JP2523843B2 - 卵胞刺激ホルモン - Google Patents

卵胞刺激ホルモン

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Description

【発明の詳細な説明】 〔技術分野〕 本発明は、尿の卵胞刺激ホルモン、それを含有する医
薬組成物およびその精製方法に関する。
〔発明の背景〕
卵胞刺激ホルモン（FSH）は、不妊症の療法に有用で
あることが知られている。このホルモンを含有する製剤
は、生体内法であるか生体外法であるかを問わずに使用
され、妊娠能を高めるために使用されてきた。ヒトFSH
は、ヒトの下垂体および閉経後期の尿から単離された。
最近になって、それは組換えDNA法を用いて生産されて
いる。
初期に市販された製品は、HMG（例えば、Pergonal(R)
Serono）、すなわち、FSH、黄体形成ホルモン（LH）お
よび他の尿タンパク質の混合物である閉経後期の尿から
抽出されるヒト閉経期ゴナドトロピンを含むヒトFSHを
含んでなる。しばらくして、科学および療法上の両目的
で精製FSH製品を得る試みがなされた。最近市販された
製品メトロジン（Metrodin(R)）（Serono）は、他の尿
タンパク質を含有するが、LHは極微量である尿のFSH製
剤であり、そして不妊症の療法に使用されている。この
製剤の使用は、例えば多嚢胞性卵巣症候群（PCOS）にお
けるごとくFSHと一緒に外因性LHの投薬が好ましくない
場合に、特に有利である。
今までのところ、療法を目的としたFSHの投薬は、連
続的かつ筋注のみにより実施されてきた。筋注は、医師
または医療専門家により一般に行われるので、患者は治
療を受けるためには、定期的に医院または病院に通院す
ることが必要とされる。このことは、相当な負担とな
る。さらに、この種の適用にかかる時間は、その処置が
通常数週間または数ヵ月以上にわたるので、患者に耐え
がたい忍耐を強いる。
皮下注射による投薬法は、患者自身による投薬を可能
にし、その結果、患者の協調性および迎合性を改善する
であろう。
皮下用ぜん動性ポンプを用いるヒト閉経期ゴナドトロ
ピン（HMG）の拍動性投薬法による女性の不妊症療法に
対するHMGの皮下投与は、既に記載されている〔Nakamur
a Y.ら、Fertility and Sterility,46（１）:46〜54ペ
ージ、1986〕この皮下投薬法は、使用される製剤中に不
純物が存在するので局所アレルギーが生じる障害に苦し
む可能性があり、従って、その療法は中止されている。
凍結下垂体および閉経後期の尿濃縮物からそれぞれ得
られる高純度下垂体のFSHおよび尿のFSHの特徴につい
て、P.Roosは（“Human Follicle Stimulating Hormon
e",Acta Endocrinologica Supplementum 131,1968）に
記載している。下垂体1mg当りのFSH活性約14,000 I.U.
および尿のFSH1mg当りのFSH活性約780 I.U.の高さの生
物学的な有効性が得られた。殆んどの活性下垂体製剤お
よび尿製剤に混在するLH含量は、約0.1重量％に相当す
ることが推測された。その精製方法には、DEAE−セルロ
ースによるクロマトグラフィー、セファデックスＧ−10
0によるゲル濾過、ヒドロキシルアパタイト・クロマト
グラフィーおよびポリアクリルアミドゲル電気泳動法な
ど１以上の手段が包含される。最高に精製された尿のFS
H製剤の一つは、Doniniらにより〔「閉経期の尿に由来
するFSHの精製および部分的な化学−物理学的な特性」
（“Purification and partial Chemico−physical cha
racterization of FSH from Menopausal Urine"），Gon
adotrophins and Ovarin Development（Proceedings of
two workshop meetings）,Eand S Livingstone,Edinbu
rgh and London,1970〕に記載されている。このもの
は、3.2 I.U.LH/mg程度の低濃度でLH夾雑物を有し、生
物学的力価1255.6 I.U.FSH/mgを有する。この場合にお
ける出発原料は、前述したようなFSHおよびLHホルモン
ならびに他の尿タンパク質の混合物であるヒト閉経期ゴ
ナドトロピン（HMG）製剤（Pergonal(R)）であった。こ
の結果は、DEAE−セルロースによるクロマトグラフィ
ー、次いでセファデックスＧ−100によるゲル濾過、そ
して最後の工程として分取ポリアクリルアミドゲル電気
泳動による初発HMGの段階的な精製法によって達成され
た。
さらに高い生物学的力価は、常法のクロマトグラフ的
精製方法に免疫クロマトグラフィーおよびゲル濾過工程
を追加することにより、H.Van Hellら〔「ヒト尿のFSH
およびLHの精製およびいくつかの特性」（“Purificati
on and some properties of human urinary FSH and L
H"），Gonadotropins（Proceedings of Int.1 Symposiu
m on Gonadotropins,1971）,wiley−Interscience,New
York〕によって達成された。免疫クロマトグラフィー
は、部分的に精製されたFSH分画から特異的にLH活性を
除去するためのセファロースに結合された抗HCG抗体を
使用して実施された。RIAアッセイによれば、最高に精
製されたFSH分画は、4720 I.U.FSH/mgを含み、LH夾雑物
は、15 I.U LH/mg程度であった。
免疫クロマトグラフ的試みは、Doniniら〔「HMGから
のFSHおよびLHの分離精製」（“Purification and Sepa
ration of FSH and LH from HMG"），Acta Endocrinolo
gica 52,186〜198ページ、1966〕に既に記載されてお
り、そして筆者らは、早くも1966年に力価329.7 I.U.FS
H/mgを有しかつLHの夾雑物が生物学的に検出できないFS
H製剤を得ていた。別の実験によると、アッセイ値148.3
I.U.FSH/mgおよび2.4 I.U.LH/mgの分画が得られてい
た。前記329.7 I.U.FSH/mg製剤についてはRIAが全く実
施されていないので、もしRIAによりアッセイが行われ
ていればLHの痕跡が見出されていたであろうと、H.van
Hell（前述）の結果から類推され得る。
健全な未成熟マウスに、生物学的に純粋なFSH製剤の
一定量にLH量を増加させながら加えて注射し、次にLH活
性に応答が比例するような子宮の重量の増加を測定する
ことからなる、LH測定用の新規ビオアッセイが示されて
いるDoniniらの論文〔黄体形成ホルモンの生物学的な測
定に対する新規な試み（“A new approach to the Biol
ogical Deternination of the Luteinizing Hormon
e"），Acta Endocrminologica,58,463〜472ページ、196
8〕中に、最小量のLH夾雑物でさえも生理学的に影響を
与えることが明らかにされている。この方法によれば、
4.44 I.U.のFSHと一緒に注射した時、0.068 I.U.程の少
量のLHが子宮の重量を増加し得ることを示した。
従って、療法ではLH活性が全く存在しないFSH活性が
必要である場合に、完全に純粋なFS製剤が望まれること
が明瞭である。
前述のごとく、最近市場に出された製品Metrodin(R)
（Serono）は、既に記載した論文（Acta Endocrinologi
ca 52,186〜198ページ、1966）にDoniniらにより公表さ
れたものと実質的に同一の方法により得られる精製FSH
製剤である。前記製剤の公表された生物学的純度に一致
するような説明書の品質基準は、75 I.U.のFSH当り0.7
I.U.以下のLH、すなわち、ほぼ生物学的にアッセイの限
界感度を示す。しかしながら、ある療法上の適用では、
LHが完全に存在しないことが好ましい。さらに、Metrod
in(R)におけるヒトFSHは、相当量の他の尿タンパク質を
伴う（すなわち、このものは化学的に純粋なFSH製剤で
ない）。
英国特許出願第2,173,803A号明細書は、下垂体糖タン
パク質中にFSHを精製するについて、さらに別の試みを
提供する。この試みは、まず最初にそのホルモンと固定
化モノクローナル抗体との複合物を形成し、次いでpH3
〜４の酸性水性緩衝液でそのホルモンを溶離することか
らなる。FSHに関する限りでは高純度のホルモンが得ら
れるが、いまだ0.1重量％のLHおよび0.5重量％のTSHが
混在する。
Scott.C.Chappelらは、論説（Endocrine Reviews 4
（２）,179〜211ページ、1983）において、FSHの微量異
成分（microheterogeneity）およびそのFSH分子が有す
る炭水化物成分の生理学的な意義について記載する。本
発明の高精製尿のFSH（hpu FSH）と比較の目的で使用さ
れる高精製下垂体のFSHとの出願人により実施された実
験において示される化学−物理的な相違に関して説明す
ることができる仮説は、何等かの変性が最終的な尿分泌
までの代謝経路を通じて起こるものであるとすることが
できる。
同時または後発的な翻訳上の変性は、２種の似ていな
いグリコシリル化したαおよびβサブユニットとして知
られている非共有結合ポリペプチド鎖からなる糖タンパ
ク質、FSHの微量異成分の多様性に基づくことが明らか
である。
付随的に、同じ論説は、高精製下垂体のFSHと尿のFSH
製剤との1mg当りの生物学的活性値における実質的な相
違について説明を試みている。さらに、妥当な仮説は、
炭水化物成分、より具体的には末端シアル酸残基の役割
に基づくものであるとすることができる。
下垂体のFSHおよび尿のFSHは共に「FSH」と称されて
いるが、２つの起源から単離された分子が同一または化
学的に等価であるかどうかを証明する決定的な証拠は、
いまだ発見されていないことに注意しなければならな
い。
〔発明の開示〕
得られるFSHが検出可能な痕跡量のLHおよび他の尿タ
ンパク質を全く含まないように純度で閉経後期の尿濃縮
物から、ヒト尿のFSHを単離し得ることが、ここに見い
出された。さらに、全く予期に反して本発明の尿のFSH
のアミノ酸分析は、既知のFSHβサブユニットについて
この技術分野で報告されている（例えば、前述のScott
らの文献を参照のこと）ような118個または108個に代わ
り111個のアミノ酸の新規なFSHβサブユニットを示し
た。より具体的には、本発明は次のようなアミノ酸配列
の新規なFSHβサブユニットを提供する。すなわち、 ならびに既知のゴナドトロンピαサブユニットおよび
前記のように特定される111個のアミノ酸βサブユニッ
トを含んでなる新規なタンパク質に関する。このタンパ
ク質は、卵胞刺激ホルモン（FSH）の生物学的活性を有
する。このものは、グリコシル化型のものが好ましい。
最も好ましくは、検出可能な痕跡の黄体形成ホルモンお
よび他の尿タンパク質を実質的に含まないものである。
本発明の追加の態様は、本発明の精製タンパク質およ
び薬学的に許容可能な賦形剤を含有する医薬組成物であ
る。この組成物は、皮下投与に適する剤形であるのが好
ましい。本発明の皮下注射用医薬組成物は、既知のFSH
製剤で通常遭遇するそれらのアレルギー反応の出現が起
こらない。
本発明の追加の態様に従えば、本発明の新規かつ高精
製FSHの製造方法が提案される。この方法は、実質的に
免疫精製工程と逆相HPLCとの組み合せに基づく。この免
疫精製工程は、実質的に前記英国特許出願第2,173,803A
号明細書において記載されるような固定化モノクローナ
ル抗体を使用するが、免疫複合物からFSHの溶離をより
高いpH値で実施する点で根本的に相違する。
本発明の溶離工程においては、好ましくはpHが約10を
超えそしてモル濃度が約０を超える水性溶液を使用して
実施される。出願人により実施された実験の条件下で
は、固定化抗体は実質的に不活化されないことが明らか
になった。これは、前述の英国特許出願明細書（第１ペ
ージ、第36〜37行）の「抗体の迅速な不活性化を招くの
でかかる高いpHを有する溶離剤の使用は、実際的には実
行不能である」との記載の教示と逆である。
この挙動の相違は、樹脂へ抗体を連結するために利用
した方法の相違に基づく可能性がある。
本発明によれば、溶離剤のpHは、好ましくは11を超
え、より好ましくは11.3〜11.7の範囲内にあるものであ
る。
モル濃度値は、好ましくは0.8を超え、より好ましく
は約１である。
本発明の方法に使用するのに適する溶離剤は、アンモ
ニア、ジエチルアミンならびにトリス（TRIS）緩衝剤お
よびグリシン−NaOHのような緩衝剤である。
次に、逆相高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）工程
は、すべての夾雑タンパク質の完全な除去を達成するこ
とを可能にするものである。この除去は、前記英国特許
出願明細書にも認められるように、免疫精製工程単独で
は達成されない。かかる工程が、残存する痕跡量の夾雑
タンパク質を効果的に除去するだけでなく、またFSHの
生物学的活性のすべてを保持することは、ウシFSHおよ
びヒトFSH（HMGの標準品）に対する生物学的活性が、そ
れらを逆相HPLCにかけた時に失活するとのP.Hallinおよ
びS.A.Khan〔J.Liq.Chromat.９（13）,2855〜68ペー
ジ、1986〕の論説を考慮すると驚くべきことである。他
方、同じ論文には、生物学的活性の十分な回収を示す
が、ヒトの尿調製物（すなわち、FSHおよびLHを共に含
有する）をイオン交換HPLCにかけた場合にほんの部分的
な分離を示すにすぎない。
後に続く前記HPLC工程では、常法によりFSHが回収さ
れる保存および／取扱いの目的で生成物を凍結乾燥して
もよい。生成物の濃縮、安定化またはその他の加工を実
施するための他の適当な手段は、熟慮される。
明らかに、閉経後期の尿の入手可能性は、ヒトの下垂
体よりはるかに大きい。この相対的な入手可能性が、出
願人の発明を非常に重要なものとする。
本発明の方法で使用するためのFSH−特異的モノクロ
ーナル抗体は、既知の手段を用いて産生することができ
る。
代表的な例では、ハイブリドーマ細胞株9/14が、Univ
ersity of CambridgeにおいてFSHに対する最適な親和性
についてスクリーニングされた。モノクローナル抗体は
細胞培養方法による培地の上澄中に産生され、硫酸アン
モニウム50％（w/v）を用いる塩分画、次いでイオン逆
相クロマトグラフィーおよびHPLCゲル濾過および透析に
より精製された。
細胞株9/14により産生されそして前述のように精製さ
れるモノクローナル抗体は、次のような規格を有してい
た。
ａ）タンパク質純度:90％以上 ｂ）免疫グロブリンのクラス:IgG 1 ｃ）親和性定数:3.5×108Ｌ・モル-1 ｄ）特異性：抗 原 交差反応％ FSH 100 HCG １ HCG−βサブユニット １ LH １ TSH １ ｅ）溶液中でのFSHに対するバインデング能：約1,000
I.U.FSH/mg McAb。
FSH−特異的モノクローナル抗体は、J.PorathによるM
othods in Enzymology 34.13〜30,1974に記載の方法に
従って、ジビニルスルホンを用いてセファロース4Bに化
学的に結合される。
代表的な例では、１のセファロース4Bを孔質ガラス
フィルター上で、最初に新鮮な蒸留水5lで洗浄し、次い
で1Mの炭酸ナトリウム（pH11）5lで洗浄した。洗浄した
セファロースを1Mの炭酸ナトリウム（pH11）１中に懸
濁した。攪拌しながらジビニルスルホン200mlを連続的
に滴下した。室温で70分して反応が終了し、次いで1Nの
HCl（pH7.0未満）を添加することにより停止した。
この活性化した樹脂を抗FSHモノクローナル抗体2gを
含有する0.25Mの炭酸ナトリウム（pH9.0）１に懸濁し
て活性化樹脂に90％を超えてバインディングする樹脂を
得た。得られた免疫樹脂を４℃で貯蔵した。
以下の実施例１は、市販のHMG、すなわちPergonal(R)
Serono中の活性成分に対して適用した場合の本発明の方
法の２つの精製工程を具体的に説明する。
HMGが本発明の工程において好ましい出発物質である
とはいえ、後者のあまり精製されていない閉経後期の尿
濃縮物やその類似物にも、また適用できることが理解さ
れる。好結果は、出発原料として1mg当り1 I.U.程度のF
SHを含有する尿濃縮を使用して得られた。
本発明の他の態様および利点は、次の実施例を考慮す
れば明らかになる、これらは限定を意図するものではな
い。
実施例1:高精製尿のFSH（hpuFSH）の調製 第１工程：抗FSH McAb−DVS−セファロースによる免疫
精製 HMGを出発原料として使用した。免疫樹脂抗FSH McAb
−DVS−セファロースを、４℃において0.1Mのトリス塩
酸、0.3MのNaCl緩衝液（pH＝7.5）により平衡化した。
そのカラムにその総FSHバインディング能の80〜90％
に相当するIU FSH量を負荷した。
保持されないタンパク質を溶離液にOD280が0.02未満
になるまで平衡化に用いた緩衝液で溶出した。
吸着uFSHを、４℃にて1Mのアンモニア溶液を用いて免
疫樹脂から溶離した。免疫樹脂容量の約４倍に相当する
アンモニア溶離液を集め、４℃にてできるだけ迅速に氷
酢酸を添加することによりpHを9.0に調節し、次いでア
ミコン（Amicon）装置（膜のC.O.10,000 D）によりその
溶液を限外濾過し、小量になるで濃縮した。
第２工程：逆相HPLC 得られた溶液をpH＝5.6に調節し、室温で予め0.05Mの
酢酸アンモニウム（pH＝5.6）で平衡化したC18逆相カラ
ム（Pro Pak waters）にかけた。
流速は100ml/分であり、そして溶離液は280nmにてモ
ニターした。
HPLC精製は、UV検出器および分取グラージェント発生
器を装備したPrep 500A装置（Waters）を使用して実施
した。
生物学的活性の高精製尿のFSHは、移動相の50％までの
イソプロパノールグラージェントにより溶出された。分
画は、分析用GPCおよびRIAによりチェックした。
有機溶媒を40℃における減圧下で留去し、次いで溶液
を凍結乾燥した。
実施例2:FSHの特性決定 本発明の高精製尿のFSH調製物を、その完全な特性決
定を行うために数種の化学−物理的、生物学的および免
疫学的試験にかけた。以下に示すように、前記試験の殆
んどは、後述する方法に従って得られた高精製下垂体の
FSHの対比により実施した。
その方法は、以下の工程からなる。
１）６％の酢酸アンモニウム（pH5.6）を含有する40％
のエタノールを用いる抽出による粗HPGの予備精製およ
び96％の冷エタノールを用いる上澄の沈澱工程。
２）溶出液として0.15Mの酢酸ナトリウム（pH7）を用い
るDEAEセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィー
によるHPGのさらなる精製、次いで96％の冷エタノール
を用いる沈殿工程。
３）緩衝液として0.05Mの炭酸アンモニウムを用いるセ
ファデックスＧ−100上でのゲル濾過によるFSH画分のさ
らなる精製工程。
４）SPセファデックスC50上でのイオン交換クロマトグ
ラフィーによるFSH精製の最終工程。高精製下垂体のFSH
を0.1Mのリン酸緩衝液（pH6.2）で溶出し、次いで凍結
乾燥した。
前記下垂体のFSHの生体内生物学的比活性（Steelman
−Pohley試験；第２のIRP−HMGのI.U.）は、後述の「バ
イオアッセイ」に記載される方法を使用すると、凍結乾
燥粉末1g当り4770 I.U.のFSHであることが決定された。
特性決定試験は、以下のように実施された。
LHの夾雑 この試験は、第２のIRP−HMGおよびトレーサーとして
125I〔両者とも最近Biodota(R)社から市場に出されたLH
terKIT（コード10204）に含まれる〕に対するLH標準検
量線を使用する特殊なラジオイムノアッセイによって実
施された。抗血清として使用される出願人により調製さ
れたヒッジの抗HCG血清は、LHに対して100％の交差反応
性を有し、FSHに対する交差反応性は0.1％未満であっ
た。
実施例１により調製された高精製尿のFSHは、製造者
の説明書におるRIA方法で検出可能なLH夾雑物が全く存
在しない結果を与えることが確認された。
前記の結果は、LKB−Pharmaciaにより市場に出された
DELFIA（解離−促進ランタニドフルオロイムノアッセ
イ）と称されるより一層好感度のアッセイを使用して確
認された。
SDS−PAGE SDS中でのスラブゲル電気泳動は、Nature,227,680〜6
85ページ（1970）にLaemmliによって記載された方法に
従い、13.5％ポリアクリルアミドゲル（pH＝8.8）によ
り還元条件下で実施された。
染色は、25％のメタノール/75％の酢酸溶液中、0.25
％のクーマシーブリリアントブルーを用いて実施され
た。
本発明のhpuFSH調製物および前述のように得られた高
精製下垂体FSH調製物（hppFSH）の両方ともこの試験に
かけた。尿のFSH調製物（uFSH）および下垂体のFSH調製
物（pFSH）の両方の吸収帯を分子量マーカー（M.W.）と
共に示す第１図に結果は図示される。
uFSHおよびpFSH調製のいずれも、糖タンパク質に典型
的な主要大吸収帯が、約20,000ダルトンの分子量と同じ
ところに見られ、これは文献値とも一致する。SDS−PAG
Eにおけるこれらの糖タンパク質の既知の挙動のため
に、この値は少し過大評価されている。
サイズ排除クロマトグラフィー hpuFSHおよびhppFSH両者の分析は、溶離液として0.1M
のリン酸緩衝液（pH6.8）と0.2MのNaClを用いてLKBによ
るTSK G200SWカラム上で実施した。流速は0.7ml/分であ
り、読み取りは波長230nmで行った。
結果を第２表に示すが、この図はuFSHおよびpFSHとも
実質的に同一の保持時間（それぞれ13.37および13.55
分）を有する単一の主ピークを示す。
等電点電気泳動 等電点電気泳動は、11.5％（w/v）のTCAおよび3.5％
（w/v）のスルホサリチル酸に固定した５％の薄層ポリ
アクリルアミドゲル（Anpholine LKB(R),pH3.5〜9.5）
上で実施し、銀染色法BIO−RAD(R)キットで染色した。h
ppFSHおよびhpuFSHの両者に対する結果を第３図に示
し、そして図には等電点マーカーも示している。この図
から理解できるように、尿のFSHおよび下垂体のFSHとも
数本の吸収帯を示すが、全くパターンは異なる。特に、
尿のFSHの主吸収帯は4.8より低い領域にあるが、一方、
下垂体のFSHはより高いpH領域に主吸収帯を示す。
この試験は、尿のFSHおよび下垂体のFSHは同一の分子
でなく、そしてそれら自体のタンパク質成分が相違しな
い場合には、少なくともそれらの炭水化物成分における
残基が異なることを示す。
バイオアッセイ hpuFSH生体内生物学的活性は、バイオアッセイ用HMG
の第２の国際的対照製品（2nd International Referenc
e Preparation）に対して検量されたHMG自家製標準物を
対照物質として使用して、スティールマン・ポーレイ
（Steelman Pohley）法（Endocrtinology 53,604〜616
ページ、1953）によって試験した。このアッセイは、FS
Hの生物学的活性の国際単位（I.U.）を決定するために
全ての主要な薬局方および保健当局により受け入れられ
ている。
前記実施例に従って得られるhpuFSH調製物は、凍結乾
燥粉末1mg当りFSHの比活性6200 I.U.を有することが判
明した（すなわち、FSH尿調製物について従来記載され
た最高の比活性）。
アミノ酸配列の決定 ａ）uFSHサブユニットの分離 uFSHサブユニットの分離は、カラムAquapore RP−300,2
00×4.6mm,7μｍ（Brownlee Labs）を装備したウォータ
ーズ（Waters）HPLCシステムを使用して実施した。
溶出液は、Ａ＝0.1％TFA（トリフルオロ酢酸、HPLCグ
レード、Pierce）、Ｂ＝アセトニトリル中0.055％TFA。
流速は、35℃にて1ml/分であり、初期条件は15％Ｂで
ある。
グラージェントは、20分で40％Ｂに上昇させる。
UV検出器は229nmに設定する。
分析操作では、通常、0.5mg/mlのhpuFSHおよび0.5％
のTFAの20μｌが注入される。
TFA溶液におけるプレインキュベーションは不要であ
る。
分取用の分離は、同一のカラムを使用して実施され
る。
良好な分離能は、Ａ緩衝液中に溶解された0.5mgのhp
ヒトuFSH（バッチn.032）を注入することにより達成さ
れた。画分を手動的に集め、スピード・バック・（Spee
d Vac）濃縮器を用いて乾燥させた。サブユニットを水
に溶解し、HPLCで分析し次いで−20℃にて貯蔵した。
βサブユニットは幅広いピークとして約10.5分後に溶
出され、αサブユニットは鋭いピークとして15分に溶出
した。
βサブユニットおよびαサブユニットとしてのそれぞ
れのピークの確認は、特異的RIAにより実施した。
一般に、βサブユニットの回収率は約50％であるが、
対照的にαサブユニットの回収率は90％を超えた。
ｂ）αサブユニットおよびβサブユニットの還元ならび
にカルボキシメチル化 ａ）項に記載のように分離されたそれぞれのサブユニッ
トの還元は、システイン含量に対して15倍モル過剰のDT
T（ジチオスレイトール、Serva）を使用して、0.5MのTr
is、0.1％のEDTA、6Mのグアニジン塩酸基（pH8.5）中、
37℃で２時間実施した。
次に、反応混合物にヨード酢酸ナトリウム（DTTに対
して2.1倍モル）を添加し、暗所に30分間静置した。
反応を停止するために、１％のメルカプトエタノール
およびTFAを添加した。
カルボキシメチル化サブユニットは、HPLCにより精製
された。βカルボキシメチル化サブユニットは、水への
溶解性が乏しいため、その最終収率はまったく低かっ
た。
ｃ）βサブユニットの還元、ピリジルエチル化およびト
リプチン消化 ａ）項に記載のように分離されたＢサブユニットの還元
は、次のように、すなわち0.5MのTtis、0.5ml中サブユ
ニット0.1mg、0.1％のEDTA、6Mのグアニジン塩酸基（pH
8.5）、ジチオスレイトール2.7mgを使用して室温下で２
時間実施した。ピリジルエチル化は、前記溶液に４−ビ
ニルピリジン0.02mlを添加することにより実施した。こ
の反応は、室温で２時間行った。最後に、反応混合物を
0.1％のTFAで平衡化したC4カートリッジ（Baker）上に
負荷した。このカートリッジを0.1％のTFAで洗浄し、次
いで0.1％のTFA中40％のアセトニトリルでピリジルエチ
ル化βサブユニットを溶出した。この溶出画分を濃縮
し、βサブユニットについて先に説明したようなHPLCに
よって精製した。前述のようにHPLCによって精製したピ
リジルエチル化βサブユニットを、１％のNH4HCO3（pH
8）に溶解した。
この溶解にトリプシンを添加し、37℃で1.5時間反応
を実施した。トリプシン分解画分を、30分に０％から55
％に至る濃度勾配およびUV検出器を214nmに設定する以
外は前述と同様な方法を使用するHPLCによって精製し
た。
このトリプシン分解画分を、サブユニットの配列決定
（ｅ）項参照）について記載されるのと同じ方法で配列
決定された。
ｄ）αサブユニットの配列決定 αサブユニット、カルボキシメチル化αサブユニッ
ト、または完全な高精製ヒトのuFSHを使用してタンパク
質シーケンサー（470A,Applied Biosystem）にそれぞれ
５ナノモル以下を負荷し、Applied Biosystemから入手
した標準03RPTHプログラムまたはこれもApplied Biosys
temから入手される特殊プログラム（03CPRO）（ここで
は、ProもしくはGlyの回収率が最大となる）に従って数
種の配列決定実験を行った。この特殊なプログラムは、
配列中にProもしくはGlyが予期される場合に標準プログ
ラム（03RPTH）の代わりに使用する。その分子のNH2末
端から出発して最初の45個の残基を固定したところ、そ
の結果は文献〔J.Biol.Chem.250,6735ページ（1975）〕
から知られているアミノ酸配列であることが確認され
た。Alaから出発する既知の配列に関連する52位および7
8位におけるAsnは、グリコシル化が生じるアミノ酸であ
る。NH2末端では常に異型が存在し、そして配列決定さ
れた全ての試料において同様である。完全な分子（すな
わち、Alaから出発するもの）は、前記連鎖類において6
5％存在し、最初の２つのアミノ酸が欠失している分子
（すなわち、Aspから出発するもの）は５％存在し、最
初の３つのアミノ酸が欠失している分子（すなわち、Va
lから出発するもの）は30％存在する。
（αサブユニットの異型性。） ａ）βサブユニットの配列決定 βサブユニット、カルボキシメチル化βサブユニッ
ト、完全な高精製ヒトｕ−FSHおよびピリジルエチル化
βサブユニットに由来するトリプシンペプチド類を使用
して、数種の配列決定実験を行った。
Applied Biosystemより入手した標準03RPTHプログラ
ムを使用するタンパク質シーケンサー（470A,Applied B
iosystem）にかけた。その結果は、βサブユニットが11
1個のアミノ酸長であり、次のアミノ酸配列を有するこ
とを示した。
１位におけるAsnから出発する上記配列に関する７位
および24位のAsnは、グリコシル化が生じるアミノ酸で
ある。βサブユニットのNH2末端においては、常に異型
が存在し、配列決定されたすべての資料に同様であっ
た。完全な分子（すなわち、Asnから出発するもの）
は、前記連鎖類の35％存在し、最初のアミノ酸が欠失し
ている分子（すなわち、Serから出発するもの）はその1
5％存在し、最初の２つのアミノ酸が欠失している分子
（すなわち、Cysから出発するもの）は、その50％存在
する。
（βサブユニットの異型性。） 実施例3:医薬製剤 本発明のhpuFSHを含有する医薬投与剤型の調製は、特
に難しいものでもない。物質が凍結乾燥後にその生物学
的活性を保持するなら、このものは注射剤として好まし
い剤型である。
凍結乾燥hpuFSH含有製剤は、生理食塩水および／また
は他の適当な希釈剤を使用して注射液が得られた。
それらの一部として、ある種の賦形剤、例えばマンニ
トール、ラクトース、グリシン、グルコース、サッカロ
ースおよびそれらの混合物を組成物中で適当に使用する
ことができる。他の常用の担体、増量剤などを使用する
こともできる。混合物は調製可能である。
本発明で実施される例では、注射製剤用の賦形剤とし
てラクトースが使用された。
注射剤を調製するにあたって、場合により一般的な酸
または塩基剤を添加することによってpHを調整してもよ
い。酸剤には酢酸などが包含される。塩基剤には水酸化
ナトリウムなどが包含される。混合物もまた使用するこ
とができる。
１種以上の安定剤、例えばアルブミンなどの使用も自
由である。
それぞれ75 I.U.のFSHを含有する１バッチ20,000アン
プル製造用の代表的な製剤方法は以下のとおりである。
計算量（生物学的活性の単位について）の凍結乾燥FS
Hバルク粉末を注射用の無発熱物質源性の冷水700mlに溶
解した。必要に応じて、酢酸かまたは水酸化ナトリウム
（当ケース）を使用することによりpH6.2〜6.8に再調整
した。次に、この溶液を0.2ミクロンの細孔を有するフ
ィルターを通して滅菌した。
ラクトース200gを注射用の無発熱物質源性の水2lに溶
解し、前述のように滅菌処理して前記FSH溶液に添加し
た。
注射用の無発熱物質源性の水を終容量が15lになるま
で添加し、この溶液をアンプル（各0.75ml）に分注し、
次いで低温滅菌凍結乾燥で凍結乾燥した。
それぞれ75 I.U.のFSHおよびラクトース10mgを含むア
ンプルが得られた。
好ましくは、アンプルは、150 I.U.のFSHを含んでも
よい。
別の医薬製剤の例では、前記賦形剤ラクトースに滅菌
したヒトアルブミン1mgをさらに添加したものを含めて
調製した。
本発明を具体例に従って説明してきたが、これらの変
型は本発明の思想および範囲から外れるものではないで
あろうことを理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シルナ，アントニーノ イタリア国，00126 ローマ，ビア デ イ モンティ ディ エッセ．パオロ 126 (72)発明者 ビッラ，ステファーノ イタリア国，00195 ローマ，ビア オ スラビア 37 (56)参考文献 特表 昭63−500212（ＪＰ，Ａ) 英国特許2173803（ＧＢ，Ａ) Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏ ｌ．９，Ｎｏ．13，Ｐ．2855−2868 （1986)

Claims (22)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】α−およびβ−サブユニットを含んで成る
    卵胞刺激ホルモン（FSH）調製物であって、α−サブユ
    ニットがゴナドトロピンのα−サブユニットであり、か
    つβ−サブユニットが次のアミノ酸配列 を有し、その凍結乾燥の粉末のmg当たり6,200I.U.以上
    の卵胞刺激ホルモンのFSH比活性を有し、そして実質的
    に検出可能な痕跡量の横体ホルモン（LH）およびその他
    の尿タンパク質を含まないことを特徴とする調製物。
  2. 【請求項２】前記β−サブユニットが110個のアミノ酸
    を有し、且つはじめのAsn（１位）を欠く請求項１にお
    いて特定するアミノ酸に相当する、請求項１記載の調製
    物。
  3. 【請求項３】前記β−サブユニットが109個のアミノ酸
    を有し、且つはじめのAsnおよび２位のSerを欠く請求項
    １において特定するアミノ酸に相当する、請求項１記載
    の調製物。
  4. 【請求項４】前記ゴナドトロピンのα−サブユニットが
    次のアミノ酸配列、 を有する請求項１記載の調製物。
  5. 【請求項５】前記α−サブユニットが90個のアミノ酸を
    有し、且つはじめのAlaおよび２位のproを欠く請求項４
    において特定するアミノ酸に相当する、請求項１〜４の
    いずれかに記載の調製物。
  6. 【請求項６】前記α−サブユニットが89個のアミノ酸を
    有し、且つはじめのAla、２位のProおよび３位のAspを
    欠く請求項４において特定するアミノ酸に相当する、請
    求項１〜５のいずれかに記載の調製物。
  7. 【請求項７】グリコシル化型である請求項１〜６のいず
    れかに記載の調製物。
  8. 【請求項８】前記β−サブユニット類の７位および24位
    におけるAsnならびに前記α−サブユニット類の52位お
    よび78位におけるAsnがグリコシル化された請求項７記
    載の調製物。
  9. 【請求項９】ヒトの閉経期の尿から抽出された請求項１
    〜８のいずれかに記載の調製物。
  10. 【請求項１０】請求項１〜９のいずれかに記載の調製物
    を調製するための方法であって： （ａ）閉経後期の尿濃縮物をFSH特異的固定化モノクロ
    ーナル抗体を使用する免疫精製にかける； （ｂ）FSHを回収するためにアルカリ性溶離剤により溶
    離させる；および （ｃ）残存する任意の痕跡夾雑物を逆相HLPCにより除去
    する； 含むことを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】請求項１〜９のいずれかに記載の調製物
    を調製するための方法であって： （ａ）ヒトの閉経期ゴナドトロピン（HMG）をFSH特異的
    固定化モノクローナル抗体を使用する免疫精製にかけ
    る； （ｂ）FSHを回収するためにアルカリ性溶離剤により溶
    離させる；および （ｃ）残存する任意の痕跡夾雑物を逆相HLPCにより除去
    する； 含むことを特徴とする方法。
  12. 【請求項１２】前記溶離剤が、約10を越えるpHおよび約
    0.5を越えるモル濃度を有する水性溶液であることを特
    徴とする請求項10また11記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記溶離剤が、11.3〜11.7の範囲内にあ
    るpHおよび約１のモル濃度を有することを特徴とする請
    求項12記載の方法。
  14. 【請求項１４】前記溶離剤が、1Mのアンモニアであるこ
    とを特徴とする請求項10〜13のいずれかに記載の方法。
  15. 【請求項１５】請求項１〜９のいずれかに記載の調製物
    または請求項10〜14のいずれかに記載の方法により調製
    した調製物の療法上有効量を含有する不妊症の療法のた
    めの医薬製剤。
  16. 【請求項１６】適当な賦形剤を含んで成る請求項15記載
    の医薬製剤。
  17. 【請求項１７】前記賦形剤ガラクトースである請求項16
    記載の医薬製剤。
  18. 【請求項１８】請求項15〜17のいずれかに記載の注射可
    能な凍結乾燥された医薬製剤。
  19. 【請求項１９】皮下投与に適用される請求項15〜18のい
    ずれかに記載の医薬製剤。
  20. 【請求項２０】アンプル当たり約75 I.U.のFSHを含む請
    求項15記載の医薬製剤。
  21. 【請求項２１】アンプル当たり約150 I.UのFSHを含む請
    求項15記載の医薬製剤。
  22. 【請求項２２】安定剤としてヒトアルブミンを含んで成
    る請求項15〜21のいずれかに記載の医薬製剤。
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ZA (1) ZA884492B (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2119727A1 (en) 2008-05-16 2009-11-18 JCR Pharmaceuticals CO., LTD. Method for production of recombinant human FSH
US10537723B2 (en) 2014-09-11 2020-01-21 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Microneedle device
US10632065B2 (en) 2014-10-27 2020-04-28 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Microneedle device containing recombinant follicle stimulating hormone

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IT1206302B (it) * 1987-06-26 1989-04-14 Serono Cesare Ist Ricerca Ormone follicolo-stimolante urinario
US5087615A (en) * 1989-03-17 1992-02-11 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Novel method of ovulation induction in humans
IT1250075B (it) * 1991-12-18 1995-03-30 Serono Cesare Ist Ricerca Composizioni farmaceutiche contenenti gonadotropine.
IT1270866B (it) * 1993-03-10 1997-05-13 Eniricerche Spa Vettore ricombinante e suo impiego per la preparazione esocellulare di anticorpi in forma di singola molecola da bacillus subtilis
US6737515B2 (en) * 1993-11-19 2004-05-18 Washington University Follicle stimulating hormone-glycosylation analogs
US6162905A (en) * 1996-11-07 2000-12-19 Ibsa Institut Biochimique S.A. FSH and LH separation and purification process
TW518235B (en) * 1997-01-15 2003-01-21 Akzo Nobel Nv A gonadotropin-containing pharmaceutical composition with improved stability on prolong storage
US5990288A (en) * 1997-10-21 1999-11-23 Vitro Diagnostics, Inc. Method for purifying FSH
US6414123B1 (en) * 1997-10-21 2002-07-02 Vitro Diagnostics, Inc. Method for purifying FSH
JP4719357B2 (ja) * 1998-07-23 2011-07-06 アレス トレイディング ソシエテ アノニム Ｆｓｈ及びｆｓｈ変異体の製剤、製品及び方法
US20030166525A1 (en) * 1998-07-23 2003-09-04 Hoffmann James Arthur FSH Formulation
AU779869B2 (en) 1999-04-13 2005-02-17 Nektar Therapeutics Pulmonary administration of dry powder formulations for treating infertility
GB9924351D0 (en) 1999-10-14 1999-12-15 Brennan Frank Immunomodulation methods and compositions
JP2001349892A (ja) * 2000-04-03 2001-12-21 Unilever Nv 検査方法及びデバイス
PT1282418E (pt) * 2000-05-19 2005-10-31 Applied Research Systems Utilizacao de derivados pirazolo para o tratamento da infertilidade
ES2281458T3 (es) * 2000-12-21 2007-10-01 Nektar Therapeutics Composiciones de polvo estables en almacenamiento del receptor de interleucina 4.
MEP38608A (en) * 2001-10-22 2011-02-10 Merck Serono Sa Gonadotrophins for folliculogenesis
US7317095B2 (en) 2001-10-22 2008-01-08 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Mutant glycoproteins
US7754722B2 (en) 2002-09-20 2010-07-13 Merck Serono Sa Piperazine derivatives and methods of use
EA200501548A1 (ru) * 2003-04-01 2006-02-24 Апплайд Резеч Системз Арс Холдинг Н.В. Ингибиторы фосфодиэстераз при бесплодии
AR043972A1 (es) * 2003-04-02 2005-08-17 Ares Trading Sa Formulaciones farmaceuticas de fsh y lh
EP1638595B1 (en) * 2003-06-20 2013-03-20 Ares Trading S.A. Freeze-dried fsh / lh formulations
JP4763616B2 (ja) 2003-12-22 2011-08-31 アレス トレーディング ソシエテ アノニム Ｆｓｈを精製するための方法
US20070270339A1 (en) * 2004-04-23 2007-11-22 Serono, Inc. Use of GPCR54 Ligands for the Treatment of Infertility
MX2007005327A (es) * 2004-11-09 2007-08-02 Ares Trading Sa Metodo para purificacion de la hormona foliculo estimulante (hfe).
KR20080044836A (ko) 2005-07-15 2008-05-21 라보라뚜와르 세로노 에스. 에이. 자궁내막증 치료용 ｊｎｋ 억제제
BRPI0613042A2 (pt) 2005-07-15 2010-12-14 Serono Lab inibidores de jnk para o tratamento de endometriose
SG155183A1 (en) 2005-08-26 2009-09-30 Ares Trading Sa Process for the preparation of glycosylated interferon beta
KR20080052650A (ko) 2005-09-07 2008-06-11 라보라토리스 세로노 에스.에이. 자궁내막증 치료용 ｉｋｋ 저해제
CA2612613A1 (en) * 2005-09-14 2007-03-22 Mara Rossi Method for the determination of poloxamers
AU2006323925B2 (en) 2005-12-09 2012-08-02 Ares Trading S.A. Method for purifying FSH or a FSH mutant
AU2008279584A1 (en) * 2007-04-27 2009-01-29 Dow Global Technologies Inc. Improved production and in vivo assembly of soluble recombinant icosahedral virus-like particles
UA103598C2 (uk) 2007-06-28 2013-11-11 Биодженерикс Аг Клон клітин, що продукують fsh
WO2009098318A1 (en) 2008-02-08 2009-08-13 Biogenerix Ag Liquid formulation of fsh
TWI488640B (zh) 2008-04-16 2015-06-21 Ferring Int Ct Sa 藥學製劑
CN101269215B (zh) * 2008-05-15 2011-03-23 上海天伟生物制药有限公司 一种糖蛋白激素组合物
AU2010234028B2 (en) 2009-04-01 2013-11-14 Theramex HQ UK Limited Method for purifying recombinant FSH
TWI604850B (zh) 2009-10-05 2017-11-11 菲瑞茵國際中心股份有限公司 藥學製劑
EP2325194A1 (en) 2009-11-24 2011-05-25 Glycotope GmbH Process for the purification of glycoproteins
CA2831486A1 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Ferring B.V. Pharmaceutical preparation
CN103509121B (zh) 2012-11-22 2015-01-28 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 一种fsh融合蛋白及其制备方法和用途
RU2755000C2 (ru) * 2016-10-11 2021-09-08 Онкогреен Тхерапеутикс Са Лиганды к рецептору фолликулостимулирующего гормона (FSH) в диагностике и лечении опухолей
CN111349154A (zh) * 2018-12-21 2020-06-30 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 一种重组人促卵泡激素及其制备方法和药物应用
MX2022007638A (es) * 2019-12-26 2022-07-19 Lg Chemical Ltd Procedimiento de purificacion de la hormona foliculoestimulante.
CN113583125B (zh) * 2021-07-09 2022-09-20 苏州晟济药业有限公司 抗体以及包含其的结合剂、免疫吸附材料及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2173803A (en) 1985-04-22 1986-10-22 Health Lab Service Board Isolating pituitary glycoprotein hormones

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3852422A (en) * 1971-06-26 1974-12-03 Serono Ist Farm Long-active gonadotropins
SU618113A1 (ru) * 1976-11-19 1978-08-05 Всесоюзный научно-исследовательский институт технологии кровезаменителей и гормональных препаратов Способ получени фолликулостимулирующего гормона
US4923805A (en) * 1983-11-02 1990-05-08 Integrated Genetics, Inc. Fsh
US4845077A (en) * 1984-04-03 1989-07-04 Serono Laboratories, Inc. Method of inducing ovulation
EP0161063B1 (en) * 1984-04-03 1991-07-24 Serono Laboratories, Inc. Method of inducing ovulation
GB2174600B (en) * 1985-05-10 1989-12-20 Univ Melbourne Induction of ovulation in mares
IT1206302B (it) * 1987-06-26 1989-04-14 Serono Cesare Ist Ricerca Ormone follicolo-stimolante urinario

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB2173803A (en) 1985-04-22 1986-10-22 Health Lab Service Board Isolating pituitary glycoprotein hormones

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｉｑｕｉｄＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，Ｖｏｌ．９，Ｎｏ．１３，Ｐ．２８５５−２８６８（１９８６）

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2119727A1 (en) 2008-05-16 2009-11-18 JCR Pharmaceuticals CO., LTD. Method for production of recombinant human FSH
US7939296B2 (en) 2008-05-16 2011-05-10 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of recombinant human FSH
US10537723B2 (en) 2014-09-11 2020-01-21 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Microneedle device
US10632065B2 (en) 2014-10-27 2020-04-28 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Microneedle device containing recombinant follicle stimulating hormone

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