KR20240033183A - 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법 - Google Patents

면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법 Download PDF

Info

Publication number
KR20240033183A
KR20240033183A KR1020247007180A KR20247007180A KR20240033183A KR 20240033183 A KR20240033183 A KR 20240033183A KR 1020247007180 A KR1020247007180 A KR 1020247007180A KR 20247007180 A KR20247007180 A KR 20247007180A KR 20240033183 A KR20240033183 A KR 20240033183A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
gly
arg
thr
leu
Prior art date
Application number
KR1020247007180A
Other languages
English (en)
Inventor
쥬디트 바우마이스터
마리에-파울레 루시엔네 아르만다 보우체
카를로 보우톤
마리에-안게 부이세
베에를레 스노엑크
스테파니에 스타엘렌스
Original Assignee
아블린쓰 엔.브이.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=47423024&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20240033183(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from PCT/EP2011/067132 external-priority patent/WO2012042026A1/en
Priority claimed from PCT/EP2012/061304 external-priority patent/WO2012175400A1/en
Application filed by 아블린쓰 엔.브이. filed Critical 아블린쓰 엔.브이.
Publication of KR20240033183A publication Critical patent/KR20240033183A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/22—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from camelids, e.g. camel, llama or dromedary
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

본 발명은 - 주어진 ISV가 본원에 기재된 바와 같은 단백질 간섭을 겪을 것인지 및/또는 어세이(예컨대, ADA 면역어세이)에서 (비특이적) 신호를 발생시킬 것인지를 예측하는 데에 이용될 수 있는 어세이(이러한 예측 어세이는 예를 들면, 주어진 ISV가 이러한 단백질 간섭 및/또는 이러한 신호를 발생시킬 경향을 가질 수 있는지를 시험하는 데에 이용될 수 있고/있거나, 이러한 단백질 간섭 또는 이러한 신호의 발생을 겪을 경향이 없거나 덜한 ISV를 선택하는 데에 사용될 수 있고/있거나, ISV에 대한 일부 변경(들)이 이러한 간섭 또는 이러한 신호를 발생시킬 그의 경향을 (전체적으로 또는 부분적으로) 감소시킬지를 시험하는 데에 이용될 수 있는 어세이 또는 시험으로서 이용될 수 있고/있거나, 이러한 단백질 간섭 또는 신호를 발생시킬 그의 경향을 감소시키도록 ISV의 변경 또는 개선을 안내하는 데에 이용될 수 있는 어세이 또는 시험으로서 이용될 수 있음); - 이러한 단백질 간섭 또는 이러한 신호를 발생시킬 그의 경향을 제거하거나 감소시키도록 ISV를 변경하고/하거나 개선하는 방법; - 이러한 단백질 간섭 또는 이러한 신호를 발생시킬 그의 경향을 제거하거나 감소시키는, ISV 내로 도입될 수 있는 변경; - 이러한 단백질 간섭 또는 이러한 신호를 발생시킬 경향을 갖지 않거나 (보다) 낮은/감소된 경향을 갖도록 (예를 들면, 본원에 기재된 어세이(들)를 이용함으로써) 구체적으로 선택된 ISV; 및 - 이러한 단백질 간섭 또는 이러한 신호를 발생시킬 경향을 갖지 않거나 (보다) 낮은/감소된 경향을 갖는 변경된 및/또는 개선된 ISV를 제공하고 일부 구체적인 비한정적 양태에서 이들에 관한 것이다.

Description

면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법{TECHNIQUES FOR PREDICTING, DETECTING AND REDUCING ASPECIFIC PROTEIN INTERFERENCE IN ASSAYS INVOLVING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS}
본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인의 분야에 관한 것이다.
면역글로불린 단일 가변 도메인 또는 "ISV"는 일반적으로 본원에서 면역글로불린 폴드(fold)를 포함하거나 적합한 조건(예컨대, 생리학적 조건) 하에서 (즉, 폴딩에 의해) 면역글로불린 폴드를 형성할 수 있고, 즉 면역글로불린 가변 도메인(예를 들면, VH, VL 또는 VHH 도메인)을 형성할 수 있고, (기능성 항원 결합 부위를 형성하기 위해 또 다른 면역글로불린 가변 도메인과의 상호작용(예컨대, VH-VL 상호작용)을 필요로 하지 않는다는 의미에서) 기능성 항원 결합 부위를 포함하는 면역글로불린 가변 도메인을 형성하는(또는 이러한 적합한 조건 하에서 형성할 수 있는) 아미노산 서열로서 정의된다.
당분야에서 현재 공지되어 있는 면역글로불린 단일 가변 도메인의 몇몇 예는 VHH 및/또는 (다른) 나노바디, dAb 및 (단일) 도메인 항체이다. 이들 중 다양한 나노바디들이 본원의 출원일 당시 I 기 및 II 기 임상 시험 단계에 있다. 이것 때문에, ISV로 치료받은 사람들(예컨대, 임상 시험 대상체, 및 이러한 ISV가 시판 단계에 도달한 후 이러한 ISV로 치료받은 환자)의 생물학적 샘플을 분석하기 위한 이용가능하고 신뢰할만한 어세이를 갖는 것이 중요하다.
이것은 규제 목적을 위해 중요할 뿐만 아니라 생물학적 약물을 사용한 환자의 치료를 위해서도 중요한데, 이는 상기 치료를 처방하는 의사도 상기 치료의 다양한 양태를 모니터링하기 위해 이용가능하고 신뢰할만한 어세이를 갖고 싶을 것이기 때문이다.
예를 들면, 생물학적 약물 분자들의 임상 개발에 있어서, 그들의 면역원적 잠재력 및 특히 그들이 소위 "항-약물 항체" 또는 "ADA"를 이끌어낼 수 있는 정도를 평가하는 것은 중요하다. 이것은 소위 "항-약물 항체" 또는 "ADA (면역)어세이"를 이용함으로써 확인된다(예를 들면, 문헌(Shankar et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48 (2008), 1267-1281); 문헌(Mire-Sluis et al., J. Immunol. Meth. 289 (2004), 1-16); 문헌(Peng et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54, (2011), 629-635); 및 문헌(Loyet et al., J. Immunol. Meth. 345 (2009), 17-28) 참조). 이러한 ADA 어세이 및 이를 수행하는 방법은 약학 분야의 표준 지식이고, 이들은 생물학적 약물 제품의 임상 개발 동안 관용적으로 이용된다(뿐만 아니라 전세계의 다양한 규제 관청들에 의해 요구된다).
예를 들면, 상기 문헌(Mire-Sluis)의 3 및 4 페이지에 기재되어 있고 예를 들면, 상기 문헌(Peng)의 도면에도 개략적으로 예시되어 있는 바와 같이, 다수의 상이한 ADA 어세이 포맷들, 예컨대, "ELISA-가교형성 포맷", "ELISA-직접적 포맷", "간접적 포맷", 방사면역-침전 어세이(RIP), "표면 플라스몬 공명" 및 "전기화학발광-가교형성 포맷"이 공지되어 있다. ADA 면역어세이를 수행하는 다른 포맷은 당업자에게 자명할 것이다.
당업자는 ADA 어세이를 셋업하고 수행하는 데에 적합한 것으로 밝혀져 있는 다수의 상이한 상업적으로 입수가능한 기술 플랫폼도 인지하고 있을 것이다. 이들은 MSD 플랫폼(메소스케일(Mesoscale)), 가이로랩(Gyrolab)(가이로스(Gyros)) 및 옥테트(octet) 플랫폼(포테바이오(Fortebio))을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
ADA 어세이 포맷의 몇몇 비한정적 예는 도 1a 내지 1c에도 개략적으로 나타나 있다.
일반적으로, ISV에 대한 ADA를 검출하거나 측정하는 이러한 ADA 어세이에서 ISV는 "분석 물질"(즉, 임의의 ADA가 시험되는 샘플에 존재하는지를 검출하는 데에 사용되는 화합물)로서 사용되고, ADA는 "항원"(즉, 시험되는 샘플에서 검출될 화합물)이라는 것을 인지해야 한다. 따라서, 이들 어세이들에서, ISV는 담체(예컨대, ELISA 플레이트)에 통상적으로/종종 결합될 것인 반면, ADA는 (존재하는 경우) 어세이를 받을 샘플에 존재할 것이다.
본원에 기재된 본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 대조적으로 ISV가 단백질 간섭을 발생시킬 것인지를 예측하기 위해 본원에서 이용되는 방법에서 ISV는 통상적으로 "항원"(즉, 검출될 화합물)로서 사용될 것이고, (본원에 더 기재되어 있는 바와 같은) 항체는 "분석 물질"로서(즉, 주어진 ISV가 결합하는지 아니면 결합하지 않는지, 및 이로써 단백질 간섭을 발생시킬 높은 또는 증가된 위험을 갖는지 아니면 갖지 않는지를 검출하기 위한 수단으로서) 사용된다는 것을 이미 인지해야 한다. 따라서, 본 발명에 따른 이 방법에서, (본원에서 "분석 항체"로도 지칭되는) 분석 물질로서 사용되는 항체는 통상적으로 담체(즉, ELISA 플레이트)에 결합될 것이고, ISV는 시험될 샘플에 있을(존재할) 것이다. 그러나, 본 발명은 "분석 항체"가 담체에 결합되어 있는 어세이로 한정되지 않는다는 것을 일반적으로 인지해야 한다. 예를 들면, (예를 들면, 도 1에 나타나 있고 실시예에 기재된 바와 같이) 본 발명에 따른 어세이를 수행하는 대안적인 방식에서, 분석 항체는 가교형성제로서 사용되므로, (플레이트 상에 코팅되어 있는 ISV를 통해 플레이트에 간접적으로 결합되어 있지만) 플레이트에 결합되어 있다기보다는 용액에 존재할 것이다. 그러나, 실시예에 기재된 특정 가교형성 어세이(경쟁 어세이)에서도, 분석 항체는 여전히 분석 물질로서(즉, 관심 있는 ISV가 결합하는지 아니면 결합하지 않는지를 확인함으로써, 단백질 간섭을 발생시킬 높은 또는 증가된 위험을 갖는지 아니면 갖지 않는지를 확인하기 위해) 사용된다. 당업자는 본원의 추가 개시내용에 기초하여 주어진 ISV가 결합할 수 있는지 아니면 결합할 수 없는지를 확인함으로써 단백질 간섭을 발생시킬 높은 또는 증가된 위험을 갖는지 아니면 갖지 않는지를 확인하기 위해 분석 항체를 분석 물질로서 사용할 수 있는 다른 어세이 포맷을 디자인할 수 있을 것이라는 것도 예상된다.
단일 쇄 Fv 또는 "ScFv"(불변 도메인과 연결되어 있지 않은, ISV와 유사한 면역글로불린 단일 가변 도메인을 함유하는 구축물)에 대한 연구의 결과로서, 면역글로불린 가변 도메인의 C-말단은 항체에서 가변 도메인과 불변 도메인 사이의 계면에 묻혀 있으나 가변 도메인이 불변 도메인과 연결되어 있지 않을 때 용매에 노출되게 되는 소수성 패취(patch)를 형성한다는 것이 당분야에서 공지되어 있다(Nieba et al., Protein Engineering, 10, 435-444 (1997)). 노출된 C-말단은 (새로 발생된 및/또는 기존) 항-약물 항체를 발생시킬 수 있고/있거나 이러한 항-약물 항체와 상호작용할 수 있는 B-세포 에피토프를 형성할 수 있고(국제 특허출원 공보 제WO 11/07586호), 그 후 상기 항-약물 항체의 존재는 상기 언급된 ADA 어세이를 이용함으로써 확인될 수 있다는 것도 공지되어 있다. 이러한 이유로, 상기 소수성을 감소시키고/시키거나 상기 에피토프를 제거하기 위해 가변 도메인의 C-말단의 일부를 형성하는 아미노산 잔기들의 일부에 대한 돌연변이를 만드는 것이 제안되었다. 예를 들면, 니에바와 그의 동료들(Nieba et al.)은 VH 영역의 위치 11, 14, 41, 84, 87 및/또는 89(카바트(Kabat)에 따른 넘버링)를 돌연변이시킬 것을 제안한 반면, 국제 특허출원 공보 제WO 11/07586호에는 VL 도메인의 위치 99, 101 및/또는 148(AHo 넘버링) 또는 VH 도메인의 위치 12, 97, 98, 99, 103 및/또는 144(다시 AHo 넘버링 - 이들 위치들은 카바트에 따른 위치 11, 83, 84, 85, 89 및 103에 상응함)를 돌연변이시키는 것이 제안되어 있다.
그러나, 이들 참고문헌들 중 어느 것도 대상체의 혈액 또는 혈청에 존재하는 일부 단백질들이 ISV를 수반하는 ADA 어세이를 간섭할 수 있다는 것을 인식하지 못하고, 이로 인해 이들 참고문헌들은 시험될 샘플에서 (발생하는 또는 기존) 항-약물 항체의 실제 존재/정도를 확인하는 데에 ADA 어세이가 이용될 수 있도록 이러한 ADA 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 방지하는 방법이라는 과제를 해결하지(또는 해법을 제공하지) 못한다.
대조적으로, 본 발명은 면역글로불린 단일 가변 도메인이 ADA 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 겪을 경향을 가질 것인지 아니면 갖지 않을 것인지를 당업자가 용이하게 예측할 수 있게 하는 방법 및 어세이를 제공한다. 또한, 본원에 기재된 방법 및 어세이는 가변 도메인이 ADA 어세이에서 이러한 단백질 간섭을 겪을 경향 또는 위험을 가질 수 있다고 발견되는 경우 가변 도메인에 대한 임의의 (제안된) 변경이 이러한 단백질 간섭을 감소시키거나 본질적으로 완전히 방지할 것인지를 예측하기 위해 당업자가 이러한 (제안된) 변경을 용이하게 시험할 수 있게 한다.
또한, 본 발명은 이러한 단백질 간섭을 감소시키거나 본질적으로 방지하기 위해 가변 도메인에 대해 만들어질 수 있는 다수의 변경을 기술한다. 한 비한정적 양태에 따르면, 이러한 변경은 (본원에 더 기재된 바와 같은) 한정된 수의 (본원에 더 기재된 바와 같은) 아미노산 잔기를 가변 도메인의 C-말단에 추가하는 단계를 포함한다. 놀랍게도, 다수의 상이한 가변 도메인들 및 이들에 기초한 구축물들 경우, 비록 1개의 아미노산의 추가 자체가 니에바와 그의 동료들에 따를 때 ISV의 C-말단에 존재하는 소수성 패취를 "덮거나" "묻는" 데에 충분하지 않을지라도, 단일 아미노산 잔기(예컨대, 단일 알라닌 잔기)를 C-말단에 추가하는 것조차도 ADA 어세이에서 단백질 간섭이라는 문제점을 실질적으로 또는 심지어 본질적으로 완전히 제거할 수 있다는 것을 발견하였다. 유사하게, 본 발명을 임의의 방식, 또는 임의의 기작 또는 설명으로 한정하고자 하는 것은 아니지만, 이러한 1개의 아미노산의 추가가 국제 특허출원 공보 제WO 11/07586호에 따를 때 가변 도메인의 C-말단에 존재할 수 있는 임의의 B-세포 에피토프를 "덮거나" "묻는" 데에 충분하지 않을 것이라는 것도 추정된다. (즉, 니에바와 그의 동료들 및 국제 특허출원 공보 제WO 11/07586호에 의해 제안된 바와 같이 C-말단 영역 자체 내에서 임의의 치환을 만들지 않으면서) 본 발명의 이 구체적인 양태에 따라 가변 도메인의 C-말단에서 한정된 수 또는 심지어 단일 아미노산을 추가하는 것이 비특이적 단백질 간섭이라는 문제점을 상당히 감소시킬 수 있거나 심지어 본질적으로 제거할 수 있고 많은 경우에서 그러할 것이지만, C-말단에의 이러한 추가가 C-말단 영역 내의 돌연변이와 병용되는 것도 본 발명의 이 양태의 범위 내에 있다는 것도 인지해야 한다. 그러나, 이와 관련하여, 본 발명이 이러한 돌연변이를 만드는 것을 뒷받침하는 근거에 대해 특별히 한정되지 않는다는 것도 인지해야 한다. 예를 들면, 가변 도메인(VHH 도메인을 포함하나 이것으로 한정되지 않음)을 인간화하거나 VH 도메인을 "낙타화"하기 위해 C-말단 내의 아미노산 잔기(니에바와 그의 동료들 및 국제 특허출원 공보 제WO 11/07586호에 의해 명확히 언급되어 있는 위치들의 아미노산 잔기를 포함함)에 대한 돌연변이를 만드는 것은 잘 공지되어 있다(예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 08/020079호 및 본원에서 인용된 애블린스 엔. 브이.(Ablynx N.V.)의 다른 출원들 중 몇몇 출원들 참조).
본 발명은 하기 비한정적 바람직한 양태, 실시예 및 도면에 의해 더 기재될 것이다.
도 1a 내지 1c는 ADA 어세이 포맷의 몇몇 비한정적 실시예를 개략적으로 보여준다. 이들 어세이들을 수행하기 위한 몇몇 대표적인 비한정적 프로토콜은 실시예 4에서 언급되어 있다.
도 2는 ISV, 예컨대, 나노바디의 대표적인 3D 구조를 개략적으로 보여준다.
도 3은 NB 3.4 내지 3.9(서열번호 5 내지 10)와 실시예 2에서 수득된 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여주는 (실시예 3에 기재된 비아코어(BIACORE) 어세이를 이용함으로써 수득된) 결합 곡선이다.
도 4는 NB 3.4, 3.11, 3.12 및 3.13(서열번호 5, 12, 13 및 14)과 실시예 2에서 수득된 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여주는 (실시예 3에 기재된 비아코어 어세이를 이용함으로써 수득된) 결합 곡선이다.
도 5는 NB 3.4, 3.14 및 3.15(서열번호 5, 15 및 16)와 실시예 2에서 수득된 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여주는 (실시예 3에 기재된 비아코어 어세이를 이용함으로써 수득된) 결합 곡선이다.
도 6은 NB 3.1, 3.2 및 3.4(서열번호 3, 4 및 5)와 실시예 2에서 수득된 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여주는 (실시예 3에 기재된 비아코어 어세이를 이용함으로써 수득된) 결합 곡선이다.
도 7은 NB 4.1 및 4.2(서열번호 17 및 18)와 실시예 2에서 수득된 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여주는 (실시예 3에 기재된 비아코어 어세이를 이용함으로써 수득된) 결합 곡선이다.
도 8은 NB 6.1, 6.2, 6.4 및 6.5(서열번호 19 내지 22)와 실시예 2에서 수득된 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여주는 (실시예 3에 기재된 비아코어 어세이를 이용함으로써 수득된) 결합 곡선이다.
도 9는 실시예 8에서 사용된 서열(서열번호 37 내지 89)을 보여주고 상응하는 기준 서열을 나열하는 표이다.
본원에 교시된 방법, 어세이 및 변경은 불변 도메인(또는 가변 도메인의 C-말단 영역을 "차폐하거나", 덮거나 "묻는" 기능을 하는 또 다른 기 또는 펩티드 모이어티(moiety)와) 연결되어 있지 않거나 달리 회합되어 있지 않은 임의의 가변 도메인에 적용될 수 있고, 보다 일반적으로 용매에 노출되는 C-말단 영역을 갖는 임의의 가변 도메인에 적용될 수 있다고 예상된다. 그러나, 본 발명의 한 바람직한 비한정적 양태에 따라, 상기 방법, 어세이 및 변경은 특히 중쇄 가변 도메인(VH 도메인)에 적용될 수 있고, 본 발명의 한 구체적인 양태에 따라 VHH 도메인에 적용될 수 있다.
본원에 기재된 방법, 어세이 및 변경은 하나 이상의 가변 도메인을 함유하는 단백질 구축물(construct), 특히 가변 도메인이 구축물의 C-말단 부분을 형성하거나, 본원에 기재된 방법 및 어세이의 경우, 이와 달리 가변 도메인의 C-말단 영역이 용매에 노출되는 이러한 구축물에 적절하게 적용될 수 있다는 것도 예상된다. 본 발명의 한 바람직한 비한정적 양태에 따라, 상기 방법, 어세이 및 변경은 VH 도메인(특히, VHH 도메인)이 구축물의 C-말단 부분을 형성하거나, 본 발명의 방법 및 어세이의 경우, 이와 달리 용매에 노출되는 구축물에 적용된다.
이러한 구축물의 몇몇 비한정적 예는 직접적으로 연결된 2개 이상의 ISV, 또는 (한 구체적인 양태에 따라 VH 또는 VHH 도메인과 함께) 이러한 구축물의 C-말단 부분을 형성하는 하나 이상의 적합한 연결제를 통해 연결된 2개 이상의 ISV를 함유하는 다가, 다중특이적(예컨대, 이중특이적) 또는 다중파라토프적(예컨대, 이중파라토프적) 구축물이다. 예를 들면, 한정 없이, 이러한 구축물은 직접적으로 또는 하나 이상의 적합한 연결제를 통해 연결된 VH 도메인, 특히 나노바디(즉, VHH 도메인, 인간화된 VHH 도메인 또는 낙타화된 VH 도메인)로만 구성될 수 있다. 이러한 구축물의 몇몇 비한정적 예 및 (특히, 나노바디에 기초하여) 이러한 구축물을 제조할 수 있는 일반적인 교시에 대해서는 예를 들면, 문헌(Conrath et al., JBC 276, 10(9), 7346 (2001)) 및 문헌(Muyldermans. Reviews in Mol. Biotechnol., 74: 27 (2001))을 참조한다.
그러나, 예를 들면, 본 발명이, 용매에 노출되는 가변 도메인을 갖고 특히 그의 C-말단에 가변 도메인을 갖는 다른 구축물, 예를 들면, 단일 쇄 Fv, 특히 C-말단에 그의 중쇄 가변 도메인을 갖는 ScFv에 적용될 수 있다는 것도 예상된다.
본 명세서 및 특허청구범위에서, "ISV", "분석 물질" 및 "단백질 간섭"과 같은 용어는 본원에서 더 정의된 바와 같은 의미를 갖는다.
특히, 본원에 기재된 ISV는 특히, 나노바디, 또는 VH 도메인이거나 VH 도메인을 포함하는 (다른) ISV(즉, 나노바디 제외)일 수 있고, 바람직하게는 나노바디이다.
또한, ISV를 포함하는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드(예컨대, ISV-기초 약물)는 바람직하게는 그의 C-말단에 상기 (또는 하나 이상의) 이러한 ISV를 갖는다. 상기 ISV는 특히, 나노바디, 또는 VH 도메인이거나 VH 도메인을 포함하는 (다른) ISV(즉, 나노바디 제외)일 수 있고, 바람직하게는 나노바디이다.
본원에 기재된 발명은 특히, 중쇄 가변 도메인, 예컨대, (인간 VH 도메인을 포함하는) VH 도메인 및 나노바디, 예컨대, (인간화된 VHH 도메인 및 서열 최적화된 VHH 도메인을 포함하는) VHH 도메인 또는 낙타화된 VH 도메인을 포함하고/하거나, 이러한 도메인에 기초하고/하거나 이러한 도메인으로부터 유래된 ISV에 적용되기 위한 것이고 적용되기에 적합하다. 이들은 합성(예를 들면, 합성 라이브러리로부터 출발하여 수득되고/되거나 고정된 골격 영역에 기초한) VH 또는 VHH 도메인, 반합성(예를 들면, 천연 VH 또는 VHH 도메인으로부터 출발하여 인간화된, 낙타화된 또는 서열-최적화된, 또는 친화성 성숙 또는 CDR 이식에 의해 수득된) VH 또는 VHH 도메인, 또는 전체 천연 발생 VH 또는 VHH 도메인일 수 있다. 따라서, 본 발명은 VH 또는 VHH 도메인이고/이거나, VH 또는 VHH 도메인에 기초하고/하거나 VH 또는 VHH 도메인으로부터 유래된 ISV에 대하여 본원에 더 기재될 것이다.
본 발명을 확립하는 데에 있어서, 생물학적 샘플(예컨대, 전혈, 혈청 및 혈장을 포함하는 혈액 샘플, 안구액, 기관지폐포액/BALF, 뇌척수액 또는 다른 생물학적 체액 샘플)을 분석하는 데에 이용되는 몇몇 어세이들(예를 들면, ADA 면역어세이)에서 단백질 간섭이 일어날 수 있고 이러한 단백질 간섭이 이들 어세이들 중 일부 및/또는 이들 샘플들 중 일부에서 비특이적 신호를 발생시킬 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 이러한 단백질 간섭이 ISV(특히, 나노바디; 또는 하나 이상의 이러한 ISV 또는 나노바디를 포함하는 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 생물학적 약물)로 치료받은 대상체 및/또는 이를 투여받은 대상체(예컨대, 환자 또는 임상 시험 대상체)로부터 수득된 샘플에서 일어날 수 있을 뿐만 아니라, ISV를 제공받은 경험이 없는 대상체의 샘플에서도 일어날 수 있다는 것(이러한 간섭이 임의의 새로 발생된 ADA보다는 오히려 기존 단백질과의 비특이적 단백질-단백질 상호작용으로 인한 것일 가능성이 있다는 것을 암시함)을 발견하였다.
이러한 어세이에서 이러한 단백질 간섭 및/또는 이러한 신호가 ISV의 약리학적 성질(예컨대, 약동학적/PK 또는 약력학적/PD 성질)의 임의의 변화 또는 감소와 관련되어 있지 않다는 것을 발견하였지만, 이러한 비특이적 단백질 간섭을 예측하고/하거나, 검출하고/하거나, 감소시키고/시키거나 가능하다면 방지하기 위해 이용될 수 있는 기법을 갖는 것이 바람직할 것이다. 이것은 본 발명의 일반적인 목적이다.
특히, 본 발명은
- 주어진 ISV가 이러한 단백질 간섭을 겪을 것인지 및/또는 어세이(예컨대, ADA 면역어세이)에서 이러한 (비특이적) 신호를 발생시킬 것인지를 예측하는 데에 이용될 수 있는 어세이. 이러한 예측 어세이는 예를 들면, 주어진 ISV가 이러한 단백질 간섭 및/또는 이러한 신호를 발생시킬 경향을 가질 수 있는지를 시험하는 데에 이용될 수 있고/있거나; 이러한 단백질 간섭 또는 이러한 신호의 발생을 겪을 경향이 없거나 덜한 ISV를 선택하는 데에 이용될 수 있고/있거나; ISV에 대한 일부 변경(들)이 이러한 간섭 또는 이러한 신호를 발생시킬 그의 경향을 (전체적으로 또는 부분적으로) 감소시킬지를 시험하는 데에 이용될 수 있는 어세이 또는 시험으로서 이용될 수 있고/있거나; 이러한 단백질 간섭 또는 신호를 발생시킬 그의 경향을 감소시키도록 ISV의 변경 또는 개선을 안내하는 데에 이용될 수 있는 어세이 또는 시험으로서 이용될 수 있다;
- 이러한 단백질 간섭 또는 이러한 신호를 발생시킬 그의 경향을 제거하거나 감소시키도록 ISV를 변경하고/하거나 개선하는 방법;
- 이러한 단백질 간섭 또는 이러한 신호를 발생시킬 그의 경향을 제거하거나 감소시키는, ISV 내로 도입될 수 있는 변경;
- 이러한 단백질 간섭 또는 이러한 신호를 발생시킬 경향을 갖지 않거나 (보다) 낮은/감소된 경향을 갖도록 (예를 들면, 본원에 기재된 어세이(들)를 이용함으로써) 구체적으로 선택된 ISV; 및
- 이러한 단백질 간섭 또는 이러한 신호를 발생시킬 경향을 갖지 않거나 (보다) 낮은/감소된 경향을 갖는 변경된 및/또는 개선된 ISV
를 제공하고 일부 구체적인 비한정적 양태에서 이들에 관한 것이다.
예를 들면, 제1 비한정적 양태에서, 본 발명은 주어진 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 면역어세이(즉, 대상체에게 투여된 후, 생물학적 체액 샘플이 상기 대상체로부터 수득되어 상기 샘플이 본원에 더 기재된 바와 같은 면역어세이로 분석됨)에서 단백질 간섭을 발생시킬 것인지(또는 발생시킬 높은 또는 증가된 위험을 갖는지)를 예측하는 데에 이용될 수 있는 방법으로서, 적어도 하기 단계들을 포함하는 면역어세이를 수행하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다:
(i) 상기 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)를, 인간 대상체로부터 수득되고 ISV 또는 나노바디의 C-말단을 인식하고/하거나 상기 C-말단에 결합하는 그의 능력에 기초하여 선택되고/되거나, 발생되고/되거나 단리된 항체("분석 항체")와 접촉시키는 단계; 및
(ii) 상기 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 상기 면역어세이에서 상기 항체에 의해 결합되는지를 확인하는 단계.
이 방법에서, ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 상기 분석 항체에 의해 결합될 때, 상기 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 (본원에 더 정의된 바와 같은) 이러한 단백질 간섭을 발생시킬 것(또는 발생시킬 높은 또는 증가된 위험을 갖는다는 것)이 예측될 수 있다. 이것에 기초할 때, 예를 들면, 상기 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물은 (상기 어세이를 이용하여 측정할 수 있는) 이러한 단백질 간섭을 발생시킬 그의 성향을 감소시키거나 제거하도록 변경될 수 있거나 개선될 수 있고, 상기 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물을 변경하는 데에 이용될 수 있는 몇몇 방법들은 본원에 기재될 것이다(예를 들면, 소수의 아미노산 잔기를 C-말단에 부착시키고/시키거나 하나 이상의 특정 아미노산 치환을 도입하는 것을 포함한다).
따라서, 일반적으로, 본 발명은 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 단백질 간섭을 발생시킬 경향을 예측하는 데에 이용될 수 있고/있거나 단백질 간섭을 발생시킬 그의 경향을 감소시키거나 방지하도록 ISV를 개선하기 위한 수단으로서 이용될 수 있는 어세이 및 방법/기법이 당업자에게 이용될 수 있게 한다. 이를 수행함에 있어서, 본 발명은 단백질 간섭을 발생시킬 그의 낮은 또는 감소된 능력(또는 임의의 능력의 부재)에 기초하여 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물을 선택하기 위한 수단도 당업자에게 제공한다. 따라서, 본 발명은 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물의 최적화 및 개발에 이용될 수 있는 중요한 어세이 및 수단을 당업자에게 제공한다.
또한, 본원에 더 기재된 바와 같이, 본 발명은 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 단백질 간섭을 발생시킬 그의 경향을 감소시키거나 방지하도록 변경될 수 있거나 개선될 수 있는 다수의 방식을 당업자에게 교시한다. 따라서, 본 발명은 단백질 간섭을 발생시킬 감소된 또는 낮은 경향을 갖거나 이러한 경향을 전혀 갖지 않는 변경된 및/또는 개선된 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 일반적으로 이용될 수 있게 한다.
본원에 더 기재된 바와 같이, 본 발명은 특히, 주어진 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)이 면역어세이, 보다 구체적으로 ADA 어세이에서 (본원에 더 기재된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 것인지를 예측하는 데에 이용될 수 있다. 상기 ADA 어세이는 예를 들면, 일반적으로 ISV에 대한 ADA를 검출하거나 측정하기 위한 ADA 어세이일 수 있고, 특히 상기 단계 (i) 및 (ii)에서 사용된 ISV에 대한 ADA를 검출하거나 측정하기 위한 ADA 어세이일 수 있다.
본원에서 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 ISV는 특히, 나노바디, 또는 VH 도메인이거나 VH 도메인을 포함하는 (다른) ISV(즉, 나노바디 제외)일 수 있고, 바람직하게는 나노바디이다.
또한, ISV를 포함하는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드(예컨대, ISV-기초 약물)는 바람직하게는 그의 C-말단에 상기(또는 하나 이상의) 이러한 ISV를 갖는다. 상기 ISV는 특히, 나노바디, 또는 VH 도메인이거나 VH 도메인을 포함하는 (다른) ISV(즉, 나노바디 제외)일 수 있고, 바람직하게는 나노바디이다.
상기 면역어세이 또는 ADA 어세이에서 시험되는 샘플은 본원에서 "시험 샘플" 또는 "어세이 샘플"로도 지칭된다. 혼동을 방지하기 위해, 예컨대, "시험 샘플" 또는 "어세이 샘플"은 본원에서 사용된 (다중클론 또는 단일클론) "분석 항체"를 수득하기 위한 출발 물질로서 본원에서 사용되는 생물학적 샘플과 혼동되어서는 안 된다.
한 구체적인 바람직한 비한정적 양태에서, 본 발명은 주어진 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 이러한 ISV의 사용을 수반하는 면역어세이(특히, ADA 어세이)에서 (본원에 더 기재된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 것인지를 예측하는 데에 이용될 수 있다. 상기 ADA 어세이는 예를 들면, 일반적으로 ISV에 대한 ADA를 검출하거나 측정하기 위한 ADA 어세이일 수 있고, 특히 상기 단계 (i) 및 (ii)에서 사용된 ISV에 대한 ADA를 검출하거나 측정하기 위한 ADA 어세이일 수 있다.
훨씬 더 구체적인 비한정적 양태에서, 본 발명은 주어진 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가, 샘플이 ISV에 대한 임의의 ADA를 함유하는지를 확인하거나 측정하기 위한 면역어세이(특히, ADA 어세이)에서 (본원에 더 기재된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 것인지를 예측하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 면역어세이는 상기 ISV에 대한 임의의 ADA가 "시험 샘플"에 존재하는지를 확인하거나 측정하기 위해 수행되는 공지된 유형의 ADA 어세이(이에 대해서는 예를 들면, 본원에서 인용된 ADA 어세이에 대한 종래기술을 참조함) 중 하나일 수 있고, 이때 상기 시험 샘플은 상기 ISV가 (본원에 더 기재된 바와 같이) 투여된 대상체로부터 수득된 (본원에 기재된 바와 같은) 생물학적 체액 샘플이다.
본원에 더 기재된 바와 같이, 모든 이들 양태들(및 본원에 기재된 본 발명의 추가 양태)에서, 본 발명은 이러한 면역어세이 또는 ADA 어세이에서 이러한 단백질 간섭을 겪을 경향이 없거나 덜한 ISV를 선택하는 데에 이용될 수도 있고/있거나; ISV에 대한 일부 변경(들)이 이러한 면역어세이 또는 ADA 어세이에서 이러한 간섭을 발생시킬 그의 경향을 (전체적으로 또는 부분적으로) 감소시킬 것인지를 시험하는 데에 이용될 수 있는 어세이 또는 시험으로서 이용될 수도 있고/있거나; 이러한 면역어세이 또는 ADA 어세이에서 이러한 단백질 간섭을 발생시킬 그의 경향을 감소시키도록 ISV의 변경 또는 개선을 안내하는 데에 이용될 수 있는 어세이 또는 시험으로서 이용될 수도 있다.
본 발명의 다른 양태, 실시양태, 이점 및 적용은 본원의 추가 설명으로부터 명확해질 것이다.
본 명세서에서, 용어 "ISV"가 사용될 때마다, 다음과 같은 의미임을 이해해야 한다:
- 이러한 ISV는 바람직하게는 나노바디이고, 이때 용어 "나노바디"는 일반적으로 국제 특허출원 공보 제WO 08/020079호 또는 제WO 09/138519호에 정의되어 있으므로, 구체적인 양태에서 일반적으로 VHH, 인간화된 VHH 또는 낙타화된 VH(예컨대, 낙타화된 인간 VH)를 의미하거나, 일반적으로 서열 최적화된(예를 들면, 화학적 안정성 및/또는 가용성, 공지된 인간 골격 영역과의 최대 중첩 및 최대 발현에 대해 최적화된) VHH를 의미한다. 용어 나노바디 또는 나노바디들은 애블린스 엔. 브이.의 등록된 상표명이므로, 나노바디® 및/또는 나노바디들®로서 지칭될 수도 있다는 것을 인지한다.
- 용어 "ISV"는 그의 가장 넓은 의미에서 "ISV-기초 생물학적 약물", 및 ISV가 나노바디일 때 "나노바디-기초 생물학적 약물"도 포함한다. "ISV-기초 생물학적 약물"은 본원에서 하나 이상(예컨대, 1개, 2개 또는 3개)의 ISV를 포함하거나 본질적으로 이러한 ISV로 구성된 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 생물학적 약물로서 정의된다. 유사하게, "나노바디-기초 생물학적 약물"은 하나 이상(예컨대, 1개, 2개 또는 3개)의 나노바디를 포함하거나 본질적으로 이러한 나노바디로 구성된 단백질, 폴리펩티드 또는 다른 생물학적 약물로서 정의된다. 용어 "ISV"와 마찬가지로, 용어 "ISV-기초 생물학적 약물"이 사용될 때마다, 이러한 ISV-기초 생물학적 약물은 바람직하게는 나노바디-기초 생물학적 약물이라는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 내용 내에서, "ISV-기초 생물학적 약물" 및 "나노바디-기초 생물학적 약물" 둘다가 예를 들면, 1가, 2가(또는 다가), 이중특이적(또는 다중특이적) 및 이중파라토프적(또는 "다중파라토프적") ISV 구축물 또는 나노바디 구축물일 수 있다. 또한, 임의의 ISV-기초 또는 나노바디-기초 생물학적 약물은 하나 이상(예컨대, 1개, 2개 또는 3개)의 ISV 또는 나노바디 이외에 예를 들면, 하나 이상(예컨대, 1개 또는 2개)의 다른 추가 치료 모이어티, 및/또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 생물학적 물질의 약동학적 또는 약력학적 성질(예컨대, 그의 반감기)에 영향을 미치는 하나 이상(예컨대, 1개 또는 2개)의 다른 모이어티를 임의적으로 더 포함할 수 있다. 이러한 추가 치료 또는 다른 모이어티의 적합한 예는 당업자에게 자명할 것이고, 예를 들면, 일반적으로 임의의 치료 활성 단백질, 폴리펩티드, 또는 다른 결합 도메인 또는 결합 유닛뿐만 아니라, 예를 들면, 변경, 예컨대, 국제 특허출원 공보 제WO 09/138159호의 149 내지 152 페이지에 기재된 변경도 포함할 수 있다. ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물은 바람직하게는 치료제이거나 치료제(예방 및 진단을 포함함)로서 사용되기 위한 것이고, 이를 목적으로 바람직하게는 치료 관련 표적(예를 들면, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 또는 다른 인터류킨 등)에 대한 하나 이상의 ISV를 함유한다. 이러한 ISV-기초 또는 나노바디-기초 생물학적 약물의 몇몇 구체적인 비한정적 예에 대해서는 애블린스 엔. 브이.에 의한 다양한 출원들(예를 들면, 한정 없이, 국제 특허출원 공보 제WO 2004/062551호, 제WO 2006/122825호, 제WO 2008/020079호 및 제WO 2009/068627호)뿐만 아니라, 예를 들면, (한정 없이) 국제 특허출원 공보 제WO 06/038027호, 제WO 06/059108호, 제WO 07/063308호, 제WO 07/063311호, 제WO 07/066016호 및 제WO 07/085814호와 같은 출원을 참조한다. 또한, 본 명세서에서, 본원에서 달리 명확히 언급되어 있지 않은 한, 본원에서 언급된 모든 용어들은 국제 특허출원 공보 제WO 09/138519호(또는 국제 특허출원 공보 제WO 09/138519호에서 언급된 종래기술) 또는 제WO 08/020079호(또는 국제 특허출원 공보 제WO 08/020079호에서 언급된 종래기술)에서 제공된 의미를 갖는다. 또한, 방법 또는 기법이 본원에서 구체적으로 기재되어 있지 않은 경우, 상기 방법 또는 기법은 국제 특허출원 공보 제WO 09/138519호(또는 국제 특허출원 공보 제WO 09/138519호에서 언급된 종래기술) 또는 제WO 08/020079호(또는 국제 특허출원 공보 제WO 08/020079호에서 언급된 종래기술)에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
특히, 하기 용어들은 국제 특허출원 공보 제WO 09/138519호의 62 내지 75 페이지에서 제공된 의미와 동일한 의미를 갖고/갖거나 적용가능한 경우 상기 페이지들에 기재된 방식으로 결정될 수 있다: "작용제(agonist)", "길항제", "역 작용제", "비극성 비하전된 아미노산 잔기", "극성 비하전된 아미노산 잔기", "극성 하전된 아미노산 잔기", "서열 동일성", "정확히 동일한" 및 "아미노산 차이"(2개의 아미노산 서열들의 서열 비교를 언급할 때), "본질적으로 단리된 (형태)", "도메인", "결합 도메인", "항원성 결정인자", "에피토프", (항원) "에 대한" 또는 "에 대해 유도된", "특이성" 및 "반감기". 또한, 용어 "조절하는" 및 "조절하기 위해", "상호작용 부위", "에 대해 특이적인", "교차-차단한다", "교차-차단된" 및 "교차-차단하는", 및 "본질적으로 pH와 무관한"은 본 출원인의 국제 특허출원 공보 제WO 10/130832호의 74 내지 79 페이지에서 정의된 바와 같다(그리고/또는 상기 페이지에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다). 또한, 본 발명의 구축물, 화합물, 단백질 또는 폴리펩티드를 언급할 때, "1가", "2가"(또는 "다가"), "이중특이적"(또는 "다중특이적") 및 "이중파라토프적"(또는 "다중파라토프적")과 같은 용어는 국제 특허출원 공보 제WO 09/138519호, 제WO 10/130832호 또는 제WO 08/020079호에서 제공된 의미를 가질 수 있다.
ISV, 나노바디, ISV-기초 생물학적 약물, 나노바디-기초 생물학적 약물, 또는 임의의 다른 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드와 관련하여 본원에서 사용된 용어 "반감기"는 일반적으로 국제 특허출원 공보 제WO 08/020079호의 57 페이지의 단락 o)에 기재된 바와 같이 정의될 수 있고, 상기 단락에서 언급된 바와 같이 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 혈청 농도가 예를 들면, 천연 기작에 의한 상기 서열 또는 화합물의 분해 및/또는 상기 서열 또는 화합물의 제거 또는 격리로 인해 생체내에서 50%까지 감소되는 데에 소요되는 시간을 지칭한다. 본 발명의 아미노산 서열, 화합물 또는 폴리펩티드의 생체내 반감기는 임의의 공지된 방식 그 자체, 예컨대, 약동학적 분석에 의해 측정될 수 있다. 적합한 기법은 당업자에게 자명할 것이고, 예를 들면, 일반적으로 국제 특허출원 공보 제WO 08/020079호의 57 페이지의 단락 o)에 기재된 바와 같을 수 있다. 또한, 국제 특허출원 공보 제WO 08/020079호의 57 페이지의 단락 o)에서 언급된 바와 같이, 반감기는 파라미터, 예컨대, t1/2-알파, t1/2-베타 및 곡선 하의 면적(AUC)을 이용함으로써 표현될 수 있다. 이와 관련하여, 본원에서 사용된 용어 "반감기"는 특히, t1/2-베타 또는 말기 반감기를 지칭한다는 것을 인지해야 한다(이때, t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘다가 고려되지 않을 수 있다). 예를 들면, 하기 실험 부분 및 표준 교재, 예컨대, 문헌(Kenneth, A et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach (1996))을 참조한다. 문헌("Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2nd Rev. edition (1982))도 참조한다. 유사하게, 용어 "반감기의 증가" 또는 "증가된 반감기"도 국제 특허출원 공보 제WO 08/020079호의 57 페이지의 단락 o)에서 정의된 바와 같고 특히 t1/2-알파 및/또는 AUC 또는 둘다의 증가를 수반하거나 수반하지 않는 t1/2-베타의 증가를 지칭한다.
용어가 본원에 구체적으로 정의되어 있을 때, 용어는 당분야에서 그의 통상적인 의미를 갖고, 이 의미는 당업자에게 자명할 것이다. 예를 들면, 표준 교재, 예컨대, 문헌(Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)); 문헌(F. Ausubel et al, eds., "Current protocols in molecular biology", Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987)); 문헌(Lewin, "Genes II", John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985)); 문헌(Old et al., "Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering", 2nd edition, University of California Press, Berkeley, CA (1981)); 문헌(Roitt et al., "Immunology" (6th. Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001)); 문헌(Roitt et al., Roitt's Essential Immunology, 10th Ed. Blackwell Publishing, UK (2001)); 및 문헌(Janeway et al., "Immunobiology" (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005))뿐만 아니라, 본원에서 인용된 일반적인 배경기술도 참조한다.
또한, 본원에서 나노바디의 아미노산 잔기는 논문(Riechmann and Muyldermans, J. Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195) 또는 여기서 인용된 논문에서 낙타과의 VHH 도메인에 적용된 바와 같이 (Kabat et al. "Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)에 의해 제공된 VH 도메인에 대한 일반적인 넘버링에 따라 넘버링된다. 이 넘버링에 따를 때, 나노바디의 FR1은 위치 1 내지 30에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR1은 위치 31 내지 35에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR2는 위치 36 내지 49에서 아미노산을 포함하고, 나노바디의 CDR2는 위치 50 내지 65에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR3은 위치 66 내지 94에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 CDR3은 위치 95 내지 102에서 아미노산 잔기를 포함하고, 나노바디의 FR4는 위치 103 내지 113에서 아미노산 잔기를 포함한다. [이와 관련하여, VH 도메인 및 VHH 도메인에 대해 당분야에서 잘 공지된 바와 같이, CDR들 각각에서 아미노산 잔기의 총 수는 상이할 수 있고 카바트 넘버링에 의해 표시된 아미노산 잔기의 총 수에 상응하지 않을 수 있다(즉, 카바트 넘버링에 따른 하나 이상의 위치가 실제 서열에서 점유되지 않을 수 있거나, 실제 서열이 카바트 넘버링에 의해 허용된 숫자보다 더 많은 아미노산 잔기를 함유할 수 있다). 이것은 일반적으로 카바트에 따른 넘버링이 실제 서열에서 아미노산 잔기의 실제 넘버링에 상응할 수 있거나 상응하지 않을 수 있다는 것을 의미한다. 그러나, 일반적으로, 카바트의 넘버링에 따를 때 CDR 내의 아미노산 잔기의 수와 관계없이, 카바트 넘버링에 따른 위치 1은 FR1의 출발점에 상응하고(역의 경우 성립), 카바트 넘버링에 따른 위치 36은 FR2의 출발점에 상응하고(역의 경우 성립), 카바트 넘버링에 따른 위치 66은 FR3의 출발점에 상응하고(역의 경우 성립), 카바트 넘버링에 따른 위치 103은 FR4의 출발점에 상응한다(역의 경우 성립)고 기재될 수 있다].
낙타과의 VHH 도메인 및 나노바디에도 유사한 방식으로 적용될 수 있는, VH 도메인의 아미노산 잔기를 넘버링하는 대안적인 방법은 소위 "AbM 정의" 및 소위 "접촉 정의"로 지칭되는, 문헌(Chothia et al., Nature 342, 877-883 (1989))에 기재된 방법이다. 그러나, 본 설명, 양태 및 도면에서, 달리 표시되어 있지 않은 한, 리히만(Riechmann) 및 뮐더만스(Muyldermans)에 의해 VHH 도메인에 적용된 바와 같은 카바트에 따른 넘버링을 따를 것이다.
도면, 임의의 서열목록 및 실험 부분/실시예는 본 발명을 단지 더 예시하기 위해 제공되고, 본원에서 달리 명시되어 있지 않은 한, 본 발명의 범위 및/또는 첨부된 특허청구범위를 임의의 방식으로 한정하는 것으로서 해석되거나 간주되어서는 안 된다는 것도 인지해야 한다.
본 발명이 본 발명에서 관찰되고 본 발명에 따라 감소될 수 있는 단백질 간섭(및/또는 면역어세이에서 발생하는 신호)의 임의의 원인, 설명, 가설 또는 기작으로 구체적으로 한정되지 않는다는 것도 인지해야 한다. 그러나, 일부 개체들 또는 개체 군의 혈액 또는 혈청(또는 다른 생물학적 체액, 예컨대, 본원에서 언급된 생물학적 체액)이 일부 환경 하에서 ISV에 (비특이적으로) 결합하여, 이러한 개체들로부터 수득된 혈액 또는 혈청 샘플을 분석하는 데에 이용되는 일부 어세이들에서 간섭 신호를 발생시킬 수 있는 일부 (기존) 단백질들을 함유할 수 있다고 추정된다. 이것은 특히, 본 발명에 의해 해결되는 비특이적 단백질 간섭이 ISV를 이미 투여받은 대상체로부터 수득된 샘플을 어세이할 때뿐만 아니라, 이전에 ISV를 제공받지 않은 대상체로부터 수득된 샘플을 어세이할 때에도 일어난다는, 본 발명의 확립에서 수득된 관찰결과에 기초한다.
특히, 본 발명의 확립에서 수득된 관찰결과에 기초할 때, 본 발명이 비록 이것으로 한정되지 않지만, 이러한 (기존) 단백질이 특히, (전체 크기의 통상적인 4-쇄 단일클론 항체뿐만 아니라 낙타과에서 발견되는 "중쇄 단독" 항체에서도 항체의 나머지, 즉 각각 통상적인 단일클론 항체의 CH1 영역 및 낙타과 중쇄 항체의 힌지 영역에 연결되어 이러한 전체 크기의 항체에서 이러한 단백질 간섭으로부터 차폐될 수 있는) 이러한 ISV의 C-말단에 결합할 수 있다고 생각된다.
이것은 그의 C-말단에서의 ISV의 일부 (단순한) 변경이 이러한 단백질 간섭을 실질적으로 감소시킬 수 있거나 본질적으로 방지할 수 있다는, 본 발명의 확립에서 본 발명자들에 의해 수득된 발견(이 발견은 본원에 더 기재되어 있음)에 의해 확인된다. 따라서, 이 방식으로 ISV를 변경하는 방법 및 이 방식으로 변경된 ISV는 본원에 더 기재되어 있는 바와 같이 본 발명의 추가 양태를 형성한다.
본 발명은 특히, (생물학적) 약물을 투여받은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플(예컨대, 혈액 또는 혈청 샘플)(이러한 샘플은 본원에서 "시험 샘플" 또는 "어세이 샘플"로도 지칭됨)에 대해 수행된 면역어세이에서 비특이적 결합으로 인한 단백질 간섭 및/또는 신호를 감소시키거나 방지하는 데에 이용될 수 있다. 이것의 몇몇 예는 생물학적 약물을 대상체에게 투여하였을 때 약물 침착 및 항체 형성의 특징규명에 이용되는 면역어세이, 예컨대, 유럽 의약청(EMEA)의 인간 사용을 위한 의약품 자문위원회(CHMP)에 의해 발행된 문헌("Guideline on the Clinical Investigation of the Pharmacokinetics of Therapeutic Proteins" (document CHMP/EWP/89249/2004 dated January 27, 2007))에서 언급된 면역어세이이다. 이 문헌의 4 및 5 페이지에는 다음과 같이 기재되어 있다:
"여러 가능한 약점이 확인되어 있고 약물 침착 및 항체 형성의 잘못된 특징규명을 야기할 수 있다. 하기 문제들이 고려되어야 한다[…]:
면역 어세이
약물 어세이:
[…]:
(iii) 내재성 물질에 의한 간섭.
(iv) 분석물에 결합하고 포획 항체와의 상보적인 결합을 억제하는 혈장 성분 또는 항-약물 항체에 의한 간섭."
본 발명은 특히, ISV(특히, 나노바디; 또는 본원에서 더 정의된 바와 같이, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물)를 투여받은 대상체로부터 채취한 생물학적 체액의 시험 샘플/어세이 샘플을 분석하는 데에 이용되는 면역어세이에서 이러한 유형의 간섭을 예측하거나, 감소시키거나 방지하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명은 특히, 약물 침착의 특징규명 및/또는 임의의 ADA(항-약물) 항체의 형성의 확인을 위해 이용되는 면역어세이에서 이러한 유형의 (비특이적) 단백질 간섭을 예측하거나, 감소시키거나 방지하기 위해 이용될 수 있다. 이와 관련하여, 일반적으로 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 "단백질 간섭을 예측하거나, 감소시키거나 방지하는"과 같은 표현이 사용될 때, 이것은 이러한 단백질 간섭 자체를 예측하거나, 감소시키거나 방지하는 것을 포함할 뿐만 아니라, 일반적으로 면역어세이(단백질 간섭과 관련된 (비특이적) 신호가 발생할 수 있는 면역어세이, 예를 들면, ADA 어세이)에서 비특이적 신호의 발생을 예측하거나, 감소시키거나 방지하는 것, 특히 비특이적 신호가 이러한 어세이에서 관찰될 때 통상적으로 (비특이적) 단백질 간섭에 기인하고/하거나, 이러한 간섭과 관련되어 있고/있거나 이러한 간섭의 징후로서 간주되는 비특이적 신호의 발생을 이러한 면역어세이에서 예측하거나, 감소시키거나 방지하는 것도 포함한다는 것을 인지해야 한다. 이와 관련하여, 본원에서 언급된 바와 같이, 본 발명이 임의의 원인, 설명, 가설 또는 기작으로 구체적으로 한정되지 않는다는 것을 일반적으로 인지해야 한다.
한 구체적인 비한정적 양태에서, 본 발명은 ISV(특히, 나노바디; 또는 본원에서 더 정의된 바와 같이, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물)를 투여받은 대상체로부터 채취한 생물학적 체액의 샘플(즉, "시험 샘플")에 대해 수행되는 "항-약물 항체" 또는 "ADA" 어세이에서 이러한 단백질 간섭을 예측하거나, 방지하거나 감소시키는 데에 이용될 수 있다.
또 다른 구체적인 비한정적 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 ISV(특히, 나노바디; 또는 본원에서 더 정의된 바와 같은, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물)에 대한 (임의의) 항-약물 항체의 존재를 검출하고/하거나, 측정하고/하거나 특징규명하는 데에 이용되는 "항-약물 항체" 또는 "ADA" 어세이에서 이러한 단백질 간섭(및/또는 통상적으로 이와 관련된 비특이적 신호)를 예측하거나, 방지하거나 감소시키는 데에 이용될 수 있다. 특히, 본 발명은 생물학적 체액 샘플(즉, "시험 샘플"), 보다 구체적으로 하나 이상의 이러한 ISV 또는 나노바디(또는 본원에서 더 정의된 바와 같은, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물)를 투여받은 대상체로부터 수득된 생물학적 체액 샘플에 대해 수행되는 이러한 "항-약물 항체" 또는 "ADA" 어세이에서 이러한 단백질 간섭을 예측하거나, 방지하거나 감소시키는 데에 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 (임상 시험과 관련하여 및/또는 치료와 관련하여) 샘플을 수득하는 데에 사용된 대상체에게 투여된 ISV 또는 나노바디(또는 본원에서 더 정의된 바와 같은, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물)에 대한 (임의의) 항-약물 항체의 존재를 검출하고/하거나, 측정하고/하거나 특징규명하는 데에 이용되는 이러한 "항-약물 항체" 또는 "ADA" 어세이에서 이러한 단백질 간섭을 예측하거나, 방지하거나 감소시키는 데에 이용될 수 있다.
따라서, 한 구체적인 비한정적 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 이러한 ISV 또는 나노바디(또는 본원에서 더 정의된 바와 같은, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물)를 투여받은 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플(즉, "시험 샘플")에서 이러한 단백질 간섭(및/또는 통상적으로 이와 관련된 비특이적 신호)을 예측하거나, 방지하거나 감소시키는 데에 이용될 수 있고, 이때 상기 샘플은 면역학적 어세이, 예컨대, ADA 어세이에서 사용되기에 적합하고/하거나 이러한 어세이에서 사용되기 위한 것이다. 언급된 바와 같이, 이러한 생물학적 샘플은 (전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하는) 혈액, 안구액, 기관지폐포액/BALF, 뇌척수액, 또는 면역어세이, 특히 ADA 어세이에서 사용되기에 적합한 임의의 다른 적합한 생물학적 체액 또는 샘플일 수 있다.
한 구체적인 비한정적 양태에서, 이러한 시험 샘플은 ISV, 나노바디, ISV-기초 생물학적 약물(본원에 더 정의된 바와 같음), 또는 나노바디-기초 생물학적 약물(본원에서 더 정의된 바와 같음)을 사용한 다회 투여(예를 들면, 10일 이상, 예컨대, 1개월 이상 또는 이보다 긴 기간에 걸친 1회 내지 3회 이상의 별도 투여) 및/또는 만성 치료(즉, 10일 이상, 예컨대, 1개월 이상 동안의 치료)를 받은 대상체로부터 수득될 수 있다. 이러한 ISV, 나노바디, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물은 예를 들면, 치료와 관련하여 또는 임상 시험과 관련하여 상기 대상체에게 투여될 수 있다.
한 구체적인 비한정적 양태에서, 이러한 시험 샘플은 ISV, 나노바디, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물을 투여받은 대상체에서 (본원에서 정의된 바와 같고, 1가 ISV에 비해) 증가된 반감기, 예를 들면, 1일 이상, 바람직하게는 3일 이상, 보다 바람직하게는 7일 이상, 예컨대, 10일 이상의 반감기를 갖는(갖고/갖거나 구비한) ISV, 나노바디, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물을 투여받은 대상체로부터 수득될 수 있다.
예를 들면, 한정 없이, 이러한 ISV, 나노바디, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물은 작용화(functionalization)에 의해, 및/또는 구축물의 반감기를 증가시키는 모이어티 또는 결합 유닛을 구축물 내에 포함시킴으로써 증가된 반감기를 가질 수 있다. 이러한 작용화, 모이어티 또는 결합 유닛의 예는 당업자에게 자명할 것이고, 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같을 수 있고, 예를 들면, 페길화, 혈청 알부민과의 융합, 또는 혈청 단백질, 예컨대, 혈청 알부민에 결합할 수 있는 펩티드 또는 결합 유닛과의 융합을 포함할 수 있다. 이러한 혈청 알부민 결합 펩티드 또는 결합 도메인은 (혈청 알부민 결합 펩티드 또는 결합 도메인을 갖지 않는 동일한 구축물에 비해) 구축물의 반감기를 증가시킬 수 있는 임의의 적합한 혈청 알부민 결합 펩티드 또는 결합 도메인일 수 있고, 특히 본 출원인의 국제 특허출원 공보 제WO 2008/068280호(및 특히, 본 출원인의 국제 특허출원 공보 제WO 2009/127691호 및 비예비공개된 미국 특허출원 제61/301,819호)에 기재된 혈청 알부민 결합 펩티드, 또는 혈청 알부민 결합 ISV(예컨대, 혈청 알부민 결합 나노바디; 예를 들면, Alb-1 또는 Alb-1의 인간화된 버전, 예컨대, Alb-8, 이에 대해서는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 06/122787호 참조)일 수 있다.
따라서, 한 구체적인 비한정적 양태에서, 이러한 생물학적 샘플은 (인간) 혈청 알부민 결합 펩티드 또는 결합 도메인을 포함하는 ISV, 나노바디, ISV-기초 생물학적 약물 또는 나노바디-기초 생물학적 약물을 투여받은 대상체로부터 수득될 수 있다.
이미 전술된 바와 같이, 한 비한정적 양태에서, 본 발명은 일반적으로 주어진 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 면역어세이에서(즉, 상기 ISV가 대상체에게 투여되고, 생물학적 체액 샘플이 상기 대상체로부터 수득되어, 상기 생물학적 체액이 본원에 더 기재된 바와 같이 면역어세이로 분석된 후) (본원에 더 기재된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 것인지(또는 발생시킬 높은 또는 증가된 경향을 갖는지)를 예측하는 데에 이용될 수 있는 방법으로서, 적어도 하기 단계들을 포함하는 면역어세이를 수행하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다:
(i) 상기 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)를, 인간 대상체로부터 수득되고 ISV 또는 나노바디의 C-말단을 인식하고/하거나 이러한 C-말단에 결합하는 그의 능력에 기초하여 선택되고/되거나, 발생되고/되거나 단리된 항체("분석 항체")와 접촉시키는 단계; 및
(ii) 상기 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 상기 면역어세이에서 상기 항체에 의해 결합되는지를 확인하는 단계.
본원에서 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 ISV는 특히, 나노바디, 또는 VH 도메인이거나 VH 도메인을 포함하는 (다른) ISV(즉, 나노바디 제외)일 수 있고, 바람직하게는 나노바디이다.
또한, ISV를 포함하는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드(예컨대, ISV-기초 약물)는 바람직하게는 그의 C-말단에 상기 (또는 하나 이상의) 이러한 ISV를 갖는다. 상기 ISV는 특히, 나노바디, 또는 VH 도메인이거나 VH 도메인을 포함하는 (다른) ISV(즉, 나노바디 제외)일 수 있고, 바람직하게는 나노바디이다.
또한, 본원에 더 기재되어 있는 대안적인 실시양태에서, 인간 대상체로부터 수득된 전술된 항체 대신에 본원에서 "21-4-3"(또는 간략하게 "21-4", VH 및 VL 서열에 대해서는 서열번호 35 및 36 참조)으로서 지칭된 단일클론 항체가 사용될 수 있다. 21-4는 실시예 7에 더 기재된 바와 같이 국제 특허출원 공보 제WO 2006/122825호에 기재된 서열번호 98의 나노바디 구축물로 면역화된 마우스로부터 출발하여 하이브리도마 기술을 이용함으로써 발생되었고, 21-4를 발현하는 하이브리도마 세포주("ABH0015"로 명명됨)는 기탁번호 LMBP-9680-CB 하에 2012년 6월 4일자로 BCCM(벨기에 겐트 소재)에 기탁되었다. 단일클론 21-4는 국제 특허출원 공보 제WO 2006/122825호에 기재된 서열번호 98의 나노바디 구축물의 C-말단을 인식하는 것으로 밝혀져 있고, 상기 C-말단은 빌레브란트 인자(Willebrand Factor)(vWF)에 대해 발생된 나노바디(인간화된 VHH)로 구성된다. 21-4는 처음에는 (혈청) 샘플 중의 단백질 나노바디(특히, 국제 특허출원 공보 제WO 2006/122825호에 기재된 서열번호 98의 나노바디 구축물)를 검출하는 데에 사용될 분석 시약으로서 발생되었고; 놀랍게도, 21-4는 ISV가 (국제 특허출원 공보 제WO 2006/122825호에 기재된 서열번호 98의 나노바디 구축물에 대해 또는 다른 나노바디에 대해 발생된 몇몇 다른 비교가능한 (마우스) 단일클론들보다 훨씬 더 많이) 비특이적 단백질 간섭을 겪을 경향을 갖는지를 예측하기 위해 이용될 수도 있다는 것을 발견하였다.
특히, 21-4와 ISV(또는 그의 C-말단에서 ISV를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 본원에서 언급된 유사한 단백질 또는 폴리펩티드)의 결합의 측정이 실시예 9에 기재된 프로토콜에 따라 측정될 때 (측정된 RU 값을 식 [측정된 RU]/[단백질의 MW] x 106에 따라 단백질에 대한 분자량에 대해 조절한 후) 500 미만의 RU 값을 제공하는 경우, 상기 ISV 또는 단백질은 (하기 실시예에 기재된 데이터 세트에 의해 제공된 신뢰도 내에서) 단백질 간섭을 겪을 경향을 갖지 않을 가능성이 있다는 것을 발견하였다. 상기 식의 목적을 위해, MW는 ISV에 존재하는 모든 아미노산 잔기들의 모든 MW의 합계로서 계산될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 임의의 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드는 바람직하게는 (실시예 9에 기재된 프로토콜에 따라 측정하고, 측정된 RU 값을 상기 기재된 식에 따라 사용된 ISV 또는 단백질의 분자량에 대해 조절한 후) 21-4에 의한 결합에 대해 500 미만의 이러한 RU 값을 갖는다.
따라서, 본 발명의 이 양태는 일반적으로 주어진 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 면역어세이에서(즉, 상기 ISV가 대상체에게 투여되고, 생물학적 체액 샘플이 상기 대상체로부터 수득되어, 상기 생물학적 체액이 본원에 더 기재된 바와 같이 면역어세이로 분석된 후) (본원에 더 기재된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 것인지(또는 발생시킬 높은 또는 증가된 경향을 갖는지)를 예측하는 데에 이용될 수 있는 방법으로서, 적어도 하기 단계들을 포함하는 면역어세이를 수행하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다:
(i) 상기 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)를 단일클론 항체 21-4(즉, "분석 항체"로서 사용됨)와 접촉시키는 단계; 및
(ii) 상기 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 상기 면역어세이에서 상기 단일클론 항체 21-4에 의해 결합되는지를 확인하는 단계.
상기 방법은 특히, 비아코어(BiaCore) 또는 유사한 기법을 이용함으로써, 보다 구체적으로 실시예 9에 기재된 프로토콜을 이용함으로써 수행될 수 있다. 본원에서 언급된 바와 같이, 이 프로토콜에서 ISV 또는 ISV-기초 약물의 결합이 (측정된 RU 값을 식 [측정된 RU]/[단백질의 MW] x 106에 따라 단백질에 대한 분자량에 대해 조절한 후) 500 미만의 RU 값을 보이는 경우, 상기 ISV 또는 ISV-기초 단백질은 인간의 혈액 또는 혈청에 존재하는 임의의 간섭 인자(들)에 의해 결합되지 않을 가능성이 있고/있거나 ADA 어세이에서 (즉, 하기 실험 부분에 기재된 신뢰도 내에서) 비특이적 단백질 간섭을 겪을 경향을 갖지 않을 가능성이 있다.
본원에서 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 ISV는 특히, 나노바디, 또는 VH 도메인이거나 VH 도메인을 포함하는 (다른) ISV(즉, 나노바디 제외)일 수 있고, 바람직하게는 나노바디이다.
또한, ISV를 포함하는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드(예컨대, ISV-기초 약물)는 바람직하게는 그의 C-말단에 상기 (또는 하나 이상의) 이러한 ISV를 갖는다. 상기 ISV는 특히, 나노바디, 또는 VH 도메인이거나 VH 도메인을 포함하는 (다른) ISV(즉, 나노바디 제외)일 수 있고, 바람직하게는 나노바디이다.
또한, 본원에서 언급된 바와 같이, 21-4를 사용하는 상기 방법은 ISV, 또는 ISV를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드가 인간의 혈액 또는 혈청에 존재하는 간섭 인자(들)에 의해 결합되는지(또는 결합되는 경향을 갖는지)를 확인하는 데에 이용될 수도 있다.
또한, 본원에서 언급된 바와 같이, 21-4를 사용하는 상기 방법은 그의 C-말단에서 VH 도메인을 갖는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드(예컨대, 항체 단편 또는 ScFv)가 인간의 혈액 또는 혈청에 존재하는 간섭 인자(들)에 의해 결합될 것인지(또는 결합되는 경향을 갖는지) 및/또는 ADA 어세이에서 단백질 간섭을 겪을 경향을 갖는지를 예측하는 데에도 이용될 수 있다고 예상된다.
21-4 이외에, 21-4의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인(각각 서열번호 35 및 36 참조), 또는 심지어 (다른 적합한 VH 및 VK 골격 내로 적합하게 이식된) 21-4의 CDR 서열만을 함유하는 항체 또는 항체 단편(예컨대, 적합한 Fab 단편)도 본원에 기재된 방법에서 사용될 수 있다고 예상된다.
본원에 더 기재된 바와 같이, 본 발명은 특히, 주어진 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 ADA 어세이인 면역어세이에서 (본원에 더 기재된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 것인지를 예측하는 데에 이용될 수 있다. 상기 ADA 어세이는 예를 들면, 일반적으로 ISV에 대한 ADA를 검출하거나 예측하기 위한 ADA 어세이일 수 있고, 특히 상기 단계 (i) 및 (ii)에서 사용된 ISV에 대한 ADA를 검출하거나 측정하기 위한 ADA 어세이일 수 있다.
한 특정 바람직한 비한정적 양태에서, 본 발명은 주어진 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 이러한 ISV의 사용을 수반하는 면역어세이(특히, ADA 어세이)에서 (본원에 더 기재된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 것인지를 예측하는 데에 이용될 수 있다. 상기 ADA 어세이는 예를 들면, 일반적으로 ISV에 대한 ADA를 검출하거나 예측하기 위한 ADA 어세이일 수 있고, 특히 상기 단계 (i) 및 (ii)에서 사용된 ISV에 대한 ADA를 검출하거나 측정하기 위한 ADA 어세이일 수 있다.
훨씬 더 구체적인 비한정적 양태에서, 본 발명은 주어진 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 이러한 ISV의 사용을 수반하는 면역어세이(특히, ADA 어세이)에서 (본원에 더 기재된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 것인지를 예측하는 데에 이용될 수 있다. 예를 들면, 이러한 면역어세이는 상기 ISV에 대한 임의의 ADA가 시험될 샘플에 존재하는지를 확인하거나 측정하기 위해 수행되는 ADA 어세이(즉, ISV를 수반하는 어세이)일 수 있고, 이때 상기 샘플은 (본원에 더 기재된 바와 같이) 상기 ISV를 투여받은 대상체로부터 수득된 (본원에 더 기재된 바와 같은) 생물학적 체액 샘플이다. 예를 들면, 본원에서 더 언급된 바와 같이, 상기 샘플(즉, "시험 샘플")은 (전혈, 혈청 또는 혈장을 포함하는) 샘플, 안구액, 기관지폐포액/BALF, 뇌척수액 또는 임의의 다른 적합한 생물학적 체액일 수 있고, 특히 면역학적 어세이, 예컨대, ADA 어세이에서 사용되기에 적합하고/하거나 이러한 어세이에서 사용되기 위한 것인 생물학적 샘플일 수 있다.
본원에 더 기재된 바와 같이, 모든 이들 양태들(및 본원에 기재된 본 발명의 추가 양태)에서, 본 발명은 이러한 면역어세이 또는 ADA 어세이에서 이러한 단백질 간섭을 겪을 경향이 없거나 덜한 ISV를 선택하는 데에 이용될 수도 있고/있거나; ISV에 대한 일부 변경(들)이 이러한 면역어세이 또는 ADA 어세이에서 이러한 간섭을 발생시킬 그의 경향을 (전체적으로 또는 부분적으로) 감소시킬 것인지를 시험하는 데에 이용될 수 있는 어세이 또는 시험으로서 이용될 수도 있고/있거나; 이러한 면역어세이 또는 ADA 어세이에서 이러한 단백질 간섭을 발생시킬 그의 경향을 감소시키도록 ISV의 변경 또는 개선을 안내하는 데에 이용될 수 있는 어세이 또는 시험으로서 이용될 수도 있다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 방법의 단계 (i)는 (본원에 더 기재된 바와 같이) 상기 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)를, 인간 대상체로부터 수득되고 ISV 또는 나노바디의 C-말단을 인식하고/하거나 이러한 C-말단에 결합하는 그의 능력에 기초하여 선택/단리된 항체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 방법의 상기 단계 (i)에서, "상기 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)"는 면역어세이에서 항원(즉, 검출될 물질)로서 사용된다. 또한, 상기 단계 (i)에서, "인간 대상체로부터 수득되고 ISV 또는 나노바디의 C-말단을 인식하고/하거나 이러한 C-말단에 결합하는 그의 능력에 기초하여 선택/단리된 항체"는 분석 시약으로서(즉, 다른 항체들이 그들의 유도에 사용된 항원의 존재를 검출하기 위해 면역어세이에서 사용되는 방식과 동일한 방식으로) 사용된다.
이미 언급된 바와 같이, 본원에 기재된 본 발명을 더 잘 이해하기 위해, 단계 (i)에서 ISV가 통상적으로 "항원"(즉, 검출될 화합물)로서 사용될 것이고, "분석 항체"가 분석 물질(즉, 주어진 ISV가 결합하는지 아니면 결합하지 않는지를 검출함으로써, 단백질 간섭을 발생시킬 높은 또는 증가된 위험을 갖는지 아니면 갖지 않는지를 검출하기 위한 수단)로서 사용될 것이라는 것을 인지해야 한다. 예를 들면, 단계 (i)이 ELISA 포맷으로 수행되는 경우, "항체/분석 물질"은 통상적으로 담체(즉, ELISA 플레이트)에 결합될 것이고, ISV는 시험될 샘플에 있을(존재할) 것이다.
대조적으로, ISV에 대한 ADA를 검출하거나 측정하기 위한 ADA 어세이에서 ISV는 "분석 물질"(즉, 임의의 ADA가 존재하는지를 검출하는 데에 사용되는 화합물)로서 사용되고, ADA는 "항원"(즉, 검출될 화합물)이라는 것을 인지해야 한다. 따라서, 이들 어세이들에서, ISV는 담체(예컨대, ELISA 플레이트)에 통상적으로/종종 결합될 것인 반면, ADA는 (존재하는 경우) 어세이로 분석될 샘플에 존재할 것이다.
그러나, 이미 언급된 바와 같이, 본 발명은 "분석 항체(analytical antibody)"가 담체에 결합되어 있는 어세이로 한정되지 않는다는 것을 일반적으로 인지해야 한다. 예를 들면, (예를 들면, 실시예 5에 나타낸 바와 같이) 본 발명에 따른 어세이를 수행하는 대안적인 방식에서, 분석 항체는 가교형성제로서 사용되므로, (플레이트 상에 코팅되어 있는 ISV를 통해 플레이트에 간접적으로 결합되어 있지만) 플레이트에 결합되어 있다기보다는 용액에 존재할 것이다. 그러나, 실시예 5에 기재된 특정 (가교형성) 어세이(경쟁 어세이)에서도, 분석 항체는 여전히 분석 물질로서(즉, 관심 있는 ISV가 결합하는지 아니면 결합하지 않는지를 확인함으로써, 단백질 간섭을 발생시킬 높은 또는 증가된 위험을 갖는지 아니면 갖지 않는지를 확인하기 위해) 사용된다. 당업자는 본원의 추가 개시내용에 기초하여 주어진 ISV가 결합할 수 있는지 아니면 결합할 수 없는지를 확인함으로써 단백질 간섭을 발생시킬 높은 또는 증가된 위험을 갖는지 아니면 갖지 않는지를 확인하기 위해 분석 항체를 분석 물질로서 사용할 수 있는 다른 어세이 포맷을 디자인할 수 있을 것이라는 것도 예상된다.
단계 (i)에서 사용된 "분석 항체"는 다중클론 또는 단일클론 항체일 수 있다.
분석 항체가 다중클론 항체인 경우, 상기 분석 항체는 예를 들면, 인간 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플(예컨대, 혈액, 혈장, B-세포, 또는 다중클론 항체가 적절하게 단리될 수 있는 또 다른 적절한 생물학적 샘플 또는 체액)로부터 수득/정제/단리된 다중클론 항체(제제)일 수 있다. 이것은 예를 들면, 하나 이상의 ISV(예컨대, 단계 (i)에서 사용된 ISV, 그러나 이것은 요구되거나 필수적이지는 않음)를 투여받은 인간 대상체로부터 수득된 적절한 생물학적 샘플일 수 있으나, ISV를 제공받거나 ISV로 치료받은 경험이 없는 인간 대상체로부터 수득된 적절한 생물학적 샘플일 수도 있다(바람직하게는, 이러한 생물학적 샘플이다). 보다 중요한 것은 다중클론 항체가 ISV를 친화성 모이어티로서 보유하는 친화성 매트릭스 또는 컬럼을 사용하는 하나 이상의 친화성 단계(및 다중클론 항체를 수득/정제/단리하기 위한 공지된 그 자체의 하나 이상의 추가 단계)를 포함하는 방법에 의해 상기 생물학적 샘플로부터 수득되었다는 것이다. 예를 들면, 다중클론 항체는 예를 들면, 실시예 2에 기재된 바와 같이 ISV를 보유하는 친화성 컬럼을 사용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 이러한 생물학적 샘플로부터 수득될 수 있다. 이것은 예를 들면, 항원으로서 ISV를 보유하는 친화성 매트릭스를 사용하여 생물학적 샘플로부터 항체를 단리하기 위한 잘 공지된 면역친화성 크로마토그래피 기법을 이용함으로써 수행될 수 있다. 이러한 기법은 당분야에서 일반적으로 공지되어 있고, 이의 적합한 예는 본원의 개시내용에 기초할 때 당업자에게 자명할 것이다.
이러한 다중클론 항체(제제)는 특히 IgG(또는 IgG 분획)일 수 있다.
예를 들면, 상기 다중클론 항체는 C-말단 태그(즉, 그의 C-말단은 아미노산 서열 VTVSS(서열번호 33)로 종결됨)를 함유하지 않는 ISV(특히, 나노바디, 예컨대, VHH, 인간화된 및/또는 서열-최적화된 VHH 또는 낙타화된 VH, 예컨대, 낙타화된 인간 VH)를 친화성 매트릭스에 결합된 항원으로서 사용하는, 인간 대상체로부터 수득된 생물학적 체액 샘플에 대해 수행된, (면역)친화성 크로마토그래피를 포함하는 방법에 의해 수득된 다중클론 항체일 수 있다. 특히, 친화성 매트릭스에 결합된 항원으로서 사용된 ISV는 그의 C-말단이 아미노산 서열 VTVSS(서열번호 33)로 종결되는 인간화된 또는 서열-최적화된 VHH(또는 대안적으로 상응하는 낙타화된 인간 VH)일 수 있다. 한 구체적인 비한정적 양태에서, 친화성 매트릭스에 결합된 항원으로서 사용된 ISV는 이러한 인간화 또는 서열-최적화의 결과로서 위치 14에서 프롤린(P) 잔기를 포함하는 인간화된 또는 서열-최적화된 VHH일 수 있고, 이때 상응하는 "천연" VHH는 위치 14에서 알라닌(A)을 포함한다(즉, 항원으로서 사용된 ISV는 천연적으로 위치 14에서 알라닌을 포함하는 VHH의 인간화된 버전이고, 상기 알라닌 잔기는 인간화 및/또는 서열 최적화의 결과로서 프롤린(P) 잔기로 치환되었다). 항원으로서 사용된 ISV는 예를 들면, 국제 특허출원 공보 제WO 08/020079호 또는 제WO 09/138519호에 일반적으로 기재된 바와 같이 이러한 인간화 또는 서열 최적화의 결과로서 하나 이상의 다른 아미노산 치환도 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 "분석 항체"를 발생시키기/단리하기 위한 항원으로서 사용될 수 있는 ISV의 몇몇 구체적인 예는 서열번호 1 및 2에 제시되어 있다.
다중클론 항체를 수득하는 데에 이용되는 방법은 (면역)친화성 단계 이외에 (친화성 단계 전 또는 후에 수행되는) 생물학적 샘플로부터 다중클론 항체를 단리/정제하기 위한 하나 이상의 추가 단계도 포함할 수 있다. 이러한 단계 및 이들을 수행하는 기법은 당업자에게 자명할 것이다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 단계 (i) 및 (ii)를 포함하는 본원에 더 기재된 방법을 포함하고, 이때 "분석 항체"(즉, 인간 대상체로부터 수득되고 ISV 또는 나노바디의 C-말단을 인식하고/하거나 이러한 C-말단에 결합하는 그의 능력에 기초하여 선택/단리된 항체)는, ISV(바람직하게는 나노바디)가 항원으로서 사용되고 바람직하게는 C-말단 서열로서 아미노산 서열 VTVSS(서열번호 33)를 포함하는 ISV가 항원으로서 사용되고, 보다 바람직하게는 C-말단 서열로서 아미노산 서열 VTVSS(서열번호 33)를 포함하는 인간화된 및/또는 서열 최적화된 나노바디가 항원으로서 사용되고, 훨씬 더 바람직하게는 C-말단 서열로서 아미노산 서열 VTVSS(서열번호 33)를 포함하고 위치 14에서 프롤린 잔기를 포함하는 인간화된 및/또는 서열 최적화된 나노바디, 예컨대, C-말단 서열로서 아미노산 서열 VTVSS(서열번호 33)를 포함하고 (예를 들면, 인간화된 및/또는 서열 최적화된 VHH 내의 상기 위치에서 천연적으로 발생하는 알라닌 잔기를 치환시키기 위한) 상기 인간화 및/또는 서열-최적화의 결과로서 나노바디 내로 도입된 위치 14 상의 프롤린 잔기를 포함하는 나노바디가 항원으로서 사용되는 하나 이상의 친화성 단계(예컨대, 친화성 크로마토그래피, 예컨대, 면역친화성 크로마토그래피의 단계)를 포함하는 방법을 이용함으로써, 인간 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플(이때, 상기 생물학적 샘플은 상기 샘플로부터 항체를 발생시키기/단리하기 위한 방법에서 사용되기에 적합한 샘플임)로부터 수득된다.
상기 "ISV"는 "분석 항체"로서 본 발명에서 사용되기에 적합한 단일클론 항체를 (인간으로부터 수득된 적절한 생물학적 샘플로부터 출발하여) 단리하는 방법에서도 사용될 수 있다.
예를 들면, 이러한 단일클론 항체는 혈액, B-세포, 또는 항체의 단리에 적합한 또 다른 샘플 또는 물질로부터 출발하여 수득될 수 있고, ISV 또는 나노바디(의 C-말단)를 인식하고/하거나 이 나노바디에 결합하는 그의 능력에 기초하여 선택될 수 있다(이때, 스크리닝 및/또는 선택 동안 항원으로서 사용된 ISV(들)는 바람직하게는 이러한 ISV/항원에 대해 기재된 부분을 포함하는 이전 단락들에 기재된 바와 같다). 이러한 스크리닝 및 선택은 예를 들면, 유럽 특허 제0 488 470호, 국제 특허출원 공보 제WO 92/02551호, 유럽 특허 제1 633 787호, 국제 특허출원 공보 제WO 01/55216호, 국제 특허출원 공보 제WO 02/26829호, 국제 특허출원 공보 제WO 04/051268호, 국제 특허출원 공보 제WO 04/102198호 또는 국제 특허출원 공보 제WO 04/106377호에 기재된 B-세포 선택 기법과 본질적으로 동일한 또는 적절하게 유사한 B-세포 선택 및/또는 증폭 기법, 또는 국제 특허출원 공보 제WO 06/079372호에 기재된 나노클론 기법(그러나, 낙타과 B-세포보다는 오히려 인간 B-세포를 사용함)과 유사한 기법을 이용함으로써 임의의 적절한 방식으로 수행될 수 있다.
일단 적절한 항체를 발현하는 하나 이상의 B-세포가 확인/단리되면, 상기 항체는 임의의 적합한 방식으로 단리될 수 있고/있거나, 발현될 수 있고/있거나 생성될 수 있다. 예를 들면, 상기 B-세포(들)는 (선택된 B-세포로부터 출발하여 하이브리도마를 발생시키는 잘 공지된 그 자체의 기법을 이용함으로써) 원하는 항체/항체들을 생성하는 하이브리도마로서 불멸화될 수 있고, 그 후 상기 항체/항체들은 당분야에서 잘 확립되어 있고 다양한 교재 및 매뉴얼에 기재되어 있고 이전 단락에서 언급된 특허 문헌들에도 기재되어 있고/있거나 언급되어 있는 적절한 기법을 이용함으로써 상기 하이브리도마(들)(의 배양 상청액)로부터 단리될 수 있다.
대안적으로, 상기 B-세포(들)는 공지된 그 자체의 B-세포 증폭 기법을 이용함으로써 증폭될 수 있고, 항체/항체들은 상기 증폭된 B-세포(들)(의 배양 상청액)로부터 단리될 수 있다. 이것은 당분야에서 잘 확립되어 있고 다양한 교재 및 매뉴얼에 기재되어 있고 이전 단락에서 언급된 특허 문헌들에도 기재되어 있고/있거나 언급되어 있는 적절한 기법을 이용함으로써 수행될 수 있다.
또 다른 대안에서, 관심 있는 항체/항체들을 코딩하는 DNA는 (예를 들면, 적합한 단일 세포 PCR 클로닝 기법을 이용함으로써) 직접적으로 또는 원하는 B-세포(들)의 적절한 증폭 후 상기 B-세포(들) 또는 다른 적절한 세포로부터 (예를 들면, 증폭에 의해) 수득될 수 있다. 그 다음, 상기 DNA는 적절한 숙주 세포 또는 숙주 유기체 내에서 적절하게 발현되어 원하는 항체/항체들을 제공할 수 있다. 이것은 당분야에서 잘 확립되어 있고 다양한 교재 및 매뉴얼에 기재되어 있고 이전 단락에서 언급된 특허 문헌들에도 기재되어 있고/있거나 언급되어 있는 적절한 기법을 이용함으로써 수행될 수 있다.
(인간 대상체로부터 수득된 적절한 샘플로부터 출발하는) 레퍼토리(repertoire) 클로닝, 및 항원으로서 사용된 ISV에 결합하는 항체에 대한 클로닝된 레퍼토리의 스크리닝을 포함하는 방법에 의해 "분석 항체"로서 사용되기에 적합한 단일클론 항체를 발생시키는 것도 가능하다(이때, 스크리닝 및/또는 선택 동안 항원으로서 사용된 ISV(들)는 바람직하게는 이러한 ISV/항원에 대해 기재된 부분을 포함하는 이전 단락에 기재된 바와 같다). 레퍼토리 클로닝 방법, 및 선택 및 스크리닝을 위해 클로닝된 레퍼토리를 표시하는 다양한 기법(예컨대, 파지 표시, 리보좀 표시 및 효모 표시)은 당업자에게 자명할 것이고, 예를 들면, 유럽 특허 제0 589877호, 유럽 특허 제0 774 511호, 국제 특허출원 공보 제WO 90/14430호 및 유럽 특허 제0368 684호뿐만 아니라 이 주제에 대한 다양한 교재에 기재되어 있다.
일반적으로, (다중클론 또는 단일클론) 분석 항체를 수득하기 위한 출발점으로서 사용되는 생물학적 샘플은 임의의 적합한 인간 대상체로부터 수득된 임의의 적합한(즉, 각각 다중클론 또는 단일클론 항체를 수득하기 위한 출발 물질로서 적합한) 샘플일 수 있다. 한 구체적인 비한정적 양태에서, 이러한 샘플은 예를 들면, 여성, 특히 폐경 후 여성으로부터 수득될 수 있다. 따라서, 한 구체적인 비한정적 양태에서, 상기 단계 (i) 및 (ii)에서 사용된 분석 항체는 폐경 후 여성으로부터 수득된/유래된(또는 폐경 후 여성으로부터 수득된/유래된 항체로부터 유래된) 생물학적 샘플로부터 출발하여 수득된다.
또한, (다중클론 또는 단일클론) 분석 항체를 수득하기 위한 출발점으로서 사용되는 생물학적 샘플은 (예를 들면, 임상 시험의 일부로서 또는 치료적으로) ISV를 이전에 투여받은 대상체로부터 수득될 수 있지만, 바람직하게는 ISV를 이전에 투여받지 않은 대상체로부터 수득된다.
그러나, 본 발명은 사용된 분석 항체/항체들의 공급원으로 특별히 한정되지 않는다는 것을 인지해야 하고, 몇몇 경우 본원에 기재된 기법을 이용하여 상업적으로 입수가능한 인간 혈액 또는 혈장(및 심지어 포유동물 또는 영장류의 다른 종, 예컨대, 개코원숭이 또는 사이노몰구스 원숭이로부터의 혈액, 혈장 또는 B-세포)을 포함하는 다른 공급원으로부터 다른 적합한 분석 항체를 수득하는(발생시키는, 단리하는) 것이 가능한 것으로 입증되었다.
상기 언급된 바와 같이, 단계 (i) 및 (ii)에서 사용된 (다중클론 또는 단일클론) 분석 항체는 ISV 또는 나노바디의 C-말단을 인식하여 이 C-말단에 결합할 수 있어야 하고, 가장 바람직하게는 ISV 또는 나노바디의 C-말단에 결합하는 이 능력에 기초하여 선택되고/되거나 단리된다.
도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, ISV가 VH 또는 VHH 도메인에 기초하거나 VH 또는 VHH 도메인으로부터 유래되는 경우, ISV의 C-말단은 아미노산 서열 VTVSS(서열번호 33)를 포함하고, 따라서 분석 항체는 그의 C-말단에서 아미노산 서열 VTVSS(서열번호 33)를 갖는 임의의 ISV를 인식할 수 있어야 한다. 도 2로부터 더 알 수 있는 바와 같이, 서열 VTVSS(서열번호 33)(내의 아미노산 잔기들 중 적어도 일부)는 다른 잔기들 중에서 위치 14의 아미노산 잔기(및 아미노산 서열 내의 상기 위치에 인접한/가까운 위치, 예컨대, 위치 11, 13 및 15의 아미노산 잔기)도 포함하고 위치 83의 아미노산 잔기(및 아미노산 서열 내의 상기 위치에 인접한/가까운 위치, 예컨대, 위치 82, 82a, 82b 및 84의 아미노산 잔기) 및/또는 위치 108의 아미노산 잔기(및 아미노산 서열 내의 상기 위치에 인접한/가까운 위치, 예컨대, 위치 107의 아미노산 잔기)도 포함할 수 있는 ISV 상의 잠정적 에피토프의 일부이다. 위치 109는 C-말단 VTVSS(서열번호 33) 서열의 제1 V이고, 예를 들면, 위치 110도 단백질 간섭에 영향을 미칠 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이것은 본원에서 "C-말단 영역"으로도 총칭되고, 이 C-말단 영역은 적어도 C-말단 서열 VTVSS(서열번호 33) 및 위치 14의 아미노산 잔기를 포함하고, 위치 83 및 108의 아미노산 잔기, 및 가능하게는 위치 13, 15, 82b, 83, 84 및 107의 아미노산 잔기도 포함할 수 있다.
이미 언급된 바와 같이, 임의의 가설 또는 설명으로 한정되지 않지만, 전체 크기의 4-쇄 단일클론 항체 또는 전체 크기의 중쇄 단독 항체, 예컨대, 낙타과에 존재하는 중쇄 단독 항체에서, VH 또는 VHH 도메인의 C-말단은 항체의 나머지 부분, 즉 통상적인 단일클론 항체의 CH1 영역 또는 낙타과 중쇄 항체의 힌지 영역에 연결됨으로써, 이러한 전체 크기의 항체에서 이러한 단백질 간섭으로부터 차폐될 수 있고/있거나 (통상적인 4-쇄 항체에서) VH/VL 상호작용에 의해 덮여질 수 있으므로, 이 "C-말단 영역"은 통상적으로 용매에 노출되지 않고/않거나 이러한 ISV를 투여받은 사람의 혈액, 혈청 또는 체내에 존재하는 단백질에 대한 상호작용 부위로서 접근될 수 없다. 그러나, ISV 또는 나노바디가 그 자체로(즉, 항체의 임의의 다른 부분에 연결되지 않고) 사용되는 경우, 또는 그의 C-말단에서 ISV 또는 나노바디를 보유하는 ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 사용되는 경우, 이 C-말단 에피토프는 다른 단백질과의 (비특이적) 상호작용에 이용될 수 있고, 임의의 가설 또는 설명으로 한정되지 않지만, 이 C-말단 영역은 비로소 접근가능하게 되어 시험될 "시험 샘플"에 이미 존재하는 하나 이상의 단백질(예를 들면, 하나 이상의 IgG)과의 (비특이적) 단백질 상호작용을 겪을 수 있고, 이것이 면역어세이(특히, ADA 어세이)에서 단백질 간섭 및/또는 비특이적 신호를 야기할 수 있다고 추정된다.
언급된 바와 같이, 본원에 기재된 방법은 이러한 단백질 상호작용을 예측하거나, 감소시키거나 방지하는 데에 이용될 수 있고, 이러한 단백질 상호작용을 발생시킬 (부분적으로 또는 바람직하게는 본질적으로 전체적으로) 감소된 경향을 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물에 제공하도록 상기 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물에 대한 변경을 안내하기 위한 수단으로서 이용될 수도 있다.
이전 단락으로부터 자명할 바와 같이, 임의의 가설 또는 설명으로 한정되지 않지만, "C-말단 영역"에 대한 (일부) 변경이 이러한 비특이적 단백질 상호작용을 겪을 ISV의 경향을 변경할(바람직하게는 감소시킬) 것이 특히 예측되고(본 발명의 교시의 일부임), 이것은 실험적으로 관찰된 결과이기도 하다(예를 들면, 하기 실시예 1C 및 3에 제공된 실험 결과 참조).
이것에 기초하여, 임의의 가설 또는 설명으로 한정되지 않지만, 본 발명은 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물의 C-말단 영역 내에 이 목적으로 도입될 수 있는 일부 변경(이의 (잠재적) 효과는 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 시험될 수 있음)도 교시한다. 또한, 본원의 교시에 기초할 때, 당업자는 이 목적으로 도입될 수 있는 C-말단 영역에 대한 다른 (후보) 변경(이의 (잠재적) 효과는 본원에 기재된 방법을 이용함으로써 시험될 수 있음)을 선택할 수 있거나, 디자인할 수 있거나 제안할 수 있다는 것이 예상된다.
본 발명에서 사용된 분석 항체로 되돌아가건대, 이것은 바람직하게는 ISV의 (상기 정의된 바와 같은) C-말단 영역, 특히 나노바디의 C-말단 영역(그러나, 이것으로 한정되지 않음)을 인식하는 (다중클론 또는 단일클론) 항체이다.
예를 들면, 한 구체적인 비한정적 양태에서, "분석 항체"는 서열의 C-말단이 VTVSS(서열번호 33)로 종결되는 ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역을 인식하지만(그리고/또는 이러한 C-말단 영역에 결합, 특히 특이적으로 결합할 수 있지만), C-말단 VTVSS(서열번호 33)에 연결된 하나 이상의 추가 아미노산 잔기(예컨대, 1개 내지 5개의 아미노산 잔기, 또는 대안적으로 작은 펩티드 서열 또는 심지어 또 다른 폴리펩티드 또는 단백질)가 존재할 때 (상이한 ISV일 수 있으나 바람직하게는 동일한 ISV인) ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역을 인식하지 못하는(그리고/또는 이러한 C-말단 영역에 특이적으로 결합할 수 없는) 다중클론 또는 단일클론 항체일 수 있다.
또 다른 보다 구체적인 비한정적 양태에서, "분석 항체"는 서열의 C-말단이 VTVSS(서열번호 33)로 종결되고 (예를 들면, 인간화, 낙타화 및/또는 서열 최적화의 결과로서) 위치 14의 아미노산이 위치 14에서 천연적으로 발생하지 않는 아미노산, 및/또는 위치 14에서 천연적으로 발생하는 아미노산에 비해 변경되어 있는 아미노산인 ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역을 인식하지만(그리고/또는 이러한 C-말단 영역에 결합, 특히 특이적으로 결합할 수 있지만), C-말단 VTVSS(서열번호 33)에 연결된 하나 이상의 추가 아미노산 잔기(예컨대, 1개 내지 5개의 아미노산 잔기, 또는 대안적으로 작은 펩티드 서열 또는 심지어 또 다른 폴리펩티드 또는 단백질)가 존재하고/하거나, 위치 14의 아미노산이 위치 14에서 천연적으로 발생하는 아미노산(예를 들면, 알라닌, 또는 ISV가 위치 14에서 프롤린을 천연적으로 함유하는 경우 프롤린)인 (상이한 ISV일 수 있으나 바람직하게는 동일한 ISV인) ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역을 인식하지 못하는(그리고/또는 이러한 C-말단 영역에 특이적으로 결합할 수 없는) 다중클론 또는 단일클론 항체일 수 있다.
예를 들면, "분석 항체"는 서열의 C-말단이 VTVSS(서열번호 33)로 종결되고 위치 14의 아미노산이 프롤린인(특히, 위치 14의 아미노산이 예를 들면, 인간화, 낙타화 및/또는 서열 최적화의 결과로서 프롤린으로 변경되어 있는 경우) ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역을 인식하지만(그리고/또는 이러한 C-말단 영역에 결합, 특히 특이적으로 결합할 수 있지만), C-말단 VTVSS(서열번호 33)에 연결된 하나 이상의 추가 아미노산 잔기(예컨대, 1개 내지 5개의 아미노산 잔기, 또는 대안적으로 작은 펩티드 서열 또는 심지어 또 다른 폴리펩티드 또는 단백질)가 존재하고/하거나, 위치 14의 아미노산이 알라닌인 (상이한 ISV일 수 있으나 바람직하게는 동일한 ISV인) ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역을 인식하지 못하는 다중클론 또는 단일클론 항체일 수도 있다.
"분석 항체"는 서열의 C-말단이 VTVSS(서열번호 33)로 종결되고 위치 14의 아미노산이 프롤린인(특히, 프롤린 잔기가 상기 ISV의 상기 위치에서 천연적으로 발생하는 경우) ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역을 인식하지만(그리고/또는 이러한 C-말단 영역에 결합, 특히 특이적으로 결합할 수 있지만), 위치 14가 여전히 (천연적으로 발생된 또는 비변경된) 프롤린인 C-말단 VTVSS(서열번호 33)에 연결된 하나 이상의 추가 아미노산 잔기(예컨대, 1개 내지 5개의 아미노산 잔기, 또는 대안적으로 작은 펩티드 서열 또는 심지어 또 다른 폴리펩티드 또는 단백질)가 존재하는 (상이한 ISV일 수 있으나 바람직하게는 동일한 ISV인) ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역을 인식하지 못하는 다중클론 또는 단일클론 항체일 수도 있다.
"분석 항체"는 예를 들면, 본원에서 "Nb 3.4"(서열번호 5)로 지칭된 ISV의 서열(의 C-말단 영역)을 인식하지만, 본원에서 "Nb 3.1"(서열번호 3)로 지칭된 ISV의 서열을 인식하지 못하고/못하거나 (그리고 바람직하게는) 본원에서 "Nb 3.2"(서열번호 4)로 지칭된 ISV의 서열을 인식하지 못하는 다중클론 또는 단일클론 항체일 수도 있다.
상기 목적을 위해, "분석 항체"가 ISV 또는 나노바디를 인식하는지(아니면 인식하지 못하는지)(및/또는 ISV 또는 나노바디에 (특이적으로) 결합할 수 있는지 아니면 결합할 수 없는지)는 임의의 적절한 결합 어세이(예컨대, 비아코어)를 이용함으로써 확인될 수 있으나, 실시예 3에 기재된 비아코어 어세이, 또는 ADA 어세이, 예컨대, 실시예 5에 기재된 ADA 가교형성/경쟁 어세이를 이용함으로써 확인될 수도 있다(도 1a 내지 1c, 특히 도 1b 또한 참조).
이러한 어세이를 수행하기에 적합한 포맷/기법은 본원의 개시내용에 기초할 때 당업자에게 자명할 것이고, 예를 들면 (한정 없이) 하기 기법들을 포함한다:
- 플레이트에 직접적으로 또는 간접적으로 코팅된 분석 항체를 사용한 비색 어세이, 예컨대, ELISA, 및 단일클론 또는 다중클론 항-ISV 항체를 사용한 결합된 ISV의 검출. 이 셋업에 유용한 다른 대안적 기술은 전기화학발광(MSD 플랫폼), 형광(DELFIA, GYROS), 및 결합된 ISV의 이차 검출에 의존하는 다른 방법을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.
- 직접적으로 또는 간접적으로 고정된 분석 항체를 사용한 표면 플라스몬 공명(예컨대, 비아코어) 또는 다른 실시간 바이오센서 방법(즉, SPR의 사용을 제외한 방법) 및 후속적으로 주입된/투여된 ISV의 결합의 모니터링. 이들 방법들은 결합된 ISV의 추가 검출을 필요로 하지 않는다. 이 유형의 어세이를 수행하기 위한 대표적인 방법은 실시예 3에 기재되어 있다.
- ADA 함유 생물학적 체액 대신에 분석 항체를 사용하여 가교형성 어세이(ADA 어세이)에서 ISV의 경쟁 거동을 분석하는 방법. 가교형성 어세이의 경우, 다양한 기술, 예컨대, ELISA, MSD 플랫폼을 이용할 수 있다. 이러한 유형의 어세이를 수행하기 위한 대표적인 방법은 도 1a 내지 1c에 개략적으로 나타나 있고, 이러한 종류의 어세이의 한 구체적인 예도 실시예 5에 기재되어 있다.
- 분석 항체가 크로마토그래피 매트릭스 상에 고정되어 있는 임의의 크로마토그래피 방법 및 용액으로부터의 ISV의 특이적 포획/단리.
일단 적합한 분석 항체가 본원 또는 실시예들 중 하나에 기재된 방법들 중 한 방법(또는 이 방법과 본질적으로 동등한 방법)을 이용함으로써 수득되면, 상기 분석 항체는 즉, 전술된 단계 (i) 및 (ii)를 수행함으로써 주어진 ISV 또는 나노바디(또는 ISV-기초 또는 나노바디-기초 약물)가 (본원에서 정의된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 것인지(또는 발생시킬 높은 또는 증가된 경향을 갖는지)를 확인하는 데에 사용될 수 있다. 이미 본원에 기재된 바와 같이, 이것은 일반적으로 상기 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물을 분석 항체와 접촉시키는 단계, 및 상기 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 상기 분석 항체에 의해 인식되는지(및/또는 결합되는지, 특히 특이적으로 결합되는지)(특히, 상기 ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역, 또는 상기 ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물의 C-말단을 형성하는 임의의 ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역이 상기 분석 항체에 의해 인식되는지)를 확인하는 단계를 포함한다.
이것은 일반적으로 항원(이 경우, ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물)이 항체에 의해 결합되는지를 확인하기 위한 임의의 적합한 기법을 이용함으로써 수행될 수 있고, 적합한 (면역)어세이 기법은 당업자에게 자명할 것이다. 몇몇 비한정적 예는 적합한 ELISA 기법(예를 들면, 샌드위치 ELISA를 포함함)이고, 이때 (당업자에게 자명할 바와 같이) 사용된 ELISA 포맷에 따라, 분석 항체 또는 ISV가 플레이트 상에 코팅될 수 있거나, 분석 항체 또는 ISV가 검출가능하게 표지될 수 있다. 다른 기법은 예를 들면, 비아코어 기계의 이용을 수반할 수 있다(이때, 분석 항체 또는 ISV는 칩 상에 코팅될 수 있음, 예를 들면, 실시예 3 참조). 또 다른 대안은 (예를 들면, 실시예 5에 예시된 바와 같은) 경쟁 가교형성 어세이일 수 있고, 이때 분석 항체에 의해 결합되는 것으로 공지된 또 다른 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물과 경쟁하는 ISV의 능력(또는 역의 경우도 성립됨)이 시험된다. 주어진 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 분석 항체에 의해 (특이적으로) 결합되거나 인식되는지를 확인하기 위한 이들 기법 및 다른 적절한 기법은 본원의 개시내용에 기초할 때 당업자에게 자명할 것이다.
본 발명(특히, 본 발명에서 사용된 분석 항체)은 주어진 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 면역어세이, 예컨대, ADA 어세이(특히, ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물에 대한 임의의 ADA의 존재를 확인하기 위한 ADA 어세이)로 분석될 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플(즉, "시험 샘플")에 존재할 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 다른 성분과의 (비특이적) 단백질 상호작용을 겪을 수 있는 상호작용 부위(예컨대, C-말단 영역에 또는 이 영역 내에 존재하는 상호작용 부위, 및/또는 그의 일부가 C-말단 영역으로 형성된 상호작용 부위)를 함유하는지 아니면 함유하지 않는지를 확인하는 데에 이용될 수 있다는 것도 본원의 개시내용에 기초할 때 자명할 것이다. 따라서, ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 본 발명에서 사용된 분석 항체에 의해 인식되는 경우, 상기 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 이러한 (접근가능한 또는 노출된) 상호작용 부위를 함유함으로써, 시험 샘플을 시험하기 위한 이러한 면역어세이 또는 ADA 어세이에서 사용될 때 (본원에서 정의된 바와 같은) 이러한 단백질 상호작용을 발생시킬 경향을 가질 가능성이 매우 높다. 당업자에게 자명할 바와 같이, 이것은 가능한 경우 또 다른 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물을 선택/사용함으로써, 또는 이러한 단백질 상호작용에 대한 그의 경향이 실질적으로 감소되거나 본질적으로 제거되도록(이것도 본원에 개시된 방법 및 분석 항체를 사용함으로써 시험될 수 있음) ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물을 변경함으로써 바람직하게는 방지되어야 하는 것이다.
본원의 개시내용에 기초할 때 당업자에게 마찬가지로 자명할 바와 같이, 이러한 변경은 예를 들면, 시험 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 단백질 또는 다른 성분과의 (비특이적) 단백질 상호작용을 겪을 그의 능력이 감소되거나 제거되도록 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물 상의 상호작용 부위에 대한 하나 이상의 변경(예컨대, 아미노산 삽입, 추가, 결실 또는 치환)을 만드는 것을 포함할 수 있다. 이것은 하나 이상의 변경을 도입한 후 본원에 개시된 방법 및 분석 항체를 사용하여 이 능력이 감소되었는지 아니면 감소되지 않았는지를 시험함으로써 한정된 시행착오에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 이러한 변경을 도입할 수 있고, 그 후 분석 항체에 결합하는 변경된 ISV의 능력을 원래의/비변경된 ISV의 능력과 비교할 수 있다. 대안적으로, (예를 들면, 실시예 5에 예시된 바와 같은) 경쟁 가교형성 포맷을 이용하거나 비아코어(예를 들면, 실시예 3 참조)를 이용하여 분석 항체와의 결합에 대해 원래의 ISV와 (여전히) 경쟁하는 변경된 ISV의 능력을 확인할 수 있다.
본 발명이 임의의 가설 또는 설명으로 한정되지 않지만, 하기 실시예에 기재된 실험 증거에 기초하여, 본 발명자들은 이 상호작용 부위가 (본원에서 정의된 바와 같은) C-말단 영역에/근처에 위치할 가능성이 있거나, 상기 상호작용 부위가 C-말단 영역의 일부를 형성한다는 것(또는 C-말단 영역이 이 상호작용 부위의 일부를 형성한다는 것)을 발견하였다. 이것은 예를 들면, ISV가 이러한 단백질 간섭을 발생시킬 경향을 갖고 그의 C-말단에서 아미노산 잔기로서 VTVSS(서열번호 33)를 갖는 경우, 한정된 수(예컨대, 1개 내지 10개, 예를 들면, 1개 내지 5개, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 아미노산 잔기, 또는 대안적으로 태그 또는 또 다른 펩티드, 단백질 또는 다른 모이어티를 이 C-말단에 부착시키는 것이 통상적으로 상기 경향을 실질적으로 감소시키거나 본질적으로 제거할 것이라는 관찰결과에 적어도 부분적으로 기초한다. 몇몇 경우, (임의의 천연 발생 아미노산들, 예컨대, 국제 특허출원 공보 제WO 09/138519호의 64 페이지의 표 A-2에 나열된 아미노산들, 예를 들면, 알라닌, 글리신, 발린, 류신 및 이소류신(그러나, 이들로 한정되지 않음)으로부터 각각 독립적으로 선택될 수 있는 임의의 적합한 아미노산(들) 또는 아미노산들의 조합물일 수 있는) 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기를 C-말단 VTVSS(서열번호 33)에 추가하는 것조차도 상기 경향을 이미 실질적으로 감소시킬 수 있거나 본질적으로 제거할 수 있다는 것을 발견하였다. 이것도 VHH가 위치 14에서 알라닌 잔기(언급된 바와 같이 C-말단 영역의 일부를 형성함; 도 2 참조)를 천연적으로 함유하는 몇몇 경우 천연 발생 VHH가 종종 이러한 단백질 간섭을 발생시킬 경향을 갖지 않는(또는 낮은 경향을 갖는) 반면, 위치 14의 상기 알라닌이 (예를 들면, 인간화 또는 서열-최적화를 목적으로) 프롤린 잔기로 치환되어 있는 상응하는 VHH는 결과적으로 (즉, 위치 14에서 알라닌을 갖는 VHH에 비해) 이러한 단백질 간섭을 발생시킬 증가된 경향을 가질 수 있다는 관찰결과에 부분적으로 기초한다.
한 양태에서, 본 발명은 (예를 들면, 하나 이상의 아미노산 치환, 추가 또는 결실을 도입함으로써) 변경된, 특히 (i) (본원에서 정의된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 실질적으로 감소된 경향(예컨대, 적어도 통계적으로 적절히 감소된 경향)을 갖도록; 및/또는 (ii) 본원에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 실시예 3 또는 5에 기재된 특정 어세이)에서 본원에 기재된 분석 항체(예컨대, 실시예 2에 기재되어 있고 실시예 3 및 5에서 사용된 다중클론 항체)에 의해 결합될 실질적으로 감소된 능력을 갖도록(이들 두 경우에서 바람직하게는 변경을 갖지 않는다는 점을 제외하고 동일한 VHH, 나노바디 또는 ISV와 비교됨) (예컨대, C-말단 영역에서의 하나 이상의 아미노산 치환 또는 추가에 의해) C-말단 영역에서 변경된 VHH, 나노바디(본원에서 정의된 바와 같고, 특히 인간화된 VHH 또는 낙타화된 VH, 예컨대, 낙타화된 인간 VH) 또는 또 다른 ISV(또는 그의 C-말단에서 VHH, 나노바디 또는 다른 ISV를 갖는 ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물)에 관한 것이다.
따라서, 한 양태에서, 본 발명은 VHH 또는 VH 도메인(즉, VH 도메인이거나 VH 도메인으로부터 유래된 ISV)이고/이거나 VHH 또는 VH 도메인(의 아미노산 서열)에 기초하거나 이로부터 유래된 VHH, 나노바디(본원에서 정의된 바와 같고, 특히 인간화된 VHH 또는 낙타화된 VH, 예컨대, 낙타화된 인간 VH) 또는 또 다른 ISV(또는 그의 C-말단에서 VHH, 나노바디 또는 다른 ISV를 갖는 ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물)로서, 그의 C-말단에서 아미노산 서열 VTVSS(X)n(서열번호 34)을 포함하는 VHH, 나노바디 또는 ISV에 관한 것이고, 이때 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5(바람직하게는 1 또는 2, 예컨대, 1)이고, 각각의 X는 독립적으로 선택된 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이다(바람직하게는, 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 류신(L) 및 이소류신(I)으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택되나, 하기 제시된 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 다른 (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기, 또는 전술된 바람직한 아미노산 잔기와 다른 아미노산 잔기(예컨대, 세린, 프롤린, 쓰레오닌 및/또는 라이신)의 조합물도 사용될 수 있다). 바람직하게는, 그의 C-말단에서 아미노산 서열 VTVSS(X)n(서열번호 34)을 갖는 상기 VHH, 나노바디 또는 ISV는 (i) (본원에서 정의된 바와 같은) 단백질 간섭을 발생시킬 실질적으로 감소된 경향(예컨대, 적어도 통계적으로 적절히 감소된 경향)을 갖고/갖거나, (ii) 본원에 기재된 본 발명의 방법(예컨대, 실시예 3 또는 5에 기재된 특정 어세이)에서 본원에 기재된 분석 항체(예컨대, 실시예 2에 기재된 다중클론 항체)에 의해 결합될 실질적으로 감소된 능력을 갖는다(상기 두 경우에서 바람직하게는 그의 C-말단에서 아미노산 서열 VTVSS(서열번호 33)를 갖지 않는다는 점을 제외하고 동일한 VHH, 나노바디 또는 ISV와 비교된다). 예를 들면, 실시예 3에 제시된 어세이 및 데이터를 참조한다.
전술된 VHH, 나노바디 또는 (다른) ISV는 바람직하게는 (실시예 9에 기재된 프로토콜에 따라 측정하고 측정된 RU 값을 분자량에 대해 조절한 후) 21-4에 의한 결합에 대해 500 미만의 RU 값을 갖는다. 본원의 명세서 및 특허청구범위에서 임의의 C-말단 서열 VTVSS(X)n(상기 양태 (a) 내지 (p) 중 임의의 양태를 포함함)을 언급할 때마다, 본 발명의 한 구체적인 양태에 따라 아미노산 X 중 어느 것도 시스테인 잔기가 아니라는 것도 인지해야 한다.
예를 들면, 몇몇 바람직한 양태에서, ISV 또는 ISV 함유 구축물의 C-말단은 (이 C-말단이 VH로부터 유래된 ISV, VHH 또는 나노바디일 때)
(a) VTVSS(X)n(이때, n은 1이고, X는 Ala임);
(b) VTVSS(X)n(이때, n은 2이고, 각각의 X는 Ala임);
(c) VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 각각의 X는 Ala임);
(d) VTVSS(X)n(이때, n은 2이고, 하나 이상의 X는 Ala이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(e) VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 하나 이상의 X는 Ala이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(f) VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 2개 이상의 X는 Ala이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(g) VTVSS(X)n(이때, n은 1이고, X는 Gly임);
(h) VTVSS(X)n(이때, n은 2이고, 각각의 X는 Gly임);
(i) VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 각각의 X는 Gly임);
(j) VTVSS(X)n(이때, n은 2이고, 하나 이상의 X는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(k) VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 하나 이상의 X는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(l) VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 2개 이상의 X는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨);
(m) VTVSS(X)n(이때, n은 2이고, 각각의 X는 Ala 또는 Gly임);
(n) VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 각각의 X는 Ala 또는 Gly임);
(o) VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 하나 이상의 X는 Ala 또는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨); 또는
(p) VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 2개 이상의 X는 Ala 또는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨)일 수 있고, 이때 양태 (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) 및 (n)이 특히 바람직하고, n이 1 또는 2인 양태가 바람직하고, n이 1인 양태가 특히 바람직하다.
본원의 명세서 및 특허청구범위에서 임의의 C-말단 서열 VTVSS(X)n(상기 양태 (a) 내지 (p) 중 임의의 양태를 포함함)을 언급할 때마다, 본 발명의 한 구체적인 양태에 따라 아미노산 X 중 어느 것도 시스테인 잔기가 아니라는 것도 인지해야 한다.
따라서, 한 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 1이고 X는 Ala임)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 2이고 각각의 X는 Ala임)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 2이고, 하나 이상의 X는 Ala이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 하나 이상의 X는 Ala이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 2개 이상의 X는 Ala이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 각각의 X는 Ala임)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 1이고, X는 Gly임)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 2이고, 각각의 X는 Gly임)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 각각의 X는 Gly임)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 2이고, 하나 이상의 X는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 하나 이상의 X는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 2개 이상의 X는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 2이고, 각각의 X는 Ala 또는 Gly임)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 각각의 X는 Ala 또는 Gly임)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 하나 이상의 X는 Ala 또는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 3이고, 2개 이상의 X는 Ala 또는 Gly이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택됨)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)(또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n(이때, n은 1, 2 또는 3이고, 각각의 X는 Ala 또는 Gly임)의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)에 관한 것이다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV), 또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이고, 이때
- n은 1, 2 또는 3이고, 각각의 X는 Ala 또는 Gly이거나;
- n은 2 또는 3이고, 하나를 제외한 모든 X는 Ala 또는 글리신이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택된다.
또 다른 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열 VTVSS(X)n의 C-말단을 갖는 나노바디 또는 (다른) ISV(VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래됨)(나노바디가 바람직함)인 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV), 또는 그의 C-말단에 이러한 ISV(바람직하게는 이러한 나노바디)를 함유하는 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이고, 이때
- n은 1, 2 또는 3이고, 각각의 X는 Ala 또는 Gly이거나;
- n은 2 또는 3이고, 하나 이상의 X는 Ala 또는 글리신이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택되거나;
- n은 2 또는 3이고, 하나를 제외한 모든 X는 Ala 또는 글리신이고, 나머지 아미노산 잔기(들) X는 임의의 천연 발생 아미노산으로부터 독립적으로 선택되지만 바람직하게는 Val, Leu 및/또는 Ile로부터 독립적으로 선택된다.
상기 양태에서, "VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래된 상기 (다른) ISV"는 VH 서열을 포함하거나 VH 서열로부터 유래되고 나노바디가 아닌(즉, VHH, 인간화된 VHH 또는 낙타화된 VH가 아닌) 임의의 ISV를 의미한다. 예를 들면, 이러한 (다른) ISV는 예를 들면, VH-기초 (단일) 도메인 항체, VH-기초 dAb™, 또는 VH-기초 마이크로바디일 수 있다(국제 특허출원 공보 제WO 00/29004호 참조).
본원에서 언급된 ISV들(이전 양태들에서 언급된 ISV들을 포함하나 이들로 한정되지 않음) 중 하나가 C-말단 서열 VTVSS(X)n을 가질 때마다, 본 발명의 한 구체적인 양태에 따라 서열 VTVSS(X)n에서 아미노산 X 중 어느 것도 시스테인 잔기가 아니라는 것을 인지해야 한다.
본원에 더 기재된 바와 같이, 임의의 이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 예를 들면, 임의적으로 하나 이상의 적절한 연결제를 통해 연결된 2개 이상의 ISV들(예컨대, 2개 이상의 나노바디들)을 함유하는 구축물일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 이러한 구축물은 2가, 3가, 4가 또는 5가 구축물(예컨대, 2가, 3가, 4가 또는 5가 나노바디 구축물)일 수 있고, 예를 들면, 이중특이적, 삼중특이적 또는 이중파라토프적 구축물(예를 들면, 반감기 연장을 위해 혈청 알부민(바람직함) 또는 또 다른 혈청 단백질에 결합할 수도 있는 단일특이적, 이중특이적 또는 이중파라토프적 구축물을 포함함)인 2가, 3가, 4가 또는 5가 구축물(예컨대, 2가, 3가, 4가 또는 5가 나노바디 구축물)일 수 있다.
전술된 양태들 각각에 따른 나노바디, ISV 및 단백질/폴리펩티드는 바람직하게는 (실시예 9에 기재된 프로토콜에 따라 측정하고, 측정된 RU 값을 상기 기재된 식에 따라 사용된 ISV 또는 단백질의 분자량에 대해 조절한 후) 21-4에 의한 결합에 대해 500 미만의 RU 값을 갖는다.
본원에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 그들의 C-말단에서 VH 도메인을 갖는 다른 단백질 또는 폴리펩티드(특히, 항체 단편, 예컨대, Fab 단편, 또는 항체 단편에 기초한 다른 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대, ScFv)에 적용될 수도 있다는 것도 예상된다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 그의 C-말단에서 아미노산 서열 VTVSS(X)n(서열번호 34)을 갖는 VH 도메인을 갖는 이러한 단백질 또는 폴리펩티드(예컨대, ScFv)에 관한 것이고, 이때 n은 1 내지 10, 바람직하게는 1 내지 5, 예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 5이고, 각각의 X는 독립적으로 선택된(바람직하게는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 류신(L) 및 이소류신(I)으로 구성된 군으로부터 독립적으로 선택된) (바람직하게는 천연 발생) 아미노산 잔기이다. 몇몇 구체적인 양태에 따라, 상기 C-말단은 상기 (a) 내지 (p) 중 임의의 양태, 바람직하게는 (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) 및 (n) 중 한 양태에 따를 수 있고, 이때 n은 1, 2 또는 3, 바람직하게는 1 또는 2이다.
이러한 단백질 또는 폴리펩티드는 바람직하게는 (실시예 9에 기재된 프로토콜에 따라 측정하고, 측정된 RU 값을 상기 기재된 식에 따라 사용된 ISV 또는 단백질의 분자량에 대해 조절한 후) 21-4에 의한 결합에 대해 500 미만의 RU 값을 갖는다. 또한, 본 발명의 이 양태의 한 구체적인 양태에 따라, C-말단 서열 VTVSS(X)n에서 아미노산 X 중 어느 것도 시스테인 잔기가 아니다.
본 발명은 ISV(바람직하게는 치료 ISV), 또는 하나 이상의 ISV(바람직하게는 하나 이상의 치료 ISV)를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드, 및 하나 이상의 적합한(즉, 약학 용도에 적합한) 담체, 희석제 또는 부형제 및 임의적으로 하나 이상의 추가 활성 물질을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이고, 이때 상기 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 더 기재된 바와 같다(즉, 본원에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태, 특히 이전 페이지들에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태에 따른 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드, 보다 구체적으로 본원에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태에 따른 C-말단/서열을 갖는 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드). 이러한 조성물, 담체, 희석제 또는 부형제는 예를 들면, 나노바디, 또는 하나 이상의 나노바디(이미 언급된 바와 같이, 본 발명에 따라, ISV도 바람직하게는 나노바디임)를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학 조성물에 대해 국제 특허출원 공보 제WO 08/020079호에 기재된 바와 같을 수 있다.
추가로, 본 발명은 인간(예를 들면, 질환의 치료를 필요로 하는 환자)에서 질환의 치료에 사용되기 위한 ISV, 또는 하나 이상의 ISV를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드에 관한 것이고, 이때 상기 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 더 기재된 바와 같다(즉, 본원에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태, 특히 이전 페이지들에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태에 따른 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드, 보다 구체적으로 본원에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태에 따른 C-말단/서열을 갖는 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드).
추가로, 본 발명은 약학 조성물의 제조에 있어서 ISV, 또는 하나 이상의 ISV를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드의 용도에 관한 것이고, 이때 상기 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 더 기재된 바와 같다(즉, 본원에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태, 특히 이전 페이지들에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태에 따른 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드, 보다 구체적으로 본원에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태에 따른 C-말단/서열을 갖는 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드).
추가로, 본 발명은 약학 조성물의 제조에 있어서 ISV, 또는 하나 이상의 ISV를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드를 인간 대상체(예를 들면, 치료를 필요로 하는 환자)에게 투여하는 단계를 포함하는 치료 방법; 또는 하나 이상의 이러한 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 (전술된 바와 같은) 약학 조성물에 관한 것이고, 이때 상기 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드는 본원에 더 기재된 바와 같다(즉, 본원에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태, 특히 이전 페이지들에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태에 따른 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드, 보다 구체적으로 본원에 기재된 양태들 중 하나 이상의 양태에 따른 C-말단/서열을 갖는 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드).
전술된 바와 관련하여, 본원에 기재된 ISV, 단백질 및 폴리펩티드의 치료 용도가 본 발명의 매우 중요한 양태라는 것은 분명한데, 이는 이러한 치료 용도(또는 이러한 치료 용도를 위한 이러한 ISV, 단백질 및 폴리펩티드의 임상 개발)가 상기 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드가 면역원성을 나타내는지(즉, 인간 대상체에게 투여되었을 때 ADA를 발생시킬 수 있는지)를 확인하기 위한 ADA 어세이의 이용을 수반할 수 있기 때문이다. 이와 관련하여, 치료제가 보다 오랜 기간 동안(수주, 수개월 또는 수년 동안) 사용되고/되거나 인간 대상체에서 3일 이상, 예컨대, 1주 이상, 및 최대 10일 또는 그 이상의 반감기(바람직하게는 t1/2-베타로서 표현됨)를 갖는 경우, 특히 가능한 면역원성에 대한 문제가 해결되어야 할 것이라는 것도 분명할 것이다.
따라서, 본 발명의 한 구체적인 양태에 따라, 본원에 기재된 ISV, 단백질, 폴리펩티드 또는 약학 조성물은 인간에서 만성 질환의 치료를 위한 것이고/이거나, 본원에 기재된 이러한 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드는 1주 이상, 바람직하게는 2주 이상, 예컨대, 1개월 이상의 기간 동안 이를 (즉, 치료 활성 용량으로) 투여받은 대상체의 순환계에 (즉, 약리 활성 수준으로) 존재하기 위한 것이고/이거나, 본원에 기재된 이러한 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드는 인간 대상체에서 3일 이상, 예컨대, 1주 이상, 및 최대 10일 또는 그 이상의 반감기(바람직하게는 t1/2-베타로서 표현됨)를 갖고/갖거나, 본원에 기재된 이러한 ISV, 단백질, 폴리펩티드 또는 약학 조성물은 3일 이상, 예컨대, 1주 이상, 예를 들면, 2주 이상 또는 1개월 이상의 기간, 또는 심지어 더 오랜 기간(즉, 3개월 이상, 6개월 이상 또는 1년 이상)에 걸쳐 투여되거나 심지어 만성적으로 투여되는 2회 이상의 용량으로서 인간에게 투여되기 위한 것이다.
추가로, 본 발명은 ISV, 나노바디 또는 ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 단백질 간섭을 발생시킬 경향을 (실질적으로) 감소시키거나 본질적으로 제거하는 방법으로서, 적어도 하기 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다:
- 임의적으로, 적어도 본원에서 언급된 단계 (i) 및 (ii)를 포함하는 방법을 이용하여, ISV, 나노바디 또는 ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 단백질 간섭을 발생시킬 경향을 측정하는 단계;
- 하나 이상의 아미노산 치환, 추가 또는 결실을 상기 ISV 또는 나노바디, 또는 ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물의 C-말단 ISV 또는 나노바디(존재하는 경우)에 도입함으로써, 특히 하나 이상의 아미노산 치환 또는 추가를 상기 ISV 또는 나노바디의 C-말단 영역, 또는 ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물의 C-말단 ISV 또는 나노바디(존재하는 경우)의 C-말단 영역에 도입함으로써, 예를 들면, 임의의 천연 발생 아미노산들(예컨대, 국제 특허출원 공보 제WO 09/138519호의 64 페이지의 표 A-2에 나열된 아미노산, 예를 들면, 알라닌, 글리신, 발린, 류신 및 이소류신, 그러나 이들로 한정되지 않음)로부터 각각 독립적으로 선택된 1개 내지 10개, 예컨대, 1개 내지 5개, 예컨대, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 아미노산 잔기를 서열의 C-말단에 추가함으로써 상기 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물을 변경하는 단계;
- 임의적으로, 이처럼 변경된 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 단백질 간섭을 발생시킬 경향을, 원래의 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 단백질 간섭을 발생시킬 경향과 비교할 수 있게 하는 방식(본원에 기재된 분석 항체와의 결합에 대해 경쟁 어세이에서 이들을 비교하는 것을 포함하나 이것으로 한정되지 않음)으로, 적어도 본원에서 언급된 단계 (i) 및 (ii)를 포함하는 방법을 이용하여, 이처럼 변경된 ISV, 나노바디, ISV-기초 약물 또는 나노바디-기초 약물이 단백질 간섭을 발생시킬 경향을 측정하는 단계. 대안적으로, 21-4의 사용을 수반하는 본원에 기재된 방법이 이용될 수 있다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 언급된 서열들은 하기 표 A(서열번호 1 내지 37) 및 도 9(서열번호 38 내지 89)에 나열되어 있다.
[표 A]
실험 부분 :
실시예 1: 다중클론 분석 항체의 발생
"분석 항체"로서 사용될 수 있는 다중클론 항체(IgG 분획)를 다음과 같이 발생시켰다:
A. 다중클론 항체를 단리하기 위한 적합한 혈장 샘플의 확인
ISV로 치료받은 경험이 없는 건강한 개체들로부터 수득된 20개의 혈장 샘플들을 본 발명에서 분석 항체로서 사용될 수 있는 ISV에 대한 항체의 존재에 대해 평가하였다.
본 실시예에서 처음 사용된 ISV는 서열번호 1이었다. 그 후, 상호작용이 이 특정 ISV에 대해 특이적이지 않지만 다수의 ISV들을 사용할 때 일어날 수 있는 비특이적 단백질-단백질 상호작용이라는 것을 확인하기 위해, 다른 ISV들(하기 단락 C 참조)을 사용하여 하기 어세이를 반복하였다. 서열번호 1에 대한 대안으로서 예를 들면, 서열번호 2도 사용할 수 있다.
이용된 어세이는 항-약물 항체를 포획하기 위해 바이오티닐화된 ISV(서열번호 1의 바이오티닐화된 변이체)를 사용하고 항-약물 항체를 검출하기 위해 설포-태깅된 ISV를 사용하는 ECL(전기화학발광)-기초 가교형성 어세이이었다. 유사한 포맷이 ADA 어세이를 수행하는 데에도 이용된다. 각각 설포-NHS-LC-바이오틴(피어스(Pierce)) 및 설포-태그 NHS-에스테르(MSD)를 제조자의 설명서에 따라 사용하여 일차 아민에 대한 표준 커플링 화학반응을 이용하여 ISV의 바이오티닐화 및 설포-태깅을 수행하였다. 혈장 샘플을 PBS/0.1% 카세인으로 1/5로 희석하고 96웰 폴리프로필렌 플레이트 내에서 37℃ 및 600 RPM에서 30분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 샘플(50 ㎕)을 2 ㎍/㎖ 바이오티닐화된 ISV와 2 ㎍/㎖ 설포-태깅된 ISV(서열번호 1)의 1:1 혼합물(100 ㎕)로 1/3으로 희석하고 실온 및 600 RPM에서 1시간 동안 항온처리하였다. MSD MA® 96웰 표준 스트렙타비딘 플레이트를 실온에서 150 ㎕/웰의 수퍼블록(Superblock)® T20으로 1시간 동안 차단한 후, PBS/0.05% 트윈20(= 세척 완충제)으로 3회 세척하였다. 샘플/1:1 혼합물(바이오티닐화된 ISV 및 설포-태깅된 ISV(서열번호 1))(50.0 ㎕)을 상기 폴리프로필렌 플레이트로부터 MSD 플레이트로 옮기고 실온에서 600 RPM에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 3회 세척한 후 2 x 판독 완충제(MSD)(150 ㎕/웰)를 첨가하고 MSD 기계(섹터 이미저(Sector Imager) 2400 판독기) 상에서 ECL 유닛(ECLU)을 판독하였다. 방법 검증 동안 측정된 스크리닝 컷-점을 이용하여 샘플을 양성 또는 음성으로서 스크리닝하였다. ADA 어세이 개발을 위한 지침서(Shankar, 2008)에 의해 권장된 바와 같이 적절한 통계적 분석을 이용함으로써 ISV로 치료받은 경험이 없는 건강한 개체들로부터 수득된 118개의 개별 혈장 샘플들의 배경 값에 기초하여 상기 스크리닝 컷-점을 계산하였다. 비-파라미터 평가를 이용하였고, 이상치를 배제한 후 컷-오프 값을 95번째 백분위수에 기초하여 계산하였다.
6개의 혈장 샘플들이 양성으로서 명확히 기록되었다: IHuP#002-001-ABL-01, IHuP#002-001-ABL-08, IHuP#002-001-ABL-10, IHuP#002-001-ABL-15, IHuP#002-001-ABL-19 및 IHuP#002-001-ABL-20(표 I).
이들 샘플들을 약물 변위(displacement) 셋업(확인 어세이)에서 더 분석하여 양성 스크리닝 결과의 특이성을 확인하였다(표 II). 따라서, 샘플을 12.5 ㎍/㎖ ISV(서열번호 1)를 함유하는 PBS/0.1% 카세인으로 1/5로 희석하고 96웰 폴리프로필렌 플레이트 내에서 37℃ 및 600 RPM에서 30분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 샘플(50 ㎕)을 2 ㎍/㎖ 바이오티닐화된 ISV와 2 ㎍/㎖ 설포-태깅된 ISV(서열번호 1)의 1:1 혼합물(100 ㎕)로 1/3으로 희석하고 실온 및 600 RPM에서 1시간 동안 항온처리하였다. 그 후, 스크리닝 어세이에 대해 전술된 바와 같이 샘플/1:1 혼합물(바이오티닐화된 ISV 및 설포-태깅된 ISV)(50.0 ㎕)을 상기 폴리프로필렌 플레이트로부터 MSD MA® 96웰 표준 스트렙타비딘 플레이트로 옮기고 실온에서 600 RPM에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 3회 세척한 후 2 x 판독 완충제(MSD)(150 ㎕/웰)를 첨가하고 MSD 기계(섹터 이미저 2400 판독기) 상에서 ECL 유닛(ECLU)을 측정하였다. 방법 검증 동안 측정되었고 ADA 어세이 개발을 위한 지침서(Shankar, 2008)에 의해 권장된 바와 같이 적절한 통계적 분석을 이용함으로써 ISV로 치료받은 경험이 없는 건강한 개체로부터 수득된, 50 ㎍/㎖ ISV(서열번호 1)로 스파이킹된(spiked) 118개의 개체 혈장 샘플의 ECL 반응에 기초하여 계산된 확인 컷-점을 이용하여 샘플을 진정한 양성 샘플로서 확인하였다. 50%의 최소 신호 감소를 99% 신뢰 구간에 기초하여 계산하였다.
ECL-기초 가교형성 어세이에서 양성을 나타내었고 약물 변위 셋업 어세이에서 양성 샘플로서 확인된 샘플을, 친화성 크로마토그래피를 이용하여 다중클론 항체를 발생시키기 위한 공급원으로서 선택하였다.
[표 I]
[표 II]
ISV로 치료받은 경험이 없는 개체로부터 수득된 추가 3개의 혈청 샘플들도 전술된 ECL-기초 가교형성 어세이를 이용하여 평가하였고 약물 변위 셋업 어세이를 이용하여 확인하였다.
2개의 혈청 샘플들이 ECL-기초 가교형성 어세이에서 양성 샘플로서 명확히 기록되었다: IHUS#B09032311A3 및 IHUS#B09032311A20(표 III). 2개의 양성으로 스크리닝된 샘플들을 약물 변위 셋업에서 더 분석하여 양성 스크리닝 결과의 특이성을 확인하였다.
[표 III]
B. 정제된 다중클론 IgG 분획의 발생
단백질 G HP 스핀 트랩 컬럼(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 제조자의 설명서에 따라 사용하여 샘플 IHUS#B09032311A3 및 IHUS#B09032311A20(상기 참조)으로부터 다중클론 IgG를 정제하였다. 요약하건대, 원심분리(100x g에서 30초)로 컬럼으로부터 저장 용액을 제거한 후, 결합 완충제(20 mM 인산나트륨, pH 7.0)를 첨가하여 상기 컬럼을 평형화시켰다. 원심분리 후, 원하는 다중클론 항체를 함유하는 용액을 첨가하였고(600 ㎕ 중의 최대 1 mg), 상기 컬럼을 약하게 혼합하면서 4분 동안 항온처리하였다. 그 다음, 상기 컬럼을 원심분리하고 결합 완충제(600 ㎕)의 연속적 첨가 및 원심분리로 2회 세척하였다. 400 ㎕ 용출 완충제(0.1 M 글리신-HCL, pH 2.7)를 첨가하고 역위로 혼합한 후, 항체를 30 ㎕ 중화 완충제(1 M 트리스-HCL, pH 9.0)에서 원심분리하여 용출하였다.
이로써 수득된 IgG 분획이 ISV(들)와의 비특이적 결합과 관련되어 있다는 것을 확인하기 위해, 정제된 IgG 항체를 전술된 ECL-기초 가교형성 어세이에서 분석하고 상기 단락 A에서 이용된 약물 변위 셋업 어세이를 이용하여 확인하였다. 두 샘플(IHUS#B09032311A3 및 IHUS#B09032311A20)에서, 정제된 IgG 항체는 상기 어세이들에서 양성 신호를 발생시키는 비특이적 결합과 관련되어 있는 것으로 확인되었다(표 III). 이것은 정제된 다중클론 IgG가 "분석 항체"로서 사용될 수 있다는 것을 확인시켜주었고, 상기 IgG는 실시예 3 및 5(의 어세이)에서 그 자체로 사용되었다.
C. 다른 ISV들과의 비특이적 결합
관찰된 단백질 간섭이 단일 ISV에 대해 특이적이고/이거나, ISV들 상의 특정 영역, 에피토프 또는 항원성 결정인자, 및/또는 야생형 ISV들에 대해 만들어진 일부 돌연변이들(예컨대, 하나 이상의 인간화 돌연변이)에 대해 특이적인지를 확인하기 위해, 혈장 샘플 IHUS#B09032311A3, IHUS#B09032311A20 및 IHUS#B09032311A1을 사용하여 ECL-기초 가교형성 어세이 및 약물 변위 셋업 어세이(둘다 상기 단락 A에 기재된 바와 같고, 이때 서열번호 1이 설포-태깅된 ISV로서 사용됨)를 반복하였다. 이들 혈장 샘플들이 상기 단락 B에서 단리된 다중클론 "분석" 항체를 함유하기 때문에, 이것은 상기 다중클론 분석 항체의 특이성, 선택성 및 에피토프 인식에 대한 정보도 제공한다.
8개의 ISV들을 시험하였고(각각 서열번호 23 내지 30 - 상기 표 A 참조), 이들 중 1개의 ISV는 야생형 VHH(서열번호 23)이었고, 나머지 7개의 ISV들은 상이한 인간화 치환을 갖는 야생형 서열의 인간화된 버전이었다. 2개의 ISV들(서열번호 29 및 30)은 C-말단에서 추가 아미노산 잔기(각각 1개 및 3개의 추가 알라닌 잔기)도 함유하였다.
데이터는 표 IV에 제시되어 있다. 임의의 설명 또는 이론으로 한정되고자 하는 것은 아니지만, (본원에서 정의된 바와 같은) C-말단 영역에 대한 변화는 사용된 혈장 샘플이 단백질 간섭을 발생시킬 수 있는 정도에 분명히 강한 영향을 미칠 수 있다는 것을 알 수 있다. 예를 들면, 1개 또는 3개의 아미노산 잔기를 C-말단에 추가하는 것은 단백질 간섭이 발생할 경향을 강하게 감소시킬 수 있다는 것을 알 수 있다(예를 들면, C-말단에 추가된 임의의 아미노산 잔기를 갖지 않는 상응하는 인간화된 변이체인 서열번호 28의 경우 90% 감소에 비해, 서열번호 29 및 30의 경우 샘플 IHUS#B09032311A3을 사용한 ECLU 어세이에서 단지 18% 및 13% 감소). 유사하게, 야생형 서열의 위치 14에서 프롤린 잔기를 도입하는 것도 사용된 혈장 샘플이 단백질 간섭을 발생시킬 수 있는 정도에 분명히 강한 영향을 미칠 수 있다(예를 들면, A14P 치환을 갖는 야생형 서열인 서열번호 24의 경우 91% 감소에 비해, 서열번호 23의 야생형 서열의 경우 샘플 IHUS#B09032311A3을 사용한 ECLU 어세이에서 단지 20% 감소). 마찬가지로 C-말단 영역에 가까운 치환인 K83R 및 Q108L도 단백질 간섭을 발생시킬 경향에 있어서 A14P 치환만큼 많은 증가는 아니지만 약간의 증가를 유발하였고, A14P+K83R+Q108L 치환의 총 조합 효과는 하나 이상의 아미노산 잔기를 C-말단에 추가함으로써 무효화될 수 있다(서열번호 29 및 30에 대한 데이터와 다른 인간화된 변이체에 대한 데이터를 다시 비교).
이 데이터에 기초할 때, 분명히 다중클론 분석 항체가 일반적으로 ISV의 (본원에서 정의된 바와 같은) C-말단 영역을 인식하였다는 결론도 도출되었다. 도 2로부터 알 수 있는 바와 같이, 위치 14(및 보다 낮은 정도의 효과를 나타내는 위치 83 및 108)도 (ISV의 3차원적 삼원 구조를 고려할 때) ISV의 C-말단 영역의 일부를 형성한다.
[표 IV]
실시예 2: 분석 항체의 친화성 정제
본 실시예는 ISV의 C-말단을 인식할 수 있고/있거나 이러한 C-말단에 결합할 수 있는 분석 항체를 인간 대상체의 생물학적 체액으로부터 단리하는 데에 이용될 수 있는 2종의 방법을 기술한다. 상기 항체는 실시예 1에 기재된 시험에 따라 ADA 어세이에서 양성 신호를 유도하는 것을 특징으로 하는 4개의 상이한 혈청 샘플들로부터 단리된다.
혈청 샘플들로부터 출발하여, 이들 프로토콜들 각각은 본원에 기재된 방법에서 분석 항체로서 사용될 수 있는 간섭 인자(들)의 정제된 제제를 제공한다. 이들 방법들은 다른 목적을 위해 상기 간섭 인자(들)를 정제하는 데에도 보다 더 일반적으로 이용될 수 있다(예를 들면, ISV 또는 ISV-구축물과 단일클론 21-4의 결합이 동일한 ISV 또는 ISV-구축물과 간섭 인자의 결합을 예측함으로써 상기 ISV 또는 ISV-구축물이 ADA 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 겪을 경향을 예측한다는 것을 보이기 위해 하기 프로토콜을 이용하여 정제한 간섭 인자(들)를 실시예 8에서도 실험적으로 사용하였다).
실시예 2A: 단백질 A 및 친화성 크로마토그래피를 이용한 정제
제1 단계에서, 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 이용하여 혈청 샘플로부터 IgG 항체 분획을 농축하였다. 이 농축에 이용된 전형적인 컬럼은 하이트랩(HiTrap) 맙셀렉트슈어(MabselectSure) 및 맙셀렉트엑스트라(MabSelectXtra)(지이 헬쓰케어); 및 포로스맙캡쳐(PorosMabCapture) A(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))를 포함하였다. 혈청 샘플로부터의 IgG 항체의 정제를 모든 실험들 전체에 걸쳐 자동화된 유사한 방식으로 수행하였다. 크로마토그래피 실행을 악타(AKTA) 정제기 시스템(지이 헬쓰케어) 상에서 수행하였고 유니콘(UNICORN) 단백질 정제 소프트웨어(지이 헬쓰케어)를 이용하여 실시간으로 기록하였다. 요약하건대, 혈청 샘플을 D-PBS(둘베코스 포스페이트 완충 식염수)로 1:1 희석하고 0.22 ㎛ 필터로 여과한 후, 0.5 ㎖/분의 고정된 유속으로 컬럼 상에 적재하였다. D-PBS를 0.5 ㎖/분의 유속으로 사용하여 5 컬럼 부피에 걸쳐 상기 컬럼을 세척함으로써 비특이적 결합 성분을 제거하였다. 100 mM 글리신 완충제(pH 2.6)를 0.5 ㎖/분의 유속으로 사용하여 산성 용출함으로써 IgG 분획을 용출하였다. 용출 후, 1.5 M 트리스 완충제(pH 8.8)를 사용하여 상기 분획을 중화시켰다. SDS-PAGE를 실행하여 용출물 중의 IgG 항체의 단리를 확인하였다.
제2 단계에서, 4개의 상이한 혈청들로부터 수득된 단백질 A 정제된 IgG 분획을 ISV 커플링된 친화성 컬럼 상에 적용함으로써 간섭 IgG를 더 농축하였다. 보다 구체적으로, 서열번호 1의 서열을 갖는 ISV를 함유하는 컬럼에 결합시킴으로써 간섭 IgG를 더 농축하였다. 이를 위해, CNBr(시아노겐 브로마이드)-커플링 방법을 제조자의 절차에 따라 이용하여 ISV를 세파로스 4 패스트 플로우(Sepharose 4 fast flow)(지이 헬쓰케어)에 공유연결시켰다. 친화성 정제를 모든 실험들 전체에 걸쳐 자동화된 유사한 방식으로 수행하였다. 크로마토그래피 실행을 악타 정제기 시스템 상에서 수행하였고 유니콘으로 기록하였다. 요약하건대, IgG 농축된 샘플(최대 10 ㎖의 적재 부피)을 0.5 ㎖/분의 고정된 유속으로 컬럼 상에 적재하였다. D-PBS를 0.5 ㎖/분의 유속으로 사용하여 5 컬럼 부피에 걸쳐 상기 컬럼을 세척함으로써 비특이적 결합 성분을 제거하였다. 100 mM 글리신 완충제(pH 2.6)를 0.5 ㎖/분의 유속으로 사용하여 산성 용출함으로써 ISV-결합 성분을 용출하였다. 용출 후, 1.5 M 트리스 완충제(pH 8.8)를 사용하여 상기 분획을 중화시켰다. SDS-PAGE를 이용하여 상기 분획을 분석함으로써 용출물 중의 IgG 항체의 단리를 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).
이들 분획들을 풀링하여 추가 분석, 예컨대, 실시예 3에 기재된 분석에 사용하였다.
실시예 2B: 캡쳐셀렉트™ 크로마토그래피를 이용한 정제
대안적으로, 낙타과로부터 유래된 중쇄 단독 가변 도메인(VHH)에 기초한 상업적으로 입수가능한 IgA 결합 친화성 수지 캡쳐셀렉트 hIgA™(BAC BV)를 사용하여 혈장으로부터 간섭 인자(들)를 회수하고 정제하였다. 그 후, 간섭 IgG와 함께 IgA를 함유하는 수집된 "IgA 분획"을 단백질 A 컬럼 상에 적재하여 IgA 분획을 제거하였다. 일반 IgG 정제 조건(실행 완충제: PBS; 용출 완충제: 100 mM 글리신(pH 2.7); 1 M 트리스를 통한 용출 후 중화)에 따라 단백질 A 컬럼을 프로세싱하였다. 95% 초과의 수율로 프로트(Prot) A 용출물로부터 간섭 인자를 회수하였다.
이 방법에 대한 변경에서, 또 다른 캡쳐셀렉트 친화성 수지(캡쳐셀렉트 알파-1 항트립신 수지, 상업적으로 입수가능한 VHH-기초 친화성 수지, 임의의 항체 관련 단백질을 표적화하지 않음)를 사용하였다. 이 수지는 높은 간섭 인자 결합 효능을 제공하였고 선택적 2 단계 용출을 허용하였다: 2.0 M MgCl2을 사용한 중성 pH 용출을 통한 항트립신에 이어서, 산성 단계(단백질 A/G 용출 조건과 유사한 0.1 M 글리신 pH 3.0; 1.5 M 트리스를 사용한 중화)를 통한 간섭 인자 용출. 이 1 단계 정제는 고 간섭 혈장 ㎖ 당 최대 15 ㎍(존재하는 총 IgG의 대략 0.3%)의 간섭 IgG1을 제공하였다. 임의적으로, 중화된 간섭 분획을 탈염시킬 수 있고 D-PBS로 평형화된 크기 배제 컬럼을 통해 더 정제할 수 있다.
실시예 3: 단백질 간섭을 발생시킬 ISV의 경향에 대한 상이한 ISV 치환의 영향
상기 설명에서 언급된 바와 같이, 본 발명은 주어진 ISV가 단백질 간섭을 발생시킬 경향을 갖는지 아니면 갖지 않는지를 평가하는 것을 가능하게 하는 일부 어세이들 및 기법들을 이용가능하게 한다. 이들은 실시예 1에서 이용된 ECL-기초 가교형성 어세이 및 약물 변위 셋업 어세이뿐만 아니라, 이 실시예 3에 기재된 비아코어 어세이 및 하기 추가 실시예에 기재된 가교형성/경쟁 ADA 어세이도 포함한다.
상기 설명에서도 언급된 바와 같이, 이들 어세이들은 특정 변화(예컨대, 아미노산 결실, 치환 또는 추가)가 단백질 간섭을 발생시킬 주어진 ISV의 경향에 영향을 미칠 수 있는지(바람직하게는 감소시킬 수 있는지)를 확인하는 데에도 이용될 수 있다. 이들 변화들 중 일부는 본원의 개시내용, 및 실시예 1 및 본 실시예 3에서 제시된 실험 데이터에 기초할 때 당업자에게 자명할 또는 자명해질 것이다.
실시예 1에서 발생된 데이터에 의해 이미 암시된 바와 같이, ISV의 (본원에서 정의된 바와 같은) C-말단 영역에 있거나 이러한 C-말단 영역에 가까운 일부 돌연변이들은 단백질 간섭을 발생시킬 그의 경향에 (강하게) 영향을 미칠 수 있는 것으로 보인다. 예를 들면, 몇몇 아미노산 잔기(예컨대, 1개 또는 3개의 알라닌 잔기)를 C-말단에 추가하는 것은 단백질 간섭을 발생시킬 ISV의 경향을 강하게 감소시키는 것으로 보이고, 심지어 단백질 간섭을 발생시킬 경향을 증가시키는 것으로 보이는 (예를 들면, C-말단 영역에 있거나 이러한 C-말단 영역에 가까운) 다른 치환(예를 들면, A14P 치환)의 존재를 무력화시킬 수 있는 것으로 보인다.
본 실시예 3에서, 실시예 2에서 발생된 분석 다중클론 항체를 사용하여 상이한 치환을 갖는 관련 ISV들을 비교함으로써 C-말단에서의 다른 치환의 효과 및 C-말단에의 추가 아미노산 추가의 효과 둘다를 조사하였다. 조사된 ISV들 각각과 분석 다중클론 항체 사이의 상호작용의 동역학을, 지이 헬쓰케어의 비아코어™ T100 바이오센서를 이용한 표면 플라스몬 공명(SPR)으로 측정함으로써 분석을 수행하였다. 본 실시예 3에서 시험된 ISV는 서열번호 3 내지 22(상기 표 A 및 하기 표 V 참조)의 ISV이었다.
전형적인 실험에서, 10 mM NaOAc(pH 5.0) 중의 다중클론 항체 용액을 10 ㎍/㎖의 농도로 제조하였다. 그 다음, EDC/NHS 방법(EDC = N-에틸-N'-[3-다이에틸아미노-프로필]-카보다이이미드; NHS = N-하이드록시석신이미드)에 의한 아민 커플링을 제조자의 절차에 따라 이용하여 이 다중클론 항체를 CM5 센서칩 상에 고정시켰다. 고정된 양은 대략 2700 반응 유닛(RU)을 제공하였다. 그 다음, 고정된 농도 500 nM의 ISV를 분 당 45 ㎕의 유속으로 120초 동안 표면 상에 주입하였다. 효율적인 재생 완충제가 확인될 수 없었기 때문에, 해리 시간을 2400초까지 연장하였다. ISV를 블랭크 유동 셀 상에 주입함으로써 수득된 신호를, ISV를 다중클론 항체 결합된 유동 셀 상에 주입함으로써 수득된 신호로부터 차감하였다. 상기 블랭크 유동 셀을 단백질 첨가 없이 다중클론 항체에 대한 유동 셀과 유사한 방식으로 활성화/불활성화시켰다. 또한, 블랭크 주입(HBS-EP + 실행 완충제(HBS = 헤페스(Hepes) 완충 식염수; 지이 헬쓰케어)을 차감하여 가능한 기준 변동을 보정하였다.
C-말단에의 아미노산 잔기의 추가 효과를 조사하기 위해, 실시예 2에 기재된 바와 같이 발생된 분석 다중클론 항체를 사용하여 상이한 추가를 갖는 ISV의 결합을 비교함으로써 1개 또는 2개 알라닌 및 1개, 2개 또는 3개 글리신의 추가의 영향을 조사하였다. 이 목적을 위해 발생되고 시험된 ISV들은 NB 3.4 내지 3.9(서열번호 5 내지 10)이었다.
도 3은 수득된 데이터의 종류의 대표적인 예로서 NB 3.4 내지 3.9와 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여준다. 표 V는 수득된 결과를 요약한다.
[표 V]
C-말단 영역에서 (다른) 치환의 효과를 조사하기 위해, 전술된 바와 동일한 분석 다중클론 항체를 사용하여 상이한 치환들을 함유하는 관련된 ISV들을 비교함으로써 이들 상이한 치환들의 영향을 조사하였다. 분석을 전술된 바와 같이 수행하였다.
시험된 상기 치환들을 함유하는 ISV들은 NB 3.4, NB 4.1 및 4.2(서열번호 17 및 18), 및 NB 6.1, 6.2, 6.4 및 6.5(서열번호 19 내지 22)와 비교된 NB 3.1, 3.2 및 3.4(서열번호 3, 4 및 5), 및 NB 3.10 내지 3.15(서열번호 11 내지 16)이었다.
수득된 데이터의 종류의 대표적인 예로서,
- 도 4는 NB 3.4, 3.11, 3.12 및 3.13과 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여주고;
- 도 5는 NB 3.4, 3.14 및 3.15와 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여주고;
- 도 6은 NB 3.1, 3.2 및 3.4와 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여주고;
- 도 7은 NB 4.1 및 4.2와 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여주고;
- 도 8은 NB 6.1, 6.2, 6.4 및 6.5와 고정된 다중클론 항체의 결합을 보여준다.
표 VI, VII 및 VIII은 수득된 결과를 요약한다.
[표 VI]
[표 VII]
[표 VIII]
임의의 구체적인 가설 또는 설명으로 한정되지 않지만, 상기 제시된 데이터는 ISV의 (본원에서 정의된 바와 같은) C-말단 영역에 대한 (다양한) 치환이 단백질 간섭을 발생시킬 그의 경향을 변경/개선할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4: 도 1의 ADA 어세이를 수행하기 위한 대표적인 프로토콜
본 실시예는 도 1에 개략적으로 나타낸 경쟁/가교형성 ADA 어세이를 수행하는 데에 이용될 수 있는 몇몇 대표적인 비한정적 조건을 제공한다:
- 용액에서 도 1a의 ADA 어세이: 샘플 100% 매트릭스, 30', 37℃, 10 매트릭스 중의 아세트산을 사용한 산 처리, 5', 실온, 예비항온처리/산 중화 샘플: ISV-설포(:트리스) 1:1:1(1:0.9:0.9:0.1), 1시간, 실온; 플레이트 상에서 1시간, 실온; 3회 세척, 판독 완충제 4x
- 용액에서 도 1b의 ADA 어세이: 샘플 20% 매트릭스, 30', 37℃, 예비항온처리 샘플: ISV-설포 1:1:1, 1시간, 실온, 플레이트 상에서 1시간, 실온, 3회 세척, 판독 완충제 2x
- 도 1c의 순차적 ADA 어세이: 포획 ISV-바이오, 1시간, 실온, 3회 세척, 샘플 20% 매트릭스, 15', 실온, 플레이트 상에서: 2시간, 실온, 3회 세척, 검출 ALX-0141-설포, 1시간, 실온, 3회 세척, 판독 완충제 4x
실시예 5: 분석 항체를 사용한 비특이적 단백질 간섭에 대한 ISV의 민감성의 예측
본 실시예는 비특이적 단백질 간섭에 대한 ISV의 민감성을 예측하는 데에 사용될 수 있는 분석 항체를 사용하는 가교형성/경쟁 ADA 어세이를 기술한다.
시험될 ISV를 10 ㎍/㎖의 농도로 희석하고 400 ng/㎖의 분석 항체와 함께 항온처리하고 실시예 2에 따라 정제하고 96웰 폴리프로필렌 플레이트 내에서 37℃ 및 600 rpm에서 항온처리하였다. 그 다음, 샘플(50 ㎕)을 2 ㎍/㎖ 바이오티닐화된 ISV와 2 ㎍/㎖ 설포-태깅된 ISV의 1:1 혼합물(100 ㎕)로 1/3으로 희석하고 실온 및 600 RPM에서 1시간 동안 항온처리하였다. MSD MA® 96웰 표준 스트렙타비딘 플레이트를 실온에서 150 ㎕/웰의 수퍼블록® T20으로 1시간 동안 차단한 후, PBS/0.05% 트윈20(= 세척 완충제)으로 3회 세척하였다. 샘플/1:1 혼합물(바이오티닐화된 ISV 및 설포-태깅된 ISV)(50.0 ㎕)을 상기 폴리프로필렌 플레이트로부터 MSD 플레이트로 옮기고 실온에서 600 RPM에서 1시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 3회 세척한 후 2 x 판독 완충제(MSD)(150 ㎕/웰)를 첨가하고 MSD 기계(섹터 이미저 2400 판독기) 상에서 ECL 유닛(ECLU)을 판독하였다.
이 어세이를 이용하여, 서열번호 23 내지 30의 ISV들을 시험하고 비교하였다. 데이터는 표 IX에 나타나 있다. 이들 데이터는 본 실시예에 기재된 어세이가 단백질 간섭을 발생시킬 ISV의 경향을 예측하는 데에 이용될 수 있다는 것을 보여줄 뿐만 아니라, 발생된 데이터도 C-말단 영역에서의 치환의 효과에 대한 이전 실시예들의 연구결과를 확인시켜준다. 알 수 있는 바와 같이, 전체적으로 인간화된 ISV의 C-말단에서의 3개(보다 적게는 1개) 알라닌 잔기의 추가는 분석 항체의 결합과 경쟁하는 그의 능력을 제거하였다. 야생형 ISV 변이체 상의 위치 14에서 알라닌을 프롤린으로 돌연변이시킨 것은 어세이에서 경쟁자로서의 그의 능력을 분명히 증가시킨 반면(= ISV 변이체를 비특이적 단백질 간섭에 더 민감하게 만듬), 위치 83 및 108을 돌연변이시킨 것은 비특이적 단백질 간섭에 대한 ISV의 민감성에 명확히 영향을 미치지 않았다.
[표 IX]
실시예 6: 항-OX40L 나노바디의 C-말단에의 아미노산의 추가가 그의 OX40L 차단 효능에 미치는 영향
본 실시예는 C-말단 연장이 나노바디의 활성 또는 차단 효능에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
3가 이중특이적 서열 최적화된 항-OX40L 나노바디 Nb 3.16(서열번호 31)의 시험관내 효능을, 그의 C-말단에서 1개의 추가 Ala을 함유하는 상응하는 나노바디 Nb 3.17(서열번호 32)의 효능과 비교하였다.
제1 어세이에서, T-세포 활성화 어세이를 다음과 같이 수행하였다. 피콜 파크 플러스(Ficoll Paque Plus) 시약(지이 헬쓰케어)을 사용하여 건강한 공여자의 버피 코트(레드 크로스(Red Cross), 벨기에 겐트 소재)로부터 PBMC를 단리하였고 RPMI 1640 완전 배지(RPMI 1640 + 글루타맥스(GlutaMAX) + 25 mM 헤페스 + 10% 태아 소 혈청 + 1% 페니실린/스트렙토마이신; 인비트로겐(Invitrogen))를 사용하여 세척하였다. PBMC(1x105개 세포/웰)를 파이토해마글루티닌(PHA-L; 최종 농도 0.6 ㎍/㎖)으로 자극한 후, 1x104개의 hOX40L 발현 CHO 세포(3000 RAD에서 감마 신틸레이터로 조사됨; UZ, 벨기에 겐트 소재) 및 항-OX40L 나노바디 RPMI 1640 완전 배지의 연속 희석물을 첨가하고 CO2 항온처리기 내에서 37℃에서 22시간 동안 항온처리하였다. PBMC에 의한 IL2의 생성을 ELISA에서 측정하였다. 맥시소르프(Maxisorp) 플레이트의 웰을 4℃에서 항-인간 IL2 단일클론 항체(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 밤새 코팅하였다. 코팅된 웰을 세척하고 차단한 후, 세포 상청액의 1/2 희석물을 첨가하였다. 2000 pg/㎖로부터 출발하는 재조합 인간 IL2(비디 바이오사이언시스)의 1/2 연속 희석물을 표준물로서 포함시켰다. 바이오티닐화된 항-인간 IL2 단일클론 항체(비디 바이오사이언시스) 및 HRP 접합된 스트렙타비딘(써모 사이언티픽(Thermo Scientific)) 및 esTMB(에스디티 리전츠(SDT Reagents))를 사용하여 검출을 수행하였다. 반응을 1 N HCl로 중단시키고 450 nm에서 OD를 판독하였다. 예측된 바와 같이, 3가 이중특이적 서열 최적화된 나노바디 Nb 3.17(IC50 = 0.13 nM, 95% CI = 0.098 내지 0.17 nM)의 효능을 Nb 3.16(IC50 = 0.10 nM, 95% CI = 0.071 내지 0.15 nM)의 효능과 비교하였다.
제2 ELISA-기초 경쟁 어세이에서, 나노바디의 연속 희석물(1.5 μM 내지 0.083 pM)을 PBS + 0.1% BSA + 0.01% 트윈-20 중의 100 ng/㎖ 인간 OX40/Fc(알 앤드 디 시스템스(R&D Systems)) 및 10 ng/㎖ 바이오티닐화된 인간 OX40L(알 앤드 디 시스템스; 실시예 1에 기재된 바와 같이 사내 바이오티닐화됨)과 함께 실온에서 밤새 예비항온처리하였다. 그 다음, 샘플을 10 ㎍/㎖ 항-인간 Fc 나노바디(사내 발생됨)로 코팅된 맥시소르프 플레이트 상에서 항온처리하고 PBS + 1% BSA + 0.1% 트윈-20으로 차단하였다. HRP 접합된 스트렙타비딘(써모 사이언티픽) 및 sTMB(에스디티 리전츠)를 사용하여 결합된 인간 OX40/Fc를 검출하였다. 반응을 1 N HCl로 중단시키고 450 nm에서 OD를 판독하였다. 세포-기초 어세이에 따를 때, 3가 이중특이적 서열 최적화된 나노바디 Nb 3.17(IC50 = 0.178 nM, 95% CI = 0.152 내지 0.200 nM)의 효능은 Nb 3.16(IC50 = 0.179 nM, 95% CI = 0.149 내지 0.215 nM)의 효능과 필적할만하였다.
실시예 7: 단일클론 항체 21-4-3의 발생
상이한 마우스 균주들로 구성된 2개의 군(BALB/c 및 NMRI - 각각 3마리의 마우스)을 적절한 항혈청 역가가 수득될 때까지 부스팅하면서 39일의 기간에 걸쳐 (동등한 부피의 항원 및 프로인트 완전 또는 불완전 항원보강제로 구성된 유중수 에멀젼 중의) 국제 특허출원 공보 제WO 2006/122825호의 서열번호 98의 나노바디 구축물로 복강내로 면역화시켰다.
자극된 마우스를 CO2에서 질식시킨 후, 무균 상태에서 비장을 제거하였고, 풀링된 비장의 단일 세포 현탁액을 제조하였다. 비장 세포 및 골수종 세포를 DMEM으로 수회 세척하고 1 ㎖ 50%(중량/부피) PEG 3350(비장 세포 대 SP2/0의 비 3:1)의 존재 하에서 융합시켰다. 융합을 위해 독일 미생물 및 세포 배양물 수집 보관소(DSMZ GmbH, 독일 브라운슈베이그 소재)로부터 입수한 골수종 세포주 SP2/0-Ag14를 사용하였다. 이 세포주는 BALB/c 비장 세포와 골수종 세포주 P3x63Ag8 사이의 하이브리드이다. 이처럼 생성된 하이브리도마를, 20% FCS 및 아미노프테린을 함유하는 CGM(HAT 배지)에 재현탁시키고, 배양보조(feeder) 세포로서 복막 삼출액 세포와 함께 140 ㎕/웰 CGM(20% FCS)을 함유하는 8개의 96웰 조직 배양 평저 플레이트(코닝-스타(Corning-Costar)) 내로 플레이팅하였다(140 ㎕/웰). 상기 플레이트를, 보충제 2-머캡토에탄올, L-글루타민, 안정한 글루타민, HT 및 비필수 아미노산(공급자에 의해 권장된 농도) 및 상이한 농도(10%, 15% 또는 20%)의 FCS와 함께 DMEM을 함유하는 완전 생장 배지(CGM)에서 10일 동안 항온처리하였다. 이 기간 동안 HAT 배지를 세포에 2회 공급하였다. 하이브리도마 세포의 세포 배양 상청액은 통상적으로 1 내지 20 ㎍/㎖의 항체를 함유하였고, 이것을 결합 ELISA에서 시험하여 국제 특허출원 공보 제WO 2006/122825호의 서열번호 98의 나노바디 구축물과의 결합을 확인하였다.
양성 IgG 생성 웰의 세포를 48웰 플레이트의 웰 내로 옮기고 (세포의 생장 특징에 따라) 2일 내지 4일 동안 배양하였다. 비특이적 결합제를 배제하기 위해 ALX081 및 인간/사이노몰구스 IgG에 대한 결합 ELISA를 수행하였다. 국제 특허출원 공보 제WO 2006/122825호의 서열번호 98의 나노바디 구축물에 대해 특이적인 결합제를 발현하는 하이브리도마 세포를, 제한된 희석을 이용하여 2회 클로닝하였다. 융합 및 재스크리닝 후, ALX-081에 대한 항체를 생성하는 7개의 일차 배양물들을 확인하였다. 모든 이들 일차 배양물들은 인간 또는 사이노몰구스 IgG와 교차반응하지 않는 항체를 생성하였다. 상기 일차 배양물들을 (2회) 재클로닝하였다.
클론 21-4(제2 클로닝 후 ALX-081에 대한 항체를 안정하게 생성한 클론들 중 하나)를 "ABH0015"로 명명하여 기탁번호 LMBP-9680-CB 하에 2012년 6월 4일자로 BCCM(Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms; 벨기에 겐트 소재)에 기탁하였다. ABH0015에 의해 생성된 마우스 단일클론 항체는 21-4-3으로 지칭되었고, 21-4-3에 대한 동종형 결정은 IgG1 중쇄 및 카파 경쇄를 보여주었고, 이들을 서열분석하였다(각각 서열번호 35 및 36 참조). 21-4-3은 국제 특허출원 공보 제WO 2006/122825호의 서열번호 98의 나노바디 구축물의 C-말단 영역에 결합하는 것으로 밝혀졌다(데이터는 나타내지 않음).
실시예 8: 21-4와 ISV의 결합은 비특이적 단백질 간섭을 겪는 ISV의 경향을 예측한다.
하기 실시예 9와 함께 본 실시예는 단일클론 항체 21-4와 ISV의 결합이, 주어진 ISV가 (예를 들면, ADA 어세이에서) 비특이적 단백질 간섭을 겪을 경향을 가질 것인지를 (본 실시예에 표시된 확실성 정도 내에서) 예측하는 데에 이용될 수 있다는 것을 입증한다.
본 실시예 8은 특히, 21-4가 주어진 ISV에 대한 일부 제안된 변경(예컨대, 하나 이상의 아미노산 잔기를 ISV의 C-말단에 추가하는 것 및/또는 ISV의 C-말단 영역 내에서 하나 이상의 아미노산을 치환시키는 것)이 비특이적 단백질 간섭을 겪을 상기 ISV의 경향의 감소를 유발할 것인지를 예측하는 데에 이용될 수 있다는 것을 보여준다.
요약하건대, 53개의 상이한 나노바디들 및 나노바디 구축물들(도 9 및 서열번호 38 내지 89 참조)로 구성된 세트를 단일클론 항체 21-4-3에 의한 결합에 대해 시험하였다. 또한, 21-4에 의한 결합과 정제된 간섭 인자에 의한 결합 사이에 임의의 상관관계가 있는지를 알아보기 위해, 동일한 나노바디들 및 나노바디 구축물들을 3명의 상이한 인간 공여자들(본원에서 "공여자 8", "공여자 19" 및 "공여자 30"으로서 지칭됨)로부터 수득된 간섭 인자(들)의 정제된 제제에 의한 결합에 대해 시험하였다.
ISV와 21-4의 결합은 동일한 ISV와 간섭 인자(들)의 결합을 (본원에 기재된 데이터에 의해 제공된 전체 신뢰도 내에서) 예측하는 데에 실제로 이용될 수 있다는 것을 확립하였다.
이를 입증하기 위해, 하기 기재된 실험 데이터에 의해 상세히 나타낸 바와 같이, 53개의 나노바디들 또는 나노바디 구축물들(도 9에 나열된 바와 같음; 서열번호 38 내지 89 참조)과 21-4의 결합을 (하기 기재된 프로토콜에 따라) 비아코어 T100을 이용하여 측정하였고, 동일한 비아코어 기계 및 동일한 프로토콜을 이용하여 측정한 기준 나노바디 또는 구축물(마찬가지로 도 9에 나열되어 있음)의 결합과 비교하였다. 결과는 하기 표 X에 나타나 있다.
[표 X]
시험된 53개의 나노바디들 또는 나노바디 구축물들 각각에 대해, 시험된 나노바디들 또는 나노바디 구축물들이 기준물에 비해 C-말단에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기(단백질 간섭에 대한 이러한 추가의 효과를 시험하기 위해, 특히 상기 간섭을 감소시키기 위해 추가됨) 및/또는 (예를 들면, 기준물에 비해 인간화의 결과로서) C-말단 영역 내의 하나 이상의 돌연변이를 갖도록 상기 기준물을 선택하였다.
결과는 주어진 나노바디의 결합(RU 유닛으로서 측정됨) 대 기준물의 결합(마찬가지로 RU 유닛으로 측정됨)에서의 백분율 감소로서 표현되었다 - 예를 들면, 기준 나노바디의 측정된 결합 수준(RU)이 276이고 주어진 나노바디의 결합 수준(마찬가지로 RU)이 9인 경우, 결합 수준의 감소는 [9 RU/276 RU] x 100% = 3%의 수준인데, 이것은 기준물(100%)에 비해 97%의 감소를 의미한다.
유사하게, 상기 3명의 공여자들 각각의 정제된 간섭 인자(들)와 53개의 나노바디들 또는 나노바디 구축물들 각각의 결합을 동일한 비아코어 기계를 이용하여 측정하였고, 상기 정제된 간섭 인자(들)와 동일한 기준 나노바디 또는 구축물의 결합과 비교하였다. 결과는 상기 간섭 인자와 주어진 나노바디 또는 나노바디 구축물의 결합 대 상기 간섭 인자와 기준물의 결합에서의 백분율 감소로서 유사하게 표현되었다.
하나 이상의 아미노산 잔기가 기준물에 비해 C-말단에 추가되어 있는 본질적으로 모든 나노바디 또는 나노바디 구축물의 경우 간섭 인자(들)의 결합이 급격히 감소되었다는 것을 발견하였다. 이것은 하나 이상의 아미노산 잔기를 ISV의 C-말단(VTVSS)에 추가하는 것이 ADA 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 감소시킬 수 있다는 것을 확인시켜준다. 대다수의 경우 기준물에 비해 (즉, 하나 이상의 아미노산 잔기를 C-말단에 추가하지 않고) C-말단 영역 내에서 치환시키는 것만은 간섭 인자(들)의 결합에 대한 유사한 급격한 영향을 미치지 않았다.
그 다음, 기준물에 비해 21-4에 의한 결합에서의 감소가 기준물에 비해 정제된 간섭 인자의 3개 상이한 제제들 각각에 의한 결합에서의 감소와 임의의 방식으로 상관관계를 갖는지를 확인하기 위해 데이터를 더 분석하였다. 이러한 상관관계는 발견되었다.
예를 들면, 시험된 54개의 나노바디들 또는 나노바디 구축물들 중 36개가 21-4에 의한 결합에 있어서 그들 각각의 기준 서열에 비해 70% 초과의 감소를 보였다(이때, 이들 36개 중 대다수가 몇몇 경우 C-말단 영역 내의 치환과 함께 C-말단에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기를 가졌다). 이들 36개 중 32개는 간섭 인자(들)에 의한 결합에 있어서 기준물에 비해 50% 초과의 감소도 보였다(대다수의 경우, 특히 C-말단에서 추가된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는 나노바디 또는 나노바디 구축물의 경우, 상기 감소는 50%를 훨씬 초과하는 정도, 예컨대, 70% 초과의 또는 심지어 90% 초과의 정도이었다; 표 X에 제공된 데이터 참조). 이것은 36개 경우 중 32개 경우(즉, 89%)에서, 21-4에 의한 결합에 있어서 (기준물 = 100%에 비해) 70% 초과의 감소가 간섭 인자에 의한 결합에 있어서 (동일한 기준물에 비해) 50% 초과의 감소를 예측한다는 것을 입증한다. 명료함을 위해, 각각의 경우, 상기 감소는 100% - [시험된 나노바디로 달성된 감소 수준에 대해 하기 표에 제공된 백분율].
유사하게, 시험된 53개의 나노바디들 또는 나노바디 구축물들 중 33개가 21-4에 의한 결합에 있어서 그들 각각의 기준 서열에 비해 90% 초과의 감소를 보였다(이때, 이들 33개 중 대다수가 몇몇 경우 C-말단 영역 내의 치환과 함께 C-말단에서 하나 이상의 추가 아미노산 잔기를 가졌다). 이들 33개 중 32개는 간섭 인자(들)에 의한 결합에 있어서 그들 각각의 기준 서열에 비해 50% 초과의 감소도 보였다. 이것은 33개 경우 중 32개 경우(즉, 97%)에서, 21-4에 의한 결합에 있어서 (기준물에 비해) 90% 초과의 감소가 간섭 인자에 의한 결합에 있어서 (동일한 기준물에 비해) 50% 초과의 감소를 예측한다는 것을 입증한다.
(21-4에 의한 결합의 70% 초과의 감소에 의해 입증된 바와 같이) 간섭 인자(들)의 결합에 있어서 50% 초과의 이러한 감소는 이러한 간섭 인자(들)가 해당 ISV에 대한 ADA 어세이를 본질적으로 더 이상 간섭하지 않는다는 것을 의미한다는 것도 인지해야 한다: ADA 어세이를 이용한 실험적 확인은 간섭 인자(들)에 의한 결합이 45% 초과의 정도까지 감소될 때, ADA 어세이에 대한 간섭 인자(들)의 존재의 유의한 영향이 관찰될 수 없다는 것을 보여주었다. 이와 관련하여, 이것은 몇몇 경우에서 관찰되는 바와 같이 간섭 인자(들)에 의한 결합이 50%를 훨씬 초과하는 정도(예컨대, 70% 초과의 또는 심지어 90% 초과의 정도)까지 감소될 때 훨씬 더 그러할 것이라는 것도 당업자에게 자명할 것이다(본원에서 제공된 데이터를 다시 참조).
실제로, 21-4에 의한 결합의 45% 초과의 감소가 간섭 인자에 의한 결합의 45% 초과의 감소를 표시하고, 이것은 언급된 바와 같이 간섭 인자(들)가 ADA 어세이를 더 이상 간섭하지 않는다는 것을 의미한다는 것을 발견하였다.
더욱이, 21-4에 의한 결합(에서의 감소)과 간섭 인자에 의한 결합(에서의 감소) 사이의 상관관계에 대한 본원에서 제공된 데이터는 본 발명자들이 21-4에 의한 결합에 대한 절대적인 값을, ISV 또는 ISV-기초 구축물이 ADA 어세이를 간섭할 수 있는 방식으로의 간섭 인자(들)에 의한 결합에 민감하지 않을 것이라는 것을 (본 실시예 8에 기재된 데이터에 의해 제공된 신뢰도 내에서) 예측할 수 있는 값 미만으로 설정할 수 있게 하였다. 하기 실시예 9에 기재된 바와 같이, 이 값은 (실시예 9에 기재된 바와 같이 측정되고 계산된) 500 RU이다.
단일클론 21-4를 상기 실시예 7에서 수득된 하이브리도마의 배양 배지로부터 다음과 같이 정제하였다: 단일클론 항체 21-4-3을 분비하는 하이브리도마 세포를 100 ㎖ 또는 500 ㎖의 부피로 무혈청 배지(CD 하이브리도마, 깁코(Gibco), 8 mM L-글루타민(인비트로겐) 및 1x 콜레스테롤(250x 콜레스테롤 지질 농축물, 깁코)로 보충됨)에서 스피너 플라스크 내에서 배양하였다. 투명해진 상청액을 여과하였고, 뮤린 IgG1을 2 ㎖/분의 감소된 유속으로 단백질 A 컬럼(하이트랩, 맙셀렉트 슈어, 5 ㎖, 지이 헬쓰케어) 상에 포획하였다. 결합된 항체를 0.1 M 시트레이트 완충제(pH 3.0)로 용출하였고, 용출 분획(5 ㎖)을 1 ㎖의 1 M 트리스(pH 9)로 직접 중화하였다. 항체의 순도를 환원 및 비환원 SDS-PAGE로 검증하였다.
공여자 8 및 19의 간섭 인자(들)의 정제된 제제를 본질적으로 실시예 2A에 기재된 바와 같이 친화성 정제로 상기 공여자들의 혈청 샘플로부터 수득하였다. 공여자 30의 간섭 인자(들)를 본질적으로 실시예 2B에 기재된 바와 같이 공여자 30의 혈청 샘플로부터 수득하였다.
21-4와 나노바디 또는 나노바디 구축물 각각의 결합을 측정하기 위해, 실시예 9에 기재된 프로토콜을 이용하였다.
CM5 센서 칩 상에 직접 고정된, 공여자 8, 19 및 30 각각의 간섭 인자를 사용하여 본질적으로 실시예 3에 기재된 바와 같이 비아코어 T100을 이용하여 상기 3명의 공여자들의 간섭 인자와 나노바디 또는 나노바디 구축물 각각의 결합을 측정하였다.
실시예 9: (단일클론 21-4를 사용하여) ISV가 비특이적 단백질 간섭을 겪을 경향을 갖는지를 예측하기 위한 프로토콜
25℃에서 실행 완충제 HBS-EP+와 함께 CM5 T120416 센서 칩을 사용하는 비아코어 T100을 사용하여 결합 측정을 수행하였다. 직접 고정된 mAb 21-4-3 표면이 효율적으로 재생될 수 없다는 것이 발견되었기 때문에 고정된 토끼 항-마우스 IgG를 통해 21-4를 포획하였다. 사용된 항-마우스 IgG는 모든 IgG 서브클래스, IgA 및 IgM(지이 헬쓰케어; Cat#BR-1008-38; Lot#10056316)과 반응하는 다중클론 토끼 항-마우스 IgG 항체이었다. 활성화를 위해 EDC/NHS의 7분 주입을 이용하고 불활성화를 위해 1 M 에탄올아민 HCl(pH 8.5)의 7분 주입을 이용하는 수동 아민 커플링(비아코어, 아민 커플링 키트)을 이용하여 항-마우스 IgG의 고정을 수행하였다. 결합 조건은 표 XI에 나열되어 있다. 단백질의 고정 수준 및 MW에 기초하여, 고정된 항-마우스 IgG에 결합하는 mAb21-4-3에 대한 이론적 Rmax는 (1개의 mAb21-4-3 분자가 1개의 항-마우스 IgG 분자에 결합할 때) 약 13000 RU이었다.
[표 XI]
상기 방식으로 고정된 21-4를 사용하는 결합 실험(비아코어 T100)을 위해 이용된 조건은 표 XII에 제공되어 있다. 항-마우스 IgG 표면은 mAb21-4-3의 포획 및 모든 샘플의 주입 후 성공적으로 재생될 수 있었다(이때, 기준 수준은 각각의 재생 후 한정된 증가를 가졌다).
*[표 XII]
상기 프로토콜을 이용하여 표 X에 기재된 21-4 결합 데이터를 발생시켰다. RU에 대한 절대적인 값이 (측정된 RU 값을 식 ([측정된 RU]/[단백질의 MW] x 106)에 따라 ISV, 단백질 또는 폴리펩티드의 분자량에 대해 조절한 후) 고려되었을 때, 추가된 알라닌 잔기를 갖고 21-4 및 간섭 인자 둘다와의 결합에 있어서 90% 초과의 감소를 보인, 표 X에서 언급된 나노바디 및 나노바디 구축물이 일반적으로 30 RU 내지 400 RU의 RU 값을 제공하였다(이때, 도 9에 나열된 상응하는 기준 나노바디들 또는 폴리펩티드들은 1000 초과, 통상적으로 1500 초과, 종종 2000 초과의 RU 값을 갖는다)는 것을 발견하였다.
이에 기초할 때, 이 어세이에서 500 미만의 (조절된) RU 값은 ADA 어세이를 간섭하는 방식으로 간섭 인자에 의해 (본질적으로) 결합되지 않을 ISV(또는 본원에 기재된 바와 같이 하나 이상의 ISV를 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드)를 명확히 나타내는 것으로 간주되었다.
본원 전체에서 인용된 (참고문헌, 발행된 특허, 공개된 특허출원 및 공동계류 특허출원을 포함하는) 모든 참고문헌들의 전체 내용이 특히, 본원에서 언급된 교시에 대해 본원에 명확히 참고로 도입된다.
BCCM(Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms) LMBP-9680CB 20120604
SEQUENCE LISTING <110> Ablynx N.V. <120> TECHNIQUES FOR PREDICTING, DETECTING AND REDUCING ASPECIFIC PROTEIN INTERFERENCE IN ASSAYS INVOLVING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS <130> P011-08-PCT <160> 89 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 270 <212> PRT <213> - <400> 1 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Lys Ser Ser Gly Asp Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Arg Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Thr Tyr Asp Asn Arg 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 130 135 140 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 145 150 155 160 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met 165 170 175 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala 180 185 190 Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp 195 200 205 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 210 215 220 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu 245 250 255 Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 260 265 270 <210> 2 <211> 385 <212> PRT <213> - <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Tyr Ile Arg Pro Asp Thr Tyr Leu Ser Arg Asp Tyr Arg Lys 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 145 150 155 160 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 165 170 175 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp 180 185 190 Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 195 200 205 Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu 210 215 220 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser 225 230 235 240 Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 260 265 270 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 275 280 285 Ser Ser Tyr Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg 290 295 300 Glu Phe Val Ser Ser Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 305 310 315 320 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 325 330 335 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val 340 345 350 Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Ile Arg Pro Asp Thr Tyr Leu Ser Arg Asp 355 360 365 Tyr Arg Lys Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 370 375 380 Ser 385 <210> 3 <211> 117 <212> PRT <213> - <400> 3 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp 20 25 30 Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Thr Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 140 <212> PRT <213> - <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp 20 25 30 Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Thr Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 115 120 125 Asp Leu Asn Gly Ala Ala His His His His His His 130 135 140 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> - <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp 20 25 30 Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 125 <212> PRT <213> - <400> 6 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala 115 120 125 <210> 7 <211> 124 <212> PRT <213> - <400> 7 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 8 <211> 124 <212> PRT <213> - <400> 8 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 115 120 <210> 9 <211> 125 <212> PRT <213> - <400> 9 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 <210> 10 <211> 126 <212> PRT <213> - <400> 10 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 <210> 11 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 11 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 12 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 12 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 13 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 13 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 14 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 14 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 15 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 16 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 121 <212> PRT <213> - <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn 20 25 30 Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 146 <212> PRT <213> - <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn 20 25 30 Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Arg Asp Trp Asp Phe Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Pro Val 130 135 140 Gly Gly 145 <210> 19 <211> 151 <212> PRT <213> - <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Thr Trp 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr 100 105 110 Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Thr Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 130 135 140 Ala His His His His His His 145 150 <210> 20 <211> 128 <212> PRT <213> - <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Thr Trp 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr 100 105 110 Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Thr Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 21 <211> 151 <212> PRT <213> - <400> 21 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr 100 105 110 Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 130 135 140 Ala His His His His His His 145 150 <210> 22 <211> 128 <212> PRT <213> - <400> 22 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr 100 105 110 Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 23 <211> 134 <212> PRT <213> - <400> 23 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser 50 55 60 Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 85 90 95 Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly 100 105 110 Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Gln Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 24 <211> 134 <212> PRT <213> - <400> 24 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser 50 55 60 Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 85 90 95 Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly 100 105 110 Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Gln Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 25 <211> 134 <212> PRT <213> - <400> 25 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser 50 55 60 Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 85 90 95 Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly 100 105 110 Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Gln Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 26 <211> 134 <212> PRT <213> - <400> 26 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser 50 55 60 Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 85 90 95 Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly 100 105 110 Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 27 <211> 134 <212> PRT <213> - <400> 27 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Arg Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser 50 55 60 Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 85 90 95 Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly 100 105 110 Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 28 <211> 134 <212> PRT <213> - <400> 28 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser 50 55 60 Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 85 90 95 Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly 100 105 110 Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser 130 <210> 29 <211> 137 <212> PRT <213> - <400> 29 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser 50 55 60 Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 85 90 95 Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly 100 105 110 Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala 130 135 <210> 30 <211> 137 <212> PRT <213> - <400> 30 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser 50 55 60 Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile 65 70 75 80 Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 85 90 95 Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly 100 105 110 Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr 115 120 125 Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala 130 135 <210> 31 <211> 367 <212> PRT <213> - <400> 31 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp 20 25 30 Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val 115 120 125 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu 130 135 140 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met 145 150 155 160 Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser 165 170 175 Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 180 185 190 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln 195 200 205 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile 210 215 220 Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 260 265 270 Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg 275 280 285 His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly 290 295 300 Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 305 310 315 320 Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 325 330 335 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr 340 345 350 Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 355 360 365 <210> 32 <211> 368 <212> PRT <213> - <400> 32 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp 20 25 30 Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val 115 120 125 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu 130 135 140 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met 145 150 155 160 Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser 165 170 175 Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 180 185 190 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln 195 200 205 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile 210 215 220 Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 260 265 270 Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg 275 280 285 His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly 290 295 300 Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 305 310 315 320 Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 325 330 335 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr 340 345 350 Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 355 360 365 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> - <400> 33 Val Thr Val Ser Ser 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> - <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X = a group (X)n, in which N = 1-10, preferably 1-5 and X is any amino acid. <400> 34 Val Thr Val Ser Ser Xaa 1 5 <210> 35 <211> 218 <212> PRT <213> - <400> 35 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Ser Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Val Thr Gly Glu Pro Ala Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Leu Ile His Phe Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu 100 105 110 Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala 115 120 125 Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu 130 135 140 Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160 Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp 165 170 175 Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro 180 185 190 Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys 210 215 <210> 36 <211> 214 <212> PRT <213> - <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile His Asn Phe 20 25 30 Ile Ser Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Lys Val Pro Arg Leu Ile Ile 35 40 45 His Asp Thr Ser Thr Leu Gln Pro Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Arg Asp Tyr Ser Phe Ser Ile Thr Asn Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu His Tyr Asp Asn Leu Leu Arg 85 90 95 Ser Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala 100 105 110 Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly 115 120 125 Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile 130 135 140 Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu 145 150 155 160 Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr 180 185 190 Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 <210> 37 <211> 122 <212> PRT <213> - <400> 37 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 38 <211> 271 <212> PRT <213> - <400> 38 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Lys Ser Ser Gly Asp Ser Thr Arg Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Arg Val Ser Arg Thr Gly Leu Tyr Thr Tyr Asp Asn Arg 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val 130 135 140 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu 145 150 155 160 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Asn Tyr Ala Met 165 170 175 Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala 180 185 190 Ile Thr Arg Ser Gly Val Arg Ser Gly Val Ser Ala Ile Tyr Gly Asp 195 200 205 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 210 215 220 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Ala Ala Ser Ala Ile Gly Ser Gly Ala Leu Arg Arg Phe Glu 245 250 255 Tyr Asp Tyr Ser Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 260 265 270 <210> 39 <211> 386 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanobody or Nanobody construct <400> 39 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Tyr Ile Arg Pro Asp Thr Tyr Leu Ser Arg Asp Tyr Arg Lys 100 105 110 Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser 145 150 155 160 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 165 170 175 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp 180 185 190 Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp 195 200 205 Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu 210 215 220 Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser 225 230 235 240 Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 260 265 270 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 275 280 285 Ser Ser Tyr Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg 290 295 300 Glu Phe Val Ser Ser Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 305 310 315 320 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn 325 330 335 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val 340 345 350 Tyr Tyr Cys Ala Ala Tyr Ile Arg Pro Asp Thr Tyr Leu Ser Arg Asp 355 360 365 Tyr Arg Lys Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 370 375 380 Ser Ala 385 <210> 40 <211> 364 <212> PRT <213> - <400> 40 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu 115 120 125 Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu 130 135 140 Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp 145 150 155 160 Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser 165 170 175 Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190 Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn 195 200 205 Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly 210 215 220 Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 225 230 235 240 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala 260 265 270 Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala 275 280 285 Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Glu Ile Asn Thr Asn Gly Leu 290 295 300 Ile Thr Lys Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg 305 310 315 320 Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro 325 330 335 Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Pro Ser Gly Phe Asn 340 345 350 Arg Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 355 360 <210> 41 <211> 246 <212> PRT <213> - <400> 41 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn 20 25 30 Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 130 135 140 Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 145 150 155 160 Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 165 170 175 Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp 180 185 190 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr 195 200 205 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 210 215 220 Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser Ala 245 <210> 42 <211> 260 <212> PRT <213> - <400> 42 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn 20 25 30 Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro 100 105 110 Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 130 135 140 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe 145 150 155 160 Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg 165 170 175 Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro 180 185 190 Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg 195 200 205 Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 210 215 220 Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg 225 230 235 240 Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr 245 250 255 Val Ser Ser Ala 260 <210> 43 <211> 250 <212> PRT <213> - <400> 43 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Leu Asp Tyr Tyr 20 25 30 Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Leu Cys Ile Asp Ala Ser Asp Asp Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Pro Ile Gly Leu Ser Ser Ser Cys Leu Leu Glu Tyr Asp Tyr 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 145 150 155 160 Phe Thr Phe Arg Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 165 170 175 Lys Gly Pro Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 180 185 190 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 195 200 205 Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 225 230 235 240 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 245 250 <210> 44 <211> 368 <212> PRT <213> - <400> 44 Asp Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp 20 25 30 Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val 115 120 125 Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu 130 135 140 Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met 145 150 155 160 Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser 165 170 175 Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 180 185 190 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln 195 200 205 Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile 210 215 220 Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu 245 250 255 Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 260 265 270 Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg 275 280 285 His Arg Pro Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly 290 295 300 Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 305 310 315 320 Ile Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 325 330 335 Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr 340 345 350 Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 355 360 365 <210> 45 <211> 117 <212> PRT <213> - <400> 45 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp 20 25 30 Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Thr Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 143 <212> PRT <213> - <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Gly Arg Leu Asp 20 25 30 Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Thr Gly Glu Pro Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr Gly Asp Phe Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Asn Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn 85 90 95 Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp Gly Gln Gly Thr Gln 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala 115 120 125 Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 130 135 140 <210> 47 <211> 146 <212> PRT <213> - <400> 47 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Val Phe Lys Ile Asn 20 25 30 Val Met Ala Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val 35 40 45 Ala Gly Ile Ile Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Phe Ile Thr Thr Glu Ser Asp Tyr Asp Leu Gly Arg Arg Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Arg Asp Trp Asp Phe Asp Val Phe Gly Gly Gly Thr Pro Val 130 135 140 Gly Gly 145 <210> 48 <211> 151 <212> PRT <213> - <400> 48 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ile Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Thr Trp 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr 100 105 110 Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Thr Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 130 135 140 Ala His His His His His His 145 150 <210> 49 <211> 151 <212> PRT <213> - <400> 49 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Pro Phe Ser Thr Lys 20 25 30 Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Gly Gly Thr Ser Arg Tyr Tyr Gly Asp Phe Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Gly Glu Arg Ser Thr Tyr Ile Gly Ser Asn Tyr Tyr Arg Thr 100 105 110 Asn Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 130 135 140 Ala His His His His His His 145 150 <210> 50 <211> 121 <212> PRT <213> - <400> 50 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 51 <211> 121 <212> PRT <213> - <400> 51 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 121 <212> PRT <213> - <400> 52 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Ser 115 120 <210> 53 <211> 121 <212> PRT <213> - <400> 53 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly 115 120 <210> 54 <211> 121 <212> PRT <213> - <400> 54 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gly Gly 115 120 <210> 55 <211> 122 <212> PRT <213> - <400> 55 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 56 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 56 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 <210> 57 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 57 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 <210> 58 <211> 124 <212> PRT <213> - <400> 58 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 <210> 59 <211> 125 <212> PRT <213> - <400> 59 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 115 120 125 <210> 60 <211> 124 <212> PRT <213> - <400> 60 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Pro 115 120 <210> 61 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 61 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Pro 115 120 <210> 62 <211> 124 <212> PRT <213> - <400> 62 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Pro Thr 115 120 <210> 63 <211> 122 <212> PRT <213> - <400> 63 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Trp 115 120 <210> 64 <211> 122 <212> PRT <213> - <400> 64 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Asn Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 20 25 30 Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 35 40 45 Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Gly Ser Asp Thr 50 55 60 Leu Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp 85 90 95 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Gly Gly Ser Leu Ser Arg Ser Ser 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Leu 115 120 <210> 65 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 65 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 66 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 66 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 67 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 68 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 68 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 69 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 70 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser 115 120 <210> 71 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 71 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly 115 120 <210> 72 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 72 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Gly 115 120 <210> 73 <211> 124 <212> PRT <213> - <400> 73 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Gly Gly 115 120 <210> 74 <211> 124 <212> PRT <213> - <400> 74 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly 115 120 <210> 75 <211> 125 <212> PRT <213> - <400> 75 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala 115 120 125 <210> 76 <211> 126 <212> PRT <213> - <400> 76 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly 115 120 125 <210> 77 <211> 124 <212> PRT <213> - <400> 77 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 78 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 78 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 79 <211> 124 <212> PRT <213> - <400> 79 His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu 1 5 10 15 Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser 20 25 30 Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly Glu 35 40 45 Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn Tyr 50 55 60 Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly 115 120 <210> 80 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 80 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gly Gly 115 120 <210> 81 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 81 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Val Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 82 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 82 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 83 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 83 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Ala 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 84 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 84 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Ser 115 120 <210> 85 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 85 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gly Gly 115 120 <210> 86 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 86 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser 115 120 <210> 87 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 87 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Gly Gly 115 120 <210> 88 <211> 124 <212> PRT <213> - <400> 88 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 89 <211> 123 <212> PRT <213> - <400> 89 His His His His His His Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg 20 25 30 Ser Ile Gly Arg Leu Asp Arg Met Gly Trp Tyr Arg His Arg Pro Gly 35 40 45 Glu Pro Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Gly Gly Ser Ser Ile Asn 50 55 60 Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ser 65 70 75 80 Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Asn Phe Asn Lys Tyr Val Thr Ser Arg Asp Thr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Gln Val Gly Gly 115 120

Claims (9)

  1. 중쇄 가변 도메인을 포함하거나, 이에 기초하고/하거나 유래한 것인, 면역글로불린 단일 가변 도메인(ISV)으로서,
    상기 ISV는, VH 도메인, VHH 도메인, 인간화된 VHH 도메인, 서열 최적화된 VHH 도메인 또는 낙타화된 VH 도메인으로부터 선택되고,
    상기 ISV는, C-말단에 아미노산 서열 VTVSS(X)n(서열 번호 34)을 포함하고,
    n이 1, 2, 3, 4 또는 5이고,
    각각의 X는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기인, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  2. 제1항에 있어서,
    n이 1, 4 또는 5이고, 각각의 X는 알라닌(A), 글리신(G), 발린(V), 류신(L) 또는 이소류신(I)으로부터 독립적으로 선택되는 아미노산 잔기인, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 1가 ISV인, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, X는 알라닌인, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, n이 1 또는 3이고, X는 알라닌인, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, n이 1이고, X는 알라닌인, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, C-말단에 아미노산 잔기로서 VTVSS(서열 번호 33)를 갖는 동일한 ISV 구축물과 비교하여 단백질 간섭을 일으키는 경향이 감소되거나 제거된, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료에 사용하기 위한, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료에 사용하기 위한 ISV로서, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 또는 기타 인터루킨과 같은 치료 관련 표적에 대해 사용하기 위한, 면역글로불린 단일 가변 도메인.
KR1020247007180A 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법 KR20240033183A (ko)

Applications Claiming Priority (14)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161500464P 2011-06-23 2011-06-23
US201161500360P 2011-06-23 2011-06-23
US61/500,464 2011-06-23
US61/500,360 2011-06-23
US201161541368P 2011-09-30 2011-09-30
PCT/EP2011/067132 WO2012042026A1 (en) 2010-09-30 2011-09-30 Biological materials related to c-met
EPPCT/EP2011/67132 2011-09-30
US61/541,368 2011-09-30
US13/435,567 US8703135B2 (en) 2010-09-30 2012-03-30 Biological materials related to c-Met
US13/435,567 2012-03-30
EPPCT/EP2012/61304 2012-06-14
PCT/EP2012/061304 WO2012175400A1 (en) 2011-06-23 2012-06-14 Serum albumin binding proteins
KR1020227026895A KR20220114104A (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
PCT/EP2012/062251 WO2012175741A2 (en) 2011-06-23 2012-06-25 Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227026895A Division KR20220114104A (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20240033183A true KR20240033183A (ko) 2024-03-12

Family

ID=47423024

Family Applications (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227026895A KR20220114104A (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020187020494A KR102025035B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020197008750A KR102240318B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020217011601A KR102430693B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020197026729A KR102246924B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020137035011A KR101965462B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020247007180A KR20240033183A (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법

Family Applications Before (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227026895A KR20220114104A (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020187020494A KR102025035B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020197008750A KR102240318B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020217011601A KR102430693B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020197026729A KR102246924B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
KR1020137035011A KR101965462B1 (ko) 2011-06-23 2012-06-25 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법

Country Status (22)

Country Link
US (11) US20180009888A9 (ko)
EP (1) EP2723769B2 (ko)
JP (6) JP6258199B2 (ko)
KR (7) KR20220114104A (ko)
CN (5) CN108653728B (ko)
AU (7) AU2012273929B2 (ko)
BR (3) BR122018012485B1 (ko)
CA (3) CA2837998C (ko)
DK (1) DK2723769T4 (ko)
ES (1) ES2622006T5 (ko)
HU (1) HUE031828T2 (ko)
IL (4) IL293155A (ko)
IN (1) IN2014CN00373A (ko)
LT (1) LT2723769T (ko)
MX (2) MX350074B (ko)
PH (1) PH12017501178A1 (ko)
PL (1) PL2723769T5 (ko)
PT (1) PT2723769T (ko)
RU (2) RU2700630C2 (ko)
SG (4) SG10201805064SA (ko)
WO (1) WO2012175741A2 (ko)
ZA (1) ZA201309295B (ko)

Families Citing this family (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9139825B2 (en) 2009-10-30 2015-09-22 Novartis Ag Universal fibronectin type III bottom-side binding domain libraries
EP4234698A3 (en) 2010-05-06 2023-11-08 Novartis AG Compositions and methods of use for therapeutic low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) antibodies
EP2621953B1 (en) 2010-09-30 2017-04-05 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
KR20220114104A (ko) 2011-06-23 2022-08-17 아블린쓰 엔.브이. 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
SI2723769T2 (sl) 2011-06-23 2022-09-30 Ablynx Nv Tehnike za napovedovanje, zaznavanje in zmanjševanje nespecifične motnje proteina v testih, ki vključujejo domene imunoglobulina z eno spremenljivko
HUE047238T2 (hu) 2011-06-23 2020-04-28 Ablynx Nv Szérumalbuminhoz kötõdõ fehérjék
CA2845029A1 (en) * 2011-08-17 2013-02-21 Glaxo Group Limited Modified proteins and peptides
WO2013073968A2 (en) * 2011-09-12 2013-05-23 Industrial Research Limited Agents for modulation of cell signalling
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
WO2013067355A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Novartis Ag Low density lipoprotein-related protein 6 (lrp6) - half life extender constructs
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
WO2014043509A2 (en) * 2012-09-13 2014-03-20 Novartis Ag Antigen binding molecule with terminal modifications
US9725710B2 (en) 2014-01-08 2017-08-08 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
EP3693386A1 (en) 2014-05-16 2020-08-12 Ablynx NV Immunoglobulin variable domains
CA2948945C (en) * 2014-05-16 2023-08-08 Ablynx Nv Methods for detecting and/or measuring anti-drug antibodies, in particular treatment-emergent anti-drug antibodies
CN109053885A (zh) * 2014-05-16 2018-12-21 埃博灵克斯股份有限公司 改进的免疫球蛋白可变结构域
NL2013661B1 (en) 2014-10-21 2016-10-05 Ablynx Nv KV1.3 Binding immunoglobulins.
CA3226056A1 (en) 2015-01-21 2016-07-28 Inhibrx, Inc. Non-immunogenic single domain antibodies
BR112017020275A8 (pt) 2015-03-31 2023-01-31 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polipeptídeos
AU2016239844B2 (en) 2015-04-02 2021-05-13 Ablynx N.V. Bispecific CXCR4-CD-4 polypeptides with potent anti-HIV activity
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
LT3294768T (lt) 2015-05-13 2019-11-11 Ablynx Nv T ląstelių rekrutingo polipeptidai tcr alfa/beta reaktyvumo pagrindu
AU2016260909B2 (en) 2015-05-13 2019-08-22 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides based on CD3 reactivity
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
RU2018119732A (ru) * 2015-10-30 2019-12-03 Аблинкс Нв Полипептиды против il-23
TWI746473B (zh) * 2015-11-02 2021-11-21 美商辛分子醫藥有限公司 針對細胞內抗原之單域抗體
NO2768984T3 (ko) 2015-11-12 2018-06-09
CA3005082A1 (en) * 2015-11-12 2017-05-18 Ablynx Nv Improved p2x7 receptor binders and polypeptides comprising the same
PL3374392T3 (pl) 2015-11-13 2022-03-28 Ablynx Nv Ulepszone domeny zmienne immunoglobuliny wiążące albuminę surowicy
CN114605530A (zh) * 2015-11-18 2022-06-10 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合剂
SG11201804178YA (en) 2015-11-18 2018-06-28 Merck Sharp & Dohme Pd1 and/or lag3 binders
BR112018010085A2 (pt) 2015-11-18 2018-11-13 Merck Sharp & Dohme ligantes de pd1/ctla4
UA125337C2 (uk) 2015-11-18 2022-02-23 Мерк Шарп І Доум Корп. Ctla4-зв'язувальні речовини
BR112018010802A2 (pt) 2015-11-27 2018-11-27 Ablynx Nv polipeptídeos que inibem cd40l
KR20180081825A (ko) 2015-12-04 2018-07-17 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 종양 세포에서 wnt 신호 전달을 길항하는 바이파라토픽 폴리펩타이드
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
RU2765809C2 (ru) * 2016-06-23 2022-02-03 Аблинкс Н.В. Усовершенствованные фармакокинетические анализы для одиночных вариабельных доменов иммуноглобулина
WO2018050833A1 (en) 2016-09-15 2018-03-22 Ablynx Nv Immunoglobulin single variable domains directed against macrophage migration inhibitory factor
WO2018060453A1 (en) 2016-09-30 2018-04-05 Vhsquared Limited Compositions
EP3529347A1 (en) 2016-10-19 2019-08-28 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
US11840569B2 (en) 2016-11-16 2023-12-12 Ablynx N.V. T cell recruiting polypeptides capable of binding CD123 and TCR alpha/beta
CN117164710A (zh) 2016-12-07 2023-12-05 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白单可变结构域
EP3571225A1 (en) * 2017-01-17 2019-11-27 Ablynx NV Improved serum albumin binders
JP7300385B2 (ja) 2017-01-17 2023-06-29 アブリンクス エン．ヴェー． 改善された血清アルブミン結合剤
CN110546506B (zh) 2017-03-31 2023-04-04 埃博灵克斯股份有限公司 改进的免疫原性测定法
KR20200011933A (ko) 2017-05-31 2020-02-04 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 종양 세포에서 wnt 신호 전달을 길항하는 폴리펩티드
US11261260B2 (en) * 2017-06-02 2022-03-01 Merck Patent Gmbh ADAMTS binding immunoglobulins
MX2019014448A (es) 2017-06-02 2020-02-10 Merck Patent Gmbh Inmunoglobulinas de enlace a mmp13.
US11603401B2 (en) 2017-06-02 2023-03-14 Ablynx N.V. Aggrecan binding immunoglobulins
MX2019014397A (es) 2017-06-02 2020-02-10 Merck Patent Gmbh Polipeptidos que enlazan adamts5, mmp13 y agrecano.
US11155607B2 (en) 2017-07-19 2021-10-26 Vib Vzw Serum albumin binding agents
JP6708797B2 (ja) 2017-08-23 2020-06-10 本田技研工業株式会社 鞍乗り型車両のエアバッグ装置
CN111315784A (zh) 2017-10-31 2020-06-19 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所 新的抗原结合嵌合蛋白及其方法和用途
US10785574B2 (en) 2017-12-14 2020-09-22 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic transducer driver and controller
EP3569618A1 (en) 2018-05-19 2019-11-20 Boehringer Ingelheim International GmbH Antagonizing cd73 antibody
TW202016151A (zh) 2018-06-09 2020-05-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 針對癌症治療之多特異性結合蛋白
WO2020014194A1 (en) * 2018-07-10 2020-01-16 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for mitigating drug target interference in an anti-drug antibody (ada) immunoassay
FR3088640A1 (fr) 2018-10-14 2020-05-22 Smart Diagnostix Pharma Nouveau polypeptide se liant specifiquement a la proteine p16
US20220289837A1 (en) 2019-04-30 2022-09-15 Vib Vzw Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Stabilizing Agents
JP2022537780A (ja) 2019-06-21 2022-08-29 ソリッソ ファーマシューティカルズ，インク． ポリペプチド
KR20220064953A (ko) 2019-06-21 2022-05-19 소리소 파마슈티컬스 인크. 폴리펩티드
TW202128756A (zh) 2019-10-02 2021-08-01 德商百靈佳殷格翰國際股份有限公司 用於癌症治療之多重專一性結合蛋白
GB201914468D0 (en) 2019-10-07 2019-11-20 Crescendo Biologics Ltd Binding Molecules
CA3158991A1 (en) 2019-11-27 2021-06-03 Vib Vzw Positive allosteric modulators of the calcium-sensing receptor
BR112022009799A2 (pt) 2019-12-06 2022-08-16 Ablynx Nv Polipeptídeos compreendendo domínios variáveis únicos de imunoglobulina alvejando tnfalfa e il-23
BR112022010231A2 (pt) 2019-12-06 2022-09-06 Ablynx Nv Polipeptídeos compreendendo domínios variáveis únicos de imunoglobulina direcionados a tnfalfa e ox40l
AR120698A1 (es) 2019-12-09 2022-03-09 Ablynx Nv Polipéptidos que comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y tslp
JP2023504914A (ja) 2019-12-09 2023-02-07 アブリンクス・エヌ・フェー Ｉｌ－１３およびｔｓｌｐを標的化する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド
WO2021123360A1 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Vib Vzw Nanobody exchange chromatography
WO2021156490A2 (en) 2020-02-06 2021-08-12 Vib Vzw Corona virus binders
US20230087785A1 (en) 2020-02-25 2023-03-23 Vib Vzw Leucine-Rich Repeat Kinase 2 Allosteric Modulators
WO2022003156A1 (en) 2020-07-02 2022-01-06 Oncurious Nv Ccr8 non-blocking binders
MX2023003522A (es) 2020-09-25 2023-04-19 Ablynx Nv Polipeptidos que comprenden dominios variables unicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y ox40l.
WO2022117569A1 (en) 2020-12-02 2022-06-09 Oncurious Nv A ccr8 antagonist antibody in combination with a lymphotoxin beta receptor agonist antibody in therapy against cancer
JP2024508207A (ja) 2020-12-02 2024-02-26 ブイアイビー ブイゼットダブリュ がんに対する組み合わせ治療におけるｌｔｂｒアゴニスト
CA3201219A1 (en) 2020-12-04 2022-06-09 Mir Ali Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
BR112023011782A2 (pt) 2020-12-14 2023-10-31 Takeda Pharmaceuticals Co Proteínas de ligação condicionalmente biespecíficas
JP2023553694A (ja) 2020-12-18 2023-12-25 アブリンクス エン．ヴェー． ＩＬ－６およびＴＮＦ－αを標的化する免疫グロブリン単一可変ドメインを含むポリペプチド
KR20230122084A (ko) 2020-12-18 2023-08-22 아블린쓰 엔.브이. Tcr 알파/베타 반응성에 기초한 t 세포 동원 폴리펩타이드
TW202241947A (zh) 2020-12-18 2022-11-01 比利時商艾伯霖克斯公司 包含靶向磷脂醯肌醇蛋白聚糖—３和ｔ細胞受體的免疫球蛋白單可變結構域的多肽
GB202020502D0 (en) 2020-12-23 2021-02-03 Vib Vzw Antibody composistion for treatment of corona virus infection
EP4288095A1 (en) 2021-02-05 2023-12-13 Vib Vzw Sarbecovirus binders
CN117794566A (zh) 2021-02-05 2024-03-29 Vib研究所 沙贝病毒结合剂
WO2022175532A1 (en) 2021-02-19 2022-08-25 Vib Vzw Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders
CN113173978B (zh) * 2021-04-22 2024-03-01 温州医科大学 一种对hpv16e6蛋白具有结合亲和力的多肽及其应用
WO2023016828A2 (en) 2021-07-30 2023-02-16 Vib Vzw Cation-independent mannose-6-phosphate receptor binders for targeted protein degradation
WO2023093899A1 (zh) * 2021-11-29 2023-06-01 江苏恒瑞医药股份有限公司 经修饰的蛋白或多肽
WO2023110190A1 (en) 2021-12-13 2023-06-22 Heraeus Medical Gmbh Tests and methods for detecting bacterial infection
WO2023111266A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Ablynx Nv POLYPEPTIDES COMPRISING IMMUNOGLOBULIN SINGLE VARIABLE DOMAINS TARGETING TCRαβ, CD33 AND CD123
WO2023135198A1 (en) 2022-01-12 2023-07-20 Vib Vzw Human ntcp binders for therapeutic use and liver-specific targeted delivery
WO2023164551A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Takeda Pharmaceutical Company Limited Conditionally bispecific binding proteins
WO2023198848A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Vib Vzw An ltbr agonist in combination therapy against cancer
WO2023222825A1 (en) 2022-05-18 2023-11-23 Vib Vzw Sarbecovirus spike s2 subunit binders
WO2023240156A1 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Tidal Therapeutics, Inc. Ionizable cationic lipids and lipid nanoparticles, and methods of synthesis and use thereof
US20240109965A1 (en) 2022-06-14 2024-04-04 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains targeting t cell receptor
WO2024023271A1 (en) 2022-07-27 2024-02-01 Ablynx Nv Polypeptides binding to a specific epitope of the neonatal fc receptor
WO2024068744A1 (en) 2022-09-27 2024-04-04 Vib Vzw Antivirals against human parainfluenza virus

Family Cites Families (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1545106C3 (de) 1963-07-16 1979-05-31 Union Carbide Corp., New York, N.Y. (V.St.A.) Verfahren zur Herstellung von linearen Polyarylenpolyäthern
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
GB9016299D0 (en) * 1990-07-25 1990-09-12 Brien Caroline J O Binding substances
CA2090126C (en) 1990-08-02 2002-10-22 John W. Schrader Methods for the production of proteins with a desired function
US5608039A (en) * 1990-10-12 1997-03-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Single chain B3 antibody fusion proteins and their uses
DK0488470T3 (da) 1990-11-26 1997-12-22 Akzo Nobel Nv Fremgangsmåde til fremstilling af antistoffer
IL127127A0 (en) 1998-11-18 1999-09-22 Peptor Ltd Small functional units of antibody heavy chain variable regions
US7622259B1 (en) * 1999-07-05 2009-11-24 K.U. Leuven Research & Development Detection of von-Willebrand factor (vWF) activity
US6541225B1 (en) 2000-01-26 2003-04-01 Raven Biotechnologies, Inc. Methods and compositions for generating human monoclonal antibodies
AU2001289930A1 (en) 2000-09-25 2002-04-08 Rega Stichting Vzw Method for the production of human antibodies, antibodies thus obtained and their use in therapy and diagnosis
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
US20060002935A1 (en) 2002-06-28 2006-01-05 Domantis Limited Tumor Necrosis Factor Receptor 1 antagonists and methods of use therefor
FR2846667B1 (fr) 2002-11-06 2004-12-31 Pasteur Institut Fragments variables d'anticorps de camelides a chaine unique diriges contre le peptide beta-amyloide 1-42 et leurs applications pour le diagnostic et le traitement des maladies neuroagregatives
CA2505325C (en) 2002-11-08 2014-02-25 Ablynx N.V. Stabilized single domain antibodies
ATE528648T1 (de) 2002-12-03 2011-10-15 Ucb Pharma Sa Verfahren zum nachweis antikörper-herstellender zellen
CA2511910A1 (en) * 2002-12-27 2004-07-15 Domantis Limited Dual specific single domain antibodies specific for a ligand and for the receptor of the ligand
ES2542330T3 (es) 2003-01-10 2015-08-04 Ablynx N.V. Polipéptidos terapéuticos, homólogos de los mismos, fragmentos de los mismos y su uso en modular la agregación mediada por plaquetas
EP1585767A2 (en) * 2003-01-16 2005-10-19 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP1623229A2 (en) 2003-05-15 2006-02-08 Cytos Biotechnology AG Selection of b cells with specificity of interest: method of preparation and use
GB0312481D0 (en) 2003-05-30 2003-07-09 Celltech R&D Ltd Antibodies
JPWO2005041648A1 (ja) 2003-11-04 2007-04-26 独立行政法人科学技術振興機構 高脂血症・高アルブミン血症モデル動物
ZA200701656B (en) 2004-08-05 2008-09-25 Genentech Inc Humanized anti-cment antagonists
MX2007006593A (es) 2004-12-02 2008-03-04 Domantis Ltd Anticuerpos de dominio simple anti-il 1r1 y sus usos terapeuticos.
AU2005325801A1 (en) 2005-01-31 2006-08-03 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
SG184709A1 (en) 2005-05-18 2012-10-30 Ablynx Nv Improved nanobodies™ against tumor necrosis factor-alpha
CA2960105A1 (en) * 2005-05-20 2006-11-23 Ablynx Nv Single domain vhh antibodies against von willebrand factor
DE102005023617A1 (de) * 2005-05-21 2006-11-23 Aspre Ag Verfahren zum Mischen von Farben in einem Display
WO2006129843A2 (en) * 2005-05-31 2006-12-07 Canon Kabushiki Kaisha Bispecific capturing molecule
JP2007008925A (ja) * 2005-05-31 2007-01-18 Canon Inc 標的物質捕捉分子
WO2006129828A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Canon Kabushiki Kaisha Target substance capturing molecule
CA2629850A1 (en) 2005-12-01 2007-06-07 Domantis Limited Competitive domain antibody formats that bind interleukin 1 receptor type 1
US20090155283A1 (en) 2005-12-01 2009-06-18 Drew Philip D Noncompetitive Domain Antibody Formats That Bind Interleukin 1 Receptor Type 1
FR2894741B1 (fr) 2005-12-08 2009-12-04 Centre Nat Etd Spatiales Chaine de reception par satellite
US20100047171A1 (en) † 2006-01-24 2010-02-25 Roland Beckmann Fusion Proteins That Contain Natural Junctions
CN101415730B (zh) 2006-03-30 2013-04-10 诺瓦提斯公司 c-Met抗体的组合物和使用方法
US7741273B2 (en) * 2006-04-13 2010-06-22 Warsaw Orthopedic, Inc. Drug depot implant designs
AU2007348941B2 (en) * 2006-08-03 2011-08-04 Medimmune Limited Antibodies directed to alphaVbeta6 and uses thereof
JP2010500876A (ja) 2006-08-18 2010-01-14 アブリンクス エン．ヴェー． Ｉｌ−６媒介性シグナル伝達に関連する疾患及び障害の治療のための、ｉｌ−６ｒに指向性を有するアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド
CN101646689A (zh) * 2006-09-08 2010-02-10 埃博灵克斯股份有限公司 具有长半衰期的血清清蛋白结合蛋白
CN101528767A (zh) * 2006-10-11 2009-09-09 埃博灵克斯股份有限公司 以基本不依赖pH的方式结合血清蛋白的氨基酸序列、包括其的化合物、及其用途
AU2007328900A1 (en) 2006-12-05 2008-06-12 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins
ES2618830T3 (es) 2006-12-08 2017-06-22 Lexicon Pharmaceuticals, Inc. Anticuerpos monoclonales contra ANGPTL3
US8907065B2 (en) * 2006-12-15 2014-12-09 Ablynx N.V. Polypeptides that modulate the interaction between cells of the immune system
EP2097451A2 (en) 2006-12-22 2009-09-09 Ablynx N.V. Anti-chemokine (ccl2, ccl3, ccl5, cxcl11, cxcl12) single-domain antibodies
JP2010518839A (ja) 2007-02-21 2010-06-03 アブリンクス エン．ヴェー． 血管内皮増殖因子に指向性を有するアミノ酸配列、及び過度の及び／もしくは病的な血管形成又は血管新生を特徴とする症状及び疾患を治療するためにこれを含むポリペプチド
GB0706793D0 (en) 2007-04-05 2007-05-16 Evotec Ag Compounds
CN101796072B (zh) * 2007-05-24 2014-09-24 埃博灵克斯股份有限公司 用于治疗骨疾病和病症的针对rank-l的氨基酸序列以及包括其的多肽
EP2014681A1 (en) 2007-07-12 2009-01-14 Pierre Fabre Medicament Novel antibodies inhibiting c-met dimerization, and uses thereof
AR062123A1 (es) * 2007-07-27 2008-10-15 Inst Nac De Tecnologia Agropec Dominio vhh monomerico derivado de anticuerpos de camelidos anti-vp6 dominio dimerico, metodo de inmunodeteccion de rotavirus, composiciones, metodos de prevencion y tratamiento de infecciones con rotavirus
CA2698343C (en) * 2007-09-04 2018-06-12 The Regents Of The University Of California High affinity anti-prostate stem cell antigen (psca) antibodies for cancer targeting and detection
AU2008304574A1 (en) * 2007-09-24 2009-04-02 Vanderbilt University Monoclonal antibodies to respiratory syncytial virus and uses thereof
AU2008328785A1 (en) * 2007-11-27 2009-06-04 Ablynx N.V. Method for obtaining polypeptide constructs comprising two or more single domain antibodies
CA2709399C (en) * 2007-12-28 2021-01-19 Genentech, Inc. Anti-hedgehog antibodies
BRPI0907648B1 (pt) 2008-01-29 2022-01-11 Institute Of Molecular Biology And Genetics National Academy Of Science Of Ukraine Anticorpo isolado humanizado, usos de um anticorpo, métodos para preparar um anticorpo, para gerar anticorpos imunorreativos com slc34a2 e para triar ou identificar agentes ou compostos que modulam slc34a2, composições, ácido nucleico isolado, e, microorganismo hospedeiro
AU2009237662A1 (en) 2008-04-17 2009-10-22 Ablynx N.V. Peptides capable of binding to serum proteins and compounds, constructs and polypeptides comprising the same
DE102008023620A1 (de) 2008-05-15 2009-11-19 Mettler-Toledo (Albstadt) Gmbh Funktionseinheit mit einer aufrufbaren Funktion und Verfahren zu deren Aufruf
NZ589036A (en) * 2008-05-16 2012-07-27 Ablynx Nv AMINO ACID SEQUENCES DIRECTED AGAINST CXCR4 AND OTHER GPCRs AND COMPOUNDS COMPRISING THE SAME
US7858729B2 (en) 2008-05-29 2010-12-28 Novomer, Inc. Methods of controlling molecular weight distribution of polymers and compositions thereof
CN102112155B (zh) 2008-06-05 2016-08-10 埃博灵克斯股份有限公司 针对病毒包膜蛋白的氨基酸序列和用于治疗病毒疾病的包含其的多肽
EP2143735A1 (en) * 2008-07-10 2010-01-13 Institut Pasteur Variable domains of camelid heavy-chain antibodies directed against glial fibrillary acidic proteins
WO2010042815A2 (en) * 2008-10-09 2010-04-15 Duke University Vhh antibody fragments for use in the detection and treatment of cancer
US8372808B2 (en) 2008-10-31 2013-02-12 Wisconsin Alumni Research Foundation Suppression of glial fibrillary acidic protein
WO2010100135A1 (en) † 2009-03-05 2010-09-10 Ablynx N.V. Novel antigen binding dimer-complexes, methods of making/avoiding and uses thereof
NZ595344A (en) 2009-03-27 2013-09-27 Glaxo Group Ltd Drug fusions and conjugates
WO2010115998A2 (en) * 2009-04-10 2010-10-14 Ablynx Nv Improved amino acid sequences directed against il-6r and polypeptides comprising the same for the treatment of il-6r related diseases and disorders
WO2010130832A2 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Ablynx N.V. Amino acid sequences directed against dickkopf-1 and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders associated with bone loss and/or osteolytic lesions
ES2804450T3 (es) * 2009-07-10 2021-02-08 Ablynx Nv Método para la producción de dominios variables
US8306355B2 (en) 2009-07-13 2012-11-06 Sharp Laboratories Of America, Inc. Methods and systems for reducing compression artifacts
WO2011064382A1 (en) * 2009-11-30 2011-06-03 Ablynx N.V. Improved amino acid sequences directed against human respiratory syncytial virus (hrsv) and polypeptides comprising the same for the prevention and/or treatment of respiratory tract infections
US8962807B2 (en) 2009-12-14 2015-02-24 Ablynx N.V. Single variable domain antibodies against OX40L, constructs and therapeutic use
AR079645A1 (es) * 2009-12-18 2012-02-08 Sanofi Aventis Anticuerpos antagonistas y sus fragmentos fab contra la proteina de las membranas plaquetarias humanas glicoproteina vi (gpvi) y sus usos
JP5914353B2 (ja) 2009-12-23 2016-05-11 エスバテック − ア ノバルティス カンパニー エルエルシー 免疫原性を減少させるための方法
BR112012022102A2 (pt) * 2010-03-03 2017-01-10 Boehringer Ingelheim Int polipeptídeos de ligação a a-beta.
CA2791863C (en) 2010-03-10 2022-06-21 Genmab A/S Monoclonal antibodies against c-met
WO2011117423A1 (en) * 2010-03-26 2011-09-29 Ablynx N.V. Immunoglobulin single variable domains directed against cxcr7
CA2800292A1 (en) * 2010-04-30 2011-11-03 Ablynx Nv Amino acid sequences of nanobodies directed against p19 subunit of the heterodimeric cytokine il-23
BR112012029588A2 (pt) * 2010-05-20 2017-07-25 Ablynx Nv materiais biológicas relacionados a her3.
US11644471B2 (en) 2010-09-30 2023-05-09 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
EP2621953B1 (en) 2010-09-30 2017-04-05 Ablynx N.V. Biological materials related to c-met
MX2013007936A (es) * 2011-01-06 2013-08-09 Glaxo Group Ltd Ligandos que se unen al receptor ii del factor de crecimiento transformante-beta.
AU2012237287B2 (en) 2011-03-30 2016-09-08 Ablynx Nv Methods of treating immune disorders with single domain antibodies against TNF-alpha
WO2012130314A1 (en) † 2011-03-31 2012-10-04 Elara Pharmaceuticals Gmbh Composition comprising docetaxel
HUE047238T2 (hu) 2011-06-23 2020-04-28 Ablynx Nv Szérumalbuminhoz kötõdõ fehérjék
KR20220114104A (ko) 2011-06-23 2022-08-17 아블린쓰 엔.브이. 면역글로불린 단일 가변 도메인을 수반하는 어세이에서 비특이적 단백질 간섭을 예측하고 검출하고 감소시키는 기법
US20150344568A1 (en) 2011-06-23 2015-12-03 Ablynx N.V. Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
WO2013014208A2 (en) 2011-07-27 2013-01-31 Glaxo Group Limited Antigen binding constructs
CA2845029A1 (en) * 2011-08-17 2013-02-21 Glaxo Group Limited Modified proteins and peptides
US9346884B2 (en) 2011-09-30 2016-05-24 Ablynx N.V. Biological materials related to c-Met
US8614548B2 (en) 2012-01-19 2013-12-24 Sonoco Development Incorporated Electroluminescent display and method for production
US9328174B2 (en) 2012-05-09 2016-05-03 Novartis Ag Chemokine receptor binding polypeptides
CA2874498A1 (en) 2012-05-22 2013-11-28 Owens Corning Intellectual Capital, Llc Laminated foam product and methods for making laminated foam products
WO2014111550A1 (en) † 2013-01-17 2014-07-24 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Modified anti-serum albumin binding proteins
CN109053885A (zh) * 2014-05-16 2018-12-21 埃博灵克斯股份有限公司 改进的免疫球蛋白可变结构域
EP3209327A1 (en) * 2014-10-21 2017-08-30 Ablynx N.V. Treatment of il-6r related diseases
NO2768984T3 (ko) 2015-11-12 2018-06-09
UA125337C2 (uk) 2015-11-18 2022-02-23 Мерк Шарп І Доум Корп. Ctla4-зв'язувальні речовини
CN114605530A (zh) * 2015-11-18 2022-06-10 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合剂
SG11201804178YA (en) 2015-11-18 2018-06-28 Merck Sharp & Dohme Pd1 and/or lag3 binders
BR112018010085A2 (pt) 2015-11-18 2018-11-13 Merck Sharp & Dohme ligantes de pd1/ctla4
WO2017129630A1 (en) * 2016-01-26 2017-08-03 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Anti-vwf d'd3 single-domain antibodies and polypeptides comprising thereof
CN117164710A (zh) * 2016-12-07 2023-12-05 埃博灵克斯股份有限公司 改进的血清白蛋白结合免疫球蛋白单可变结构域
EP3571225A1 (en) * 2017-01-17 2019-11-27 Ablynx NV Improved serum albumin binders
US11261260B2 (en) * 2017-06-02 2022-03-01 Merck Patent Gmbh ADAMTS binding immunoglobulins
AR120698A1 (es) * 2019-12-09 2022-03-09 Ablynx Nv Polipéptidos que comprenden dominios variables únicos de inmunoglobulina que se dirigen a il-13 y tslp

Also Published As

Publication number Publication date
JP2017160230A (ja) 2017-09-14
CN108659121A (zh) 2018-10-16
BR122018012485B1 (pt) 2022-09-20
WO2012175741A3 (en) 2013-02-14
AU2019201606B2 (en) 2021-04-01
AU2021201506A1 (en) 2021-03-25
US20140199295A1 (en) 2014-07-17
KR20180086280A (ko) 2018-07-30
WO2012175741A2 (en) 2012-12-27
NZ716279A (en) 2017-07-28
ES2622006T3 (es) 2017-07-05
JP2021107426A (ja) 2021-07-29
SG194982A1 (en) 2013-12-30
KR101965462B1 (ko) 2019-04-04
AU2020230299B2 (en) 2022-10-06
DK2723769T4 (da) 2022-09-05
US20170275360A1 (en) 2017-09-28
SG10201605048XA (en) 2016-07-28
AU2017204339A1 (en) 2017-07-13
AU2018202782B2 (en) 2020-07-16
DK2723769T3 (en) 2017-04-03
JP6982400B2 (ja) 2021-12-17
US20210388061A1 (en) 2021-12-16
SG10201707604SA (en) 2017-11-29
IL229503B (en) 2022-06-01
US11192937B2 (en) 2021-12-07
EP2723769B1 (en) 2017-01-11
CA3141978A1 (en) 2012-12-27
CN108663504B (zh) 2021-06-22
US20180355031A1 (en) 2018-12-13
KR20210047369A (ko) 2021-04-29
CA2837998A1 (en) 2012-12-27
CN108659120A (zh) 2018-10-16
BR112013032145B1 (pt) 2022-09-20
IL293155A (en) 2022-07-01
IN2014CN00373A (ko) 2015-04-03
PT2723769T (pt) 2017-04-04
BR112013032145A2 (pt) 2017-12-05
PH12017501178A1 (en) 2018-07-23
AU2020230299A1 (en) 2020-10-01
JP6869923B2 (ja) 2021-05-12
CN108653728A (zh) 2018-10-16
US20210403536A1 (en) 2021-12-30
CA3142288A1 (en) 2012-12-27
AU2018202782A1 (en) 2018-05-10
MX2013014614A (es) 2014-08-01
JP2022031790A (ja) 2022-02-22
KR102240318B1 (ko) 2021-04-15
KR102246924B1 (ko) 2021-04-30
PL2723769T5 (pl) 2022-10-17
CN108653728B (zh) 2022-11-18
EP2723769A2 (en) 2014-04-30
US20170275361A1 (en) 2017-09-28
US20220298227A9 (en) 2022-09-22
BR112013032145A8 (pt) 2018-07-03
CA2837998C (en) 2022-03-01
KR20140040779A (ko) 2014-04-03
NZ617995A (en) 2016-06-24
AU2024200309A1 (en) 2024-02-08
IL250396A0 (en) 2017-03-30
BR122017005075A2 (pt) 2019-09-03
CN108663504A (zh) 2018-10-16
KR102025035B1 (ko) 2019-11-04
IL250396B (en) 2022-06-01
CN104203975A (zh) 2014-12-10
MX2018007826A (es) 2021-12-08
IL293163A (en) 2022-07-01
US20210388062A1 (en) 2021-12-16
US10858418B2 (en) 2020-12-08
JP2014520134A (ja) 2014-08-21
JP2024050769A (ja) 2024-04-10
JP2018162305A (ja) 2018-10-18
RU2019128430A (ru) 2019-10-25
US20200216532A1 (en) 2020-07-09
LT2723769T (lt) 2017-04-10
AU2012273929B2 (en) 2017-04-27
ZA201309295B (en) 2015-01-28
US11192938B2 (en) 2021-12-07
JP6258199B2 (ja) 2018-01-10
KR102430693B1 (ko) 2022-08-08
KR20220114104A (ko) 2022-08-17
CN104203975B (zh) 2018-05-11
IL229503A0 (en) 2014-01-30
PL2723769T3 (pl) 2017-07-31
US20180009888A9 (en) 2018-01-11
HUE031828T2 (en) 2017-08-28
KR20190041513A (ko) 2019-04-22
MX350074B (es) 2017-08-25
US20220119497A1 (en) 2022-04-21
US20230242620A1 (en) 2023-08-03
KR20190107200A (ko) 2019-09-18
SG10201805064SA (en) 2018-07-30
US20200325221A1 (en) 2020-10-15
EP2723769B2 (en) 2022-06-15
AU2017204339B2 (en) 2019-03-28
AU2021201506B2 (en) 2023-10-19
BR122017005075B1 (pt) 2022-09-20
RU2014102007A (ru) 2015-11-27
ES2622006T5 (es) 2022-10-13
RU2700630C2 (ru) 2019-09-18
AU2019201606A1 (en) 2019-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6869923B2 (ja) 免疫グロブリン単一可変ドメインを伴うアッセイにおける非特異的タンパク質干渉を予測、検出及び低減するための技術
AU2012273929A1 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
US11644471B2 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
US20150344568A1 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains
RU2798971C2 (ru) Методы предсказания, обнаружения и уменьшения неспецифической интерференции белков в способах анализа с использованием одиночных вариабельных доменов иммуноглобулинов
NZ716279B2 (en) Techniques for predicting, detecting and reducing aspecific protein interference in assays involving immunoglobulin single variable domains

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination