JPH01502662A - たん白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 た　ん　白 丑ｊＬ走野。

本発明は、卵胞液中のＦＳＨ抑制活性を有するたん白の同定に関するものである 。これらたん白は、ＦＳＨ抑制活性を有する別種のインヒピンとは特定ラジオイ ムノアッセイにおける反応性が欠除していること、ならびに分子量およびＮＨ！ 末端アミノ酸配列が異なること、およびサブユニット構造を有さないこと等の点 において区別することが出来る。

！ｉ技血 下垂体筒たん白ホルモンであるフオリトロピン（ＦＳＨ）およびルトロビン（Ｌ ｍ（）は視床下部放出ホルモンＧｎＲＨに応じて分泌されることが知られている 。これらは性腺に作用し、そして次いで性腺はフィードバック禁止剤として作用 するホルモンを産出する。ＬＨのフィードバック禁止作用はほとんど専ら性腺ス テロイドの作用によるものであるが、ＦＳＨのそれは１部は性腺糖たん白ホルモ ンインヒビンの作用によるものであり、かつ１部は性腺ステロイドによるもので あると考えられてしする。

最近インヒビンは均質体にまで精製され、そしてその基本構造が遺伝子配列から 決定された。これはミュラー抑制物質（ＭＩｓ）および形質転換成長因子β（Ｔ ＧＦ−β）を含む遺伝子ファミリーの１貝である。インヒビンはＡおよびαサフ ゛ユニットとＢおよびβサブユニットとから成るヘテロ２量体であり、そしであ る種においてはβ１およびβ■と呼ｉｆれる２つの型のβサブユニットがありこ れらはそれぞれαβ、およびαβ、型インヒビンを形成する。

驚くべきことには、β、ホモ２量体およびβ、β、ヘテロ２量体は卵胞液中に存 在しそしてインヒビンとは逆の作用を有することが発見された。すなわち、これ らはＦＳＨの合成および放出を刺激する作用を有し、そして「アクチビンＪ　（ Ｌｉｎｇ等のＮａｔｕｒｅ、　３２１．７７９〜７８２　（１９８６））又はｒ ＦＲＰＪ　（ＦＳＨ放出ペプチド）　（Ｖａｌｅ等のＮａｔｕｒｅ、　３２１． ７７６〜？７９　（１９８６））と命名された。この分野の概要についてはＴｓ ｏｎｉｓおよび５ｈａｒｐｅのＮａｔｕｒｅ、　３２１．７２４〜７２５　（１ ９８６））に述べられている。

本発明は、ＦＳＨ抑制たん白（ＦＳＰ）と命名されたＦＳＨ抑制作用を有する第 ２のたん白質型の分子を単離することを目的とする。

ＦＳＰはＦＳＨレベルを抑制することが出来るので、免疫付与によるかあるいは ＦＳＰ投与後のＦＳＨレベルにおける反作用を利用することによって受精力を促 進する様な場合の両性用の避妊剤として、あるいは又性腺機能をモニターする場 合の診断補助剤として有用であると考えられる。しかしながら、このたん白はそ の下垂体ＦＳＩ（産生の抑制作用に基づいて精製されそしてＦＳＰと命名されは したが、その名前の意味する作用以外にも多くの作用（例えば成長因子／分化因 子の作用も含めて）も又有している事実を否定することは出来ない０例えば、Ｍ ＩＳは卵母細胞減数分裂禁止剤としても作用し、そしてＴＧＦ−βはＦＲＰ／ア クチビン様作用を有する。

光里立皿水 第１の態様として本発明は、ＦＳＰと命名されたＦＳＨ抑制活性を有する特殊な たん白を卵胞液から単離しそしてその特性決定をするものである。該たん白は還 元剤を使用しない５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に３０〜６０ｋＤの範囲内に ある分子量を有する。

ウシ卵胞液から単離したものは、同一のＮＨ２末端アミノ酸配列を有するという 特性が認められた。これらは、Ｎ、−末端アミノ酸配列および分子量の違い、な らびにサブユニット構造がないこと、インヒビン免疫活性がないことそして更に は管内試験においてインヒビン抗血清を中和してその生物活性を中和する作用を 有さない等の事実からインヒビンとは区別されるものである。培養した下垂体細 胞のＦＳＨ！ｉｌ胞成分を抑制する作用を基準としたこれらの「インヒビン様」 生物活性は、本文中記載の方法で精製した場合に、ウシ３１とＤインヒビンの活 性の５〜１０％である。

第１の好ましい態様として本発明は、管内でＦＳＨ分泌を抑制する能力を有する ウシ卵胞液（ｂＦＦ）から単離した１本鎖たん白を提供する。この１本鎖たん白 は、還元剤を使用しない５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に約３１ｋＤ、約３５ ｋＤおよび約３９ｋＤの見かけの分子量を有する。

第２の好ましい態様として本発明は、管内でのＦＳＨ分泌を抑制する能力を有す るヒト卵胞液（ｈＦＦ）から単離した１本鎖（ｔｌりたん白を提供する。これら は還元剤を使用しない５ＤＳ−ＰＡＧＥで測定した場合に約４０ｋＤないし約６ ０ｋＤ、好ましくは約４６ｋＤ又は約５５ｋＤの分子量を有する。

なお本発明は、本発明のたん白の分解生成物やその同等合成体（これらはＦＳＰ の生物学的および免疫学的活性を維持すると考えられる）をも提供するものであ ると認められる。これら分解生成物や同等合成体も又避妊剤としであるいはモニ ター機能用の診断助剤として有用である。

又、そのＮｌ（、末端アミノ酸配列の決定を含めてＦＳＰの特性決定をすること は、本文中に記載の様な天然物質源からの精製以外の方法によってもＦＳＰを生 産することが出来る道を開くものである。この様な方法としては、ｃＤＮＡ技術 を含めた組換えＤＮＡ技術および（または）その他の精製スキーム等があげられ る。

本発明は又、本発明のたん白の少なくとも１種と非毒性担体又は希釈剤とから成 る組成物を提供するものである。

本発明の組成物は経口投与用のものでも又注射型のものでも良く、そして好まし い医薬として又は動物用医薬として許容されるアジュバントを含むものである。

又本発明の組成物は、徐放性型の組成物、特にを推動物における移植および徐放 性剤に通した組成物をも含有するものである。この様な剤型においては、該組成 物はを推動物中に移植して性腺機能に作用しそしてその所望の効果が達成された 後に取り除くことが出来る。

又本発明は、有効量の本発明組成物をを推動物に投与することから成る、を推動 物における性腺機能に作用する方法も含むものである。

更に別のＢ様として又本発明は、本発明のたん白の１種又はそれ以上あるいは本 発明の組成物を投与することによりを推動物に免疫付与した結果として得られる 抗体製剤を包含するものである。この様な抗体製剤としてはポリクローナルおよ びモノクローナル抗体製剤を挙げることが出来る。これら抗体製剤は、本発明の たん白又は組成物を適当な希釈剤又はアジュバント、例えばフロイント型アジュ バント又はマーコール型アジュバントで乳化した後これを適当な投与経路により 哺乳動物ホストに投与しそして通常のワクチン化法を利用して作ることが出来る 。

こうして作られた抗体は実際にポリクローン性又はモノクローン性であり、そし てこれはもちろん使用した製造方法に依存するものである。この様な抗体は診断 器材として使用出来又、ホストへの受動投与としても使用出来る。

本文中においてｒＥｓＰ、は非種特異性であるので、ＦＳＰの関連種をすべて、 例えばウシ、ヒト、ヒツジ、ブタ、ウマ、トリ、および魚ＦＳＰ、そして特にヒ トおよびウシＦＳＰを包含するものである。又このｒＥｓＰＪは非グリコジル化 およびグリコモル化ＦＳＰ種のいずれも包含する。

又本文において「を推動物」とは魚類、両性類、爬虫類、鳥類および哺乳類（ヒ トを含む）を包含するものである。

国際特許出願筒ＰＣＴ／ＡＵ８５１００１１９号に記載のインヒビンの用途を、 インヒビンおよびＦＳＰが生物活性を共有すると示された範囲においてＦＳＰに も適用し得ると考えられる。

本発明は種々のＦＳＰの用途を包含するものであり、例えば、哺乳類におけるＦ ＳＨレベルの抑制方法；哺乳類におけるＦＳＨレベルの上昇方法；雌性哺乳類に おける排卵率を増加する方法；雄性哺乳類における精子形成を増強する方法；雌 雄両性の哺乳類における受胎能（繁殖能）を減少する方法：性的に未成熟な雌性 又は雄性の哺乳類における思春期の始まりを促進する方法：雌性又は雄性の哺乳 類における思春期の始まりを遅らせ、あるいは思春期を抑制する方法；早熟な思 春期の治療法；哺乳類の受胎可能状態を決定する方法；ならびに哺乳類における 排卵の抑制方法等を挙げることが出来る。これらの方法においてはいずれも、本 発明のたん白、組成物又は抗体を必要に応じて適当な投与量を哺乳類に投与する のである０例えば、排卵の抑制にはＬ）（の分泌を抑制するのに充分な高投与量 のＦＳＰを投与することが必要となる。

更に又本発明は本発明の抗体を使用することを特徴とするＦＳＰの分析方法も包 含する。

凹皿Ω呈垂星延凱 本発明は上述の様に広範に及ぶ態様を包含するものであるが、本発明の好ましい 態様を更に下記の実施例および添付の図面により説明する。

添付図面中、第１図はゲル透過分画後のｂＦＦＦＳＰ含有画分のＲＰ−ＨＰＬＣ を示すＲＰ−ＨＰＬＣクロマトダラムである。中性および酸性条件下での２回の 連続するゲル透過工程から得られたＦＳＰ含有画分を、０．１％ＴＦＡ中の０〜 ５０％アセトニトリルの３０分直線勾配を使用したウルトラボアＲＰＳＣカラム で分画した。２番目のパネルで、破線は雲７４９抗血清で測定したインヒビン免 疫活性を示すものであり、実線はＩ４７４抗血清で測定した同活性である。（詳 しくは後記した。）第２図は３１．３５および３９ｋＤＦ　Ｓ　Ｐおよびウシ３ １ｋＤインヒビンの精製物の銀着色分析５ＤＳ−ＰＡＧである。試料は１２．５ ％ボリアクリルアミドゲル上で電気泳動しそして銀着色した。試料はβ−メルカ プトエタノールで還元した。標準分子量はウシ血清アルブミン６７０００　、オ バルプミン４３０００　、炭酸脱水素酵素２９０００　、ガチツウ卵リゾチーム ２０８００　、ニワトリ卵リゾチーム１４３００である　Ｉ　ｇウシ３１ｋＤイ ンヒビン。

第３図は管内培養ラット下垂体細胞の基本ＦＳＨおよびＬＨ（培地内）放出量お よび細胞内含有量に及ぼすＦＳＰおよびインヒヒンの作用を示す、ＦＳＰおよび インヒビンのＦＳＨ培地投与一応答線は一致しなかった。

同投与一応答線はＦＳＨ細胞内含有量については一致した。

第４図はｈＦＦからのｈＦｓＰ生物活性のＲＰ−ＨＰＬＣによる分離を示す、尚 更に詳細については第１図を参照のこと。

第５図はヒトＦＳＰの調製用ＰＡＣ；Ｅである。ＲＰ−ＨＰＬＣにより得られた ＦＳＰ含有画分（第４図参照）を更に１０％ＰＡＧで分画しそして次いで電気溶 出工程にかけた。ＦＳＨ抑制活性は各画分に測定された。たん白標準マーカー（ 第２図参照）との関連において、ＦＳ）Ｉ抑制活性は４６および５５ｋＤに見ら れるピーク活性を有するゲルの４０〜６０　ｋ　Ｄ　領域中に同定された。

るための　の１！！ 本文中においては下記の略語を使用した。

ｂＦＦ：ウシ卵胞液 ｂＦＳＰ：ウシＦＳＨ抑制たん白 ＣＧ二絨毛ゴナドトロピン Ｄ：ダルトン ＤＴＴ　ニジチオスレイトール ＥＤＴＡ：エチレンジアミンテトラ酢酸ＥＬＩＳＡ：エライザ（酵素結合イムノ ソルベントアッセイ）ＦＲＰ　：　ＦＳＨ放出ペプチド ＦＳＨ：フォリトロピン又は卵胞刺激ホルモンＦＳＰ　：　ＦＳＨ抑制たん白 χＧ二重力による力の〜倍 ｇニゲラム ＧｎＲＨ：ゴナドトロヒン放出ホルモン又はＬＨＲＨｈＦＦ：ヒト卵胞液 ｈＦｓＰ　：ヒトＦＳＨ抑制たん白 ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィーに：　（接頭語としての）キロ ｔ；リットル ＬＨニルトロピン又は黄体形成ホルモンＬＨＲ）Ｉ　：黄体形成ホルモン放出ホ ルモンＭ：モル濃度 ｍ：　（接頭語としての）ミリ ＭＩＳ：ミュラー禁止物質 ｍｏｌ　：　モル ＭＷ；分子量 Ｐ：　（接頭語としての）ピコ ｎ：　（接頭語としての）ナノ ＰＡＧ：ポリアクリルアミドゲル ＰＡＧＥ：ポリアクリルアミドゲル電気泳動ＰＣＭＢ：バラクロルメルクリ安息 香酸ＰＭＳ　：閉経後血清 ＰＭＳＦｓふう化フェニルメチルスルホニルＰＭＳＧ　：妊娠雌つマ血清ゴナド トロピンＲＩＡニラジオイムアッセイ ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相ＨＰＬＣ ３ＤＳ　ニドデシル硫酸ナトリウム ＳＳ：去勢ウシ血清 Ｔｒｉｓ：）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタンμ：（接頭語としての）ミ クロ −１：重量 １隻■土 ＦＳＨを−ん　ＦＳＰ　れる　シ　′　ｂＦＦたん　の　゛よび　。

二皿豹五抜 使用したたん自分離性はウシ３１ｋＤインヒビンの単離用にすでに知られている 方法に準じたものである（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等、Ｍｏｌ　。

Ｃｅ１ｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、、　ｊｇ＋　２７１−２７７　（１９８６） 　＊ウシ卵胞液を、０．０５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ７，０）を使用したセフ ァクリル５２００ＨＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）でのゲルろ過クロマトグラフィ ーにより分画した。ｐＨ沈でん工程後、ボイド容積画分を４Ｍ酢酢酸上セファデ ックス０１００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）のゲルろ過により分画した０次いで ３１ｋＤインヒビン含有画分を逆相ＨＰＬＣにより分離した（第１図）０画分５ ２〜６０中に局在する抑制活性線分は３１ｋＤインヒビン（画分６１〜６８）よ り早く溶出した。ＦＳＰ含有画分を、勾配浸漬因子を基準とした同様の逆相ＨＰ ＬＣ条件下に０．１％ＴＦＡ中のゆるやかな２０−４０％アセトンニトリル勾配 を使用して再処理した０次いで試料を１０％アクリルアミド５ＤＳ−ＰＡ（：、 Ｅ系上で分画しくＬａｅ＋ｗ＋＋＋ｌｉ、　Ｖ、に、のＮａｔｕｒｅ、　′ｍＬ ６８０−６８５　（１９７０）、そして電気溶出工程によりゲルから試料を再生 した（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等のＭｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、＋　９Ｌ 　２２７−２３６（１９８３）。電気溶出した試料からＳＤＳを除去するために 、約３％のＳＤＳを含有するこれらを０．１％ＴＦＡで０．２％ＳＤＳの最終濃 度にまで希釈し、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　ＲＰ３００カラム（３０Ｘ２．１　ｍ。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ社）に供給しそして０．４　ＷＩｌ／分 の速度で０．１％ＴＦＡ中３０分０−７０％のアセトニトリル勾配により分画し た。溶出試料を２０ｐｌの０．０２％ＳＤＳを含有ひるシリコン管中に集めて凍 結乾燥した。

アミノ酸配列決定は、気−液相モデル４０７Ａシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｓｓ社）およびＨＰＬＣにより同定したＰＴＨ−アミノ酸（ Ｚｉｓｓｅｒｍａｎ等のＡｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、７７＋　５６９−５７３ 　（１９７７））を使用して行なった。

Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ　（ＮＢＲ Ｆ、　ＧｅｏｒｇｅｆｏｗｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔ ｅｒ）からのたん白配列データベースを配列同定判断に使用した。

成体雄Ｓｐｒａｇｕｅ−［１ａｗｌｅｙラット由来の下垂体細胞培養物を上記の 様にして用意した＊　（Ｓｃｏｔｔ等のＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌＯｇＬ　」虹、　 １５３６−１５４２　（１９８０））、培養後２日目にインヒビンとＦＳＰ画分 とを加え、そして５日目に培地と細胞を分離した。培地および細胞溶解産物中の ＦＳ）（およびＬＡをＲ１，Ａにより測定した。先の培養条件ならびにヒツジ翠 丸リンパ製剤換算であらかじめ検量した標品としてのｂＦＦ製剤を利用して管内 バイオアッセイ法によりインヒビン活性を測定した（Ｓｃｏｔｔ等、１９８０年 ）。

管内中和工程（ＭｃＬａｃｈｌａｎ等のＭｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌ、＋　４６Ｌ１７５−１８５　（１９８６）は一定体積のインヒビン抗血清 に段階的に変えた投与量のインヒビン又はＦＳＨ抑制活性を付与して２０″Ｃで ２時間培養することにより行なった。次いで試料を下垂体細胞培養ウェルに加え 、そして種々の濃度の抗血清の存在下又は不存在下での投与一応答線を比較する ことにより中和の程度を計算した。

インヒビン免疫活性は、トレーサーとしてよう素化３１ｋＤインヒビンをそして ウシ５８ｋＤインヒビンに対する抗血清（１４７４）（ＭｃＬａｃｈｌａｎ等、 １９８６年）又はウシ３１ｋＤインヒビンに対する抗血清（１７４９）　（Ｍｃ Ｌａｃｈｌａｎ等のＪ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏｃｒ、　Ｍｅｔａｂ、（１９８ ７））のいずれかを使用して第２抗体ラジオイムノアンセイ（ＭｃＬａｃｈｌａ ｎ等、１９８６年）により測定した。これらの方法においてはウシインヒビンα およびβサブユニットおよび広範な成長因子に対して最少の又は検出不能交差反 応を示した（ＭｃＬａｃｈｌａｎ等、１９８７年）。使用した標品は部分精製３ １ｋＤウシインヒビン製剤である。

員塁友よグ立立次定 中性および酸性ｐＨ条件下での連続ゲルろ過クロマトグラフィーとその次の逆相 ＨＰＬＣおよび調製用５ＤＳ−ＰＡＧＥとによりｂＦＦを分画した。検出不能イ ンヒビン免疫活性関連ＦＳＨ抑制活性を、逆相ＨＰＬＣにおいてインヒビンより 早く溶出した画分中において同定した（第１図）。ＦＳＰ含有画分を合わせたも のを調製用５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、そして活性をゲルから電気溶出した 。生物活性は、ゲルの３１．３５および３９　ｋｎ　６１域においてバッチ毎に 割合を変えて同定した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量３１．３５および３９ｋＤを有する３つ の生物活性ポリペプチドを単離した（第２図）、還元条件下ニソレソｈ３１．３ ５オヨヒ３９ｋＤ型Ｆ　Ｓ　Ｐニー）キ４５ｋＤ、　４２および３９ｋ［ｌ、お よび４１および３８ｋ［ｌの分子量のものがそれぞれ得られ、これによりこれら ポリペプチドはＣ０ＯＨ末端切断および（または）グリコジル化に由来するミク ロ異質性を有する一本鎖構造であろうと推定される。この３つのポリペプチドは いずれも自己Ｅｄｍａｎ分解がら演鐸した同一のＮＨｚＨ端アミノ酸配列（表１ ）を有していた。

且しユ２３　４−玉」ニア８９上１１１２１３１４艮上１０影３１ｋＤＧＮＳ／ ＣＴ　ＬＲＱＡＫＮＧ−−ＱＶＬＹＫ３５ｋＤＧＮＳ／ＣＴ／Ｗ”ＬＲＱＡＫＮ ＧＲ−ＱＶＬＹＫ３９ｋＤ（Ｇ）ＮＳ／Ｃ−Ｌ（Ｒ）ＱＡＫＮ　Ｇ（Ｒ）Ｓ／Ｃ Ｑ　Ｖ　Ｌ　Ｙ　Ｋ（＊）スレオニンの位置はシグナルが配列決定したたん白の 量について予測しりものよりも低かったので不明瞭であった。

当初の収量はそれぞれ２４．１６０および２０ｐｍｏｌであった。がっこしたア ミノ酸は同定確率の低いものである。サイクル番号３および１３で検出したシグ ナルの下部分は、ＰＴＨ−セリンおよびＰＴＨ−シスチンのジチオスレイトール 付加物の位置であった。このシグナルは確実なＰＴ）Ｉ−セリンシグナルがなく 、変性セリン又はシスティン残基のいずれかを示唆するものである。

３５および３１ｋＯ分析の場合に、検出された汚染配列のみが５　ｐｍｏ１以下 のシグナルを与えた。

ＦＳＰのインヒビン様生物活性をラット下垂体細胞培養物分析により調べた（第 ３図）、ＦＳＰはインヒビンと同様にＦＳＨ放出基礎量を抑制しく５０％抑制濃 度ＩＣ，。”’０．１８ｎＭ）又はＦＳＨ細胞内基礎含有量を抑制する（ＩＣｓ 。＝０．２２ｎＭ）が、しかしそのＦＳＨ放出投与量一応答線は対応しない、Ｆ ＳＰおよびインヒビンの投与量非関連効果をＬＨ放出基礎、量およびＬＨ細細胞 内基礎表について観察した。バイオアッセイの基準として細胞内ＦＳＨ量を使用 した場合、ＦＳＰは下記の様なインヒビン生物活性を示した。　３１ｋＤＦ　Ｓ 　Ｐ、８９ν／［たん白、　３５ｋＤＦ　Ｓ　Ｐ、７２ｖ／　ｙｇたん白；およ び３９ｋＤＦ　Ｓ　Ｐ、３５ｖ／　ｕｇたん白、これらの特異活性はウシ３１ｋ Ｄインヒビン（７５０シ／ｉ！ｇ）の５−１０％であった。

上記したインヒビンＲＩＡ系（ＭｃＬａｃｈｌａｎ等のＭｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｅｎｄｏｃｒ、、Ｑ、　１７５　（１９８６））におけるｂＦｓＰの反応性は無 視出来る程度のものであった。その結果、計算したｂＦＳＰの生物学的／免疫学 的割合は〉３２０であるが、一方抗インヒビン抗血清を使用して測定した３１ｋ Ｄウシインヒビンのそれは０．３５である。

ＦＳＰインヒビン様生物活性は、３１ｋＤインヒビン生物活性を最大に抑制した 投与量での中和とは対照的に、管内中和分析においてはインヒビン抗血清によっ て著しく中和されることはなかった。

３９ｋＤＦＳＰｍ製物のいくつかが３５ｋＤたん白を含有していたことが観察さ れたことから、３５ｋＤＦ　Ｓ　Ｐおよびおそらくは３１ｋＯＦＳＰは共に３９ ｋＤＦ　Ｓ　Ｐの変性形であると考えられる。

ＦＳＰは、その配列および分子量が異なると、サブユニット構造を持たないこと 、インヒビン免疫活性が検出されないことおよび管内試験においてＦＳＰ生物活 性を中和するインヒビン抗血清がないこと等から（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等、１９ ８６年）、インヒビンではなく、又汚染インヒビンでもよい。

ＦＳＰの入手可能なアミノ酸配列データがら、ＦＳＰはインヒビンと相同体では ないが、部分的（４０％）に多くの種々のホスホエノールピルビン酸カルボキシ ラーゼ、ウシ腸管内カルシウム結合たん白およびヒトインターフェロンα−１前 駆体（この内後者のたん白のみが生長調整活性を示す）等のたん白と同一である ことが明らかとなった。インヒビン自体は生長調整作用を示すことが明らかとは ならなかったが、インヒビンと構造的にＩＩ（ＥＪした他のなん白〔例えばアク チビン（イン上ビンサブユニット２量体［ＭｃＬａｃｈｌａｎ等のＢａ１ｌｌｉ ｅｒｅ’　ａ　Ｃ１１ｎ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　ａｎｄ　Ｍｅｔａｂ、、　Ｊ　、　８９　１１２　（ １９Ｂ？））　）、ＴＧＦ　−β（Ｒｏｂｅｒｔｓ等のＣａｎｃｅｒ　５ｕｒｖ ｅｙｓ、４．６８７−７０５　（１９８５））、ミュラー禁止物質（Ｃａｔｅ等 のＣｅ１Ｌ旦、　６８５−６９８　（１９８６））は該作用を示す。

更に、ＦＳＰおよびヒトα−インターフェロンは相同体であるので、ヒトα−イ ンターフェロンがＦＳＨおよびＬＨの両方の機能と体内的に相互反応することが 予測されることは興味深いことである０通常周期の健康な女性についての研究に おいて（Ｋａｕｐｐｉｌａ、　Ｋ、等のＩｕｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ、　２９ ．２９１−２９４（１９８２））、ＦＳＨおよびＬＨの循還濃度は血清性ステロ イドとは異なりインターフェロンの投与によっては影響されないことから、血清 ステロイド濃度の減少はＦＳＨおよびＬＨの放出および（または）合成の減少に よるものではないことが示される。この研究の結果は、インターフェロンが卵巣 のステロイド生成の刺激作用を部分的にブロックすることによりＦＳＨおよびＬ Ｈの両方の機能を調節するものであることを示唆していると言える。

ヒト白血球由来インターフェロンは又・ライデンヒ細胞の管内ステロイド生成を 禁止する作用に影響を及ぼすことが知られている（Ｇｒａｖａ等のＢｉｏｃｈｅ ｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏ＋ｕｅｕｍ、＋月Ｕヨ８０９−８１５ （１９８５））。

ＦＳＰのインヒビン様管内生物活性はインヒビンと多くの類および細胞内含有が 抑制され、すなわちこのことはＦＳＰは先にインヒビンについて証明した活性で ある少なくとも２つの作用、すなわちＦＳＨ放出を抑制しそしてＦＳＨ分解を促 進する能力、を有することを示すものである（Ｆａｒｎｗｏｒｔｈ、　Ｐ、　Ｇ 、等のＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８７））、　Ｆ 　Ｓ　Ｈ細胞内含有物を管内バイオアッセイに使用すると、終点ＦＳＰはインヒ ビンの活性同様に５〜１０％である。しかるにそれは尚管内において高い作用能 力を有しくＩＣ，。＝０．２ｎＭ）、このことからこれはＦＳＨを抑制するのに 別の生理的役割を果していることが考えられる。

１星旦１ （ａ）　ヒ　ＦＳＰ　ｈＦＳＰ ｂＦＦ由来ＦＳＰの特性決定に使用したのと同様の方法を使用して、ｈＦＦ中の ＦＳＰの存在を検討した。ｈＦＦ由来インヒビンの分画に使用した逆相ＨＰＬＣ 工程においてインヒビンより早く溶出した両分中に管内生物活性が存在した（第 ４図）。

ｈＦＦからの精製においてヒトインヒビンの同定に使用したインヒビンラジオイ ムノアッセイを使用したところ、ＦＳＨ抑制活性を有するこの領域に関連した免 疫活性は全く検出されなかった。調製用ＰＡＧＥにおいて生物活性画分を分画し たところ、４６および５５ｋＤに活性のピークを持ったゲルの４０〜６０ｋＩｌ Ｉ域中に生物活性が回収された（第５図）、ｈＦＳＰの分子量範囲（４０〜６０ ｋＤ　）はｂＦＳＰについて観察された範囲（３０〜５２ｋＤ）よりも大きい値 の範囲内にあるが、これより低分子量のものも多くはないが存在しており、しか しここでは検出されない。これとは別にグリコジル化にも相異がありその場合に も分子量に何らかの変更が見られる。

国際特許出願第ＰＣＴ／八〇８５１００１１９号にはインヒビンの用途が記載さ れている。一方本文に記載した通り、ＦＳＰはインヒビンと同様の生物活性を有 している。従って先の国際特許出願に記載したインヒビンの用途は同様にＦＳＰ にも適用可能である。

本発明のＦＳＰ又はその部分は、内因性ＦＳＰに対してヒト又は動物に免疫付与 するための免疫原として使用可能な抗原となり得るものである。

１つの可能な使用法としては、ＦＳＨ力価を増加し、そして（または）受胎能を 増強させるために使用することがある。

ＦＳＰ又はその誘導体は、ヒト又は動物用の生物活性剤又は治療剤として使用す ることが出来る。その１つの可能な使用法としては、循還ＦＳＨ力価を下げるこ とにより避妊薬として作用させることである。投与後にＦＳＰを除去するとＦＳ Ｈ力価における反作用により受胎能が増加する。又ＦＳＰは癌の治療および診断 用に使用することも出来、更に又生長因子又は細胞分化因子としての用途も期待 される。

又、ＦＳＰ又はその誘導体は不妊の診断および治療にも使用することが出来る。

第１図 第２図 非還元形　還元形 ５３９３５３１１　３９３５３１　Ｉ　５ｋＤａ　ｋＤａ 第８図 ヒトインヒビン（ピーク■）およびヒトＦＳＰの逆相ＨＰＬＣ管内バイオアッセ イ ４０　５０　６０　７０　ｆｉｏ　Ｓ。

画分番号 ヒトＦＳＰの調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動（υ） 薄　片 国際調査報告 ’−−−−＝−ｍ＾ｍ−＃曙−）−ＰＣＴ／ＡＵ８８１０００２４■出　願　人 　モナシュ・メディカル・センタ＠出　願　人　セント・ヴインセンッ・インス テイチュート・オブ・メディカ ル・リサーチ オーストラリア国　ヴイクトリア　３００４、メルボルン、セント・キルダ・ロ ード　（番地なし） オーストラリア国　ヴイクトリア　３０６５、フイッツロイ、ヴイクトリア・パ ーク　４１

Claims (32)

【特許請求の範囲】
1. １．還元剤を使用しないＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が３０ｋＤない し６０ｋＤの範囲内にあり、中和性インヒビン抗血清により抑制されない管内Ｆ ＳＨ抑制活性を有し、そしてインヒビンの免疫活性を有さないことを特徴とする 。下垂体液由来の実質的に純粋な１本領たん白。
2. ２．実質的に下記式 ＸｌＮＸ２Ｘ３ＬＲＱＡＫＮＧＸ４Ｘ２ＱＶＬＹＫ（ここでＸ１はＧを含有する アミノ酸から成り、Ｘ２はＳ又はＣを含有するアミノ酸から成り、Ｘ３はＴ又は Ｗを含有するアミノ酸から成り、そしてＸ４はＲを含有するアミノ酸から成る） から成るＮＨ２末端アミノ酸配列を有する、請求の範囲第１項に記載のたん白。
3. ３．実質的に下記式 ＧＮＳ／ＣＴ／ＷＬＲＱＡＫＮＧＲＳ／ＣＱＶＬＹＫ（ここにＳ／ＣおよびＴ／ Ｗはその位置における二者択一のアミノ酸を意味する） から成るＮＨ２末端アミノ酸配列を有する、請求の範囲第１又は第２項に記載の たん白。
4. ４．還元剤を使用しないＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約３１ｋＤ、 約３５ｋＤ又は約３９ｋＤであることを特徴とする、請求の範囲第１〜３項のい ずれかに記載のたん白。
5. ５．ウシ卵胞液由来の請求の範囲第４項に記載のたん白。
6. ６．実施例１に記載の方法で精製した時に３０ｖ／ｋｇないし３００ｖ／ｋｇの 本文中に定義したインヒビン様生物活性を有するたん白である、請求の範囲第１ 〜５項のいずれかに記載のたん白。
7. ７．還元剤を使用しないＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約４０ｋＤな いし約６０ｋＤの間にあることを特徴とする、請求の範囲第１項に記載のたん白 。
8. ８．還元剤を使用しないＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定した分子量が約４６ｋＤ又 は約５５ｋＤであることを特徴とする、請求の範囲第６項に記載のたん白。
9. ９．ヒト卵胞液由来の請求の範囲第６項又は第７項に記載のたん白。
10. １０．該たん白が糖たん白である、請求の範囲第１〜９項のいずれかに記載のた ん白。
11. １１．何らかの手段により製造された、請求の範囲第１〜１０項に記載のたん白 。
12. １２．請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載の少なくとも１つのたん白を非 毒性担体又は希釈剤と一緒に含有して成る組成物。
13. １３．該組成物が径口投与に適したものである、請求の範囲第１２項に記載の組 成物。
14. １４．注射剤型である、請求の範囲第１２項に記載の組成物。
15. １５．該組成物が非毒性アジュバントを含有する、請求の範囲第１３又は１４項 に記載の組成物。
16. １６．徐放性型である、請求の範囲第１２項に記載の組成物。
17. １７．脊椎動物中への移植ならびに徐放性剤として適する、請求の範囲第１６項 に記載の組成物。
18. １８．請求の範囲第１４〜１７項のいずれかに記載の組成物の有効量を脊椎動物 に投与することから成る、該脊椎動物の性腺機能を調整する方法。
19. １９．請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載のたん白の１つ又はそれ以上を 脊椎動物に投与することによって該脊椎動物に免疫付与した結果として産生され る抗体調製物。
20. ２０．該抗体調製物がポリクローン性である、請求の範囲第１９項に記載の抗体 調製物。
21. ２１．該抗体調製物がモノクローン性である、請求の範囲第１９項に記載の抗体 調製物。
22. ２２．請求の範囲第１９〜２１項のいずれかに記載のＦＳＰに対する抗体を使用 することを特徴とする、ＦＳＰの分析方法。
23. ２３．請求の範囲第１２〜１７項のいずれかに記載の組成物を投与することを特 徴とする、哺乳類のＦＳＨレベルを抑制する方法。
24. ２４．請求の範囲第１９〜２１項のいずれかに記載の抗体を哺乳類に投与するこ とを特徴とする、該哺乳類のＦＳＨレベルを上昇させる方法。
25. ２５．請求の範囲第１２〜１７項のいずれかに記載の組成物を雌の哺乳類に投与 することを特徴とする、該哺乳類の排卵速度を増加させる方法。
26. ２６．請求の範囲第１２〜１７項のいずれかに記載の組成物を雄の哺乳類に投与 することを特徴とする、該哺乳類の精子形成を促進する方法。
27. ２７．請求の範囲第１２〜１７項のいずれかに記載の組成物を投与することを特 徴とする、雄又は雌の哺乳類の受胎能を減退させせる方法。
28. ２８．請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載のＦＳＰで性的に未成熟の雄又 は雌の哺乳類を免疫することを特徴とする、該哺乳類における思春期の始まりを 促進する方法。
29. ２９．請求の範囲第１２〜１７項のいずれかに記載の組成物を投与することを特 徴とする、雄又は雌の哺乳類における思春期の始まりを遅らせ、あるいは思春期 を抑制する方法。
30. ３０．早熟な思春期の治療のための、請求の範囲第２９項に記載の方法。
31. ３１．哺乳類の生体液中のＦＳＰレベルを測定することを特徴とする、哺乳類の 受胎能状態を調べる方法。
32. ３２．請求の範囲第１〜１１項のいずれかに記載のＦＳＰの充分に高い投与量を 哺乳類に投与してそのＬＨ分泌を抑制することを特徴とする、哺乳類の排卵を抑 制する方法。