MXPA05010373A

MXPA05010373A - Inhibidores de fosfodiesterasas en infertilidad.

Info

Publication number: MXPA05010373A
Application number: MXPA05010373A
Authority: MX
Inventors: J Arkinstall Stephen
Original assignee: Applied Research Systems
Priority date: 2003-04-01
Filing date: 2004-04-01
Publication date: 2005-12-05
Also published as: WO2004087211A2; KR20050115331A; BRPI0409229A; EA200501548A1; US20080213889A1; US7153824B2; NO20054890L; US20060229288A1; AU2004226353A1; JP2006522151A; US20040259792A1; EP1624893A2; WO2004087211A3; CA2517487A1

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos para incrementar la produccion de oocitos en un mamifero, mas especificamente, la especificacion describe metodos y composiciones para inducir la maduracion folicular usando un inhibidor de PDE. El inhibidor puede ser usado solo a dosis altas. Alternativamente, la maduracion folicular se logra combinando una dosis baja de FSH con el tratamiento del inhibidor PDE.

Description

INHIBIDORES DE FOSFODIESTERASAS EN INFERTILIDAD Campo de la Invención La presente invención se dirige de manera general a biología reproductiva y a tecnologías reproductivas asistidas (ATR, por sus siglas en Inglés) , tales como iperestimulación controlada de ovario (COH, por sus siglas en Inglés) para fertilización in vitro (IVF) . Más específicamente, la presente invención se dirige a métodos y composiciones para inducir la maduración del folículo in vivo usando uno o más inhibidores de fosfodiesterasa ya sea solos o en combinación con una o más gonadotropinas , que incluyen la estimulación de maduración del folículo para propósitos tales como inducción de ovulación (OI) . Además, la invención se dirige a métodos y composiciones para inducir la maduración de oocitos in vitro, usando uno o más inhibidores de fosfodiesterasa ya sea solos o en combinación con una o más gonadotropinas .

Antecedentes de la Invención El ciclo reproductivo humano femenino confía en número de hormonas gonadotropinas . Entre estas principales están la hormona estimulante del folículo de las hormonas pituitarias, (FSH) y hormona luteinizante (LH) . Durante la oogénesis, el proceso por el cual la célula germinal femenina el óvulo, se produce, ocurre dentro de un folículo. Un REF. : 166694 folículo es una colección de células en el ovario que contienen un oocito (huevo) . La maduración del folículo la cual finalmente conduce a ovulación, es dependiente de los efectos estimulatorios de la FSH. En cada ciclo menstrual, muchos folículos son reclutados para la maduración de los oocitos . Al comienzo del ciclo menstrual de aproximadamente 28 días, los folículos están en la forma primordial, la cual es simplemente un oocito circundado por una capa única de células . Como el crecimiento folicular y la maduración se activan por FSH, múltiples capas de células granulosas se forman aproximadamente la capa única inicial de células, un proceso que continúa a través del ciclo medio. Estas células granulosas son responsables de nutrir el oocito y de la producción y liberación del estrógeno. La FSH, producida por la pituitaria, induce actividad de aromatasa en las células granulosas, con ello, incrementando la producción de estrógenos . De este modo, concurrente con la maduración de un folículo, existe un incremento en la producción de estrógeno en la parte primaria del ciclo menstrual de 28 días. El folículo también contiene receptores para la segunda gonadotropina pituitaria, LH. Como el folículo continúa creciendo y madurando por el ciclo medio (aproximadamente 14 días) , se desarrolla un espacio (antro) dentro de la masa de células granulosas. Al medio ciclo, una oleada de producción de LH actúa en los receptores LH para causar al folículo ruptura y liberación del oocito el cual viaja abajo del tubo falopiano y, el cual puede ser subsecuentemente fertilizado. La mujer que ovula normal recluta aproximadamente 300 oocitos inmaduros para cada ciclo menstrual. Durante un ciclo normal, de todos un folículo regresará (atresia) , y un folículo dominante único emergerá y continuará liberando un oocito. La inducción de ovulación (10) y regímenes de tecnologías reproductivas asistidas (TRA) , son regímenes hormonales que comprenden dos fases principales: una fase estinvulatoria y una fase ovulatoria. Cuando es apropiado, una fase de supresión puede preceder la fase estimulatoria. La fase de supresión involucra la administración de un agonista de GnRH, el cual es usado para suprimir LH o niveles de estradiol. La fase estimulatoria inicia con la administración de un agente que tiene actividad estimulante del folículo (tal como FSH) , y es usualmente prolongada 6 a 10 días. Típicamente, un paciente es tratado con aproximadamente 150 IU de FSH por día partiendo en aproximadamente tres días después de la menstruación espontánea o inducida. La administración de FSH se continúa hasta que existe solo un folículo de diámetro medio mayor que o igual a aproximadamente 16-18 mm (el desarrollo del folículo puede ser evaluado por ultrasonido) . En este punto, la fase ovulatoria es inducida usando una dosis relativamente grande (5,000-10,000 1U) de un agente que tiene actividad LH, tal como gonadotropina coriónica humana (hCG) , para romper el folículo e imitar el pico de hormona luteinizante natural (LH) u afluente que ocurre en el ciclo medio, para provocar la liberación de un oocito único en los tubos falopianos . El paciente es instruido para tener relaciones sexuales 24 a 38 horas después de la administración de las dosis mayores de hCG. Durante la fase estimulatoria, la administración de la hormona estimulante del folículo (FSH) , o un agente que ejerce actividad estimulante del folículo, o un agente estimulante la liberación endógena de FSH, estimula el crecimiento folicular del ovario. La administración de FSH o un agente que ejerce actividad similar a FSH o un agente estimulante la liberación endógena de FSH, no necesita ser continuo en la fase estimulatoria, ni necesita continuar hasta el final de la fase estimulatoria. Agentes alternativos que pueden actuar en ya sea la fase estimulatoria o la fase ovulatoria son deseables, particularmente agentes oralmente disponibles. El documento US 2002/0103106 Al (Palmer et al.), describe el uso oral y subcutáneo de inhibidores del tipo fosfodiesterasa IV en la fase ovulatoria para provocar la ovulación. El documento US 2003/0018037 (Westbrook Lempriere et al.), describe el uso de inhibidores de PDE5 después de la ovulación en un ciclo no asistido para mejorar la supervivencia embrional, incrementar el peso al nacimiento, incrementar el flujo sanguíneo uterino e incrementar los niveles de progesterona del suero. La inducción de ovulación (10) es el tratamiento de mujeres anovulatorias o amenorréicas para causar la liberación de un oocito único en los . ubos falopianos por fertilización in vivo o inseminación intrauterina (IIU) . La meta de un régimen IO es provocar que un oocito único sea liberado, para evitar embarazos múltiples. En un régimen convencional para 10, la primera fase de tratamiento es llamada la fase estimulatoria . En algunos pacientes que se someten a 10, puede ser deseable comenzar el tratamiento con una fase de supresión. En la fase de supresión, las gonadotropinas pituitarias son suprimidas por la administración de una hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) previo a comenzar la terapia con FSH. La administración de un agonista GnRH es iniciada en la fase luteal de un ciclo menstrual (usualmente en aproximadamente el día 20 del ciclo menstrual) . La supresión de la función de ovarios usualmente toma desde 8 hasta 21 días con un agonista GnRH, y puede ser monitoreada monitoreando niveles de LH o estradiol (E2) (LH < 5 IU/L, E2 < 50 pg/ml, indica generalmente supresión adecuada) . La fase estimulatoria es entonces iniciada por administración de FSH. El uso de un agonista GnRH suprime el pico LH natural u afluente el cual puede provocar la liberación de oocitos prematuramente. Esto permite mejor sincronización de liberación de los oocitos, y consecuentemente relaciones sexuales . En pacientes que sufren de síndrome de ovario poliquístico (SOPQ) , es deseable también usar un agonista GnRH, debido a que estos pacientes a menudo tienen niveles LH endógenos inapropiadamente altos, también permiten la supresión de LH a través de la fase estimulatoria, permitiendo mejor respuesta a FSH. La fase estimulatoria de 10 es también a menudo llevada a cabo usando agentes que provocan la liberación endógena de FSH, tal como citrato de clomifeno o inhibidores de ¦ romatasa . El citrato de clomifeno es administrado durante una fase estimulatoria (usualmente una dosis de 50 a 100 mg en los días 3 a 7 ó 5 a 9 del ciclo menstrual) , causando un incremento en la secreción endógena de FSH, conduciendo a crecimiento folicular. Los inhibidores de aromatasa, por ejemplo, Letrazol, Anastrozol, YM-511, pueden ser dados en los días 3 a 7 ó 5 a 9 del ciclo menstrual, y también provocan una liberación de la FSH endógena, como se describe en el documento WO 02/083239, el cual está incorporado aquí por referencia. Contrario a 10, en donde un folículo ovulatorio único y un oocito único se desean, en regímenes de tecnología reproductiva asistida (TRA) , se desea colectar tantos oocitos en un ciclo único como sea posible . El tratamiento de infertilidad por TRA, tal como fertilización in vitro (FIV) , inyección intracitoplásmica de esperma (IICE) , Procedimiento Intrafalopiano de Transferencia de Gametos (PITG) , y Procedimiento Intrafalopiano de Transferencia de Cigotos (PITC) , requieren hiperestimulación controlada de ovario (HOC) para incrementar el número de gametos femeninos. Healy, et al., Lancet 343:1539-1544 (1994). Por ejemplo, la fertilización in vitro (FIV) , la cual es ahora un tratamiento comúnmente usado para subfertilidad humana masculina y femenina, es una técnica de TRA basada en la recuperación de los oocitos humanos maduros, seguida por fertilización de los oocitos maduros con espermatozoides. Bajo protocolos de tratamientos de FIV estándar, los oocitos maduros humanos son reclutados por un régimen prolongado de tratamiento de hormona, por ejemplo, 30 días. Este protocolo es iniciado suprimiendo la FSH y LH propia del paciente mediante hormona de liberación de gonadotropina GnRH o un análogo de GnRH, y es seguido por inyecciones de gonadotropinas exógenas, por ejemplo FSH y/o LH, para asegurar el desarrollo de folículos preovulatorios múltiples . En una etapa apropiada de crecimiento folicular, oocitos múltiples son cosechados por aspiración inmediatamente antes de la ovulación. El oocito aspirado es subsecuentemente fertilizado in vitro y cultivado, típicamente por tres días antes de la transferencia del embrión resultante en el útero en la etapa de 4-8 células.

Más específicamente, los regímenes estándares para HOC en TRA incluyen una fase de supresión, también llamada una fase de regulación descendente, en la cual la LH endógena es suprimida por administración de un agonista GnRH iniciando en la fase luteal de un ciclo menstrual (usualmente en aproximadamente el día 20 de un ciclo menstrual) . La supresión de la función de ovario usualmente toma de 8 a 21 días con un agonista GnRH, y puede ser monitoreada monitoreando los niveles de LH o estradiol (LH < 5 IU/L, E2 < 50 pg/ml, indicando generalmente supresión adecuada) . La regulación descendente es seguida por una fase estimulatoria en la cual el desarrollo folicular es inducido por administración diaria de la hormona de estimulación del folículo (FSH) , usualmente a aproximadamente 75-6000 IU/día. Alternativamente, puede ser usado un antagonista GnRH, en lugar de un agonista GnRH, en tal caso, la estimulación folicular con FSH es iniciada, usualmente al día 1, 2 ó 3 después de la menstruación espontánea o inducida, y la producción LH endógena es suprimida por administración de un antagonista GnRH que inicia en aproximadamente el día 6 después de las menstruaciones . El antagonista GnRH y la administración de FSH se continúan hasta que es sugerido el criterio para administración de una ovulación accionada por dosis de hCG, como se describe abajo. Durante la fase estimulatoria, los ovarios son examinados por ultrasonido, para detectar y medir el desarrollo de los folículos. Debido a que el desarrollo folicular múltiple es el objetivo de los protocolos HOC en TRA, cuando los ovarios muestran al menos 3 folículos con un diámetro medio mayor de 16 mm (preferiblemente uno de 18 mm) , una inyección de hCG (5,000-10,000 IU) se da para provocar la ovulación. La recuperación del oocito es sincronizada por 36-48 horas después de la inyección de hCG. Los oocitos son usualmente recuperados de folículos pre-ovulatorios por aspiración. Debido al hecho de que los protocolos tales como aquellos descritos anteriormente, han sido usados en protocolos clínicos por un número de años, estos protocolos no están sin desventajas significantes. La FSH tiene una vida media relativamente corta, y el tratamiento con FSH para ya sea 10 u TRA, involucra inyecciones diarias de dosis relativamente grandes de FSH (75-600 IU FSH diariamente) , durante la fase estimulatoria. Las inyecciones diarias pueden causar malestar al paciente e inconveniencia y pueden ser relativamente costosas. Tales dosis grandes y administraciones diarias tienen el riesgo relacionado de producir síndrome de hiperestimulación del ovario (OHSS) , el cual en varios casos, puede poner en riesgo la vida. Existen otros efectos colaterales a partir de las preparaciones de gonadotropina que incluyen ganancia de peso, dilatación, náuseas, vómito, el tiempo involucrado con el proceso de monitoreo y el riesgo de cáncer de término prolongado conocido. Estos regímenes de tratamiento de la hormona llegarán a ser aún más un problema cuando la FIV es ofrecida a mujeres perfectamente normales en estos programas debido a los problemas de infertilidad asociados con la pobre calidad del esperma de la pareja masculina. De este modo, existen problemas asociados con los protocolos actuales usados en la generación de oocitos para FIV. Permanece una necesidad para la producción de cantidades mayores de oocitos que son favorables para la ovulación. Debido a los riesgos involucrados con la administración de gonadotropinas , han sido sugeridos varios protocolos alternativos. Una forma para aliviar los riesgos, efectos colaterales y desventajas económicas de protocolos de estimulación de ovario controlado, involucra la recuperación de oocitos inmaduros seguida por maduración in vitro. En este procedimiento, la hembra no es estimulada, o recibe solamente estimulación mínima, y los oocitos recuperados son sometidos a tratamiento hormonal in vitro. Este protocolo de maduración in vitro (MIV) involucra una reducción/eliminación significante en un número de efectos colaterales mencionados anteriormente, y tiene las ventajas económicas secundarias de reducir las cantidades de hormonas usadas para el tratamiento. Sin embargo, mientras en animales, la maduración in vitro (MIV) ha llegado a ser un método eficiente para producir oocitos para FIV, las relaciones de éxito registradas para MIV humana clínica han sido bajas. Como otra alternativa, la recolocación de la FSH con medicamentos alternativos que tienen la capacidad para ayudar al crecimiento folicular y la cual evita los riesgos de OHSS, podrá ser altamente deseable. Además, la provisión de una preparación la cual actúa con FSH para causar el crecimiento folicular, podría también ser altamente deseable, como podrán ser aumentados los bajos niveles endógenos de FSH, causando crecimiento folicular en aquellos pacientes quienes son anovulatorios debido a los bajos niveles endógenos de FSH, o podría aumentar la FSH exógenamente administrada, permitiendo una respuesta mejorada en respondedores pobres en TRA, o permitir la misma respuesta en TRA con dosis inferiores y/o inyecciones menos frecuentes de FSH, al mismo tiempo que se evita el riesgo de OHSS.

Sumario de la Invención En ciertos aspectos, la presente invención proporciona un método para incrementar la maduración del folículo que comprende, tratar un mamífero con un inhibidor de fosfodiesterasa (PDE) en una cantidad efectiva para estimular el crecimiento y maduración folicular. En otro aspecto, la invención proporciona un uso de un inhibidor de una enzima de fosfodiesterasa para estimular el crecimiento folicular de ovario en un paciente. En todavía otro aspecto, la invención proporciona un método para estimular el crecimiento folicular de ovario en un paciente en necesidad del mismo, que comprende administrar una dosis efectiva de un inhibidor de fosfodiesterasa al paciente. También incluidos como un aspecto de la invención, están métodos para incrementar la maduración del folículo que comprenden, tratar un mamífero con un inhibidor de PDE y una hormona gonadotropina, en donde el PDE y gonadotropina se proporcionan en una cantidad efectiva colectiva para estimular el crecimiento y maduración folicular. En otro aspecto, la invención proporciona un uso de un inhibidor de PDE para la preparación de un medicamento para estimulación del crecimiento folicular de ovario en un paciente. Preferiblemente, el inhibidor de PDE es usado en la preparación de un medicamento para estimulación del crecimiento folicular del ovario en un paciente que se somete a inducción de ovulación. Más preferiblemente, el PDE se usa en la preparación de un medicamento para estimulación del crecimiento folicular del ovario en un paciente que se somete a hiperestimulación controlada de ovario para tecnologías reproductivas asistidas. El inhibidor de PDE se administra partiendo en la fase estimulatoria, antes de la ovulación y se detiene preferiblemente o al día cuando la fase ovulatoria es iniciada por administración de grandes dosis de un agente que tiene actividad LH (tal como 5,000-10,000 hCG) . Más preferiblemente, la administración del inhibidor de PDE se detiene dos, uno o cero días antes del día en el cual la hCG es administrada. Más preferiblemente, la administración del inhibidor PDE se detiene al día en el cual la hCG es administrada. El medicamento puede ser por administración simultánea, separada o secuencial con FSH, o un agente que tiene actividad FSH, o un agente que conduce a liberación endógena de FSH. Preferiblemente, el medicamento es por administración simultánea, separada o secuencial con FSH. Alternativamente, el medicamento es por administración simultánea, separada o secuencial con un agente que tiene actividad FSH, o un agente que conduce a liberación endógena de FSH. El medicamento es preferiblemente administrado partiendo en o aproximadamente al día 2 a 3 después de la menstruación. Se administra en una base diaria hasta que el crecimiento folicular es suficiente en el punto al cual una dosis acciona la ovulación de hCG, preferiblemente se administran 5,000-10,000 IU. Cuando el medicamento se administra con FSH, la dosis de FSH se reduce con respecto a la dosis requerida en el mismo paciente en la ausencia del inhibidor de PDE, para lograr los mismos resultados en términos de crecimiento folicular.

En modalidades preferidas de conformidad con este aspecto de la invención, el inhibidor de PDE es un inhibidor de al menos un tipo de PDE seleccionado de 1,5 y 6. El inhibidor PDE se selecciona de los siguientes compuestos: 5- [2-etoxi-5- (4-metil-l-piperazinilsulfonil) fenil] -i-metil-3-?-propil-1, 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] irimidin-7-ona (sildenafil) ; Zaprinast; dipiridamol ; 5- (2-etoxi-5-morfolinacetilfenil) -l-metil-3-n-propil-l, 6-dihidro-7H-20 pirazolo [ , 3-d] pirimidin-7-ona; 3-etil-5- [5- (4-etilpiperazin-1-ilsulfonil) -2-n-propoxifenil] -2- (pir-idin-2-il) metil-2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] irimidin-7-ona; 3-etil-5- [5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) -2- (2-metoxietoxi) iridi-n-3-il] -2- (piridin-2-il) metil-2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4,3-d] pirimidin-7-ona; (+) -3-etil-5- [5- ( -etilpiperazin-1-ilsulfonil) -2- (2-metoxi-l (R) -metiletoxi) piridin-3-il] -2-metil-2, 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; 5- [2-etoxi-5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil)piridin-3-il] -3-etil-2- [2-metoxietil] -2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; 5- [2-iso-butoxi-5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) iridin-3-il] -3-etil-2- (l-metilpiperidin-4-il) -2, 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; 5- [2-etoxi-5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) iridin-3-il] -3-etil-2-fenil-2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; 5- (5-acetil-2-propoxi-3 -piridinil) -3-etil-2- (l-isopropil-3-azetidinil) -2, 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; 5- (5-acetil-2- butoxi-3-piridinil) -3-etil~2- (l-etil-3-azetidinil) -2, 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] irimidin-7-ona (6R, 12aR) -2,3,6, 7 , 12, 12a~hexahidro-2-metil-6- (-3,4-metilenedioxifenil) pirazino [2', 1': 6, 1] irido [3 , 4-b] indol-1,4-diona (Tadalafil; IC-351) ; el compuesto de los ejemplos 78 y 95 de la solicitud internacional publicada WO 95/19978, así como también el compuesto de los ejemplos 1, 3, 7 y 8 en este documento; 2- [2-etoxi-5- (4-etil-piperazin-l-il-l-sulfonil) -fenil] -5-metil-7-propil-3H-imidazo [5 , 1-f] [1, 2, ] riazin-4-ona (vardenafil) ; el compuesto del ejemplo 11 publicado en la solicitud internacional WO93/074124 (ESAI) ; los compuestos 3 y 14 de Rotella D P. J. Med. Chem. , 2000, 43, 1257; 4-bromo-5- (piridinilmetilamino) -6- [3 (4-clorofenil) -propoxi] -3- (2H) piridazinona; sal monosódica del ácido 1- [4- [ (1, 3-benzodioxol-5-ilmetil) amino] -6-cloro-2-quinozilinil] -4-piperidin-carboxílico; (+) -cis-5, 6a, 7,9,9, 9a-hexahidro-2- [4- (trifluorometil) -fenilmetil-5-metil-ciclopent- [4 , 5] imidazo [2, l-purin-4 (3H) ona; furaziocilina; cis-2-hexil-5-metil-3 ,4, 5, 6a, 7, 8,9, 9a-octahidrociclopent [4 , 5] -imidazo [2- , 1-b] purin-4-ona; 3-acetil-l- (2-clorobencil) -2-propilindol-6-carboxilato; 3-acetil-l- (2-clorobencil) -2-propilindol-6-carboxilato; 4-bromo-5- (3-piridilmetilamino) -6- (3- (4-clorofenil) ropoxi) -3- (2H) iridazinona; l-metil-5 (5~ morfolinoacetil-2-n-propoxifenil) -3-n-propil-l, 6-di idro-7H-pirazolo(4,3-d)pirimidin-7-ona; sal monosódica del ácido 1- [4- t (1, 3-benzodioxol-5-il-metil) amino] -6-cloro-2-guinazolinil] -4-piperidincarboxllico; Pharmaproj ects No. 4516 (Glaxo Wellcome) ; Pharmaproj ects No. 5051 (Bayer) ; Pharmaproj ects No. 5064 (Kyowa Hakko; véase documento WO 96/26940) ; Pharmaprojects No. 5069 (Schering Plough) ; GF-196960 (Glaxo Wellcome) ; E-8010 y E-4010 (Eisai) ; Bay-38-3045 & Bay-38-9456 (Bayer) , Vinpocetine (Richter Gideon) ; SCH-51866 (Schering-Plough), SCH-59498; (6aR,9aS)-2- (Bifenililmetil) -5, 6a, 7,8,9, 9a-hexahidro-5-metil-3 (fenilmetil) ciclopent [4 , 5] imidazo- [2 , 1-b] purin-4 (3H) -ona; 5 ' -Metil-2 ' (bifenililmetil) -3 ' - (fenilmetil) espiro [ciclopentan-1,7' (8?) - [3H] imidazo [2 , 1-b] purin] -4 (5?) -ona; (6aR, 9aS) - 5, 6a, 7,8,9, 9a-Hexahidro-5-metil-2- (feniletinil) -3- (fenilmetil) ciclopent [4 , 5] imidazo [2 , 1-b] -purin-4 (3H) -ona; dipiridamol; AWD-12-171 y AWD-12-217 (ASTA Medica) ; BMS-341400 (Bristol Meyers Squibb); U -343,664 (Pfizer); 5E-3623, 5E-3569, 5E-3657, E4021 (Eisai); KS-505a (Kyowa Hakko Kogyo) ; YC-1 (Yung Shin Pharmaceutical Industries) ; número de referencia IDDB 323951 (Bayer) ; WIN-61691 (Sanofi Winthrop) ; FR226807 (Fujisawa) ; referencias IDDB 461317, 462503, 461321, 461324, 466146 (Johnson & Johnson); 3- (1, 3-benzodioxol-5-il) -9-oxo-l, 3,4, 9-tetrahidro-2H-pirrolo [3 , 4-b] quinolin-2-carboxilato de piridin-4-ilmetilo; los compuestos listados en la Tabla 1 de Jiang, et al., J. Med. Chem. , 46:441-444 (2003), particularmente los compuestos 20b, 20e, 20f, 201, 20o, 20p, (-)-20q, 20t, 20u, 20v, 20w y 26a. El inhibidor de PDE puede ser un inhibidor selectivo de PDE 1 o PDE 5, o PDE 1 y PDE 5. El inhibidor PDE se puede seleccionar de Sildenafil y Zaprinast, Dipiridamol, y (6aR, 9aS) -2- (bifenililmetil) -5 , 6a, 7,8,9, 9a-hexahidro-5-milt-3 (fenilmetil) ciclopent [4 , 5] imidazo- [2 , 1-b] urin-4 (3H) -ona y 5 ' -Metil-2 ' (bidenililmetil) -3 ' - (fenilmetil) espiro [ciclopentano-1 , 7 ' ( 8 ' H) - [3H] imidazo [2,1-b] urin] -4 (5 ?) -ona ("compuesto no. 31" y "compuesto no. 33", respectivamente, descrito en Ahn, et al., J. Med. Chem., 40 :2196-2210 (1997) . En otro aspecto, la invención proporciona un método de maduración de oocito in vltro, que comprende tratar un oocito in vltro con un inhibidor de PDE, o con un inhibidor de PDE y una hormona de gonadotropina, en donde la PDE y gonadotropina se proporcionan en una cantidad suficiente colectiva para causar la maduración del oocito. Preferiblemente, el incremento en el número de oocitos maduros está en el orden de cero a un oocito en la ausencia de dicho tratamiento, siendo incrementado por cuatro o más oocitos por el uso de los métodos descritos en este documento . Un aspecto particular de la presente invención proporciona un método para incrementar la maduración del folículo en un animal que comprende, administrar al animal una composición que comprende al menos un inhibidor de PDE y una hormona gonadotropina, en donde la PDE y gonadotropina son administradas en una cantidad colectiva efectiva para incrementar el número de oocitos responsivos de gonadotropina coriónica. En modalidades particularmente preferidas, el inhibidor PDE es un inhibidor PDE. Los inhibidores PDE 4 ejemplares que pueden ser usados incluyen, pero no se limitan a los seleccionados del grupo que consiste de Piclamilast, Roflumilast, Ariflo, Filaminast, Mesopram, D4418, Arofilina, y CL1044 , pueden ser usados inhibidores PDE 4 adicionales . Muchos están ejemplificados aquí abajo, sin embargo, se debe entender que los análogos y derivados de estos compuestos que tienen actividad inhibitoria PDE , pueden también ser usados . Se contempla que los métodos de la invención pueden ser realizados usando solamente un inhibidor de PDE. Alternativamente, un cóctel de múltiples inhibidores de PDE puede ser empleado . Tal cóctel puede incluir uno o más inhibidores PDE 4 además de uno o más de otros inhibidores de PDE. Se contempla particularmente, que la composición puede comprender al menos, un inhibidor PDE 4 y al menos otro inhibidor PDE seleccionado del grupo que consiste de un inhibidor PDE 1, un inhibidor PDE 5, un inhibidor PDE 6, inhibidor PDE 7, inhibidor PDE 9, inhibidor PDE 10 e inhibidor PDE 11. En modalidades específicas, los métodos de la invención pueden emplear composiciones las cuales comprenden dos o más inhibidores de PDE 4. En los métodos de la presente invención, la gonadotropina usada para estimular o incrementar la maduración del folículo, se seleccionan del grupo que consiste de la hormona de estimulación del folículo (FSH) , hormona luteinizante (LH) , y gonadotropina coriónica (GC) y combinaciones de las mismas. Preferiblemente, la gonadotropina es FSH. En otras modalidades, el método comprende administrar FSH y además administrar una hormona de gonadotropina no FSH, tal como por ejemplo, LH. Alternativamente, el método comprende administrar FSH en combinación con un estimulador, agonista o adyuvante de FSH. Alternativamente, el método puede comprender administrar un estimulador, agonista o adyuvante de FSH solo o en combinación con un inhibidor de PDE 4. Estimuladores ejemplares de la actividad de FSH incluyen, inhibidores de aromatasa tales como Letrozol, Anastrozol y Vorozol (véase documento PCT/EP01/14730 y Solicitud de Patente Estadounidense No. 20020103106, incorporada por referencia en este documento) . En modalidades específicas, el inhibidor de PDE y el tratamiento de la hormona de gonadotropina son administrados concurrentemente. Por "tratamiento de la hormona gonadotropina" , la presente invención contempla el tratamiento de FSH sola, el tratamiento de FSH en combinación con una gonadotropina no FSH, o tratamiento con un estimulante u otro agonista de la actividad de FSH ya sea sola o en combinación con FSH y/o otra gonadotropina no FSH. En algunas modalidades, el inhibidor de PDE es administrado previo a la administración de la hormona de gonadotropina. En otras modalidades, el inhibidor PDE es administrado después de la administración de la hormona de gonadotropina.- La dosificación del FSH puede ser cualquier dosificación rutinariamente usada en una instalación clínica. Por ejemplo, la FSH puede ser administrada a un intervalo de dosificación desde aproximadamente 5 hasta 450 IU/día. Más preferiblemente, la FSH es administrada a un intervalo de dosis desde aproximadamente 5 hasta 75 IU/día. En modalidades específicas, se contempla que la administración del PDE 4 u otro inhibidor PDE, permitirá una reducción en la cantidad de FSH normalmente administrada a un individuo. Para propósitos de esta solicitud, una dosis "subóptima" de FSH es cualquiera de tales dosificaciones reducidas de FSH, esto es, una dosificación de FSH inferior que podría resultar en la estimulación óptima de la maduración del folículo. La FSH puede ser FSH recombinante (r-FSH) , preferiblemente la FSH recombinante humana (hFSH) . En otras modalidades, la FSH es purificada de la orina. La invención también proporciona un método para incrementar el desarrollo in vivo de folículos preovulatorios en un mamífero, el método comprende administrar al mamífero, una composición que comprende al menos, un inhibidor PDE 4 y una hormona exógena de FSH. Tal método puede además comprender la supresión de FSH endógena y la producción de LH en el mamífero, previa a la administración del inhibidor PDE 4 y la hormona SHF. Preferiblemente, la hormona exógena FSH es una hormona recombinante de la FSH. En otras modalidades, la hormona FSH exógena es una hormona FSH recombinante . En otras modalidades, la hormona FSH exógena es la hormona FSH urinaria. En modalidades específicas, el inhibidor PDE 4 es administrado en una dosis desde aproximadamente 0.05 mg/día hasta aproximadamente 5 mg/día. Se contempla que la dosificación del inhibidor variará de conformidad con el inhibidor especifico, así como también con las características del paciente que esta siendo tratado. Se contem la que la dosificación puede ser 0.05 mg/día, 0..075 mg/día, 0 .10 mg/día; 0.125 mg/día; 0. 150 mg/día; 0 , .175 mg/día; 0 .20 mg/día; 0.225 mg/día; 0. 250 mg/día; 0 , .275 mg/día; 0 .30 mg/día; 0.325 mg/día; 0. 350 mg/día; 0. ,375 mg/día; 0 .40 mg/dí ; 0.425 mg/día; 0. 450 mg/día; 0 , .475 mg/día; 0 .50 mg/día; 0.525 mg/día; 0. 550 mg/día; 0. .575 mg/día; 0 .60 mg/día; 0.625 mg/día; 0. 650 mg/día; 0. .675 mg/día; 0 .70 mg/día; 0.725 mg/día; 0. 750 mg/día; 0. , 775 mg/día; 0 .80 mg/día; 0.825 mg/día; 0. 850 mg/día; 0. , 875 mg/día; 0 .90 mg/día; 0.925 mg/día,- 0. 950 mg/día; 0. ,975 mg/día; 1. 0 mg/día; 1. 25 mg/día; 1.5 .g/día; 1. ,75 mg/día 2.0 mg/día; 2.25 mg/día; 2.5 mg/día; 2.75 mg/día; 3.0 mg/día; 3.25 mg/día; 3.5 mg/día; 3.75 mg/día; 4.0 mg/día; 4.25 mg/día; 4.5 mg/día; 4.75 mg/día; 5.0 mg/día o más por día. En modalidades preferidas, se contempla que el inhibidor PDE 4 se administre como en una dosificación desde aproximadamente 10 mg/kg hasta aproximadamente 200 mg/día. Aquellos de habilidades en la técnica podrán entender que estas son meramente cantidades e intervalos de dosificaciones ejemplares. Se debe entender que cualquier cantidad numérica individual entre las dosificaciones, expresamente mencionadas en este documento, están particularmente contempladas y cada uno de los valores individuales entre estas dosis, está específicamente propuesto para estar dentro del ámbito de la invención. Los valores individuales entre las dosis específicas mencionadas en este documento, han sido simplemente omitidos para facilidad de legibilidad y no debido a que fueron propuestos para ser excluidos del ámbito de la solicitud. Lo mismo es cierto de los otros, composiciones sin inhibidor PDE son administradas en este documento . En otras modalidades, se contempla que la FSH sea administrada en un intervalo de dosificación de IU FSH/día hasta 75 IU FSH por día. Sin embargo, la FSH puede ser administrada como una dosificación de 150 IU FSH por día. La FSH preferiblemente es administrada en una dosis única. Otras modalidades contemplan administrar la FSH en múltiples dosis . La FSH puede ser administrada intramuscularmente, subcutáneamente o vía cualquier otro método conveniente de administración. Preferiblemente, la FSH es administrada entre el día 2 y el día 14 del ciclo menstrual del mamífero. En modalidades específicas, la FSH es administrada entre 7 a 12 días consecutivos . En modalidades particulares, la supresión del FSH y LH endógena comprende administrar hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) o un análogo de la misma al mamífero. Más particularmente, la GnRH es administrada al mamífero por 30 días previos a la administración del inhibidor PDE 4 y la hormona FSH. Las cantidades de dosificación de la GnRH pueden ser cualquier dosificación rutinariamente empleada para supresión de gonadotropinas endógenas . Tales modalidades pueden típicamente emplear GnRH o un antagonista de la misma administrada en un intervalo de dosificación desde aproximadamente 0.25 mg hasta aproximadamente 3 mg de GnRH en una base diaria. En los métodos de la presente invención, la administración del inhibidor PDE 4 y FSH, produce más oocitos ovulables hCG en el mamífero, comparada con la producción de oocitos ovulables hCG, en la ausencia de la administración del inhibidor PDE 4 y FSH. Por ejemplo, en la ausencia de tal tratamiento, el sujeto puede producir cero o un oocito ovulable hCG, sin embargo, el tratamiento incrementa el número a cuatro o más oocitos ovulables hCG. De este modo, pueden ser más pronunciados 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, o más oocitos que se pueden cosechar como un resultado de los métodos de la presente invención. Los métodos de la invención contemplan cosechar los oocitos 12 días después de la administración inicial del inhibidor de PDE 4 y la hormona FSH. Los métodos pueden además involucrar fertilizar los oocitos cosechados in vitro, y cultivar los oocitos fertilizados, cosechados en la etapa de 4-8 células. Tales oocitos fertilizados de la etapa de 4-8 células, pueden ser además transferidos al útero de un mamífero. El mamífero puede ser el mismo mamífero a partir del cual los oocitos son cosechados o puede ser un mamífero diferente a partir del cual los oocitos fueron cosechados . La invención además proporciona un kit para el tratamiento de la infertilidad, el kit comprende una primera composición que comprende al menos un inhibidor PDE 4 en una formulación farmacéuticamente aceptable, y una segunda composición que comprende FSH en una formulación farmacéuticamente aceptable. El kit puede comprender FSH urinaria o FSH recombinante . En cualquier caso, la FSH es preferiblemente FSH humana. La FSH del kit es preferiblemente proporcionada en una dosis unitaria de entre aproximadamente 5 IU FSH y aproximadamente 75 IU FSH. El kit puede además comprender una tercera composición que comprende LH en una formulación farmacéuticamente aceptable. Cantidades ejemplares de LH empleadas en las dosis unitarias en los kits son dosis de entre aproximadamente 75 IU LH y aproximadamente 150 IU LH. Otras características y ventajas de la invención llegarán a ser más aparentes a partir de la siguiente descripción detallada. Se debe entender, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, mientras que indican modalidades preferidas de la invención, se dan por medio de ilustración solamente, debido a varios cambios y las modificaciones dentro del espíritu y ámbito de la invención llegarán a ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.

Breve Descripción de las Figuras Las siguientes figuras forman parte de la presente invención y están incluidas para ilustrar además, aspectos de la presente invención. La invención puede ser mejor entendida por referencia a los dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en este documento. La Figura 1 muestra el número de oocitos ovulados por rata en ratas hembras inmaduras tratadas con una dosis subóptima de FSH ( "FSH baja": 151.5 ng X 4 por rata) y las ratas se trataron con la dosis subóptima de FSH ("FSH baja") más Dipiridamol (1, 5, 25 mg/kg x 4 por rata) . La Figura 2 muestra el número de oocitos ovulados por rata en ratas hembras inmaduras tratadas con una dosis subóptima de FSH ( "FSH baja": 151.5 ng X 4 por rata) y las ratas se trataron con la dosis subóptima de FSH ("FSH baja") más Zaprinast (1, 5, 25 mg/kg x 4 por rata) . La Figura 3 muestra el número de oocitos ovulados por rata en ratas hembras inmaduras tratadas con una dosis subóptima de FSH ("FSH baja": 151.5 ng X 4 por rata) y las ratas se trataron con la dosis subóptima de FSH ("FSH baja") más Sildenafil (1, 5, 25 mg/kg x 4 por rata) . La Figura 4 muestra el número de folículos secundarios en ratas tratadas con dosis bajas de FSH ("FSH baja"; 151.5 ng X 3 por rata), dosis altas de FSH ("FSH alta" ; 606.2 ng X 3 por rata), y dosis bajas de FSH más Sildenafil (25 mg/kg x 3 por rata) . La Figura 5 muestra el número de folículos antrales en ratas tratadas con dosis bajas de FSH ("FSH baja"; 151.5 ng X 3 por rata), dosis altas de FSH ("FSH alta"; 606.2 ng X 3 por rata) , y dosis bajas de FSH más Sildenafil 75 mg/kg. La Figura 6 muestra el número de oocitos ovulados por rata en ratas hembras inmaduras tratadas con dosis baja de FSH ( "FSH baja": 151.5 ng X 3 por rata) y dosis altas de FSH ("FSH alta"; 606.2 ng X 3 por rata), y dosis baja de FSH (151.5 ng X 4 por rata) mas Sildenafil (1, 5, 25 mg/kg x 4 por rata) administrado en un amortiguador acuoso. La Figura 7 muestra el número de oocitos ovulados por rata en ratas embras inmaduras no tratadas con FSH ("sin FSH"), una dosis subóptima de FSH ( "FSH baja": 151.5 ng X 3 por rata), la dosis subóptima de FSH ( "FSH baja": 151.5 ng X 4 por rata) mas Tadalafil (25 mg/kg x 4 por rata) , y una dosis alta de FSH ("FSH alta": 606.2 ng X 3 por rata), administrada en un amortiguador acuoso. La Figura 8 muestra el número de oocitos ovulados por rata en ratas hembras inmaduras no tratadas con FSH ("sin FSH"), una dosis subóptima de FSH ("FSH baja": 151.5 ng X 3 por rata), la dosis subóptima de FSH ("FSH baja": 151.5 ng X 4 por rata) más el Compuesto no. 31 ( (6aR, 9aS) -2- (bifenililmetil) -5, 6a, 7,8,9, 9a-hexahidro-5-metil-3 (fenilmetil) ciclopent [ , 5] imidazo- [2 , 1-b] urin-4- (3H) -ona) (25 mg/kg x 4 por rata), y FSH alta (606.2 ng X 3 por rata), administrada en un amortiguador acuoso. La Figura 9 muestra el número de oocitos ovulados por rata en ratas hembras inmaduras no tratadas con FSH ("sin FSH"), una dosis subóptima de FSH ("FSH baja": 151.5 ng X 3 por rata), la dosis subóptima de FSH ("FSH baja": 151.5 ng X 4 por rata) más el Compuesto no. 33 (5 ' -metil-2 ' -(bifenililmetil) -3' - (fenilmetil) espiro [ciclopentan-l , 7 ' (8?) - [3H] imidazo [2, 1-b] purin] -4- (5 ?) -ona) (25 mg/kg x 4 por rata), y FSH alta (606.2 ng X 3 por rata), administrada en un amortiguador acuoso . Figuras 10A-10C. Estudios in vitro determinan la capacidad de inhibidores PDE 4 para inducir o incrementar cA P en células granulosas de rata (ovario de rata dispersado) y/o células granulosas porcinas que expresan el receptor FSH (JC410/FSHR) . Figura 11. Demostración in vivo de inducción de la maduración del folículo por administración de una combinación de una dosis baja de FSH con concentraciones variantes (0.08 mg/kg; 0.4 mg/kg; 2 mg/kg) de Piclamilast. Figura 12. Demostración in vivo de inducción de la maduración del folículo por administración de una combinación de una dosis baja de FSH con concentraciones variantes (0.08 mg/kg 0.4 mg/kg; 2 mg/kg) de Roflumilast . Figura 13. Demostración in vivo de inducción de la maduración del folículo. Comparación de la producción de oocitos después de la estimulación usando dosis bajas y altas de FSH solo; concentraciones variantes (0.08 mg/kg; 0.4 mg/kg; 2 mg/kg) de Piclamilast y usando una combinación de una dosis baja de FSH con concentraciones variantes (0.08 ™g/kg 0.4 mg/kg; 2 mg/kg) de Piclamilast. Se muestran resultados de dos estudios independientes . Figura 1 . Demostración in vivo de inducción de maduración del folículo. Los datos cumulativos demuestran producción de oocitos incrementada después de la estimulación usando una combinación de una dosis baja de FSH con concentraciones variantes (0.08 mg/kg; 0.4 mg/kg 2 mg/kg) de Piclamilast. Figura 15. Demostración in vivo de inducción de maduración del folículo. Los datos cumulativos demuestran producción de oocitos incrementada después de la estimulación usando una combinación de una dosis baja de FSH con concentraciones variantes (0.0032,0.016,0.08 mg/kg; 0.4 mg/kg; 2 mg/kg) de Mesopram. Se muestran los resultados de dos estudios independientes .

Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas La estimulación del ovario usando hormonas de gonadotro inas es ahora reconocida como un régimen de tratamiento significante para parejas que tienen niveles subóptimos de fertilidad. Los procedimientos de FIV confían en el uso de cantidades significantes de FSH y otras hormonas de gonadotropina para estimular la producción de oocitos para fertilización. Sin embargo, tal estimulación de ovario a menudo conduce a significantes efectos colaterales perjudiciales. Por lo tanto, existe una necesidad de métodos adicionales para incrementar la producción de oocitos ovulables que no dependan solamente de la estimulación del ovario con gonadotropinas . La presente invención se dirige a la inducción de maduración del folículo usando inhibición de fosfodiesterasa (PDE) . Se ha descubierto que los inhibidores de PDE, cuando se administran a ratas inmaduras , conducen a un incremento en el número de oocitos ovulables por hCG. Más particularmente, los inhibidores de PDE 4 cuando se administran en combinación con dosis subóptimas de FSH producen incremento sustancial en el número de tales oocitos . Los inventores también han descubierto sorprendentemente, que las moléculas que son inhibidoras de enzimas de fosfodiesterasa (PDE) preferiblemente las PDE de tipos seleccionados de 1, 5, 6, 7, 9, 10, 11, más preferiblemente PDE tipos 1 y 5, todos dentro del ámbito de la presente invención, son capaces de auxiliar en el crecimiento folicular en la presencia de cantidades subóptimas de FSH. En modalidades ejemplares específicas, se descubrió que la administración de inhibidores de PDE 4, Piclamilast y Roflumilast, incrementa la maduración del folículo inducida de FSH. Los efectos más dramáticos son vistos cuando una dosis baja de FSH es administrada en combinación con un inhibidor de PDE 4. Como se puede observar a partir de los datos en las Figuras 12-14, la administración de una dosis baja de FSH sola (véase Figura 11 y Figura 12) , producirá algunos óvulos ovulados por rata que la estimulación del ovario con una dosis alta de FSH, las cuales típicamente producirán en el orden de 15-18 óvulos ovulados por rata. Los problemas de usar dosis altas de FSH han sido discutidos anteriormente . La presente invención demuestra que el número de oocitos ovulables puede ser marcadamente incrementado a partir de los números b sales vistos con FSH baja cuando las ratas son tratadas con inhibidores PDE 4. De hecho, como se puede observar a partir de la Figura 11 y Figura 12, la administración combinada de dosis bajas de FSH con 0.4 mg/kg de ya sea Piclamilast o Roflumilast produce oocitos más ovulables que aún la dosis alta de FSH sola (Figura 11 y Figura 12) . Además, como se pude observar de la Figura 14, también se notó que dosis superiores de Piclamilast (por ejemplo, 2 mg/kg) solas, sin co-administración de FSH, incrementan los oocitos hCG ovulables.

Dados los datos ejemplares anteriores, se contempla que los inhibidores PDE, y particularmente, los inhibidores PDE pueden ser usados en la producción de oocitos ovulables in vivo. Esto será particularmente útil en el contexto del tratamiento de infertilidad femenina, pero aún una hembra normal se beneficiará de tal tratamiento, particularmente si existe un deseo para incrementar la probabilidad de embarazo. En modalidades más específicas, los inhibidores PDE 4 están contemplados por ser particularmente útiles en el mejoramiento o incremento de la maduración del folículo produciendo un incremento en el número de oocitos ovulables en mamíferos in vivo comparados con el número de oocitos ovulables que son producidos en la ausencia de administración de los inhibidores PDE . Dados los hallazgos en la Figura 14, se contempla que la administración de inhibidores de PDE4 solos, sin estimulación concomitante con dosis bajas de FSH será suficiente para incrementar los oocitos ovulables en una hembra. Como tal, ciertos métodos de la invención evitan completamente la necesidad de estimulación del ovario con FSH exógeno. Alternativamente, los hallazgos muestran en las Figuras 11-14 que los métodos de la invención que también comprenden administrar niveles bajos de FSH en combinación con inhibidores de PDE 4, son suficientes para producir un incremento marcado en oocitos ovulables. Con respecto a si los inhibidores PDE 4 son administrados solos o como parte de un tratamiento de combinación con bajos niveles de FSH, los métodos de la presente invención proporcionan avance significante en la técnica reduciendo marcadamente la cantidad de estimulación de FSH requerida para proporcionar un incremento terapéuticamente benéfico en los oocitos ovulables . Tal reducción marcada en la cantidad de FSH necesaria es de mayor benéfico debido a que reduce o elimina muchos de los problemas asociados con la administración de gonadotropinas en tratamientos de fertilidad.

Específicamente, una reducción en la dosificación de FSH disminuirá la probabilidad de inducir OHSS en una hembra que se somete a tratamiento de fertilidad. Mientras mucha de la discusión presentada en este documento está en términos del uso de inhibidores de PDE 4 , los hallazgos de la presente invención soportan el uso de otros inhibidores de PDE ya sea sola, en combinación con inhibidores de PDE 4, en combinación con dosis bajas de FSH, o en combinación con inhibidores de PDE 4 y dosis bajas de FSH. Por ejemplo, se contempla que otros inhibidores de PDE por ejemplo, un inhibidor PDE 5 puede ser usado en un método para incrementar los oocitos ovulables en un mamífero. Tal método puede usar el inhibidor PDE 5 solo, o alternativamente, el método puede usar el inhibidor PDE 5 en combinación con ya sea un inhibidor PDE 4 o una dosis baja de FSH, o el método puede usar el inhibidor PDE 5 en combinación con un inhibidor PDE 4 y una dosis baja de FSH. En una modalidad preferida, el inhibidor es selectivo para los tipos de fosfodiesterasa 1 y/o 5. (un inhibidor "selectivo" de PDE tipos 1 y/o 5, por ejemplo, significa una molécula que presenta un IC50 para PDE tipos 1 y/o 5 que son en o aproximadamente 10 veces, preferiblemente 100 veces, más preferiblemente 1000 veces, inferior que el ICS0 de la molécula por otros tipos de PDE. El IC50 de una molécula para una enzima PDE puede ser medido por un ensayo in vitro, como se reporta, por ejemplo, en Thompson, et al., Adv. Cyclic Nucleotid Res. 10:69-92 (1979). También preferiblemente, el inhibidor PDE tiene un peso molecular bajo 500 Da. En una modalidad preferida adicional, el inhibidor PDE es un inhibidor de PDE tipo 1, más preferiblemente, un inhibidor selectivo de PDE tipo 1. Preferiblemente, el inhibidor PDE es un inhibidor PDE no peptídico. Aún otra alternativa preferida es un método en el cual un inhibidor PDE 4 es administrado en combinación con el inhibidor PDE 5 y una dosis baja de FSH. Se contempla que en tales métodos, la dosis de FSH usada cuando un inhibidor PDE se administra por menos de o igual a 75% de la dosis de FSH, podría ser requerida en el mismo paciente en la ausencia del uso del inhibidor PDE para lograr el mismo nivel de maduración folicular. Más preferiblemente, la cantidad de FSH será menos de o igual a aproximadamente 50% de la dosis de FSH que podría ser requerida en el mismo paciente, aún más preferiblemente, la dosis será menos de o igual al menos al 30% de la dosis de FSH que podría ser requerida en el mismo paciente sin el inhibidor PDE . Las combinaciones y métodos para usar los inhibidores PDE y composiciones FSH se discuten en detalle adicional aquí abaj o .

FSH y otras Composiciones de Gonadotropinas La FSH es una hormona de glicoproteína pituitaria que está compuesta de dos subunidades . La subunidad a- es común a FSH, así como también las otras glicoproteínas , LH, hCG, y TSH, la subunidad ß- confiere especificidad a FSH. El campo del tratamiento de infertilidad es avanzado y hay actualmente numerosas preparaciones de FSH que son comercxalmente disponibles y pueden ser usadas en los métodos de la invención. Tales preparaciones comerciales incluyen composiciones FSH derivadas de las composiciones urinarias y FSH recombinantes . Estas composiciones incluyen por ejemplo, Pergonal™, Fertinex™, Repronex™, Bravelle™, Humegon™, Gonal-F, Follistim™. Estas son preparaciones FSH comerciales meramente ejemplares y aquellos de habilidades en la técnica entenderán que puede ser posible producir otras de tales preparaciones de FSH para uso en los métodos y composiciones de la presente invención. En la extensión de que las composiciones precedentes proporcionan guía ejemplar como formulaciones y dosificaciones de FSH que pueden ser usadas, se discuten en más detalle abajo. Sin embargo, se debe entender que tales dosis y formulaciones pueden ser fácilmente modificadas y todavía ser útiles en el contexto de la presente invención, tan pronto como las dosificaciones y formulaciones de FSH cuando se administran en combinación con uno o más inhibidores de PDE producen un incremento en el número de oocitos ovulables in vivo comparado con el número de oocitos producidos en la ausencia de tal administración. Humegon™ (Organin, West Orange, NJ) , es una preparación purificada de gonadotropinas que tienen actividad FSH y LH. Las propiedades, indicaciones y protocolos para el uso de esta preparación de gonadotropinas se discute en detalle en la Phsysician' s Desk Reference . (PDR™, 52ava. Ed. 1998, páginas 1949-1951, incorporadas en este documento por referencia) . Brevemente, cada vial contiene 75 IU FSH, 75 IU o 150 IU LH. Humegon™ y hCG pueden ser administradas en una manera ' secuencial para ovulación y embarazo en mujeres infértiles anovulatorias en quienes la causa de anovulación es funcional y no es debida a la falla de ovario. De manera similar, Humegon™ y hCG están indicados para estimular el desarrollo de folículos múltiples (es decir, estimulación del desarrollo del folículo) para pacientes ovulatorios que participan en un programa de fertilización in vitro.

Tí icamente, la dosis de Humego usada para producir maduración de folículos necesita ser ajustada e individualizada para cada paciente. Sin embargo, típicamente la dosis recomendada inicial podrá ser 75 IU FSH/LH/día administrada intramuscularmente por 7 a 12 días, seguida por una dosis de hCG (5,000 U hasta 10, 000 U) , administrada un día después de la última dosis de Humegon™. Típicamente, la terapia de Humegon™ no debe continuar por más de 12 días consecutivos en un curso único de terapia. Para administración, el vial de Humegon™ (que contiene ya sea 75 IU FSH/LH o 150 FSH/LH) se disuelve en 2 mi de saina estéril e inmediatamente se administra intramuscularmente . Pergonal™ (Serono Laboratories Inc., Randolph, MA) , descrito en la Physician' s Desk Reference (PDR™, 52ava. Ed. 1998, páginas 2773-2775), es otra preparación purificada comercialmente descrita de gonadotropinas preparadas a partir de orina de mujeres postmenopáusicas, que puede ser usada para suministrar las composiciones de FSH de los métodos de la presente invención. Esta composición es formulada para administración intramuscular. Nuevamente, esta es una composición farmacéutica que comprende dosis unitarias de 75 IU FSH/LH o 150 IU FSH/LH. Este agente farmacéutico es bien reconocido como una composición para administración a una mujer para la producción de crecimiento folicular en mujeres quienes no tienen insuficiencia de ovario. Para efectuar la ovulación, preferentemente solo la maduración del folículo, el día 7-12 del curso de administración de Pergonal™ es seguido por la administración de un bolo de hCG. Repronex™ (Ferring Pharmaceutical Inc., Tarrytown, NJ) , descrito en la Phsysician' s Desk Reference. (PDR™, 57ava. Ed. 2003, páginas 1325-1327), es otra preparación purificada ejemplar de gonadotropinas aisladas de la orina de mujeres post-menopáusicas . Esta composición, disponible en dosis unitarias de actividad 75IU o 150 IU FSH/LH, es administrada por 7 a 12 días para producir el crecimiento folicular del ovario. Una maduración folicular suficiente ha ocurrido, el hCG es administrado para inducir ovulación. Repronex™ puede ser administrado subcutáneamente o intramuscularmente a pacientes infértiles con oligoanovulación o por pacientes que se someten a terapia reproductiva asistida. En la indicación anterior, los pacientes que han recibido intervención terapéutica para la supresión de la gonadotropina endógena, Repronex™, son administrados en una dosis inicial de 150 IU diariamente por los primeros cinco días del tratamiento. Basados en el monitoreo clínico de por ejemplo, niveles de estradiol en el suero, y monitoreo de ultrasonido vaginal, la dosificación subsecuente puede ser ajustada ascendentemente o descendentemente de conformidad con la respuesta individualizada del paciente. Preferiblemente, el ajuste de dosificación no debe ser más de uno cada tercer día y no debe exceder un intervalo de más de 75 a 150 IU por ajuste. Preferiblemente, la dosis diaria máxima no debe exceder 450 IU y el número máximo de días en el curso consecutivo de la terapia Repronex™ no debe exceder 12 días . Tales guías de ajuste de dosificación son aplicables a otras preparaciones de FSH discutidas en este documento. Si el paciente parece mostrar signos de maduración de folículo, se administra hCG 1 día después de la cesación de la terapia basada en Repronex™. En pacientes que son tratados con Repronex™ para terapia reproductiva asistida, en donde el paciente ha recibido una terapia supresiva de gonadotropina inicial (por ejemplo, GnRH o supresión pituitaria antagonista) , la dosis inicial típica puede ser 225 IU de Repronex™, la cual puede ser subsecuentemente ajustada de conformidad con la respuesta individual del paciente. Una vez que es evidente un desarrollo folicular suficiente, se administra hCG (unidades 5,000-10,000 USP) , para inducir maduración folicular final en la preparación para recuperación de oocitos. En el caso de que los ovarios sean anormalmente agrandados como un resultado de la administración de Repronex™, se mantiene con hCG para disminuir la posibilidad de desarrollar OHSS . Como se indica anteriormente, esta composición es administrable subcutáneamente. Para administración subcutánea, el Repronex™ es mezclado 2 mi con solución salina y las inyecciones subcutáneas son suministradas al abdomen inferior. Fertinex™ (Serono Laboratories Inc., Randolph, A) , descrito en la Phsysician's Desk Reference. (PDR™, 52ava. Ed. 1998, páginas 2771-2773), es una preparación de FSH altamente purificada de la orina de mujeres post-menopáusicas . La purificación de la composición de FSH se logra a través de cromatografía de inmunoafinidad usando un anticuerpo monoclonal murino a FSH y produce un FSH con un perfil de actividad específico desde aproximadamente 8,500-13500 IU FSH/mg de proteína, cantidades muy bajas de LH y una pureza mayor de 95% con respecto a otras proteínas urinarias. Tales métodos de purificación pueden ser fácilmente usados para obtener FSH de fuentes no comerciales, por ejemplo, orina de mujeres post-menopáusicas. Fertinex™ es administrable subcutáneamente y es suministrada en contenedores que contienen 75 IU FSH o 150 IU FSH. Esta FSH ha sido administrada en intervalos de dosificaciones ejemplares que varían desde 75 IU hasta 300 IU/día. Bravelle™ (Ferring Pharmaceutical Inc., Tarryto n, NJ) , descrito en la Physician' s Desk Reference (PDR™, 57ava Ed. 2003, páginas 1325-1327), es otra preparación de FSH altamente purificada ejemplar que puede ser usada en los métodos presentes. Bravelle™ puede ser administrado subcutáneamente o intramuscularmente y está disponible en dosis unitarias de 75 IU y 150 IU FSH.

Gonal F es una preparación FSH recombinante adecuada para administración subcutánea. Las propiedades y características de Gonal F™ se describen en detalle en la Physician's Desk Reference (PDR™, 57ava. Ed. 2003, páginas 3124-3128) . Además de estas composiciones comercialmente disponibles, aquellos de habilidades en la técnica pueden elegir purificar FSH de fuentes naturales, por ejemplo, orina de mujeres post-menopáusicas , usando técnicas bien conocidas por aquellos de habilidades en la técnica (véase por ejemplo, Patente Estadounidense No. 5,767,067). Alternativamente, aquellos de habilidades en la técnica pueden elegir producir FSH recombinante usando técnicas bien conocidas por aquellos de habilidades en el arte. Se contempla particularmente, que agonistas FSH de acción prolongada, podrán ser útiles en los métodos de la invención. Por ejemplo, se sabe que la hCG tiene una vida media más larga que la FSH. Ambas gonadotropinas portan una subunidad a- común, con la actividad especifica siendo conferida por la subunidad ß. Se ha demostrado previamente, que la subunidad a- de una gonadotropina puede ser usada con la subunidad ß de otra y todavía proporcionar una gonadotropina quimérica fisiológicamente activa. Además, se ha demostrado que la biopotencia incrementada de hCG comparada con LH fue debida al péptido carboxi-terminal de la subunidad ß- de hCG (Matzuk et al., Endocrinology 126:376-383, 1990). Los agonistas de acción prolongada de FSH pueden ser generados los cuales contienen una extensión peptídica carboxi-terminal de la subunidad ß de hCG en el término carboxi de la subunidad ß de FSH. (LaPolt et al., Endocrinology, 131:6, 2514-2520, 1992). Tales moléculas quiméricas han mostrado poseer una vida media de circulación y potencia marcadamente incrementada comparada con la FSH de tipo nativa (Fares et al., Proc. Nat'l Acad. Sci., 89:4304-4308, 1992) . Con respecto al curso del FSH, se ha demostrado aquí, que la inducción significante de la maduración del folículo se puede lograr usando dosis subóptimas de FSH. Como se discutió anteriormente, la dosificación típica de FSH administrada en protocolos de tratamiento de fertilidad varía desde aproximadamente 75 IU FSH/día hasta aproximadamente 450 IU FSH/día por un curso desde aproximadamente 7 días hasta aproximadamente 12 días . En los métodos de la presente invención, se contempla que la dosis de FSH usada para estimular la maduración folicular, en combinación con la PDE4 u otros inhibidores de PDE, puede ser la misma conforme las dosis actualmente sean usadas para el tratamiento de oligoanovulación y/o en tecnologías productivas asistidas (es decir, varían entre 75 IU FSH hasta aproximadamente 450 IU FSH por día) . Sin embargo, dado que la presente invención muestra que es posible obtener maduración folicular aún con dosis subóptimas de FSH, cuando tales dosis son administradas en combinación con un inhibidor PDE 4, se prefiere que la dosis sea inferior que estas dosis típicas. Se contempla que los métodos de la presente invención pueden ser usados tan poco como 5 IU FSH/día. De este modo, se contempla que cualquier régimen de tratamiento dado puede emplear 5 Iü FSH/día, 10 IU FSH/día, 15 IU FSH/día, 20 IU FSH/día, 25 IU FSH/día, 30 IU FSH/día, 35 IU FSH/día, 40 IU FSH/día, 45 IU FSH/día, 50 IU FSH/día, 55 IU FSH/día, 60 IU FSH/día, 65 IU FSH/día, 70 IU FSH/día, 75 IU FSH/día, 150 IU FSH/día, o más unidades de FSH por día. Por supuesto, se debe entender que estas son dosificaciones diarias meramente ejemplares y otras dosis de integrantes entre cualquiera de las dosis específicamente mencionadas, también pueden ser usadas en los métodos de tratamiento de la invención. Además, se debe entender que las dosificaciones pueden ser ajustadas ascendentes o descendentes durante cualquier curso dado de administración de FSH. La FSH puede ser administrada a través de cualquier ruta normalmente empleada para la administración de hormonas gonadotropinas . Más preferiblemente, la administración es ya sea vía inyección intramuscular o subcutánea. A través de los protocolos de tratamiento, el paciente es monitoreado para determinar signos de reacción adversa que incluyen signos de OHSS. Además de FSH, otras hormonas gonadotropinas serán usadas en los métodos de la presente invención y envasadas en kits descritos aquí. Tales hormonas incluyen hCG. Esta es comercialmente disponible como Novarel™ (Ferring Pharmaceutical Inc., Tarrytown, NJ) , descrita en la Physician' s Desk Reference (PDR™, 57ava. Ed. 2003, páginas 1324-1325) y es una gonadotropina producida por la placenta humana y obtenida a partir de la orina de mujeres embarazadas . Otra preparación comercial de hCG es Pregnyl™ (Organon, West Orange, NJ) . Las propiedades, indicaciones y protocolos para el uso de esta hormona se discuten en detalle en la Physician' s Desk Reference. (PDR™, 57ava. Ed. 2003, páginas 2401) . Ambas de estas preparaciones son para administración intramuscular. Típicamente, esta hormona es administrada en una dosificación de entre aproximadamente 5,000 Unidades y 10,000 Unidades para inducir la ovulación. Aún otra hormona que puede ser usada y envasada aquí es GnRH. Existen numerosas fuentes comerciales de esta hormona. La GnRH y análogos de las mismas están comercialmente .disponibles como Cetrotido™ (Serono, PDR™, 57ava. Ed. 2003, páginas 3119-3121); Eligard™ (Sanofi-Synthelabo, PDR™, 57ava. Ed. 2003, página 2994); Lupron™ (PDR™, 57ava. Edición 2003, páginas 3185); y Zoladex™ (AstraZeneca PDR™, 57ava. Ed. 2003, página 695). Estos agentes son usados para suprimir la producción LH/FSH en mujeres y son por lo tanto usados para retardar la ovulación. Dosis típicas de estos agentes varían desde aproximadamente 0.25 mg hasta aproximadamente 3 mg. La terapia de estimulación del ovario con FSH es típicamente iniciada al 2do. o 3er. día del ciclo menstrual. La GnRH o análogos de la misma son administrados ya sea una vez diariamente (dosis inferior, por ejemplo, 0.25 mg) , o como una dosis única (por ejemplo, 3 mg) durante el comienzo a la mitad de la fase folicular (la "fase estimulatoria" ) . La GnRH es administrada hasta el día de la administración de hCG. Cuando los análisis de ultrasonido revelan que los folículos son de un tamaño adecuado, hCG es administrada para inducir la ovulación y maduración final del oocito.

Inhibidores de Fosfodiesterasa Las fosfodiesterasas (PDE, por sus siglas en Inglés) son una familia de enzimas responsables del metabolismo de los segundos mensajeros intracelulares AMP cíclicos (cAMP) y GMP cíclicos (cGMP) . La PDE 4 es una cAMP específica de PDE que es la principal, sino la única, enzima metabolizante de cAMP encontrada en células inflamatorias e inmunes, y contribuye significantemente al metabolismo AMP cíclico en músculos lisos. La PDE 4 es inhibida por el Rolipram antidepresivo (4- [3- (Ciclopentiloxi) -4-metoxi-fenil] -2-pirrolidinona; A.G. Scientific, Inc., San Diego, CA) . El Rolipram fue la primera generación de inhibidores PDE 4 desarrollados (véase Conti, Biology of Reproduction 67:1653-1661, 2002). Subsecuentemente, otros de tales inhibidores han sido identificados, incluyendo pero no limitado a Piclamilast, Roflumilast, Ariflo, Filaminast, Mesopram, D4418, Arofyllina, CL1044. Además, otros inhibidores de PDE tales como Sildenafil, AS701948/1 y AS701947/1, también serán útiles en la presente invención. De este modo, inhibidores PDE4 particularmente preferidos para uso en la presente invención incluyen lirimilast. (Bayer AG) ; CDP-840 (Celltech Group PLC) , NCS-613 (Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) E-4021 (Eisai Co Ltd) , GRC-3785 (Glenmark Pharmaceuticals Ltd) , IC-485 (ICOS Corp) ; IPL-455903 (Inflazyme Pharmaceuticals Ltd) , ONO-6126 (Ono Pharmaceutical Co Ltd), Tofimilast (Pfizer Inc.), Piclamilast (Rhone-Poulenc SA (Aventis SA) ) , Cilomilast. (SmithKline Beecham PLC) , Filaminast Wyeth-Ayerst Pharmaceuticals nc) , AY-126120 (Wyeth-Ayerst Pharmaceuticals IncO) , Mesopram (Schering) , y Roflumilast (Altana) . Los anteriores y otros inhibidores PDE4 son bien conocidos por aquellos de habilidades en la técnica y han sido descritos en por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 6649633; Patente Estadounidense No. 6624181; Patente Estadounidense No. 6127363; DE 1545687, DE 2028869, DE 2123328, DE 2315801, DE 2402908, DE 2413935, DE 3900233, EP 0103497, EP 0139464, EP 0158380, EP 0163965, EP 0335386, EP 0389282, EP 0428302, EP 0435811, EP 0459505, EP 0470805, EP 0490823, EP 0506194, EP 0511865, EP 0527117, EP 0393500, EP 0510562, EP 0553174, EP 0557016, EP 0626939, EP 0664289, EP 0671389, EP 0685474, EP 0685475, EP 0685479, EP 0736532, EP 0738715, EP 0748805, EP 0763534, EP 0816357, EP 0819688, EP 0819689, EP 0832886, EP 0834508, EP 0848000, JP 92234389, JP 94329652, JP 95010875, JP 98072415, JP 98147585, Patentes Estadounidenses Nos. 5,703,098, 5,739,144, WO 9117991, WO 9200968, WO 9212961 WO 9307146, WO 9315044 WO 9315045 WO 9318024, WO 9319068 WO 9319720, WO 9319747 WO 9319749 WO 9319751, WO 9325517 WO 9402465, WO 9412461 WO 9420455 WO 9422852, WO 9427947 WO 9501338, WO 9501980 WO 9503794 WO 9504045, WO 9504046 WO 9505386, WO 9508534 WO 9509623 WO 9509624, WO 9509627 WO 9509836, WO 9514667 WO 9514680 WO 9514681, WO 9517392 WO 9517399, WO 9519362 WO 9520578 WO 9522520, WO 9524381 WO 9527692, WO 9535281 WO 9535283 WO 9535284, WO 9600218 WO 9601825, WO 9606843 WO 9611690 WO 9611917, WO 9612720 WO 9631486, WO 9631487 WO 9635683 WO 9636595, WO 9636596 WO 9636611, WO 9636625 WO 9636638 WO 9638150, WO 9639408 WO 9640636, WO 9703967 WO 9704779 WO 9705105, WO 9708143 WO 9709345, WO 9712895 WO 9718208 WO 9719078, WO 9720833 WO 9722585, WO 9722586 WO 9723457 WO 9723460, O 9723461, WO 9724117, WO 9724355, WO 9725312, WO 9728131, WO 9730999, WO 9731000, WO 9732853, WO 9735854, O 9736905, WO 9743288, WO 9744036, WO 9744322, WO 9747604, WO 9748697, WO 9804534, WO 9805327, WO 9806692, WO 9806704, WO 9807715, WO 9808828, WO 9808830, WO 9808841, WO 9808844, WO 9809946, WO 9809961, WO 9811113, WO 9814448, WO 9818796, WO 9821208, O 9822453 , WO 9845268 , O 9855481, WO 9856756, WO 9905111, WO 9905112, WO 9505113, WO 9906404, WO 9918095, WO 9501338, O 9603399, O 9636625, WO 9636626, WO 9735854, WO 9821208, WO 9831674, WO 9840382, O 9855481, O 9905111, O 9905112, WO 9905113, WO 9931071 y WO 9931090 . Cualquiera de estas sustancias puede ser usada como la composición inhibidora de PDE4 en el contexto de la presente invención. Las sustancias que tienen buena disponibilidad oral son particularmente preferidas . Estos inhibidores de PDE 4 pueden ser administrados a través de cualquier ruta comúnmente empleada para la administración de un inhibidor de PDE. Típicamente, estos agentes químicos son formulados para administración oral. Las tabletas pueden ser formuladas para comprender: 50 µ^; 100 xq; 200 µg,¦ 300 µg,· 400 µg; 450 µg; 500 µg. Actualmente, el roflumilast está siendo desarrollado para indicaciones pulmonares con dosis de aproximadamente 400 ug/día, por administración oral . Se contempla que tales dosis puedan también ser útiles en el contexto de la presente invención.

Los inhibidores de PDE 4 son administrados al sujeto en una dosis diaria de 200 g/dí ; 300 µg/d ; 400 µg/día; 500 o aún tanto como 1 a 5 mg/día. Típicamente, el paciente puede recibir tan poco como 100 µg/día por el curso del tratamiento. Por supuesto, se debe entender que el sujeto puede recibir más o menos del inhibidor de PDE 4 de conformidad con el requerimiento individualizado. Típicamente, dosis mayores de 100 mg/día deben ser evitadas. El inhibidor PDE 4 puede ser suministrado en una dosis única o alternativamente, puede ser subdividido y administrado en dosis múltiples durante un periodo de tiempo dado. La administración de tabletas ordinarias que contienen los inhibidores puede ser una vez, dos veces, tres o más veces al día. También se debe entender que mientras la administración oral es preferida, dosis similares pueden ser administradas a través de las rutas rutinarias de administración. Sildenafil es un inhibidor PDE 5 farmacéuticamente aprobado que puede proporcionar guía adicional como a las formulaciones y rutas de administración de los inhibidores de PDE 4 (véase PDR™ 57ava. Edición, páginas 2653-2S56) . Para protocolos de tratamiento, aquellos de habilidades ordinarias en · la técnica pueden usar las líneas guías usadas para este inhibidor PDE farmacéutico. Otros PDE 5, asi como también los inhibidores PDE1, pueden ser útiles en la presente invención. Tales inhibidores han sido descritos en la Solicitud de Patente Estadounidense No. 60/470,434 titulada "Inhibidores de Enzimas de PDE en Infertilidad" , y Solicitud de Patente Estadounidense No. 10/014,812 (Publicación de Solicitud de Patente Estadounidense No. 20020103106, incorporada aquí por referencia en su totalidad) , titulada "Métodos para Inducir la Ovulación" , la cual describe una variedad de inhibidores de PDE3/4 para provocar la ovulación que puede ser usada en los métodos de maduración de folículo de la presente invención. Se debe notar que los métodos de la presente invención se dirigen a métodos para incrementar la maduración del folículo y son distintos de los métodos para inducir la ovulación. Composiciones adicionales están descritas en el documento PCT/EP01/14730. Inhibidores ejemplares que pueden ser útiles en las terapias combinadas discutidas aquí incluyen, pero no se limitan a, 5- (2-etoxi~5- (4-metil-l-piperazinilsulfonil) fenil] -l-metil-3-n-propil-l, 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] irimidin-7-ona (sildenafil) ; Zaprinast; dipiridamol ; 5- (2-etoxi-5-morfolinacetilfenil) -l-metil-3 -n-propil-1, 6-dihidro-7H-20 pirazolo [4 , 3-d] irimidin-7-ona; 3-etil-5- [5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) -2-n-propoxifenil] -2- (pir-idin-2-il) metil-2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; 3-etil-5- [5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) -2- (2-metoxietoxi) piridi-n-3 -il] -2- (piridin-2-il)metil~2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4, 3-d] irimidin-7-ona; (+) -3-etil-5- [5- (4- etilpiperazin-1-ilsulfonil) -2- (2-metoxi-l (R) -metiletoxi) iridin-3-il] -2-metil-2 , 6-dihidro~7H-pirazolo [4,3-d] pirimidin-7-ona; 5- [2-etoxi~5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) piridin-3-il] -3-etil-2- [2-metoxietil] -2, 6-dihidro-7H-pirazolo [ , 3-d] piriraidin-7-ona; 5- [2-iso-butoxi-5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) iridin-3-il] -3-etil-2- (1-metilpiperidin-4-il) -2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; 5- [2-etoxi-5- (4~etilpiperazin-l-ilsulfonil)piridin-3-il] -3-etil-2-fenil-2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; 5- (5-acetil-2-propoxi-3-piridinil) -3-etil-2- (1-isopropil-3-azetidiníl) -2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4,3-d] pirimidin-7-ona; 5- [2-iso-butoxi~5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) piridin-3-il] -3-etil-2~ (l-metilpiperidin-4-il) -2 , 6~dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; 5- [2-etoxi-5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) piridin-3-il] -3-etil-2-fenil- 2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] irimidin-7-ona; 5- (5-acetil-2-butoxi-3-piridinil) -3-etil-2- (l-etil-3-azetidinil) -2 , 6-dihldro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; (6R, 12aR) -2,3,6, 7, 12, 12a-hexahidro-2-metil-6- (-3,4-raetilenedioxifenil) irazino [2' , 1': 6, 1] pirido [3 , 4-b] indol-1,4-diona (Tadalafil; IC-351) ; es decir, el compuesto de los ejemplos 78 y 95 de la solicitud internacional publicada WO 95/19978, asl como también el compuesto de los ejemplos 1, 3, 7 y 8 en este documento; 2- [2-etoxi-5- (4-etil-piperazin-l-il-1-sulfonil) -fenil] -5-metil-7-propil-3H-imidazo [5 , 1- f] [1, 2, ] triazin-4 -ona (vardenafil) ; el compuesto del ejemplo 11 publicado en la solicitud internacional WO93/074124 (ESAI) ; los compuestos 3 y 14 de Rotella D P. J. Med. Chem., 2000, 43, 1257; 4-bromo-5- (piridinilmetilamino) -6- [3 (4-clorofenil) -propoxi] -3- (2H) piridazinona; sal monosódica del ácido 1- [4- [ (l,3-benzodioxol-5-ilmetil) amino] -6-cloro-2-quinozilinil] -4-piperidin-carboxílico; (+) -cis-5 , 6a, 7 , 9 , 9 , 9a-hexahidro-2- [4- (trifluorometil) -fenilmetil-5-metil-ciclopent- [4 , 5] imidazo [2 , l-purin- (3H) ona; furaziocilina; cis-2-hexil-5-metil-3 ,4, 5, 6a, 7, 8, 9, 9a-octa idrociclopent [4,5] -imidazo [2- , 1-b] purin-4-ona; 3-acetil-l- (2-clorobencil) -2-propilindol-6-carboxilato; 3-acetil-l- (2-clorobencil) -2-propilindol-6-carboxilato; 4-bromo-5- (3-piridilmetilamino) -6- (3- (4-clorofenil) propoxi) -3- (2H) piridazinona; l-metil-5(5-morfolinoacetil-2-n-propoxifenil) -3-n-propil-l, 6-dihidro-7H-pirazolo (4 , 3-d) pirimidin-7-ona; sal monosódica del ácido 1- [4- [ (1, 3-benzodioxol-5-il-metil) amino] -6~cloro-2-quinazolinil] -4-piperidincarboxílico; Pharmaprojects No. 4516 (Glaxo Wellcome); Pharmapro ects No. 5051 (Bayer); Pharmaprojects No. 5064 (Kyo a Hakko; véase documento WO 96/26940) ; Pharmaprojects No. 5069 (Schering Plough) ; GF-196960 (Glaxo Wellcome) ; E-8010 y E-4010 (Eisai) ; Bay-38-3045 & Bay-38-9456 (Bayer) , Vinpocetina (Richter Gideon) ; SCH-51866 (Schering-Plough), SCH-59498; (6aR,9aS)-2-(Bifenililmetil) -5, 6a, 7 , 8 , 9, 9a-hexahidro-5-metil-3 (fenilmetil) ciclopent [4 , 5] imidazo- [2 , 1-b] purin-4 (3H) -ona; 5 ' -Metil-2 ' (bifenililmetil) -3 ' - (fenilmetil) espiro [ciclopentan-1,7' (8?) - [3H] imidazo [2 , 1-b] purin] -4 (5?) -ona; (6aR, 9aS) - 5, 6a, 7, 8,9, 9a~Hexahidro-5-metil-2- (feniletinil) -3-(fenilmetil) ciclopent [4 , 5] imidazo [2 , 1-b] -purin-4 (3H) -ona; dipiridamol; AWD-12-171 y AWD-12-217 (ASTA Medica) ; BMS-341400 (Bristol Meyers Squibb); UK-343,664 (Pfizer); 5E-3623, 5E-3569, 5E-3657, E4021 (Eisai) ; KS-505a (Kyowa Hakko Kogyo) ; YC-1 (Yung Shin Pharmaceutical Industries) ,· número de referencia IDDB 323951 (Bayer) ; WIN-61691 (Sanofi inthrop) ; FR226807 (Fujisawa); referencias IDDB 461317, 462503, 461321, 461324, 466146 (Johnson & Johnson); 3- (1, 3-benzodioxol-5-il) -9-oxo-l, 3,4, 9-tetrahidro-2H-pirrolo [3 , 4-b] quinolin-2-carboxilato de piridin-4-ilmetilo; los compuestos listados en la Tabla 1 de Jiang, et al., J". Med. Chem. , 46:441-444 (2003), particularmente los compuestos 20b, 20e, 20f, 201, 20o, 20p, (-)-20q, 20t, 20u, 20v, 20w y 26a. Los inhibidores PDE particularmente preferidos son Sildenafil y Zaprinast, Dipiridamol, y los compuestos no. 31 y 33 (GaR, 9aS) -2- (bifenililmetil) -5 , 6a, 7, 8, 9, 9a-hexahidro-5-metil-3 (fenilmetil) ciclopent [4 , 5] imidazo- [2 , 1-b] purin-4 (3H) -ona y 5 ' -Metil-2 ' (bidenililmetil) -3 ' -(fenilmetil) espiro [ciclopentano-1, 7' (8 ' H) - [3H] imidazo [2 , 1-b]purin] -4 (S'H) -ona. Las composiciones farmacéuticas que comprenden inhibidores PDE las cuales pueden ser usadas en el método de la invención, incluyen todas las composiciones en donde los inhibidores de PDE están contenidos en una cantidad efectiva para lograr la dosis propuesta. Además, las composiciones farmacéuticas pueden contener portadores farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y auxiliares los cuales facilitan el procesamiento de los compuestos activos en preparaciones las cuales pueden ser farmacéuticamente usadas . Vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos en la técnica y se describen por ejemplo en. Gennaro, et al., un texto de referencia estándar en este campo. Gennaro, et al., de Remington' s Pharmaceutica.1 Sciences, Parte 8, 20ava Ed. , Merck Publishing Company, Easton, Pennsylvania (2000) . Vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser seleccionados rutinariamente de conformidad con el modo de administración y la solubilidad y estabilidad de los inhibidores de PDE. Por ejemplo, las formulaciones para administración intravenosa pueden incluir soluciones acuosas estériles las cuales también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos estables. El uso de biomateriales y otros polímeros para el suministro de fármaco, asi como las diferentes técnicas y modelos para validar un modo específico de administración, se describen en la literatura (Lou, et al., Exp. Opin. Ther. Patente, 11: 1395-1410 (2001); Cleland, et al., Curr. Opin. Biotechnol . , 12: 212-9 (2001)). Los inhibidores de PDE pueden ser administrados por cualquier medio que logre el propósito proyectado. Por ejemplo, la administración puede ser por un número de rutas diferentes incluyendo, pero no limitado a subcutánea, intravenosa, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal , intra-cerebral , intratecal, intranasal, oral, rectal, transdérmica, intranasal o bucal. Preferiblemente los inhibidores PDE se administran oralmente . La administración parenteral puede ser por inyección de bolo o por perfusión gradual durante un tiempo. Se entenderá que la dosificación administrada dependerá de la edad, salud y peso del receptor, tratamiento actual, si es cualquiera, frecuencia del tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. La dosis total requerida para cada tratamiento puede ser administrada por dosis múltiples o en dosis únicas. Preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles, las cuales pueden contener agentes auxiliares o excipientes los cuales son bien conocidos en la técnica. Formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua, por ejemplo, sales solubles en agua. Además, puede ser administrada una suspensión del compuesto activo como una formulación inyectable aceitosa. Dependiendo de la ruta propuesta de suministro, los inhibidores PDE pueden ser formulados como composiciones orales o inyectables. Las composiciones para administración oral pueden tomar la forma de soluciones o suspensiones líquidas de volumen, o polvos de volumen. Más comúnmente, sin embargo, las composiciones están presentadas en formas de dosificación unitaria para facilitar la dosificación exacta. El término "formas de dosificación unitaria" se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos y otros mamíferos, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéuticamente adecuado. Formas de dosificación unitaria típicas incluyen ampolletas o jeringas pre-llenadas , pre-medidas de las composiciones líquidas o pildoras, tabletas, cápsulas o similares en el caso de composiciones sólidas. En tales composiciones, el inhibidor PDE es usualmente un componente menor (desde aproximadamente 0.1 hasta aproximadamente 50% en peso o preferiblemente desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 40% en peso) con el resto siendo varios vehículos o portadores y que procesan ayuda útil para formar la forma de dosificación deseada. Formas líquidas adecuadas para administración oral pueden incluir un vehículo acuoso o no acuoso adecuado con amortiguadores , agentes de suspensión y dispersantes, colorantes, saborizantes y similares. Las formas sólidas pueden incluir, por ejemplo, cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa; un agente desintegrante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio; un deslizante tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o saborizante naranja. Las composiciones inyectables se basan típicamente en solución salina estéril inyectable o salina amortiguada con fosfato u otros portadores inyectables conocidos en la técnica . Los componentes anteriormente descritos para composiciones oralmente administradas o inyectables son solamente representativos. Materiales adicionales así como también técnicas de procesamiento y similares son conocidas por los expertos practicantes (Genna.ro et al., 2000). Los inhibidores PDE pueden también ser administrados en formas de liberación sostenida o de sistemas de suministro de fármaco de liberación sostenida. Una descripción de materiales de liberación sostenida representativos es también conocida por el experto practicante (Karsa, et al. (ed.), Encapsulation and Controlled Reléase, Springer Verlag (1993); Yacobi, et al.. Oral Sustained Reléase Formulations: Design and Evaluation, Pergamon Press (1998) ) . Por "cantidad efectiva" , significa una cantidad suficiente para lograr una concentración del inhibidor PDE el cual es capaz de promover el crecimiento folicular, con o sin FSH exógeno o reemplazos de FSH. Tales concentraciones pueden ser rutinariamente determinadas por aquellos expertos en la técnica. La cantidad del compuesto actualmente administrado típicamente será determinada por un especialista, en vista de las circunstancias relevantes, que incluyen la condición a ser tratada, la selección de la ruta de administración, el compuesto actual administrado, la edad, peso y respuesta del paciente individual, los niveles de FSH endógenos del paciente y similares. La expresión "farmacéuticamente aceptable" significa abarcar cualquier portador el cual no interfiere sustancialmente con la efectividad de la actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico al huésped al cual se administra. Por ejemplo, para administración parenteral, los ingredientes activos anteriores pueden ser formulados en formas de dosificación unitaria por inyección en vehículos tales como salina, solución dextrosa, albúmina de suero y solución Ringer. Además del portador farmacéuticamente aceptable, composiciones que comprenden inhibidores PDE pueden también comprender cantidades menores de aditivos, tales como estabilizadores, excipientes, amortiguadores y preservativos. Aquellos expertos en la técnica se refieren a la Solicitud Provisional Estadounidense con No. de serie 60/470,434 titulada "Inhibitors de PDE Enzymes in Infertility. " En dicha especificación se describen métodos y composiciones de inhibidores PDE1 y/o PDE5 útiles para inducir ovulación e hiperestimulación controlada de ovario para fertilización in vitro. El documento completo se incorpora en este documento por referencia en su totalidad para enseñanzas de inhibidores y protocolos para administración de tales inhibidores. Cualquiera de los inhibidores descritos en este documento, puede ser usado en los protocolos de la presente invención. Inhibidores PDE4 particularmente preferidos que pueden ser usados en este documento incluyen, pero no se limitan a Roflumilast (métodos y composiciones para elaborar este compuesto, pueden ser encontrados en el documento WO9501338) , Piclamilast (métodos de elaboración del mismo procedimiento se describen en J. Med. Chem. 37:1696-1703 (1994)), Ariflo/Cilomilast (métodos de elaboración del mismo se describen en J. Med. Chem. 41:821-835 (1998)), Mesopram (métodos de elaboración del mismo son el documento W097/155561) , Filaminast (métodos de elaboración del mismo se describen en el documento EP0470 805 Bl) .

Suministro de una Combinación de Inhibidores FSH y Fosfodiesterasa para inducir la Maduración del Folículo En ciertos aspectos, los métodos de la invención contemplan el uso combinado de inhibidores PDE 4 con una composición que contiene FSH para incrementar la maduración del folículo. Sin embargo, además de terapias basadas solamente en el suministro de terapia de combinación FSH/DE 4 , los métodos de la presente invención también contemplan la terapia de combinación con una tercera composición que mejorará los efectos de maduración del folículo de los métodos de tratamiento de la invención. Tal tercera composición puede ser un segundo inhibidor PDE 4 , o un segundo inhibidor de PDEs que no son específicamente un inhibidor PDE 4. Por ejemplo, se contempla que los métodos de la presente invención pueden además involucrar la administración de un inhibidor PDE 1 y PDE 5. Además, el LH y/o hCG también se proporcionará en los métodos de la presente invención. Se entenderá que un tratamiento benéfico se puede llevar a cabo por administración de un solo inhibidor PDE4. Para lograr el resultado terapéutico apropiado en las terapias de combinación contempladas en este documento, es decir, para lograr un incremento en el número de oocitos ovulables en el mamífero que es tratado, se podrá administrar de manera general al sujeto, la FSH y la composición del inhibidor PDE 4. Estas composiciones podrán ser proporcionadas en una cantidad efectiva combinada para producir el resultado terapéutico deseado. De forma típica, como se indicó anteriormente, el tratamiento de FSH es un curso de administraciones diarias que dura entre 7 hasta 12 días . La administración del inhibidor PDE 4 puede ser administrada concurrentemente con la terapia FSH. En tales casos, el inhibidor PDE 4 y FSH pueden estar contenidos en la misma forma como una mezcla. De forma alternativa, las composiciones del inhibidor PDE 4 pueden ser tomadas antes, o después de la terapia de FSH. Además, mientras la terapia de FSH debe preferiblemente ser únicamente administrada por cualquier periodo de tiempo dado de 7 hasta 12 días durante cualquier ciclo menstrual dado, se contempla que el inhibidor PDE 4 puede ser administrado continuamente administrado a través del ciclo tan pronto como dicha administración no cause efectos colaterales nocivos. Alternativamente, el inhibidor PDE 4 puede ser administrado menos frecuentemente que la terapia de FSH . En las otras modalidades en la cual un tercer agente terapéutico es administrado, el tercer agente puede nuevamente ser administrado concurrentemente con uno, otro o ambas de las composiciones terapéuticas del inhibidor PDE 4 y FSH o puede ser administrado antes o después de las terapias FSH/PDE 4. En una modalidad, todas las modalidades en donde dos o más de las composiciones terapéuticas se administran separadamente, se podría asegurar de manera general, que un periodo significante de tiempo no ha expirado entre el tiempo de cada suministro, de manera tal que el agente basado en PDE 4 y la administración de FSH y/o el tercer agente, todavía podrían ser capaces de ejercer un efecto ventajosamente combinado en la célula. En tales casos, se contempla que se podrían administrar las tres composiciones dentro de aproximadamente 12-24 horas entre sí y, más preferiblemente, dentro de aproximadamente 6-12 horas entre sí, con un tiempo retraso de únicamente aproximadamente 12 horas, siendo más preferido. En algunas situaciones, puede ser deseable prolongar el periodo de tiempo para el tratamiento significantemente, sin embargo, en donde transcurren varios dias (2, 3, 4, 5, 6 ó 7) entre las administraciones respectivas. De igual manera, en donde el protocolo completo se repite, puede ser deseable ya sea repetir el protocolo a través de ciclos consecutivos o alternativamente, el especialista puede determinar que es deseable permitir 1, 2, 3 , 4 o más ciclos transcurridos entre dos protocolos de tratamiento de la presente invención.

Selección y Monitoreo del Paciente Los pacientes que reciben los tratamientos de la invención son pacientes femeninos, preferiblemente, entre las edades de 20 y 45. La selección del paciente para los métodos de la presente invención puede emplear los mismos parámetros como se describe en las entradas de PDR™ para uso de terapias basadas en FSH descritas abajo. Por ejemplo, antes del tratamiento, el paciente es sometido a un examen ginecológico y evaluación endocrinológica completos, que incluyen una valoración de anatomía pélvica. La falla de ovario principalmente debe ser excluida determinando los niveles de gonadotropina del suero basal y se debe asegurar que la paciente no este embarazada. A lo largo de los regímenes de tratamiento de la presente invención, el paciente debe ser valorado antes de, durante, y después, de la terapia para monitorear los signos de OHSS. Los síntomas de OHSS incluyen pero no se limitan a dolor abdominal, distensión abdominal, síntomas gastrointestinales que incluyen náuseas, diarrea, alargamiento severo del ovario, ganancia de peso, disnea y oliguria. Clínicamente, las manifestaciones de síntomas en hipovolemia, hemoconcentración, desequilibrio electrolítico, ascitos, hemoperitoneo, efusiones pleurales, estrés pulmonar agudo hidrotórax y tromboembolismo . En el caso que los síntomas de OHSS se originen durante la administración de la terapia basada en FSH o cualquier otro agente que es administrado para estimulación de maduración folicular, la administración deberá cesar y el sujeto deberá ser colocado bajo supervisión médica para determinar si la hospitalización u otra intervención es necesaria. Otros síntomas que pueden ser usados para monitorear la terapia basada en FSH incluyen cambios en la citología vaginal, apariencia y volumen de la mucosa vaginal, Filancia y cristalización de la mucosa cervical. Estos últimos síntomas son indicativos del efecto estrogénico de la terapia, y deben ser monitoreados porque la administración de FSH estimulará la producción de estrógeno. Preferiblemente estos efectos estrogénicos deben ser monitoreados en conjunto con más determinaciones directas del desarrollo del folículo tal como, por ejemplo, determinación de estradxol del suero y ultrasonografxa . Las manifestaciones clínicas de la ovulación, diferentes al embarazo, se pueden obtener ya sea a través de una medición directa o indirecta de la producción de progesterona . Tal indicio incluye: un aumento en la temperatura corporal basal, incremento en progesterona del suero, menstruación después de un cambio en la temperatura corporal. En conjunto con los indicadores anteriores de producción de progesterona, puede ser usada visualización sonográfica de los ovarios para ayudar en la determinación si la ovulación ha ocurrido. Tal monitoreo monográfico puede incluir evaluación de fluido en el cul-de-sac, estigma de ovario y la presencia de folículos colapsados . Las determinaciones sonográficas también ayudarán en la determinación si los ovarios son agrandados en OHSS .

Uso de Inhibidores de PDE para Inducir la Ovulación El inhibidor PDE es preferiblemente administrado al paciente durante una fase estimulatoria a partir de, o aproximadamente diez días, más preferiblemente a, o aproximadamente tres a, o aproximadamente ocho días, preferiblemente iniciando en o aproximadamente el día 2 o día 3 del ciclo menstrual. Para 10, la administración es preferiblemente continuada hasta que haya un folículo de diámetro medio mayor que o igual a aproximadamente 16-18 rara (y preferiblemente no más de dos folículos de diámetro medio mayor que 14 mm) . La administración del inhibidor PDE preferiblemente se detiene en los días que la hCG es administrada para comenzar la fase ovulatoria. Para la inducción de ovulación, el inhibidor PDE puede ser administrado solo (actuando con FSH endógena) , o puede ser administrado en conjunto con FSH o un agente que tiene actividad FSH, o liberación de FSH endógena estimulada. La administración del inhibidor PDE en conjunto con otro agente estimulante el folículo puede ser simultánea, separada o secuencial . Los agentes que tienen actividad FSH incluyen FSH recombinante y urinaria, y también FSH mezclada con cantidades variadas de LH, tal como hMG. Agentes que tienen actividad FSH también incluyen análogos de FSH, por ejemplo, CTO-FSH [un recombinante FSH modificado de acción prolongada, que consiste de una subunidad a de tipo nativo y una subunidad a híbrida en la cual el péptido carboxi terminal de hCG se ha fusionado al C-terminal de la subunidad ß de FSH, véase LaPolt, et al., Endocrinology, 13:2514-2520 (1992); o Klein, et al., Human Reprod. 18:50-56 (2003)]. También se incluye una FSH-CTP de cadena sencilla, una molécula de cadena sencilla, que consiste de las siguientes secuencias (de N-terminal o C-terminal) : PFSH hCG-CTP(113-145) aFSH en donde FSH significa la subunidad ß de FSH, hCG CTP (113- 145) significa el péptido carboxi terminal de hCG y aFSH significa la subunidad <x de FSH, como se describe en Klein et al., Fertility & Esterility 77:1248-1255 (2002). Los agentes los cuales estimulan o conducen a producción o liberación de FSH endógeno incluyen citrato de clomifeno e inhibidores de aromatasa, tales como, por ejemplo, Letrozol, YM-511, Anastrozol o Fadrozol . El uso de estas moléculas en 10 se describe, por ejemplo, en los documentos WO 02/083241 y WO 02/083239. En un régimen preferido para 10, se administra al paciente un inhibidor PDE, preferiblemente un inhibidor PDE 1 y/o 5, más preferiblemente un inhibidor PDE 1 y/o 5 selectivo, más preferiblemente un inhibidor PDE 1, y más particularmente preferiblemente un inhibidor PDE 1 selectivo, preferiblemente iniciando en o aproximadamente al día tres después de la menstruación. Esto marca el comienzo de la fase estimulatoria. Se continúa la Administración del inhibidor PDE, preferiblemente en una base diaria, pero puede también ser dos veces diaria o en días alternados, o aún en una dosis única. El progreso del desarrollo de folículos puede ser monitoreado por ultrasonido. El crecimiento folicular es juzgado por ser suficiente cuando hay un folículo de diámetro medio mayor que o igual a, o aproximadamente 16-18 mm, y preferiblemente no mayor que dos folículos con diámetro medio mayor que 16 mm, se da una activación de ovulación (haciendo el final de la fase estimulatoria y el inicio de la fase ovulatoria) , usando un agente que tiene actividad LH, por ejemplo, hCG (usualmente 5,000 a 10,000 IU) , LH (25,000 a 70,000 IU) o un inhibidor PDE IV (como se describe en la solicitud de patente estadounidense publicada no. 2002/0103106 Al) . El paciente es después indicado para tener relaciones sexuales 24 a 36 horas después de la administración de la activación de la ovulación. Alternativamente, la fertilización puede ser por inseminación intrauterina (IUI) . En los pacientes que tiene niveles de suero FSH no estimulados y no regulados descendentemente (ciclo natural) , abajo de o aproximadamente 2 IU/litro (la medición en o aproximadamente 2 días después de la menstruación) , la inducción de la ovulación deberá ser preferiblemente llevada a cabo usando un inhibidor PDE en conjunción con FSH o agentes que tienen actividad FSH, o agentes que estimulan la liberación endógena de FSH. La dosis de FSH requerida será menos que la requerida en pacientes quienes no recibieron un inhibidor PDE para lograr la misma o mejor respuesta, en términos de números de folículos que tienen un diámetro medio de a o aproximadamente 16 mm o mayor al día 8 de estimulación. Cuando la FSH o un agente que tiene la actividad estimulante del folículo, o agentes que estimulan la liberación endógena de FSH son usados en 01, la administración de FSH puede ser iniciada antes o después de la administración del inhibidor PDE, o los dos agentes pueden ser administrados iniciando simultáneamente. Preferiblemente, la administración de PDE inicia simultáneamente con la administración del inhibidor de PDE, o en o aproximadamente un día antes de la administración del inhibidor PDE. La fase estimulatoria comienza con la primera administración del inhibidor FSH o PDE, cualquiera que sea primero, o si solamente un inhibidor PDE es usado, al día que tal administración comienza.

Uso de Inhibidores de PDE para Hiperestimulacion controlada de ovario Para controlar la hiperestimulacion de ovario (HOC) , para TRA, un inhibidor PDE puede ser usado sin FSH exógena (o un agente que tiene actividad estimulante del folículo) , de conformidad con la invención, para mejorar los niveles endógenos de HFS, que resultan en hiperestimulacion controlada de ovario, y el desarrollo de folículos ovulatorios múltiples. Si el paciente tiene niveles de FSH del suero no estimulados y no regulados descendentemente (ciclo natural) por debajo de o aproximadamente 5 IU/litro (medido en o aproximadamente al día 2 después de la menstruación) , el HOC debe ser preferiblemente llevado acabo usando un inhibidor PDE en conjunto con FSH o un agente que tiene actividad estimulante del folículo, o agentes que estimulan la liberación endógena de FSH, tal como aquellos mencionados anteriormente. Cuando la FSH o un agente que tiene actividad estimulante del folículo, o agentes que estimulan la liberación endógena de FSH se usan en HOC, la administración de FSH puede ser iniciada antes o después de la administración del inhibidor PDE, o los dos agentes pueden ser administrados simultáneamente. Preferiblemente, la administración de FSH inicia simultáneamente con administración del inhibidor de PDE, o en o aproximadamente un día antes de la administración del inhibidor PDE. La fase estimulatoria inicia con la primera administración de FSH o inhibidor de PDE, cualquiera que sea primero, o si solamente un inhibidor de PDE es usado, al día que comienza la administración. En un régimen preferido para COH, el paciente es primero regulado descendentemente para suprimir la hormona luteinizante endógena (LH) , por administración de un agonista de la hormona de liberación de gonadotropina (GnRH) iniciando en la fase luteal de un ciclo menstrual (usualmente en aproximadamente el día 20 de un ciclo menstrual) . La supresión de la función del ovario usualmente toma de 8 a 21 días con un agonista GnRH, y puede ser monitoreado, monitoreando niveles de LH o estradiol (LH < 5 Iü/L, E2 < 50 gp/ml, indica generalmente supresión adecuada) . Los agonistas GnRH incluyen, por ejemplo, Buserelina, Goserelina, Leuprorelina, Triptorelina y Nafarelina. La regulación descendente es seguida por una fase estimulatoria en la cual, el desarrollo folicular es estimulado usando un inhibidor de PDE, preferiblemente un inhibidor PDE 1 y/o 5, más preferiblemente un inhibidor PDE 1 y/o 5 selectivo, más preferiblemente un inhibidor PDE 1, mayormente preferible un inhibidor PDE1 selectivo. El inhibidor PDE puede ser usado solo o en conjunto con la administración de la hormona estimulante del folículo (FSH) o un agente que tiene actividad FSH o un agente estimulante la liberación endógena de FSH. Al día en el cual la estimulación inicia con un inhibidor PDE o FSH, cualquiera que sea primero iniciado, es definido como el inicio de la fase estimulatoria. El uso de un inhibidor PDE permite el uso de dosis inferiores de FSH (o equivalentes) que podrían ser usadas en el mismo paciente si la FSH sola fuera usada para HOC, mientras se logra la misma o mejor respuesta folicular, en términos de números de folículos que tienen un diámetro medio de a, o aproximadamente 16 mm o mayor al día 8 de estimulación. Preferiblemente, la dosis de FSH usada cuando un inhibidor es administrado, será menos que o igual a aproximadamente 75% de la dosis de FSH que podría ser requerida en el mismo paciente sin el inhibidor PDE, para lograr la misma respuesta folicular, más preferiblemente, la dosis de FSH será menos de o igual a aproximadamente 50% de la dosis de FSH que podría ser requerida en el mismo paciente sin el inhibidor PDE, más preferiblemente, la dosis de FSH será menos que o igual a, o aproximadamente 30% de la dosis de FSH que podría ser requerida en el mismo paciente sin el inhibidor PDE. Cuando se administra un inhibidor de PDE, la dosis de FSH será preferiblemente en, o aproximadamente 25-600 IU FSH diariamente, más preferiblemente en o aproximadamente 50-450 IU diariamente, más preferiblemente 50-300 IU diariamente. La estimulación con inhibidor PDE en la ausencia o presencia de FSH exógeno (o equivalentes) , es preferiblemente continuada hasta que el crecimiento folicular es juzgado ser suficiente, es decir, cuando existen al menos, 3 folículos con un diámetro medio mayor que o aproximadamente 16 mm (preferiblemente uno de 188 mm) , mientras se continua administrando el agonista GnRH. Una dosis que activa la ovulación de un agente que tiene actividad LH (por ejemplo, 5,000-10,000 IU de hCG) , es entonces administrada como se describe para 10. La recuperación del oocito es sincronizada por 36-38 horas después de la activación de la ovulación. Los oocitos son usualmente recuperados de folículos pre-ovulatorios por aspiración. Los oocitos son calibrados, fertilizados in vitro, y los embriones son seleccionados para transferencia al útero aproximadamente 72-96 horas después de la colección. En otro régimen preferido para COH, se usa un antagonista GnRH. Sin la administración de un agonista GnRH, se inicia la estimulación folicular, usualmente al día 1, 2 ó 3 después de la menstruación espontánea o inducida con un inhibidor PDE, preferiblemente un inhibidor PDE 1 y/o 5, más preferiblemente un inhibidor PDE 1 y/o 5 selectivo, más preferiblemente un inhibidor PDE 1, más preferiblemente un inhibidor PDE 1 selectivo, en conjunto con la administración de una hormona estimulante del folículo (FSH) o un agente que tiene actividad FSH o un agente estimulante la liberación endógena FSH. Después, se administra un antagonista GnRH que inicia en aproximadamente el día 6 después de la menstruación. Loa antagonistas GnRH incluyen, por ejemplo, Cetrorelix, Nal-Glu, Antide, Ganirelix, Azaline B y Antarelix. La estimulación con el inhibidor PDE y FSH (o equivalentes) , se continúa hasta que existen al menos, 3 folículos con un diámetro medio mayor de 16 mm (preferiblemente uno de 18 mm) . Una dosis de activación de ovulación de un agente que tiene actividad LH es entonces administrada, como se describe para 10. El antagonista GnRH es administrado hasta el día de la activación de la ovulación. En un régimen preferido alterno para COH, la estimulación folicular se inicia por administración de un inhibidor de aromatasa, preferiblemente en los días 3 hasta 6 después de la menstruación, en conjunto con un inhibidor PDE, preferiblemente un inhibidor PDE 1 y/o 5 , más preferiblemente un inhibidor PDE 1 y/o 5 selectivo, más preferiblemente, un inhibidor PDE 1, mayormente preferible un inhibidor PDE 1 selectivo. En o aproximadamente el día 6, se da un antagonista GnRH, el inhibidor de aromatasa es detenido y las inyecciones de FSH se inician. La administración antagonista de inhibidor PDE, FSH y GnRH se continúa hasta que se administra la dosis de activación de ovulación de hCG.

Uso de los Oocitos para Fertilización in vitro Los métodos de la presente invención son usados para producir oocitos hCG ovulables . El tratamiento de inhibidor PDE4/hormonal de FSH combinado, puede ser un tratamiento corto o largo, con o sin regulación descendente de la pituitaria, o con o sin el uso de antagonistas GnRH; y con o sin el uso de hCG. La terapia inhibidor PDE 4/FSH es administrada hasta que los folículos han madurado suficientemente para ser folículos de tamaño medio a completo (tamaño 10 a 25 mm, preferencial folículos de 16 a 20 mm) . Los oocitos de tales folículos pueden ser dejados ovular in vivo, ya sea a través del afluente hCG a partir del ciclo menstrual del paciente, si la producción de hormona gonadotropina endógena no ha sido suprimida, o suministrado al paciente una inyección exógena de hCG (por ejemplo, 5,000 hasta 10,000 Unidades). Alternativamente, folículos de tamaño medio a completo (tamaño 10 a 25 mm, preferencial folículos de 16 a 20 mm) , son cosechados por aspiración bajo guía de ultrasonido para ser fertilizados in vitro. El fluido aspirado es investigado para determinar complejos de cúmulos de oocitos (COC, por sus siglas en Inglés) y una vez investigados bajo el estereomicroscopia (con o sin el uso de filtros de embriones) , los COC son colocados en cultivo. Una amplia variedad de medios de cultivos de oocitos o componentes de medios conocidos por aquellos de habilidades en la técnica. Tales medios pueden, pero no necesariamente, tienen que contener albúmina de suero humano (HSA) . Después o durante el cultivo in vitro, los oocitos pueden ser fertilizados por FIV convencional o por inyección intracitoplásmica de esperma (ICS1, por sus siglas en Inglés) o por cualquiera de otros métodos convencionales de fertilización que conducen a cigotos fertilizados. El desarrollo del embrión puede ser transferido al día 1 hasta el día 6 después de la fertilización, preferencialmente al día 2 a 3, ya sea como transferencia de huevos única o transferencia de huevos múltiples . El paciente puede recibir progesterona y/o terapia de estrógeno antes y después de la transferencias de huevo en protocolos individualmente diseñados para cebar y sostener linaje endometrial receptivo apropiado. Los métodos de la presente invención producen un número incrementado de oocitos ovulables para uso en los procedimientos de FIV tal como aquellos descritos anteriormente. Sin embargo, puede ser que los métodos de la presente invención también serán útiles en la maduración in vitro de oocitos inmaduros. En tales modalidades, los oocitos son recuperados de folículos antrales de los ovarios antes de ser expuestos al afluente del ciclo medio de gonadotropinas y son por lo tanto, caracterizados como inmaduros o sin oocitos completamente maduros . Los oocitos humanos , asi como también los oocitos de otras especies serán reconocidos por tener tan poco o ninguna expresión de cúmulo, una vesícula germinal y sin cuerpos polares, y serán fácilmente reconocidos como tales por las personas expertas en los tratamientos de FIV. Un uso potencial de las terapias de la presente invención podría ser reemplazar CC o FSH en protocolos sin FIV en donde tal tratamiento puede incrementar la maduración de un folículo dominante o único para fertilización natural preferentemente para cosecharlas por tecnologías reproductivas asistidas . Mientras mucha de la discusión aquí ha descrito la maduración de folículos humanos, se contempla que los métodos de la presente invención pueden ser empleados para producir oocitos por FIV de otros mamíferos, tal como una mascota (por ejemplo, un gato, un perro o un cobayo) ; o un animal de zoológico (por ejemplo, un primate) . En modalidades más preferidas, el mamífero es parte de la industria, preferiblemente, un animal de granja tal como ganado, caballo, cerdo, un visón, cabra o una oveja. En las modalidades más preferidas, el mamífero es un ser humano. Para maduración in vitro, los oocitos inmaduros son tratados in vitro con un inhibidor de PDE o un inhibidor de PDE y una hormona gonadotropina, para producir oocitos maduros que pueden ser fertilizados.

Composiciones Farmacéuticas y kits Las composiciones farmacéuticas para administración de conformidad con la presente invención, pueden comprender al menos, una hormona gonadotropina, preferiblemente FSH de conformidad con la presente invención en forma farmacéuticamente aceptable opcionalmente combinada con un portador farmacéuticamente aceptable. Estas composiciones pueden ser administradas por cualquiera de los medios que logran sus propósitos propuestos . Cantidades individualizadas y regímenes para la administración de composiciones de FSH para la estimulación de la maduración del folículo usando los métodos de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por aquellos de habilidades ordinarias en la técnica usando la guía proporcionada por la Physician's Desk Reference para el uso de tales composiciones en el tratamiento de trastornos anovulatorios y para su uso en tecnologías de reproducción asistida. Como se discute anteriormente, aquellos de habilidades en la técnica podrían inicialmente emplear cantidades y regímenes de FSH actualmente siendo usado en tales contextos médicos. Para este efecto, aquellos expertos en la técnica son específicamente referidos para cada una de las entradas en la Physician' s Desk Reference discutida anteriormente y aquellas entradas están incorporadas en este documento por referencia en su totalidad para mostrar métodos y composiciones para la administración de agentes tales como Fertinex™, Gonal F™, Bravelle™ y similares discutidos aquí anteriormente. Cada una de aquellas entradas en la Physician' s Desk Reference, proporcionan guía ejemplar para tipos de formulaciones, rutas de administración y regímenes de tratamiento que pueden ser usados en la administración de FSH. Cualquiera de los protocolos, formulaciones, rutas de administración y similares descritas en este documento, pueden ser fácilmente modificadas para uso en la presente invención. Composiciones dentro del ámbito de la invención incluyen todas las composiciones que comprenden al menos, un inhibidor PDE4 de conformidad con la presente invención en una cantidad efectiva para lograr el propósito proyectado de estimulación, inducción o de otro modo, incremento del número de oocitos ovulables en un mamífero, ya sea cuando se administra solo o más preferiblemente, cuando se administra en combinación con una dosis baja de FSH. Los inhibidores PDE4 y/o los otros agentes activos usados en los métodos de la presente invención, pueden ser administrados por cualquiera de los medios normalmente empleados para tal administración. Aquellos de habilidades son particularmente referidos a la Solicitud de Patente Estadounidense No. 60/470,343 titulada "Inhibidores de Enzima PDE en Infertilidad". Publicación de Patente Estadounidense No. 20020103106 y PCT/EPOl/14730, cada uno de los cuales describe cantidades y rutas de administración de inhibidores de PDE en aplicaciones relacionadas con la fertilidad. Más preferiblemente, las composiciones usadas en la presente invención, son administradas oralmente. Mientras las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades efectivas de cada componente está dentro de las habilidades de la técnica. Dosificaciones típicas del FSH comprenden aproximadamente 5 IU FSH/día hasta aproximadamente 75 IU FSH/día, por un periodo de 7 a 12 días. Dosis típicas de el inhibidor PDE4 pueden variar desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 100 mg/día o más. Mientras continúa, se contempla que en la administración diaria de la PDE4 , puede ser deseable cesar la administración PDE4 al mismo tiempo como la administración de FSH cesa. Por supuesto, mientras la terapia de FSH es tradicionalmente dada por un periodo de 7 a 12 días, puede ser que en el contexto de la presente invención, solamente una dosis única o algunas dosis bajas de FSH, son necesarias para efectuar el resultado terapéuticamente benéfico de maduración de folículo incrementada. La terapia debe ser detenida en el caso de que se observen síntomas de OHSS. Se entiende que la dosis adecuada de una composición de conformidad con la presente invención dependerá de la edad, salud y peso del receptor, clase de tratamiento concurrente, si existe alguno, frecuencia de tratamiento, y la naturaleza del efecto deseado. Sin embargo, las dosificaciones más preferidas pueden ser ajustadas al sujeto individual, como se entiende y pueden ser determinadas por uno de habilidades en la técnica sin experimentación indebida. Esto involucra típicamente el ajuste de una dosis estándar, por ejemplo, reducción de la dosis si el paciente tiene un bajo peso corporal. Como se discute anteriormente, la dosis total requerida para cada tratamiento puede ser administrada en dosis múltiples o en una dosis única. Las composiciones pueden ser administradas solas o en conjunto con otros terapéuticos dirigidas a la enfermedad o dirigidas a otros síntomas de la misma. Como es aparente a partir de la descripción descrita en este documento, en un aspecto amplio, la presente solicitud contempla aplicación clínica de una terapia de combinación que comprende una primera composición que contiene un inhibidor de PDE, y una segunda composición que contiene FSH. Por lo tanto, las composiciones deben ser formuladas en composiciones farmacéuticas adecuadas, es decir, en una forma apropiada para aplicaciones in vivo en tales terapias de combinación. De manera general, esto ocasionará preparar composiciones que son esencialmente libres de pirógenos, así como también otras impurezas que podrían ser peligrosas a humanos o animales . Las formulaciones FSH pueden ser formuladas relacionadas con las preparaciones FSH actualmente disponibles discutidas aquí completamente. Las formulaciones inhibidoras PDE4 pueden ser formuladas similarmente a por ejemplo, formulaciones de Viagra™, el cual es un inhibidor PDE5 bien conocido. Se deseará de manera general emplear sales y amortiguadores apropiados para proporcionar las composiciones estables, y permitir la absorción de las composiciones en el sitio objetivo. De manera general, las composiciones hormonales de la invención proporcionadas en forma liofilizada para ser reconstituidas previo a la administración de las composiciones del inhibidor PDE4, son probablemente formuladas en forma de tableta. Los amortiguadores y soluciones para la reconstitución de las hormonas pueden ser proporcionados junto con la formulación farmacéutica para producir composiciones acuosas de la presente invención para administración. Tales composiciones acuosas comprenderán una cantidad efectiva de cada uno de los agentes terapéuticos siendo usados, disueltos o dispersados en un portador o medio acuoso farmacéuticamente aceptable . Tales composiciones también son referidas como inóculos . La frase "farmacéuticamente o farmacológicamente aceptable", se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas u otros inconvenientes cuando se administran a un mamífero o un humano. Como se usa aquí, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos y similares . El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea compatible con las composiciones terapéuticas, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas . Los ingredientes activos suplementarios pueden también ser incorporados en las composiciones . Las composiciones activas de la presente invención incluyen preparaciones farmacéuticas clásicas de FSH, las cuales han sido discutidas en este documento, así como también aquellas conocidas por aquellos expertos en la técnica. Los inhibidores PDE4 también se conocen por aquellos expertos en la técnica. La administración de estas composiciones de conformidad con la presente invención, serán vía cualquier ruta común, tan pronto como el tejido objetivo esté disponible vía tal ruta. Más comúnmente, estas composiciones son formuladas para administración oral. Sin embargo, otras rutas convencionales de administración, por ejemplo, por suministro subcutáneo, intravenoso, intradérmico, intramuscular, intramamario, intraperitoneal, intratecal, intraocular, retrobulbar, intrapulmonar (por ejemplo, liberación en término) , aerosol, sublingual, nasal, anal, vaginal o transdérmico, o por implante quirúrgico en un sitio particular, pueden también ser usadas particularmente cuando es problemática la administración oral. El tratamiento puede consistir de una dosis única o una pluralidad de dosis durante un periodo de tiempo. Los compuestos activos pueden ser preparados para administración como soluciones de base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua adecuadamente mezclada con un tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden ser preparadas en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un preservativo para prevenir el crecimiento de microorganismos . Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de solución o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida en la extensión que exista facilidad en la capacidad de la jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento y debe ser preservada contra la acción contaminante de microorganismos , tales como bacterias y hongos . El portador puede ser un medio solvente o dispersión que contiene por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido, y similares) , mezclas adecuadas de los mismos, y aceites vegetales. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, por el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de tensioactivos . La prevención de la acción de microorganismos puede ser llevada aproximadamente por varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectable puede ser llevada aproximadamente por el uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones estériles inyectables son preparadas incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente apropiado con varios de los otros ingredientes enumerados anteriormente, como se requiera, seguido por esterilización filtrada. De manera general, son preparadas dispersiones incorporando los varios ingredientes activos esterizados en un vehículo estéril el cual contiene el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos enumerados anteriormente . En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables, los métodos preferidos de preparación son técnicas de secado por vacío y secado por congelación, las cuales proporcionan un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo previamente filtrada estéril. Como se usa aquí, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos , agentes que retardan la absorción e isotónicos y similares. El uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticas activas, es bien conocido en el arte . Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en la composición terapéutica. Los ingredientes activos suplementarios pueden también ser incorporados en las composiciones . Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas en forma neutral o sal . Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición acida (formadas con los grupos amino libres de la proteína) , y las cuales son formadas con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos clorhídricos o fosfóricos o tales ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden también ser derivadas de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y tales bases orgánicas como isopropilamina, trietilamina, histidina, procaína y similares. Después de la formulación, las soluciones serán administradas en una manera compatible con la formulación de dosificación y en tal cantidad como sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones son fácilmente administradas en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación del fármaco y similares. Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser adecuadamente amortiguada si es necesario y el diluyente liquido primero proporcionado isotónico con salina o glucosa suficiente. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal . "Dosis unitaria" se define como una cantidad discreta de una composición terapéutica dispersada en un portador adecuado. Ejemplos de dosis preferidas de los inhibidores FSH y PDE han sido discutidas anteriormente. La administración parenteral de uno o ambos compuestos terapéuticos se puede llevar a cabo con un bolo inicial, seguida por infusión continua para mantener los niveles de circulación terapéuticos del producto de fármaco. Aquellos de habilidades ordinarias en la técnica, fácilmente optimizarán dosificaciones efectivas y regímenes de administración como se determina por la buena práctica médica y la condición clínica del paciente individual . La frecuencia de dosificación dependerá de los parámetros farmacocinéticos de los agentes y las rutas de administración. La formulación farmacéutica óptima será determinada por uno de habilidades en la técnica, dependiendo de la ruta de administración y la dosificación deseada. Véase por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, I8ava. Ed., Mack, Easton, PA (1990) , incorporado en este documento por referencia. Tales formulaciones pueden influenciar el estado físico, estabilidad, velocidad de liberación in vivo y velocidad de separación in vivo de los agentes administrados. Dependiendo de la ruta de administración, una dosis adecuada puede ser calculada de conformidad con el peso corporal, área de superficie corporal o tamaño de órgano. Refinamientos adicionales de los cálculos necesarios para determinar la dosis de tratamiento apropiada, son rutinariamente elaborados por aquellos de habilidades en la técnica sin experimentación indebida, especialmente en vista de la información de dosificación y ensayos descritos en este documento, asi como también los datos farmacocinéticos observados en ensayos clínicos de humanos o animales . Dosificaciones apropiadas pueden ser valoradas a través del uso de ensayos establecidos para determinar los niveles de sangre en conjunto con los datos de respuesta de dosis relevantes. El régimen de dosificación final será determinado por el especialista que atiende, considerando factores los cuales modifican la acción de los fármacos, por ejemplo, la actividad específica del fármaco, severidad del daño y la sensibilidad del paciente, la edad, condición, peso corporal, sexo y dieta del paciente, la severidad de cualquier infección, tiempo de administración y otros factores clínicos. Conforme se conducen los estudios, la información adicional emergerá con respecto a los niveles de dosificaciones apropiadas y duración del tratamiento para enfermedades y condiciones específicas. Se apreciará que las composiciones farmacéuticas y métodos de tratamiento de la invención, pueden ser útiles en los campos de la medicina humana y medicina veterinaria. De este modo, el sujeto a ser tratado puede ser un mamífero, preferiblemente humano u otro animal . Para propósitos veterinarios, los sujetos incluyen por ejemplo, animales de granjas que incluyen vacas, ovejas, cerdos, caballos y cabras, animales de compañía tales como perros y gatos, animales exóticos y/o de zoológicos, animales de laboratorio que incluyen ratones, ratas, conejos, cobayos y hámsteres; y aves tales como pollos, pavos, patos y gansos. La presente invención también contempla kits para uso en el tratamiento de trastornos de fertilidad. Tales kits incluyen al menos, una primera composición que comprende una FSH en un portador farmacéuticamente aceptable, y una segunda composición que comprende al menos un inhibidor PDE 4 en un portador farmacéuticamente aceptable. Los kits pueden adicionalmente comprender soluciones o amortiguadores para efectuar el suministro de la primera o segunda composición. Los kits pueden además comprender composiciones adicionales las cuales contienen inhibidores PDE, por ejemplo, inhibidores PDE 4 adicionales o inhibidores PDE1 o PDE 5 adicionales y/o hormonas adicionales tales como, por ejemplo, hCG, LH y similares. Los kits pueden además comprender catéteres, jeringas u otros dispositivos de suministro para una o más de las composiciones usadas en los métodos de la invención. Los kits pueden además comprender instrucciones que contienen protocolos de administración para los regímenes terapéuticos .

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar las modalidades preferidas de la invención. Se debe apreciar por aquellos expertos en el arte, que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor para función bien en la práctica de la invención, y así pueden ser consideradas por constituir modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica deben, en vista de la presente descripción, apreciar que muchos cambios se pueden hacer en las modalidades específicas las cuales se describen y todavía obtener un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu y ámbito de la invención.

Materiales y Métodos Animales: Se usaron ratas hembra CD(CD)BR Inmaduras Sprague Dawley, que pesan 36-39 g en la recepción. Los animales se alojaron en cuartos bajo las siguientes condiciones ambientales constantes: temperatura 22 °C + 2, humedad relativa 55% ± 10, 15-20 cambios de aire por hora (filtrado en HEPA al 99.99%) y luz artificial con un ciclo cardiaco de 12 horas (7:00 h - 19:00 h) . Para la duración completa del estudio, las ratas se mantuvieron en jaulas de alambre (40.5 x38.5 cm x 18h) con comederos de acero inoxidable y se alimentaron con una dieta de pelotillas estándar (4RF21 producido por Charles River Italia' s licensee Mucedola s.r.l) y agua "ad libitum" .

Químicos: La hormona estimulante del folículo recombinante humano (r-hFSH) y la gonadotropina coriónica recombinante humana (r-hCG) se proporcionaron por Laboratories Serono Aubonne (LSA, Aubonne, Suiza) . Los compuestos fueron sintetizados ya sea basados en métodos sintéticos de compuestos publicados o adquiridos de fuentes comerciales. En particular, aquellos expertos se refieren al documento O9501338 el cual muestra métodos para elaborar Roflumilast, J. ed. Chem. 1994, 37, 1696-1703, para una descripción detallada de métodos de elaboración Piclamilast, J. Med. Chem. 1998, 41, 821-835, para una descripción de métodos para elaborar Ariflo/Cilomilast , el documento 97/15561 para métodos para elaborar Mesopram y el documento EP0470 805 Bl para métodos de elaborar Filaminast. Tales métodos pueden ser modificados para producir otros inhibidores PDE. Otros compuestos de prueba (Dipyridamol , Zaprinast, Sildenafil) fueron sintetizados basados en métodos de síntesis del compuesto publicados o adquiridos de fuentes comerciales. Además, la Solicitud de Patente Estadounidense No. 60/470,434 titulada "inhibitors of PDE Enzimes in Infertility, " Publicación de Patente Estadounidense No. 20020103106, y documento PCT/EPOl/14730 se incorporan en este documento por referencia como se muestran otros de tales compuestos relacionados que pueden ser usados en este documento.

Ensayo de Maduración del Folículo de Rata in Vivo: Las ratas hembras inmaduras llegaron en viernes de la semana antes a la experimentación a 18-19 días de edad junto con una hembra lactante (diez cachorros por hembra lactante) . Todas las ratas se destetaron de la madre al siguiente Lunes (21-22 días de edad) y se clasificaron aleatoriamente en los grupos experimentales (6-8 animales/grupo) . Las ratas fueron inyectadas subcutáneamente (en la nuca del cuello) dos veces al día por dos días (primera inyección: 8.30 - 9.00 y segunda inyección 15.30 - 16.00) con r-hFSH o vehículo (PBS) a un volumen de 250 µ?/???ßs????. Las dosis de FSH inyectadas fueron ya sea subóptimas (606 ng/rata total de dosis dividida entre cuatro inyecciones; indicadas como "FSH baja" en las Figuras) o alta (2424.8 ng/rata de la dosis dividida total sobre 4 inyecciones; indicada como "FSH Alta" en las Figuras) como un control positivo. Además de las inyecciones anteriores, las ratas también fueron también inyectadas subcutáneamente con los compuestos o vehículos de prueba dos veces al día por 2 días en la dosis indicada (mg/kg por inyección) , concomitantemente con las inyecciones de FSH. Estos compuestos fueron diluidos en ya sea NP3S (n-metil-2-pirrolidona al 5%, polietilen glicol 400 al 30%, polietilen glicol 200 al 25%, propilen glicol al 20%, salina al 20%) o vehículos acuosos. Por lo tanto, el número total de inyecciones recibidas por cada rata para promover el crecimiento folicular fueron ocho, incluyendo cuatro inyecciones de vehículo r-hFSH o r-hFSH más cuatro inyecciones del compuesto de prueba o vehículo del compuesto de prueba. Al día 2 del experimento y solo con la inyección de r-hFSH final, las ratas también se trataron con una inyección subcutánea única de r-hCG (1430 ng/rata) para inducir ovulación de todos o la mayoría de los folículos madurados. A las 10:00 horas de la mañana después de la administración de r-hCG, las ratas fueron eutanizadas por asfixia con C02. Los animales fueron puestos en partes posteriores y superficies inferiores y se rociaron con etanol tanto para esterilizar como para mantener el pelo de caerse en la disección de los animales. Con la ayuda de tijeras y fórceps, la piel y el músculo fueron cortados partiendo del sínfisis púbico con la dirección aboral-oral hasta el esternón. Los órganos internos se expusieron y el intestino se removió a un costado . Los ovarios , las hormonas uterinas y el cuerpo uterino se removieron sujetándolos separados de la grasa y del tejido conectivo. El tracto reproductivo completo entonces se colocó en cavidad en una placa de 24 cavidades que contiene PBS (1 animal/cavidad) . Después todos los animales se sacrificaron y los ovarios fueron colectados, los oviductos se removieron uniformemente de los ovarios, se sumergieron en PBS y se colocaron en un portaobjetos de microscopio. El ovario entonces se recuperó, se limpió y se colocó en PBS para pesar (el útero se desecho) . Los pares de oviductos fueron colocados en un portaobjetos y después se colocaron en la parte superior del primer portaobjetos usando una pieza para asegurar el extremo congelado de los portaobjetos juntos. Después los oviductos fueron colocados en el portaobjetos inferior, el portaobjetos superior se plegó sobre el extremo no congelado y después se encintó, se comprimieron los oviductos entre los dos portaobj etos . Los oviductos fueron entonces examinaron por un microscopio de luz bajo condiciones de fase de contraste (a un mínimo de amplificación 40x) y los ovarios si están algunos presentes en las dos ampollas para cada rata, fueron cuantificados . Los resultados se graficaron como el número promedio de oocitos ovulados por rata. Las barras de error reflejan el error estándar de la media para cada grupo.

Ejemplo 1: inducción de ovulación usando varios inhibidores PDE en combinación con FSH de dosis baja Los experimentos se condujeron de conformidad con el Ensayo de Maduración del Folículo de Rata in vivo, descrito anteriormente. En un experimento, los ovarios se colectaron de ratas a la mitad del segundo día de tratamiento para análisis histológico, antes de la última serie de inyecciones . Estas ratas recibieron únicamente las primeras tres dosis de FSH y los compuestos de prueba antes de la eutanasia y colecta del órgano. Los folículos secundarios fueron evaluados contando el número total de los folículos secundarios: incluyendo ambos folículos pequeños (aquellos en cualquier etapa intermedia de maduración, que tienen capas múltiples granulosas con las primeras vacuolas dispersadas, pero sin un antro) y folículos antrales (aquellos que tienen dilatación antral, con un diámetro externo de aproximadamente 500 micrones, o superior, con o sin adelgazamiento de la capa celular granulosa) . Los folículos antrales (= 500 ncm) también se cuantificaron separadamente.

Análisis de Datos: La proporción de animales ovillantes, el número promedio de óvulos presentes en la ampolla por rata, y el peso de ovario promedio, fueron calculados de los valores únicos en cada grupo experimental y se trazaron las gráficas relevantes . Todas las figuras demostraron errores estándares más/menos media de la media. En las Figuras, el número arriba de las barras de error estándar indica el número de ratas en el grupo que tienen uno o más óvulos ovulados comparados con el número total de ratas en el grupo, por ejemplo, X/Y significa que las ratas X de un total de Y tienen uno o más óvulos ovulados .

Compuestos Probados Los siguientes compuestos se probaron en los protocolos anteriores : (i) Zaprinast (inhibidor de PDE's 1, 5, 6, 7, 9, 10, 11) ; (ii) Sildenafil (inhibidor de PDE's 1, 5 y 6) ; (iii) Dipiridamol (inhibidor de PDE' , 5, 6, 7, 8, 10, 11) ; (iv) Tadalafil (un inhibidor de PDE's 5 y 6) (v) Compuesto no. 31 (6aR, 9aS) -2-bifenililmetil) - 5 , 6a, 7 , 8 , 9 , 9a-hexahidro-5-metil- 3 (fenilmetil) ciclopent [4 , 5] imidazo- [2 , 1-b] purin- 4(3H)-ona) (un inhibidor de PDEl) . (vi) Compuesto no. 33 (5 ' -metil-2 ' (bifenililmetil) -3 ' - (feniltnetil) espiro [ciclopentan-1, 7' (8?) - [3H [iraidazo [2, 1-b] purin] -4 (5?) -ona) (un inhibidor de PDEl) . Estas moléculas han sido mostradas por exhibir la siguiente selectividad para varias enzimas PDE: ref 1: Terrett, et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 6 (15) : 1819-1824 (1996). ref 2: Physicians Desk Reference, 57th Ed. , 2003. ref 3: Corbin, et al., International Journal of Clinical Practice, 56(6): 453-459 (2002). ref 4: Ahn, et al., J". Med. Chem. , 40:2196-2210 (1997).

El *PDE3 se expresó en oocitos, los inhibidores PDE feridos son selectivos contra PDE3 , porque la inhibición de PDE3 puede conducir a crecimiento de oocito no óptimo. Wiersma, et al., J. Clin. Invest . , 102(3): 532-537 (1998). La **PDE6 se expresó en las barras y conos de la retina; el inhibidor PDE6 puede causar disturbio visual moderado; inhibidores PDE preferidos son selectivos contra PDE6 (es decir, preferiblemente tienen al menos a, o aproximadamente 100 veces mayor capacidad para inhibir PDEl o PDE5 comparada con PDE6 ) ,- Resultados: Se administró dipiridamol (un inhibidor de PDE's 5, 6, 7, 8, 10, 11) a dosis de 1, 5 y 25 mg/kg x 4 inyecciones por rata (subcutáneamente) en NP3S con la Dosis Baja de FSH, que resulta en un incremento en el número de oocitos ovulados por rata comparado con la Dosis Baja de FSH más el control de vehículo NP3S. Con la dosis baja de FSH sola, se colectó un promedio de un oocito por rata, y únicamente 4 de diez ratas ovularon. En contraste, cuando la dosis baja de FSH fue en conjunto con Dipiridamol (1, 5 ó 25 mg/kg), el número promedio de oocitos por rata fue 7.5, 6.8 y 6.2, respectivamente, 7 de 10, 6 de 10 ó 10 de 10 ratas ovuladas, respectivamente. Estos resultados se muestran en la Figura 1. Se administró Zaprinast (un inhibidor de PDE's 1, 5, 6, 7, 9, 10, 11) a dosis de 1, 5 y 25 mg/kg x 4 inyecciones por rata (subcutáneamente) en NP3S con la FSH con Dosis Baja, que resulta en un incremento relacionado a la dosis en el número de oocitos ovulados por rata comparado con FSH a Dosis Baja más control de vehículo NP3S. Con la dosis baja de FSH sola, se colectó un promedio de 2.4 oocitos por rata, y únicamente 5 de diez ratas ovularon (Experimento 1) . Por el contrario, cuando la dosis baja de FSH fue en conjunto con Zaprinast (1, 5 ó 25 mg/kg) el número promedio de oocitos por rata fue 3.25, 6.4, 9.5 respectivamente, y 6 de 10, 9 de 10 ó 10 de 10 ratas ovularon (Experimento 1) , respectivamente. Estos resultados se muestran en la Figura 2. Se administró Sildenafil (un inhibidor de PDE's 1, 5 y 6) a dosis de 1,5 y 25 mg/kg x 4 inyecciones por rata (subcutáneamente) en NP3S con la FSH de Dosis Baja, que resulta en un incremento relacionado a la dosis en el número de oocitos ovulados por rata comparada a la FSH de Dosis Baja más el control de vehículo NP3S. Con la dosis baja de FSH sola, se colectó un promedio de 1 oocito por rata, y únicamente 3 de diez ratas ovularon (Experimento 1) . Por el contrario, cuando la dosis baja de FSH fue en conjunto con Sildenafil (1, 5 ó 25 mg/kg) el número promedio de oocitos por rata fue 3.5, 5.5, 6.9 respectivamente, y 6 de 8, 5 de 8 ó 7 de 8 ratas ovularon (Experimento 1), respectivamente. Estos resultados se muestran en la Figura 3. El número total de los folículos secundarios por rata (2 ovarios) en ratas tratadas con vehículo FSH baja, FSH Alta o FSH Baja + 75 mg/kg de Sildenafil se muestra en la Figura 4. El número total de folículos secundarios es mayor en el grupo Sildenafil + FSH que en cualquiera de otros grupos [Vehículo = 69; FSH Baja = 64; FSH Baja más Sildenafil = 84; FSH Alta = 64] . El número total de folículos antrales (2 ovarios) en ratas tratadas con vehículo, FSH Baja, FSH Alta o FSH Baja + 75 mg/kg Sildenafil, se muestra en la Figura 5. El número total de folículos antrales en ratas tratadas con Sildenafil * FSH es mayor que el número de folículos antrales es ratas tratadas con FSH Baja [Vehículo = 3.2; FSH Baja = 4.1; FSH Baja más Sildenafil = 7.4; FSH alta = 9.5] . El Sildenafil se administró a dosis de 1, 5 y 25 mg/kg x 4 inyecciones por rata (subcutáneamente) en vehículo acuoso con la FSH de Dosis Baja, que resulta en un incremento relacionado a la dosis en el número de oocitos ovulados por rata comparada con la FSH de Dosis Baja sola más control de vehículo acuoso. Con la dosis baja de FSH sola, se colectaron un promedio de 1 oocito por rata, y únicamente 2 de 8 ratas ovularon. Por el contrario, cuando la dosis baja de FSH fue en conjunto con Sildenafil (5 mg/kg) el número promedio de oocitos por rata fue 20, y 7 de 8 ratas ovularon. Estos resultados se muestran en la Figura 6. [Nota: la Figura 6 difiere de la fig. 3 en que el vehículo es acuoso preferentemente NP3S-SM orgánico] .

Se administró Tadalafil (un inhibidor de PDE's 5 y 6) a una dosis de 25 mg/kg x 4 inyecciones por rata (subcutáneamente) en agua con FSH de Dosis Baja, que resulta en un incremento relacionado a la dosis en el número de oocitos ovulados por rata comparado con FSH de Dosis Baja más control de vehículo NP3S. Cuando no se usó FSH, se colectó menos de un oocito por rata. Estos resultados se muestran en la Figura 7. Cuando no se administró FSH se colectó un promedio de un oocito por rata. Con la dosis subóptima de FSH ("FSH baja": 151.5 ng X 4 por rata) se colectaron un promedio de 5 oocitos por rata. Cuando la dosis subóptima se combinó con Tadalafil (25 mg/kg x 4 por rata; "FSH baja más Tadalafil") se colectaron un promedio de 16 oocitos por rata. Con una dosis alta de FSH ( "FSH alta": 606.2 ng x 3 por rata) se colectaron un promedio de 21 oocitos por rata. El compuesto No. 31 de Ahn, et al., J\ Med. , Chem. , 40:2196-2210 (1997) ( (6aR, aS) -2- (bifenililmetil) - 5 , 6a, 7,8, 9a-hexahidro-5-metil~ 3 (fenilmetil) ciclopent [ , 5] imidazo- [2 , 1-b] purin-4 (3H) -ona) (un inhibidor de PDE 1) se muestra abajo: El compuesto No. 31 se administró a una dosis de 25 ro /kg x 4 inyecciones por rata (subcutáneamente) en NP3S con la FSH de Dosis Baja, que resulta en un incremento relacionado a la dosis en el número de oocitos ovulados por rata comparado con la FSH de Dosis Baja más el control de vehículo NP3S. Estos resultados se muestran en la Figura 8. Cuando no se administró FSH, se colectó un promedio de un oocito por rata. Cuando una dosis subóptima de FSH se administró ("FSH baja": 151.5 ng x 4 por rata) se colectaron un promedio de 5 oocitos por rata. Cuando la dosis subóptima de FSH se combinó con el compuesto no. 31 (25 mg/kg x 4 por rata) , se colectaron un promedio de 18 oocitos por rata. Con la dosis alta de FSH ("FSH alta": 606.2 ng x 3 por rata), se colectaron un promedio de 21 oocitos por rata. El compuesto no. 33 (5 ' -metil-2 ' (bifenililmetil) -3 ' - (fenilmetil) espiro [ciclopentan-1, 7 ' - (8 ?) - [3H] imidazo [2,1-b] purin] -4 (5 ?) -ona) (un inhibidor de PDE 1) de Ahn, et al., J. Med. Chem. , 40:2196-2210 (1997) se muestra abajo: El compuesto no. 33 se administró a una dosis de 25 mg/kg x 4 inyecciones por rata (subcutáneamente) en NP3S con FSH de Dosis Baja, que resulta en un incremento relacionado a la dosis en el número de oocitos ovulados por rata como se compara con la FSH de Dosis Baja más el control de vehículo NP3S. Estos resultados se muestran en la Figura 9. Cuando no se administró FSH se colectó un promedio de 1 oocito por rata. Cuando se administró una dosis subóptima de FSH ("FSH baja": 151.5 ng x 4 por rata) se colectaron un promedio de 5 oocitos por rata. Cuando la dosis subóptima de FSH se combinó con el compuesto no. 33 (25 mg/kg x 4 por rata) se colectaron un promedio de 27 oocitos por rata. Con la dosis alta de FSH (FSH alta": 606.2 ng x 3 por rata) se colectaron un promedio de 20 oocitos por rata. Se administró Mesopram a 0.80, 0.4 y 2 mg/kg/día junto con una dosis baja de FSH. Se observó un mejoramiento significante de maduración folicular sobre el grupo que recibe solo FSH baja. A dosis alta, aparenta ser una disminución en maduración folicular. Después se administró Mesopram a dosis bajas: 0.032, 0.016, 0.08 mg/kg junto con una dosis baja de FSH, la cual demostró un incremento de la dosis en maduración folicular, alcanzando importancia a 0.08 mj/kg. Estos resultados se muestran en la figura 15. Se probaron otros inhibidores de PDE en el modelo anterior, y los resultados se listan en la Tabla 1.

Tabla 1. Actividad de crecimiento folicular de varios inhibidores PDE.

Ejemplo 2: Inducción de cAMP usando varios inhibidores de PDE en combinación con FSH de dosis baja Además de la evaluación de células granulosas de rata, producidas como se describe anteriormente, para medir cAMP en líneas celulares, se usaron células granulosas de porcino JC-410. Estas células se obtuvieron de Dr. Jorge Chedrese (University of Saskatche an) . Las células se mantuvieron en DME /F12 suplementado con suero de bovino recién nacido al 5% (Gibco) y 5 vg/ml de insulina (Gibco) . Las líneas celulares estables se establecieron transíectando ADNc para los receptores LH y FSH humana en las células usando técnicas de transfección estándares y selección con 300 pg/ml de Geneticina (Gibco) . Después de la selección, las células se mantuvieron a la misma concentración de Geneticina. Para la administración de cAMP, las células se colocaron a una densidad de 25,000 células por cavidad, en placas de 96 cavidades, una diaria antes al ensayo. Al siguiente día, las células fueron estimuladas por 1 hora con dosis incrementada del inhibidor de moléculas en la presencia, o ausencia de 1 nM de FSH, como se indica. Todos los compuestos se diluyeron en amortiguador de ensayo (DMEM/F12, BSA al 0.1% - Sigma) que contiene DMSO al 4% (la concentración final 0.5% en el ensayo) . Después de 1 hora de estimulación, las células se sometieron a lisis y se sometió a ensayo la cAMP usando el ensayo Tamiz Tropix cAMP (Applied Biosystems) , de conformidad con el protocolo del fabricante. Se monitorearon las mediciones de cAMP en cultivos dispersos de ovario primario como sigue . Los ovarios se tomaron de ratas Sprague-Dawley (22 días de edad) y se descapsularon bajo un microscopio de bisección en 3-5 mi de medio de digestión. El medio de digestión consiste de medio de ensayo (medio de McCoy 5A suplementado con 1 mg/ml de BSA (Sigma), 5 g/ml de gentamicina y 3 g/ml de amfotericina B (Gibco) ) , que contiene 8 mg/ml de colagenasa (Sigma) y 0.05% de DNase (Invitrogen) . Después de la desencapsulación, los ovarios fueron disectados en piezas pequeñas usando agujas de calibre 27, se transfirieron a un tubo de 15 mi y se digirieron por 45 minutos a 37 °C, mientras se sacuden. El tejido digerido se filtró a través de un filtro Nalgene de 70 µp? y lo filtrado se centrifugó a 1000 rpm por 5 minutos. Las pelotillas se lavaron con medio de ensayo y se centrifugaron una segunda vez . Las pelotillas resultantes se suspendieron en 2 mi de medio de crecimiento (medio de McCoy 5A suplementado con FBS al 5%, 5 yg/ml de gentamicina, 3 yg/ml de amfotericina B (Gibco) y las células cuantificaron. Las células se diluyeron en medio de crecimiento, se colocaron a 25-30,000 células/cavidad y se cultivaron por 48 horas antes de la estimulación. Las células se estimularon y la cAMP se analizó como se describe anteriormente para las mediciones de línea celular.

Resultados : Se probó un panel de inhibidores PDE4 para determinar su capacidad para inducir cAMP en FSH tratadas, o no tratadas, células granulosas de rata y/o líneas de células granulosas porcinas que expresan el receptor FSH humana JC410 (JC419FSHR) in vitro. De los inhibidores PDE4, algunos fueron altamente activos en la inducción de cAMP, algunos fueron de actividad intermediaria y algunos tuvieron o no tuvieron actividad en este modelo. Notablemente, en la ausencia de FSH, los inhibidores PDE tienen poca o ninguna capacidad para inducir cAMP (véase figura 10A-10C) . La potencia de los inhibidores con los mismos con respecto a la fuente de las células granulosas, es decir, fue relativamente similar en tanto la línea de células como las células granulosas primarias . In vivo, dos inhibidores PDE 4 ejemplares, Piclamilast y Roflumilast, incrementan la maduración del folículo inducida por FSH. Bajas concentraciones de Piclamilast (0.8 y 0.4 mg/kg) no fueron suficientes para inducir maduración del folículo en la ausencia de un nivel bajo de FSH exógeno (Fig. 13) . Sin embargo, a la concentración superior de 2 mg/kg, el Piclamilast no induce maduración folicular (véase Figura 13) . Cuando el Piclamilast es administrado en la presencia de dosis bajas de FSH, hubo una inducción muy marcada en la maduración del folículo, como se evidencia por el número incrementado de oocitos ovulables (Fig. 14) . Los resultados anteriores muestran que los inhibidores PDE4 pueden, cuando se administran a mamíferos, junto con dosis subóptimas de FSH, conducir a un incremento en el número de oocitos ovulables de hCG. Métodos y composiciones para explotar este hallazgo han sido descritos aquí anteriormente. Todas las composiciones y/o métodos descritos y reivindicados en este documento, pueden ser elaborados y ejecutados sin experimentación indebida en vista de la descripción actual. Mientras las composiciones y métodos de esta invención han sido descrito en términos de las modalidades preferidas, será aparente por aquellos de habilidades en la técnica que pueden ser aplicadas variaciones a las composiciones y/o métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito aquí, sin apartarse del concepto, espíritu y ámbito de la invención. Más específicamente, será aparente que ciertos agentes los cuales son tanto químicamente como fisiológicamente relacionados, pueden ser sustituidos por los agentes descritos en este documento, mientras los mismos o similares resultados podrían ser logrados. Todos los sustitutos similares y modificaciones aparentes para aquellos expertos en la técnica, están sugeridas para estar dentro del espíritu, ámbito y concepto de la invención como se define por las reivindicaciones adjuntas. Las referencias, patentes y publicaciones de patentes citadas en este documento completamente, en la extensión de que proporcionan procedimientos ejemplares u otros detalles complementarios a aquellos expuestos en este documento, todas están específicamente incorporadas en este documento por referencia.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Uso de un inhibidor de una enzima de PDE para la preparación de un medicamento para estimular el crecimiento folicular de ovario en una hembra.

2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el paciente se somete a inducción de ovulación.

3. Uso de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 , en donde el paciente se somete a hiperestimulación controlada de ovario .

4. Uso de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3 , en donde el medicamento es para administración simultánea, separada o secuencial con FSH, o un agente que tiene actividad de FSH o un agente que estimula la liberación endógena de FSH.

5. Uso de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3 , en donde el medicamento es para administración simultánea, separada o secuencial con FSH.

6. Uso de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, en donde el medicamento es para administración simultánea, separada o secuencial con un agente que tiene actividad FSH, o un agente que estimula la liberación endógena de FSH.

7. Uso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el medicamento es administrado partiendo en o aproximadamente al día 2 a 3 después de la menopausia.

8. Uso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el medicamento es administrado diariamente hasta que el crecimiento folicular es suficiente, cuando una dosis de activación de ovulación de hCG es administrada .

9. Uso de conformidad con la reivindicación 8 , en donde la dosis que activa la ovulación de hCG es 5,000-10,000 IU.

10. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el medicamento es administrado con FSH, y en donde la dosis de FSH es menos que la dosis requerida en el mismo paciente en la ausencia de un inhibidor de PDE, para lograr el mismo resultado en términos de crecimiento folicular.

11. Uso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el inhibidor de PDE es un inhibidor de al menos un tipo de PDE seleccionado de 1, 5 y 6.

12. Uso de conformidad con cualquier reivindicación precedente, en donde el inhibidor de PDE se selecciona de: 5- [2-etoxi-5- (4-metil-l-piperazinilsulfonil) fenil] -l-metil-3-?-propil-1, 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona (sildenafil) ; Zaprinast; dipiridamol ; 5- (2-etoxi-5- morfolinacetilfenil) -l-metil-3-n-propil-l, 6-dihidro-7H-20 pirazolo [4 , 3 -d] irimidin-7-ona; 3-etil-5- [5- (4-etilpiperazin 1-ilsulfonil) -2-n-propoxifenil] -2- (pir-idin-2-il)metil-2, S-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimid'in-7-ona; 3-etil-5- [5- (4 etilpiperazin-l-ilsulfonil) -2- (2-metoxietoxi)piridi-n-3-il] - 2- (piridin-2-il)metil-2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4,3-d] pirimidin-7-ona; (+) -3-etil-5- [5- (4-etilpiperazin-l ilsulfonil) -2- (2-metoxi-l (R) -metiletoxi) piridin-3 -il] -2-metil-2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3 -d] pirimidin-7-ona; 5- [2 etoxi-5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) piridin-3-il] -3-etil-2- [2-metoxietil] -2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [ , 3-d] pirimidin-7-ona; 5- [2-iso-butoxi-5- (4-etilpiperazin-l-ilsulfonil) piridin-3 -il] -3-etil-2- (l-metilpiperidin-4-il) -2, 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; 5- [2-etoxi-5- (4 etilpiperazin-1-ilsulfonil) iridin-3-il] -3 -etil-2-fenil-2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] irimidin-7-ona; 5- (5-acetil-2 propoxi-3-piridinil) -3-etil-2- (l-isopropil-3-azetidinil) -2, 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] piriraidin-7-ona; 5- (5-acetil-2 butoxi-3-piridinil) -3-etil-2- ( l-etil-3 -azetidinil) -2 , 6-dihidro-7H-pirazolo [4 , 3-d] pirimidin-7-ona; (6R, 12aR) -2,3,6 7, 12, 12a-hexahidro-2-metil-6- (-3,4-metilenedioxifenil) pirazino [2 ' , 1': 6, 1] pirido [3 , 4-b] indol 1,4-diona (Tadalafil; IC-351) ; 2- [2-etoxi-5- (4-etil piperazin-l-il-l-sulfonil) -fenil] -5-metil-7-propil-3H-imidazo [5 , 1-f] [1, 2 , 4] triazin-4-ona (vardenafil) ; 4-bromo-5 (piridinilmetilamino) -6- [3 (4-clorofenil) -propoxi] -3- (2H) piridazinona; sal tnonosódica del ácido l-[4-[(l,3-benzodioxol-5-ilmetil) amino] -6-cloro-2-quinozilinil] -4-piperidin-carboxílico; (+) -cis-5, 6a, 7,9,9, 9a-hexahidro-2- [4- (trifluorometil) -fenilmetil-5-metil-ciclopent- [4 , 5] imidazo [2 , l-purin-4 (3H) ona; furaziocilina; cis-2-hexil-5-metil-3 , 4, 5, 6a, 7, 8, 9, 9a-octahidrociclopent [4,5] -imidazo [2- , 1-b] purin- -ona; 3-acetil-l- (2-clorobencil) -2-propilindol-6-carboxilato; 3-acetil-l- (2-clorobencil) -2-propilindol-6-carboxilato; 4-bromo-5- (3-piridilmetilamino) -6- (3- (4-clorofenil) propoxi) -3- (2H) iridazinona; l-metil-5 (5-morfolinoacetil-2-n-propoxifenil) -3-n-propil-l, 6-dihidro-7H-pirazolo (4 , 3-d) pirimidin-7-ona; sal monosódica del ácido 1- [4- [ (1, 3-benzodioxol-5-il-metil) amino] -6-cloro-2-quinazolinil] -4-piperidincarboxílico; Pharmaproj ects No. 4516; Pharmaprojects No. 5051; Pharmaprojects No. 5064; Pharmaproj ects No. 5069; GF-196960; E-8010 y E-4010; Bay-38-3045 & Bay-38-9456; Vinpocetine; SCH-51866; SCH-59498; (6a , 9aS) -2- (Bifenililmetil) -5, 6a, 7, 8, 9, 9a-hexahidro~5-metil-3 (fenilmetil) ciclopent [4 , 5] imidazo- [2 , 1-b] urin-4 (3H) -ona; 5 ' - etil-2 ' (bifenililmetil) -3 ' - (fenilmetil) espiro [ciclopentan-1, 7' (8?) - [3H] imidazo [2, 1-b]purin] -4 (5?) -ona; (6aR,9aS)- 5, 6a, 7, 8, 9, 9a-Hexahidro-5-metil-2- (feniletinil) -3- (fenilmetil) ciclopent [4 , 5] imidazo [2, 1-b] -purin-4 (3H) -ona; dipiridamol; AWD-12-171 y AWD-12-217; BMS-341400; UK-343,664; 5E-3623, 5E-3569, 5E-3657, E4021; KS-505a; YC-1; número de referencia IDDB 323951; WIN-61691; FR226807; referencias IDDB 461317, 462503, 461321, 461324, 466146; 3- (1, 3 -benzodioxol-5-il) -9-oxo-l, 3, , 9-tetrahidro-2H-pirrolo [3 , 4-b] guinolin-2-carboxilato de piridin-4 -ilmetilo;

13. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el inhibidor PDE se selecciona de Sildenafil y Zaprinast, Dipiridamol; (6aR, 9aS) -2- (bifenililmetil) -5, 6a, 7,8,9, 9a-hexahidro-5-metil-3 (fenilmetil) ciclopent [4 , 5] imidazo- [2, 1-b] purin-4 (3H) -ona y 5'-Metil-2' (bidenililmetil) -3' - (fenilmetil) espiro [ciclopentano-1 , 7' (8?) - [3H] imidazo [2, 1-b.purin] -4 (S'H) -ona.

14. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el inhibidor de PDE es Zaprinast .

15. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el inhibidor de PDE es Sildenafil .

16. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el inhibidor de PDE es Tadalafil .

17. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el inhibidor de PDE es un inhibidor selectivo de PDEl y PDE5.

18. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el inhibidor de PDE es un inhibidor selectivo de PDEl.

19. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el inhibidor de PDE es un inhibidor selectivo de PDE5.

20. Método para incrementar la maduración del folículo, caracterizado porque comprende tratar una hembra con una composición que comprende un inhibidor de fosfodiesterasa (PDE) en una cantidad efectiva para estimular la maduración folicular.

21. Método para incrementar la maduración de oocitos, caracterizado porque comprende tratar un oocito in vitro con una composición que comprende un inhibidor de PDE en una cantidad efectiva para causar maduración de oocitos .

22. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la composición comprende al menos un inhibidor de PDE4.

23. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porgue la composición comprende al menos, un inhibidor de PDE4 seleccionado del grupo que consiste de Piclamilast, Roflumilast, Ariflo, Filaminast, Mesopram, D4418, Arofilina y CL1044.

24. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la composición comprende al menos un inhibidor PDE4 y otro inhibidor de PDE seleccionado del grupo que consiste de un inhibidor de PDE1, un inhibidor de PDE7, un inhibidor de PDE9, un inhibidor de PDE 10, y un inhibidor de PDE 11.

25. Método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque el método además comprende tratamiento con al menos una gonadotropina seleccionada del grupo que consiste de FSH, hormona luteinizante y gonadotropina coriónica.

26. Método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método además comprende tratamiento con al menos una gonadotropina seleccionada del grupo que consiste de FSH, hormona luteinizante y gonadotropina coriónica .

27. Método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el método además comprende tratamiento con al menos una gonadotropina selecciona del grupo que consiste de FSH, hormona luteinizante y gonadotropina coriónica.

28. Método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porgue el método además comprende tratamiento con al menos una gonadotropina selecciona del grupo que consiste de FSH, hormona luteinizante y gonadotropina coriónica .

29. Método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque el método además comprende tratamiento con FSH.

30. Método de conformidad con la reivindicación 20 ó 21, caracterizado porque el método además comprende administrar FSH y al menos una hormona gonadotropina no FSH.

31. Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la hormona gonadotropina no FSH es hormona luteinizante .

32. Método de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado porque la hormona gonadotropina no FSH es hormona gonadotropina coriónica.

33. Método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el método comprende administrar un estimulador, agonista o adyuvante de FSH solo o en combinación con un inhibidor de PDE4.

34. Método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el estimulador de FSH se selecciona del grupo que consiste de Letrazol, Anastrozol y Vorozol.

35. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el inhibidor de PDE y la hormona gonadotropina son administrados concurrentemente.

36. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el inhibidor de PDE4 y FSH está contenido en un vial único como una mezcla.

37. Vial caracterizado porque contiene una dosis única de una mezcla de inhibidor de PDE4 y FSH.

38. Método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el inhibidor de PDE5 se administra previo al tratamiento con la hormona gonadotropina.