KR20210070220A - 내산소성 비피도박테리움 균주를 유효성분으로 포함하는 반려동물용 생균제 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
내산소성 비피도박테리움 균주를 유효성분으로 포함하는 반려동물용 생균제 조성물 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 내산소성 비피도박테리움 균주를 유효성분으로 포함하는 반려동물용 생균제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 반려동물용 생균제는 반려동물의 장내 유산균과 비피더스 균의 수는 증가시키고, 대장균의 수는 감소시켜 장내 미생물총을 개선할 수 있으므로, 장염 또는 배변활동이 불편한 반려동물을 위한 건강보조사료로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
Description
본 발명은 내산소성 비피도박테리움 균주를 유효성분으로 포함하는 반려동물용 생균제 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
반려동물산업에 있어서, 2011년 7월부터 항생제 금지조치에 따른 대체품목인 생균제 시장의 규모가 17여 개의 보조사료 중 44%를 차지하고 있다. 종래 반려동물을 위한 보조사료는 털이나 뼈, 관절 등 주요 기능성 제품의 판매가 주를 이뤘다면 최근에는 유산균, 스트레스 완화, 눈 건강 등 기능적이고 특화된 제품들에 대한 수요가 증가하고 있는 추세이다. 국내시장의 경우, 고가의 유기농 제품과 프리미엄 제품을 포함하여 수입제품이 시장의 대부분을 차지하고 있으며, 반려동물 사료수입량이 지속적으로 증가하면서 2001년 17,169톤에서 2011년 36,308톤 규모로 성장하였으며, 2012년에는 전체 반려동물 사료시장의 약 58%가 수입제품으로 확인되었다. 수입제품을 찾는 소비자들의 수요가 증가하면서 해외 유명제품을 수입해서 판매하는 구매대행 업체가 늘어나고 있으나, 현지 가격과의 차이가 상당한 것으로 확인되었다. 이에 따라 수입제품에 버금가는 국내제품을 개발하고 사양실험, 급여효과, 사례 등을 철저히 분석하는 한편 가격경쟁력을 갖추어 향후 증가할 것으로 예상되는 시장상황에 유기적으로 대응할 필요가 있는 상황이다.
반려동물 시장의 급격한 성장에 따라 건강 및 위생문제도 심각하게 대두되고 있다. 특히 피부염, 급성 위장염, IBD(Inflammatory bowel disease), 알레르기, 탈모, 스트레스, 비만과 과체중, 비뇨생식기 감염, 헬리코박터 위염, 기생충 감염 등이 주된 질병으로 밝혀졌다, 치료뿐 아니라 예방차원 목적에서도 생균제의 관심이 매우 높아지고 있다.
비피더스(bifidus)는 모유 영양아의 분변에서 최초로 분리되었으며, 유아 및 성인에 있어서도 비피더스 변화가 스트레스, 알레르기 또는 암 등과 밀접하게 관련되어 있음이 밝혀짐에 따라 건강 기여효과가 인정되고 있으며, 발효유, 유아식, 건강식품, 정장제 등에 널리 활용되고 있다. 비피더스는 혐기성균으로 혐기조건을 필요로 하기때문에 산업적으로 이용하는데 제한적이며, 발효유 내 비피더스 균수 문제가 제기되고 있다. 이는 비피더스가 원료유에서 잘 자라지 않기 때문에 발효유 제조 후 혐기적으로 배양한 비피더스를 첨가하여 유통하게 되는데, 유통과정에서 비피더스 생육조건인 혐기조건 형성이 어려워 지속적으로 사멸하는 문제점이 발생하기 때문이다. 비피더스의 다양한 생리활성을 식품산업에 이용하는 추세이나, 편성혐기성균(偏性嫌氣性菌)이라는 점과 현재 국내에서 발효유 제품에 사용하고 있는 유산균은 외국인에서 유래된 균주로서 한국인에게서 우수한 생리활성을 나타내지 못한다는 점도 지적되고 있다. 비피더스의 건강증진작용으로는 감염에 대한 저항성, 항암, 항종양, 혈중 콜레스테롤 함량 저하 및 정장효과 등의 다양한 생리활성이 보고되어 있다.
한편, 한국등록특허 제2003822호에는 '반려동물의 모질을 개선하는 효능을 갖는 유산균과 이를 포함하는 생균제 조성물을 유효성분으로 함유하는 모질 개선을 위한 동물 사료용 첨가제 및 동물 사료 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0568036호에는 '장기능 활성화 및 면역기능 강화작용을 하는 비피토박테리움 균주 및 이를 함유하는 생균제제'가 개시되어 있으나, 본 발명의 내산소성 비피도박테리움 균주를 유효성분으로 포함하는 반려동물용 생균제 조성물 및 이의 제조방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 반려동물용 사료첨가제로 사용되는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 조성물로서 열 또는 동결건조 공정으로 제조가 가능한 조성물을 개발하고자, 국립축산과학원으로부터 내산소성을 가지는 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주(기탁번호 KACC91563P)를 기술이전받아 상기 균주의 대량생산을 위한 최적화된 산업용 배지 및 배양조건을 개발하였고, 분말형태의 생균제를 생산하기 위해 최적 냉동건조 조건을 확립하여 반려동물용 생균제 제품을 개발하였다. 또한, 상기 개발한 반려동물용 생균제 제품을 이용하여 반려견에 대한 사양실험을 수행한 결과, 본 발명에서 개발한 생균제 제품을 섭취한 반려견의 장내환경 및 분변지수가 생균제 섭취 전에 비해 개선되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 기탁번호가 KACC91563P인 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주를 배양배지에 접종하여 배양하는 단계; 및 상기 배양된 균주 배양액의 냉동건조물에 냉동보호제를 첨가한 후 동결건조하는 단계;를 포함하는, 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말을 유효성분으로 포함하는 장내 환경 및 분변지수 개선을 위한 반려동물용 생균제 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 반려동물용 생균제는 반려동물의 장내 유산균과 비피더스 균의 수는 증가시키고, 대장균의 수는 감소시켜 장내 미생물총을 개선할 수 있으므로, 장염 또는 배변활동이 불편한 반려동물을 위한 건강보조사료로 유용하게 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주(기탁번호 KACC91563P)를 함유하는 생균제의 시제품 사진이다.
도 2는 본 발명에 따른 비피도박테리움 롱검 균주를 함유하는 생균제 섭취에 따른 반려견 분변의 황화수소(H2S) 및 암모니아(NH4) 변화를 보여준다.
도 2는 본 발명에 따른 비피도박테리움 롱검 균주를 함유하는 생균제 섭취에 따른 반려견 분변의 황화수소(H2S) 및 암모니아(NH4) 변화를 보여준다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호가 KACC91563P인 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주를 배양배지에 접종하여 배양하는 단계; 및 상기 배양된 균주 배양액의 냉동건조물에 냉동보호제를 첨가한 후 동결건조하는 단계;를 포함하는, 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 기탁번호가 KACC91563P인 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주는 내산소성(aerotolerant)을 가지며, 단독으로 커드의 형성이 가능한 비피도박테리움 롱검 6-T-4-55(Bifidobacterium longum 6-T-4-55) 균주이다 (한국등록특허 제1250463호).
본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 배양배지는 바람직하게는, 배지 조성물의 단위부피 L 당 옥수수침지액(corn steep liquor) 20~40 ㎖, 효모 추출물 1~3 g, 글루코스 1~3 g, 탈지유 분말 0.1~2 g, 수산화나트륨 0.1~2 g, 염화나트륨 3~7 g, L-시스테인(cysteine) 0.3~0.7 g 및 파라핀유(paraffinic oil) 30~50 ㎖을 포함하는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 배지 조성물의 단위부피 L 당 옥수수침지액 25~35 ㎖, 효모 추출물 1.5~2.5 g, 글루코스 1.5~2.5 g, 탈지유 분말 0.5~1.5 g, 수산화나트륨 0.5~1.5 g, 염화나트륨 4~6 g, L-시스테인 0.4~0.6 g 및 파라핀유 35~45 ㎖을 포함하는 것일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는 배지 조성물의 단위부피 L 당 옥수수침지액 30 ㎖, 효모 추출물 2 g, 글루코스 2 g, 탈지유 분말 1 g, 수산화나트륨 1 g, 염화나트륨 5 g, L-시스테인 0.5 g 및 파라핀유 40 ㎖을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 기탁번호가 KACC91563P인 비피도박테리움 롱검 균주는 동일한 배양배지에서 종균배양(seed culture)한 후, 본 배양배지의 0.6~1.0 중량%(v/v)로 접종하여 배양하였다. 상기 배양은 32~37℃의 온도에서 22~50시간 동안 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에 따른 제조방법에 있어서, 상기 냉동보호제는 배양된 균주 배양액의 냉동건조물을 동결건조하기 전 단계에서 첨가하는 것으로, 바람직하게는 배양배지의 0.1~1.0 중량%(w/v)로 첨가되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 배양배지의 0.4~0.7 중량%(w/v)로 첨가되는 것일 수 있으며, 더 더욱 바람직하게는 배양배지의 0.56 중량%(w/v)로 첨가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 냉동보호제는 탈지분유, MSG (monosodium glutamate) 및 만니톨이 동일 중량으로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말의 제조방법은, 전술한 배양배지 및 냉동보호제의 사용을 통해 동결건조분말 내 비피도박테리움 롱검의 생균수가 26~30℃의 온도에서 102~106일 동안 5.0 x 109 내지 1.0 x 1010 cfu/g을 유지될 수 있도록 하여, 열에 약한 비피더스의 보존성을 현저하게 증가시킨 것이 특징이다.
본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말을 제공한다.
본 발명에 따른 동결건조분말은 26~30℃의 온도에서 102~106일 동안 비피도박테리움 롱검의 생균수가 5.0 x 109 내지 1.0 x 1010 cfu/g으로 유지될 수 있고, 상기 온도뿐만 아니라 3~5℃의 온도에서도 동일 기간 유사한 수준으로 생균수를 유지하는 것이 특징이다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말을 유효성분으로 포함하는, 장내 환경 및 분변지수 개선을 위한 반려동물용 생균제 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 '생균제'는 장내 미생물의 균형을 개선하여 숙주동물에게 유익한 작용을 하는 물질을 의미하는 것으로, 프로바이오틱스(probiotics)로도 불리운다. 본 발명의 반려동물용 생균제 조성물은 유효성분으로 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) KACC91563P 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 포함할 수 있고, 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다.
예를 들어, 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조될 수 있고, 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 상기 생균제 조성물은 비피도박테리움 롱검 KACC91563P 균주 외에, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플랜타룸(L. plantarum), 및 페디오코커스 애시도락티시(Pediococcus acidilactici)를 추가로 포함할 수 있으며, 면역증강물질 및 피부알러지 억제물질 또한 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 반려동물용 생균제 조성물에 있어서, 상기 반려동물은 이에 한정되지 않으나, 반려견 또는 반려묘일 수 있다.
본 발명의 상기 반려동물용 생균제 조성물은 반려동물의 장내 유산균 수 및 배변지수를 증가시키며, 장내 대장균 수 및 분변 내 황화수소 및 암모니아를 저감시키는 효과가 있어, 장염 또는 배변활동이 불편한 반려동물을 위한 건강보조사료로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 비피도박테리움 롱검(
Bifidobacterium longum
) 균주(기탁번호: KACC91563P)의 대량 생산을 위한 최적화 산업용 배지 및 조건 개발
1-1. 산소차단 유무에 따른 액상산업배지에서의 비피더스 생장 확인
비피도박테리움 롱검 균주를 유산균 전용배지인 MRS(대조구)와 선바이오에서 조합한 LAB Industrial broth, CSL Industrial broth 또는 SMP Industrial broth에 각각 0.5%씩 접종한 후 32℃에서 배양하였다. 각각의 배지는 121℃에서 15분간 멸균처리한 후 사용하였다. 또한, 산소차단을 목적으로 파라핀 오일을 첨가한 그룹과 무첨가그룹으로 각각 나누어 비피도박테리움 롱검 균주의 생장을 분석하였다.
| 배지 종류 | 조성 |
| MRS broth | MRS 55g, L-cysteine 0.5g, Paraffinic oil 40㎖/1L of DW. |
| LAB Industrial broth | Yeast extract 22g, Glucose 18g, Salts 5g, L-cysteine 0.5g, Paraffinic oil 40㎖/1L of DW. |
| CSL Industrial broth | CSL 30ml, Yeast extract 2g, Glucose 2g, Skim milk powder 1g, NaOH 1g, Salts 5g, L-cysteine 0.5g, Paraffinic oil 40㎖/1L of DW. |
| SMP Industrial broth | Yeast extract 20g, Glucose 20g, Skim milk powder 200g, L-cysteine 0.5g, Salts 5g, Paraffinic oil 40㎖/1L of DW. |
그 결과, 대부분의 배지에서 2일 배양 시 최대수치인 2.0x109 cfu/㎖까지 생장하였으며 이후 감소하는 추세를 보여 1-2일 배양이 최적배양시간임을 알 수 있었다(표 2). 또한, 파라핀오일 첨가구와 무첨가구에서의 비피도박테리움 롱검의 생장에 큰 차이를 보이지 않아 비피도박테리움 롱검 KACC91563P 균주가 내산소성이 있음을 확인할 수 있었다.
| 구 분 | 0 hr | 24 hrs | 48 hrs | 72 hrs | 120 hrs | 168 hrs | |
| 파라핀 오일 첨가 |
MRS | 6.5x106 | 2.0x109 | 2.5x109 | 3.0x107 | 1.5x106 | 5.0x105 |
| LAB산업배지 | 7.9x106 | 8.6x108 | 8.3x108 | 9.6x108 | 4.9x108 | 8.4x107 | |
| CSL산업배지 | 6.2x106 | 5.2x108 | 1.8x108 | 2.8x107 | 7.6x106 | 1.2x107 | |
| SMP산업배지 | 6.7x106 | 2.2x109 | 4.3x108 | 1.0x108 | 7.6x106 | 3.4x106 | |
| 파라핀 오일 무첨가 |
MRS | 6.9x106 | 2.2x109 | 1.7x109 | 8.0x107 | 1.7x106 | 9.0x105 |
| LAB산업배지 | 7.4x106 | 7.7x108 | 6.9x108 | 8.5x108 | 1.7x108 | 9.2x107 | |
| CSL산업배지 | 6.8x106 | 1.0x109 | 9.6x108 | 6.6x107 | 2.7x107 | 1.3x107 | |
| SMP산업배지 | 5.8x106 | 2.4x109 | 1.3x109 | 1.1x108 | 1.6x107 | 1.0x107 | |
1-2. pH 조절과 온도에 따른 비피더스 생장 확인
CSL 산업배지와 LAB 산업배지에서 pH 및 온도에 따른 비피도박테리움 롱검의 생장 상태를 알아보기 위하여 32℃와 37℃, 염화나트륨(NaOH) 보정과 무보정 그룹 등 4개 처리구로 나누어 실험하였다. 스타터 균주는 각 배양액 1L 기준 5㎖씩 접종하였다. pH 조절은 배양 16시간 경과 후에 pH가 5이하로 떨어진 처리구에 1M NaOH를 추가하여 pH를 6.0 이상으로 조절하여 배양하였다.
그 결과, 하기 표 3 및 표 4에서와 같이 32℃와 37℃ 배양에 따른 차이는 볼 수 없었으나, 단지 배양 2일째 pH 무보정 CSL 산업배지가 1.3x109 cfu/㎖로 균수가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다. 또한, 전체적으로 CSL 산업배지가 LAB 산업배지보다 균수가 높은 것을 알 수 있었다. 또한, NaOH 보정과 무보정에 따른 차이는 온도와 마찬가지로 볼 수 없었으며, 단지 배양 2일째부터 pH 조절 즉, NaOH 보정 시 균수 감소가 확인되었다.
| 구분 | CSL | 0 hr | 16 hrs | 24 hrs | 40 hrs | 48 hrs |
| 32℃ | NaOH(O) | 2.2x107 | 1.4x109 | 9.2x108 | 1.0x109 | 6.9x108 |
| NaOH(X) | 2.2x107 | 1.3x108 | 1.3x109 | 2.0x109 | 1.3x109 | |
| 37℃ | NaOH(O) | 2.2x107 | 1.3x109 | 9.7x108 | 9.4x108 | 4.1x108 |
| NaOH(X) | 2.2x107 | 1.5x108 | 1.1x109 | 1.5x109 | 1.2x109 |
| 구분 | LAB | 0 hr | 16 hrs | 24 hrs | 40 hrs | 48 hrs |
| 32℃ | NaOH(O) | 2.2x107 | 4.8x109 | 9.7x108 | 4.5x108 | 6.2x108 |
| NaOH(X) | 2.2x107 | 6.7x108 | 7.1x108 | 6.8x108 | 6.8x108 | |
| 37℃ | NaOH(O) | 2.2x107 | 5.4x108 | 7.9x108 | 1.3x109 | 9.3x108 |
| NaOH(X) | 2.2x107 | 6.7x108 | 5.4x108 | 4.9x108 | 3.8x108 |
실시예 2. 비피도박테리움 롱검(
Bifidobacterium longum
) 균주(기탁번호: KACC91563P)의 분말 생균제품 대량생산을 위한 최적 냉동건조 조건 개발
SMP 산업배지와 CSL 산업배지는 표 1에 개시된 조성으로 1톤을 제조하여 90℃에서 1시간 열처리 후 32℃로 냉각시켰다. 그 후 비피도박테리움 롱검의 종균 배양액을 8L (0.8%) 접종하고, CO2 가스를 30분간 투입하였다. 배양 24시간 후, 균주 배양액을 원심분리하였고, 냉동건조기(EYELA Co., Japan ; condencer capacity: 300kg)를 사용하여 (0.05 torr, -40℃ 이하)에서 48시간 냉동건조하였으며, 탈지분유, MSG (monosodium glutamate) 및 만니톨이 동일 중량으로 혼합된 냉동보호제 5.6 kg을 첨가한 후 동결건조하였다.
| 배양액 균수 | precipitant 균수 | supernatant 균수 | FD 분말 균수 | |
| CSL배지 | 1,000kg x 3.9x109cfu/㎖ = 3.9x1015cfu/㎖ |
72kg x 2.7x1010cfu/g = 2.0x1015cfu/g |
928kg x 2.8x107cfu/㎖ = 2.6x1014cfu/㎖ |
8kg x 1.1x1010cfu/g = 8.8x1013cfu/g |
| CSL공정수율 | 100% | 51.3% | 6.7% | 2.3% |
| SMP배지 | 1,000kg x 2.8x10cfu/㎖9 = 2.8x1015cfu/㎖ |
180kg x 3.1x1010cfu/g = 5.6x1014cfu/g |
820kg x 3.0x108cfu/㎖ = 2.46x1014cfu/㎖ |
37.4kg x 2.9x108cfu/g = 1.1x1013cfu/g |
| SMP공정수율 | 100% | 20.0% | 8.8% | 0.4% |
CSL 배지 1 ton을 이용한 비피도박테리움 롱검의 배양액의 총균수는 3.9x1015 cfu/㎖이었으며, 최종 동결건조(FD) 분말 8kg에 함유된 균수는 8.8x1013 cfu/g으로, FD 수율은 8.8/390 = 2.2564%로 확인되었다. SMP 배지 1 ton을 이용한 비피도박테리움 롱검의 배양액의 총균수는 2.8x1015 cfu/㎖이며, 최종 FD 분말 37.4kg에 함유된 균수는 1.1x1013 cfu/g으로, FD 수율이 1.1/280 = 0.39%로 나타났다. CSL 배지와 SMP 배지의 FD 분말 수율을 비교하면 88:11로, CSL 배지가 SMP 배지보다 8배 정도 높아 CSL 배지가 비피도박테리움 롱검의 FD 공정에 적합한 배지임을 확인하였다.
SMP 산업배지를 사용하여 배양에서부터 동결건조과정을 거친 FD 분말을 4℃(냉장)와 28℃(실온)에서 각각 보관하면서 저장성을 조사하였다. 그 결과, 4℃ 냉장보관의 경우 초기 3.5x108 cfu/g에서 시작하여 약 4달(113일) 경과 후에 2.0x107 cfu/g으로 94.3%의 균 사멸을 보였다. 또한, 28℃ 실온보관의 경우도 초기 3.5x108 cfu/g에서 약 1달만에 3.2x105 cfu/g, 4달 후에는 1.0x104 cfu/g으로 대부분 사멸하여, SMP 산업배지가 온도에 상당히 약한 모습을 보였다.
| 구분 | 0day | 1day | 3days | 10days | 20days | 30days | 70days | 113days |
|
SMP
(냉장보관) |
3.5x108 | 3.0x108 | 2.4x108 | 3.0x108 | 3.0x108 | 2.0x108 | 3.6x107 | 2.0x107 |
|
SMP
(실온보관) |
3.5x108 | 1.3x108 | 8.0x107 | 2.3x107 | 1.0x107 | 3.2x105 | 3.2x105 | 1.0x104 |
반면, CSL 산업배지를 사용하여 배양에서부터 동결건조과정을 거친 FD 분말은 4℃ 냉장보관의 경우 초기 1.1x1010 cfu/g에서 한달 후에 7.7x109 cfu/g로 70%의 생존을 보였으며, 약 4달(104일) 경과 후에 7.3x109 cfu/g으로 66%의 생존율을 보여주었다. 또한, 28℃ 실온보관의 경우 초기 1.1x1010 cfu/g에서 약 1달만에 8.3x109 cfu/g으로 냉장보관보다 오히려 생균수가 높았으며, 4달 후(104일)에 7.0x109 cfu/g으로 63%의 생존율을 보여 냉장보관과 큰 차이를 볼 수 없었다. 상기 결과를 통해 CSL 산업배지로 제조한 비피더스 제품의 경우 실온 유통 가능성을 높일 수 있을 것으로 판단되었다.
| 구분 | 0day | 1day | 3days | 6days | 10days | 20days | 30days | 60days | 104days |
|
CSL
(냉장보관) |
1.1x1010 | 1.0x1010 | 7.9x109 | 7.8x109 | 8.4x109 | 8.0x109 | 7.7x109 | 7.3x109 | 7.3x109 |
|
CSL
(실온보관) |
1.1x1010 | 1.0x1010 | 8.2x109 | 7.6x109 | 8.2x109 | 8.0x109 | 8.3x109 | 7.7x109 | 7.0x109 |
실시예 3. 반려견을 대상으로 한 사양실험
본 발명자는 CSL 산업배지를 이용하여 내산소성을 가지는 비피도박테리움 롱검 균주(기탁번호: KACC91563P)를 배양하고 이를 동결건조하여 반려동물을 위한 비피더스 생균제를 제조하였다. 상기 반려동물을 위한 생균제는 비피도박테리움 롱검 KACC91563P 균주(1.0x108 cfu/g 이상) 외, 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, 1.0x107 cfu/g 이상), 락토바실러스 플랜타룸(L. plantarum, 1.0x107 cfu/g 이상), 페디오코커스 애시도락티시(Pediococcus acidilactici, 1.0x107 cfu/g 이상)를 포함하도록 제조하였다.
상기 제조된 생균제를 이용하여 반려견 11마리를 이용하여 반려견 사양시험을 실시하였다. 사양시험은 반려견 장내 미생물 개선효과 확인을 위하여 분변내 유산균, 대장균 수를 도말검사를 통하여 확인하였으며, 반려견 환경 개선효과 확인을 위하여 Bristol stool chart를 통한 설사지수 검사, 발색법을 통한 분변의 암모니아 측정, 키트를 통한 분변의 황화수소를 측정하였다. 본 사양시험에 참여하는 시험동물은 보호자를 통한 자원으로 모집되었으며, 총 11마리의 반려견이 모집되었고, 반려견의 종과 나이, 성별, 중성화 등의 기본 정보는 하기 표 8과 같다.
시료의 섭취는 본 발명의 생균제와 사료를 함께 섞어 급이하는 방식으로 진행되었으며, 하루 2회 섭취하도록 보호자에게 설명하였다. 반려견의 분변은 시험 시작 후 0, 42, 85일째에 사진촬영 후 분석에 사용되었다. 분변의 미생물 수는 멸균된 생리식염수 10 ㎖에 분변 1g을 섞은 후 충분히 현탁시키고, 이를 십진희석법으로 희석한 후, Macconkey agar, MRS agar 및 Bifidobacterium selective agar에 도말하여 37℃에서 혐기 혹은 일반 배양을 실시한 후 생성된 콜로니를 계측기를 이용하여 측정한 뒤 균수를 계산하였다. 분변 내 황화수소의 측정을 실험실에 도착한 분변이 담겨있는 튜브의 입구에서 약 lcm 높이의 위치에서 황화수소 측정 검치관을 장착한 Gastec GV-100S를 이용하여 측정하였다. 분변 내 암모니아의 측정은 발색법인 인도페놀법을 이용하여 측정하였다. 멸균된 생리식염수에 현탁된 분변의 상등액을 동 식염수를 이용하여 2배 희석한 뒤, 시료 2.5 ㎖를 페놀 용액 0.1 ㎖, Nitroprusside sodium 용액 0.1 ㎖, 산화용액 0.25 ㎖를 넣고 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 완료된 시료는 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 시료 섭취에 따른 반려견 분변의 설사지수의 확인은 Bristol stool chart를 바탕으로 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 생균제를 섭취한 반려견의 분변 내 대장균 수 변화는 하기 표 9와 같이 생균제의 섭취 기간이 길어질수록 감소하는 것을 알 수 있었으며, 유산균 및 비피더스 균은 표 10 및 표 11에 개시된 것과 같이 생균제의 섭취 기간이 길어질수록 증가되는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기와 같은 장내 미생물의 변화에 따라 반려견의 분변에서 황화수소 및 암모니아의 생성 또한 저감되는 것을 확인할 수 있었다(도 2). 상기의 결과를 통해 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주(기탁번호:KACC91563P)를 함유하는 본 발명의 생균제는 반려동물의 장내 환경 개선 및 분변지수 개선의 효과가 있어, 반려동물을 위한 건강보조사료로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
Claims (8)
- 기탁번호가 KACC91563P인 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 균주를 배양배지에 접종하여 배양하는 단계; 및
상기 배양된 균주 배양액의 냉동건조물에 냉동보호제를 첨가한 후 동결건조하는 단계;를 포함하는, 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말의 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 배양배지는 배지 조성물의 단위부피 L 당 옥수수침지액(corn steep liquor) 20~40 ㎖, 효모 추출물 1~3 g, 글루코스 1~3 g, 탈지유 분말 0.1~2 g, 수산화나트륨 0.1~2 g, 염화나트륨 3~7 g, L-시스테인(cysteine) 0.3~0.7 g 및 파라핀유(paraffinic oil) 30~50 ㎖을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 상기 냉동보호제는 배양배지의 0.1~1.0 중량%(w/v)로 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제3항에 있어서, 상기 냉동보호제는 탈지분유, MSG (monosodium glutamate) 및 만니톨이 동일 중량으로 혼합된 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말.
- 제5항에 있어서, 상기 동결건조분말 내 비피도박테리움 롱검은 26~30℃ 온도에서 102~106일 동안 5.0 x 109 내지 1.0 x 1010 cfu/g의 생균수를 유지하는 것을 특징으로 하는 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말.
- 제5항의 비피도박테리움 롱검의 실온 안정성이 증가된 동결건조분말을 유효성분으로 포함하는, 장내 환경 및 분변지수 개선을 위한 반려동물용 생균제 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 생균제 조성물은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 플랜타룸(L. plantarum) 및 페디오코커스 애시도락티시(Pediococcus acidilactici)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 생균제 조성물.
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