BR122017005075A2 - técnicas para prever, detectar e reduzir interferência de proteína não especifica em ensaios envolvendo domínios variáveis únicos de imunoglobulina - Google Patents

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Abstract

técnicas para prever, detectar e reduzir interferência de proteína não especifica em ensaios envolvendo domínios variáveis únicos de imunoglobulina a presente invenção se refere em determinados aspectos específicos, entre outros aos: ensaios que podem ser utilizados para prever se um determinado isv será sujeito à interferência de proteínas, tal como aqui descrito e/ou dar origem a um sinal (inespecifíco) em tal ensaio (tal como, por exemplo, em um imunoensaio ada). tais ensaios preditivos poderiam, por exemplo, ser utilizados para testar se um determinado isv pode ter uma tendência a dar origem a tal interferência de proteínas e/ou tal sinal, para selecionar os isv’s que não são ou são menos propensos a tal interferência de proteínas ou para produzir tal sinal, como um ensaio ou teste que pode ser utilizado para testar se determinadas alterações para um isv reduzirá (totalmente ou parcialmente) a sua tendência a dar origem a tal interferência ou tal sinal, e/ou como um ensaio ou teste que pode ser utilizado para orientar a modificação ou aperfeiçoamento de um isv, de modo a reduzir sua tendência a dar origem a tal interferência de proteína ou sinal; - métodos para modificar e/ou melhorar os isv’s de modo a remover ou reduzir sua tendência a dar origem a tal interferência de proteínas ou tal sinal; - modificações que podem ser introduzidas em um isv que remove ou reduzir sua tendência a dar origem a tal interferência de proteína ou tal sinal; - isv’s que foram especificamente selecionados (por exemplo, utilizando os ensaios aqui descritos) para ter nenhuma ou pouca tendência a dar origem a tal interferência de proteína ou tal sinal; modificar e/ou melhorar os isv’s que não têm ou têm tendência reduzida para dar origem a tal interferência de proteína ou tal sinal.

Description

TÉCNICAS PARA PREVER, DETECTAR E REDUZIR INTERFERÊNCIA
DE PROTEÍNA NÃO ESPECIFICA EM ENSAIOS ENVOLVENDO DOMÍNIOS
VARIÁVEIS ÚNICOS DE IMUNOGLOBULINA” [0001] O presente pedido é um pedido de patente divisional do BR 11 2013 032145 8 baseado no PCT/US2012/062251, depositado em 25 de junho de 2012.
[0002] A presente invenção se refere ao campo dos domínios variáveis únicos de imunoglobulina.
[0003] Um domínio variável único de imunoglobulina ou ISV geralmente é definido aqui como um seqüência de aminoácido que:
- compreende uma dobra de imunoglobulina ou, sob condições adequadas (por exemplo, condições fisiológicas) é capaz de formar uma dobra de imunoglobulina (i.e., dobrando), i.e., a fim de formar um domínio variável de imunoglobulina (como, por exemplo, um domínio VH, VL ou VHH);
e que
- formas (ou sob tais condições adequadas é capaz de formar) um domínio variável de imunoglobulina que compreende um sítio de ligação do antígeno funcional (no sentido de que não requer uma interação com outro domínio variável de imunoglobulina (tal como uma interação de VH-VL) para formar um sítio de ligação do antígeno funcional).
[0004] Alguns exemplos de domínios variáveis únicos de imunoglobulina que atualmente são conhecidos na arte são dos VHH's e/ou (outros) Nanocorpos, dAb's e anticorpos de domínio (único). Destes, a partir da data de depósito do presente pedido, vários Nanocorpos estão em ensaios clinicos de fase I e fase II.
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Isto torna importante ter ensaios disponíveis confiáveis para a análise de amostras biológicas de pessoas que são tratadas com ISV's (tais como os participantes de ensaios clínicos e, após
tais ISV's alcaçarem o mercado, pacientes que são tratados com
tais ISV's).
[0004] Isto não é somente importante para fins de
regulamentação, mas também para o tratamento de pacientes com
drogas biológicas, porque os médicos que prescrevem o tratamento também gostariam de ter disponíveis ensaios confiáveis para monitorar os vários aspectos do tratamento.
[0005] Por exemplo, no desenvolvimento clínico de moléculas de drogas biológicas, é importante avaliar seu potencial imunogênico e em particular o grau aos quais estas podem eliciar os então chamados anticorpos antidrogas ou ADA's. Isso é determinado usando o assim chamado anticorpo antidroga ou (imuno)ensaios ADA (veja, por exemplo, the review by Shankar et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 48 (2008), 1267-1281; bem como Mire-Sluis et al., J. Immunol. Meth.
289 (2004), 1-16; Peng et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 54, (2011), 629-635; e Loyet et al., J. Immunol. Meth. 345 (2009), 17-28. Tais ensaios ADA e métodos para executá-los são conhecimento comum no campo da farmacologia, e são rotineiramente usados durante o desenvolvimento clínico de produtos de drogas biológicas (bem
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3/136 como é requerido por diversas agências reguladoras em todo o mundo).
[0006] Por exemplo, como descrito nas páginas 3 e 4 do artigo pelo Mire-Sluis e como, por exemplo, também exemplificado esquematicamente nas figuras do artigo de Peng, um número de diferentes formatos de ensaios ADA é conhecido, tais como Formato de ponte-ELISA, Formato direto ELISA, Formato indireto, ensaio Rádio imunoprecipitação (RIP), Ressonância de plásmons de superfície e Formato de ponte de eletroquimioluminescência. Outros formatos para a realização de imunoensaios ADA serão claros para uma pessoa versada na arte.
[0007] Uma pessoa versada na arte também estará familiarizada com a quantidade de diferentes plataformas de tecnologia comercialmente disponíveis que foram mostradas como sendo adequadas para a criação e realização de ensaios ADA. Incluindo, mas sem se limitar a plataforma MSD (mesoescala), Gyrolab (giroscópios) e a plataforma de octeto (Fortebio).
[0008] Alguns exemplos não limitativos de formatos de ensaio ADA também são esquematicamente mostrados nas figuras 1A a 1C.
[0009] Em geral, deve-se notar que, em tais ensaios ADA para detectar ou medir ADA's contra um ISV, o ISV é usado como o agente analítico (ou seja, como o composto usado para detectar se quaisquer ADA's estão presentes na amostra que é testada), e os ADA's são os antígenos (ou seja, o composto para ser
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4/136 detectado na amostra que é testada). Assim, nestes ensaios, o ISV será geralmente/frequentemente ligado ao transportador (tal como a placa ELISA), considerando que ADA's (se houver) estará presente na amostra que é submetida ao ensaio.
[0010] Para entender melhor a invenção aqui descrita, já foi observado que ao contrário, nos métodos que são usados neste documento para prever se um ISV dará origem à interferência de proteína, o ISV será geralmente usado como o antígeno (ou seja, como o composto a ser detectado), e um anticorpo (que é também é aqui descrito) é usado como agente analítico (ou seja, como um meio para detectar se um determinado ISV se liga ou não, respectivamente; e, portanto, tem um risco aumentado ou elevado de dar origem à interferência de proteína ou não, respectivamente). Assim, neste método de acordo com a invenção, o anticorpo usado como agente analítico (que é também referido neste documento como anticorpo analítico) será normalmente ligado ao portador (ou seja, a placa ELISA) e o ISV estará (presente) na amostra a ser testada. No entanto, geralmente será observado que a invenção não etá limitada aos ensaios, em que o anticorpo analítico é ligado ao transportador. Por exemplo, uma forma alternativa de realizar um ensaio de acordo com a invenção (como mostrado, por exemplo, na figura 1 e descrito nos exemplos), o anticorpo analítico em vez disso é usado como um agente de ponte e assim estará na solução em vez de ligado à placa (apesar de que está indiretamente ligado a placa através
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5/136 do ISV que é revestido na placa). No entanto, também no ensaio ponte específico descrito nos exemplos (que é um ensaio competitivo) o anticorpo analítico ainda é usado como o agente analítico (ou seja, para determinar se o ISV de interesse se liga ou não, respectivamente; e, portanto, tem um risco aumentado ou elevado de dar origem à interferência de proteína ou não, respectivamente). Prevê-se também que, com base na divulgação adicional neste documento, uma pessoa versada será capaz de projetar outros formatos de ensaio em que o anticorpo analítico pode ser usado como um agente analítico para determinar se um determinado ISV pode se ligar ou não, respectivamente; e, portanto, tem um risco aumentado ou elevado de dar origem à interferência de proteína ou não.
[0011] Como resultado da investigação na cadeia única Fv's ou ScFv's (que são construtos que contêm domínios variáveis únicos de imunoglobulina que é semelhante ao ISV, não estão associados aos domínios constantes), tem sido descrito na arte que o C-terminal de um domínio variável de imunoglobulina forma uma barreira hidrofóbica que em um anticorpo que está enterrado na interface entre o domínio variável e o domínio constante, mas que se torna solvente-exposto quando o domínio variável não está associado um domínio constante (Nieba et al, engenharia de proteínas, 10, 435-444 (1997)). Também tem sido descrito que o C-terminal exposto pode formar epítopos de célula B que podem dar origem e/ou interagir com anticorpos antidrogas (emergentes
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6/136 e/ou pré-existentes) (WO 11/07586) , cuja presença pode ser então determinada usando os ensaios ADA's acima referidos. Por este motivo, foi proposto fazer mutações em alguns resíduos aminoácidos que fazem parte do C-terminal dos domínios variáveis para reduzir a dita hidrofobicidade e/ou remover os ditos epítopos. Por exemplo, Nieba et al. sugere mutar as posições 11, 14, 41, 84, 87 e/ou 89 de uma região VH (numeração de acordo com Kabat), considerando que no WO 11/07586 é sugerida a mutação das posições, 99, 101 e/ou 148 (numeração AHo) de um domínio VL ou posições 12, 97, 98, 99, 103 e/ou 144 de um domínio VH (novamente a numeração Aho - estas posições correspondem às posições 1183, 84, 85, 89 e 103 de acordo com Kabat).
[0012] No entanto, nenhuma dessas referências reconhece que certas proteínas presentes no sangue ou soro de um indivíduo possam interferir com ensaios ADA envolvendo ISV's, e por causa disso, essas referências não são direcionadas para (nem oferecer uma solução para) o problema de como evitar a interferência de proteína não específica em tais ensaios ADA a fim de permitir o ensaio ADA deva ser usado para determinar a verdadeira presença/extensão dos anticorpos antidrogas (decorrentes ou préexistentes) na amostra a ser testada.
[0013] Por outro lado, a presente invenção fornece métodos e ensaios que facilmente permitem que uma pessoa versada preveja se um domínio variável único de imunoglobulina terá ou não uma tendência a sofrer interferência de proteína não específica nos
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7/136 ensaios ADA. Os métodos e os ensaios descritos neste documento também permitem que uma pessoa versada, quando se verifica que um domínio variável pode ter uma tendência ou risco de sofrer tais interferências de proteína em um ensaio ADA, teste facilmente as modificações (propostas) para um domínio variável para prever se tais modificações (propostas) irão reduzir ou essencialmente evitar completamente tal interferência de proteína.
[0014] A presente invenção também descreve uma série de modificações que podem ser feitas nos domínios variáveis a fim de reduzir ou evitar essencialmente tais interferências de proteína. De acordo com um aspecto não limitativo, esta modificação envolve a adição de um número limitado (como descrito neste documento) de resíduos de aminoácidos (como descrito neste documento) na extremidade C-terminal de domínio da variável. Surpreendentemente, verificou-se que, para um número de diferentes domínios variáveis ou construtos baseado nestess, mesmo adicionando um resíduo de aminoácido único à extremidade C-terminal (como um resíduo de alanina único) pode substancialmente, ou mesmo essencialmente remover completamente o problema de interferência de proteína em ensaios ADA, apesar de adicionar tal aminoácido por si só não seja suficiente para cobrir ou enterrar a barreira hidrofóbica que segundo Nieba et al., está presente no C-terminal de um ISV. Da mesma forma, mas sem querer limitar a invenção em qualquer forma ou para
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8/136 qualquer mecanismo ou explicação, presume-se também que adicionando tal aminoácido podria não ser suficiente para cobrir ou enterrar qualquer epítopos de célula B que segundo o WO 11/07586 podem estar presentes no C-terminal de um domínio variável. Também deve ser observado que, embora, de acordo com este aspecto específico da presente invenção, adicionar um número limitado ou até mesmo um aminoácido único no C-terminal do domínio variável (ou seja, sem fazer quaisquer substituições dentro da região C-terminal em si, tal como proposto por Nieba et al. e WO 11/07586) pode - e em muitos casos - reduzir significativamente ou mesmo essencialmente remover o problema de interferência de proteína não específica, também está no âmbito deste aspecto da invenção que tais adições à extremidade C-terminal são combinadas com mutações na região C-terminal. A este respeito, no entanto, também deve ser observado que a invenção não está particularmente limitada à lógica atreleda a tais mutações. Por exemplo, é bem conhecido fazer mutações para resíduos aminoácidos dentro do C-terminal (incluindo aquelas posições que são explicitamente ditas por Nieba et al. e no WO 11/07586) para humanizar um domínio variável (incluindo, sem limitação a, um domínio VHH) ou para camelizar um domínio VH (por exemplo, é feita referência a WO 08/020079 e algumas outros pedidos da Ablynx N.V. referidos aqui).
[0015] É previsto que métodos, ensaios e modificações ensinados neste documento podem ser aplicados a qualquer domínio variável
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9/136 que não está ligado ou de outra forma associado com um domínio constante (ou com outro grupo ou porção peptídica que funciona como escudo, para cobrir ou enterrar a região C-terminal do domínio variável) e mais geralmente a qualquer domínio variável que tem regiões C-terminal que é solvente-expostas. No entanto, de acordo com um aspecto preferido, mas não limitativo da invenção, os métodos, ensaios e modificações podem ser particularmente aplicadas aos domínios variáveis de cadeia pesada (domínios VH) e de acordo com um aspecto específico da invenção aos domínios Vhh.
[0016] Prevê-se também que os métodos, ensaios e modificações aqui descritos podem ser devidamente aplicados em construtos de proteína que contêm um ou mais domínios variáveis, e em especial para tais construtos em que um domínio variável forma a parte C-terminal do construto ou, no caso dos métodos e ensaios aqui descritos, em que a região C-terminal de um domínio variável, é de outra forma solvente-exposta. Novamente, de acordo com um aspecto preferido, mas não limitativo da invenção, os métodos, ensaios e modificações são aplicados aos construtos em que um domínio VH (e em particular um domínio VHH) constitui a parte Cterminal do construto ou, no caso dos métodos e ensaios da invenção, são de outra forma solvente-expostas.
[0017] Alguns exemplos não limitativos de tais construtos são multivalentes, multiespecífico (tais como biespecífico) ou construtos multiparatópicos (tal como biparatópicos) que contêm
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10/136 dois ou mais ISV ligados diretamente ou através de um ou mais ligantes adequados (com mais uma vez, de acordo com um aspecto específico, um domínio VH ou VHH) formando a parte C-terminal de tal construto. Por exemplo, e sem limitação, tal construto pode ser composto inteiramente de domínios VH e em particular de Nanocorpos (ou seja, domínios VHH, domínios VHH humanizado ou domínios VH camelizado), novamente ligado diretamente ou através de um ou mais ligantes adequados. Para alguns exemplos não limitativos de tais construtos e um ensino geral de como tais construtos podem ser feitos (em especial com base em Nanocorpos), referência, por exemplo, é feita a Conrath et al, JBC 276, 9, 7346 (2001), bem como para review article by Muyldermans. Reviews in Mol. Biotechnol., 74:27 (2001).
[0018] No entanto, por exemplo, também é previsto que a invenção pode ser aplicada a outros construtos que têm um domínio variável solvente-expostos e em particular, têm um domínio variável no seu C-terminal, tais como, por exemplo, Fv's de cadeia única, e em particular ScFv's que tem seu domínio variável da cadeia pesada no C-terminal.
[0019] No presente relatório descritivo e reivindicações, termos como ISV, agente analítico e interferência de proteína tem o significado conforme definido aqui.
[0020] Em particular, um ISV conforme descrito neste documento pode especialmente ser um Nanocorpo ou um (outro) ISV (ou seja,
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11/136 outro que não seja um Nanocorpo) que é um domínio VH ou que compreende um domínio VH; e que seja de preferência um Nanocorpo. [0021] Além disso, qualquer proteína ou polipeptídeo que compreende um ISV (como um fármaco à base de ISV) de preferência tem o dito tal (ou pelo menos um) ISV em sua extremidade Cterminal. Novamente, o dito ISV pode especialmente ser um Nanocorpo ou um (outro) ISV (ou seja, outro que não seja um Nanocorpo) que é um domínio VH ou que compreende um domínio VH; e que seja de preferência um Nanocorpo.
[0022] A invenção aqui descrita é em especial pretendida e adequada para ser aplicada aos ISVs que compreendem, se baseiam em e/ou são derivados de domínios variáveis de cadeia pesada, tais como domínios VH (incluindo domínios VH humanos) e Nanocorpos, tais como domínios VHH (incluindo domínios VH humanizados e de sequência otimizada) ou domínios VH camelizados. Estes podem ser sintéticos (por exemplo, obtidos a partir de uma biblioteca sintética ou com base em regiões de armação fixa), semisintéticos (por exemplo, humanizado, camelizado ou de sequência otimizada ou obtidos pela maturação de afinidade ou enxerto CDR, a partir de um domínio VH ou VHH natural) ou domínios VH ou VHH totalmente naturais. A invenção será, portanto, ainda aqui descrita com referência a ISV's que são, ou se baseiam e/ou são derivados de domínios VH ou VHH.
[0023] Ao estabelecer a presente invenção, verificou-se que, em alguns ensaios (tal como, por exemplo, em imunoensaios ADA)
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12/136 que são usados para a análise de amostras biológicas (tais como amostras de sangue, incluindo todo o sangue, soro, plasma, fluido ocular, fluido broncoalveolar/BALF, fluido cefalorraquidiano ou outras amostras de fluidos biológicos) da interferência de proteína pode ocorrer, e tais interferências de proteína podem dar origem a um sinal não específico em alguns destes ensaios e/ou em algumas destas amostras. Também se verificou que tais interferências de proteína podem ocorrer não apenas nas amostras que foram obtidas de indivíduos que foram tratados com ISV's (e em particular com a Nanocorpos; ou com proteínas, os polipeptídeos ou outras drogas biológicas que compreendem pelo menos uma de ISV ou Nanocorpo) e/ou daqueles em que os mesmos foram administrados (tais como pacientes ou participantes de ensaios clínicos), mas também em amostras de indivíduos que nunca receberam ISV (indicando que tal interferência é provavelmente devida a uma interação da proteína-proteína não específica com proteínas pré-existentes, ao invés de nenhum ADA emergente).
[0024] Embora tenha sido encontrado que tal interferência de proteína e/ou sinal em tais ensaios não são associados com qualquer alteração ou redução nas propriedades farmacológicas (tais como propriedades farmacocinéticas/PK ou farmacodinâmicos/PD) do ISV, seria desejável ter técnicas disponíveis para predizer, detectar, reduzir e/ou se possível
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13/136 evitar tal interferência de proteína não específica. Este é o objetivo geral da presente invenção.
[0025] Em particular, a invenção fornece e em certos aspectos específicos, mas não limitativos, se refere a:
- os ensaios que podem ser usados para prever se um determinado ISV se sujeitará a tal interferência de proteína e/ou dará origem a um sinal (inespecifíco) em tal ensaio (tal como, por exemplo, em um imunoensaio ADA). Tais ensaios preditivos poderíam, por exemplo, ser utilizados para testar se um determinado ISV pode ter uma tendência a dar origem a tal interferência de proteínas e/ou tal sinal, para selecionar os ISV's que não são ou são menos propensos a tal interferência de proteínas ou para produzir tal sinal, como um ensaio ou teste que pode ser utilizado para testar se determinadas alterações para um ISV reduzirá (totalmente ou parcialmente) a sua tendência a dar origem a tal interferência ou tal sinal, e/ou como um ensaio ou teste que pode ser utilizado para orientar a modificação ou aperfeiçoamento de um ISV, de modo a reduzir sua tendência a dar origem a tal interferência de proteína ou sinal;
- métodos para modificar e/ou melhorar os ISV's de modo a remover ou reduzir sua tendência a dar origem a tal interferência de proteínas ou tal sinal;
- modificações que podem ser introduzidas em um ISV que remove ou reduzir sua tendência a dar origem a tal interferência de proteína ou tal sinal;
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- ISV's que foram especificamente selecionados (por exemplo, utilizando os ensaios aqui descritos) para ter nenhuma ou pouca tendência a dar origem a tal interferência de proteína ou tal sinal;
- modificar e/ou melhorar os ISV's que não têm ou têm tendência reduzida a dar origem a tal interferência de proteína ou tal sinal.
Por exemplo, em um primeiro aspecto não limitativo, a invenção se relaciona a um método que pode ser usado para prever se um determinado ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) dará origem a (ou tem um risco aumentado ou elevado de dar origem a) interferência de proteína em um imunoensaio (ou seja, após ter sido administrada em sujeito, uma amostra de um fluido biológico foi obtida do referido sujeito e a dita amostra é submetida a um imunoensaio como adicionalmente descrito aqui), o dito método compreendendo a realização de um imunoensaio que pelo menos compreende as etapas de:
(i) contatar o dito ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) com um anticorpo que foi obtido de um indivíduo humano e que foi selecionado, gerado e/ou isolado com base na sua capacidade de reconhecer e/ou de se ligar à extremidade C-terminal de um ISV ou Nanocorpo (o anticorpo analítico); e (ii) determinar se o dito ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) está ligado pelo dito anticorpo no dito imunoensaio.
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15/136 [0026] Neste método, quando ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo está ligado ao dito anticorpo analítico, pode-se esperar que o dito ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo dará origem a (ou tem um risco aumentado ou elevado de darem origem a) tal interferência de proteína (como adicionalmente descrito aqui). Com base nisso, por exemplo, o dito ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo pode ser modificado ou melhorado para reduzir ou remover a sua tendência a dar origem a tais interferências de proteína (que novamente podem ser determinada usando o ensaio acima), e algumas estratégias que podem ser usadas para modificar o dito ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo serão descritos neste documento (e, por exemplo, inclui anexar um pequeno número de resíduos de aminoácidos à extremidade C-terminal e/ou introduzir uma ou mais substituições de aminoácidos específicos).
[0027] Assim, de modo geral, a invenção torna disponível para aqueles versados na técnica, ensaios e métodos/técnicas que podem ser usadas para prever a tendência de ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo para dar origem à interferência de proteína e/ou como uma ferramenta para melhorar os ISVs de modo a reduzir ou evitar a sua tendência a dar origem à interferência de proteína. Ao fazê-la, a invenção também fornece a pessoa versada na arte, meios para selecionar
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ISV's, Nanocorpos, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo baseado na sua baixa ou reduzida capacidade (ou a ausência de qualquer capacidade) para dar origem à interferência de proteína. Assim, a invenção fornece a pessoa versada na arte, uma importante ferramenta e ensaios que podem ser usados na otimização e desenvolvimento de ISV's, Nanocorpos, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo.
[0028] Também, conforme adicionalmente descrito neste documento, a invenção ensina a uma pessoa versada na arte, várias maneiras de modificado ou melhorado um ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo, a fim de reduzir ou evitar a sua tendência a dar origem à interferência de proteína. Assim, a invenção também geralmente torna disponíveis ISV, Nanocorpos, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo modificados e/ou melhorados com uma baixa ou sem nenhuma tendência a darem origem à interferência de proteína.
[0029] Conforme adicionalmente descrito neste documento, a invenção pode especialmente ser usada para prever se um determinado ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) dará origem à interferência de proteína (como descrito neste documento) em um imunoensaio, e mais em particular em um ensaio ADA. O dito ensaio ADA, por exemplo, pode ser um ensaio ADA para detectar ou medir ADA contra ISV's de modo geral e em particular pode ser um ensaio ADA para
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17/136 detectar ou medir ADA's contra ISV's usado nas etapas (i) e (ii) acima.
[0030] Novamente, como mencionado aqui, um ISV conforme descrito neste documento pode especialmente ser um Nanocorpo ou um (outro) ISV (ou seja, outro que não seja um Nanocorpo) que é um domínio VH ou que compreende um domínio VH; e que seja de preferência um Nanocorpo.
[0031] Além disso, qualquer proteína ou polipeptídeo que compreende um ISV (tal como um fármaco à base de ISV) de preferência tem o dito (ou pelo menos um) ISV em sua extremidade C-terminal. Novamente, o dito ISV pode especialmente ser um Nanocorpo ou um (outro) ISV (ou seja, outro que não seja um Nanocorpo) que é um domínio VH ou que compreende um domínio VH; e que seja de preferência um Nanocorpo.
[0032] A amostra que é testada no dito imunoensaio ou ensaios ADA, também é dita neste documento como amostra de teste ou amostra de ensaio. Para evitar confusão, tais como amostra de teste ou amostra de ensaio estes não devem ser confundidos com a amostra biológica que é usada aqui como material de partida para a obtenção do anticorpo analítico (monoclonal ou policlonal) usado na invenção.
[0033] Em um aspecto particular preferido, mas não limitativo, a invenção pode ser usado para prever se um determinado ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) dará origem à interferência de proteína (como
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18/136 descrito neste documento) em um imunoensaio (e em particular, em um ensaio ADA) que envolve o uso de tal ISV. Novamente, o dito ensaio ADA, por exemplo, pode ser um ensaio ADA para detectar ou medir ADA's contra ISV's de modo geral, e em particular pode ser um ensaio ADA para detectar ou medir ADA's contra ISV's usado nas etapas (i) e (ii) acima.
[0034] Em um aspecto também particular, mas não limitativo, a invenção pode ser usada para prever se um determinado ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) dará origem à interferência de proteína (como descrita neste documento) em um imunoensaio (e em particular, em um ensaio ADA) que se destina a determinar ou medir se a amostra contém nenhum ADA's contra ISV's. Mais uma vez, por exemplo, tal imunoensaio pode ser um dos tipos conhecidos de ensaios ADA (para o qual, por exemplo, referência pode ser feitas ao estado da técnica nos ensaios ADA citados neste documento), ou seja, realizado para determinar ou medir se nenhum ADA contra o dito ISV está presente na amostra, no qual a dita amostra é uma amostra de fluido biológico (conforme descrito neste documento) que é obtido a partir de um indivíduo ao qual o dito ISV tem sido administrado (conforme descrito neste documento).
[0035] Como descrito neste documento, em todos estes aspectos (e nos demais aspectos da invenção descritos aqui), a invenção também pode ser usada para selecionar o ISV que não é ou é menos propenso a tais interferências de proteína em imunoensaios ou
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19/136 ensaios ADA; como um ensaio ou teste que pode ser usado para testar se certas para um ISV reduzirá (total ou parcialmente) sua tendência a dar origem a tais interferências em imunoensaios ou ensaios ADA; e/ou como um ensaio ou teste que pode ser usado para guiar a modificação ou melhoria de um ISV a fim de reduzir sua tendência a dar origem a tais interferências de proteína em imunoensaios ou ensaios ADA.
[0036] Outros aspectos, modalidades, vantagens e aplicações da invenção se tornarão evidente a partir da descrição adicional neste documento.
[0037] No presente relatório descritivo, sempre que o termo ISV for usado, deve ser entendido que:
- tal ISV é de preferência é um Nanocorpo, em que o termo Nanocorpo é geralmente como definido no WO 08/020079 ou WO 09/138519 e assim, em um aspecto específico geralmente denota um VHH, VHH de seqüência otimizada e/ou humanizado ou um VH camelizado, tal como um VH humano camelizado) (tal como, por exemplo, otimizados para solubilidade e/ou estabilidade química, sobreposição máxima com regiões de estruturas humanas conhecidas e expressão máxima). Note-se que os termos Nanocorpo ou Nanocorpos são marcas registradas da Ablynx N.V. e, portanto, também pode ser ditas como Nanocorpo® ou Nanocorpos®);
- o termo ISV em seu sentido mais amplo inclui também produtos biológicos baseados em ISV e, quando o ISV é um Nanocorpo, produtos biológicos baseado em Nanocorpo. Um
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20/136 produto biológico baseado em ISV é definido aqui como uma proteína, polipeptídeo ou outra droga biológica que compreendem ou são essencialmente constituídos por pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três) ISV. Da mesma forma, um produto biológico baseado em Nanocorpo é definido como uma proteína, polipeptídeo ou outra droga biológica que compreendem ou são essencialmente constituídos de pelo menos um (por exemplo, um, dois ou três) Nanocorpos. Como o termo ISV, sempre que o termo produto biológico baseado em ISV é usado, deve ser entendido que tal produto biológico baseado em ISV é de preferência produto biológico baseado em Nanocorpo. No âmbito da presente invenção, tanto um produto biológico baseado em ISV quanto um produto biológico baseado em Nanocorpo pode, por exemplo, ser um construto ISV ou construto Nanocorpo monovalente, bivalente (ou polivalentes), biespecífico (ou multiespecífico) e biparatópico (ou multiparatópico), respectivamente. Além disso, qualquer produto biológico baseado em ISV ou baseado em Nanocorpo pode, por exemplo, além de um ou mais (como um, dois ou três) ISV's ou Nanocorpos, opcionalmente compreender ainda um ou mais (por exemplo, uma ou duas) outras porções terapêuticas e/ou um ou mais (por exemplo, uma ou duas) outras porções que influenciam as propriedades farmacocinéticas ou farmacodinâmicas do produto biológico baseado em ISV ou baseado em Nanocorpo (por exemplo, sua meia-vida). Exemplos adequados de mais porções terapêuticas ou outras serão claros para aqueles versados na arte e, por
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21/136 exemplo, geralmente podem incluir qualquer polipeptídeo, proteína terapeuticamente ativa, ou outro domínio de ligação ou unidade de ligação, bem como, por exemplo, modificações tais como as descritas nas páginas 149 a 152 do WO 138159/09. Um produto biológico baseado em ISV ou baseado em Nanocorpo é de preferência um produto terapêutico ou um produto destinado a ser usado como terapêutico (que inclui o diagnóstico e profilaxia) e para esta proposta contém de preferência pelo menos um ISV contra um alvo terapeuticamente relevante (tais como, por exemplo, RANK-L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 ou outras interleucinas, etc.). Para alguns exemplos específicos, mas não limitativos de tais produtos biológicos baseados em ISV ou baseados em Nanocorpo, por exemplo, referências são feitas as várias pedidos da Ablynx N.V. (tais como, por exemplo, e sem se limitar aos WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 e WO 2009/068627), como bem como, por exemplo, (e sem se limitar) aos pedidos tais como WO 06/038027, WO 06/059108, WO 07/063308, WO 07/063311, WO 07/066016 e 07/085814. Também no relatório descritivo do presente, a menos que explicitamente mencionados neste documento, caso contrário todos os termos mencionados neste documento têm o significado dado no WO 09/138519 (ou na arte prévia citada no WO 09/138519) ou WO 08/020079 (ou na arte prévia citada no WO 08/020079). Além disso, sempre que um método ou técnica não é especificamente descrita neste documento, estas podem ser realizadas conforme descrito no WO 09/138519 (ou na
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22/136 arte prévia citada no WO 09/138519) ou WO 08/020079 (ou na arte prévia citada no WO 08/020079).
[0038] Em particular, os seguintes termos têm o mesmo significado como dado daqui por diante, e/ou onde aplicável pode ser determinada da maneira descrita nas páginas a 75 do WO
09/138519:
agonista, antagonista, agonista inverso, resíduo de aminoácido descarregado apolar , resíduo de aminoácidos descarregado polar, resíduo de aminoácido carregado polar, identidade de sequência, exatamente o mesmo e diferença de aminoácido (quando se referindo a uma comparação de seqüência de duas seqüências de aminoácidos), (na) forma essencialmente isolada, domínio, domínio de ligação, determinante antigênico, epítopo, contra ou direcionado contra (um antígeno), especificidade e meiavida. Além disso, os termos modulação e modular, local de interação, específico para, bloqueio, bloqueado, bloqueando e essencialmente independente do pH são como definidos (e/ou pode ser determinados conforme descrito) nas páginas 74 a 79 do WO 10/130832 da própria Requerente. Além disso, ao se referir ao construto, composto, proteína ou polipeptídeo da invenção, termos como monovalente, bivalente (ou polivalentes), biespecífico (ou multiespecífico), e biparatópico (ou multiparatópico) pode ter o significado dado no WO 09/138519, WO 10/130832 ou WO 08/020079.
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23/136 [0039] O termo meia-vida como usado aqui em relação a um ISV, Nanocorpo, baseado em Produtos biológicos baseados em ISV e Nanocorpos ou qualquer outra sequência de aminoácidos, composto ou polipeptídeo geralmente podem ser definidos como descritos no WO 08/020079, página 57 e como mencionado aqui se refere ao tempo necessário para que a concentração sérica da sequência de aminoácidos, composto ou polipeptídeo se reduza em 50%, in vivo, por exemplo, devido à degradação da sequência ou composto e/ou depuração ou sequestro da sequência ou composto por mecanismos naturais. A meia-vida in vivo de uma sequência de aminoácidos, composto ou polipeptídeo da invenção pode ser determinada em qualquer maneira conhecida propriamente dita, tais como análise farmacocinética. Técnicas adequadas serão claras para uma pessoa versada na arte na arte e, por exemplo, geralmente podem ser como descritas no parágrafo o) na página 57 do WO 08/020079. Como também mencionado no parágrafo o) na página 57 do WO 08/020079, a meia-vida pode ser expressa usando parâmetros como t1/2-alfa, t1/2-beta e a área sob a curva (AUC). A este respeito, note-se que o termo meia-vida neste documento em particular se refere a t1/2-beta ou terminal meia-vida (em que o t1/2-alfa e/ou o AUC ou ambos podem ser mantidos fora de considerações). Por exemplo, referência é feita a parte Experimental abaixo, bem como aos manuais padrões, tais como Kenneth, et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters et al, Pharmacokinete analysis: A Practical Approach
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24/136 (1996). Referência também é feita a Pharmacokinetics, M Gibaldi & D Perron, published by Marcei Dekker, 2nd Rev. edition (1982) . Da mesma forma, os termos aumentar a meia-vida ou meia-vida aumentada também como definidos no parágrafo o) na página 57 do WO 08/020079, em particular, se referem a um aumento no t^-beta, com ou sem um aumento no t^-alfa e/ou a AUC ou ambos.
[0040] Quando um termo não é especificamente definido neste documento, este têm o significado usual na arte, que será claro para uma pessoa versada na arte. Por exemplo, referência é feita aos manuais padrões, como Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd.Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel et al, eds., Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York (1987); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., (1985); Old et al. , Principies of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2nd edition, University of Califórnia Press, Berkeley, CA (1981);
Roitt et al., Immunology (6th . Ed.), Mosby/Elsevier, Edinburgh (2001); Roitt et al. , Roitt's Essential Immunology, 10 Ed. Blackwell Publishing, UK (2001); e Janeway et al. , Immunobiology (6th Ed.), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York (2005), bem como no estado geral da arte citado aqui.
[0041] Também, neste documento, os resíduos de aminoácidos de um Nanocorpo são numerados de acordo com a numeração geral para
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25/136 domínios Vh dada por Kabat et al. (Sequence of proteins of
immunological interest, US Public Health Services, NIH
Bethesda, MD, Publication No. 91), como aplicado ao domínio Vhh
do camelídeos no artigo de Riechmann and Muyldermans, J.
Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195 (veja por exemplo a figura 2 desta publicação); ou referidos aqui. De acordo com esta numeração, FR1 de um Nanocorpo que compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 1-30, CDR1 de um Nanocorpo compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 3135, FR2 de um Nanocorpo que compreende os aminoácidos nas posições 36-49, CDR2 de um Nanocorpo que compreende os resíduos de aminoácidos de ácido nas posições 50-65, FR3 de um Nanocorpo compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 66-94, CDR3 de um Nanocorpo que compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 95-102, e FR4 de um Nanocorpo que compreende os resíduos de aminoácidos nas posições 103-113. [A este respeito, convém notar que - como é conhecido na arte de domínios Vh e domínios Vhh - o número total de resíduos de aminoácidos em cada um dos CDR's pode variar e pode não corresponder ao número total de resíduos de aminoácidos indicados pela numeração de Kabat (ou seja, uma ou mais posições de acordo com a numeração de Kabat não poderão ser ocupadas na sequência real, ou a sequência real pode conter resíduos de aminoácidos mais do que o número permitido pela numeração de Kabat). Isto significa que, em geral, a numeração de acordo com Kabat pode ou não corresponder
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26/136 à numeração real dos resíduos de aminoácidos na sequência real. Geralmente, entretanto, pode-se dizer que, de acordo com a numeração de Kabat e independentemente do número de resíduos de aminoácidos nos CDR's, de acordo com a posição 1 na numeração de Kabat corresponde ao início da FR1 e vice-versa, a posição 36 de acordo com a numeração de Kabat corresponde ao início da FR2 e vice-versa, a posição 66 de acordo com a numeração de Kabat corresponde ao início de FR3 e vice-versa, e na posição 103 de acordo com a numeração de Kabat corresponde ao início da FR4 e vice-versa].
[0042] Métodos alternativos para a numeração dos resíduos de aminoácidos dos domínios VH, cujos métodos podem também ser aplicados de forma análoga aos domínios VHh de camelídeos e aos Nanocorpos, são métodos descritos por Chothia et al. (Nature 342, 877-883 (1989)), a então chamada definição AbM e a então chamada definição de contato. No entanto, na presente descrição, reivindicações e figuras, a numeração de acordo com Kabat aplicada aos domínios VHh por Riechmann Muyldermans serão seguidos, salvo indicação contrária.
[0043] Também deve ser notado que as Figuras, Listagem de Sequência e Exemplos/Parte Experimental são dados somente para ilustrar ainda mais a invenção e não devem ser interpretados ou considerados como limitadores do escopo da invenção e/ou das reivindicações anexas de forma alguma, a menos que explicitamente indicado em contrário.
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27/136 [0044] Além disso, note que a presente invenção não é especificamente limitada a uma casualidade, explicação, hipótese ou mecanismo de/para interferência de proteína (e/ou sinais decorrentes em imunoensaios) que é observada, e que pode ser reduzida de acordo com a presente invenção. No entanto, presumese que o sangue ou soro (ou outros fluidos biológicos, tais como aqueles mencionados neste documento) de certos indivíduos ou grupos de indivíduos podem conter certas proteínas (préexistente) que, sob certas circunstâncias, podem se ligar (não especificamente) a extremidade do ISV para um sinal de interferência em determinados ensaios que são usados para analisar as amostras de soro ou sangue provenientes de tais indivíduos. Isto é, nomeadamente, com base na observação feita no estabelecimento da presente invenção que a interferência de proteína não específica que é direcionada pela presente invenção não apenas ocorre quando as amostras de análises que foram obtidas de indivíduos nos quais ISV foram previamente administrados, mas também quando das amostras de análises que foram obtidas de indivíduos que não receberam previamente um ISV.
[0045] Em particular, com base em observações que foram feitas no estabelecimento da presente invenção, e embora a invenção não seja limitada a estas, acredita-se que essas proteínas (préexistente) podem em particular (ser capaz) de se ligarem à extremidade C-terminal de tais ISV's (cujos, anticorpos de 4
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28/136 cadeias convencionais monoclonais de tamanho completo, bem como anticorpos apenas de cadeia pesada que são encontrados em camelídeos estão ligados ao resto do anticorpo - ou seja, à região CH1 nos monoclonais convencionais e para a região de dobradiça em anticorpos de cadeia pesada de camelídeos, respectivamente - e, portanto, tais anticorpos tamanho completo podem ser protegidos de tal interferência de proteína).
[0046] Isto é confirmado pelas conclusões feitas pelos inventores da presente invenção no estabelecimento da presente invenção (cujas conclusões são também descritas aqui) que certas modificações (simples) dos ISV's na sua extremidade C-terminal podem reduzir substancialmente ou essencialmente evitar tal interferência de proteína. Por conseguinte, os métodos para modificar os ISV's desta maneira, bem como os ISV's que foram modificados desta forma dos aspectos adicionais da invenção, como descritos neste documento.
[0047] A presente invenção, em particular, pode ser usada para reduzir ou evitar a interferência de proteína e/ou sinais devido à ligação não específica em imunoensaios que são executadas em amostras biológicas (tais como amostras de sangue ou soro) obtidas de um indivíduo ao qual um fármaco (biológico) foi administrado (novamente, tais amostras são também ditas neste documento como amostra ou amostra de ensaio). Alguns destes exemplos são imunoensaios que são utilizados para caracterização de eliminação da droga e da formação de anticorpos após a
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29/136 administração de um fármaco biológico a um indivíduo, tais como os referidos em “Guideline on the Clinicai Investigation of the Pharmacokinetics of Therapeutic Proteins” (document CHMP/EWP/89249/2004 dated January 27, 2007) issued by the Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) of the European Medicines Agency (EMEA). Como indicado nas páginas 4 e 5 do presente documento:
[0048] Vários possíveis pontos fracos foram identificados e podem resultar em caracterização errônea da disposição da droga e da formação de anticorpos. As seguintes questões devem ser consideradas [...]:
[0049] Imunoensaio
Ensaio de drogas:
[...] [0050] (iii) a interferência por substâncias endógenas.
[0051] (iv) interferência pelos componentes do plasma ou anticorpos antidrogas que se ligam ao analito e inibem a ligação complementar para capturar anticorpo.
[0052] A invenção particularmente ser usada para prever, reduzir ou evitar este tipo de interferência em imunoensaios que é usado na análise de amostras/ensaio de amostras de fluidos biológicos, retiradas de indivíduos nos quais foram administrados ISV's (e em particular; Nanocorpos ou um produto biológico à base de ISV ou produto biológico baseado em Nanocorpo, conforme definidos aqui).
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30/136 [0053] A invenção em particular pode ser usada para prever, reduzir ou evitar a interferência de proteína deste tipo (não específica) em imunoensaios que são utilizados para a caracterização da disposição de drogas e/ou para determinar a formação de quaisquer anticorpos (antidrogas) ADA's. A este respeito, deve notar que geralmente neste relatório e reivindicações anexas, que quando palavras como prever, reduzir ou evitar a interferência de proteína é usada, isso não só inclui prever, reduzir ou evitar tais proteínas interferência por si, mas também geralmente prever, reduzir ou evitar a ocorrência de sinais não específicos em imunoensaios (tais como aqueles em que sinais (não específicos) associados com a interferência de proteína pode ocorrer, por exemplo, em ensaios ADA), e particularmente, prever, reduzir ou evitar, que em tais imunoensaios, a ocorrência de sinais não específicos que, quando estes são observados em tal ensaio, são geralmente atribuídos, associados e/ou tomados como um sinal de interferência de proteína (não específica). A este respeito, geralmente convém, como mencionado neste documento, que a presente invenção não é especificamente limitada à casualidade, explicação, hipótese ou mecanismo.
[0054] Em um aspecto específico, mas não limitativo, a invenção pode ser usado para prever, evitar ou reduzir tais interferências de proteína em ensaios anticorpo antidroga ou ensaios ADA que são realizados nos ensaios (ou seja, análise
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31/136 de amostras”) de fluidos biológicos recolhidos de análise de amostras de fluidos biológicos, retiradas de indivíduos nos quais foram administrados ISV's (e em particular; Nanocorpos ou um produto biológico à base de ISV ou produto biológico baseado em Nanocorpo, conforme definidos aqui).
[0055] Em outro aspecto específico, mas não limitativo, a invenção pode ser usada para prever, evitar ou reduzir tais interferências de proteína (e/ou sinais não específicos geralmente associados com o mesmo) em anticorpo antidroga ou ensaios ADA que são usados para detectar, medir e/ou caracterizar a presença de (qualquer) anticorpos antidroga contra um ou mais ISV (e, em particular contra Nanocorpos; ou um Produto biológico à base de ISV ou produto biológico à base de Nanocorpo conforme adicionalmente definido aqui). Em particular, a invenção pode ser usada para prever, evitar ou reduzir tais interferências de proteína em tais anticorpo antidroga ou ensaios ADA que são realizados em amostras (ou seja, amostras de testes de fluidos biológicos, e mais em particular em amostras de fluidos biológicos de que foram retiradas de indivíduos nos quais foram administrados um ou mais ISV's ou Nanocorpos (ou um produto biológico à base de ISV ou produto biológico à base de Nanocorpo conforme adicionalmente definido aqui). Por exemplo, a invenção pode ser usada para prever, evitar ou reduzir tais interferências de proteína em tais anticorpo antidroga ou ensaios ADA que são usados para
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32/136 detectar, medir e/ou caracterizar a presença de (qualquer) anticorpos antidroga contra ISV ou Nanocorpo (ou um produto biológico à base de ISV ou produto biológico à base de Nanocorpo, conforme adicionalmente definido aqui) que foram administrados em um indivíduo do qual a amostra foi obtida (no contexto de um ensaio clínico ou no contexto terapêutico).
[0056] Assim, um aspecto específico, mas não limitativo, a invenção pode ser usado para prever, evitar ou reduzir tais proteínas interferência (e/ou sinais não específicos geralmente associados com o mesmo) em amostras biológicas (ou seja, amostras de testes) retiradas de indivíduos nos quais foram administrados um ou mais ISV's ou Nanocorpos (ou um produto biológico à base de ISV ou produto biológico à base de Nanocorpo, conforme adicionalmente definido aqui), no qual as ditas amostras são apropriadas e/ou pretendidas para uso em um ensaio imunológico, tal como um ensaio ADA. Como mencionado, tal amostra biológica pode ser sangue (incluindo todo o sangue, soro, plasma, fluido ocular, fluido broncoalveolar/BALF, fluido cefalorraquidiano ou outras amostras de fluidos biológicos adequados ou amostra que é adequada para uso em um imunoensaio, e em particular um ensaio ADA.
[0057] Em um aspecto específico, mas não limitativo tal amostra de teste pode ser obtida de um indivíduo que tenha sido submetido a várias administrações (por exemplo, pelo menos 1 a 3 administrações separadas por um período de pelo menos 10 dias,
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33/136 como pelo menos um mês ou mais) e/ou para tratamento crônico (ou seja, tratamento durante pelo menos 10 dias, tal como pelo menos um mês) com um ISV, Nanocorpo, um produto biológico à base de ISV (conforme adicionalmente definido aqui) ou produto biológico à base de Nanocorpo (conforme adicionalmente definido aqui). Tal ISV, Nanocorpo, produto biológico à base de ISV ou produto biológico à base de Nanocorpo pode, por exemplo, ter sido administrados ao dito indivíduo no contexto terapêutico ou no contexto de um ensaio clínico.
[0058] Em um aspecto específico, mas não limitativo tal amostra de teste pode ser obtida de um indivíduo ao qual ISV, Nanocorpo, produto biológico à base de ISV ou produto biológico à base de Nanocorpo, tem sido administrados que tem (e/ou foi fornecido com) um meia-vida aumantada (como definido aqui e comparado com um ISV monovalente), por exemplo, uma meia-vida pelo menos 1 dia, de preferência pelo menos 3 dias, mais de preferência pelo menos 7 dias, tal como pelo menos 10 dias no indivíduo ao qual a mesma é/foi administrada.
[0059] Por exemplo, e sem limitação, tal ISV, Nanocorpo, produto biológico à base de ISV ou produto biológico à base de Nanocorpo pode ter sido formnecido com uma meia-vida aumentada pela funcionalização e/ou por incluir no construto uma porção ou unidade de ligação que aumentam a meia-vida do construto. Exemplos de tais funcionalização, porção ou unidade de ligação serão claros para uma pessoa versada na arte podem, por exemplo,
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34/136 ser descritas neste documento e, por exemplo, podem incluir peguilação, fusão a albumina sérica, fusão a um peptídeo ou uma unidade de ligação que pode se ligar a uma proteína do soro, tal como a albumina sérica. Tal peptídeo que se liga a albumina sérica ou domínio de ligação pode ser qualquer peptídeo que se liga a albumina sérica ou domínio de ligação apropriado capaz de aumentar à meia-vida do construto (em comparação com o mesmo construto sem o peptídeo que se liga albumina sérica ou o domínio de ligação) e em particular pode ser o peptídeo que se liga albumina sérica conforme descrito no WO 2008/068280 da própria Requerente (e em especial ao WO 2009/127691 e o pedido de patente ainda não publicado 61/301.819 ambos da própria Requerente), ou um ISV que se liga a albumina sérica (tal como um Nanocorpo que se liga à albumina sérica; por exemplo, Alb-1 ou uma versão humanizada da Alb-1, tal como Alb-8, para as quais, por exemplo, referência é feita ao WO 06/122787).
[0060] Assim, em um aspecto específico, mas não limitativo, tal amostra biológica pode ser obtida de um indivíduo para o qual um ISV, Nanocorpo, produto biológico à base de ISV, produto biológico à base de Nanocorpo tem sido administrado que compreende um peptídeo de ligação à albumina (humana) ou um domínio de ligação.
[0061] Como já mencionado acima, em um aspecto não limitativo, a invenção geralmente se relaciona com um método que pode ser usado para prever se um determinado ISV ou Nanocorpo (ou fármaco
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35/136 à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) dará origem a (ou tem tendência alta ou aumentada para dar origem a) interferência de proteína (como descrita neste documento) em um imunoensaio (ou seja, após o dito ISV ter sido administrado a um indivíduo, uma amostra de um fluido biológico do dito indivíduo foi obtida, e o dito fluido biológico foi submetido a um imunoensaio como adicionalmente descrito aqui), o dito método compreende a realização de um imunoensaio que pelo menos compreende as etapas de:
(i) contatar o dito ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) com um anticorpo que foi obtido de um indivíduo humano e que foi selecionado, gerado e/ou isolado com base na sua capacidade de reconhecer e/ou de se ligar à extremidade C-terminal de um ISV ou Nanocorpo (anticorpo analítico); e (ii) determinar se o dito ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) está ligado pelo dito anticorpo no dito imunoensaio.
[0062] Novamente, como mencionado neste documento, um ISV conforme descrito neste documento pode especialmente ser um
Nanocorpo ou um (outro)
ISV (ou seja, outro que não seja um
Nanocorpo) que é um domínio VH ou que compreende um domínio VH; e que seja de preferência um Nanocorpo.
[0063] Além disso, qualquer proteína ou polipeptídeo que compreende um ISV (tal como um fármaco à base de ISV) de
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36/136 preferência tem o dito (ou pelo menos um) ISV em sua extremidade C-terminal. Novamente, o dito ISV pode especialmente ser um Nanocorpo ou um (outro) ISV (ou seja, outro que não seja um Nanocorpo) que é um domínio VH ou que compreende um domínio VH; e que seja de preferência um Nanocorpo.
[0064] Em uma modalidade alternativa, que também é descrita neste documento, em vez do anticorpo acima obtido de um indivíduo humano, o anticorpo monoclonal aqui referido como 21-4-3 (ou 21-4 para curto, ver SEQ ID NO's 35 e 36 para as seqüências VH e VL) pode ser usado. 21-4 foi gerado usando a tecnologia de hibridomas, a partir de um rato imunizado com o construto do Nanocorpo de SEQ ID NO: 98 em WO 2006/122825, como melhor descrito no exemplo 7, e uma linhagem de células de hibridoma (chamada ABH0015) expressando 21-4 foi depositada em 4 de junho de 2012 na BCCM, Ghent, Bélgica, sob o número de adesão LMBP-9680-CB. O monoclonal 21-4 mostrou reconhecer o construto do Nanocorpo de SEQ ID NO: 98 no WO 2006/122825, cuja extremidade C-terminal consiste de um Nanocorpo (VHH humanizado) levantado contra o fator de Von Willebrand (vWF). 21-4 foi originalmente criado como reagente analítico para uso na detecção da proteína Nanocorpos (n particular, o construto de Nanocorpo de SEQ ID NO: 98 no WO 2006/122825) em amostras (soro); surpreendentemente, agora foi encontrado que 21-4 também pode ser usado para prever se um ISV tem uma tendência a sofrer interferência de proteína não específica (mais assim que alguns outros, (ratos)
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37/136 monoclonais comparáveis levantados contra o construto de Nanocorpo de SEQ ID NO: 98 em WO 2006/122825 ou contra outros Nanocorpos).
[0065] Em particular, verificou-se que se a ligação de 21-4 para um ISV (ou para proteína ou polipeptídeo que contém um ISV em sua extremidade C-terminal, polipeptídeo ou proteína similar como mencionado neste documento) dá um valor de RU de menos de 500 (após ajustar o valor do RU medido para o peso molecular da proteína, de acordo com a fórmula [RU medido]/[MW da proteína] X 106) quando determinada de acordo com o protocolo estabelecido no exemplo 9, onde o dito ISV ou proteína provavelmente não terá uma tendência a sofrer interferência de proteína (dentro da confiança fornecida pelo conjunto de dados estabelecidos nos exemplos abaixo). Para efeitos da fórmula acima, MW pode ser calculado como a soma de todos os MW's de todos os resíduos de aminoácidos presentes no ISV.
[0066] Assim, qualquer ISV, proteína ou polipeptídeo descrito neste documento, de preferência tem um valor RU para ligação de 21-4 de menos de 500 (determinado de acordo com o protocolo estabelecido no exemplo 9, e após ajustar o valor medido do RU para o peso molecular do ISV ou da proteína usada de acordo com a fórmula acima enunciada).
[0067] Assim, este aspecto da invenção geralmente se refere a um método que pode ser usado para prever se um determinado ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de
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Nanocorpo) dará origem à (ou tem a tendência alta ou aumentada para dar origem à) interferência de proteína (como descrita neste documento) em um imunoensaio (ou seja, após o dito ISV ter sido administrado em um indivíduo uma amostra de um fluido biológico do dito indivíduo foi obtida, e o dito fluido biológico é submetido a um imunoensaio como adicionalmente descrito aqui), o dito método compreendendo a realização de um imunoensaio que pelo menos compreende as etapas de:
(i) contatar o dito ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) com o anticorpo monoclonal 21-4 (ou seja, usado como o anticorpo analítico); e (ii) determinar se o dito ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) está ligado pelo anticorpo monoclonal 21-4 no dito imunoensaio [0068] O dito método pode em particular ser realizado usando BiaCore ou uma técnica semelhante, e mais em particular utilizando o protocolo estabelecido no exemplo 9. Como mencionado aqui, quando a ligação do ISV ou fármaco à base de ISV neste protocolo mostra um valor de RU de menos de 500 (após ajustar o valor medido do RU para o peso molecular da proteína, de acordo com a fórmula [RU medido]/[MW da proteína] X 106), o dito ISV ou proteína à base de ISV provavelmente não será ligado a nenhum efeito de interferência presente no sangue ou soro de um ser humano e/ou provavelmente não terá uma tendência a sofrer interferência de proteína não específica em um ensaio ADA (ou
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39/136 seja, dentro os graus de confiança estabelecidos na parte experimental abaixo).
[0069] Novamente, como mencionado neste documento, um ISV conforme descrito neste documento pode especialmente ser um Nanocorpo ou um (outro) ISV (ou seja, outro que não seja um Nanocorpo) que é um domínio VH ou que compreende um domínio VH;
e que seja de preferência um Nanocorpo.
[0070] Além disso, qualquer proteína ou polipeptídeo que compreende um ISV (como um fármaco à base de ISV) de preferência tem o dito (ou pelo menos um) ISV em sua extremidade C-terminal. Novamente, o dito ISV pode especialmente ser um Nanocorpo ou um (outro) ISV (ou seja, outro que não seja um Nanocorpo) que é um domínio VH ou que compreende um domínio VH; e que seja de preferência um Nanocorpo.
[0071] Como também mencionados aqui, o método acima, usando 214 também pode ser usado para determinar se um ISV ou proteína ou polipeptídeo, que compreende um ISV, está ligado (ou tem uma tendência a ficar ligado) pelos fatores de interferência que estão presentes no sangue ou soro de um ser humano.
[0072] Também, como mencionado neste documento, prevê-se que o dito método usando 21-4 também pode ser usado para prever se qualquer proteína ou polipeptídeo (como um fragmento de anticorpo ou ScFv) que tem um domínio VH em sua extremidade Cterminal será ligado (ou tem uma tendência a ficar ligado) pelos fatores de interferência que estão presentes no sangue ou soro
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40/136 de um ser humano e/ou tem uma tendência a sofrer interferência de proteína em um ensaio ADA.
[0073] Além de 21-4, prevê-se que um anticorpo ou fragmento de anticorpo (tal como um fragmento Fab apropriado) que contém a cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve de 21-4 (ver do SEQ ID NO: 35 e 36, respectivamente) ou mesmo apenas as seqüências CDR de 21-4 (devidamente enxertados em outras estruturas adequadas de VH e VK) também podem ser utilizadas nos métodos descritos neste documento.
[0074] Conforme adicionalmente descrito neste documento, a invenção pode especialmente ser usada para prever se um determinado ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) dará origem à interferência de proteína (como descrita neste documento) em um imunoensaio que é um ensaio ADA. O dito ensaio ADA, por exemplo, pode ser um ensaio ADA para detectar ou medir ADA's contra ISV's em geral e em particular pode ser um ensaio ADA para detectar ou medir ADA's contra o ISV usado nas etapas (i) e (ii) acima.
[0075] Em um aspecto particular preferencido, mas não limitativo, a invenção pode ser usada para prever se um determinado ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) dará origem à interferência de proteína (como descrita neste documento) em um imunoensaio (e em particular, em um ensaio ADA) que envolve o uso de tal ISV. Novamente, o dito ensaio ADA, por exemplo, pode ser um ensaio
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ADA para detectar ou medir ADA's contra ISV's em geral e em particular pode ser um ensaio ADA para detectar ou medir ADA's contra ISV's usado nas etapas (i) e (ii) acima.
[0076] Em um aspecto mais particular, mas não limitativo, a invenção pode ser usada para prever se um determinado ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) dará origem à interferência de proteína (como descrita neste documento) em um imunoensaio (e em particular, em um ensaio ADA) que envolve o uso de tal ISV. Por exemplo, tal imunoensaio pode ser um promotor do ensaio (ou seja, envolvendo o ISV) que é realizado para determinar ou medir se nenhum ADA contra o dito ISV está presente na amostra que é testada, onde a dita amostra é uma amostra de fluido biológico (conforme descrito neste documento) que é obtida a partir de um indivíduo, ao qual foi administrado o dito ISV (como descrito neste documento). Por exemplo, como já descrito neste documento, a dita amostra (ou seja, a amostra de teste) pode ser uma amostra de (incluindo todo o sangue, soro ou plasma), fluido ocular, fluido broncoalveolar/BALF, fluido cefalorraquidiano ou qualquer outro fluido biológico adequado e pode, em particular, ser uma amostra biológica que é apropriada e/ou pretendida para o uso em um ensaio imunológico, tal como um ensaio ADA.
[0077] Como já descrito neste documento, em todos estes aspectos (e nos demais aspectos da invenção descritos aqui), a invenção também pode ser usada para selecionar os ISV's que são
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42/136 menos ou não são propensos a tais interferências de proteína em imunoensaios ou ensaios ADA; tal como um ensaio ou teste que pode ser usado para testar se certas modificações para um ISV reduzirá (total ou parcialmente) sua tendência a dar origem a tais interferências em imunoensaios ou ensaios ADA; e/ou como um ensaio ou teste que pode ser usado para guiar a modificação ou melhoria de um ISV a fim de reduzir sua tendência a dar origem a tais interferências de proteína em imunoensaios ou ensaios ADA.
[0078] Como mencionado, a etapa (i) do método da invenção compreende contatar o dito ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) com um anticorpo que foi obtido de um indivíduo humano e foi selecionado/isolado com base na sua capacidade de reconhecer e/ou de se ligar à extremidade C-terminal de um ISV ou Nanocorpo (como descrito neste documento). Na dita etapa (i) do método aqui descrito, dito ISV ou Nanocorpo (fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) é usado como antígeno no imunoensaio (ou seja, como a substância a ser detectada). Também, na dita etapa (i), o anticorpo que foi obtido de um indivíduo humano e que foi selecionado/isolado com base na sua capacidade de reconhecer e/ou de se ligar à extremidade C-terminal de um ISV ou Nanocorpo é usado como reagente analítico (ou seja, da mesma maneira que outros anticorpos são usados em imunoensaios para detectar a presença de um antígeno ao qual eles são direcionados).
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43/136 [0079] Como já mencionado, a fim de entender melhor a invenção aqui descrita, note que, na etapa (i), o ISV será usado geralmente como antígeno (ou seja, como o composto a ser detectado), e o anticorpo analítico será usado como o agente analítico (isto é, como um meio para detectar se um determinado ISV se liga ou não, respectivamente; e, portanto, tem um risco maior ou elevado de dar origem à interferência de proteína ou não, respectivamente). Por exemplo, quando a etapa (i) é executada em um formato de ELISA, o agente analítico/ anticorpo será de modo geral ligado ao portador (ou seja, a placa ELISA) e o ISV estará (presente) na amostra a ser testada.
[0080] Por outro lado, deve-se notar que, em ensaios ADA para detectar ou medir ADA's contra um ISV, o ISV é usado como agente analítico (ou seja, como o composto usado para detectar se nenhum ADA está presente), e os ADA's são os antígenos (ou seja, o composto a ser detectado). Assim, nestes ensaios, o ISV será geralmente/frequentemente ligado ao transportador (como a placa ELISA), considerando que ADA (se houver) estará presente na amostra que é submetida ao ensaio.
[0081] No entanto, como já mencionado, geralmente deve se notar que a invenção não está limitada aos ensaios, em que o anticorpo analítico é ligado ao transportador. Por exemplo, uma forma alternativa de realizar um ensaio de acordo com a invenção (conforme mostrado no exemplo 5), o anticorpo analítico em vez disso é usado como um agente de ponte e assim será em solução
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44/136 em vez de se ligar à placa (apesar deste está indiretamente ligado à placa através do ISV que é revestido na placa). No entanto, também no ensaio (ponte) específico descrito no exemplo 5 (que é um ensaio competitivo) o anticorpo analítico ainda é usado como o agente analítico (ou seja, para determinar se o ISV de interesse se liga ou não, respectivamente; e, portanto, tem um risco aumentado ou elevado de dar origem à interferência de proteína ou não, respectivamente). Prevê-se também que, com base na divulgação dada aqui, uma pessoa versada será capaz de projetar outros formatos de ensaio em que o anticorpo analítico pode ser usado como um agente analítico para determinar se um determinado ISV pode se ligar ou não, respectivamente; e, portanto, tem um risco aumentado ou elevado de dar origem à interferência de proteína ou não.
[0082] O anticorpo analítico usado na etapa (i) pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal.
[0083] Quando o anticorpo analítico é um anticorpo policlonal, este pode, por exemplo, ser um anticorpo policlonal (preparação), que foi obtido/purificado/isolado de uma amostra biológica obtida de um indivíduo humano (tais como sangue, plasma, células B ou outra amostra ou fluido biológico adequado do quais os anticorpos policlonais podem ser devidamente isolados). Por exemplo, isso pode ser uma amostra biológica adequada que foi obtida de um indivíduo humano para o qual pelo menos um ISV (tal como o ISV usado na etapa (i), mas isso não é
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45/136 necessário ou essencial) foi administrado, mas também pode ser (e de preferência é) uma amostra biológica adequada de um indivíduo humano que nunca recebeu ou que foi tratado com ISV. O mais importante é que o anticorpo policlonal foi obtido de uma dita amostra biológica por um método que envolve pelo menos uma etapa de afinidade usando uma matriz de afinidade ou coluna que carrega um ISV como a porção de afinidade (e uma ou mais etapas adicionais para obtenção/purificação/isolamento dos anticorpos policlonais conhecidos por si). Por exemplo, o anticorpo policlonal pode ser obtido de tal amostra biológica através de cromatografia de afinidade usando uma coluna de afinidade que carrega um ISV, como por exemplo, descrito no exemplo 2. Isso por exemplo pode ser realizado usando técnicas conhecidas para cromatografia de immunoaffinity para isolar os anticorpos de uma amostra biológica, usando uma matriz de afinidade que carrega um ISV como o antígeno. Tais técnicas são geralmente conhecidas na arte e exemplos adequados destas serão claros para uma pessoa versada na arte com base na presente divulgação.
[0084] Um anticorpo policlonal (preparação) pode particularmente ser um IgG (ou fração de IgG).
[0085] Por exemplo, isto pode ser um anticorpo policlonal que foi obtido por meio de um método que envolve a cromatografia de afinidade (imuno) realizada em uma amostra de fluido biológico obtido de um indivíduo humano, usando um ISV como antígeno para ligar à matriz de afinidade (e em particular um Nanocorpo, tal
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46/136 como um VHH, VHH de seqüência otimizada e/ou humanizado ou um VH camelizado, tal como um VH humano camelizado) que não contenha uma etiqueta C-terminal (i.e., da qual a extremidade C-terminal da sequência termina com VTVSS (SEQ ID NO: 33)). Em particular, o ISV usado como o antígeno para ligar a matriz de afinidade pode ser um VHH de seqüência otimizada ou humanizado (ou alternativamente um VH humano camelizado correspondente) da qual a extremidade C-terminal da sequência termina com VTVSS (SEQ ID NO: 33). Em um aspecto específico, mas não limitativo, o ISV usado como o antígeno que se liga à matriz de afinidade pode ser um VHH de seqüência otimizada ou humanizado que, como resultado de tal seqüência de otimização ou humanização, compreende um resíduo de prolina (P) na posição 14 onde o VHH nativo correspondente compreende uma alanina (A) na posição 14 em outras palavras, o ISV (usado como o antígeno é uma versão humanizada de um VHH que naturalmente compreende uma alanina na posição 14, cujo resíduo de alanina, resultante da humanização e/ou da otimização da seqüência foi substituído por um resíduo de prolina (P)). O ISV usado como o antígeno também pode incluir uma ou mais outras substituições de aminoácidos como resultado de tal humanização ou otimização da seqüência, por exemplo, descrito de modo geral no WO 08/020079 ou WO 09/138519.
[0086] Alguns exemplos específicos de ISVs que podem ser usados como o antígeno para gerar/isolar o anticorpo analítico usados na invenção são fornecidos nas SEQ ID NO's: 1 e 2.
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47/136 [0087] Novamente, o método usado para obter o anticorpo policlonal pode, além das etapas de afinidade (imune), também incluir uma ou mais etapas adicionais de isolar/purificar um anticorpo policlonal da amostra biológica (realizada antes ou após as etapas de afinidade). Novamente, tais etapas e técnicas para executá-las serão claras para uma pessoa versada na arte.
[0088] Assim, em um aspecto, a invenção compreende um método como adicionalmente descrito aqui que compreende etapas (i) e (ii) descritas aqui, em que o anticorpo analítico (ou seja, o anticorpo que foi obtido de um indivíduo humano e que tem sido selecionado/isolado com base na sua capacidade de reconhecer e/ou de se ligar à extremidade C-terminal de um ISV ou Nanocorpo) foi obtido de uma amostra biológica obtida de um indivíduo humano (onde a dita amostra biológica é uma amostra que é adequada para uso em um método para gerar/isolar um anticorpo da dita amostra) usando um método que compreende pelo menos uma etapa de afinidade (como uma etapa de cromatografia de afinidade, tais como cromatografia de imunoafinidade) na qual um ISV (e de preferência um Nanocorpo) é usado como um antígeno, e de preferência um ISV é usado como um antígeno que compreende a sequência de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) como a seqüência C-terminal, e mais preferencialmente um Nanocorpo de seqüência otimizada ou humanizado é usado como o antígeno que compreende a sequência de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) como a seqüência C-terminal, e ainda mais preferivelmente, um Nanocorpo de
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48/136 seqüência otimizada ou humanizado é usado como o antígeno que compreende a sequência de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) como a seqüência C-terminal e que compreende um resíduo de prolina na posição 14, como um Nanocorpo que compreende a sequência de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO: 33), como a seqüência C-terminal e que compreende um resíduo de prolina na posição 14 que foi introduzido no Nanocorpo como resultado da dita humanização e/ou otimização de sequência (por exemplo, para substituir um resíduo de alanina que ocorre naturalmente na dita posição no VHH que foi humanizado e/ou teve a seqüência otimizada).
[0089] Os ISV's acima também podem ser usados em métodos para isolar os anticorpos monoclonais (novamente a partir de uma amostra biológica adequada, obtidas de um ser humano) que são adequados para uso na invenção como anticorpo analítico.
[0090] Por exemplo, tal anticorpo monoclonal que pode ser obtido do sangue, células B ou outro material ou amostra apropriada para isolar os anticorpos, pode ser selecionado com base em sua capacidade de reconhecer e/ou se ligar a (extremidade C-terminal de) um ISV ou Nanocorpo (em que, novamente, os ISV's usados como antígeno durante a triagem e/ou seleção são de preferência conforme descrito nos parágrafos anteriores incluindo as preferências declaradas para tal ISV/antígeno). Tal triagem e seleção podem ser efetuadas de forma adequada, por exemplo, usando essencialmente as mesmas técnicas de seleção e/ou expansão de células B ou outras apropriadas semelhantes às
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49/136 técnicas de seleção da célula B descritas na patente EP 0488470, WO 92/02551, EP1633787, WO 01/55216, WO 02/26829, WO 04/051268, WO 04/102198 ou WO 04/106377 ou técnicas semelhantes à técnica descrita no WO 06/079372 (mas usando células B humanas ao invés de células B de camélideos).
[0091] Uma vez que uma ou mais células B que expressam um anticorpo adequado foram identificadas/isolada, o dito anticorpo pode ser isolado, expresso ou produzido de forma adequada. Por exemplo, a dito célula B pode ser imortalizada como hibridomas produzindo os anticorpo/anticorpos desejados (usando técnicas conhecidas por si, para a geração de hibridomas, a partir de Células B selecionadas), e o dito anticorpo/anticorpos podem então ser isolados (o sobrenadante da cultura) dos ditos hibridomas, novamente usando técnicas adequadas, bem conhecidas na arte e descritas em vários manuais e padrões, e também descritos ou referidos nas publicações de patentes mencionadas no parágrafo anterior.
[0092] Como alternativa, as ditas células B podem ser expandidas utilizando técnicas de expansão de células B conhecidas por si, e o anticorpo/anticorpos podem ser isolados (o sobrenadante da cultura) das ditas células B expandidas. Novamente, estas podem ser realizadas usando técnicas adequadas, bem conhecidas na arte e descritas em vários manuais e padrões, e também descritos ou referidos nas publicações de patentes mencionadas no parágrafo anterior.
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50/136 [0093] Em ainda como alternativa, o DNA que codifica o anticorpo/anticorpos de interesse pode ser obtido (por exemplo, pela amplificação) das ditas células B ou outras células apropriadas, ainda diretamente (por exemplo, usando técnicas de clonagem PCR de célula única) ou após a expansão adequada da célula B desejada. O dito DNA pode então ser expresso adequadamente no organismo hosedeiro ou célula hospedeira adequada para fornecer o anticorpo/anticorpos desejados. Novamente, isso pode ser realizado usando técnicas adequadas, bem conhecidas na arte e descritas em vários manuais e padrões, e também descritos ou referidos nas publicações de patentes mencionadas no parágrafo anterior.
[0094] Também é possível gerar anticorpos monoclonais que são adequados para uso como o anticorpo analítico por um método que envolve repertório clonagem (a partir de uma amostra adequada, obtida de um indivíduo humano) e a seleção do repertório clonado para anticorpos que se ligam ao ISV utilizado como antígeno (na qual, novamente, os ISV's usados como o antígeno durante a triagem e/ou seleção, são de preferência conforme descritos nos parágrafos anteriores, incluindo as preferências declaradas para tal ISV/antígeno). Métodos para a clonagem de repertório e várias técnicas para exibir repertórios clonados para seleção e triagem (tais como a exibição do fago, exibição do ribossoma e exibição de levedura) serão claros para uma pessoa versada na arte e são descritas, por exemplo, no EP
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589877, EP 0 774 511, WO 90/14430 e EP 0368 684 bem como em vários manuais sobre o assunto.
[0095] Geralmente, a amostra biológica que é usada como ponto de partida para a obtenção do anticorpo analítico (monoclonal ou policlonal) pode ser qualquer amostra apropriada (ou seja, adequada como material de partida para a obtenção de um anticorpo monoclonal ou policlonal, respectivamente) obtido de qualquer indivíduo humano adequado. Em um aspecto específico, mas não limitativo tal amostra pode, por exemplo, ter sido obtida de uma mulher e em especial uma mulher após a menopausa. Assim, em um aspecto específico, mas não limitativo, o anticorpo analítico usado nas etapas (i) e (ii) acima foi obtido a partir de uma amostra biológica que foi obtida/derivada de uma mulher após a menopausa (ou foi um anticorpo obtido/derivado de uma mulher pós-menopausa).
[0096] Além disso, a amostra biológica que é usada como ponto de partida para a obtenção do anticorpo analítico (monoclonal ou policlonal) pode ser obtida um indivíduo no qual o ISV foi administrado anteriormente (por exemplo, como parte de um ensaio clínico ou terapêutico), mas de preferência que provém de um indivíduo a quem anteriormente não foi administrado o ISV.
[0097] No entanto, deve notar-se que a invenção não é particularmente limitada à fonte dos analíticos anticorpo/anticorpos utilizados, e tem sido possível em alguns casos, usando as técnicas descritas neste documento, para obter
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52/136 (gerar, isolar) outros anticorpos analíticos adequados de outras fontes, incluindo sangue humano ou plasma comercialmente disponíveis (e mesmo sangue, plasma ou células B de outras espécies de mamíferos ou primatas, tais como macacos babuínos ou cynomolgus).
[0098] Como mencionado acima, o anticorpo analítico (monoclonal ou policlonal) usado nas etapas (i) e (ii) deve ser tal que seja capaz de reconhecer ou de se ligar à extremidade C-terminal de um ISV ou Nanocorpo e que mais preferencialmente seja selecionado e/ou isolado com base na capacidade de se ligar à extremidade C-terminal de um ISV ou Nanocorpo.
[0099] Como pode ser visto na Figura 2, quando o ISV é baseado ou derivado de um VHH ou domínio VH, a extremidade C-terminal de um ISV compreende a sequência de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO: 33), e consequentemente o anticorpo analítico deve ser capaz de reconhecer qualquer ISV que tem a sequência de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) em sua extremidade C-terminal. Como ainda pode ser visto na Figura 2, (pelo menos alguns dos resíduos de aminoácidos na) a seqüência VTVSS (SEQ ID NO: 33) é parte de um epítopo putativo sobre o ISV que também inclui, entre outros resíduos, o resíduo de aminoácido na posição 14 (e os resíduos de aminoácidos pertos/próximos ao mesmo na seqüência de aminoácidos, tais como nas posições, 11, 13 e 15) e pode também incluir o resíduo de aminoácido na posição 83 (e os resíduos de aminoácidos pertos/próximos ao mesmo na seqüência de
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53/136 aminoácidos, tais como nas posições 82, 82a, 82b e 84) e/ou o resíduo de aminoácido na posição 108 (e os resíduos de aminoácidos pertos/próximos ao mesmo na seqüência de aminoácidos, tais como na posição 107. A posição 109 é o primeiro V da sequência C-terminal VTVSS (SEQ ID NO: 33) e tem sido demonstrado que, por exemplo, a posição 110 pode também ter uma influência sobre a interferência de proteína). Isto é também coletivamente referido aqui como a região C-terminal, subentendendo-se que esta região C-terminal pelo menos compreende a seqüência C-terminal VTVSS (SEQ ID NO: 33) e o resíduo de aminoácido na posição 14 e pode também incluir os resíduos de aminoácidos nas posições 83 e 108 e possivelmente também os resíduos de aminoácidos nas posições 13, 15, 82b, 83, 84 e 107.
[00100] Como já mencionado e novamente sem se limitar a qualquer hipótese ou explicação, em um anticorpo monoclonal de quatro cadeias de tamanho completo, ou em um anticorpo único de cadeia pesada de tamanho completo, tais como os presentes nos camelídeos, a extremidade C-terminal de um VHH ou domínio VH está ligada ao resto do anticorpo - ou seja, para a região CH1 nos monoclonais convencionais ou para a região de dobradiça em anticorpos de cadeia pesada de camelídeos respectivamente - e, portanto, em tais anticorpos tamanho completo podem ser protegidos de tal interferência de proteína) e/ou coberto pela interação VH/VL (no anticorpo de quatro cadeias convencionais),
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54/136 de mdoo que esta região C-terminal seja, portanto, geralmente não acessível e/ou solvente exposta como um site de interação de proteínas que está presente no sangue, soro ou no corpo de uma pessoa no qual o tal ISV é administrado. No entanto, se um ISV ou Nanocorpo é usado por si (ou seja, sem estar ligado a qualquer outra parte de um anticorpo), ou se é um fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo que é usado para transpoertar um ISV ou Nanocorpo em sua extremidade C-terminal, este epítopo do C-terminal está disponível para interação (não específica) com outras proteínas e, novamente sem se limitar a qualquer hipótese ou explicação, presume-se que esta região Cterminal pode agora ser acessível para se submeter a uma interação de proteínas (não específica) com uma ou mais proteínas que são pré-existentes na amostra de teste (por exemplo, um ou mais IgG's) para ser testado e que isso pode causar interferência de proteína e/ou sinais não específicos nos imunoensaios (e em particular em ensaios ADA).
[00101] Como mencionado, os métodos descritos neste documento podem ser usados para prever, reduzir ou evitar tal interação da proteína e também podem ser usados como uma ferramenta para orientar a modificação para o ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo a fim de fornecer os mesmos com uma tendência reduzida (parcialmente ou de preferência totalmente completo) para dar origem a tais interferências de proteína.
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55/136 [00102] Como será evidente a partir do parágrafo anterior e, novamente, sem se limitar a qualquer hipótese ou explicação, é particularmente esperado (e parte dos ensinamentos da presente invenção) que (certas) modificações na região C-terminal alterará (e de preferência reduzirá) a tendência de um ISV de se submeter a tal interação de proteínas não específica, e também é observada experimentalmente (ver, por exemplo, os resultados experimentais apresentados nos exemplos 1C e 3, abaixo).
[00103] Com base nisto e novamente sem se limitar a qualquer hipótese ou explicação, a presente invenção também ensina algumas modificações que podem ser introduzidas para essa finalidade na região C-terminal do ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo (da qual a eficácia (potencial) pode ser testada usando os métodos descritos nestes documentos). Também, com base nos ensinamentos deste documento, prevê-se que uma pessoa versada na arte será capaz de escolher, projetar ou propor outras modificações para à região C-terminal, que poderia ser apresentada para essa finalidade (e de que a eficácia (potencial) pode novamente ser testada usando os métodos descritos neste documento).
[00104] Retornando ao anticorpo analítico utilizado na invenção, é preferivel que um anticorpo (monoclonal ou policlonal) que reconhece a região C-terminal (como definido acima) de um ISV e em particular, mas sem se limitar a região C-terminal de um Nanocorpo.
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56/136 [00105] Por exemplo, em um aspecto específico, mas não limitativo, o anticorpo analítico pode ser um monoclonal ou policlonal que reconhece (e/ou é capaz de se ligar a e, em particular de se ligar especificamente a) região C-terminal de um ISV ou Nanocorpo, cuja extremidade C-terminal da sequência termina com VTVSS (SEQ ID NO: 33), mas não reconhece (e/ou não é capaz de se ligar especificamente a) a região C-terminal de um ISV ou Nanocorpo (que pode ser um ISV diferente, mas de preferência é o mesmo ISV) quando há um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais (tais como resíduos de aminoácidos de 1 a 5, ou alternativamente uma sequência de peptídeos pequenos ou até mesmo outro polipeptídeo ou proteína) ligado ao C-terminal VTVSS (SEQ ID NO: 33).
[00106] Em outro aspecto mais específico, mas também não limitativo, o anticorpo analítico pode ser um monoclonal ou policlonal que reconhece (e/ou é capaz de se ligar a e, em particular de se ligar especificamente a) região C-terminal de um ISV ou Nanocorpo do qual a extremidade C-terminal da sequência termina com VTVSS (SEQ ID NO: 33) e na qual a posição 14 é um aminoácido que não ocorre naturalmente na posição 14 e/ou foi modificado em relação ao aminoácido que ocorre naturalmente na posição 14 (por exemplo, como resultado da humanização, camelização e/ou da seqüência de otimização), mas que não reconhece (e/ou não é capaz de se ligar especificamente) a região C-terminal de um ISV ou Nanocorpo (que pode ser um ISV diferente,
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57/136 mas de preferência é o mesmo ISV) em que há um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais (tais como resíduos de aminoácidos de 1 a 5 ou alternativamente uma sequência de peptídeos pequenos ou até mesmo outro polipeptídeo ou proteína) ligados ao VTVSS do C-terminal (SEQ ID NO: 33); e/ou em qual posição 14 está um aminoácido que ocorre naturalmente na posição 14 (por exemplo, alanina ou, quando o ISV naturalmente contém uma prolina na posição 14, prolina).
[00107] Por exemplo, o anticorpo analítico pode também ser um monoclonal ou policlonal que reconhece (e/ou é capaz de se ligar a e, em particular de se ligar especificamente a) a região Cterminal de um ISV ou Nanocorpo, cuja extremidade C-terminal da sequência termina com VTVSS (SEQ ID NO: 33) e no qual a posição 14 é prolina (e em particular quando a posição 14 foi modificada para prolina, por exemplo, como resultado da otimização da sequência, humanização e/ou camelização), mas não reconhece a região C-terminal de um ISV ou Nanocorpo (que pode ser um ISV diferente, mas de preferência é o mesmo ISV) em que há um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais (tais como resíduos de aminoácidos de 1 a 5, ou alternativamente uma sequência de peptídeos pequenos ou até mesmo de outro polipeptídeo ou proteína) ligados ao VTVSS do C-terminal (SEQ ID NO: 33); e/ou na qual a posição 14 é alanina.
[00108] O anticorpo analítico pode também ser monoclonal ou policlonal que reconhece (e/ou é capaz de se ligar a e, em
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58/136 particular de se ligar especificamente) a região C-terminal de um ISV ou Nanocorpo do qual a extremidade C-terminal da sequência termina com VTVSS (SEQ ID NO: 33) e no qual a posição 14 é prolina (em particular, onde um resíduo de prolina ocorre naturalmente na dita posição no dito ISV), mas não reconhece a região C-terminal de um ISV ou Nanocorpo (que pode ser um ISV diferente, mas de preferência o mesmo ISV) em que há um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais (tais como resíduos de aminoácidos de 1 a 5, ou alternativamente uma sequência de peptídeos pequenos ou até mesmo outro polipeptídeo ou proteína) ligados ao VTVSS do C-terminal (SEQ ID NO: 33) em que a posição 14 é ainda uma prolina (que ocorre naturalmente ou não modificada).
[00109] O anticorpo analítico também pode ser, por exemplo, um monoclonal ou policlonal que reconhece (a região C-terminal da) a seqüência de ISV chamada Nb 3,4 neste documento (SEQ ID NO: 5) mas não reconhece (a região C-terminal da) a seqüência de ISV chamada Nb 3,1 neste documento (SEQ ID NO: 3) e/ou (e de preferência) não reconhece a seqüência do ISV chamado Nb 3,2 neste documento (SEQ ID NO: 4).
[00110] Para as propostas acima, um anticorpo analítico reconhece (ou não) um ISV ou Nanocorpo (e/ou é ou não é capaz de (especificamente) se ligar a um ISV ou Nanocorpo) pode ser determinado usando qualquer ensaio de ligação apropriado (tal como Biacore), mas também pode ser determinado usando qualquer
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59/136 ensaio BIACORE descrito no exemplo 3 ou um ensaio ADA, tais como o ensaio de ponte ADA/competição descrito no exemplo 5 (ver também figuras 1A a 1C e em particular figura 1B).
[00111] Técnicas e formatos adequados para a realização de tal ensaio será claro para uma pessoa versada na arte baseada na divulgação formnecida neste documento e inclui, por exemplo, (sem limitação):
- Um ensaio colorimétrico como ELISA com anticorpo analítico revestido diretamente ou indiretamente para a placa e a detecção de ISV acoplado com anticorpo anti-ISV monoclonal ou policlonal. Outras tecnologias alternativas úteis para esta configuração incluem, mas não estão limitadas a eletroquimioluminescência (a plataforma MSD), fluorescência (DELFIA, GYROS) e outros métodos que se baseiam na detecção secundária do ISV acoplado.
- Uma ressonância de plásmons de superfície (tal como BIACORE) ou outro método biosensor em tempo real (ou seja, além de usar SPR) com anticorpo analítico imobilizado direta ou indiretamente e monitoramento a ligação do ISV injetado/administrado posteriormente. Esses métodos não precisam mais da deteção do ISV acoplado. Um método representativo para a realização deste tipo é o ensaio descrito no exemplo 3.
- Analisando o comportamento competitivo do ISV em um ensaio de ponte (ensaios ADA) usando o anticorpo analítico em vez de ADA contendo fluido biológico. Para o ensaio de ponte
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60/136 pode-se fazer uso de diferentes tecnologias, tais como ELISA, a plataforma MSD. Métodos representativos para executar este tipo são esquematicamente mostrados nas figuras 1A a 1C e um exemplo específico deste tipo de ensaio é também descrito no exemplo 5.
- Qualquer método de cromatografia em que o anticorpo analítico é imobilizado na matriz cromatográfica e captura/isolamento específico do ISV de uma solução.
[00112] Uma vez que um anticorpo analítico adequado foi obtido usando um dos métodos descritos neste documento ou em um dos exemplos (ou um método essencialmente equivalente ao mesmo), o dito anticorpo analítico pode ser usado para determinar se um determinado ISV ou Nanocorpo (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) dará origem a (ou tem tendência aumentada ou elevada em dar origem a) interferência de proteína (tal como definido neste documento), ou seja, através da realização das etapas (i) e (ii) acima descritas. Como já descrito neste documento, isso geralmente envolve contatar com o dito ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo com o anticorpo analítico e determinação se o dito ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo é reconhecido pelo (e/ou é ligado e em particular, especificamente ligados pelo) dito anticorpo analítico (e em particular se a região C-terminal do dito ISV ou Nanocorpo ou de qualquer ISV ou Nanocorpo que forma a extremidade C-terminal
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61/136 do dito fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo é reconhecido pelo dito anticorpo analítico).
[00113] Isso geralmente pode ser realizado usando qualquer técnica apropriada para determinar se um antígeno (no caso, o ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo) é ligado por um anticorpo, e técnicas de (imuno) ensaio apropriadas serão claras para uma pessoa versada na arte. Alguns exemplos não limitativos são técnicas de ELISA adequadas (incluindo, por exemplo, do sanduíche de ELISA); em que, dependendo do formato ELISA usado (como será claro para uma pessoa versada na arte), ou o anticorpo analítico ou o ISV pode ser revestido na placa e o anticorpo analítico ou o ISV pode ser um rotulado detectável. Outras técnicas, por exemplo, podem envolver o uso de um instrumento de BIAcore (em que novamente o anticorpo analítico ou o ISV pode ser revestido no chip, veja por exemplo, o exemplo 3). Outra alternativa, pode ser um ensaio ponte competitivo (como, por exemplo, exemplificado no exemplo 5), em que é testada a capacidade de ISV competir com outro ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo que é conhecido por se ligar pelo anticorpo analítico (ou viceversa). Estas e outras técnicas adequadas para determinar se um determinado ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo é (especificamente) ligado ou reconhecido pelo anticorpo analítico serão claras para uma pessoa versada na arte baseada na presente divulgação.
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62/136 [00114] Também será claro, baseado na divulgação deste relatório, que a presente invenção (e em particular que o anticorpo analítico utilizado na presente invenção) pode ser usada para determinar se ou não um determinado ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo contém um site de interação (como um site de interação presente no ou dentro da região C-terminal, e/ou da qual a região C-terminal faz parte) que é capaz de passar por uma interação de proteínas (não específica) com um ou mais proteínas ou outros componentes que podem estar presentes em uma amostra biológica (ou seja, uma amostra de teste) obtida a partir de um indivíduo que é submetido a um imunoensaio como um ensaio ADA (em particular, um ensaio ADA para determinar a presença de nenhum ADA's contra ISV's, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou baseado em Nanocorpo). Assim, quando um ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo é reconhecido pelo anticorpo analítico utilizado na invenção, é muito provável que o dito ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo contém tal site de interação (acessível ou exposto), e assim terá uma tendência a dar origem a tais interferências de proteína (tal como definido neste documento) quando este é usado em tal imunoensaio ou ensaios ADA para a amostra de teste. Como ficará claro para uma pessoa versada na arte, isto é algo que deve preferencialmente ser evitado, usando/selecionando outro ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo
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63/136 se possível, ou modificando o ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo de forma que sua tendência para tal interferência de proteína será substancialmente reduzida ou essencialmente removida (novamente, isso pode ser testado usando o método e o anticorpo analítico divulgados neste documento).
[00115] Como também será claro para uma pessoa versada na arte baseada na presente divulgação, essa modificação pode, por exemplo, incluir fazer uma ou mais modificações (tais como inserções de aminoácido, adições, exclusões ou substituições) para o site de interação no ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo, de modo que sua capacidade de se submeter a uma interação de proteínas (não específica) com uma ou mais proteínas ou outros componentes que possam estar presentes em uma amostra de teste será reduzida ou removida. Novamente, isso pode ser realizado pelos experimentos limitados de tentativa e erro, introduzindo uma ou mais modificações e então testar se esta capacidade foi reduzida ou não, novamente usando o método e o anticorpo analítico divulgados neste documento. Por exemplo, uma ou mais de tais modificações podem ser introduzidas, e então a capacidade do ISV modificado de se ligar ao anticorpo analítico pode ser comparada com a do ISV original/não modificado. Como alternativa, usando um formato de ponte competitivo (como, mostrado no exemplo 5), ou usando BIAcore (ver, por exemplo, o exemplo 3), a capacidade do ISV
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64/136 modificado para (ainda) competir com o ISV original para se ligar ao anticorpo analítico pode ser determinada.
[00116] Mais uma vez e embora a invenção não esteja limitada a qualquer hipótese ou explicação, baseada na evidência experimental que consta nos exemplos abaixo, os inventores descobriram que este site de interação é provavelmente localizado próximo da região C-terminal (como definido neste documento) ou que o dito site de interação forma parte da região C-terminal (ou que a região C-terminal faz parte deste site de interação). Este por exemplo é baseado pelo menos em parte sobre na observação de que, se um ISV tem uma tendência a dar origem a tais interferências de proteína e tem VTVSS (SEQ ID NO: 33) como os resíduos de aminoácidos em sua extremidade C-terminal, que anexar também um número limitado de resíduos de aminoácidos (tal como 1 a 10, por exemplo, 1 a 5, tal como 1, 2, 3, 4 ou 5), ou alternativamente uma etiqueta ou um outro peptídeo, proteína ou outra porção para esta extremidade c-terminal será de modo geral substancialmente reduzida ou essencialmente removida a dita tendência. Em alguns casos, verificou-se que até mesmo adicionando 1, 2 ou 3 aminoácidos para VTVSS do C-terminal (SEQ ID NO: 33) (que pode ser qualquer aminoácido(s) adequado ou a combinação de aminoácidos, que podem cada um ser independente escolhido de quaisquer aminoácidos naturais tais como os listados na tabela A-2 na página 64 do WO 09/138519, por exemplo, e sem limitação de alanina, glicina, isoleucina, valina e
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65/136 leucina) podem já substancialmente reduzir ou remover essencialmente a dita tendência. Isto também é em parte baseado na observação de que, em alguns casos, onde um VHH que ocorre naturalmente contém um resíduo de alanina na posição 14 (que como mencionado faz parte da região C-terminal; ver Figura 2), o VHH que ocorre naturalmente muitas vezes não tem (ou tem uma baixa) tendência a dar origem a tais interferências de proteína, considerando que um VHH correspondente no qual a dita alanina na posição 14 foi substituída com um resíduo de prolina (por exemplo, para fins de humanização ou de otimização da sequência) pode como resultado ter uma tendência aumentada para dar origem a tais interferências de proteína (ou seja, comparada ao VHH com alanina na posição 14).
[00117] Em um aspecto, a invenção se relaciona com um VHH, um Nanocorpo (conforme definido no presente documento e em particular um VHH humanizado ou um VH camelizado, tal como um VH humano camelizado) ou outro ISV (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo com um VHH, Nanocorpo ou outro ISV em sua extremidade C-terminal) que foi modificado (por exemplo, através da introdução de uma ou mais substituições, adições ou exclusões de aminoácidos) e em particular modificado nas regiões do C-terminal (tais como por uma ou mais substituições ou adições de aminoácidos na região C-terminal), de tal forma que (i) tem uma tendência substancialmente reduzida (por exemplo, pelo menos uma tendência de redução estatisticamente relevante) para dar
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66/136 origem à interferência de proteína (tal como definido neste documento); e/ou (ii) tem, no método da invenção aqui descrito (tal como, o ensaio específico descrito nos exemplos 3 ou 5), que reduzir substancialmente a capacidade de ser ligado por um anticorpo analítico conforme descrito neste documento (por exemplo, o anticorpo policlonal descrito no exemplo 2 e usado nos exemplos de 3 e 5), em ambos os casos, de preferência em comparação com o mesmo VHH, Nanocorpo ou ISV, mas sem as modificações.
[00118] Assim, em um aspecto, a invenção se relaciona com um VHH, um Nanocorpo (conforme definido no presente documento e em particular um VHH humanizado ou um VH camelizado, como um VH humano camelizado) ou outro ISV (ou fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo com um VHH, Nanocorpo ou outro ISV em sua extremidade C-terminal) que é um VHH ou domínio VH (ou seja, um ISV que é um domínio VH ou derivado de um domínio VH) e/ou que foi baseado em ou foi derivado de (sequência de aminoácidos) um VHH ou domínio VH, no qual VHH, Nanocorpo ou ISV compreende a sequência de aminoácidos VTVSS(X)n (SEQ ID NO: 34) em sua extremidade C-terminal, em que n é de 1 a 10, de preferência de 1 a 5, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 (e de preferência 1 ou 2, por exemplo, 1), e em que cada X é um resíduo de aminoácido (de preferência que ocorre naturalmente) que é escolhido de forma independente (e de preferência independente escolhido do grupo de alanina (A), glicina (G), valina (V),
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67/136 leucina (L) ou isoleucina (I); como pode ser visto a partir dos dados apresentados a seguir, outros resíduos de aminoácidos (de preferência que ocorre naturalmente) ou combinações dos resíduos de aminoácidos preferidos acima mencionados com outros resíduos de aminoácidos (tais como serinaprolina, treonina e/ou lisina) também podem ser usados). De preferência, o dito VHH, Nanocorpo ou ISV com a sequência de aminoácidos VTVSS(X)n (SEQ ID NO: 34) em sua extremidade C-terminal é de modo que (i) tem uma tendência substancialmente reduzida (por exemplo, pelo menos uma tendência de redução estatisticamente relevante) para dar origem à interferência de proteína (tal como definido neste documento); e/ou (ii) tem, no método da invenção aqui descrito (tal como, o ensaio específico descrito nos exemplos 3 ou 5), que reduzir substancialmente a capacidade de ser ligado por um anticorpo analítico conforme descrito neste documento (por exemplo, o anticorpo policlonal descrito no exemplo 2 e usado nos exemplos de 3 e 5), em ambos os casos, de preferência em comparação com o mesmo VHH, Nanocorpo ou ISV, mas com a sequência de aminoácidos VTVSS (SEQ ID NO: 33) em sua extremidade C-terminal. Por exemplo, é feita referência ao ensaio e dados apresentados no exemplo 3.
[00119] Os VHH's acima mencionados, Nanocorpos ou (outros) ISV's de preferência são tais que têm um valor RU para ligação por 214 de menos de 500 (determinado de acordo com o protocolo estabelecido no exemplo 9, e após ajustar o valor medido do RU para o peso molecular). Também deve ser observado que, sempre
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68/136 que é feita referência na descrição neste documento ou na reivindicação de qualquer seqüência VTVSS(X)n C-terminal incluindo qualquer um dos aspectos (a) a (p) acima, que de acordo com um aspecto específico da invenção, nenhum dos aminoácidos X é um resíduo de cisteína.
[00120] Por exemplo, em alguns aspectos prefereridos, a extremidade C-terminal do construto ISV ou contendo ISV (quando esta extremidade c-terminal é um ISV derivado de VH, VHH ou Nanocorpo) pode ser:
(a) VTVSS(X)n, em que n = 1 e X = Ala;
(b) VTVSS(X)n, em que n = 2 e cada X = Ala;
(c) VTVSS(X)n, em que n = 3 e cada X = Ala;
(d) VTVSS(X)n, em que n = 2 e pelo menos um X = Ala (com
resíduo aminoácido restante X sendo independentemente
escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile);
(e) VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos um X = Ala (com o resíduo aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile);
(f) VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos dois X = Ala (com o resíduo aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas
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69/136 de preferência sendo independentemente escolhido de Val,
Leu e/ou Ile);
o
(g) VTVSS(X)n, em que n = 1 e X = Gly;
(h) VTVSS(X)n, em que n = 2 e cada X = Gly;
(i) VTVSS(X)n, em que n = 3 e cada X = Gly;
(j) VTVSS(X)n, em que n = 2 e pelo menos um X = Gly (com
resíduo aminoácido restante X sendo independentemente
aminoácido que ocorre naturalmente, mas escolhido de qualquer de preferência sendo independentemente escolhido de Val,
Leu e/ou Ile);
(k) VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos um X = Gly (com o resíduo aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile);
(l) VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos dois X = Gly (com o resíduo aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile);
(m) VTVSS(X)n, em que n = 2 e cada X = Ala ou Gly;
(n) VTVSS(X)n, em que n = 3 e cada X = Ala ou Gly;
(o) VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos um X = Ala ou
X sendo independentemente restante
Gly (com o resíduo aminoácido escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas
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70/136 de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile); ou (p) VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos dois X = Ala ou Gly (com o resíduo aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile);
com aspectos (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) e (n), sendo particularmente preferido, com aspectos em que n = 1 ou 2 ser preferido e aspectos em que n = 1 é particularmente preferido.
[00121] Também deve ser notado que, quando essa referência é feita na descrição deste documento ou na reivindicação para qualquer seqüência C-terminal VTVSS(X)n incluindo qualquer um dos aspectos (a) a (p) acima, que, de acordo com um aspecto específico da invenção, nenhum dos aminoácidos X é um resíduo de cisteína.
[00122] Assim, em um aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 1 e X = Ala (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade Cterminal).
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71/136 [00123] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 2 e cada X = Ala (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00124] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 2 e pelo menos um X = Ala (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência, sendo independente escolhido de Val, Leu e/ou Ile) (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00125] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos um X = Ala (com o resíduo de aminoácido
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72/136 restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência, sendo independente escolhido de Val, Leu e/ou Ile) (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00126] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos dois X = Ala (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência, sendo independente escolhido de Val, Leu e/ou Ile) (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00127] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 3 e cada X = Ala (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
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73/136 [00128] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 1 e X = Gly (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade Cterminal).
[00129] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 2 e cada X = Gly (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00130] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 3 e cada X = Gly (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
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74/136 [00131] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 2 e pelo menos um X = Gly (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência, sendo independente escolhido de Val, Leu e/ou Ile) (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00132] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos um X = Gly (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência, sendo independente escolhido de Val, Leu e/ou Ile) (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00133] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou
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75/136 é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos dois X = Gly (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência, sendo independente escolhido de Val, Leu e/ou Ile) (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00134] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 2 e cada X = Ala ou Gly (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00135] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 3 e cada X = Ala ou Gly (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
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76/136 [00136] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos um X = Ala ou Gly (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile) (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00137] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 3 e pelo menos dois X = Ala ou Gly (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile) (ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
[00138] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreeende uma seqüência VH ou
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77/136 é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n = 1, 2 ou 3, em que cada X = Ala ou Gly.
[00139] Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que:
- n = 1, 2 ou 3, em que cada X = Ala ou Gly; ou
- n = 2 ou 3, no qual todos, mas um X = Ala ou Gly (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile) ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal).
Em outro aspecto preferido, a invenção se relaciona a um domínio variável único de imunoglobina (ISV), que é um Nanocorpo ou um (outro) ISV que compreende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH (com Nanocorpos sendo preferidos) que tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que:
- n = 1, 2 ou 3, em que cada X = Ala ou Gly; ou
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- n = 2 ou 3, no qual pelo menos um X = Ala ou Gly (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile);
- n = 2 ou 3, no qual todos os X = Ala ou Gly (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile);
ou uma proteína ou polipeptídeo que contém tal ISV (e de preferência tal Nanocorpo) em sua extremidade C-terminal.
[00140] Nos aspectos acima, com dito (outro) ISV que compreende uma seqüência VH ou é derivado de uma seqüência VH significa qualquer ISV que compreende uma seqüência VH ou que é derivado de uma seqüência VH e que não é um Nanocorpo (ou seja, não é um VHH, VHH humanizado ou VH camelizado). Por exemplo, tal (outro) ISV pode ser, por exemplo, um anticorpo de domínio (único) baseado em VH, baseada em VH dAb™, ou microcorpo baseado em VH (ver WO 00/29004).
[00141] Novamente, deve-se notar que, a qualquer momento que um do ISV é referido aqui tem uma sequência C-terminal VTVSS(X)n (incluindo, sem limitação aos referidos ISV's nos aspectos anteriores) que, de acordo com um aspecto específico da
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79/136 invenção, nenhum dos aminoácidos X na seqüência VTVSS(X)n é um resíduo de cisteína.
[00142] Como descrito neste documento, qualquer proteína ou polipeptídeo, por exemplo, pode ser construto que contém dois ou mais ISV's (tais como dois ou mais Nanocorpos), opcionalmente ligados através de um ou mais ligantes adequados. Assim, por exemplo, tal construto pode ser um construto bivalente, trivalente, tetravalente ou pentavalente (tal como um construto de Nanocorpo bivalente, trivalente, tetravalente ou pentavalente) e pode, por exemplo, ser construto bivalente, trivalente, tetravalente ou pentavalente (tal como um construto de Nanocorpo bivalente, trivalente, tetravalente ou pentavalente) que é um construto biespecífico, trispecífico ou biparatópico (incluindo, por exemplo, construtos monoespecíficos, biespecífico ou biparatópico que também podem se ligar a albumina sérica (preferida) ou outra proteína de soro para extensão da meia-vida).
[00143] Novamente, os Nanocorpos, os ISVs e proteínas/polipeptídeos de acordo com cada um dos aspectos descritos acima são de preferência, tais que tenham um valor RU para ligação por 21-4 de menos de 500 (determinado de acordo com o protocolo estabelecido no exemplo 9, e após ajustar o valor medido do RU para o peso molecular da proteína usado de acordo com a fórmula estabelecida acima).
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80/136 [00144] Como mencionado neste documento, também prevê que a invenção pode também ser aplicada a outras proteínas ou polipeptídeos (e em fragmentos de anticorpos específicos, tais como fragmentos Fab ou outras proteínas ou polipeptídeos baseados em fragmentos de anticorpos, tais como do ScFv's) que têm um domínio VH na sua extremidade C-terminal. Assim, em outro aspecto, a invenção se relaciona a tal proteína ou polipeptídeo (tal como um ScFv) que tem um domínio VH em sua extremidade Cterminal com a sequência de aminoácidos VTVSS(X)n (SEQ ID NO: 34) em sua extremidade C-terminal, em que n é de 1 a 10, de preferência de 1 a 5, como 1, 2, 3, 4 ou 5, e em que cada X é um resíduo de aminoácido (de preferência de ocorrência natural) que é escolhido de forma independente (e escolhido de preferência independentemente do grupo de alanina (A), glicina (G), valina (V), leucina (L) ou isoleucina (I). Novamente, de acordo com alguns aspectos específicos, a dita extremidade cterminal pode ser de acordo com qualquer um dos tópicos de (a) a (p) acima e, de preferência, de acordo com um de (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) ou (n), com n sendo 1, 2 ou 3 e de preferência 1 ou 2.
[00145] Novamente, essas proteínas ou polipeptídeos são de preferência, tais que tenham um valor RU para ligação por 21-4 de menos de 500 (determinado de acordo com o protocolo estabelecido no exemplo 9, e após ajustar o valor medido do RU para o peso molecular da proteína usada de acordo com a fórmula
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81/136 estabelecida acima). Também, novamente, de acordo com um aspecto específico deste aspecto da invenção, nenhum dos aminoácidos X na seqüência C-terminal VTVSS(X)n é um resíduo de cisteína.
[00146] A invenção se refere também a uma composição farmacêutica que compreende um ISV (e de preferência a um ISV terapêutico) ou uma proteína ou polipeptídeo que compreende pelo menos um ISV (e de preferência pelo menos um ISV terapêutico), no qual os ditos ISV, proteína ou polipeptídeo são conforme descritos aqui (ou seja, um ISV, proteína ou polipeptídeo de acordo com um ou mais dos aspectos aqui descritos e em particular de acordo com um ou mais dos aspectos descritos nas páginas anteriores; e mais em particular um ISV, proteína ou polipeptídeo que tem uma extremidade c-terminal/seqüência que está de acordo com um ou mais dos aspectos aqui descrito) e pelo menos um transportador, diluente ou excipiente adequado (ou seja, adequado para uso farmacêutico) e, opcionalmente, uma ou mais substâncias ainda mais ativas. Tais composições, transportadores, diluentes ou excipientes podem ser, por exemplo, como descrito em WO 08/020079 para composições farmacêuticas que compõem um Nanocorpo ou uma proteína ou polipeptídeo que compreende pelo menos um Nanocorpo (e como já mencionado, de acordo com a presente invenção, o ISV é também de preferência um Nanocorpo).
[00147] A invenção se refere também a um ISV ou uma proteína ou polipeptídeo que compreende pelo menos um ISV para uso em
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82/136 terapia de uma doença no ser humano (por exemplo, um paciente na necessidade de tal terapia), no qual os ditos ISV, proteína ou polipeptídeo são conforme descritos aqui (ou seja, um ISV, proteína ou polipeptídeo de acordo com um ou mais dos aspectos aqui descritose em particular de acordo com um ou mais dos aspectos descritos nas páginas anteriores; e mais em particular um ISV, proteína ou polipeptídeo que tem uma extremidade cterminal/seqüência que está de acordo com um ou mais dos aspectos aqui descrito).
[00148] A invenção também se refere ao uso de um ISV ou uma proteína ou polipeptídeo que compreende pelo menos um ISV na preparação de uma composição farmacêutica, no qual os ditos ISV, proteína ou polipeptídeo como é descrito neste documento (ou seja, um ISV, proteína ou polipeptídeo de acordo com um ou mais dos aspectos descritos neste documento e em particular de acordo com um ou mais dos aspectos descritos nas páginas anteriores; e mais em particular um ISV, proteína ou polipeptídeo que tem uma extremidade c-terminal/seqüência que está de acordo com um ou mais dos aspectos aqui descrito).
[00149] A invenção também se refere a um método de tratamento que inclui a administração a um indivíduo humano (por exemplo, para um paciente que necessite de tal tratamento) um ISV ou uma proteína ou polipeptídeo composto pelo menos um ISV na preparação de uma composição farmacêutica, no qual os ditos ISV, proteína ou polipeptídeo são conforme descritos aqui (ou seja,
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83/136 um ISV, proteína ou polipeptídeo de acordo com um ou mais dos aspectos aqui descritos e em particular de acordo com um ou mais dos aspectos descritos nas páginas anteriores; e mais em particular um ISV, proteína ou polipeptídeo que tem uma extremidade c-terminal/seqüência que está de acordo com um ou mais dos aspectos aqui descrito); ou uma composição farmacêutica (como descrito acima) que compreende pelo menos tal ISV, proteína ou polipeptídeo.
[00150] Com relação ao acima, ficará claro que o uso terapêutico do ISV, proteínas e polipeptídeos aqui descritos são um aspecto muito importante da invenção, como tal o uso terapêutico (ou o desenvolvimento clínico de tais ISV's, proteínas e polipeptídeos para tal uso terapêutico) pode envolver o uso de ensaios ADA para determinar se os ditos ISV, proteína ou polipeptídeo é imunogênico (ou seja, pode dar origem a ADA's quando administrados em um ser humano). A este respeito, também ficará claro que preocupações sobre possível imunogenicidade, particularmente, terá de ser resolvida quando um terapêutico também é usado por longos períodos de tempo (durante semanas, meses ou anos), e/ou tem uma meia-vida (de preferência expressa como t1/2-beta) em um indivíduo humano de pelo menos 3 dias, tal como pelo menos uma semana e até 10 dias ou mais.
[00151] Assim, de acordo com um aspecto específico da invenção, um ISV, proteína, polipeptídeo ou composição farmacêutica conforme descritos neste documento destinam-se ao tratamento de
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84/136 uma doença crônica em um ser humano, e/ou tal ISV, proteína, polipeptídeo conforme descritos neste documento destinam-se a estarem presentes na circulação do indivíduo (ou seja, em níveis farmacologicamente ativos) ao qual é administrado (ou seja, em uma dose terapeuticamente ativa) pelo menos um período de uma semana, de preferência pelo menos duas semanas, tal como pelo menos um mês; e/ou tal ISV, proteína, polipeptídeo conforme descrito neste documento são tais que tem uma meia-vida (de preferência expressa como t1/2-beta) em um indivíduo humano de pelo menos 3 dias, como pelo menos uma semana e até 10 dias ou mais; e/ou tais ISV, proteína, polipeptídeo ou composição farmacêutica conforme descritos neste documento são destinados a serem administrados em um ser humano como duas ou mais doses que são administradas por um período de pelo menos 3 dias, como pelo menos uma semana, por exemplo, pelo menos, duas semanas ou pelo menos de um mês, ou até mais (isto é, pelo menos, 3 mesespelo menos, 6 meses ou pelo menos um ano), ou até mesmo cronicamente administrado.
[00152] A invenção se refere também a um método para reduzir (substancialmente) ou essencialmente remover a tendência de um ISV, um Nanocorpo ou um fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo em dar origem à interferência de proteína, o dito método compreendendo pelo menos as etapas de:
- opcionalmente, determinar a tendência do ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo
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85/136 em dar origem à interferência de proteína, usando um método que compreende pelo menas etapas (i) e (ii) como referido neste documento;
- modificar os ditos ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo através da introdução de um ou mais uma ou mais substituições de aminoácidos, adições ou exclusões no referido ISV ou Nanocorpo, ou no ISV C-terminal ou Nanocorpo (se houver) do fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo; e, em particular através da introdução de uma ou mais substituições de aminoácidos ou adições na região Cterminal do dito ISV ou Nanocorpo, ou na região C-terminal do ISV C-terminal ou Nanocorpo (se houver) do fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo, por exemplo, pela adição à extremidade C-terminal da seqüência de 1 a 10, tal como 1 a 5, tais como 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos, cada um independente escolhidos de quaisquer aminoácidos que ocorrem naturalmente (como os listados na tabela A-2 na página 64 do WO 09/138519, por exemplo, e sem limitação de alanina, glicina, isoleucina, valina e leucina);
- determinar a tendência do ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo então modificados para dar origem à interferência de proteína, usando um método que compreende pelo menas etapas (i) e (ii) como referidas neste documento; opcionalmente, de uma forma que permite que a tendência do ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à
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86/136 base de Nanocorpo então modificados para dar origem à interferência de proteína serem comparados com a tendência do ISV, Nanocorpo, fármaco à base de ISV ou fármaco à base de Nanocorpo original para dar origem à interferência de proteína (incluindo, sem limitação, comparando-os em um ensaio de competição para a ligação com o anticorpo analítico conforme descrito neste documento). Alternativamente, o método descrito neste documento que envolve o uso de 21-4 pode ser usado.
[00153] A invenção será agora descrita por meio dos seguintes aspectos, figuras e exemplos preferidos e não limitativos, em que:
[00154] As figuras 1A a 1C mostram esquematicamente alguns exemplos não limitativos de formatos de ensaios ADA. Alguns protocolos representativos, mas não limitativos para a realização destes ensaios são mencionados no exemplo 4.
[00155] A figura 2 mostra esquematicamente uma estrutura 3D representativa de um ISV, tal como um Nanocorpo.
[00156] A figura 3 é uma curva de ligação (obtida usando o ensaio BIACORE descrito no exemplo 3) mostrando a ligação do NB 3,4 para 3,9 (SEQ ID NO's: 5 a 10) para o anticorpo policlonal imobilizado obtidos no exemplo 2.
[00157] A figura 4 é uma curva de ligação (obtida usando o ensaio BIACORE descrito no exemplo 3) mostrando a ligação dos NB's 3,4, 3,11, 3,12 e 3,13 (SEQ ID NO's: 5, 12, 13 e 14) ao anticorpo policlonal imobilizado obtido no exemplo 2.
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87/136 [00158] A figura 5 é uma curva de ligação (obtida usando o ensaio BIACORE descrito no exemplo 3) mostrando a ligação dos NB's 3,4, 3,14 e 3,15 (SEQ ID NO's: 5, 15 e 16) para o anticorpo policlonal imobilizado obtido no exemplo 2.
[00159] A figura 6 é uma curva de ligação (obtida usando o ensaio BIACORE descrito no exemplo 3) mostrando a ligação dos NB's 3,1, 3,2 e 3,4 (SEQ ID NO's: 3, 4 e 5) para o anticorpo policlonal imobilizado obtido no exemplo 2.
[00160] A figura 7 é uma curva de ligação (obtida usando o ensaio BIACORE descrito no exemplo 3) mostrando a ligação dos NB's 4,1 e 4,2 (SEQ ID NO's: 17 e 18) ao anticorpo policlonal imobilizado obtido no exemplo 2.
[00161] A figura 8 é uma curva de ligação (obtida usando o ensaio BIACORE descrito no exemplo 3) mostrando a ligação do NB 6,1, 6,2, 6,4 e 6,5 (SEQ ID NO's: 19 a 22) ao anticorpo policlonal imobilizado obtidos no exemplo 2.
[00162] A figura 9 é uma tabela que mostra as seqüências usadas no exemplo 8 (do SEQ ID NO's: 37 a 89) e estabelece a sequência de referência correspondente.
[00163] As ditas sequências na presente descrição e reivindicações estão listadas na tabela A abaixo (SEQ ID NO's: 1 a 37) e na Figura 9 (a SEQ ID NO's: 38 a 89).
[00164] TABELA A
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Nome SEQ ID NO: Sequência
ISV Ex. 1/2- 1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEW VSGIKSSGDSTRYAGSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVY YCAKSRVSRTGLYTYDNRGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRQAPGKERE FVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPE DTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSS
Alt. ISV 2 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREF VSSITGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVY YCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVE SGGGLVQPGNSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISG SGSDTLYADSVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGG SLSRSSQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCA ASGFTFSSYPMGWFRQAPGKGREFVSSITGSGGSTYYADSVKGRFTI SRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYYCAAYIRPDTYLSRDYRKYDYWG QGTLVTVSS
>Nb3,1 3 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRTGEPREL VATITGGSSINYGDFVKGRFTISIDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYY CNFNKYVTSRDTWGQGTQVTVSS
>Nb3,2 4 EVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRTGEPREL VATITGGSSINYGDFVKGRFTISIDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAVYY CNFNKYVTSRDTWGQGTQVTVSSAAAEQKLISEEDLNGAAHHHHHH
>Nb3,4 5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPREL VATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYY CNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS
>Nb3,5 6 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSAA
>Nb3,6 7 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSA
>Nb3,7 8 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSG
>Nb3,8 9 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSGG
>Nb3,9 10 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSGGG
>Nb3,10 11 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS
>Nb3,11 12 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLKPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS
>Nb3,12 13 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP
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GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTQVTVSS
>Nb3,13 14 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTQVTVSS
>Nb3,14 15 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVQVSS
>Nb3,15 16 HHHHHHEVQLVESGGGSVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRP GEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPE DTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS
>Nb4,1 17 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGREL VAGIISGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYY CAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSS
>Nb4,2 18 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGSVFKINVMAWYRQAPGKGREL VAGIISGGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRPEDTAVYY CAFITTESDYDLGRRYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSRDWDFDVFGGG TPVGG
>Nb6,1 19 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIASGLPFSTKSMGWFRQAPGKEREF VARISPGGTSRYYGDFVKGRFAISRDNAKNTTWLQMNSLKAEDTAVY YCASGERSTYIGSNYYRTNEYDYWGTGTQVTVSSAAAEQKLISEEDL NGAAHHHHHH
>Nb6,2 20 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCIASGLPFSTKSMGWFRQAPGKEREF VARISPGGTSRYYGDFVKGRFAISRDNAKNTTWLQMNSLKAEDTAVY YCASGERSTYIGSNYYRTNEYDYWGTGTQVTVSS
>Nb6,4 21 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPFSTKSMGWFRQAPGKGREF VSRISPGGTSRYYGDFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCASGERSTYIGSNYYRTNEYDYWGQGTLVTVSSAAAEQKLISEEDL NGAAHHHHHH
>Nb6,5 22 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGLPFSTKSMGWFRQAPGKGREF VSRISPGGTSRYYGDFVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVY YCASGERSTYIGSNYYRTNEYDYWGQGTLVTVSS
Exemplo 1C: Tipo selvagem 23 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAP GKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMN SLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS
Exemplo 1C: (A14P) 24 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAP GKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMN SLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS
Exemplo 1C: (K83R) 25 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAP GKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMN SLRPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTQVTVSS
Exemplo 1C: (Q108L) 26 HHHHHHEVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAP GKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMN SLKPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSS
Exemplo 1C: (A14P,K83R 27 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRRAP GKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMN SLRPEDTAVYTCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSS
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,Q108L)
Exemplo 1c: (A14P,R39Q ,K83R,T91Y ,Q108L) 28 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRQAP GKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMN SLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSS
Exemplo 1C: (A14P,R39Q ,K83R,T91Y ,Q108L)-1A 29 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRQAP GKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMN SLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSSA
Exemplo 1C: (A14P,R39Q ,K83R,T91Y ,Q108L)-3A 30 HHHHHHEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGRTFNNYAMGWFRQAP GKEREFVAAITRSGVRSGVSAIYGDSVKDRFTISRDNAKNTLYLQMN SLRPEDTAVYYCAASAIGSGALRRFEYDYSGQGTLVTVSSAAA
Nb3,16 31 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPREL VATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYY CNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPG NSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYAD SVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGT LVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVY LQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSS
Nb3,17 32 DVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLDRMGWYRHRPGEPREL VATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVYLQMNSLRPEDTAVYY CNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPG NSLRLSCAASGFTFSSFGMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGSDTLYAD SVKGRFTISRDNAKTTLYLQMNSLRPEDTAVYYCTIGGSLSRSSQGT LVTVSSGGGGSGGGSEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRSIGRLD RMGWYRHRPGEPRELVATITGGSSINYGDSVKGRFTISIDNSKNTVY LQMNSLRPEDTAVYYCNFNKYVTSRDTWGQGTLVTVSSA
Sequência C-terminal 33 VTVSS
Sequência C-terminal 34 VTVSS(X)n
21-4-3, IGH concenso= 35 QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTAYSMHWVKQAPGKGLKW MGWINTVTGEPAYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQISSLKNEDTATY FCTRGLIHFYYWGQGTTLTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTL GCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPS STWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDC
21-4-3-IGK concenso 36 DIQMTQTPSSLSASLGGRVTITCKASQDIHNFISWYQHKPGKVPRLI IHDTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSITNLEPEDIATYYCLHYDNL LRSFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYP KDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYER HNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
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91/136 [00165] Parte experimental:
[00166] Exemplo 1: Geração de um anticorpo policlonal analítica.
[00167] Um anticorpo policlonal (fração IgG) que pode ser usado como o anticorpo analítico foi gerado da seguinte forma:
[00168] A. Identificação de amostras de plasma adequado para isolar o anticorpo policlonal [00169] Vinte amostras de plasma de indivíduos saudáveis que nunca foram tratados com um ISV foram avaliadas para a presença de anticorpos contra o ISV que pode ser usado como o anticorpo analítico na invenção.
[00170] O ISV inicialmente usado neste exemplo foi SEQ ID NO: 1. Posteriormente, para confirmar que a interação não é específica para este ISV em particular, mas é uma interação de proteína-proteína não específica que pode ocorrer com uma quantidade de ISV, os ensaios abaixo foram repetidos com outros ISV's (ver o tópico C) abaixo. Como uma alternativa para SEQ ID NO: 1, por exemplo, a SEQ ID NO: 2 também pode ser usada.
[00171] O ensaio usado foi uma ECL (eletroquimioluminescência) baseada em ensaio ponte, onde o ISV biotinilado (uma variante biotinilada da SEQ ID NO: 1) é usado para capturar e ISV sulfotagged usado para detectar anticorpos antidrogas. Um formato semelhante também é utilizado para a realização de ensaios ADA. Biotinilação e a sulfo-marcação do ISV foram feita usando o acoplamento químico padrão em aminas primárias usando sulfo-NHS
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LC-biotina (Pierce) e Sulfo-tag NHS-ester (MSD), respectivamente, de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de plasma foram diluídas 1/5 em PBS/0,1% caseína e foram incubadas durante 30 minutos a 37° C, 600 RPM em placas de 96 poços revestida com polipropileno. As amostras (50 pL) foram então diluídas a 1/3 na mistura 1:1 (100 pl) de 2 pg/ml biotiniladas e 2 pg/ml sulfo-tag ISV (SEQ NO ID: 1) e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente, 600 RPM. MSD MA® placas de 96 poços padrão revestida com estreptavidina foram bloqueadas com 150 pl/poço Superblock®T20 durante 1 hora em temperatura ambiente, então lavadas 3 vezes com PBS/0,05% Tween20 (= tampão para lavagem). Amostra/mistura 1:1 (biotinilado e sulfo-tag ISV (SEQ NO ID: 1) (50,0 pl) foi transferida da placa de polipropileno para a placa MSD e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente, 600 rpm. As placas foram lavadas três vezes antes da adição de 2 x Tampão de leitura (MSD) (150 pl/poço) e ler as unidades ECL (ECLU) em um instrumento MSD (Sector Imager 2400 reader). As amostras foram selecionadas como positivoa ou negativas usando o ponto de corte determinado durante a validação do método. O ponto de corte da seleção foi calculado com base nos valores anteriores de 118 amostras individuais do plasma de indivíduos saudáveis que nunca foram tratados com um ISV, usando uma análise estatística adequada, conforme recomendado pelas normas para o desenvolvimento de ensaios ADA (Shankar, 2008). Uma avaliação não paramétrica foi
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93/136 utilizada e o valor de corte foi calculado baseado no 95° percentil, após a exclusão dos extremos.
[00172] Seis amostras de plasma foram claramente marcadas como positivas: IHuP#002-001-ABL-01, IHuP#002-001-ABL-08, IHuP#002001-ABL-10, IHuP#002-001-ABL-15, IHuP#002-001-ABL-19 e IHuP#002-001-ABL-20 (tabela I).
[00173] Estas amostras foram também analisadas em uma droga de ajuste de deslocamento (teste de confirmação) para confirmar a especificidade do resultado positivo da triagem (tabela II). Portanto, as amostras foram diluídas a 1/5 em PBS/0,1% caseina contendo 12,5 pg/mL ISV (SEQ NO ID: 1) e foram incubadas durante 30 minutos a 37° C, 600 RPM em placas de 96 poços revestidas de polipropileno. As amostras (50 pl) são então diluídas a 1/3 na mistura 1:1 (100 pl) de 2 pg/ml biotinilado e 2 pg/ml sulfo-tag ISV (SEQ NO ID: 1) e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente, 600 RPM. Posteriormente, amostra/mistura 1:1 (biotinilado e ISV sulfo-tag) (50,0 pl) foi transferida da chapa de polipropileno para a placa de estreptavidina padrão de 96 poços MSDMA® bloqueada conforme descrito acima para o ensaio de triagem e incubadas por 1 hora em temperatura ambiente, 600 rpm. As placas foram lavadas três vezes antes da adição de 2 x Tampão de leitura (MSD) (150 pl/poço) e medir unidades ECL (ECLU) em um instrumento MSD (Sector Imager 2400 reader). Amostras foram confirmadas como verdadeiros positivos usando o ponto de corte confirmatório determinado durante a validação do método e foram
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94/136 calculadas com a resposta ECL de 118 amostras individuais do plasma de indivíduos saudáveis que nunca foram tratados com o ISV, o que foi cravado com 50 pg/ml ISV (SEQ NO ID: 1) usando análise estatística adequada, conforme recomendado pelas orientações para o desenvolvimento de ensaios ADA (Shankar2008). Uma redução mínima do sinal de 50% foi calculada com base no intervalo de confiança de 99%.
[00174] Amostras que foram positivas na ECL baseada no ensaio ponte e que foram confirmadas como um resultado positivo no ensaio de ajuste de deslocamento das drogas foi selecionado como fonte para gerar o anticorpo policlonal usando cromatografia de afinidade.
[00175] Tabela I: resultados de triagem de 20 amostras de plasma nos ensaios ADA ISV.
Identificação da amostra Ensaio de triagem ECLU
IHuP #002-001-ABL-01 13081
IHuP #002-001-ABL-02 56
IHuP #002-001-ABL-03 272
IHuP #002-001-ABL-04 125
IHuP #002-001-ABL-05 70
IHuP #002-001-ABL-06 99
IHuP #002-001-ABL-07 170
IHuP #002-001-ABL-08 659358
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95/136
IHuP #002-001-ABL-09 798
IHuP #002-001-ABL-10 1101
IHuP #002-001-ABL-11 83
IHuP #002-001-ABL-12 72
IHuP #002-001-ABL-13 403
IHuP #002-001-ABL-14 62
IHuP #002-001-ABL-15 1141
IHuP #002-001-ABL-16 159
IHuP #002-001-ABL-17 72
IHuP #002-001-ABL-18 170
IHuP #002-001-ABL-19 4503
IHuP #002-001-ABL-20 8243
[00176] Tabela II: Confirmação de amostras de plasma positivamente selecionadas no ensaio de confirmação. Um ponto de corte de confirmação de 50% foi usado para avaliação dos resultados. Uma amostra não foi confirmada como uma amostra positiva verdadeira.
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96/136
Identificação de amostra de plasma Ensaio de triagem ECLU: plasma Teste de confirmação ECLU: plasma Inibição do sinal %
IHuP #002-001- ABL-01 13081 685 95
IHuP #002-001- ABL-08 659358 169410 74
IHuP #002-001- ABL-10 1101 582 47
IHuP #002-001- ABL-15 1141 467 59
IHuP #002-001- ABL-19 4503 1531 66
IHuP #002-001- ABL-20 8243 1450 82
[00177] Mais três amostras de soro de indivíduos que não foram tratadas com um ISV também foram avaliadas usando a ECL baseada no ensaio ponte descrito acima e confirmadas usando o ensaio de ajuste de deslocamento de drogas.
[00178] Duas amostras de soro foram claramente marcadas como positivas na ECL baseada em ensaio ponte de: IHUS #B09032311A3 e IHUS #B09032311A20 (tabela III). As 2 amostras positivamente selecionadas foram também analisadas no ajuste de deslocamento de drogas para confirmar a especificidade do resultado positivo da triagem.
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97/136 [00179] Tabela III: Resultados de triagem e de confirmação das amostras de soro e da fração IgG purificada correspondente
Identificação de Ensaio Teste de inib Ensai Teste inibi
amostra de soro de confirma ição o de de ção
triagem ção do do triag confirm do
do sinal sinal sina em do ação do sinal
ECL: ECL: l % sinal sinal %
soro soro ECL: : ECL:
IgG IgG
IHUS #B09032311A3 2388 286 88% 3716 370 90%
IHUS #B09032311A20 19272 915 95% 31309 1160 96%
IHUS #B09032311A1 62
[00180] B. Geração de fração de IgG purificada policlonal.
[00181] Uma IgG policlonal foi purificada a partir de amostras IHUS #B09032311A3 e IHUS #B09032311A20 (veja acima) usando a proteína G HP Spin Trap columns (GE Healthcare) de acordo com as instruções do fabricante. Em suma, após a remoção da solução de armazenamento formam a coluna por centrifugação (3s em 100 x g), a coluna foi equilibrada pela adição de tampão de ligação (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0). Após a centrifugação, a solução contendo o policlonal desejado foi adicionado (máximo de 1 mg em 600 pl) e a coluna foi incubada durante 4 min e misturada delicadamente. A coluna foi então centrifugada e lavada 2x por adição sucessiva do tampão de ligação (600pl) e centrifugação. Após adição de 400 pl do tampão de eluição (0,1 M glicina-HCL, pH 2,7) e misturar por inversão, o anticorpo foi eluído por
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98/136 centrifugação em 30 μΐ tampão de neutralização (1 M Tris-HCL, pH 9,0).
[00182] A fim de confirmar que a fração IgG assim obtida foi envolvida em uma ligação não específica para o ISV, o anticorpo IgG purificado foi analisado na ECL baseada em ensaio ponte descrito acima e confirmada usando o ensaio de ajuste de deslocamento de droga usado sob A) acima. Em ambas as amostras (IHUS #B09032311A3 e IHUS #B09032311A20), anticorpo IgG purificado foi confirmado para ser envolvido na ligação não específica conduzindo a um sinal positivo nos ensaios (tabela III). Isso confirmou que o IgG policlonal purificado poderia ser usado como um anticorpo analítico, e foi usado como tal nos(ensaios de) exemplos 3 e 5.
[00183] C. Ligação não específica a outros ISV's.
[00184] A fim de determinar se a interferência de proteína observada é específica para um único ISV, e/ou é específica para uma determinada região, epítopo ou determinante antigênico no ISV, e/ou para certas mutações feitas para o ISV do tipo selvagem (tal como uma ou mais mutações humanizadoras), a ECL baseada em ensaio ponte e o ensaio de ajuste de deslocamento de drogas (ambos conforme descritos no ponto A) acima com a SEQ ID NO: 1 sendo usada como o ISV sulfo-tag foi repetida usando as amostras de plasmas IHUS #B09032311A3, IHUS #B09032311A20 e IHUS #B09032311A1. Como estas amostras de plasma contém o anticorpo analítico policlonal isolado, sob B) acima, este também
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99/136 fornece informações sobre o reconhecimento do epítopo, seletividade e especificidade do anticorpo analítico policlonal.
[00185] 8 ISV's foram testados (SEQ ID NO: 23 a 30,
respectivamente - ver tabela A acima), da qual foi um VHH
selvagem (SEQ ID NO: 23) e os outros 7 ISV's eram versões
humanizadas da seqüência selvagem com diferentes substituições humanizadora. Dois ISV's (SEQ ID NO: 29 e 30) também continham resíduos de aminoácidos adicionais no C-terminal (resíduos de alanina adicionais 1 e 3, respectivamente).
[00186] Os dados são mostrados na tabela IV. Sem se limitar a qualquer explicação ou hipótese, podendo ser visto que as alterações para a região C-terminal (como definido neste documento) podem aparentemente influenciar fortemente na medida em que as amostras de plasma usadas podem dar origem à interferência de proteína. Por exemplo, pode ser visto que adicionar um ou três resíduos de aminoácidos para o C-terminal pode reduzir fortemente a tendência de surgir à interferência de proteína (por exemplo, somente 18% e 13% da redução no ensaio ECLU com amostra IHUS #B09032311A3 para a SEQ ID NO's: 29 e 30, em comparação com 90% de redução para SEQ ID NO: 28, a variante humana correspondente sem quaisquer resíduos de aminoácidos adicionados ao C-terminal). Da mesma forma, introduzir um resíduo de prolina na posição 14 da seqüência tipo selvagem pode também aparentemente influenciar fortemente na medida em que as amostras de plasma usadas podem dar origem à interferência de
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100/136 proteína (por exemplo, única redução de 20% no ensaio ECLU com amostra IHUS #B09032311A3 para a sequência selvagem de SEQ ID NO: 23, em comparação com a redução de 91% para SEQ ID NO: 24, a sequência tipo selvagem com uma substituição de A14P). K83R e Q108L, que também são substituições perto da região C-terminal, também levam a um aumento na tendência em dar origem à interferência de proteína, mas não tanto quanto a substituição de A14P e o efeito combinado total das substituições A14P + K83R + Q108L pode ser negado pela adição de um ou mais resíduos de aminoácidos para o C-terminal (comparar novamente os dados para as SEQ ID NO's: 2 9 e 3 0 com os dados para outras variantes humanizadas).
[00187] Com base nesses dados, também se concluiu que aparentemente, o anticorpo analítico policlonal reconheceu a região C-terminal (como definido neste documento) dos ISV's de modo geral. Como pode ser visto da Figura 2, posição 14 (e a um menor grau das posições 83 e 108) também formam as partes da região C-terminal de um ISV (quando a estrutura ternária tridimensional de um ISV é considerada).
[00188] Tabela IV: Avaliação de diferentes variantes de Nanocorpo como competidores no ensaio de ADA ISV usando o anticorpo analítico.
ID da amostra de soro IHUS #B09032311A3 IHUS #B09032311A20 IHUS #B09032311A1
ECLU no ensaio de triagem (usando SEQ ID NO: 1) 2217 18494 62
Variante de Nanocorpo (coluna direita menciona as substituições Teste de confir % de reduç ão Teste de confir % de reduçã o Teste de confir % de redução
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humanizadora e adições de C-terminal, feitas em comparação com a sequência tipo selvagem de SEQ ID NO: 23 mação ECLU mação ECLU mação ECLU
SEQ ID NO: 23 VHH tipo selvagem 1778 20 8682 53 60 4
SEQ ID NO: 24 VHH tipo selvagem + A14P 205 91 668 96 56 10
SEQ ID NO: 25 VHH tipo selvagem + K83R 1403 37 6912 63 62 1
SEQ ID NO: 26 VHH tipo selvagem + Q108L 1533 31 6991 62 59 5
ECLU no ensaio de triagem (usando SEQ ID NO: 1) 2217 18494 62
Variante de Nanocorpo (coluna direita menciona as substituições humanizadora e adições de C-terminal, feitas em comparação com a sequência tipo selvagem SEQ ID NO: 23 Teste de confir mação ECLU % de reduç ão Teste de confir mação ECLU % de reduçã o Teste de confir mação ECLU % de redução
SEQ ID NO: 27 VHH tipo selvagem + A14P + K83R + Q108L 156 93 628 97 57 8
SEQ ID NO: 28 VHH tipo selvagem + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L 228 90 570 97 58 6
SEQ ID NO: 29 VHH Tipo selvagem + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L + 1 A adicionais no C-terminal (A114) 1814 18 15087 18 60 3
SEQ ID NO: 30 VHH tipo selvagem + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L + 3 A no C-terminal (A114 + A115 + A116) 1933 13 15244 18 62 0
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102/136 [00189] Exemplo 2: purificação da afinidade do anticorpo analítico [00190] Este exemplo descreve dois métodos que podem ser usados para isolar de um fluido biológico de um indivíduo humano um anticorpo analítico que é capaz de reconhecer e/ou se ligar a extremidade C-terminal de um ISV. O anticorpo é isolado de 4 amostras de soro diferentes que foram caracterizadas onde estas induzem um sinal positivo em um ensaio ADA de acordo com o teste, conforme descrito no exemplo 1.
[00191] A partir das amostras de soro, cada um destes protocolos fornece uma preparação purificada do fator de interferência que pode ser usado como o anticorpo analítico nos métodos aqui descritos. Esses métodos em geral também podem ser usados para purificar o fator de interferência para outros fins (por exemplo, o fator de interferência purificado usando os protocolos abaixo também foi utilizado experimentalmente no exemplo 8, a fim de mostrar a ligação a um construto ISV ou ISV por monocloanais 21-4 é previsível para ligar o mesmo construto ISV ou ISV por fatores de interferência e, portanto, pela tendência do dito construto ISV ou ISV submeter-se a interferência de proteína não específica em um ensaio ADA).
[00192] Exemplo 2A: purificação usando a proteína A e cromatografia de afinidade [00193] Em uma primeira etapa, a fração do anticorpo IgG enriqueceu as amostras de soro usando cromatografia de afinidade
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103/136 da proteína A. As colunas típicas que foram usadas para enriquecimento incluídas HiTrap MabselectSure e MabSelectXtra (GE Healthcare); PorosMabCapture A (Applied Biosystems). Purificação dos anticorpos IgG das amostras de soro foi realizada de forma automatizada e semelhante ao longo de todas as experiências. As passagens cromatográficas foram realizadas sobre o sistema purificador AKTA (GE Healthcare) e logadas em tempo real usando o software de purificação de proteínas UNICORN (GE Healthcare). Resumidamente, a amostra de soro foi diluída 1:1 com D-PBS (salina tamponada com fosfato da Dulbecco) e 0,22 pm filtradas antes de ser carregada na coluna a uma taxa de fluxo fixo de 0,5 mL/min. A coluna foi lavada para remover componentes de ligação não específica ao longo de 5 volumes de coluna usando D-PBS em uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. A fração IgG foi eluída por eluição ácida, usando o 100 mM do tampão de glicina com pH 2,6 e uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. Após a eluição, as frações foram neutralizadas usando 1,5 M de tampão Tris com pH 8,8. SDS-PAGE foi executado para confirmar o isolamento dos anticorpos IgG na eluição.
[00194] Em uma segunda etapa, os IgG interferentes também foram enriquecidos pela aplicação da proteína A da fração do anticorpo IgG de IgGs de 4 amostras diferentes no ISV acoplado nas colunas de afinidade. Mais especificamente, os IgG interferentes foram ainda enriquecidos por uma ligação a uma coluna contendo um ISV com seqüência de SEQ ID NO: 1. Para isto, o ISV foi
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104/136 covalentemente ligado à Sepharose 4 fast flow (GE Healthcare) usando o CNBr (brometo de cianogênio) - método de acoplamento de acordo com o procedimento do fabricante. A purificação da afinidade foi realizada de forma automatizada e de modo semelhante ao longo de todas as experiências. As passagens cromatográficas foram realizadas sobre o sistema purificador AKTA e logadas no UNICORN. Em suma, a amostra enriquecida de IgG (volume de carga de até 10 mL) foi carregada na coluna a uma taxa de fluxo fixa de 0,5 mL/min. A coluna foi lavada para remover os componentes de ligação específica sobre 5 volumes de
coluna usando D-PBS em uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. Os
componentes de ligação ISV foram eluídos por eluição ácida,
usando 100 mM do tampão de glicina com pH 2,6 e uma taxa de
fluxo de 0,5 mL/min. Após a eluição, as frações foram
neutralizadas usando 1,5 M do tampão TRIS com pH 8,8. As frações foram analisadas utilizando SDS-PAGE, que confirmou o isolamento de anticorpos IgG na eluição (dados não mostrados).
[00195] Estas frações foram agrupadas e usadas para análises adicionais tais como os descritos no exemplo 3.
[00196] Exemplo 2B: purificação usando cromatografia CaptureSelect™.
[00197] Alternativamente, os fatores de interferência foram recuperados do plasma e purificados usando a resina de afinidade de ligação IgA CaptureSelect™ hIgA™ (BAC BV) comercialmente disponível, que é baseada nos domínios variáveis únicos de
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105/136 cadeia pesada derivados de camelídeos (VHH). A 'fração IgA' coletada contendo IgA juntamente com IgG interferentes foi posteriormente carregada em uma coluna de proteína A para remover a fração de IgA. A coluna de proteína A foi processada de acordo com as condições de purificação de IgG genéricas (tampão de execução: PBS; tampão de eluição: 100 mM de glicina pH = 2,7; pós neutralização de eluição via 1 M Tris). O fator de interferência foi recuperado da eluição de Prot A em > 95% de rendimento.
[00198] Em uma variação para este método, outra resina de afinidade CaptureSelect (resina de CaptureSelect alfa-1 antitripsina, um VHH baseado na resina de afinidade comercialmente disponível, não visando qualquer anticorpo relacionado com proteínas) foi usado. Esta resina forneceu uma alta eficácia de ligação do fator interferência e permitindo uma eluição seletiva de 2 etapas: antitripsina através da eluição de pH neutro usando 2,0 M de MgCl2, seguida pela eluição do fator de interferência através de uma etapa ácida (0,1 M de glicina com pH 3,0, semelhantes às condições de eluição da proteína A/G; neutralização foi ralizada usando 1,5 M Tris). Esta etapa de purificação rendeu até 15 pg IgG1 interferentes por plasma de alta interferência por mL, que é aproximadamente 0,3% do total do IgG presente. Opcionalmente, a fração de interferência neutralizada pode ser posta para dessalinização e
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106/136 adicioanlmetne purificada através de uma coluna de exclusão de tamanho equilibrado em D-PBS.
[00199] Exemplo 3: Influência de diferentes substituições de ISV sobre a tendência de ISV em dar origem à interferência de proteína [00200] Como mencionado na descrição acima, a presente invenção disponibiliza determinados ensaios e técnicas que tornam possível para fazer uma avaliação de se ou não um determinado ISV tem uma tendência a dar origem à interferência de proteína. Estes incluem a ECL baseada no ensaio ponte e o ensaio de ajuste de deslocamento de droga usado no exemplo 1, bem como o ensaio BIACORE descrito neste exemplo 3 e os ensaios ADA competição/ligação descritos nos exemplos abaixo.
[00201] Como também mencionado na descrição acima, estes ensaios também podem ser usados para determinar se mudanças específicas (tais como as exclusões, substituições ou adições dos aminoácidos) podem influenciar (e de preferência reduzir) a tendência de um determinado ISV em dar origem à interferência de proteína. Algumas destas mudanças vão ser ou se tornarão claras para uma pessoa versada na arte com base na divulgação dada neste documento e os dados experimentais apresentados no exemplo 1 e neste exemplo 3.
[00202] Como já indicado pelos dados gerados no exemplo 1, parece que certas mutações em ou perto da região C-terminal (como definido neste documento) de um ISV (fortemente) podem
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107/136 influenciar a sua tendência em dar origem à interferência de proteína.
Por exemplo, adicionando alguns resíduos de aminoácidos ao
C-terminal (tais como 1 ou 3 resíduos alanina) parece reduzir fortemente a tendência de um ISV em dar origem à interferência de proteína e parece mesmo ser capaz de anular a presença de outras substituições (por exemplo, perto ou na região C-terminal) que parecem aumentar a tendência em dar origem à interferência de proteína (por exemplo, uma substituição de
A14P).
[00203] Neste exemplo
3, tanto o efeito de outras substituições, bem como efeito da adição de aminoácidos adicionais para o C-terminal foram investigados, comparando os
ISV's relacionados com substituições diferentes, utilizando o anticorpo analítico policlonal gerado no exemplo
2. A análise foi feita medindo a cinética da interação entre cada um dos
ISV's investigados e o analítico policlonal através da ressonância de plásmons de superfície (SPR) usando biosensor
Biacore™ T100 da GE Healthcare. O ISV testado neste exemplo 3 foram aqueles da SEQ ID NO's:
a 22 (ver tabela acima e a tabela
V abaixo).
[00204] Em um experimento típico, uma solução de anticorpo policlonal foi preparada em pg/ml em 10 mM de NaOAc em pH
5,0. Este anticorpo policlonal então foi imobilizado em uma sensorchip
CM5 usando amina de acoplamento pelo método
EDC/NHS (EDC=N-etil-N'-[3-diethilamino-propil]-carbodiimida;
NHS=NPetição 870170016657, de 14/03/2017, pág. 117/350
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Hidroxisuccinimida) de acordo com o procedimento do fabricante. A quantidade de imobilizado rendeu aproximadamente 2700 unidades de resposta (RU). Uma concentração fixa de 500 nM de ISV foi então injetada para a superfície por 120 segundos com um caudal de 45 μΐ por minuto. Como nenhum tampão de regeneração eficiente pode ser identificado, o tempo de dissociação foi alongado para 2400 segundos. O sinal obtido pela injeção de ISV em uma célula de fluxo em branco foi subtraído do sinal obtido pela injeção do ISV até a célula de fluxo de ligação do anticorpo policlonal. A célula de fluxo em branco foi ativada/desativado de maneira similar a célula de fluxo para o anticorpo policlonal, mas sem adição de proteína. Além disso, uma injeção em branco (HBS-EP + tampão de execução (HBS = salina tamponada com Hepes: GE Healthcare)) foi subtraída para corrigir o possível desvio da linha de referência.
[00205] Para examinar o efeito da adição de resíduos aminoácidos para o C-terminal, a influência da adição de 1 ou 2 alaninas e 1, 2 ou 3 glicinas foi investigada, comparando a ligação do ISV com as diferentes adições, usando um anticorpo analítico policlonal gerado conforme descrito no exemplo 2. O ISV é gerado e testado para esta proposta foram NB's 3,4 a 3,9 (SEQ ID NO: 5 a 10).
[00206] Como exemplos representativos do tipo de dados obtidos, a Figura 3 mostra a ligação de NB's 3,4 a 3,9 para o anticorpo policlonal imobilizado. A Tabela V resume os resultados obtidos.
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109/136 [00207] TABELA V
Clone ID SEQ ID NO. Posição 113(1) Posição 114(1) Posição 115(1) Posição 116(1) Ligação ** (RU)
NB 3,4 5 S 75
NB 3,5 6 S A 9
NB 3,6 7 S A A 8
NB 3,7 8 S G 31
NB 3,8 9 S G G 13
NB 3,9 10 S G G G 13
* *: Sinal de ligação obtido no final da injeção (= sinal máximo do RU) (1) Esta numeração, posição 113 é o último S do motivo do C-terminal VTVSS, e posições, 114, 115 e 116 são as posições imediatamente seguinte (a jusante) da dita posição 113.
[00208] Para examinar o efeito de (outras) substituições na região C-terminal, a influência de diferentes substituições foi investigada através da comparação dos ISV's relacionados contendo essas substituições, usando o mesmo anticorpo analítico policlonal conforme descrito acima. A análise foi feita como descrito acima.
[00209] Os ISVs contendo as ditas substituições que foram testadas são NB's 3,1, 3,2 e 3,4 (SEQ ID NO's: 3, 4 e 5); NB's 3,10 a 3,15 (SEQ ID NO's: 11 a 16), que foram comparadas com as NB's 3,4; 4,1 e 4,2 (SEQ ID NO's: 17 e 18) e NB's 6,1, 6,2, 6,4 e 6,5 (SEQ ID NO's: 19 a 22).
[00210] Como exemplos representativos do tipo de dados obtidos: [00211] - A Figura 4 mostra a ligação de NB's 3,4, 3,11, 3,12 e 3,13 para o anticorpo policlonal imobilizado;
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110/136 [00212] A Figura 5 mostra a ligação de NB's 3,4, 3,14 e 3,15 para o anticorpo policlonal imobilizado;
[00213] A Figura 6 mostra a ligação do NB 3,1, 3,2 e 3,4 para o anticorpo policlonal imobilizado;
[00214] A Figura 7 mostra a ligação do NB 4,1 e 4,2 para o anticorpo policlonal imobilizado;
[00215] A Figura 8 mostra a ligação de NB 6,1, 6,2, 6,4 e 6,5 para o anticorpo policlonal imobilizado.
[00216] As tabelas VI, VII e VIII resumem os resultados obtidos.
[00217] TABELA VI
Clone ID SEQ ID NO. Posição 14<i) Posição 83(1) Posição 108(1) Ligação * * (RU)
NB 3,4 5 P R L 75
NB 3,10 11 A R L 91
NB 3,11 12 P K L 88
NB 3,12 13 A R Q 86
NB 3,13 14 P R Q 90
* *: J Sinal de ligação obtid o no final da injeção (= sinal máximo do RU)
(1) numeração de acordo com Kabat.
[00218] TABELA VII
Clone ID SEQ ID NO. Posição 11(1) Posição 110(1) Ligação * * (RU)
NB 3,4 5 L T 75
NB 3,14 15 L Q 79
NB 3,15 16 S T 22
* *: Sinal de ligação obtido no final da injeção (= sinal máximo do RU) (1) numeração de acordo com Kabat.
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111/136 [00219] TABELA VIII
Clone ID SEQ ID NO: Posição 14 Posição 83(1) Posição 108 (2) Marca * Ligação * * (RU)
NB 3,1 3 A K Q - 2
NB 3,2 4 A K Q + 0
NB 3,4 5 P R L - 59
Clone ID Posição 14 Posição 83 (3) Posição 108 (4) Marca * Ligação * * (RU)
NB 4,1 17 P R L - 51
NB 4,2 18 P R L + 0
Clone ID Posição 14 Posição 83 (5) Posição 108 (6) Marca * Ligação * * (RU)
NB 6,1 19 P K Q + 0
NB 6,2 20 P K Q - 39
NB 6,4 21 P R L + 0
NB 6,5 22 P R L - 66
*: se este ISV contém aminoácidos adicionais na extremidade C-terminal VTVSS * *: Ligação de sinal obtido no final da injeção (= sinal máximo do RU) (1) : ACC. numeração ao Kabat (corresponde a a.a. na posição 87 na 3 a 5 SEQ ID NO. é).
(2) : ACC. numeração ao Kabat (corresponde a a.a. na posição 123 na 3 a 5 SEQ ID NO. é).
(3) : ACC. numeração ao Kabat (corresponde o a.a. em posição 86 na SEQ ID NO. é 17 e 18).
(4) : ACC. numeração ao Kabat (corresponde a a.a. na posição 116 na SEQ ID NO. é 17 e 18).
(5) : ACC. numeração ao Kabat (corresponde a a.a. na posição 86 na 19-22 SEQ ID NO. é).
(6) : ACC. numeração ao Kabat (corresponde a a.a. na posição 112 na 19-22 SEQ ID NO. é).
[00220] Novamente, sem se limitar a qualquer explicação ou hipótese específica, os dados apresentados acima mostram que (várias) substituições para a região C-terminal (como definido neste documento) de um ISV podem alterar/melhorar sua tendência em dar origem à interferência de proteína.
[00221] Exemplo 4: protocolos representativos para a realização dos ensaios ADA da figura 1.
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112/136 [00222] Este exemplo dá algumas condições representativas, mas não limitativas que poderiam ser usadas para realizar os ensaios de ponte/competitivo ADA esquematicamente mostrados na Figura 1:
- Ensaio ADA da figura 1A em solução: matriz de 100% de amostras, 30', 37°C, tratamento com ácido usando ácido acético em 10 matrizes, 5', temperatura ambiente, amostra de neutralização ácida/pré-incubação: ISV-Sulfo (:Tris) 1:1:1 (1: 0,9: 0,9:0,1), 1h, temperatura ambiente; na placa 1 h, temperatura ambiente; 3x lavagem, 4X Tampão de Leitura.
- Ensaio ADA de figura 1B em solução: matriz de 20% de amostras, 30', 37°C, amostra de pré-incubação: ISV - Sulfo 1:1:1, 1h, temperatura ambiente, na placa 1 h, temperatura ambiente; lavagem 3x, Tampão de Leitura 2X
- Ensaio ADA sequencial da Figura 1: Capturar ISV-Bio, 1 h, temperatura ambiente, lavagem 3X, matriz de 20% de amostras, 15', temperatura ambiente, na placa 2 h, temperatura ambiente; lavagem 3x, deteção ALX-0141-Sulfo, 1 h, temperatura ambiente, lavagem 3x, Tampão de Leitura 4X.
[00223] Exemplo 5: Prevendo a sensibilidade do ISV para a interferência de proteína não específica usando o anticorpo analítico.
[00224] Este exemplo descreve um ensaio de ponte/competição ADA utilizando o anticorpo analítico que pode ser usado para prever
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113/136 a sensibilidade de um ISV para interferência de proteína não específica.
[00225] O ISV a ser testado é diluído em uma concentração de
10 pg/ml e incubadas com o anticorpo analítico em 400 ng/ml,
purificado de acordo com o exemplo 2 e incubada a 37°C a 600 rpm em placas de polipropileno de 96 poços. A amostra (50 pL) é então diluída a 1/3 na mistura 1:1 (100 pl) de 2 pg/ml
biotinilado e 2 pg/ml ISV sulfo-tag e incubada por 1 hora em
temperatura ambiente, 600 RPM, placas padrão de estreptavidina
de 96 poços MSD MA® são bloqueadas com 150 pl/poço Superblock®
T20 durante 1 hora a temperatura ambiente, então lavadas 3 vezes
com PBS/0,05%Tween20 (= tampão de lavagem). Mistura de
amostra/1:1 (biotinilado e ISV sulfo-tag) (50,0 pl) é
transferida da placa de polipropileno para a placa MSD e
incubadas por 1 hora em temperatura ambiente, 600 rpm. As placas
são lavadas três vezes antes da adição de 2 x Tampão de leitura
(MSD) (150 pl/poço) e ler as unidades ECL (ECLU) em um
instrumento MSD (Sector Imager 2400 reader).
[00226] Usando este ensaio, os ISVs de SEQ ID NO. 23 a 30 foram testados e comparados. Os dados são mostrados na tabela IX. Estes dados não só mostram que o ensaio descrito neste exemplo pode ser usado para prever a tendência de um ISV em dar origem à interferência de proteína, mas os dados gerados também confirmam as conclusões dos exemplos anteriores sobre o efeito das substituições na região C-terminal. Como pode ser visto, a
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114/136 adição de 3 resíduos de alanina adição de 3 (e a menor extensão 1) no C-terminal do ISV totalmente humanizado aboliram sua capacidade de competir com a ligação do anticorpo analítico. Posição de mutação 14 na variante ISV tipo selvagem de alanina a prolina, claramente, aumentou sua capacidade como competidores no ensaio, (= fazer a variante ISV mais propensa a interferência de proteína não específica), considerando que as posições de mutação 83 e 108 não influenciam claramente na sensibilidade do ISV para interferência de proteína não específica.
[00227] Tabela IX
Identificação da afinidade do anticorpo purificado IHuP #002-001-ABL-08
Ensaio de triagem na ECLU (usando a SEQ ID NO: 1) 2919
Variante do Nanocorpo (coluna direita menciona as substituições humanizadas e adições C-terminal feitas em comparação com a seqüência tipo selvagem da SEQ ID NO: 23) Teste de confirmação ECLU % de redução
SEQ ID NO: 23 VHH tipo selvagem 2706 7,3
SEQ ID NO: 24 VHH tipo selvagem + A14P 268 90,8
SEQ ID NO: 25 VHH tipo selvagem + K83R 2460 15,71
SEQ ID NO: 26 VHH tipo selvagem + Q108L 2533 13,23
SEQ ID NO: 27 VHH tipo selvagem + A14P + K83R + Q108L 319 89,1
SEQ ID NO: 28 VHH tipo selvagem + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L 251 91,4
SEQ ID NO: 29 VHH Tipo selvagem + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L + 1 A adicionais no Cterminal (A114) 130V 58,64
SEQ ID NO: 30 VHH tipo selvagem + A14P + R39Q + K83R + T91Y + Q108L + 3 A no C-terminal (A114 + A115 + A116) 3301 -13,09
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115/136 [00228] Exemplo 6: Influência da adição de aminoácidos para o C-terminal do Nanocorpos anti-OX40L na sua potência de bloqueio OX40L.
[00229] Este exemplo demonstra que a extensão C-terminal não tem influência na potência de bloqueio ou atividade dos Nanocorpos.
[00230] A potência em vitro da sequência biespecífica trivalente otimizada anti-OX40L Nanocorpo Nb 3,16 (SEQ ID NO:
31) foi comparado com a potência da Nanocorpo correspondente contendo uma Ala adicional no seu C-terminal Nb 3,17 (SEQ ID NO:
32) .
[00231] O primeiro ensaio, o ensaio de ativação de células T, foi realizado da seguinte forma. PBMCs foram isolados da camada leuco-plaquetária (Red Cross, Ghent, Bélgica) de doadores saudáveis usando reagente Ficoll Paque Plus (GE Healthcare) e lavado usando meio RPMI 1640 completo (RPMI1640 + GlutaMAX + 25mm HEPES + 10% de soro fetal bovino + 1% penicilina/estreptomicina; Invitrogen). O PBMC's (1 x 105 células/poço) foi estimulado com fitoemaglutina (PHA-L; concentração final 0,6 pg/ ml) antes da adição de 1 x 104 hOX40L expressando células CHO (irradiadas com cintilador gama em 3000 RAD; UZ Gent, Bélgica) e séries de diluição de Nanocorpos antiOX40L Meio RPMI 1640 completo e incubadas durante 22 horas a 37DC em uma incubadora de CO2. A produção de IL2 pelos PBMCs foi
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116/136 medida em ELISA. Poços de uma placa Maxisorp foram revestidos a noite a 4DC com anticorpo monoclonal anti-humano IL2 (BD Biosciences). Depois de lavar e bloquear os poços revestidos, ½ diluição do sobrenadante de célula foi adicionado. Como um padrão, ½ diluição em série do recombinante humano IL2 (BD Biosciences) partindo de 2000 pg/ml foram incluídos. A Detecção foi feita usar anti-humano monoclonal biotinilado IL2 (BD Biosciences) e conjugado de estreptavidina com HRP (Thermo Scientific) e esTMB (reagentes SDT). A reação foi interrompida com 1N HCl e o OD foi lido a 450 nm. Como esperado, a potência do Nanocorpo otimizado de sequência biespecífica trivalente Nb 3,17 (IC50 = 0,13nM, 95% CI = 0,098-0,17nM) foi comparável a do Nb 3,16 (IC50 = 0,10nM, 95% CI = 0,071-0,15 nM).
[00232] Em um ensaio de competição baseado em ELISA, uma série de diluição (de 1,5μΜ para 0,083 pM) dos Nanocorpos foram previamente incubados durante a noite em temperatura ambiente com 100ng/ml humana OX40/Fc (R&D Systems) e 10ng/ml OX40L humanos biotinilados (R&D systems; biotinilado internamente como descrito no exemplo 1) em PBS +0,1% BSA +0,01% Tween-20. Em seguida, as amostras foram incubadas em placas Maxisorp revestidas com 10ug/ml Nanocorpo Fc anti-humana (gerado internamente) e bloqueadas com PBS + 1% de BSA 0,1% Tween-20. OX40/Fc humano ligado foi detectado usando conjugado de estreptavidina com HRP (Thermo Scientific) e sTMB (reagentes SDT). A reação foi interrompida com 1N HCl e o OD foi lido a 450
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117/136 nm. Em conformidade com o ensaio baseados em células, a potência do Nanocorpo otimizado de sequência biespecífica trivalente Nb 3,17 (IC50 = 0,178nM, 95% CI = 0,152-0,200nM) foi comparável por aquele da Nb 3,16 (IC50 = 0,179nM, 95% CI = 0,149 a 0,215nM).
[00233] Exemplo 7: geração de anticorpo monoclonal 21-4-3.
[00234] Dois grupos de estirpes diferentes de camundongos (BALB/c e NMRI - três ratos cada) foram imunizados intraperitonealmente, com o construto de Nanocorpo de SEQ ID NO: 98 no WO 2006/122825, em uma emulsão de água em óleo de volumes iguais de antígeno e adjuvante completo ou incompleto de Freund) durante um período de 39 dias, com reforços até se obter títulos antissoros adequados.
[00235] Após a asfixia dos ratos estimulados em CO2, os baços foram removidos assepticamente e uma suspensão de célula única de baços agrupados foi preparada. As células do baço e células de mieloma foram lavadas várias vezes com DMEM e fundidas na presença de 1 ml 50% (p/v) PEG 3350 (taxa de células de baço para SP2/0 3:1). Para fusão foi usada à linhagem de células de mieloma SP2/0-Ag14 da coleção alemã de microorganismos e culturas de células (DSMZ GmbH, Braunschweig). Esta linha de célula é um híbrido entre células de baço BALB/c e a linhagem de células de mieloma P3x63Ag8. Os hibridomas então produzidos foram resuspensos no CGM contendo 20% de FCS e aminopterina (meio HAT) e revestidas (140 pl/poço) em oito placas de fundo plano de 96 poços de cultura de tecidos (Corning-Costar)
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118/136 contendo 140 μΐ/poço CGM (20% FCS) com células excudate peritoneal como células alimentadoras. As placas foram incubadas durante 10 dias em um meio de crescimento completo (CGM) contendo DMEM com suplementos 2-Mercaptoetanol, L-Glutamina, Glutamina estável, HT e aminoácidos não essenciais (em concentrações recomendadas pelo fornecedor) e FCS em diferentes concentrações (10%, 15% ou 20%). Durante este período as células foram alimentadas duas vezes com o meio HAT. Os sobrenadantes de cultura celular de células de hibridoma geralmente continham anticorpo de 1 a 20 μg/ml, que foram testados em uma ligação ELISA para confirmar a ligação ao construto de Nanocorpo de SEQ ID NO: 98 no WO 2006/122825.
[00236] As células IgG positiva produzidas em poços foram transferidas para as placas de 48 poços e cultivadas por 2 a 4 dias (dependendo do crescimento característico das células). A ligação ELISA em ALX081 e IgG humanos/cynomolgus foi realizada a fim de excluir os ligadores inespecíficos. As células de hibridoma expressando ligantes específicos para o construto de Nanocorpo de SEQ ID NO: 98 no WO 2006/122825 foram duas vezes clonadas usando diluição limitada. Após a fusão e reseleção de 7 culturas primárias, produzindo anticorpos contra ALX-081 foram identificadas. Todas essas culturas primárias produziram anticorpos sem reação cruzada com IgG humanos ou cynomolgus. As culturas primárias foram recicladas (duas vezes).
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119/136 [00237] Clone 21-4 (um dos clones anticorpos produzidos de forma estavél contra ALX-081 após a segunda clonagem) foi nomeado ABH0015 e foi depositado na Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM) em Ghent, Bélgica em 4 de junho de 2012, sob o número de acesso LMBP-9680-CB. O anticorpo monoclonal de rato produzido por ABH0015 foi chamado 21-4-3: a determinação do isotipo para 21-4-3 mostrou uma cadeia pesada de IgG1 e uma cadeia leve kappa, que foram seqüenciadas (ver do SEQ ID NO: 35 e 36, respectivamente). 21-4-3 foi mostrado para ligar a região C-terminal do construto de Nanocorpo de SEQ ID NO: 98 no WO 2006/122825 (dados não mostrados).
[00238] Exemplo 8: ligação de 21-4 para um ISV é prevista da tendência de um ISV em submeter-se a interferência de proteína não específica [00239] Este exemplo juntamente com exemplo 9 a seguir demonstra que a ligação do anticorpo monoclonal 21-4 para um ISV pode ser usada para prever (dentro dos graus de certeza indicados neste exemplo) se um determinado ISV terá tendência a sofrer interferência de proteína não específica (por exemplo, em um ensaio ADA).
[00240] Este exemplo 8 mostra particularmente que 21-4 pode ser usado para prever se certas propostas de modificação de um determinado ISV (por exemplo, adicionando um ou mais resíduos de aminoácidos para o C-terminal de um ISV e/ou substituindo uma ou mais substituições de aminoácidos dentro da região C-terminal
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120/136 de um ISV) conduzirão uma redução da tendência do dito ISV submeter-se a interferência de proteína não específica.
[00241] Em suma, um conjunto de 53 diferentes Nanocorpos e construtos de Nanocorpos (veja Figura 9 e SEQ ID NO's: 38 a 89) foram testados para ligação pelo anticorpo monoclonal 21-4-3. Os mesmos construtos de Nanocorpos e Nanocorpo também foram testados para ligação por preparações purificadas do fator de interferência obtidas de três diferentes doadores humanos (referido aqui como doador 8, doador de 19 e doador 30), para ver se havia alguma correlação entre a ligação por 21-4 e pelos fatores de interferência puificados.
[00242] Foi estabelecido que a ligação de um ISV por 21-4 realmente pode ser usada para prever a ligação dos mesmos ISVs pelo fator de interferência (dentro do grau geral de confiança aqui fornecido pelo conjunto de dados estabelecidos).
[00243] Para demonstrar isso, conforme detalhado pelo conjunto de dados experimentais estabelecidos, a ligação dos 53 Construtos de Nanocorpo ou Nanocorpos (conforme listado na Figura 9; ver SEQ ID NO: 38 a 89) por 21-4 foi medida usando um Biacore T100 (de acordo com o protocolo estabelecido abaixo) e foi comparada a ligação de um Nanocorpo ou construção de referência (também listados na Figura 9), como medido usando o mesmo instrumento Biacore e o mesmo protocolo. Os resultados são mostrados na tabela X abaixo.
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121/136 [00244] Tabela X
SEQ Aminoáci Mutações Redução na Redução na Redução na Redução na Mais do Mais do
ID do(s) C- para a ligação de interferên interferên interferên que 70% da que 90% de
NO: terminal região 21-4-3 vs cia do cia do cia do redução na redução na
C- ligação da soro do soro do soro do ligação de ligação de
terminal sequência Doador A Doador B Doador C Nanocorpo Nanocorpo
de comparado comparado comparado para 21-4- para 21-4-
referência à à à 3 prevê 3 prevê
(=100 %) sequência sequência sequência >50% de >50% de
de de de redução na redução na
referência referência referência ligação do ligação do
(=100%) (=100%) (=100%) Nanocorpo Nanocorpo
para a para a
interferên interferên
cia cia
37 A nenhuma 7% 3% 21% 31% ok ok
38 A nenhuma 0% 9% 25% 7% ok ok
39 A nenhuma 0% 10% 43% 35% ok ok
40 A nenhuma 1% 6% #N/A #N/A ok ok
41 A nenhuma 7% 6% 9% #N/A ok ok
42 A nenhuma 0% 1% 4% #N/A ok ok
43 A nenhuma 3% 3% 20% #N/A ok ok
44 A nenhuma 1% 5% #N/A #N/A ok ok
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122/136
Tabela X (Continuação - veja cabeçalho da coluna acima)
45 nenhuma P14A, P41T, S62F, S74A, S82bN, R83K, L108Q 22% 0% #N/A #N/A ok
46 AAEQKLIS EEDLNGAA HHHHHH A14P, T41P, F62S, A74S, N82bS, K83R, Q108L 2% 0% #N/A #N/A ok ok
47 GGGGSGGG SRDWDFDV FGGGTPVG G nenhuma 4% 1% #N/A #N/A ok ok
48 AAEQKLIS EEDLNGAA HHHHHH nenhuma 3% 0% #N/A #N/A ok ok
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Tabela X (Continuação - veja cabeçalho da coluna acima)
49 AAEQKLIS EEDLNGAA HHHHHH V5L, I23A, E44G, A4 9S, A68T, A74S, T78L, W79Y, K83R, T110Q, Q108L 4% 0% #N/A #N/A OK OK
50 nenhuma L11S 44% 77% 33% #N/A (<70% de redução) (<90% de redução)
51 nenhuma T110Q 88% 85% 84% #N/A (<70% de redução) (<90% de redução)
52 nenhuma S112G 100% 84% 58% #N/A (<70% de redução) (<90% de redução)
53 nenhuma S113G 13% 85% 88% #N/A NOK (<90% de redução)
54 nenhuma L11S, T110Q, S112G, S113G 16% 39% 16% #N/A OK OK
55 A nenhuma 6% 2% 21% 31% OK OK
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Tabela X (Continuação - veja cabeçalho da coluna acima)
56 G S113G 3% 2% 25% 0% OK OK
57 AS nenhuma 6% 1% 2% #N/A OK OK
58 AST nenhuma 6% 2% 2% #N/A OK OK
59 ASTK nenhuma 6% 2% 1% #N/A OK OK
60 ASP nenhuma 6% 2% 1% #N/A OK OK
61 AP nenhuma 6% 2% 2% #N/A OK OK
62 APT nenhuma 6% 2% 1% #N/A OK OK
63 W nenhuma 3% 4% 8% #N/A OK OK
64 L nenhuma 6% 3% 4% #N/A OK OK
65 nenhuma P14A 23% 73% 121% 64% NOK (<90% de redução)
66 nenhuma L11S 48% 81% 29% 84% (<70% de redução) (<90% de redução)
67 nenhuma R83K 101% 102% 117% 96% (<70% de redução) (<90% de redução)
68 nenhuma P14A, L108Q 26% 38% 115% 49% NOK (<90% de redução)
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125/136
Tabela X (Continuação - veja cabeçalho da coluna acima)
69 nenhuma L108Q 106% 80% 120% 84% (<70% de redução) (<90% de redução)
70 nenhuma T110Q 106% 90% 105% 98% (<70% de redução) (<90% de redução)
71 nenhuma S113G 44% 88% 105% 87% (<70% de redução) (<90% de redução)
72 nenhuma S112G, S113G 45% 70% 47% 56% (<70% de redução) (<90% de redução)
73 G S112G, S113G 1% 6% 8% 9% OK OK
74 G nenhuma 1% 4% 41% 33% OK OK
75 AA nenhuma 1% 1% 11% 16% OK OK
76 GGG nenhuma 2% 2% 17% 20% OK OK
77 A nenhuma 1% 2% 12% 13% OK OK
78 nenhuma Q13R 1% 96% 96% 100% NOK NOK
79 GG nenhuma 2% 1% 17% 13% OK OK
80 nenhuma T110Q, S112G, S113G 51% 65% 5% 58% (<70% de redução) (<90% de redução)
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Tabela X (Continuação - veja cabeçalho da coluna acima)
81 nenhuma L11V 75% 94% 50% 89% (<70% de redução) (<90% de redução)
82 nenhuma P84A 56% 96% 80% 100% (<70% de redução) (<90% de redução)
83 nenhuma T87A 79% 56% 73% 61% (<70% de redução) (<90% de redução)
84 nenhuma S112G 91% 84% 50% 83% (<70% de redução) (<90% de redução)
85 nenhuma L11S, T110Q, S112G, S113G 32% 46% 5% 42% (<70% de redução) (<90% de redução)
86 nenhuma L11S, T110Q 64% 76% 6% 86% (<70% de redução) (<90% de redução)
87 nenhuma L11S, S112G, S113G 41% 51% 5% 39% (<70% de redução) (<90% de redução)
88 A L11S, T110Q 1% 1% 5% 11% OK OK
89 nenhuma L11S, P14A, T110Q, S112G, S113G 2% 14% 5% 17% OK OK
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127/136 [00245] Para cada uma dos 53 Construtos de Nanocorpo ou
Nanocorpos testados, a referência foi escolhida tal que, em comparação com a referência, Construtos de Nanocorpo ou
Nanocorpos testados ou que tiveram um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais na extremidade C-terminal (que foram adicionados a fim de testar o efeito de tal adição de interferência de proteína e em particular a fim de reduzir a uma ou mais mutações na região Cterminal (por exemplo, como resultado de humanização em comparação com a referência).
Os resultados foram expressos como uma percentagem de redução na ligação (medida como unidades RU) para o determinado Nanocorpo contra a ligação de referência (também medido em unidades de RU - por exemplo, se o nível de ligação (RU) medido do Nanocorpo de referência foi de 276 e o nível de ligação do Nanocorpo dado (também em RU) foi 9, então a redução no nível de ligação foi para um nível de [9 RU/276 RU] x 100% = 3%) , o que significa uma redução de 97%, em comparação com a referência (100%).
[00247] Da mesma forma, a ligação dos fatores de interferência purificada de cada um dos três doadores para cada um dos 53 Construtos de Nanocorpo ou Nanocorpos foi medido usando o mesmo instrumento Biacore e comparado à ligação dos fatores de interferência purificada ao mesmo Nanocorpo ou
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128/136 construto de referência. Os resultados foram similarmente expressos como uma de interferência percentagem de redução na ligação do fator para o dado Nanocorpo ou construto de
Nanocorpo versus a referência.
Foi descoberto que para essencialmente todos os
Nanocorpo ou Construto Nanocorpo onde um ou mais resíduos aminoácidos foram adicionados à extremidade
C-terminal, em comparação com a referência, que a ligação dos fatores de interferência foi drasticamente reduzida.
Novamente, isto confirma que adicionar um extremidade C-terminal de interferência de proteína
Verificou-se também que na as substituições dentro da resíduos de aminoácidos à ou mais
um ISV (VTVSS) pode reduzir a
não específica em um ensaio ADA.
maioria dos casos, que fazer apenas
região C-terminal (ou seja, sem a
adição de um ou mais resíduos de aminoácidos para o comparadas com a referência, muitas vezes não tiveram um impacto drástico semelhante sobre a ligação dos fatores de interferência.
se uma redução na ligação por 21-4, em comparação com a referência foi de alguma forma correlacionada com uma redução na ligação de cada uma das três preparações diferentes do fator de interferência purificada em comparação com a referência. Tais correlações foram encontradas.
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129/136 [00250] Por exemplo, verificou-se que dos 54 Construtos de Nanocorpo ou Nanocorpos testado, 36 mostraram uma redução na ligação de 21-4 de mais de 70% em comparação com sua respectiva seqüência de referência (com a maioria destes 36 tendo um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais no C-terminal, em alguns casos em combinação com substituições dentro da região C-terminal). Dsses 36, 32 também mostraram redução da ligação pelo fator de interferência em comparação com a referência em do que 50% (e em um grande número de casos, em especial para os construtos de Nanocorpo ou Nanocorpos com um ou mais resíduos de aminoácidos adicionados no C-terminal, a redução foi muito maior do que 50%, como mais de 70% ou até mais de 90% veja os dados apresentados na tabela X). Isto demonstra que em 32 de 36 casos (ou seja, 89%) , uma redução na ligação por 21-4 de mais do que 70% (em comparação com a referência = 100%) é prevista para uma redução da ligação dos fatores de interferência de mais de 50% (em comparação com a mesma referência) . Para maior clareza, em cada caso, a redução foi calculada como 100% - [o percentual dado nas tabelas abaixo para o nível de redução conseguida com o Nanocorpo testado].
[00251] Da mesma forma, verificou que os 53 construtos de Nanocorpo ou Nanocorpos testados, 33 apresentaram uma redução na ligação de 21-4 de mais de 90% em comparação com sua respectiva seqüência de referência (novamente, com a maioria
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130/136 destes 33 tem um ou mais resíduos de aminoácidos adicionais no C-terminal, em alguns casos em combinação com as substituições dentro da região C-terminal). Estes 33, 32 também mostraram uma redução na ligação pelos fatores de interferência em comparação com sua respectiva seqüência de referência de mais de 50%. Isso demonstra que, em 32 dos 33 casos (ou seja, 97%) , uma redução na ligação de 21-4 de mais de 90% (em comparação com a referência) é prevista para uma redução da ligação dos fatores de interferência de mais de 50% (em comparação com a mesma referência).
[00252] Também deve ser notado que tal redução na ligação dos fatores de interferência em mais de 50% (como evidenciado pela redução da ligação por 21-4 de mais do que 70%) significa que tal fator de interferência essencialmente já não interfere com um ensaio ADA para o ISV em questão: confirmação experimental usando um ensaio ADA mostrou que, quando a ligação pelos fatores de interferência é reduzida em mais de 45%, nenhuma influência significativa da presença do fator a interferência no ensaio ADA pode ser observada sobre. A este respeito, também ficar claro para uma pessoa versada que isto também será o caso, quando a ligação pelos fatores de interferência é reduzida a uma extensão muito maior do que 50% (tais como por mais de 70% ou até mais de 90%) , como é observado em alguns casos (ver novamente os dados apresentados neste documento).
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131/136 [00253] Na verdade, verificou-se que uma redução de mais de 45% de ligação por 21-4 é uma indicação de uma redução da ligação por fatores de interferência de mais de 45%, o que como mencionado, significa que o fator de interferência já não interfere com ensaio ADA.
[00254] Além disso, os dados apresentados neste documento sobre a correlação entre a ligação (redução) por 21-4 e (redução na) ligação pelo fator de interferência também permitiram que os presentes inventores definissem um valor absoluto para a ligação por 21-4, abaixo do qual se pode esperar (dentro da confiança fornecida pelos dados estabelecidos no presente exemplo 8) que um ISV ou um construto à base de ISV não serão suscetíveis à ligação pelos fatores de interferência de uma forma que pudesse interferir com um ensaio ADA. Tal como consta no exemplo 9 a seguir, esse valor é 500 RU (determinado e calculado como indicado no exemplo 9).
[00255] 0 monoclonal 21-4 foi purificado a partir do meio de cultura dos hibridomas obtidos no exemplo 7 acima, da seguinte forma: células de hibridoma secretoras do anticorpo monoclonal 21-4-3 foram cultivadas em frascos de agitação em um meio livre de soro (CD hibridoma, Gibco, suplementada com 8mM de Lglutamina (Invitrogen) e 1 x colesterol (250 x colesterol lipídico concentrado, Gibco)) em um volume de lOOmL ou 500mL. Os sobrenadantes apurados foram filtrados, e o IgGl murino
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132/136 capturado em uma coluna de Proteína A (HiTrap MabSelect SuRe, 5mL, GE Healthcare) em uma taxa de fluxo reduzido de 2mL/min. 0 anticorpo ligado foi eluído em 0,1 M de tampão de citrato com pH 3,0 e as frações de eluição (de 5mL) diretamente neutralizadas com lmL de 1M TRIS pH 9. A pureza do anticorpo foi verificada por redução e não redução de SDS-PAGE.
[00256] As preparações purificadas dos fatores de interferência dos doadores 8 e 19 foram obtidas das amostras de soro dos ditos doadores por meio da purificação da afinidade, essencialmente, conforme descrito no exemplo 2A. Os fatores de interferência de uma amostra de soro 3 0 de doadores foram obtidas, essencialmente, conforme descrito no exemplo 2B.
[00257] Para determinar a ligação de 21-4 para cada um dos Nanocorpos ou construtos de Nanocorpo, utilizou-se o protocolo
descrito no exemplo 9.
[00258] A ligação dos fatores de interferência dos três
doadores para cada um dos construtos de Nanocorpos ou Nanocorpo
foi determinada usar um Biacore T100 essencialmente conforme
descrito no exemplo 3, usando o fator de interferência de cada um dos doadores 8, 19 e 30, diretamente imobilizada em um chip de sensor CM5.
[00259] Exemplo 9: protocolo para prever se um ISV terá tendência a sofrer interferência da proteína não específica (usando anticorpo monoclonal 21-4).
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133/136 [00260] Medidas de ligação foram realizadas usando um Biacore T100 com um chip de sensor CM5 T120416, com execução de tampão HBS-EP +, 25°C. 21-4 foi capturado via IgG de coelho anti-rato imobilizado, assim foi encontrado que a superfície mAb 21-4-3 foi diretamente imobilizada sem poder se regeenrada com eficiência. O IgG anti-mouse usado foi um anticorpo IgG de coelho anti-rato policlonal reagindo com todas as subclasses de IgG, IgA e IgM (GE Healthcare; Cat#BR-1008-38; Lot#10056316). A imobilização do IgG anti-rato foi realizada usando acoplamento manual de amina usando uma injeção de 7 minutos de EDC/NHS para ativação e uma injeção de 7 minutos de 1M de etanolamina HC1 com pH 8,5 para desativação (Kit de acoplamento de amina Biacore). As condições de ligação estão listadas na tabela XI. Baseado no nível de imobilização e MW das proteínas, o Rmax teórico para a ligação de mAb21-4-3 com o IgG anti-rato imobilizado foi ~ 13000RU (quando uma molécula de mAb21-4-3 é ligada a uma molécula de IgG anti-rato).
[00261] Tabela XI
Proteí Cone. Tempo de Taxa de Tampão de Nível de
na (pg/ml) contato fluxo Imobiliz a- imobilização
(s) (μΐ/min) ção (RU)
Anti- 30 420 5 lOmM de 13028
rato acetato pH
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134/136
IgG 5,0
Anti- 30 420 5 lOmM de 13318
rato 24 acetato pH
IgG 5,0
[00262] As condições usadas para a experiência de ligação (Biacore T100) usando 21-4 imobilizado da forma que são dadas na tabela XII. A superfície IgG anti-rato podería ser regenerada com êxito após a captura de mAb21-4-3 e injeção de todas as amostras (com um aumento limitado para nível de linha de referência após cada regeneração).
[00263] Tabela XII
Captura
Caminho do fluxo 4
Taxa de fluxo (μΐ/min) 10
Tempo de contato (s) 180
Concentração (pg/ml) 10
Ligação e dissociação
Caminho do fluxo 3,4
Taxa de fluxo (μΐ/min) 45
Tempo de contato de amostra (s) 120
Concentração da amostra (nM) 500
Tempo de dissociação (s) 600
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135/136
Regeneração 1
Caminho do fluxo 3,4
Taxa de fluxo (μΐ/min) 10
Tempo de contato de regeneração (s) 180
Tampão de regeneração Glicina-HCl de 10 milímetros pH 1,7
Tempo de estabilização (s) 120
Se...Então...Mais Se após a regeneração 1 > 20 RU no Fc4
Outro ciclo de saída
Regeneração 2
Caminho do fluxo 3,4
Taxa de fluxo (μΐ/min) 10
Tempo de contato de regeneração (s) 120
Tampão de regeneração Glicina-HCl de 10 milímetros pH 1,7
Tempo de estabilização (s) 120
[00264] O protocolo acima foi usado para gerar os dados de ligação de 21-4 estabelecidos na tabela X. Quando os valores absolutos para RU foram considerados (após ajustar o valor medido do RU para o peso molecular do ISV, proteína ou polipeptídeo de acordo com a fórmula ([RU medido]/ [MW da proteína] x 106) , foi encontrado que os construtos de nanocorpos e nanocorpo, mencionadas na tabela X, que tinha um resíduo de alanina adicionado e que mostrou uma redução > 90%
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136/136 na ligação de 21-4, bem como nos fatores de interferência, geralmente os valores de RU fornecidos, entre 30RU e 400RU (com a correspondente os Nanocorpos ou polipeptideos de referência conforme listado na Figura 9 - tendo valores de RU de maiores que 1000, normalmente maiores que 1500 e muitas vezes maiores que 2000).
[00265] Com base nisso, considerou-se que um valor de RU (ajustado) de menos de 500 neste ensaio seria claramente um indicativo de um ISV (ou uma proteína ou polipeptídeo que compreende pelo menos um IS, conforme descrito neste documento) que será (essencialmente) não ligado por fatores de interferência de uma maneira que pudesse interferir com um ensaio ADA.
[00266] Todo o conteúdo de todas as referências (incluindo referências bibliográficas, patentes emitidas, pedidos de patentes publicados e pedidos de patente co-pedentes) citadas ao longo deste pedido é expressamente incorporado por referência, em especial aos ensinamentos às quais são referenciadas, neste documento.

Claims (6)

1. Polipeptídeo CARACTERIZADO por conter um domínio variável único de imunoglobulina (ISV) em sua extremidade Cterminal, no qual o dito ISV é um Nanocorpo ou um ISV que compreende uma seqüência VH ou que é derivado de uma sequência VH, no qual o ISV tem uma extremidade C-terminal da sequência VTVSS(X)n, em que n é 1 a 5, e em que cada X é um resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente que é escolhido independentemente, em que o dito ISV foi modificado por uma ou mais substituições de aminoácidos na posição 11, 13, 14, 15, 82, 82a, 82b, 83, 84, 107, 108 ou na sequência C-terminal VTVSS e em que o dito ISV tem uma tendência substancialmente reduzida para dar origem a interferência de proteína em comparação com o mesmo ISV sem as modificações.
2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que:
- n = 1, 2 ou 3 (e de preferência 1 ou 2) em que cada X = Ala ou Gly; ou - n = 1, 2 ou 3 (e de preferência 1 ou 2) em que cada X = Ala; ou - n = 1, 2 ou 3 (e de preferência 1 ou 2) em que cada X = Gly; ou - n = 2 ou 3 em que pelo menos um X = Ala ou Gly (com
o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu
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2/2 e/ou Ile); ou
- n = 2 ou 3 em que todos excepto um X = Ala ou Gly (com o resíduo de aminoácido restante X sendo independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, mas de preferência sendo independentemente escolhido de Val, Leu e/ou Ile);
- n = 1 a 5, em que cada X é independentemente escolhido de qualquer aminoácido que ocorre naturalmente, com a condição de que X não é cisteína.
3. Polipeptídeo de acordo com as reivindicações 1 ou 2,
CARACTERIZADO pelo fato de que a dita uma ou mais substituições na regiões C-terminal estão nas posições selecionadas de 11, 14, 83, 108 ou 110. 4. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 . a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a
região C-terminal é substituída na posição 110.
5. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a dita substituição na posição 110 é uma substituição da treonina pela glutamina (T110Q).
6. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito ISV é um VH ou VHH e a dita substituição substitui um resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente na dita posição em um VH ou VHH.
7. Polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, CARACTERIZADO pelo fato de ser utilizado na terapia.
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