мл/мин при температуре 35oC, а начальный режим представляет собой 15% B. Градиент предусматривает повышение до 40% B в течение 20 мин. Уф-детектор устанавливают на 229 нм. Обычно проводят аналитические серии (20 мкл раствора 0,5 мг/мл вомФСГ и 0,5% TFA). Предварительная инкубация в растворе TFA необязательна. Препаративное разделение осуществляют с использованием той же колонки. Хорошее разрешение достигают путем ввода 0,5 мг высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ (серия N032), растворенного в буфере A. Фракции собирают вручную и сушат с использованием концентратора Спид Вак. Субъединицы растворяют в воде, анализируют ЖХВД и хранят при температуре -20oC.
Бета-субъединицу элюируют приблизительно через 10,5 мин в виде широкого пика; альфа-субъединицу элюируют в течение 15 мин в виде острого пика, Идентификацию пиков (на содержание бета- и альфа-субъединицы) осуществляют специфическим радиоиммуноанализом. Обычно восстановление бета-субъединицы происходит вокруг значения 50%, тогда как восстановление альфа-субъединицы составляет при значении более, чем 90%.
б) Восстановление и карбоксиметилирование альфа- и бета-субъединиц
Восстановление субъединиц, разделенных, как описано в части а), осуществляют в 0,5 Трис, 0,1% ЭДТА, 6 М Гуанидин-HC1, pH 8,5, в течение 2 ч при температуре 37oC с использованием ДТТ (дитиотрейтола, Серва) при 15-кратном молярном избытке относительно содержания цистеина. Затем в реакционную смесь прибавляют йодоацетат натрия (2,1 молярный избыток относительно ДТТ) и оставляют на 30 мин в темноте. Для прекращения реакции прибавляют 1%-ный меркаптоэтанол и TFA. Карбоксиметилированные субъединицы очищают ЖХВД. Бета-карбоксиметилированная субъединица плохо растворяется в воде, поэтому конечный выход совершенно незначителен.
Восстановление субъединиц, разделенных, как описано в части а), осуществляют в 0,5 Трис, 0,1% ЭДТА, 6 М Гуанидин-HC1, pH 8,5, в течение 2 ч при температуре 37oC с использованием ДТТ (дитиотрейтола, Серва) при 15-кратном молярном избытке относительно содержания цистеина. Затем в реакционную смесь прибавляют йодоацетат натрия (2,1 молярный избыток относительно ДТТ) и оставляют на 30 мин в темноте. Для прекращения реакции прибавляют 1%-ный меркаптоэтанол и TFA. Карбоксиметилированные субъединицы очищают ЖХВД. Бета-карбоксиметилированная субъединица плохо растворяется в воде, поэтому конечный выход совершенно незначителен.
в) Восстановление, пиридилэтилирование и трипсин-переваривание бета-субъединицы.
Восстановление бета-субъединицы, разделенной, как описано в части а), осуществляют при комнатной температуре в течение 2 ч следующим образом: 0,1 мг бета-субъединицы, 0,5 мл 0,5 М раствора Трис, 0,1% ЭДТА, 6 М гуанидин-HC1, pH 8,5, 2,7 мг дитиотрейтола. Пиридилэтилирование осуществляют путем прибавления 0,02 мл 4-винилпиридина к предыдущему раствору. Реакция продолжается в течение 2 ч при комнатной температуре. Наконец, реакционную смесь загружают в С4-патрон (Бэйкер), уравновешенный 0,1% TFA. Патрон промывают 0,1% TFA и пиридилэтилированную бета-субъединицу элюируют 40% ацетонитрилом с 0,1% TFA. Элюированные фракции сушат и очищают ЖХВД, как описано выше для бета-субъединицы. Пиридилэтилированную бета-субъединицу, очищенную ранее путем ЖХВД, растворяют в 1%-ном растворе NH4HCO3, pH 8.
В раствор прибавляют трипсин и реакцию осуществляют в течение 1,5 ч при температуре 30oC. Триптические фракции очищают жидкостной хроматографией высокого давления (ЖХВД) с использованием ранее описанной методики, за исключением того, что градиент поднимают от 0% до 55% в течение 30 мин и УФ-детектор устанавливают на 214 нм.
Триптические фракции секвенируют таким же образом, как осуществляют секвенирование субъединиц (см. часть д).
г) Секвенирование альфа-субъединицы
Несколько испытаний на определение последовательности аминокислотных остатков в белках (секвенирование) осуществляют с использованием альфа-субъединицы, карбоксиметилированной альфа-субъединицы или целого высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ, обычно загружая 5 нмоль (или немного менее) в белковый секвенсер (470 А, Эпплайд Биосистем) и используя стандартную программу O3PRTH, поставляемую Эпплайд Биосистем, или специальную программу, в которой циклы, которые расщепляют Pro или Gly, замещены специальным циклом O3CPPO. Первый из остатков, начиная с NH2-конца молекулы, идентифицируют и получают подтверждение результатов по определению аминокислотной последовательности, известных из литературы (J. Biol. Chem., 250, стр. 6735 (1975). Asn в положении 52 и в положении 78, относящихся к известной последовательности, начинающейся с Ala, представляют собой аминокислоты, где происходит гликозилирование. На конце NH2 всегда присутствует неоднородность, и она всегда одна и та же во всех секвенированных пробах. Полная молекула (то есть, начинающаяся с Ala) составляет 65% цепей, молекула, не имеющая первых двух аминокислот (то есть начинающаяся с Asp), присутствует в количестве 5% молекул, а не имеющая первых трех аминокислот (то есть начинающаяся с Val), присутствует в количестве 30% (см. табл. 1).
Несколько испытаний на определение последовательности аминокислотных остатков в белках (секвенирование) осуществляют с использованием альфа-субъединицы, карбоксиметилированной альфа-субъединицы или целого высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ, обычно загружая 5 нмоль (или немного менее) в белковый секвенсер (470 А, Эпплайд Биосистем) и используя стандартную программу O3PRTH, поставляемую Эпплайд Биосистем, или специальную программу, в которой циклы, которые расщепляют Pro или Gly, замещены специальным циклом O3CPPO. Первый из остатков, начиная с NH2-конца молекулы, идентифицируют и получают подтверждение результатов по определению аминокислотной последовательности, известных из литературы (J. Biol. Chem., 250, стр. 6735 (1975). Asn в положении 52 и в положении 78, относящихся к известной последовательности, начинающейся с Ala, представляют собой аминокислоты, где происходит гликозилирование. На конце NH2 всегда присутствует неоднородность, и она всегда одна и та же во всех секвенированных пробах. Полная молекула (то есть, начинающаяся с Ala) составляет 65% цепей, молекула, не имеющая первых двух аминокислот (то есть начинающаяся с Asp), присутствует в количестве 5% молекул, а не имеющая первых трех аминокислот (то есть начинающаяся с Val), присутствует в количестве 30% (см. табл. 1).
д) Секвенирование бета-субъединицы
Осуществляют несколько серий секвенирования с использованием бета-субъединицы, карбоксиметилированной бета-субъединицы, целого высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ и триптических пептидов из пиридилэтилированной бета-субъединицы. Образцы загружают в секвенсер белков (470 А, Эпплайд Биосистем) с использованием стандартной программы O3RPTH, предложенной Эпплайд Биосистем. Результаты показывают, что данная субъединица имеет длину 111 аминокислот и следующую аминокислотную последовательность:
Asn в положениях 7 и 24, относящихся к вышеприведенной последовательности, начинающейся также с Asn, представляют собой остатки, по которым происходит гликозирование. На NH2- конце бета-субъединицы всегда присутствует неоднородность, и она всегда одна и та же во всех секвенированных образцах. Полная молекула (то есть начинающаяся с Asn), представлена в количестве 35%, молекула, не имеющая первой аминокислоты (то есть начинающаяся с Ser), присутствует в количестве 15%, молекула, не имеющая первых двух аминокислот (то есть, начинающаяся с Cys), присутствует в количестве 50% (см. табл. 2).
Осуществляют несколько серий секвенирования с использованием бета-субъединицы, карбоксиметилированной бета-субъединицы, целого высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ и триптических пептидов из пиридилэтилированной бета-субъединицы. Образцы загружают в секвенсер белков (470 А, Эпплайд Биосистем) с использованием стандартной программы O3RPTH, предложенной Эпплайд Биосистем. Результаты показывают, что данная субъединица имеет длину 111 аминокислот и следующую аминокислотную последовательность:
Asn в положениях 7 и 24, относящихся к вышеприведенной последовательности, начинающейся также с Asn, представляют собой остатки, по которым происходит гликозирование. На NH2- конце бета-субъединицы всегда присутствует неоднородность, и она всегда одна и та же во всех секвенированных образцах. Полная молекула (то есть начинающаяся с Asn), представлена в количестве 35%, молекула, не имеющая первой аминокислоты (то есть начинающаяся с Ser), присутствует в количестве 15%, молекула, не имеющая первых двух аминокислот (то есть, начинающаяся с Cys), присутствует в количестве 50% (см. табл. 2).
Пример 3. Фармацевтические препараты
Получение фармацевтических лекарственных форм, содержащих высокоочищенный мочевой ФСГ, полученный в соответствии с настоящим изобретением, не представляет трудности. Поскольку вещество сохраняет свою биологическую активность после лиофилизации, последняя содействует получению предпочтительной формы для инъецируемых препаратов.
Получение фармацевтических лекарственных форм, содержащих высокоочищенный мочевой ФСГ, полученный в соответствии с настоящим изобретением, не представляет трудности. Поскольку вещество сохраняет свою биологическую активность после лиофилизации, последняя содействует получению предпочтительной формы для инъецируемых препаратов.
Лиофилизированный препарат, содержащий вомФСГ, воссоздают с использованием физиологического раствора и/или других пригодных разбавителей, с получением раствора для инъекций.
Многие наполнители могут быть успешно использованы в композиции в качестве ее части, такие, как, например, маннит, лактоза, глицин, глюкоза, сахароза и их смеси. Могут быть использованы и другие традиционные носители, наполнители и тому подобное.
В экспериментах, проводимых в соответствии с настоящим изобретением, в качестве наполнителя для инъецируемых препаратов использовали лактозу.
При получении инъецируемых составов для инъекции доведение pH обязательно. Применяемые для этого кислые вещества включают уксусную кислоту и тому подобное, а основные вещества включают гидроокись натрия и тому подобное.
В пределах объема настоящего изобретения предлагается использование одного или более стабилизаторов, например альбумина и тому подобного.
Типичный пример фармацевтического производства для изготовления партии 20000 ампул, каждая из которых содержит 75 международных единиц ФСГ, представляет собой следующее.
Вычисленное количество (в единицах биологической активности) порошка лиофилизированного ФСГ растворяют в 700 мл холодной апирогенной воды для инъекции. Если необходимо, pH доводят до значения между 6,2 и 6,8 с использованием либо уксусной кислоты, либо гидроокиси натрия, в зависимости от случая, Затем раствор подвергают стерильной фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм.
200 г лактозы растворяют в 2 л апирогенной воды для инъекции, подвергают стерильной фильтрации, как описано выше, и прибавляют к раствору ФСГ.
Апирогенную воду для инъекции прибавляют до получения конечного объема, равного 15 л. Затем раствор разливают в ампулы (0,75 мл каждая) и лиофилизируют в стерильном лиофилизаторе. Получают ампулы, каждая из которых содержит 75 международных единиц ФСГ и 10 мг лактозы.
В предпочтительном варианте каждая ампула может содержать 150 международных единиц ФСГ и 10 мл лактозы.
В соответствии с другим примером фармацевтического препарата получают ампулы с содержанием в каждой, кроме наполнителя лактозы, 1 мг человеческого альбумина в качестве стабилизатора.
Хотя настоящее изобретение проиллюстрировано специфическими примерами, следует иметь в виду, что различные варианты могут быть выполнены в пределах объема и сущности настоящего изобретения.
Claims (6)
1. Очищенный фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), представляющий собой α- субъединицу гонадотропина и β- субъединицу с аминокислотными последовательностями, приведенными в конце формулы
и характеризующийся следующими свойствами: активность не менее 6200 международных единиц ФСГ на 1 мг лиофилизированного порошка, свободен от лютеинизирующего гормона, Asn гликозилирован в положениях 7 и 24 β- субъединицы и в положениях 52 и 78 α- субъединицы.
и характеризующийся следующими свойствами: активность не менее 6200 международных единиц ФСГ на 1 мг лиофилизированного порошка, свободен от лютеинизирующего гормона, Asn гликозилирован в положениях 7 и 24 β- субъединицы и в положениях 52 и 78 α- субъединицы.
2. Гормон по п. 1, отличающийся тем, что выделен из климактерической мочи человека.
3. Фармацевтическая композиция, содержащая активный компонент и целевую добавку, отличающаяся тем, что в качестве активного компонента содержит белок по п. 1, а в качестве целевой добавки фармацевтически приемлемый носитель для инъекционного или подкожного введения.
4. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что в качестве наполнителя содержит лактозу.
5. Композиция по п. 3, отличающаяся тем, что содержит на ампулу белок ФСГ в количестве около 75 МЕ или около 150 МЕ.
6. Компонент фармацевтической композиции, представляющей собой очищенный ФСГ по п. 1.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT8748110A IT1206302B (it) | 1987-06-26 | 1987-06-26 | Ormone follicolo-stimolante urinario |
| IT48110A/87 | 1987-06-26 | ||
| PCT/IT1988/000048 WO1988010270A1 (en) | 1987-06-26 | 1988-06-24 | Urinary follicle stimulating hormone |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4613604/14A Division RU2059412C1 (ru) | 1987-06-26 | 1988-06-24 | Способ получения гонадотропина, обладающего активностью фолликулостимулирующего гормона, из постменопаузной мочи (мочевого концентрата) |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2105012C1 true RU2105012C1 (ru) | 1998-02-20 |
Family
ID=11264576
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4743338/13A RU2105012C1 (ru) | 1987-06-26 | 1988-06-24 | Очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг), фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической композиции |
| SU4613604/14A RU2059412C1 (ru) | 1987-06-26 | 1988-06-24 | Способ получения гонадотропина, обладающего активностью фолликулостимулирующего гормона, из постменопаузной мочи (мочевого концентрата) |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SU4613604/14A RU2059412C1 (ru) | 1987-06-26 | 1988-06-24 | Способ получения гонадотропина, обладающего активностью фолликулостимулирующего гормона, из постменопаузной мочи (мочевого концентрата) |
Country Status (26)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5128453A (ru) |
| EP (1) | EP0322438B1 (ru) |
| JP (1) | JP2523843B2 (ru) |
| KR (1) | KR0156565B1 (ru) |
| CN (2) | CN1031714C (ru) |
| AR (1) | AR243241A1 (ru) |
| AT (1) | ATE115148T1 (ru) |
| AU (1) | AU615930B2 (ru) |
| CA (1) | CA1340649C (ru) |
| DE (1) | DE3852383T2 (ru) |
| DK (1) | DK173349B1 (ru) |
| ES (1) | ES2009948A6 (ru) |
| FI (1) | FI96608C (ru) |
| GE (2) | GEP19971042B (ru) |
| GR (1) | GR1003186B (ru) |
| HK (1) | HK143195A (ru) |
| IL (1) | IL86847A (ru) |
| IT (1) | IT1206302B (ru) |
| LT (2) | LT4018B (ru) |
| LV (2) | LV10628B (ru) |
| MX (1) | MX9203471A (ru) |
| NO (1) | NO177498C (ru) |
| RU (2) | RU2105012C1 (ru) |
| UA (1) | UA19101A (ru) |
| WO (1) | WO1988010270A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA884492B (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2755000C2 (ru) * | 2016-10-11 | 2021-09-08 | Онкогреен Тхерапеутикс Са | Лиганды к рецептору фолликулостимулирующего гормона (FSH) в диагностике и лечении опухолей |
| RU2803653C1 (ru) * | 2019-12-26 | 2023-09-19 | ЭлДжи КЕМ, ЛТД. | Способ очистки фолликулостимулирующего гормона |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1206302B (it) * | 1987-06-26 | 1989-04-14 | Serono Cesare Ist Ricerca | Ormone follicolo-stimolante urinario |
| US5087615A (en) * | 1989-03-17 | 1992-02-11 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Novel method of ovulation induction in humans |
| IT1250075B (it) * | 1991-12-18 | 1995-03-30 | Serono Cesare Ist Ricerca | Composizioni farmaceutiche contenenti gonadotropine. |
| IT1270866B (it) * | 1993-03-10 | 1997-05-13 | Eniricerche Spa | Vettore ricombinante e suo impiego per la preparazione esocellulare di anticorpi in forma di singola molecola da bacillus subtilis |
| US6737515B2 (en) * | 1993-11-19 | 2004-05-18 | Washington University | Follicle stimulating hormone-glycosylation analogs |
| US6162905A (en) * | 1996-11-07 | 2000-12-19 | Ibsa Institut Biochimique S.A. | FSH and LH separation and purification process |
| TW518235B (en) * | 1997-01-15 | 2003-01-21 | Akzo Nobel Nv | A gonadotropin-containing pharmaceutical composition with improved stability on prolong storage |
| US5990288A (en) * | 1997-10-21 | 1999-11-23 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
| US6414123B1 (en) * | 1997-10-21 | 2002-07-02 | Vitro Diagnostics, Inc. | Method for purifying FSH |
| JP4719357B2 (ja) * | 1998-07-23 | 2011-07-06 | アレス トレイディング ソシエテ アノニム | Ｆｓｈ及びｆｓｈ変異体の製剤、製品及び方法 |
| US20030166525A1 (en) * | 1998-07-23 | 2003-09-04 | Hoffmann James Arthur | FSH Formulation |
| AU779869B2 (en) | 1999-04-13 | 2005-02-17 | Nektar Therapeutics | Pulmonary administration of dry powder formulations for treating infertility |
| GB9924351D0 (en) | 1999-10-14 | 1999-12-15 | Brennan Frank | Immunomodulation methods and compositions |
| JP2001349892A (ja) * | 2000-04-03 | 2001-12-21 | Unilever Nv | 検査方法及びデバイス |
| PT1282418E (pt) * | 2000-05-19 | 2005-10-31 | Applied Research Systems | Utilizacao de derivados pirazolo para o tratamento da infertilidade |
| ES2281458T3 (es) * | 2000-12-21 | 2007-10-01 | Nektar Therapeutics | Composiciones de polvo estables en almacenamiento del receptor de interleucina 4. |
| MEP38608A (en) * | 2001-10-22 | 2011-02-10 | Merck Serono Sa | Gonadotrophins for folliculogenesis |
| US7317095B2 (en) | 2001-10-22 | 2008-01-08 | Applied Research Systems Ars Holding N.V. | Mutant glycoproteins |
| US7754722B2 (en) | 2002-09-20 | 2010-07-13 | Merck Serono Sa | Piperazine derivatives and methods of use |
| EA200501548A1 (ru) * | 2003-04-01 | 2006-02-24 | Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. | Ингибиторы фосфодиэстераз при бесплодии |
| AR043972A1 (es) * | 2003-04-02 | 2005-08-17 | Ares Trading Sa | Formulaciones farmaceuticas de fsh y lh |
| EP1638595B1 (en) * | 2003-06-20 | 2013-03-20 | Ares Trading S.A. | Freeze-dried fsh / lh formulations |
| JP4763616B2 (ja) | 2003-12-22 | 2011-08-31 | アレス トレーディング ソシエテ アノニム | Ｆｓｈを精製するための方法 |
| US20070270339A1 (en) * | 2004-04-23 | 2007-11-22 | Serono, Inc. | Use of GPCR54 Ligands for the Treatment of Infertility |
| MX2007005327A (es) * | 2004-11-09 | 2007-08-02 | Ares Trading Sa | Metodo para purificacion de la hormona foliculo estimulante (hfe). |
| KR20080044836A (ko) | 2005-07-15 | 2008-05-21 | 라보라뚜와르 세로노 에스. 에이. | 자궁내막증 치료용 ｊｎｋ 억제제 |
| BRPI0613042A2 (pt) | 2005-07-15 | 2010-12-14 | Serono Lab | inibidores de jnk para o tratamento de endometriose |
| SG155183A1 (en) | 2005-08-26 | 2009-09-30 | Ares Trading Sa | Process for the preparation of glycosylated interferon beta |
| KR20080052650A (ko) | 2005-09-07 | 2008-06-11 | 라보라토리스 세로노 에스.에이. | 자궁내막증 치료용 ｉｋｋ 저해제 |
| CA2612613A1 (en) * | 2005-09-14 | 2007-03-22 | Mara Rossi | Method for the determination of poloxamers |
| AU2006323925B2 (en) | 2005-12-09 | 2012-08-02 | Ares Trading S.A. | Method for purifying FSH or a FSH mutant |
| AU2008279584A1 (en) * | 2007-04-27 | 2009-01-29 | Dow Global Technologies Inc. | Improved production and in vivo assembly of soluble recombinant icosahedral virus-like particles |
| UA103598C2 (ru) | 2007-06-28 | 2013-11-11 | Биодженерикс Аг | Клон клеток, которые продуцируют fsh |
| WO2009098318A1 (en) | 2008-02-08 | 2009-08-13 | Biogenerix Ag | Liquid formulation of fsh |
| TWI488640B (zh) | 2008-04-16 | 2015-06-21 | Ferring Int Ct Sa | 藥學製劑 |
| CN101269215B (zh) * | 2008-05-15 | 2011-03-23 | 上海天伟生物制药有限公司 | 一种糖蛋白激素组合物 |
| JP2009273427A (ja) | 2008-05-16 | 2009-11-26 | Jcr Pharmaceuticals Co Ltd | 組換え体ヒトｆｓｈの製造方法 |
| AU2010234028B2 (en) | 2009-04-01 | 2013-11-14 | Theramex HQ UK Limited | Method for purifying recombinant FSH |
| TWI604850B (zh) | 2009-10-05 | 2017-11-11 | 菲瑞茵國際中心股份有限公司 | 藥學製劑 |
| EP2325194A1 (en) | 2009-11-24 | 2011-05-25 | Glycotope GmbH | Process for the purification of glycoproteins |
| CA2831486A1 (en) | 2011-03-31 | 2012-10-04 | Ferring B.V. | Pharmaceutical preparation |
| CN103509121B (zh) | 2012-11-22 | 2015-01-28 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途 |
| EP3192556A4 (en) | 2014-09-11 | 2018-05-09 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Microneedle device |
| SG11201702779PA (en) | 2014-10-27 | 2017-05-30 | Hisamitsu Pharmaceutical Co | Microneedle device containing recombinant follicle stimulating hormone |
| CN111349154A (zh) * | 2018-12-21 | 2020-06-30 | 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 | 一种重组人促卵泡激素及其制备方法和药物应用 |
| MX2022007638A (es) * | 2019-12-26 | 2022-07-19 | Lg Chemical Ltd | Procedimiento de purificacion de la hormona foliculoestimulante. |
| CN113583125B (zh) * | 2021-07-09 | 2022-09-20 | 苏州晟济药业有限公司 | 抗体以及包含其的结合剂、免疫吸附材料及其应用 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3852422A (en) * | 1971-06-26 | 1974-12-03 | Serono Ist Farm | Long-active gonadotropins |
| SU618113A1 (ru) * | 1976-11-19 | 1978-08-05 | Всесоюзный научно-исследовательский институт технологии кровезаменителей и гормональных препаратов | Способ получени фолликулостимулирующего гормона |
| US4923805A (en) * | 1983-11-02 | 1990-05-08 | Integrated Genetics, Inc. | Fsh |
| US4845077A (en) * | 1984-04-03 | 1989-07-04 | Serono Laboratories, Inc. | Method of inducing ovulation |
| EP0161063B1 (en) * | 1984-04-03 | 1991-07-24 | Serono Laboratories, Inc. | Method of inducing ovulation |
| GB8510177D0 (en) * | 1985-04-22 | 1985-05-30 | Public Health Laborotory Servi | Isolating pituitary glycoprotein hormones |
| GB2174600B (en) * | 1985-05-10 | 1989-12-20 | Univ Melbourne | Induction of ovulation in mares |
| IT1206302B (it) * | 1987-06-26 | 1989-04-14 | Serono Cesare Ist Ricerca | Ormone follicolo-stimolante urinario |
-
1987
- 1987-06-26 IT IT8748110A patent/IT1206302B/it active
-
1988
- 1988-06-23 IL IL86847A patent/IL86847A/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-06-23 ZA ZA884492A patent/ZA884492B/xx unknown
- 1988-06-24 ES ES8801994A patent/ES2009948A6/es not_active Expired
- 1988-06-24 US US07/337,766 patent/US5128453A/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-24 RU SU4743338/13A patent/RU2105012C1/ru active
- 1988-06-24 JP JP63505461A patent/JP2523843B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-24 DE DE3852383T patent/DE3852383T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-24 RU SU4613604/14A patent/RU2059412C1/ru active
- 1988-06-24 UA UA4613604A patent/UA19101A/ru unknown
- 1988-06-24 GR GR880100418A patent/GR1003186B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-06-24 AR AR88311231A patent/AR243241A1/es active
- 1988-06-24 EP EP88906018A patent/EP0322438B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-24 AU AU19620/88A patent/AU615930B2/en not_active Expired
- 1988-06-24 WO PCT/IT1988/000048 patent/WO1988010270A1/en active IP Right Grant
- 1988-06-24 CA CA000570438A patent/CA1340649C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-06-24 AT AT88906018T patent/ATE115148T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-06-24 GE GEAP19881706A patent/GEP19971042B/en unknown
- 1988-06-24 KR KR1019890700354A patent/KR0156565B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-06-24 MX MX9203471A patent/MX9203471A/es unknown
- 1988-06-25 CN CN88103966A patent/CN1031714C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-02-24 DK DK198900899A patent/DK173349B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-02-24 NO NO890805A patent/NO177498C/no not_active IP Right Cessation
- 1989-02-24 FI FI890893A patent/FI96608C/fi active IP Right Grant
-
1993
- 1993-08-25 GE GEAP19931489A patent/GEP19981274B/en unknown
- 1993-11-17 LV LVP-93-1241A patent/LV10628B/xx unknown
- 1993-11-22 LV LVP-93-1256A patent/LV10196B/lv unknown
- 1993-12-21 LT LTIP1652A patent/LT4018B/lt not_active IP Right Cessation
- 1993-12-21 LT LTIP1654A patent/LT3999B/lt not_active IP Right Cessation
-
1995
- 1995-03-30 US US08/413,936 patent/US5767067A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-20 CN CN95107562A patent/CN1069062C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-07 HK HK143195A patent/HK143195A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-12-29 US US08/580,858 patent/US5840857A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Procceedings of Jnternational Simposium on Gonadotropins", N.-Y., Hospital-Cornell Medical Center, 1971, р. 185. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2755000C2 (ru) * | 2016-10-11 | 2021-09-08 | Онкогреен Тхерапеутикс Са | Лиганды к рецептору фолликулостимулирующего гормона (FSH) в диагностике и лечении опухолей |
| RU2803653C1 (ru) * | 2019-12-26 | 2023-09-19 | ЭлДжи КЕМ, ЛТД. | Способ очистки фолликулостимулирующего гормона |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2105012C1 (ru) | Очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг), фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической композиции | |
| US6225449B1 (en) | Hormone analogs with multiple CTP extensions | |
| AU620346B2 (en) | Follistatin and method of purifying same | |
| US20060079460A1 (en) | Purified LH | |
| Dixon et al. | The isolation and structure of α-melanocyte-stimulating hormone from horse pituitaries | |
| JP4588960B2 (ja) | ｈＣＧの精製方法及び本法により精製した組換えｈＣＧ | |
| Canova-Davis et al. | Characterization of chemically synthesized human relaxin by high-performance liquid chromatography | |
| Büllesbach et al. | Relaxin structure. Quasi allosteric effect of the NH2-terminal A-chain helix. | |
| WO1988000208A1 (en) | Ovine inhibin | |
| JP2651488B2 (ja) | Ｆｓｈ放出ペプチド | |
| CA2120358C (en) | Hormone analogs with multiple ctp extensions | |
| JPS61112100A (ja) | 新規なホルモン並びに、その製造方法、使用方法および分析方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| RH4A | Copy of patent granted that was duplicated for the russian federation |
Effective date: 20051123 |