KR20120037789A - 신생아 분변에서 분리한 내산소성 비피도박테리움 롱검 비피더스 유산균 및 이를 이용한 프로바이오틱 조성물 - Google Patents

신생아 분변에서 분리한 내산소성 비피도박테리움 롱검 비피더스 유산균 및 이를 이용한 프로바이오틱 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혐기장치 없이 배양이 가능한 비피더스 유산균, 이를 이용한 프로바이오틱 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 신생아 분변에서 선발된 내산소성 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)은 혐기장치 없이 액체배지에서 배양이 가능하여 산업적 활용이 용이하며, 특히, 우유에 배양시 mL당 109 CFU 이상 생장이 가능하고, 커드를 형성할 수 있는 특징이 있다. 이러한 본 발명의 균주의 장점을 이용한 프로바이오틱 조성물의 제조가 가능하다.

Description

신생아 분변에서 분리한 내산소성 비피도박테리움 롱검 비피더스 유산균 및 이를 이용한 프로바이오틱 조성물{Oxygen tolerant Bifidobacterium longum from Korean neonate fecal samples and probiotic compositions produced by the same}
본 발명은 혐기장치 없이 배양이 가능한 비피더스 유산균, 이를 이용한 프로바이오틱 조성물에 관한 것이다.
비피더스 유산균은 모유 영양아의 분변에서 최초로 분리되었으며, 유아 뿐만 아니라 성인에 있어서도 이들 비피더스 유산균수 변화가 스트레스나, 알레르기, 암 등과 밀접하게 관련되어 있음이 밝혀짐에 따라 비피더스 유산균의 건강 기여 효과가 인정되고 있다. 이러한 비피더스 유산균의 건강 기여 효과를 이용하기 위해 발효유, 유아식, 건강식품, 정장제 등에 널리 활용되고 있다. 그런데, 비피더스 유산균은 편성 혐기성균으로 배양을 위해 혐기조건을 필요로 하기 때문에 산업적으로 이용하는데 제한이 존재한다.
특히, 발효유 내 비피더스 유산균수에 대해서는 언론매체 등에 의해 지속적으로 문제가 제기되고 있는 상황이다. 이는 비피더스 유산균이 원료유에서 잘 자라지 않기 때문에 발효유 제조 후 혐기적으로 배양한 비피더스균을 첨가하여 유통시키게 되는데, 이러한 유통과정에서는 비피더스의 생육조건인 혐기조건을 만족시킬 수가 없어 비피더스 유산균이 지속적으로 사멸하기 때문에 상기와 같은 문제점이 발생하고 있다.
비피더스균의 다양한 생리 활성을 식품산업에 이용하는 응용 사례가 증가하고 있지만 비피더스균이 편성 혐기성균이라는 점과 현재 국내에서 발효유 제품에 사용하고 있는 유산균은 외국인에서 유래된 균주이므로 한국인에 보다 우수한 생리활성을 나타내지 못한다는 점도 지적되어 왔다.
비피더스균의 유익한 건강 증진 작용으로는 감염에 대한 저항성, 항암?항종양 효과, 혈중 콜레스테롤 함량의 저하 및 정장 효과 등의 다양한 생리 활성이 보고되어 있다. 따라서, 한국인에 적합한 프로바이오틱스(Probiotics)로서 비피더스균과 같은 유산균의 우수 개량 균주를 개발하는 것이 중요한 과제로 부각되고 있다.
따라서, 혐기조건이 필요없으며 우유 내에서 생장이 가능한 비피더스 유산균을 개발하게 될 경우, 1조 3천억원 규모의 발효유 제품 시장, 5천억원 규모의 치즈 시장 및 500억원 규모의 사료첨가제 시장 등 관련 국내 생균제 분야에 있어 그 파급효과는 매우 클 것으로 예상된다.
이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 예의 노력한 결과 혐기조건이 필요없으며, 우유 내에서 생장이 우수한 비피더스 유산균을 개발하기에 이르렀다.
결국, 본 발명의 목적은 혐기장치 없이 액체배지에서 배양이 가능하여 산업적 활용이 용이하며, 우유에 배양시 mL당 109 CFU 이상 생장이 우수한 비피더스 유산균을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 내산소성을 갖는 수탁번호 KACC91563의 비피도박테리움 롱검 6-T-4-55(Bifidobacterium longum 6-T-4-55) 비피더스 유산균이 제공될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 비피더스 유산균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 비피더스 유산균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유제품이 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 사료용 또는 식품용 첨가제로 사용되는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 열건조 또는 동결-건조하여 생균제 형태로 제조된 것임을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 프로바이오틱 조성물은 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 유용한 기능을 갖는 외래 유전자로 형질전환된 것을 특징으로 하는 수탁번호 KACC91563의 비피도박테리움 롱검 6-T-4-55(Bifidobacterium longum 6-T-4-55) 비피더스 유산균이 제공될 수 있다.
본 발명의 신생아 분변에서 선발된 내산소성 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)은 혐기장치 없이 액체배지에서 배양이 가능하여 산업적 활용이 용이하며, 특히, 우유에 배양시 mL당 109 CFU 이상 생장이 가능하고, 커드를 형성할 수 있는 특징이 있다. 이러한 본 발명의 균주의 장점을 이용한 프로바이오틱 조성물의 제조가 가능하다.
도 1은 선발된 비피더스 유산균을 호기조건 하에서 MRS 액체배지(씨스테인 0.05%)에서 배양한 생장모습을 나타낸다. 좌측은 X-α-gal 첨가한 모습을 나타내며, 우측은 X-α-gal의 분해로 상층부에 푸른색이 형성된 모습을 나타낸다.
도 2는 내산소성 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)의 탈지유 배양시 커드형성 양상을 나타낸다.
도 3은 내산소성 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)을 탈지유 배지에 접종하여 형성된 커드의 X-α-gal 함유 MRS agar 배양시 혐기배양(좌) 모습과 호기배양(우) 모습을 나타낸다.
도 4는 내산소성 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)을 10%탈지유 배지에 접종하고 40℃로 배양시 균수의 변화를 나타낸다.
도 5는 내산소성 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)을 10%탈지유 배지에 접종하고 37℃에서 24시간 배양 후 4℃에서 2주간 저장시 균수 및 pH 변화를 나타낸다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
상기와 같은 균주를 개발하기 위해, 본 발명자들은 전국(경기, 강원, 충청, 경상, 전라)에서 모집된 출생 5일 이내의 신생아 25명(남 16, 여 9)의 분변 시료를 수집하여 호기성 조건으로 배양하여 생존하는 비피더스 유산균 균주를 선발하였다. 그 결과, 시판되는 요구르트에 함유된 것보다 높은 균수를 나타내고 단독으로도 커드를 형성할 수 있어 치즈 등 유가공 제품에 응용할 수 있는 우수한 특성을 나타내는 비피더스 유산균 균주를 개발하기에 이르렀다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 내산소성을 갖는 수탁번호 KACC91563의 비피도박테리움 롱검 6-T-4-55(Bifidobacterium longum 6-T-4-55) 비피더스 유산균이 제공될 수 있다. 이 때, 상기 내산소성이라함은 산소가 존재하는 조건에서도 혐기장치 없이 생장이 가능한 특성을 의미한다. 상기 수탁번호는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2010년 6월 9일 등록하여 발급받은 것이며, 본 발명의 비피더스 유산균의 명칭은 Bifidobacterium longum 6-T-4-55로 명명되어 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 비피더스 유산균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다. 이 때의 프로바이오틱(Probiotic) 조성물은 생체의 활성을 도와 건강을 증진시킬 수 있는 미생물 이용 제품을 통칭하며, 통상 증생제 또는 생균제 등으로 포함되는 제품군을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 비피더스 유산균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유제품이 제공될 수 있다. 상기 유제품은 우유를 발효시킨 요구르트, 치즈, 아이스크림, 소스 등 우유를 가공하여 제조될 수 있는 모든 유가공 제품을 포함한다. 이 때, 상기 비피더스 유산균의 첨가비율에 제한이 있는 것은 아니나, 유제품의 경우 적정한 발효시간 내에 적정한 pH를 나타내어 식감을 저해하지 않는 정도이면 충분하다. 보다 상세하게는 본 발명에 따른 비피더스 유산균 (Bifidobacterium longum 6-T-4-55)을 104 ~ 106 CFU/ml로 탈지유 배지 또는 우유에 접종하여 37~40℃에서 24시간 가량 배양한 경우, 커드를 형성하였으며 균수는 2.8×108~1.1×109 CFU/mL, pH는 4.74~4.79 가량 나타나는 것으로 관찰되었다. 이는 시판중인 요구르트에 비해서도 매우 우수한 균수와 적절한 산도(pH)에 해당하는 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 사료용 또는 식품용 첨가제로 사용되는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다. 사료로 사용시에는 대상 가축의 종류에는 제한이 없다. 본 발명에 따른 비피더스 유산균은 혐기장치 없이 생육이 가능하므로, 사료에 첨가하여도 생균의 활성을 잃지 않고 지속적으로 작용할 수 있는 장점이 있다. 이러한 점을 활용하면, 다양한 유전자로 형질을 전환하여 부가적인 특징을 갖도록 할 수도 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 유용한 기능을 갖는 외래 유전자로 형질전환된 수탁번호 KACC91563의 비피도박테리움 롱검 6-T-4-55(Bifidobacterium longum 6-T-4-55) 비피더스 유산균이 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 열건조 또는 동결-건조하여 생균제 형태로 제조된 것임을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물이 제공될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 프로바이오틱 조성물은 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물일 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1. 혐기장치 없이 배양이 가능한 내산소성 비피더스 유산균( Bifidobacterium longum 6-T-4-55)의 동정
전국(경기, 강원, 충청, 경상, 전라)에서 모집된 출생 5일 이내의 신생아 25명(남 16, 여 9)의 분변 시료를 수집하여 비피더스 유산균의 선발배지인 TOS(transgalactosylated oligosaccharide) 한천 배지에서 혐기적으로 배양하였다. 상기 배지에서 생장하는 1,152개 균주를 콜로니별로 분리하여. 이들 분리한 균주에서 186개 균주를 무작위로 추출하여 16S rRNA를 분석하였다.
상기 추출된 186개의 균주는 다시 MRS 액체배지(시스테인 0.05% 함유)에 배양하여 생존하는 균주를 선발하였다. 상기 선발된 균주의 배양액에는 X-α-gal을 첨가하여 상층부가 푸른색으로 변색됨을 확인하여 비피더스 유산균주의 특성을 확인하였다. 이는 도 1에 나타나 있다. 상기 선발된 균주의 16S rRNA의 염기서열은 서열목록 1과 같다. 이 염기서열을 GenBank 데이터베이스에서 검색해본 결과, 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum)으로 동정할 수 있었다. 이 균주는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다(수탁번호 KACC91563, 미생물 명칭: Bifidobacterium longum 6-T-4-55. 이 때, 상기 수탁번호는 KACC91563P로 수탁증에 기재되어 있으나, 특허청 문의결과로 전자출원시 수탁번호의 맨 마지막 알파벳 P를 제외하고 기재)
실시예 2. 커드 ( Curd ) 형성 확인
실시예 1에 따라 선발된 비피더스균 배양액 100μl를 멸균된 10% 탈지유 배지(skim milk broth)에 접종하여 철야배양하였다. 그 결과, 커드(Curd)가 형성됨을 확인할 수 있었다(도 2), 커드(Curd)는 우유에 산(酸) 또는 레닌이나 펩신 따위를 넣었을 때 생기는 응고물로서, 치즈를 만드는 데 사용된다. 이 때, 상기 형성된 커드 1ml을 수집하여 희석한 다음, 100μl를 취하여 MRS agar(씨스테인 0.05%, X-α-gal 50mg/L 함유)에 도말하고 혐기배양한 다음, 콜로니가 형성된 페트리디시를 호기상태로 더 배양하였다. 도 3에 나타나 있는 바와 같이 혐기조건으로 배양된 페트리 디쉬의 콜로니와 호기조건으로 추가 배양된 페트리디쉬(X-α-gal에 대한 변색활성을 나타냄)의 콜로니를 비료하였을 때, 두 페트리디쉬의 콜로니가 일치하며 다른 균주의 생장이 관찰되지 않는 것을 알 수 있다. 즉, 기타 잡균의 영향없이 상기 실시예 1에 따라 분리된 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)에 의해 커드가 형성되었음을 알 수 있다.
시험예 1
10% 탈지유 배지에 내산소성 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)을 6.0×104 CFU/mL접종하고 40℃에 24시간 배양시 2.8×108 CFU/mL으로 생장하였으나 48시간 배양시 3.2×107 CFU/mL로 감소하였다. 24시간 배양시 pH는 4.79이었으며 커드를 형성하였고 48시간 배양시에는 pH가 4.59에 도달하였다.
시험예 2
10% 탈지유 배지에 내산소성 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)을 2.1×106 CFU/mL접종하고 37℃에 24시간 배양시 1.1×09 CFU/mL으로 생장하였으며, 커드가 형성되었고 이 때 pH는 4.74를 나타내었다. 24시간 배양 후 4℃에서 24시간 냉장저장시 1.3×109 CFU/mL을 나타내었으나 냉장저장 1주 후 4.3×107 CFU/mL로, 2주 후 1.5×106 CFU/mL으로 감소하였다. pH는 4.74에서 2주 저장 후에도 4.89를 나타내었다. 도 5는 상기 조건에서 2주간 저장시 균수 및 pH 변화를 나타낸다.
시험예 3
10% 탈지유 배지에 상업용 요구르트 스타터(크리스챤 한센 YF-3331) 2.0×107 CFU/mL과 함께 내산소성 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)을 1.8×107 CFU/mL 접종하고 37℃에 24시간 배양하였다. 그 결과, 총유산균수는 1.2×109 CFU/mL, 비피더스 유산균수는 2.2×108 CFU/mL으로 생장하였으며, 4℃에서 2주간 냉장저장후에도 비피더스균수는 5.4×108 CFU/mL을 나타내었다. 하기 표 2는 상업용 요구르트 제조 및 저장시의 pH를 나타낸다.
구분 접종 1일배양
(37℃)		 1주저장
(4℃)		 2주저장
(4℃)
YF-3331 6.18 3.66 3.70 3.67
YF-3331 + B. longum 6-T-4-55 6.15 3.93 3.94 3.97
표 1에서 볼 수 있듯이, 본 발명의 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)을 상업용 요구르트 스타터와 혼용하여 첨가한 경우에도 pH의 변화에 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.
표 2는 상업용 요구르트 제조 및 저장시 총유산균수 및 비피더스균수를 나타낸다.
구분 균수 접종
CFU/mL		 1일배양
(37℃)		 1 주저장
(4℃)		 2주 저장
(4℃)
YF-3331 총 유산균 2.0×107 8.1×108 6.8×108 6.4×108
비피더스 - - - -
YF-3331 +
B. longum 6-T-4-55		 총 유산균 2.0×107 1.2×109 1.2×109 1.2×109
비피더스 1.8×107 2.2×108 1.8×108 5.4×108
비교예 . 유제품 내 비피더스 유산균 수의 비교
상기 발명의 비피더스 유산균의 효용성을 비교하기 위하여 시중에서 판매되고 있는 주요 유업체의 상업용 요구르트 10종을 수거하여 총유산균수 및 비피더스 유산균수를 측정하였다. 요구르트를 십진희석 후 100μl를 MRS agar(X-α-gal 함유)에 스프레딩하여 혐기배양한 다음 이를 총유산균수로 기재하고, 혐기를 제거하여 푸르게 변한 콜로니를 비피더스 유산균수로 표시하였다. 그 결과는 표 1에 나타나 있다.
A B C D E F G H I J
총유산균수 1.2×109 1.4×108 1.2×109 1.1×109 6.8×107 5.0×108 1.4×109 5.3×108 8.4×107 4.5×108
비피더스 유산균수 <104 <104 <104 1.0×104 6.0×104 2.5×106 <104 <104 <104 <104
* 단위 : CFU/mL
상기 표 3에 나타나 있는 같이 10종의 상업용 요구르트의 총유산균수는 6.8×107~1.4×109 CFU/mL로 나타났으나 비피더스 유산균수는 대부분 104 CFU/mL 이하이었으며 가장 높은 제품도 2.5×106 CFU/mL로 나타났다.
이상의 시험예와 비교예에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따라 신생아 분변에서 선발된 내산소성 비피더스 유산균(Bifidobacterium longum 6-T-4-55)은 우유에 배양시 mL당 109 CFU 이상 생장이 가능하여 시판되고 있는 상업용 요구르트의 유산균 수를 상회하는 정도의 생장율을 보이며, 커드를 다른 균의 영향없이 단독으로 형성할 수 있으며, 제조 및 보관시 형성되는 pH도 음용에 적합한 수준인 것으로 나타나 이를 이용한 발효유 등의 유가공 제품의 제조가 얼마든지 가능함을 알 수 있다. 또한, 혐기장치 없이 액체배지에서 배양이 가능하므로, 이러한 장점을 활용한 산업적 활용이 매우 폭넓게 이루어 질 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 5에서 ◆ 는 CFU를, ■는 pH를 나타낸다.
국립과학원 농업유전자원센터 KACC91563 20100609
SEQUENCE LISTING <110> RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION <120> Oxygen tolerant Bifidobacterium longum 6-T-4-55 from Korean neonate fecal samples and probiotic compositions produced by the same <130> NPF18242 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 1394 <212> DNA <213> Bifidobacterium longum <400> 1 ttagacggct catcccacaa ggggttaggc caccggcttc gggtgctgcc cactttcatg 60 acttgacggg cggtgtgtac aaggcccggg aacgcattca ccgcgacgtt gctgattcgc 120 gattactagc gactccgcct tcacgcagtc gagttgcaga ctgcgatccg aactgagacc 180 ggttttcagg gatccgctcc gcgtcgccgc gtcgcatccc gttgtaccgg ccattgtagc 240 atgcgtgaag ccctggacgt aaggggcatg atgatctgac gtcatccccc accttcctcc 300 gagttaaccc cggcggtccc ccgtgagttc ccggcataat ccgctggcaa cacggggcga 360 gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacgaccat 420 gcaccacctg tgaacccgcc ccgaagggaa gccgtatctc tacgaccgtc gggaacatgt 480 caagcccagg taaggttctt cgcgttgcat cgaattaatc cgcatgctcc gccgcttgtg 540 cgggcccccg tcaatttctt tgagttttag ccttgcggcc gtactcccca ggcgggatgc 600 ttaacgcgtt agctccgaca cggaacccgt ggaacgggcc ccacatccag catccaccgt 660 ttacggcgtg gactaccagg gtatctaatc ctgttcgctc cccacgcttt cgctcctcag 720 cgtcagtaac ggcccagaga cctgccttcg ccattggtgt tcttcccgat atctacacat 780 tccaccgtta caccgggaat tccagtctcc cctaccgcac tcaagcccgc ccgtacccgg 840 cacggatcca ccgttaagcg atggactttc acaccggacg cgacgaaccg cctacgagcc 900 ctttacgccc aataattccg gataacgctt gcaccctacg tattaccgcg gctgctggca 960 cgtagttagc cggtgcttat tcaacgggta aactcactct cgcttgctcc ccgataaaag 1020 aggtttacaa cccgaaggcc tccatccctc acgcggcgtc gctgcatcag gcttgcgccc 1080 attgtgcaat attccccact gctgcctccc gtaggagtct gggccgtatc tcagtcccaa 1140 tgtggccggt cgccctctca ggccggctac ccgtcgaagc cacggtgggc cgttaccccg 1200 ccgtcaagct gataggacgc gaccccatcc cataccgcga aagctttccc agaagaccat 1260 gcgatcaact ggagcatccg gcattaccac ccgtttccag gagctattcc ggtgtatggg 1320 gcaggtcggt cacgcattac tcacccgttc gccactctca ccaccaagca aagcctgatg 1380 gatcccgttc gact 1394

Claims (7)

  1. 내산소성을 갖는 수탁번호 KACC91563의 비피도박테리움 롱검 6-T-4-55(Bifidobacterium longum 6-T-4-55) 비피더스 유산균.
  2. 제1항의 비피더스 유산균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱 조성물.
  3. 제1항의 비피더스 유산균 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 유제품.
  4. 제2항에 있어서, 사료용 또는 식품용 첨가제로 사용되는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물.
  5. 제2항에 있어서, 열건조 또는 동결-건조하여 생균제 형태로 제조된 것임을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물.
  6. 제2항에 있어서, 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함하는 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 프로바이오틱 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 외래 유전자로 형질전환된 것을 특징으로 하는 수탁번호 KACC91563의 비피도박테리움 롱검 6-T-4-55(Bifidobacterium longum 6-T-4-55) 비피더스 유산균.

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