KR20190084309A - 조절가능한 전사 - Google Patents

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마티아스 파블로브스키
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Abstract

본 발명은 적어도 하나의 유도성 카세트를 세포에 도입시키고, 유도성 카세트 내로부터 조절가능한 전사를 허용하는 안정한 방법에 관한 것이다. 방법은 임의의 진핵생물성 유기체로부터의 임의의 세포 유형에 대해 사용될 수 있지만, 특히 유도성 카세트를 다분화능 줄기 세포, 예컨대 동물 또는 인간 다분화능 줄기 세포 (hPSC)에 도입시키는데 적용된다. 유도성 카세트는, 그가 함유하는 유전자 물질이 침묵되지 않거나 또는 삽입 부위로부터 부정적인 영향을 받지 않고, 유전자 물질의 전사가 조절되는 것을 보장하는 방식으로 조절가능하게 삽입된다.
[대표도]
도 4a

Description

조절가능한 전사
본 발명은 적어도 하나의 유도성 카세트를 세포에 도입시키고, 상기 유도성 카세트 내로부터 조절가능한 전사를 허용하는 안정한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 임의의 진핵생물성 유기체로부터의 임의의 세포 유형에 대해 사용될 수 있지만, 특히 유도성 카세트를 다분화능(pluripotent) 줄기 세포, 예컨대 동물 또는 인간 다분화능 줄기 세포 (hPSC)에 도입시키는데 적용된다. 유도성 카세트는, 그가 함유하는 유전자 물질이 침묵되지 않거나 또는 삽입 부위로부터 부정적인 영향을 받지 않고, 유전자 물질의 전사가 조절되는 것을 보장하는 방식으로 조절가능하게 삽입된다.
줄기 세포 연구는 인간 발달, 재생 의약, 질환 모델링, 약물 발견, 및 세포 이식에 대한 연구에 큰 기대를 걸고 있다. 더욱이, 줄기 세포-유래된 세포는 용이하게 접근할 수 없는 인간 세포 집단의 생리학적 및 병리학적 반응을 연구하는 것을 가능하게 한다. 이는 종종 유전자 연구 (및 비-단백질-코딩 RNA - ncRNA에 코딩된 조절 메카니즘의 다른 형태)를 수반한다. 불행하게도, 인간 세포에서 유전자 정보의 조절가능한 전사 또는 발현이 특히 어려운 것으로 입증되었다.
더욱이, 재생 의약, 질환 모델링, 약물 발견 및 세포 이식의 몇몇 핵심 측면의 경우, 용이하게 접근가능한 공급원으로부터 성숙 인간 세포 유형을 조작 및 제조하는 것이 필요하다. 인간 세포에서 트랜스진 발현의 조절은 생물학 연구의 기본이다. 그러나, 이는 인간 세포에서는 어려운 것으로 입증되었다. 더욱이, 약물 발견 및 재생 의약 목적에 적합한 양 및 품질로 여러 매우 바람직한 인간 세포 유형을 시험관 내에서 유도하는 것이 실제로 요구된다. 줄기 세포의 원하는 세포 유형으로의 직접적인 분화는 종종 도전적이기 때문에, 원하는 세포 유형으로 세포의 직접적인 재프로그래밍을 비롯한 다른 접근법이 나타났다. 특히, 다분화능 줄기 세포, 예컨대 hPSC를 성숙 세포 유형으로 직접적으로 전환시키는 방법으로서 포워드 프로그래밍(forward programming)은 인간 세포의 유도를 위한 강력한 전략으로 인식되었다. 이 재프로그래밍은 줄기 세포를 특정한 성숙 세포 유형으로 전환시키기 위해 핵심 계통 전사 인자 (또는 비-코딩 RNA, 예컨대 lncRNA 및 마이크로RNA)의 강제 발현을 포함한다. 또한, 이러한 맥락에서, 인간 세포에서 유전자 정보의 조절가능한 발현은 도전적이었다. 현재 이용가능한 포워드 프로그래밍 프로토콜은 주로 세포의 렌티바이러스 형질도입을 기반으로 하며, 이는 무작위로 삽입된 유도성 카세트의 다양한 발현 또는 완전한 침묵을 일으킨다. 이는 필요한 전사 인자를 발현하는 하위 집단을 단리하기 위해 추가의 정제 단계를 초래한다. 따라서, 이들 방법을 추가로 개선시키는 것이 명백히 요구된다.
트랜스진의 유도성 발현과는 별도로, 세포에서 유전자 또는 다른 코딩 서열의 녹다운 및 녹아웃을 조절하여, 기능 상실 연구를 수행할 수 있게 하는 것이 매우 바람직하다. 줄기 세포 및 성숙 세포 유형에서 기능 상실 연구는 인간 발달, 질환 및 생리학을 조절하는 메카니즘을 연구하기 위한 특별한 기회를 제공한다. 그러나, 현재 기술은 유전자 발현의 용이하고 효율적인 조작을 허용하지 않는다. 유전자 녹다운을 촉발시키기 위해 유도성 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)와 같은 물질을 줄기 세포에 도입하기 위한 현재 기술은 상기 논의된 포워드 재프로그래밍에서 확인되는 여러 단점, 예컨대 트랜스진 침묵 및 활성을 제한하는 위치적 효과로 인해 문제가 있다. 따라서, 줄기 세포에서 기능 상실 연구를 가능하게 하는, 줄기 세포에서의 유도성 유전자 녹아웃 및 녹다운이 필요하다.
상기 방법에 대한 임의의 개선은, 침묵 및 다른 부정적인 통합 부위-관련된 영향에 대해 내성을 갖는 유도성 카세트 내에 함유된 유전자 물질, 예컨대 트랜스진의 안정한 전사가 달성되는 것을 보장해야 한다. 침묵은 여러 후생적 메카니즘, 예컨대 DNA 메틸화 또는 히스톤 변형에 의해 야기될 수 있다. 렌티바이러스 형질도입을 기반으로 하는 선행 기술의 방법에 의해 수득된 세포는 완전히, 부분적으로 또는 침묵적으로 발현된 트랜스진을 갖는 이종성 집단이다. 명백히, 이는 여러 적용에 대해 바람직하지 않다. 바이러스 벡터는 그들의 유전자 물질을 게놈의 전사 활성 영역에 통합시켜, 삽입 돌연변이 유발에 의한 종양발생 사건에 대한 잠재성을 증가시키는 경향을 입증한다.
여러 적용에서, 유도성 카세트가 필요에 따라 작동할 수 있고, 특정한 수준, 예컨대 높은 수준으로 전사될 수 있도록, 세포에서 삽입된 유전자 물질의 전사를 조절하는 것이 바람직하다. 이는 유도성 카세트의 삽입이 게놈에서 무작위인 경우에는 달성될 수 없다.
따라서, 본 발명자들은 유도성 카세트의 전사를 조절하면서 세포의 게놈으로 유도성 카세트의 안정한 도입을 가능하게 하는 방법을 개발하였다. 이는 유도성 카세트를 도입하고 삽입된 유전자 물질을 전사하는 것이 바람직한 임의의 세포 유형에서, 특히 다분화능 줄기 세포에서 유익하다. 유도성 카세트는 전사가능한 임의의 유전자 물질, 예를 들어 트랜스진 또는 비-코딩 RNA (ncRNA)를 포함할 수 있다. 유도성 카세트 내에 포함된 물질은 트랜스진의 발현 또는 유전자 녹다운 또는 녹아웃을 비롯하여 줄기 세포가 필요로 하는 효과에 의해 결정될 것이다.
본 발명자들은 본원에 기재된 이중의 게놈 안전한 하버 표적화된 시스템을 이용함으로써 유도성 카세트를 삽입하고, 상기 유도성 카세트 내에서 유전자 물질의 전사를 조절할 수 있음을 발견하였다. 이러한 방법은 삽입된 유전자 물질의 후생적 침묵의 위험을 감소시키기 때문에 매우 바람직하고, 유도성 카세트를 전사하는 세포의 동종성 집단을 수득하는 것을 가능하게 한다.
따라서, 본 발명은
세포에서 유전자 서열의 전사를 조절하는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위(genetic safe harbour site)로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 카세트의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 상기 유전자 서열을 포함하고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고;
상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법에 관한 것이다.
게놈 안전한 하버 부위 (GSH)로 유도성 카세트의 특이적인 통합은 게놈으로의 무작위 삽입에 비해 바람직하다. GSH는 "숙주 세포 또는 유기체에 대해 불리한 효과없이 새로 통합된 DNA의 예측가능한 발현을 동반할 수 있는, 인간 게놈의 유전자내 또는 유전자외 영역으로서 이전에 정의되었다. 유용한 안전한 하버는 단백질 (추가의 번역을 통해) 또는 비-코딩 RNA를 원하는 수준으로 수득하기 위해 삽입된 유전자 서열의 충분한 전사를 허용해야 한다. GSH는 또한 세포가 악성 형질변환하지 않게 하고 세포 기능을 변경시키지 않아야 한다" (Sadelain et al., 2012, Nature Reviews Cancer, 12(1), 51-8. doi:10.1038/nrc3179).
제1 유전자 안전한 하버 부위는 적어도 하나의 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자를 도입시키기 위해 이용된다. 전사 조절자 단백질 (또는 전사 인자)은 유전자의 유전자 전사를 증가시킨다. 대부분의 전사 조절자는 유전자에 작동가능하게 연결된 인핸서 또는 프로모터-근위 요소에 결합하는 DNA-결합 단백질이다.
일부 측면에서, 전사 조절자 단백질은 구성적으로 발현되고, 세포에서 영구적으로 발현된다. 따라서, 전사 조절자 단백질은 구성적인 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 구성적인 프로모터는 대부분의 조직 및 세포에서 성장 및 발달의 모든 단계에서 한결같이 유전자 발현을 지시한다. 구성적인 프로모터는 본 발명의 방법에서 사용될 때 높은 수준의 유전자 발현을 부여한다.
유전자를 비롯한 추가의 유전자 물질은 전사 조절자 단백질과 함께 제1 GSH에 삽입될 수 있다. 이러한 유전자에는 하나 이상의 마커, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP)이 포함될 수 있고, 이는 예를 들어 전사 조절자 단백질이 성공적으로 삽입되었음을 보여주기 위해 사용될 수 있다. 다른 대안은 유전자 편집을 가능하게 하는 유전자, 예를 들어 Cas9 및 유도체 또는 CasL 및 유도체, 및 세포에서 특정한 유전자의 내인성 또는 외인성 발현을 검정하기 위해 사용될 수 있는 리포터 서열을 포함한다.
제2 GSH는 원하는 유전자 서열이 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 유도성 카세트를 도입시키기 위해 사용된다. 이러한 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 정확하게 유도될 경우에만 전사를 가능하게 한다. 전사 조절자 단백질은 세포에게 외인성으로 공급된 물질에 의해 조절될 수 있다. 따라서, 외인성 물질의 존재는 유도성 프로모터로부터의 발현을 허용하거나 차단할 수 있다. 이러한 조절가능한 발현의 예는 본원에서 추가로 기재되는 Tet-ON 시스템이다.
추가의 유도성 카세트(들)을 추가의 GSH에 삽입할 수 있고, 상기 GSH는 상기 언급된 제1 및 제2 GSH와 상이하다.
하나 이상의 유전자 서열은 제2 및/또는 추가의 GSH 내에서 조절가능하게 전사될 수 있다. 실제로, 유도성 카세트는 GSH에 삽입하기를 원하는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 유전자 서열을 함유할 수 있고, 그의 전사는 조절가능하게 유도된다.
GSH 또는 GSH들에 삽입하기를 원하는 유전자 서열 또는 서열들은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 유도성 카세트 내에 존재한다. 이들 유전자 서열은 프로모터의 활성이 유도되었을 때 RNA로 전사될 수 있는 임의의 적합한 서열일 수 있다. 적합한 유전자 서열에는 트랜스진 (단백질 코딩 유전자, 생성된 RNA가 메신저 RNA (mRNA)이고, 폴리펩티드로 번역된), 비-코딩 RNA (ncRNA - 예컨대 비제한적으로 shRNA, 안티센스 RNA (asRNA), 가이드 RNA (gRNA), 마이크로RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 트랜스-작용 RNA (tasiRNA), 안타고미르, 압타머, miRNA 스폰지, 및 임의의 다른 기능적 RNA)가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
유도성 카세트는 제2 또는 추가의 GSH에 삽입되는 추가의 유전자 물질을 포함할 수 있다. 이러한 추가의 유전자 물질은 전사가 발생하는지를 나타내기 위해 하나의 또는 마커, 예컨대 녹색 형광 단백질 (GFP)을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항생제 또는 약물 내성 유전자와 같은 유전자는 성공적으로 삽입된 유도성 카세트의 선별을 가능하게 할 수 있다. 더욱이, 특정한 유전자의 기능을 연구하기 위해 상기 유전자의 또는 그의 기능을 간섭하는 서열의 유도성 발현이 바람직할 수 있다. 마찬가지로, 세포의 생물학적 기능을 강화 또는 차단시키거나 또는 유기체의 다른 부분에 있는 세포에 영향을 미치는 유전자의 발현, 예컨대 성장 인자, 펩티드 호르몬, 예컨대 인슐린 등의 발현이 바람직할 수 있다.
기술적으로, 제1 및/또는 제2 GSH로의 삽입은 하나의 염색체에서 또는 둘 다의 염색체 상에서 일어날 수 있다. GSH는 2배체 유기체의 두 염색체 모두에 있는 동일한 유전자좌에 존재한다. 두 염색체 모두 내에서의 삽입은, 유도성 카세트 내에 삽입된 유전자 물질로부터의 전사 수준을 증가시켜, 특히 높은 전사 수준을 달성하게 할 수 있기 때문에 유리하다.
GSH로의 삽입은 조절될 수 있다. GSH에서 DNA 이중 가닥 파손 (DSB)의 맞춤형 부위-특이적인 생성을 기반으로 하여 특정한 GSH로 유전자 물질의 특이적인 삽입이 달성될 수 있다. 이어서, 유전자 물질은 임의의 적합한 메카니즘, 예컨대 상동성 재조합을 이용하여 도입될 수 있다. 게놈에서 특이적인 DSB를 제조하는 임의의 방법이 이용될 수 있지만, 바람직한 시스템에는 CRISPR/Cas9 및 그의 변형된 버전, ZFN 및 TALEN 시스템이 포함된다.
추가로, 전사 조절자 및/또는 유도성 카세트의 삽입은 가역적으로 설계될 수 있고, 삽입된 유전자 물질은 적절한 경우 대안적인 전사 조절자/유도성 카세트에 의해 제거 및/또는 교체될 수 있다. 전사 조절자 및/또는 유도성 카세트를 교체하는 방법은 본 발명의 일부를 형성한다. 이러한 교체는 세포 배양물이 하나의 전사 조절자 및/또는 하나의 유도성 카세트에 의해 성공적으로 변형된 경우에 유용할 수 있고, 전사 조절자 및/또는 유도성 카세트를 대체하는 것이 바람직하다. 이미 성공적인 삽입의 이점을 이용하고, 더 많은 삽입을 가능하게 할 수 있다. 본 발명의 이러한 측면을 수행하기 위해, 삽입물은 GSH로부터 삽입물의 전부 또는 일부, 예컨대 삽입물의 일부를 제거할 수 있게 하는 절단가능한 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 제거 또는 교체 방법에는 재조합 접근법이 포함된다.
추가로, 본 발명은 전사 조절자 및/또는 유도성 카세트를 GSH에 삽입하기에 적합한 벡터에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 발명은
세포에서 트랜스진의 발현을 조절하는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스진의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유도성 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고;
상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법을 제공한다.
본 발명의 이러한 측면에서, 상기 기재된 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 트랜스진을 포함한다. 본 발명의 이러한 측면에서, 유도성 카세트 내에 포함된 원하는 유전자 서열은 트랜스진, 바람직하게는 단백질-코딩 유전자이다. 따라서, 트랜스진의 전사 및 번역 (발현)은 세포 내에서 조절될 수 있다. 본 발명의 방법의 이점은 필요에 따라 트랜스진의 과발현을 허용한다는 것이다.
추가로, 본 발명의 이러한 측면에서, 추가의 동일한 또는 상이한 트랜스진을 제1 및 제2 GSH와 상이한 추가의 GSH에 삽입할 수 있다. 이러한 트랜스진은 상기 기재된 바와 같이 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
한 측면에서, 본 발명은
세포에서 비-코딩 RNA의 전사를 조절하는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 카세트의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 비-코딩 RNA 서열을 코딩하는 DNA를 포함하고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고;
상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명의 이러한 측면에서, 추가의 동일한 또는 상이한 유도성 카세트를 제1 및 제2 GSH와 상이한 추가의 GSH에 삽입할 수 있다. 이러한 유도성 카세트는 비-코딩 RNA 서열을 코딩하는 DNA, 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 임의의 다른 유전자 서열을 포함할 수 있고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절된다.
더욱 특별하게는, 이 방법은 세포에서 내인성 유전자의 녹다운을 가능하게 한다. 따라서, 본 발명은
세포에서 내인성 유전자의 전사 및/또는 번역을 감소시키는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 카세트의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 비-코딩 RNA 서열을 코딩하는 DNA를 포함하고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고, 상기 비-코딩 RNA 서열은 내인성 유전자의 전사 또는 번역을 저해하고;
상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명의 이러한 측면에서, 추가의 동일한 또는 상이한 유도성 카세트를 제1 및 제2 GSH와 상이한 추가의 GSH에 삽입할 수 있다. 이러한 유도성 카세트는 비-코딩 RNA 서열을 코딩하는 DNA, 또는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 임의의 다른 유전자 서열을 포함할 수 있고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절된다.
임의의 측면 또는 실시양태에서, 내인성 유전자는 단백질 또는 비-코딩 RNA를 코딩할 수 있다.
본 발명의 상기 두가지 측면에서, 유도성 카세트(들)은 비-코딩 RNA, 즉, 기능성이지만 단백질로 번역되지 않는 RNA를 코딩하는 DNA를 포함한다. 이 비-코딩 RNA는 임의의 적합한 RNA, 예컨대 상기에서 논의된 것들일 수 있지만, 바람직하게는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)이다. 본 발명의 후자의 측면에서, 비-코딩 RNA는 임의의 적합한 방식으로, 일반적으로 유전자 전사 또는 번역을 차단함으로써 또는 발현을 방지함으로써 유전자를 녹다운시킬 수 있다. 궁극적으로, 상기 유전자의 발현이 감소되거나 차단되지만, 유전자 자체는 손상되지 않고 유지된다.
대안적으로, 유도성 카세트의 서열 내에 포함된 비-코딩 RNA는 세포에서 내인성 유전자를 녹아웃시켜 특히 상기 유전자 자체를 교체하거나 방해하기 위해 사용될 수 있는 RNA를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 측면을 위해 사용될 수 있는 적합한 비-코딩 RNA는 CRISPR/Cas9 플랫폼의 요소, 더욱 특별하게는 내인성 유전자를 표적으로 하도록 지시된 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다.
따라서, 한 측면에서, 본 발명은
세포에서 내인성 유전자를 녹아웃시키는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자 및 Cas9를 코딩하는 유전자 또는 그의 유도체의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 카세트의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 가이드 RNA를 포함하고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고, 상기 gRNA 서열은 내인성 유전자를 표적으로 하고;
상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명의 이러한 측면에서, 추가의 동일한 또는 상이한 유도성 카세트를 제1 및 제2 GSH와 상이한 추가의 GSH에 삽입할 수 있다. 이러한 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 임의의 유전자 서열을 포함할 수 있고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절된다.
따라서, 본 발명의 상기 측면에서, gRNA의 전사는 조절가능하게 유도된다.
추가의 측면에서, 본 발명은
세포에서 내인성 유전자의 전사 및/또는 번역을 감소시키는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 유전자 안전한 하버 부위의 제1 대립 유전자로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 카세트의 동일한 유전자 안전한 하버 부위의 제2 대립 유전자로의 표적화된 삽입 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 비-코딩 RNA 서열을 코딩하는 DNA를 포함하고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고, 상기 비-코딩 RNA 서열은 내인성 유전자의 전사 또는 번역을 저해하는 것인 방법을 제공한다.
추가로, 본 발명은
세포에서 내인성 유전자를 녹아웃시키는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자 및 Cas9를 코딩하는 유전자 또는 그의 유도체의 유전자 안전한 하버 부위의 제1 대립 유전자로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 카세트의 동일한 유전자 안전한 하버 부위의 제2 대립 유전자로의 표적화된 삽입 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 가이드 RNA를 포함하고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고, 상기 gRNA 서열은 내인성 유전자를 표적으로 하는 것인 방법을 제공한다.
이러한 단일-단계 녹아웃 또는 녹다운은 새로운 것이며, 본 발명의 일부를 형성할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은
다분화능 줄기 세포를 포워드 프로그래밍시키는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 카세트의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 핵심 계통 전사 인자를 코딩하는 유전자 서열을 포함하고, 상기 유도성 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고;
상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법을 제공한다.
추가의 또는 부가의 유도성 카세트(들)을 제1 및 제2 GSH와 구별되는 추가의 GSH에 삽입할 수 있다.
다분화능 줄기 세포에서 특정한 성숙 세포 유형으로의 포워드 프로그래밍은 매우 바람직하며, 본 발명의 이중-표적화 플랫폼을 이용하여 달성될 수 있다. 특정한 세포 유형에 대한 특별한 방법이 하기 기재된다.
한 측면에서, 본 발명은
다분화능 줄기 세포로부터 근세포를 제조하는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYOD1 유전자의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계이며, 여기서 상기 유도성 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고; 상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 단계; 및
레티노산의 존재하에 상기 세포를 배양하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
MYOD1 유전자는 근원성 분화 1 단백질을 코딩하는 유전자이다. 바람직하게는, 레티노산 (RA)은 전체-트랜스 RA이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 MYOD1을 발현하는 다분화능 줄기 세포로부터 근세포를 제조하는 방법이며, 레티노산의 존재하에 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, RA는 전체-트랜스 RA이다. 바람직하게는, 상기 세포는 MYOD1을 과발현한다.
추가의 측면에서, 본 발명은
다분화능 줄기 세포로부터 희소돌기아교세포를 제조하는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 SOX 10, OLIG2, NKX2.2 및 NKX6.2 유전자의 조합물의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유도성 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고; 상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법을 제공한다.
SOX-10, OLIG2, NKX2.2, NKX6.2 유전자는 각각 전사 인자 SOX-10, OLIG2, NKX2.2 및 NKX6.2를 코딩한다.
도 1 (a - d): 최적화된 이중 게놈의 안전한 하버 표적화된 과발현 시스템의 확인. 도 1(a) hROSA26 및 AAVS1 유전자좌에 대한 유전자 표적화 벡터의 설계. HAR: 상동성 아암, SA: 스플라이스 수용자, T2A: T2A 리보좀 스키핑 신호; Neo: 네오마이신 내성 유전자; Puro: 퓨로마이신 내성 유전자. pA: 폴리아데닐화 신호; CAG: 구성적으로 활성인 CAG 프로모터; rtTA: 제3 세대 rtTA; TRE: 유도성 Tet-반응성 요소; EGFP: 강화된 녹색 형광 단백질. 도 1(b)는 유세포 분석에 의해 검출되는 EGFP 발현 hESC에서 EGFP 유도 및 구조 동력학 (1(c))을 도시한다 (중간 형광 강도, MFI). 결과는 시점당 2개의 생물학적 복제물로부터의 것이고, 평균 ± SEM으로 표현된다. 모든 값은 독시시클린의 5 일 후 최대 형광 강도 (도면에서 0 일로 지칭됨)에 대해 정규화되었다. 도 1(d)는 5 일 동안 독시시클린으로 유도한 후 EGFP 발현 hESC에서 EGFP 과발현에 대한 독시시클린 용량-반응을 도시한다. 결과는 조건당 2개의 생물학적 복제물로부터의 것이고, 평균 ± SEM으로 표현된다. 모든 값은 실험에서 측정된 최대 형광 강도에 대해 정규화되었다. 독시시클린으로 유도한 후 GSH-표적화된 구성적인 CAG-EGFP hPSC에서 및 이중 GSH-표적화된 유도성 TRE-EGFP hPSC에서 EGFP 발현 수준. 야생형 hPSC 및 비-유도된 TRE-EGFP 세포는 음의 대조군으로 포함되었다.
도 2 (a - d): 독시시클린 (dox) 처리후 hPSC에서 뉴런 세포 (i-뉴런)로의 신속한 단일 단계 전환에 대한 실험 접근법 및 결과의 개관. 도 2(a)는 상기 전환의 개략도이며, 본 발명에 따라 NGN2에 의해 형질전환된 세포를 유도하여, Dox 처리후 뉴런 세포로 분화시킨다. 도 2(b)는 정량적인 RT-PCR-분석에 의해 증명되는, hESC로부터 i-뉴런 생성의 포워드 프로그래밍 시간 경과를 입증하며, 이는 전체-뉴런(pan-neuronal) (MAP2, SYP), 전뇌 (BRN2, FOXG1) 및 글루탐산성 뉴런 마커 유전자 (VGLUT2, GRIA4)의 일시적인 발현 패턴을 입증한다. 세포를 독시시클린 처리의 지정된 날에 분석하였다. 값은 내인성 하우스키핑 유전자 PBGD에 대해 도시되고, 다분화능 조건에 대해 정규화된다. 결과는 시점당 3개의 생물학적 복제물로부터의 것이고, 평균 ± SEM으로 표현된다. 도 2(c)는 유도 1 주일 후에 hESC로부터 유래된 i-뉴런에서 면역염색에 의해 βIII-튜불린 (TUBB3) 양성 뉴런 세포의 정량화를 도시한다. 미분화된 세포를 음성 대조군 (대조군)으로 사용하고, 개수는 새로 단리된 NGN2 발현 hESC에서 25회 계대후 (+P25) i-뉴런 생성에 대해 보고된다. 도 2(d)는 형태학적 변화를 설명하는 일련의 위상 대조 영상을 통해 hESC로부터 i-뉴런 생성의 포워드 프로그래밍 시간 경과를 도시하는 세포 사진이다.
도 3 (a-d): hPSC에서 골격근세포로의 포워드 프로그래밍. 도 3a는 MYOD1의 유도성 과발현 및 레티노산으로의 처리에 의해 hPSC에서 골격근세포로의 신속한 단일 단계 전환의 개략도를 도시한다. 도 3b는 hESC로부터 i-근세포 생성 동안에 근세포 마커 유전자의 일시적인 발현 패턴의 정량적인 RT-PCR-분석을 도시한다. 모든 값은 hPSC에 대해 도시된다. 결과는 시점당 3개의 생물학적 복제물로부터의 것이며, 평균 ± SEM으로 표현된다. 도 3 (c) 및 (d)는 유도 10 일 후에 유세포 분석에 의한 MHC 양성 세포의 정량화를 도시하며, 이는 OPTi-MYOD1 hPSC가 심지어 연장된 배양 기간 후에도 및 MYOD1 시스템의 표적화된 통합 이후 계대시킨 (p) 후에도 그들의 근원성 효능을 보유함을 입증한다. 미분화된 세포를 음성 대조군 (대조군)으로 사용하였고, 도면은 새로 단리된 OPTi-MYOD1 hESC에서 또는 50 계대 이후의 (+P50) 동일한 세포에서 i-근세포 생성에 대해 보고한다.
도 4 (a - f): 이중 GSH 표적화된 Tet-ON 과발현 시스템에 대한 표적화 전략. 도 4 (a)는 hPSC에서 hROSA26 및 AAVS1 유전자좌의 순차적인 표적화에 대한 실험 워크플로우를 도시한다. 기호 설명: Cas9n: 에스. 피오게네스(S. Pyogenes)로부터의 D10A 닉카제 돌연변이성 Cas9 엔도뉴클레아제; ZFN: 아연-핑거 뉴클레아제; Neo: 네오마이신; Puro: 퓨로마이신; rtTA: 제3 세대 역-테트라시클린 전사 촉진 인자(third generation reverse-tetracycline Trans-Activator). 이는 유도성 EGFP 발현계 (i-EGFP)를 도시한다. 도 4(b)는 hROSA26 표적화 전략의 개략도를 도시한다. 도 4(c)는 AAVS1 표적화 전략을 도시한다. 도 4(b) 및 (c)에 대한 기호 설명: R26-prom: ROSA26 유전자좌 프로모터 (THUMPD3-AS1 유전자); AAV-prom: AAVS1 유전자좌 프로모터 (PPP1R12C 유전자); ZFN: 아연-핑거 뉴클레아제; 5'-HAR/3'-HAR: 상류/하류 상동성 아암. SA: 스플라이스 수용자; T2A: T2A 펩티드; pA: 폴리아데닐화 신호; CAG: CMV 초기 인핸서, 닭 β-액틴 및 토끼 β-글로빈 혼성체 프로모터; TRE: Tet-반응성 요소; EGFP: 강화된 녹색 형광 단백질. 도 4 (d)는 표적화된 hROSA26 및 AAVS1 표적화된 hPSC 라인을 정확하게 인식하기 위해 이용되는 유전자형 분석 전략의 개략도를 도시한다; GSH-prom: GSH 프로모터 (각각 hROSA26 및 AAVS1); WT: 야생형; 유도성 카세트: 표적화 이후 통합된 전체 외인성 서열. 유전자좌 PCR: 상동성 아암에 상응하는 게놈 서열 외부의 게놈 DNA에만 결합하는 두 프라이머를 갖는 표적화된 유전자좌를 포괄하는 PCR. 그의 높은 GC-함량으로 인해 CAG 프로모터를 일반적인 PCR에 의해 증폭시킬 수 없었음을 주목한다. 따라서, CAG-함유 발현 카세트의 정확한 삽입은 PCR 앰플리콘을 상실시킨다. 야생형 밴드의 존재는 비-표적화된 대립 유전자의 존재를 나타내고; 야생형 밴드의 상실은 동형접합성 표적화를 나타낸다. 5'-INT/3'-INT: PCR: 각각 5'- 및 3'-삽입 부위를 포괄하는 PCR. 정확한 크기를 갖는 PCR 앰플리콘은 정확한 통합을 나타낸다. 3'BB PCR: 상동성 아암/표적화 벡터 백본 교차점을 포괄하는 PCR. PCR 생성물의 존재는 공여자 플라스미드의 비특이적인 오프-타겟(off-target) 통합을 나타낸다. 도 4(e)는 선별된 hROSA26-CAG-rtTA 표적화된 이형접합성 (HET) 및 동형접합성 (HOM) H9 hESC에 대한 유전자형 분석 결과를 도시하는 겔 사진이다. 도 4(f)는 선별된 AAVS1-TRE-EGFP 표적화된 이형접합성 (HET) 및 동형접합성 (HOM) H9 hESC에 대한 유전자형 분석 결과를 도시하는 겔 사진이다. 1kb+: 1kb + DNA 래더(ladder); WT: 야생형 hESC; PL: 표적화 플라스미드; H2O: 물 대조군.
도 5 (a-e): hPSC 이중 GSH 표적화를 기반으로 하는 최적화된 유도성 과발현 플랫폼 (OPTi-OX)의 개발. 도 5(a)는, 각각 hROSA26 및 AAVS1 유전자좌의 대립 유전자 중 하나 또는 둘 다가 성공적으로 표적화되었는지 여부에 따라, 이중 GSH-표적화된 유도성 EGFP H9 hESC를 4개의 실험 그룹으로 풀링하였음을 도시한다. 도 5(b)는 성공적으로 표적화된 이형- 및 동형접합성 H9 hROSA26-CAG-rtTA hESC에서 웨스턴 블롯에 의해 rtTA 단백질의 검출을 도시한다. 무작위 게놈 위치에서 제2 세대 rtTA를 보유하는 인간 ESC는 대조군 샘플로서 포함되었다. α-튜불린: 로딩 대조군. 도 5(c)는 도 5(a)에 기재된 다양한 이중 GSH-표적화된 유도성 EGFP hESC의 대표적인 예에 대한 유세포 분석을 도시한다. 도 5(d)는 도 5(a)에 기재된 다양한 이중 GSH-표적화된 유도성 EGFP hESC에서 EGFP 발현의 중간 형광 강도 (MFI)를 도시한다. 세포를 대조군 조건에서 (독시시클린 없음, CTR) 또는 독시시클린 처리 5 일 후에 (DOX) 유세포 분석에 의해 분석하였다. 각각의 데이터 점은 개별 클론 라인을 나타낸다. CAG-EGFP hESC 및 야생형 (WT) hESC는 비교를 위해 포함되었다. 독시시클린-처리된 그룹 (n=4-5, 표시됨)의 통계적 분석은, EGFP 발현 수준이 이중-동형접합성 클론에서 가장 높았음을 입증하였다 (사후 던넷(Dunnet) 검사에 의한 일원(One-way) ANOVA; F (2, 10) = 25.34, p=0.0001; **** p<0.0001; ** p=0.0026). 이 조건은 추가 실험을 위해 선택되었다. 도 5(e)는 도 5(a)에 기재된 다양한 이중 GSH-표적화된 i-EGFP hESC에서 EGFP+ 세포의 백분율을 도시한다.
도 6(a-d): hPSC에서 및 배엽 분화 동안에 OPTi-OX 플랫폼의 특징분석. 도 6(a)는 성공적으로 표적화된 살아있는 hPSC에서 5 일 동안 독시시클린으로 처리후 3개의 배엽으로 분화된 후에 EGFP 수준의 유세포 분석을 도시한다. 획득 설정은 높은 수준의 유도된 EGFP 발현 (DOX)을 포함하도록 설정되었다. 비-유도된 대조군 집단 (CTR)은 좌측 y-축 바로 옆에 위치한다. 도 6(b) 및 6(c)는 중간 형광 강도 (MFI) 및 EGFP+ 세포 백분율을 비롯하여 6(a)에서의 유세포 분석 플롯의 요약을 도시한다. 도 6(d)는 동형접합성 다분화능 줄기 세포의 EGFP mRNA 발현 수준의 정량적인 RT-PCR 결과의 막대 그래프 및 3개의 배엽으로의 후속 분화를 도시한다. WT: 야생형;
도 7: 인간 i-뉴런의 특징분석. 정량적인 RT-PCR 결과는 독시시클린으로 처리시 다분화능 인자 NANOG 및 OCT4의 신속한 하향조절을 입증한다.
도 8: 근세포 유도 동안의 RA 신호전달. 이 도면은, 근세포 유도 동안에 6가지 레티노이드 및 레티노이드 수용체의 qPCR 분석이 RARα, RARβ 및 3가지 모든 RXR 이소형의 발현을 입증하지만, i-근세포 유도 과정 내내 RARγ는 발현되지 않았음을 보여준다. A는 α이고, B는 β이고, G는 γ이다.
도 9(a) 내지 9(c): OPTi-MYOD1 hESC에서 인간 i-근세포로의 발달의 특징분석. 도 9(a)는 OPTi-MYOD1 hPSC에서 유도된 근세포로의 포워드 프로그래밍 시간 경과를 도시한다. 형태학적 변화는 니콘 바이오스테이션(Nikon Biostation) IM 저속 촬영 시스템에 의해 30 분마다 획득한 자동화 위상 대조 영상에 의해 입증되었다. 축적 막대: 200μm. 도 9(b)는 OPTi-NGN2 hESC를 독시시클린으로 처리시 다분화능 인자 NANOG 및 OCT4의 신속한 하향조절을 입증하는 qPCR 결과를 도시한다 (좌측 그래프). 5가지 모든 주요 인간 골격근세포 특이적 근세포 중쇄 이소형 (MYH 유전자 패밀리에 의해 코딩됨)은 근세포 포워드 프로그래밍 동안에 강력하게 상향조절된다 (우측 그래프). 이들은 배아 및 생후 근육 발달 (배아 이소형 MYH3; 신생아 이소형 MYH8) 동안에 발현되는 2가지 이소형 및 성인 인간 골격근에서 일반적으로 발현되는 3가지 이소형 [느린 경련 (유형 I) 섬유에서 MYH7; 빠른 경련 피로-내성 (유형 IIa) 섬유에서 MYH2, 및 빠른 피로가능성 (유형 IIx) 섬유에서 MYH1]을 포함한다. 대조적으로, 고양이의 빠른 경련, 빠른 피로가능성 근세포 섬유에서 구성적 MHC-이소형을 나타내는 MYH4는 인간에서 유의한 양으로 발현되지 않고 (<1%), 포워드 프로그래밍 시간 경과 내내 유도되지도 않는다. 도 9(c)는, 유도된 골격근세포가 넓은 범위의 전형적인 마커 단백질, 예컨대 F-액틴 (알렉사플루오르(AlexaFluor)488-접합된 팔로이딘 독소를 통해 가시화됨), 신경 세포 부착 분자 (NCAM), 데스민 (DES), 미오신 중쇄 (MYH), 티틴 (TTN), α-액티닌 (ACTN2) 및 트로포닌 T (TNNT)를 발현하지만, 근아세포 조상 마커 PAX3 및 PAX7은 발현하지 않음을 도시한다. 모든 샘플을 미오게닌 (MYOG)으로 대조 염색하였다. 축적 막대: 50μm. DAPI: 핵 염색.
도 10: 이들 3개의 그래프는 상이한 농도의 독시시클린에 의한 OPTi-MYOD1 hPSC의 유도 2 일 후에 총 MYOD1, 내인성 MYOD1 및 MYOG에 대한 qPCR 결과를 도시한다. 상이한 농도의 독시시클린에 의한 유도 48 시간 후의 qPCR 결과가 도시된다. 발현을 내인성 하우스키핑 유전자 PBGD에 대해 플롯한다.
도 11: Tet-ON 시스템의 도시. Tet-ON은 2개의 성분으로 구성되며: 상부에는 활성자 카세트가 도시되고, 여기서 구성적인 프로모터 (cP)가 rtTA (역-테트라시클린 전사 촉진 인자)의 발현을 유도한다. RtTA는 원핵생물 Tet 억제자 (TetR) 및 전사 전사 촉진 인자 도메인 VP16 (단순 헤르페스 바이러스로부터 유래됨)의 돌연변이 형태로 구성되는 융합 단백질이다. 하부에는 반응자 도메인이 도시된다. 이는 유도성 프로모터 (TRE, Tet 반응성 요소) 및 관심 유전자로 구성된다. TRE는 rtTA에 대해 반응성인 인공 프로모터이다. 이는 7개의 일련의 tet 오페론 (tetO7) 및 강력한 최소 CMV 프로모터 (mCMV) (그 자체는 활성이 아니며, rtTA가 7개의 tet 오페론에 결합할 때만 전사 기구를 동원함)로 구성된다. 테트라시클린 유도체인 독시시클린은 돌연변이성 TetR과 TRE의 결합을 위해 필요하며, 이는 유도성 카세트 (이 경우에는 EGFP)의 발현을 유도한다. (pA: 폴리아데닐화 신호).
도 12 (a-d) hPSC에서 희소돌기아교세포로의 포워드 프로그래밍. 도 12(a)는 OPTi-OLIG2-SOX10 hPSC에서 희소돌기아교세포 계통 세포 (i-OPC 및 i-OL)로의 신속한 전환에 대한 실험 접근법의 개략도를 도시한다. 도 12(b)는 4 일마다 3회의 일련의 계대 이후 BrdU-양성 세포의 정량화 및 각각 4 일 지속되는 수반된 BrdU-펄스를 도시한다 (P = 계대 횟수). 도 12(c)는 hPSC로부터 i-희소돌기아교세포를 생성하는 동안에 미엘린 관련 단백질을 코딩하는 유전자 (CNP, MAG, MBP, MOG 및 PLP)의 일시적인 발현 패턴의 정량적인 RT-PCR-분석을 도시한다. OPTi-OLIG2-SOX10 hPSC는 PDGFaa 및 FGF2로 보충된 희소돌기아교세포 배지에서 유도되었다. 유도 1 주일 후, 미토겐을 제거하여 분화를 종료시킬 수 있었다. 모든 값은 내인성 하우스키핑 유전자 PBGD에 대해 도시되고, 다분화능 조건에 대해 정규화된다. 결과는 시점당 2-3개의 생물학적 복제물로부터의 것이고, 평균 ± SEM으로 표현된다. 도 12(d)는 유도 20 일 후에 OPTi-OLIG2-SOX10 hPSC로부터 유래된 i-희소돌기아교세포에서 면역염색에 의한 CNP 및 PLP 양성 세포의 정량화를 도시한다. 미분화된 세포를 음성 대조군으로 사용하였고, 도면은 새로 단리된 OPTi-NGN2 hPSC에서 및 50 계대 이후에 (+P50) i-희소돌기아교세포에 대해 보고된다.
도 13은 본 발명의 원리의 개략도이다. 본질적으로, 이는 본 발명의 코어에서 2개의 상이한 유전자 안전한 하버 부위로의 삽입을 도시한다. 제1 삽입은 제2 삽입에서의 유도성 카세트 내에서 유전자 서열의 발현을 조절한다. 추가의 유전자 물질은 도시된 바와 같이 폴리시스트론성 벡터 구축물에 포함될 수 있다. 추가로, 2개 초과의 유전자 안전한 하버 부위가 표적화될 수 있으며, 이로써 다중 유도성 카세트 또는 다른 유전자 물질이 제1 GSH 부위에 있는 조정자의 조절하에 있을 수 있다.
도 14 (a 내지 f)는 hSPC의 이중 GSH 표적화를 기반으로 하는 유도성 녹다운 시스템의 개발을 보여주는 결과를 도시한다. 도 14a는 실험 접근법을 도시한다 - H1 - H1 프로모터, TO - tet 오페론, tetR - 테트라시클린 억제자. 도 14b는 유도성 EGFP shRNA를 이용하여 침묵시킬 수 있는 EFGP 리포터 트랜스진을 발현하는 hESC를 수득하기 위해 생성된 트랜스제닉 대립 유전자의 개략도이다. 도 14c는 유도성 EGFP shRNA 및 tetR의 지정된 조합물에 의해 표적화된 hESC에서 5 일 동안 테트라시클린의 부재 또는 존재하에 EGFP 발현을 도시한다 (STD = 야생형 표준, OPT = 코돈 최적화됨). EGFP shRNA를 보유하지 않는 이중-표적화된 hESC를 음성 대조군으로 사용하였다. n.s.=p>0.05 (유의하지 않음), **=p>0.01, ***=p>0.001 동일한 tetR 라인 tet 없음 및 shRNA 없음에 대해. 도 14d는 STD 또는 OPT tetR을 발현하는 ROSA26-표적화된 hESC에서 tetR에 대한 대표적인 웨스턴 블롯이다. HET = 이형접합성 표적화, HOM = 동형접합성 표적화. STD tetR 무작위 통합을 갖는 hESC는 양성 기준으로 도시된 반면에, WT h9 hESC는 음성 대조군이다. TUB4A4A는 로딩 대조군이다. 다양한 단백질 양을 로딩하여 정량적인 비교를 용이하게 하였다. 도 14 (E): 유세포 분석 (MFI) 및 qPCR (mRNA)에 의해 측정되는 EGFP OPTiKD hESC에서 EGFP 녹다운 및 구조 동력학. 결과는 시점당 2개의 독립적인 배양물로부터의 것이다. 도 14(F): EGFP OPTiKD hESC에서 EGFP 녹다운에 대한 테트라시클린 용량-반응 곡선. 최대-절반 억제 농도 (IC50)가 보고된다. 결과는 용량당 2개의 독립적인 배양물로부터의 것이고, 평균이 도시된다.
도 15 (a, b 및 c) 진짜 GSH로서 ROSA26 및 AAVS1 유전자좌의 확인. 도 15a는 분화 동안에 GSH 발현을 시험하기 위해 GSH EGFP 리포터 hPSC의 생성 배후의 실험 접근법을 도시한다. 뉴런, 희소돌기아교세포, 및 성상세포는 이들 세포 계통의 혼합물을 함유하는 벌크 배양물에서 수득된 반면에, 다른 모든 세포 유형은 개별적으로 생성되었다. 도 15b는 ROSA26 및 AAVS1 EGFP 리포터 트랜스제닉 대립 유전자의 개략도이다. R26-prom: ROSA26 유전자좌 프로모터; AAV-prom: AAVS1 유전자좌 프로모터; 5'- HAR/3'-HAR: 상류/하류 상동성 아암; SA: 스플라이스 수용자; T2A: 자가-절단 T2A 펩티드; Neo: 네오마이신 내성; Puro: 퓨로마이신 내성; pA: 폴리아데닐화 신호; CAG: CAG 프로모터; EGFP: 강화된 녹색 형광 단백질. 도 15 (C): 유도성 EGFP shRNA 및 tetR의 지정된 조합물에 의해 표적화된 hESC에서 5 일 동안 테트라시클린의 부재 또는 존재하에 EGFP 발현 (야생형 표준 tetR, STDtetR, 또는 코돈-최적화된 tetR, OPTtetR). EGFP shRNA를 보유하지 않는 이중-표적화된 hESC를 음성 대조군으로 사용하였다. 결과는 조건당 2-3 개별 라인으로부터의 것이다 (표 1). n.s.=p>0.05 (유의하지 않음), **=p<0.01,***=p<0.001 동일한 tetR 라인 tet 없음 및 shRNA 없음에 대해 (사후 폴름-사이닥(Holm-Sidak) 비교에 의한 ANOVA).
도 16 (a-d) ROSA26 및 AAVS1 EGFP 리포터 hESC의 생성. 도 16(A): 표적화된 라인을 정확하게 인식하기 위해 이용되는 ROSA26 표적화 접근법 및 유전자형 분석 전략의 개략도. Cas9n: 에스. 피오게네스로부터의 D10A 닉카제 돌연변이성 Cas9 엔도뉴클레아제. R26-prom: ROSA26 유전자좌 프로모터 (THUMPD3-AS1 유전자); 5'-HAR/3'-HAR: 상류/하류 상동성 아암; 트랜스진: 유전자 표적화 이후 통합된 영역; 유전자좌 PCR: 야생형 ROSA26 유전자좌의 PCR 생성물 (비-표적화된 대립 유전자를 나타냄); 유전자좌 PCR/대립 유전자 상실: 표적화된 대립 유전자의 PCR 생성물/트랜스진이 GC-풍부 CAG 프로모터를 함유하는 경우에는 실패하는 PCR (예상된 트랜스진 표적화를 나타냄); 5' INT/3' INT PCR: 트랜스진 5'-말단/3'-말단 통합 영역의 PCR 생성물 (예상된 트랜스진 표적화를 나타냄); 5' BB/3' BB PCR: 벡터 백본 5'-말단/3'-말단의 PCR 생성물 (비특이적인 오프-타겟 플라스미드 통합을 나타냄). 유사한 표적화 및 유전자형 분석 전략이 AAVS1 유전자좌 표적화에 적용되었음을 주목한다. 도 16(B): 구성적인 EGFP (강화된 녹색 형광 단백질) 발현을 위한 최상의 전략을 시험하기 위해 생성된 ROSA26 트랜스제닉 대립 유전자의 개략도. ENDO-EGFP: 내인성 ROSA26 프로모터에 의해 유도된 EGFP (R26-prom; 표적화 벡터 pR26-Puro_ENDO-EGFP); EF1α-EGFP: 신장 인자 1α 프로모터에 의해 유도된 EGFP (표적화 벡터 pR26-Neo_EF1α-EGFP); CAG-EGFP: CAG 프로모터에 의해 유도된 EGFP (표적화 벡터 pR26-Neo_CAG-EGFP); SA: 스플라이스 수용자; Puro: 퓨로마이신 내성 (퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제); Neo: 네오마이신 내성 (네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II); pA: 폴리아데닐화 신호. 도 16(C): 대표적인 ROSA26-EGFP 리포터 hESC 클론 라인, 또는 야생형 H9 hESC에서 EGFP 양성 세포 (EGFP+; 게이트가 도시됨)의 백분율 및 EGFP 중간 형광 강도 (MFI)의 유세포 분석 정량화. 도 16(D): ROSA26-EGFP 리포터 hESC에서 EGFP 양성 세포의 백분율. 결과는 조건당 이형접합성 ROSA26 표적화에 의한 3개의 클론으로부터의 것이다.
도 17. hPSC 분화 이후 최적화된 유도성 녹다운 플랫폼의 확인. 플롯은 EGFP OPTiKD (iKD) 및 sOPTiKD (siKD) hESC로부터 유래된 지정된 세포 유형에서 5 일 동안 테트라시클린의 부재 (CTR) 또는 존재 (TET)하에 qPCR에 의해 측정된 EGFP 발현을 도시한다. EGFP 수준은 각각의 개별 계통에 대한 동일한 라인에서 대조군 조건에 대해 보고된다. 약어는 도 15에 기재된 계통을 나타낸다 (pluri: 미분화된). 결과는 조건당 2개의 독립적인 배양물로부터의 것이다.
도 18 (a - d). hPSC에서 최적화된 유도성 CRISPR/Cas9 녹아웃 플랫폼의 개발. 도 18a는 유도성 녹아웃 (iKO) hPSC의 생성에 대한 실험 접근법을 도시한다. 도 18b는 유도성 gRNA 카세트를 갖는 AAVS1 표적화 벡터를 생성하기 위한 클로닝 절차의 개략도를 도시한다. 도 18c는 유도성 EGFP gRNA를 이용하여 CRISPR/Cas9에 의해 녹아웃될 수 있는 EGFPd2 리포터 트랜스진을 발현하는 hESC (EGFP sOPTiKO hESC)를 수득하기 위해 생성된 트랜스제닉 대립 유전자를 도시한다. Bsd: 블라스티시딘 내성; EGFPd2: 탈안정화된 EGFP. 도 18 (d): 도 19c (gRNA 2 - TO) 및 b (gRNA 3 - 2TO)로부터의 sOPTiKO 세포에서 EGFPd2 유도성 녹아웃 동력학의 유세포 분석 정량화. EGFP 양성 세포의 백분율을 테트라시클린의 첨가 이후 매일 모니터링하였다. 결과는 2개의 독립적인 배양물로부터의 것이다.
도 19 (a 내지 e): hESC에서 최적화된 유도성 CRISPR/Cas9 녹아웃 플랫폼의 개발. (A-D)는 gRNA (2 또는 3) 및 유도성 프로모터 (TO 또는 2TO, 도 19 e 참고)의 지정된 조합을 보유하는 EGFPd2 동형접합성 sOPTiKO hESC에서 EGFPd2 발현에 대한 대표적인 유세포 분석을 도시한다. 표적화 벡터: pAAV-Puro_siKOEGFP-2 (19a), pAAV-Puro_siKO-2TO-EGFP-2 (19b), pAAV-Puro_siKO-EGFP-3 (19c), pAAV-Puro_siKO-2TO-EGFP-3 (19d). 세포를 테트라시클린의 존재하에 (TET) 5 일 동안 배양하거나, 또는 테트라시클린의 부재하에 대조군 (CTR) 조건하에 유지하였다. 히스토그램은 직접적인 가시적인 비교를 용이하게 하기 위해 제시된 모든 샘플에 대해 곡선하 면적이 1 (100%)이도록 정규화하였음을 주목한다. 도 19(e): 1개 또는 2개의 tet 오페론 (각각 H1-TO 및 H1-2TO)을 함유하는 sOPTiKO 시스템에 대한 유도성 H1 Pol III 프로모터의 뉴클레오티드 서열. 핵심 서열 특징은 강조하였다. gRNA 클로닝을 위해 사용된 제한 효소 절단 부위가 도시된다 (도 18B). DSE: 원위 서열 요소; PSE: 근위 서열 요소; TETO2: tet 오페론; +1: RNA 전사의 출발 위치.
도 20 내지 33은 본원의 실시예에서 사용된 다양한 플라스미드의 맵을 도시한다. 이들은 다음과 같다:
20) pSpCas9n(BB)_R26-R
21) pSpCas9n(BB)_R26-L
22) pR26_CAG_EGFP
23) pR26_CAG_rtTA
24) pZFN-AAVS1-L-ELD (아연 핑거 뉴클레아제 좌측)
25) pZFN-AAVS1-R-KKR (아연 핑거 뉴클레아제 우측)
26) pAAV_CAG_EGFP (공여자)
27) pR26-Neo_CAG-OPTtetR (코돈-최적화된 tetR의 hROSA26 표적화)
28) pAAV-Puro_iKD (유도성 shRNA의 AAVS1 표적화)
29) pAAV-Neo_CAG-Cas9 (Cas9의 AAVS1 표적화)
30) pAAV-Puro_siKO (유도성 gRNA의 AAVS1 표적화)
31) pAAV-Puro_siKO-2TO (유도성 gRNA의 AAVS1 표적화, 프로모터에서 2개의 tet 오페론을 갖는 버전)
32) pAAV_TRE-EGFP (EGFP 유도성 과발현, 부착됨)
33) pAAV_TRE-MYOD1 (근육에 대한 MYOD1 유도성 과발현)
본 발명자들은 진핵생물성 세포, 구체적으로 다분화능 줄기 세포 및 그들의 자손에서 유도성 카세트 내에 포함된 유전자 서열의 유도성 전사에 유용한 방법을 개발하였다.
이는 특별하게는 특정한 성숙 세포 유형의 발달을 촉진시키는 다분화능 줄기 세포 내에서 유도성 카세트의 과발현을 통한 다분화능 줄기 세포의 포워드 프로그래밍에 적용가능하다. 추가로, 이는 또한 이들 세포에서 세포 기능 또는 거동을 기능상실시키거나 변경시키는 연구를 위해 세포 내에서 내인성 기능의 녹다운 또는 녹아웃에 적용가능한다. 녹다운 또는 녹아웃은 단백질-코딩 유전자에 적용하거나 또는 비-코딩 RNA를 코딩하는 DNA 서열에 적용할 수 있다. 이들 중 하나는 본 발명의 방법에 의해 녹아웃 또는 녹다운에 의해 표적화될 수 있다.
이 방법은 2개 이상의 GSH 걸쳐 유도된 전사 스플릿에 대한 시스템을 이용하는, 줄기 세포의 게놈에서 안전한 하버 부위의 적어도 이중 표적화를 기반으로 한다. 그러나, 이 방법은 줄기 세포로 제한되지 않고, 예를 들어 연구에서 또는 유전자 요법에서 임의의 세포 유형의 게놈을 변경시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 한 GSH는 게놈에서 상이한 GSH에 삽입된 유도성 카세트 내에 함유된 유전자 서열의 전사를 유도하기 위해 필요한 전사 조절자를 함유하도록 변형된다. 전사 조절자는 바람직하게는 구성적으로 발현된다. 외인성 물질/작용제를 공급하여, 전사 조절자 단백질의 활성을 조절하고, 따라서 유도성 카세트의 발현을 조절하는 것이 바람직하다. 본 발명의 방법에서 적어도 2개의 별도의 GSH를 사용하고, 각각의 GSH가 2배체 유기체의 두 염색체 모두에 존재하기 때문에, 총 4개의 가능한 삽입 유전자좌가 있다. 4개의 모든 유전자좌를 본 발명의 방법을 이용하여 변형시키는 경우에는, 이는 세포로부터 전사 가능한 양을 증가시킨다. 표적화된 삽입의 다양한 결과의 예가 도 5a에 도시된다. 추가로, 본 발명의 방법은 적어도 2개의 상이한 GSH 부위를 이용한다. 추가의 전사 조절자, 유도성 카세트 또는 임의의 다른 유전자 물질, 예컨대 비제한적으로 선별 마커, 항생제 또는 약물 내성 유전자, CRISPR/Cas9 시스템과 관련된 유전자, 또는 미지의 기능을 갖는 유전자를 도입시키기 위해 추가의 GSH 부위가 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
따라서, 본 발명은
세포에서 삽입된 유전자 서열의 발현을 조절하는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자 서열의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 카세트의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 상기 유전자 서열을 포함하고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고;
상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법에 관한 것이다.
추가로, 본 발명의 이러한 측면에서, 추가의 동일한 또는 상이한 유도성 카세트를 제1 및 제2 GSH와 상이한 추가의 GSH에 삽입할 수 있다. 이러한 유도성 카세트는 본원에 기재된 바와 같다.
유전자 안전한 하버 부위 내에서 특이적인 삽입이 무작위 게놈 통합에 비해 바람직하며, 이는 더욱 안전한 게놈 변형이 예상되고, 천연 유전자 발현을 침묵시키거나 또는 암세포 유형을 유도하는 돌연변이를 일으키는 것과 같은 원치않는 부작용이 유도될 가능성이 낮기 때문이다.
유전자 안전한 하버 (GSH) 부위는 게놈 내에 있는 유전자좌이며, 세포에 대해 또는 삽입된 유전자 물질에 대해 임의의 유해한 효과없이 유전자 또는 다른 유전자 물질이 삽입될 수 있다. 삽입된 유전자 서열의 발현이 이웃 유전자로부터의 임의의 리드-쓰루(read-through) 발현에 의해 교란되지 않고, 유도성 카세트의 발현이 내인성 전사 프로그램의 간섭을 최소화하는 것인 GSH 부위가 가장 유익하다. 특정한 유전자좌가 추후 GSH 부위에 있는지 여부를 결정하는데 도움이 되는 더욱 공식적인 기준이 제안되었다 (Papapetrou et al., 2011, Nature Biotechnology, 29(1), 73-8. doi:10.1038/nbt.1717.) 이들 기준은 (i) 임의의 유전자의 5' 말단으로부터 50 kb 이상이고, (ii) 암과 관련된 임의의 유전자로부터 300 kb 이상이고, (iii) 임의의 마이크로RNA (miRNA)로부터 300 kb 이상이고, (iv) 전사 단위 외부에 위치하고, (v) 초보존된 영역 (UCR) 외부에 위치하는 부위를 포함한다. 이미 확인된 GSH가 상기 기준 모두를 충족시키지는 않기 때문에, 이들 제안된 기준 모두를 충족시킬 필요는 없을 수 있다. 적합한 GSH는 이들 기준 중 적어도 2개, 3개, 4개 또는 모두를 충족시킬 것으로 생각된다.
천연 유전자 발현을 방해하지 않고 바이러스가 자연적으로 통합하는 부위를 찾기 위해 추가의 부위를 확인할 수 있다.
GSH 부위가 세포에 유해한 효과없이 유전자 물질의 삽입을 허용하고, 삽입된 유전자 물질의 전사를 허용한다는 것을 기반으로 하여, 임의의 적합한 GSH 부위가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 기술자는 이 간단한 기준 및/또는 상기 설명된 더욱 공식적인 기준을 이용하여 적합한 GSH를 확인할 수 있다.
인간 게놈의 경우, 몇몇 GSH 부위가 확인되었고, 이들에는 AAVS1 유전자좌, hROSA26 유전자좌 및 CLYBL 유전자가 포함된다. CCR5 유전자 및 HPRT 유전자 또한 가능한 GSH로서 제기되었으며, 추가의 연구는 인간 게놈에서 GSH로서 이들 중 하나 이상을 확인할 수 있다.
아데노-관련 바이러스 통합 부위 1 유전자좌 (AAVS1)는 인간 염색체 19 상에서 단백질 포스파타제 1, 조절 하위단위 12C (PPP1R12C) 유전자 내에 위치하며, 이는 인간 조직에서 균일하고 보편적으로 발현된다. 이 부위는 AAV 혈청형 2에 대한 특이적 통합 유전자좌로서 작용하고, 따라서 가능한 GSH로 확인되었다. AAVS1은 침묵에 대한 유도성 카세트의 내성을 가능하게 하는 개방 염색질 구조 및 본래의 염색체 격리자를 포함하기 때문에, 이는 전사에 대해 우호적인 환경인 것으로 확인되었다. PPP1R12C 유전자의 방해로 인해 일어나는 세포에 대한 공지된 부작용은 없다. 더욱이, 이 부위에 삽입된 유도성 카세트는 여러 다양한 세포 유형에서 전사 활성으로 유지된다. 따라서, AAVS1은 GSH인 것으로 고려되고, 인간 게놈에서 표적화된 트랜제네시스(trangenesis)를 위해 광범위하게 유용하였다.
hROSA26 부위는 마우스로부터 GSH와의 서열 유사성을 기준으로 하여 확인되었다 (ROSA26 - 역 배향 스플라이스 수용자 부위 #26). 오르톨로그(orthologue) 부위가 인간에서 확인되었음에도 불구하고, 이 부위는 유도성 카세트 삽입을 위해 흔히 사용되지 않는다. 본 발명자들은 hROSA26 부위에 대해 특이적으로 표적화하는 시스템을 개발하였으며, 따라서 유전자 물질을 이 유전자좌에 삽입할 수 있었다. hROSA26 유전자좌는 염색체 3 (3p25.3) 상에 있고, 앙상블(Ensembl) 데이터베이스 (젠뱅크(GenBank):CR624523) 내에서 확인될 수 있다. 통합 부위의 정확한 게놈 좌표는 3:9396280-9396303: 앙상블이다. 통합 부위는 THUMPD3 긴 비-코딩 RNA (역 가닥)의 개방 판독 프레임 (ORF) 내에 있다. hROSA26 부위가 내인성 프로모터를 갖기 때문에, 삽입된 유전자 물질은 상기 내인성 프로모터의 이점을 가질 수 있거나, 또는 대안적으로 프로모터에 작동가능하게 연결되게 삽입될 수 있다.
염색체 13의 긴 아암 상에서 시트레이트 리아제 베타-유사 (CLYBL) 유전자의 인트론 2가 파지 유래된 phiC31 인테그라제의 확인된 통합 핫-스팟 중 하나이기 때문에, 이는 적합한 GSH로서 확인되었다. 연구를 통해, 이 유전자좌에 무작위로 삽입된 유도성 카세트가 안정하고 발현된다는 것이 입증되었다. 이 GSH에서 유도성 카세트의 삽입이 국부적 유전자 발현을 교란시키지 않는다는 것이 확인되었다 (Cerbibi et al., 2015, PLOS One, DOI:10.1371). 따라서, CLYBL은 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있는 GSH를 제공한다.
염색체 3 상에 위치하는 CCR5 (위치 3p21.31)는 HIV-1 주요 공동-수용체를 코딩하는 유전자이다. 불리한 효과를 갖지 않는 것으로 보이지만 HIV-1 감염 내성을 갖게 하는 이 유전자에서 삭제 돌연변이는 이 부위를 GSH로 사용하는 것에 대한 관심을 불러 일으켰다. 제3 엑손을 표적으로 하는 아연-핑거 뉴클레아제가 개발되었고, 따라서 이는 이 유전자좌에서 유전자 물질의 삽입을 허용한다. CCR5의 천연 기능이 아직 해명되지 않았다는 점에서, 상기 부위는 본 발명에 대해 유용성을 가질 수 있는 추정 GSH로 남는다.
히포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 (HPRT) 유전자는 퓨린 살비지 경로를 통한 퓨린 뉴클레오티드의 생성에서 중추적인 역할을 하는 트랜스퍼라제 효소를 코딩한다. 따라서, 이 부위에서의 삽입이 정상적인 세포 기능을 방해하지 않도록 하기 위해 추가의 작업이 필요하다. 그러나, 이는 GSH 부위로서 제기되었다. 이 부위에서의 삽입은 성숙 세포 유형에 대해, 예컨대 유전자 요법을 위한 변형에 대해 더욱 적용가능할 수 있다.
다른 유기체에서 GSH가 확인되었고, 마우스에서의 ROSA26, HRPT 및 Hipp11 (H11) 유전자좌가 포함된다. 포유류 게놈은 모조(pseudo) attP 부위를 기반으로 하여 GSH 부위를 포함할 수 있다. 이러한 부위위 경우, hiC31 인테그라제, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 파지-유래된 레콤비나제가 attB 부위를 보유하는 유도성 카세트-함유 플라스미드를 모조 attP 부위에 통합시키는 능력을 갖기 때문에, 이는 비-바이러스성 삽입 도구로서 개발되었다.
GSH는 식물의 게놈에도 존재하며, 식물 세포의 변형은 본 발명의 일부를 형성한다. GSH는 쌀의 게놈에서 확인되었다 (Cantos et al., Front. Plant Sci., 26 June 2014, Volume 5, Article 302, http://dx.doi.org/10.3389/fpls.2014.00302).
본 발명의 방법에서, 삽입은 상이한 GSH에서 일어나며, 따라서 적어도 2개의 GSH가 본 발명의 방법에 필요하다. 제1 GSH는 전사 조절자 단백질의 삽입에 의해 변형된다. 제2 GSH는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 서열을 포함하는 유도성 카세트의 삽입에 의해 변형된다. 다른 유전자 물질 또한 이들 요소 중 하나 또는 둘 다에 의해 삽입될 수 있다. 유도성 카세트 내의 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 서열은 바람직하게는 DNA 서열이다. 유도성 카세트의 유전자 서열(들)은 바람직하게는 RNA 분자를 코딩하고, 따라서 전사될 수 있다. 전사는 유도성 프로모터를 이용하여 조절된다. RNA 분자는 임의의 서열을 가질 수 있지만, 바람직하게는 단백질을 코딩하는 mRNA, shRNA 또는 gRNA이다.
제1 GSH는 임의의 적합한 GSH 부위일 수 있다. 임의적으로, 이는 구성적으로 발현되는 내인성 프로모터를 갖는 GSH이고, 이는 구성적으로 발현되는 삽입된 전사 조절자 단백질을 생성할 것이다. 적합한 GSH는 인간 세포에 대한 hROSA26 부위이다. 대안적으로, 삽입된 전사 조절자 단백질은 프로모터, 바람직하게는 구성적인 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 구성적인 프로모터는 hROSA26 부위에서의 삽입물과 함께 사용될 수 있다.
전사 조절자 단백질은 DNA에 결합하는, 바람직하게는 프로모터 내에 또는 근처에 위치하는 DNA 부위에 서열-특이적으로 결합하는 단백질이고, 전사 기구가 프로모터에 결합하여 DNA 서열의 전사를 용이하게 하거나 (전사 활성자) 또는 이 경로를 차단한다 (전사 억제자). 이러한 개체는 전사 인자로도 공지되어 있다.
전사 조절자 단백질이 결합하는 DNA 서열은 전사 인자-결합 부위 또는 반응 요소로 불리고, 이들은 조절된 DNA 서열의 프로모터 내에 또는 근처에서 발견된다.
전사 활성자 단백질은 반응 요소에 결합하여 유전자 발현을 촉진시킨다. 이러한 단백질이 본 발명의 방법에서 유도성 카세트 발현을 조절하는데 바람직하다.
전사 억제자 단백질은 반응 요소에 결합하여 유전자 발현을 방지한다.
전사 조절자 단백질은 물질의 결합, 다른 전사 인자 (예를 들어, 동종이합체화 또는 이종이합체화) 또는 공동조절 단백질과의 상호작용, 인산화, 및/또는 메틸화를 비롯한 수많은 메카니즘에 의해 활성화되거나 탈활성화될 수 있다. 전사 조절자는 활성화 또는 탈활성화에 의해 조절될 수 있다.
전사 조절자 단백질이 전사 활성자 단백질인 경우에는, 전사 활성자 단백질이 활성화를 필요로 하는 것이 바람직하다. 이 활성화는 임의의 적합한 수단을 통해 이루어질 수 있지만, 세포에 외인성 물질을 첨가함으로써 전사 조절자 단백질을 활성화시키는 것이 바람직하다. 세포로 외인성 물질의 공급은 조절될 수 있고, 따라서 전사 조절자 단백질의 활성화가 조절될 수 있다. 대안적으로, 외인성 물질은 전사 조절자 단백질을 불활성화시키기 위해 공급된 다음, 전사 조절자 단백질을 활성화시키기 위해 공급을 제거할 수 있다.
전사 조절자 단백질이 전사 억제자 단백질인 경우에는, 전사 억제자 단백질이 탈활성화를 필요로 하는 것이 바람직하다. 따라서, 물질을 공급하여, 전사 억제자 단백질이 전사를 억제하는 것을 방지하고, 따라서 전사가 허용된다.
바람직하게는, 활성화가능한 또는 탈활성화가능한 것인 임의의 적합한 전사 조절자 단백질이 사용될 수 있다. 전사 조절자 단백질을 조절하기 위해 외인성 물질을 공급하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 전사 조절자 단백질은 유도성 전사 조절자 단백질로도 지칭된다.
테트라시클린-조절된 전사 활성화는 항생제 테트라시클린 또는 그의 유도체 중 하나 (예를 들어, 더욱 안정한 독시시클린)의 존재하에 전사가 가역적으로 작동하거나 작동하지 않는 유도성 유전자 발현의 방법이다. 이 시스템에서, 전사 활성자 단백질은 테트라시클린 - 반응성 전사 활성자 단백질 (rtTa) 또는 그의 유도체이다. rtTA 단백질은 특이적인 TetO 오퍼레이터 서열에서 DNA에 결합할 수 있다. 이러한 TetO 서열의 몇몇 반복부는 최소 프로모터 (예컨대, CMV 프로모터)의 상류에 있으며, 이들은 함께 테트라시클린 반응 요소 (TRE)를 형성한다. 테트라시클린 또는 유도체의 작용이 rtTA 단백질을 활성화시키는지 (Tet-On) 또는 탈활성화시키는지 (Tet-Off) 여부에 따라 이 시스템의 2가지 형태가 있다.
Tet-Off 시스템에서는, 테트라시클린 또는 그의 유도체가 rtTA에 결합하여 rtTA를 탈활성화시키고, 그가 TRE 서열에 결합할 수 없게 만들어서, TRE-조절된 유전자의 전사를 방지한다. 이 시스템은 Bujard, et al. (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (12): 5547-51에 처음 기재되었다.
Tet-On 시스템은 2가지 성분으로 구성된다; (1) 구성적으로 발현된 테트라시클린 - 반응성 전사 활성자 단백질 (rtTa) 및 rtTa 민감성 유도성 프로모터 (Tet 반응성 요소, TRE). 이는 테트라시클린 또는 그의 더욱 안정한 유도체, 예컨대 독시시클린 (dox)에 의해 결합되어 rtTa를 활성화시키고, 그가 TRE 서열에 결합하게 하여 TRE-조절된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이것의 사용은 본 발명의 방법에서 바람직할 수 있다. 이 시스템은 도 11에 도시된다.
따라서, 전사 조절자 단백질은 테트라시클린-반응성 전사 활성자 단백질 (rtTa) 단백질일 수 있고, 이는 외인성으로 공급되는 항생제 테트라시클린 또는 그의 유도체 중 하나에 의해 활성화되거나 탈활성화될 수 있다. 전사 조절자 단백질이 rtTA인 경우에는, 제2 GSH 부위에 삽입된 유도성 프로모터가 테트라시클린 반응 요소 (TRE)를 포함한다. 외인성 공급 물질은 항생제 테트라시클린 또는 그의 유도체 중 하나이다.
변이체 및 변형된 rtTa 단백질이 본 발명의 방법에서 사용될 수 있으며, 이들에는 Tet-On 진보된 전사 촉진 인자 (rtTA2S-M2로도 공지됨) 및 Tet-On 3G (rtTA-V16으로도 공지되며, rtTA2S-S2로부터 유래됨)가 포함된다.
테트라시클린 반응 요소 (TRE)는 일반적으로 최소 프로모터와 함께 스페이서 서열에 의해 분리된 19bp 박테리아 TetO 서열의 7개의 반복부로 구성된다. 최소 프로모터가 임의의 적합한 프로모터일 수 있기 때문에, TRE 서열의 변이 및 변형이 가능하다. 바람직하게는, 최소 프로모터는 rtTa 결합의 부재하에 발현을 나타내지 않거나 최소 발현 수준을 나타낸다. 따라서, 제2 GSH에 삽입된 유도성 프로모터는 TRE를 포함할 수 있다.
테트라시클린 대조군을 기반으로 하는 변형된 시스템은 T-REx™ 시스템 (써모피셔 사이언티픽(Thermofisher Scientific))이며, 전사 조절자 단백질은 전사 억제자 단백질, TetR이다. 이 시스템의 성분에는 (i) 강력한 인간 시토메갈로바이러스 급초기 (CMV) 프로모터 및 2개의 테트라시클린 오퍼레이터 2 (TetO2) 부위를 포함하는 유도성 프로모터, 및 Tet 억제자 (TetR)가 포함된다. TetO2 서열은 2개 염기쌍 스페이서에 의해 분리된 19개 뉴클레오티드 서열 5'-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3'의 2개 카피로 구성된다. 테트라시클린의 부재하에, Tet 억제자는 유도성 프로모터에서 각각의 TetO2 서열에 대해 매우 높은 친화도로 결합하며 프로모터로부터의 전사를 방지하는 동종이합체를 형성한다. 첨가되면, 테트라시클린은 각각의 Tet 억제자 동종이합체에 높은 친화도로 결합하여, 그가 Tet 오퍼레이터에 결합할 수 없게 만든다. Tet 억제자:테트라시클린 복합체는 Tet 오퍼레이터로부터 해리되어 발현을 유도한다. 이 예에서, 전사 조절자 단백질은 TetR이고, 유도성 프로모터는 2개의 TetO2 부위를 포함한다. 외인성 공급 물질은 테트라시클린 또는 그의 유도체이다.
본 발명은 추가로 코돈-최적화된 tetR (OPTtetR)에 관한 것이다. 이는 본원에 기재된 임의의 방법에서, 또는 유도성 프로모션이 바람직한 임의의 추가의 용도에서 사용될 수 있다. 이는 박테리아 tetR cDNA 서열의 다중파라미터-최적화를 이용하여 생성되었다. OPTtetR은 표준 서열 (STDtetR)과 비교할 때 tetR 발현을 10배 증가시킨다. tetR의 동형접합성 OPTtetR 발현은 실시예에서 녹다운 유도를 유지하면서 shRNA 누출을 방지하는데 충분하였다. OPTtetR에 대한 서열이 여기에 포함되며, 표준 서열은 비교를 위해 도시된다. 이 서열에 대해 적어도 75%, 80%, 85% 또는 90% 상동성, 더욱 특별하게는 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 또는 99% 상동성을 갖는 서열이 본원에서 청구된다. STDtetR과 OPTtetR 사이에서 변화되는 것으로 확인된 잔기가 상기 서열에서 나타났고, 이들 잔기가 개선된 성질을 위해 중요한 것으로 생각되기 때문에, 이들은 OPTtetR의 임의의 유도체에서 변화되지 않는다. 임의의 유도체는 지정된 위치에서 임의적으로 이들 변형을 보유할 것이다.
다른 유도성 발현계가 공지되어 있고, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 이들에는 애질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies)로부터의 완전 조절 유도성 시스템(Complete Control Inducible system)이 포함된다. 이는 황색 초파리 엑디손 수용체 (EcR)에 대한 유전자 및 엑디손 수용체에 대한 결합 부위를 포함하는 유도성 프로모터 둘 다에 의해 전사되는 포유류 세포에서 전사를 활성화시킬 수 있는 곤충 호르몬 엑디손 또는 그의 유사체 포나스테론 A (ponA)를 기반으로 한다. EcR은 핵 수용체의 레티노이드-X-수용체 (RXR) 패밀리의 구성원이다. 인간에서, EcR은 엑디손-반응성 요소 (EcRE)에 결합하는 RXR과 이종이합체를 형성한다. PonA의 부재시에는, 상기 이종이합체에 의해 전사가 억제된다.
따라서, 전사 조절자 단백질은 억제자 단백질, 예컨대 엑디손 수용체 또는 그의 유도체이다. 후자의 예에는 애질런트 테크놀로지즈로부터의 VgEcR 합성 수용체가 포함되며, 이는 EcR, 글루토코르코이드 수용체의 DNA 결합 도메인 및 단순 헤르페스 바이러스 VP16의 전사 활성화 도메인의 융합체이다. 유도성 프로모터는 EcRE 서열 또는 그의 변형된 버전을 최소 프로모터와 함께 포함한다. 변형된 버전에는 애질런트 테크놀로지즈의 E/GRE 인식 서열이 포함되며, 상기 서열에 대해 돌연변이가 이루어져 있다. E/GRE 인식 서열은 레티노이드-X-수용체 (RXR) 및 GR 결합 도메인에 대한 반전된 절반-부위 인식 요소를 포함한다. 모든 변환에서, 외인성 공급 물질은 포나스테론 A이고, 이는 유도성 프로모터에 대한 EcR 또는 그의 유도체의 억제 효과를 제거하고, 전사가 일어나게 한다.
대안적으로, 유도성 시스템은 외인성 공급 물질로서 합성 스테로이드 미페프리스톤을 기반으로 할 수 있다. 이 시나리오에서, 혼성체 전사 조절자 단백질이 삽입되고, 이는 효모 GAL4 단백질로부터의 DNA 결합 도메인, 인간 프로게스테론 수용체로부터의 말단절단된 리간드 결합 도메인 (LBD) 및 인간 NF-κB로부터의 활성화 도메인 (AD)을 기반으로 한다. 이 혼성체 전사 조절자 단백질은 써모피셔 사이언티픽 (진 스위치(Gene Switch™))으로부터 입수가능하다. 미페프리스톤은 혼성체 단백질을 활성화시키고, GAL4 상류 활성화 서열 (UAS) 및 아데노바이러스 E1b TATA 박스를 포함하는 유도성 프로모터로부터의 전사를 허용한다. 이 시스템은 Wang, Y. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180-8184에 기재되어 있다.
따라서, 전사 조절자 단백질은 활성자 또는 억제자 단백질인 임의의 적합한 조절자 단백질일 수 있다. 적합한 전사 활성자 단백질은 테트라시클린 - 반응성 전사 활성자 단백질 (rtTa) 또는 유전자 스위치 혼성체 전사 조절자 단백질이다. 적합한 억제자 단백질에는 rtTA, TetR 또는 EcR의 Tet-Off 버전이 포함된다. 전사 조절자 단백질은 필요에 따라 변형되거나 또는 유도될 수 있다.
유도성 프로모터는 전사 조절자 단백질과의 결합 또는 상호작용에 적합한 요소를 포함할 수 있다. 전사 조절자 단백질과 유도성 프로모터의 상호작용은 바람직하게는 외인성 공급 물질에 의해 조절된다.
외인성 공급 물질은 전사 조절자 단백질에 결합하거나 그와 상호작용하는 임의의 적합한 물질일 수 있다. 적합한 물질에는 테트라시클린, 포나스테론 A 및 미페프리스톤이 포함된다.
따라서, 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 GSH로의 삽입은 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결되고 제2의 상이한 GSH 부위에 삽입된 유도성 카세트의 발현에 대한 조절 메카니즘을 제공한다.
전사 조절자 단백질 유전자는 다른 유전자 물질과 함께 삽입을 위해 제공될 수 있다. 이러한 물질에는 마커 또는 리포터 분자에 대한 유전자, 예컨대 형광 및 발광 단백질을 비롯하여 가시적으로 인식가능한 특징을 유도하는 유전자가 포함된다. 그 예에는 그를 발현하는 세포가 청색/UV 광하에서 녹색으로 빛나게 하는 해파리 녹색 형광 단백질 (GFP)을 코딩하는 유전자, 빛을 생성하기 위해 루시페린과의 반응을 촉매하는 루시페라제, 및 유전자 dsRed로부터의 적색 형광 단백질이 포함된다. 리포터 단백질의 존재가 제1 GSH로부터의 단백질 발현을 확인시켜 주고, 성공적인 삽입을 나타내기 때문에, 이러한 마커 또는 리포터 유전자가 유용하다. 선별 마커에는 추가로 항생제 또는 다른 약물에 대한 내성 유전자가 포함될 수 있다. 내인성 (또는 외인성 유전자) 발현의 연구를 가능하게 하는 마커 또는 리포터 유전자 서열 또한 도입될 수 있다. 그에는 Cas 단백질, 예컨대 CasL, 관심 유전자의 제거를 가능하게 하는 Cas9 단백질, 뿐만 아니라 예를 들어 전사 인핸서 또는 억제자로서 작용함으로써 다른 유전자 발현에서 변화를 매개하는 Cas-융합 단백질이 포함된다. 더욱이, 광유전자 도구, 핵 수용체 융합 단백질, 예컨대 타목시펜-유도성 시스템 ERT, 및 설계자 약물에 의해서만 활성화되는 설계자 수용체를 비롯한 분자 도구의 비-유도성 발현이 바람직할 수 있다. 추가로, 유기체에서 동일한 세포 또는 이웃 또는 심지어 멀리 있는 세포의 기능을 변경시키는 신호전달 인자, 예컨대 호르몬 오토크린 또는 파라크린 인자를 코딩하는 서열은 전사 조절자 단백질과 동일한 GSH로부터 공동발현될 수 있다.
추가로, 추가의 유전자 물질에는 본원에서 논의된 바와 같이 비-코딩 RNA를 코딩하는 서열이 포함될 수 있다. 이러한 유전자 물질의 예에는 유전자 스위치로서 기능할 수 있는 miRNA에 대한 유전자가 포함된다.
전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자가 구성적인 프로모터에 작동가능하게 연결되는 것이 바람직하다. 대안적으로, 제1 GSH는 이미 구성적인 프로모터를 가져서 전사 조절자 단백질 유전자 및 임의의 관련된 유전자 물질의 발현을 유도할 수 있도록 선택될 수 있다. 구성적인 프로모터는 지속된 높은 수준의 유전자 발현을 보장한다. 흔히 사용되는 구성적인 프로모터에는 인간 β-액틴 프로모터 (ACTB), 시토메갈로바이러스 (CMV), 신장 인자-1α, (EF1α), 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 및 유비퀴틴C (UbC)가 포함된다. CAG 프로모터는 높은 수준의 유전자 발현을 유도하기 위해 빈번하게 사용되는 강력한 합성 프로모터이고, 이는 하기 서열로부터 구축되었다: (C) 시토메갈로바이러스 (CMV) 초기 인핸서 요소, (A) 닭 베타-액틴 유전자의 프로모터, 제1 엑손 및 제1 인트론, 및 (G) 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용자.
추가로, 전사 조절자 + 임의의 추가의 유전자 물질은 절단가능한 서열과 함께 제공될 수 있다. 이러한 서열은 DNA를 특이적으로 절단할 수 있는 개체에 의해 인식되는 서열이고, 이는 다른 DNA 절단 개체에 의한 인식을 위해 제한 효소 또는 서열, 예컨대 뉴클레아제, 레콤비나제, 리보자임 또는 인공 구축물에 대한 표적 서열인 제한 부위를 포함한다. 적어도 하나의 절단가능한 서열이 포함될 수 있지만, 바람직하게는 2개 이상이 존재한다. 이들 절단가능한 서열은 삽입물의 선택된 부분 또는 전체 삽입물이 GSH로부터 선택적으로 제거될 수 있도록 삽입물의 임의의 적합한 지점에 있을 수 있다. 따라서, 상기 방법은 GSH로부터 삽입물 또는 그의 일부분의 제거 및/또는 대체로 확장될 수 있다. 따라서, 절단가능한 부위는 제거하기를 원할 수 있는 삽입물의 일부분/전부를 플랭킹할 수 있다. 전사 조절자 및/또는 추가의 유전자 물질은 이 방법을 이용하여 제거될 수 있다.
삽입물의 일부분은 삽입물의 99%까지 - 즉 1-99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 10% 미만 중 임의의 부분일 수 있다.
절단가능한 부위에 의해 플랭킹된 삽입물의 일부분이 구성적인 프로모터를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 구성적인 프로모터는 절단가능한 서열에 의해 플랭킹된 부분에 포함되지 않는다.
바람직한 절단가능한 서열은 Cre 레콤비나제의 경우 loxP 부위이며, 이는 제거된 삽입물의 직접적인 대체를 가능하게 하기 때문이다. 대안적으로 또는 추가로, 절단가능한 서열은 Dre 레콤비나제의 경우 rox 부위이다.
제1 GSH에서 삽입이 게놈에서 두 유전자좌 모두에서 일어나서, 각각의 대립 유전자가 삽입에 의해 변형되는 것이 바람직하다. 이는 전사 조절자 및 임의의 관련된 유전자 물질을 코딩하는 유전자로부터 보다 양호한 발현을 허용한다.
제2 GSH는 임의의 적합한 GSH 부위일 수 있다. 삽입된 유도성 카세트의 발현이 전사 조절자 단백질의 조절하에서만 있도록, 제2 GSH 부위가 내인성 프로모터와 회합되지 않는 것이 바람직할 수 있다.
유도성 카세트는 세포로 운반되는 원하는 유전자 서열, 바람직하게는 DNA 서열을 포함한다. 유도성 카세트의 게놈으로의 도입은 유전자 발현을 허용하거나 또는 내인성 발현을 녹다운/녹아웃시키는 유전자 서열의 첨가에 의해 세포의 표현형을 변화시키는 잠재성을 갖는다. 본 발명의 방법은 세포에서 유도성 카세트 내의 유전자 서열(들)의 조절가능한 전사를 제공한다.
삽입을 위해 원하는 유전자 서열은 바람직하게는 RNA 분자를 코딩하는 DNA 서열이다. RNA 분자는 임의의 서열을 가질 수 있지만, 바람직하게는 코딩 또는 비-코딩 RNA이다. 코딩 또는 메신저 RNA는 폴리펩티드 서열을 코딩하고, 이러한 RNA의 전사는 세포 내에서 단백질의 발현을 유도한다. 비-코딩 RNA는 기능적일 수 있고, 그에는 비제한적으로 마이크로RNA, 소형 간섭 RNA, Piwi-상호작용 RNA, 안티센스 RNA, 소형 핵 RNA, 소형 핵소체 RNA, 소형 Cajal 바디 RNA, Y RNA, 인핸서 RNA, 가이드 RNA, 리보자임, 소형 헤어핀 RNA, 소형 일시적 RNA, 트랜스-작용 RNA, 소형 간섭 RNA 및 서브게놈 메신저 RNA가 포함될 수 있다. 비-코딩 RNA는 기능적 RNA로도 공지되어 있을 수 있다. RNA의 몇몇 유형은 본래 조절성이고, 예를 들어 mRNA 또는 유전자 DNA의 일부에 대해 상보적임으로써 유전자 발현을 하향조절할 수 있다. 마이크로RNA (miRNA; 21-22개 뉴클레오티드)는 진핵생물에서 발견되고, RNA 간섭 (RNAi)을 통해 작용하며, miRNA 및 효소의 이펙터 복합체는 상보성 mRNA를 절단시키거나, mRNA가 번역되는 것을 차단하거나, 또는 그의 분해를 가속시킬 수 있다. 또 다른 유형의 RNA, 소형 간섭 RNA (siRNA; 20-25개 뉴클레오티드)는 miRNA와 유사한 방식으로 RNA 간섭을 통해 작용한다. 일부 miRNA 및 siRNA는 표적으로 하는 유전자가 메틸화되게 하여, 이들 유전자의 전사를 감소시키거나 증가시킬 수 있다. 동물은 생식계열 세포에서 활성이고 트랜스포손에 대해 방어성인 것으로 여겨지는 Piwi-상호작용 RNA (piRNA; 29-30개 뉴클레오티드)를 갖는다. 여러 원핵생물은 RNA 간섭과 유사한 조절 시스템인 CRISPR RNA를 가지며, 이러한 시스템은 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. 안티센스 RNA는 광범위하며; 대부분은 유전자를 하향조절하지만, 일부는 전사 활성자이다. 안티센스 RNA는 mRNA에 결합함으로써 작용하여, 효소에 의해 분해되는 이중 가닥 RNA를 형성할 수 있다. 진핵생물에서 유전자를 조절하는 여러 긴 비-코딩 RNA가 있으며, 이러한 한 RNA는 Xist이고, 이는 암컷 포유류에서 하나의 X 염색체를 코팅하여 이를 불활성화시킨다. 따라서, 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 수많은 기능적 RNA가 있다.
따라서, 유도성 카세트는 단백질-코딩 유전자인 유전자 서열을 포함할 수 있다. 이 유전자는 세포에서 천연적으로 존재하지 않을 수 있거나 또는 세포에서 천연적으로 발생할 수 있지만, 해당 유전자의 조절가능한 발현이 필요하다. 대안적으로, 유도성 카세트는 특별하게는 유전자 요법 목적 또는 질환 모델 유도를 위해 세포에 존재하는 유전자의 돌연변이된, 변형된 또는 정확한 버전일 수 있다. 따라서, 유도성 카세트는 동일한 종의 상이한 유기체로부터의 또는 상이한 종으로부터의 트랜스진을 포함할 수 있다 (즉, 인간으로부터의 유전자의 발병한/돌연변이된 버전, 또는 인간으로부터의 야생형 유전자).
임의의 측면 또는 실시양태에서, 유도성 카세트 내에 포함된 유전자 서열은 합성 서열일 수 있다.
유도성 카세트는 세포의 게놈에 삽입하기를 원하는 임의의 적합한 유전자 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 유전자 서열은 단백질 생성물을 코딩하는 유전자, 또는 소정의 기능을 갖는 리보핵산 (RNA)으로 전사되는 서열 (예컨대, 소형 핵 RNA (snRNA), 안티센스 RNA, 마이크로 RNA (miRNA), 소형 간섭 RNA (siRNA), 운반 RNA (tRNA) 및 다른 비-코딩 RNAs (ncRNA), 예컨대 CRISPR-RNA (crRNA) 및 가이드 RNA (gRNA))일 수 있다.
따라서, 유도성 카세트는 세포 내에서 서열의 전사가 조절되기를 원하는 임의의 유전자 서열을 포함할 수 있다. 선택된 유전자 서열은 하기에서 추가로 논의되는 바와 같이 세포 유형 및 변형후 세포의 용도에 따라 좌우될 것이다.
예를 들어, 유전자 요법 방법의 경우, 유도성 카세트의 성분으로서 야생형 유전자 서열을 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이 시나리오에서, 유전자 서열은 임의의 인간 또는 동물 단백질-코딩 유전자일 수 있다. 단백질-코딩 유전자의 예에는 인간 β-글로빈 유전자, 인간 지단백질 리파제 (LPL) 유전자, CHM 유전자에 의해 코딩되는 인간에서의 Rab 호위 단백질 1 등이 포함된다. 대안적으로, 유도성 카세트는 성장 인자, 예컨대 BDNF, GDF, NGF, IGF, FGF, 및/또는 프로-펩티드를 절단하여 활성 형태를 형성할 수 있는 효소를 발현할 수 있다. 유전자 요법은 또한 안티센스 RNA, miRNA, siRNA, 또는 세포 내에서 또 다른 유전자의 발현을 방해하는 임의의 유형의 RNA를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 유도성 카세트의 발현에 의해 달성될 수 있다.
대안적으로, 세포가 줄기 세포인 경우, 유도성 카세트는 핵심 계통 특이적 마스터 조절자 (본원에서 마스터 조절자로 약칭됨)를 코딩하는 유전자 서열을 포함할 수 있다. 마스터 조절자는 전사 인자, 전사 조절자, 사이토킨 수용체 또는 신호전달 분자 등 중 하나 이상일 수 있다. 마스터 조절자는 그를 발현하는 세포의 계통에 영향을 미치는 발현된 유전자이다. 세포의 계통을 결정하기 위해서는 마스터 조절자의 네트워크가 필요할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 발달 계통 또는 세포 유형의 개시때 발현되는 마스터 조절자 유전자는 직접적으로 또는 유전자 발현 변화의 캐스케이드를 통해 다중 하류 유전자를 조절함으로써 해당 계통의 지정에 참여한다. 마스터 조절자가 발현되면, 이는 다른 계통을 형성하도록 지정된 세포의 운명을 다시 지정하는 능력을 갖는다. 마스터 조절자의 예에는 근원성 전사 인자 MyoD 및 조혈 전사 인자 SCL이 포함된다. 특별하게는, 마스터 조절자에는 다음이 포함되나 이로 제한되지 않는다:
신경 계통: 희소돌기아교세포: SOX10, OLIG2, NKX2.2., NKX6.2; 성상세포: NFIA, NFIB, 및 SOX9; 뉴런: Ascl1, 뉴로제닌, 및 NeuroD, Pax6, Neurog2, Ascl1, Dlx2, 및 NeuroD1; 조혈 세포, 예컨대 적혈구 및 거핵구: GATA1, FLI1 및 TAL1
중간엽 계통: 골격근: MYOD; 심근세포: Gata4, Mef2c, Baf60c 및 Tbx5; 골: L-Myc (RXOL) Runx2, 오스테릭스, Oct4; 연골: c-Myc Klf4, SOX9; 및 갈색 지방세포: C/EBP-β 및 c-Myc
내배엽
췌장 세포 유형: PDX1 및 GATA6.
줄기 세포: 외배반 SC: Oct4, Sox2, Klf4 및 c-Myc
대안적으로 또는 추가로, 유전자 서열 또는 추가의 유전자 물질은 그의 기능을 연구할 필요가 있는 유전자일 수 있고, 따라서 조절가능한 발현이 세포에 대한 발현 효과를 확인할 수 있고; 상기 유전자는 세포가 세포 이식에 사용되도록 성장 인자 및/또는 사이토킨을 포함할 수 있고/거나 상기 유전자는 리포터 검정의 성분일 수 있다.
추가로, 유전자 서열은 세포에서 비-코딩 RNA를 코딩하는 내인성 유전자 또는 DNA 서열의 발현을 녹다운시키는 기능을 갖는 비-코딩 RNA를 코딩할 수 있다. 대안적으로, 유전자 서열은 내인성 유전자를 녹아웃시키기 위해 CRISPR-Cas9 시스템에 대한 가이드 RNA를 코딩할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법은 세포 내에서 내인성 유전자 발현을 녹다운시키는 방법으로 확장된다. 상기 방법은 이전에 기재되어 있고, 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 비-코딩 RNA를 코딩하는 유전자 서열을 포함하며, 비-코딩 RNA는 상기 내인성 유전자의 발현을 저해한다. 비-코딩 RNA는 RNA 간섭 및 안티센스 RNA를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 유전자 발현을 저해할 수 있다. 따라서, 유전자 서열은 내인성 유전자에 대한 메신저 RNA를 방해할 수 있는 shRNA를 코딩할 수 있다.
내인성 유전자 발현이 부분적으로 또는 전부 감소될 수 있고, 즉, 발현은 비-코딩 RNA의 전사를 유도하기 전의 세포에 비해 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100% 감소될 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 CRIPSR-Cas9 시스템에 의해 세포 내에서 내인성 유전자를 녹아웃시키는 방법으로 확장되지만, 유전자 녹아웃을 위해 임의의 다른 적합한 시스템이 사용될 수 있다. 이 시나리오에서, Cas9 유전자가 구성적으로 발현되어, 전사 조절자에 대한 유전자와 함께 제1 GSH에 포함되는 것이 바람직하다. gRNA를 코딩하는 유전자 서열은 제2 GSH에 삽입된 유도성 카세트에 포함될 수 있다. gRNA는 Cas9-결합에 필요한 스캐폴드 서열 및 변형되는 게놈 표적을 정의하는 대략 20개 뉴클레오티드 표적화 서열로 구성된 짧은 합성 RNA이다. 따라서, Cas9의 게놈 표적은 gRNA에 존재하는 표적화 서열을 간단히 변화시킴으로써 변화될 수 있다. 이러한 시스템의 일차 용도가 유전자를 녹아웃시키기 위해 gRNA가 내인성 유전자를 표적으로 하도록 설계하는 것이지만, 이는 또한 표적 유전자를 선택적으로 활성화시커거나 억제하고, DNA의 특이적 영역을 정제하고, 심지어 DNA를 영상화하도록 변형될 수 있다. 모든 가능한 용도가 구상 중이다.
유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 서열을 포함한다. "프로모터"는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시하고 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. "유도성 프로모터"는 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 서열의 발현이 피분석물, 보조 인자, 조절 단백질 등에 의해 조절되는 것인 뉴클레오티드 서열이다. 본 발명의 경우에, 조절은 전사 조절자 단백질에 의해 이루어진다. 용어 "프로모터" 또는 "조절 요소"는 전장 프로모터 영역 및 이들 영역의 기능적 (예를 들어, 전사 또는 번역의 조절) 세그먼트를 포함하는 것으로 의도된다. "작동가능하게 연결된"은 기재된 성분들이 그의 평소 기능을 수행하도록 적합화된 것인 요소들의 배열을 지칭한다. 따라서, 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 주어진 프로모터는 적절한 효소가 존재할 때 해당 서열을 발현시킬 수 있다. 프로모터의 기능이 서열의 발현을 지시하는 한, 프로모터가 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 프로모터 서열과 유전자 서열 사이에 전사되었지만 아직 번역되지 않은 개재된 서열이 존재할 수 있고, 프로모터 서열은 여전히 유전자 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 고려될 수 있다. 따라서, 용어 "작동가능하게 연결된"은, 전사 복합체에 의한 프로모터 요소의 인식시에 유도성 카세트의 전사 개시를 가능하게 하는, 유도성 카세트에서 프로모터 요소 및 유전자 서열의 임의의 이격 또는 배향을 포함하는 것으로 의도된다.
추가로, 다른 유전자 물질 또한 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 추가의 유전자 물질에는 유전자, RNA에 대한 코딩 서열, 유전자 물질, 예컨대 마커 또는 리포터 유전자가 포함될 수 있다. 이러한 추가의 유전자 물질은 이전에 논의되었다. 일부 상황에서는, 암 유전자 요법의 경우 유전자 서열 자체가 자살 유전자가 아니라면, 유도성 카세트에 자살 유전자를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 자살 유전자는 유도성 카세트 내에서 동일한 유도성 프로모터를 사용할 수 있거나, 또는 별도의 조절을 가능하게 하기 위해 별도의 유도성 프로모터일 수 있다. 이러한 유전자는, 특정한 조건이 충족된다면 공여자/트랜스펙션된 세포를 파괴하는 것이 바람직한 것인 유전자 요법 시나리오에서 유용할 수 있다. 자살 유전자는 세포가 아폽토시스를 겪게 하는 단백질을 발현하는 유전자이거나, 또는 대안적으로 작동을 위해 외부에서 공급된 보조 인자 또는 보조 약물을 필요로 할 수 있다. 보조 인자 또는 보조 약물은 자살 유전자의 생성물에 의해 매우 독성인 개체로 전환될 수 있다.
추가로, 유도성 카세트는 절단가능한 서열을 포함할 수 있다. 이러한 서열은 DNA를 특이적으로 절단할 수 있는 개체에 의해 인식되는 서열이고, 이는 다른 DNA 절단 개체에 의한 인식을 위해 제한 효소 또는 서열, 예컨대 뉴클레아제, 레콤비나제, 리보자임 또는 인공 구축물에 대한 표적 서열인 제한 부위를 포함한다. 적어도 하나의 절단가능한 서열이 포함될 수 있지만, 바람직하게는 2개 이상이 존재한다. 이들 절단가능한 서열은 카세트의 선택된 부분 또는 전체 카세트가 GSH로부터 선택적으로 제거될 수 있도록 카세트의 임의의 적합한 지점에 있을 수 있다. 따라서, 상기 방법은 GSH로부터 카세트 또는 그의 일부분의 제거 및/또는 대체로 확장될 수 있다. 따라서, 절단가능한 부위는 제거하기를 원할 수 있는 유전자 서열의 일부분/전부를 플랭킹할 수 있다. 상기 방법은 유도성 카세트 및/또는 추가의 유전자 물질을 제거할 수 있다.
카세트의 일부분은 카세트의 99%까지 - 즉 1-99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 또는 10% 미만 중 임의의 부분일 수 있다.
절단가능한 부위에 의해 플랭킹된 삽입물의 일부분이 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 대안적으로, 유전자 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터는 절단가능한 서열에 의해 플랭킹된 부분에 포함되지 않는다.
바람직한 절단가능한 서열은 Cre 레콤비나제의 경우 loxP 부위이며, 이는 제거된 삽입물의 직접적인 대체를 가능하게 하기 때문이다. 대안적으로 또는 추가로, 절단가능한 서열은 Dre 레콤비나제의 경우 rox 부위일 수 있다.
전사 조절자 단백질 및 유도성 카세트는 임의의 관련된 유전자 물질과 함께 세포의 게놈 내에서 상이한 GSH에 삽입된다.
바람직하게는, GSH로의 삽입은 상기 기재된 바와 같이 GSH의 특이적인 서열 내에서 이루어진다. 폴리뉴클레오티드를 특이적 서열에 삽입하기 위한 임의의 적합한 기술이 이용될 수 있고, 몇몇은 선행 기술에 기재되어 있다. 적합한 기술에는 원하는 위치에 파손을 도입시키고 상기 갭으로 벡터의 재조합을 허용하는 임의의 방법이 포함된다. 따라서, 표적화된 부위-특이적인 게놈 변형을 위한 중요한 첫번째 단계는 변형시키고자 하는 게놈 유전자좌에서 이중 가닥 DNA 파손 (DSB)을 생성하는 것이다. DSB를 복구하고 원하는 서열을 도입시키기 위해 독특한 세포 복구 메카니즘이 이용될 수 있고, 이들은 오류가 생기기 더 쉬운 비-상동성 말단 결합 복구 (NHEJ); 및 유도성 카세트를 삽입하기 위해 사용될 수 있는 공여자 DNA 주형에 의해 매개된 상동성 재조합 복구 (HR)이다.
게놈에서 DSB의 맞춤형 부위-특이적 생성을 가능하게 하는 몇몇 기술이 존재한다. 이들 중 여러 기술은 맞춤형 엔도뉴클레아제, 예컨대 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN), 전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제 (TALEN) 또는 일정한 간격을 두고 분포하는 짧은 회문 반복부/CRISPR 관련 단백질 (CRISPR/Cas9) 시스템의 사용을 포함한다 (Gaj, T, et al. "ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering," Trends Biotechnol, 31:397-405, July 2013).
아연 핑거 뉴클레아제는 아연-핑거 DNA-결합 도메인을 제한 효소 FokI의 뉴클레아제 도메인에 융합시킴으로써 생성되는 인공 효소이다. 후자는 DNA를 절단시키기 위해 이합체화되어야 하는 비특이적 절단 도메인을 갖는다. 이는 FokI 도메인을 이합체화시키고 DNA를 절단하기 위해 2개의 ZFN 단량체가 필요함을 의미한다. DNA 결합 도메인은 임의의 관심 게놈 서열을 표적으로 하도록 설계될 수 있고, Cys2His2 아연 핑거의 탠덤 어레이이고, 이들 각각은 표적 서열에서 3개의 인접한 뉴클레오티드를 인식한다. 2개의 결합 부위는 5-7bp만큼 떨어져 있어서 FokI 도메인의 최적의 이합체화를 가능하게 한다. 따라서, 효소는 특이적 부위에서 DNA를 절단시킬 수 있고, 이중 가닥 파손을 달성하기 위해 2개의 근위 DNA-결합 사건이 일어나는 것을 보장함으로써 표적 특이성이 증가된다.
전사 활성자-유사 이펙터 뉴클레아제, 또는 TALEN은 이합체성 전사 인자/뉴클레아제이다. 이들은 TAL 이펙터 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인 (뉴클레아제)에 융합시킴으로써 제조된다. 전사 활성자-유사 이펙터 (TALE)는 임의의 원하는 DNA 서열에 실제로 결합하도록 조작될 수 있고, 따라서 뉴클레아제와 조합될 때, DNA는 특이적 위치에서 절단될 수 있다. TAL 이펙터는 크산토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해 분비되는 단백질이고, 그의 DNA 결합 도메인은 12번째 및 13번째 아미노산이 분기되어 있는 고도로 보존된 반복된 33-34개 아미노산 서열을 함유한다. 이들 2개의 위치는 고도로 가변성이고, 특이적 뉴클레오티드 인식과 강력한 상관관계를 나타낸다. 아미노산 서열과 DNA 인식 사이의 이러한 간단한 관계는 상기 2개의 가변 위치에서 적절한 잔기를 함유하는 반복부 세그먼트의 조합물을 선택함으로써 특이적인 DNA-결합 도메인의 조작을 가능하게 한다. 따라서, TALEN은 33 내지 35개 아미노산 모듈의 어레이로부터 제조되고, 이들 각각은 단일 뉴클레오티드를 표적으로 한다. 상기 모듈의 어레이를 선택함으로써, 거의 모든 서열이 표적화될 수 있다. 다시, 사용된 뉴클레아제는 FokI 또는 그의 유도체일 수 있다.
CRISPR 메카니즘의 3가지 유형이 확인되었고, 이 중에서 유형 II가 가장 많이 연구되어 있다. CRISPR/Cas9 시스템 (유형 II)은 짧은 가이드 RNA에 의해 결정된 부위에서 DNA의 이중 가닥 파손을 일으키기 위해 Cas9 뉴클레아제를 사용한다. CRISPR/Cas 시스템은 외래 유전자 요소에 대한 내성을 부여하는 원핵생물 면역계이다. CRISPR은 염기 서열의 짧은 반복을 함유하는 원핵생물 DNA의 세그먼트이다. 각각의 반복 이후에 외래 유전자 요소에 대한 이전의 노출로부터의 "프로토스페이서 DNA"의 짧은 세그먼트가 이어진다. CRISPR 스페이서는 RNA 간섭을 이용하여 외인성 유전자 요소를 인식하고 그를 절단한다. CRISPR 면역 반응은 2가지 단계: CRISPR-RNA (crRNA) 생물발생 및 crRNA-가이딩된 간섭을 통해 발생한다. CrRNA 분자는 프로토스페이서 DNA로부터 전사된 가변 서열 및 CRISP 반복부로 구성된다. 이어서, 각각의 crRNA 분자는 전사 촉진 CRISPR RNA (tracrRNA)로 공지된 제2 RNA와 혼성화하고, 결국 이들 둘은 함께 뉴클레아제 Cas9와의 복합체를 형성한다. crRNA의 프로토스페이서 DNA 코딩된 절편은 프로토스페이서 인접 모티프 (PAM)로 공지된 짧은 서열에 인접하는 경우에 Cas9가 상보성 표적 DNA 서열을 절단하는 것을 지시한다. 이 천연 시스템은 다른 여러 적용 중에서 게놈 DNA의 특이적 부위에서 DSB 파손을 도입시키기 위해 조작되고 연구되었다. 특히, 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)로부터의 CRIPSR 유형 II 시스템이 이용될 수 있다. 가장 간단하게는, CRISPR/Cas9 시스템은 게놈 편집을 제공하기 위해 세포로 전달되는 2개의 성분: Cas9 뉴클레아제 자체 및 소형 가이드 RNA (gRNA)를 포함한다. gRNA는 맞춤형 부위-특이적 crRNA (표적 서열로 향함) 및 표준화된 tracrRNA의 융합체이다.
DSB가 생성되면, 표적화된 유전자좌에 대해 상동성을 갖는 공여자 주형이 공급되고, DSB는 정확한 삽입이 가능하도록 상동성-관련 복구 (HDR) 경로에 의해 복구될 수 있다.
이 시스템의 유도 또한 가능하다. Cas9의 돌연변이 형태, 예컨대 닉카제 활성만을 갖는 Cas9D10A가 이용가능하다. 이는 하나의 DNA 가닥만을 전달시키고 NHEJ를 활성화시키지 않음을 의미한다. 대신에, 상동성 복구 주형이 제공될 때, DNA 복구는 고충실도 HDR 경로를 통해서만 수행된다. Cas9D10A (Cong L., et al. (2013) Science, 339, 819-823)는 표적 부위의 반대쪽 가닥 상의 인접한 영역에 대해 상보성인 2개의 sgRNA와 함께 인접한 DNA 닉을 생성하도록 설계된, 쌍형성된 Cas9 복합체에서 사용될 수 있으며, 이는 특히 유리하다.
이중 가닥 DNA 파손을 생성하기 위한 요소가 세포에서 발현을 위한 하나 이상의 벡터, 예컨대 플라스미드에 도입될 수 있다.
따라서, 유전자/유도성 카세트를 삽입시키기 위해 게놈에서 특이적인 표적화된 이중 가닥 파손을 생성하기 위한 임의의 방법이 본 발명의 방법에서 이용될 수 있다. 유전자/유도성 카세트를 삽입하는 방법이 ZFN, TALEN 및/또는 CRISPR/Cas9 시스템 또는 그의 임의의 유도 중 임의의 하나 이상을 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
임의의 적절한 수단에 의해 DSB가 생성되었다면, 삽입을 위한 유전자/유도성 카세트를 하기 기재되는 임의의 적합한 방식으로 공급할 수 있다. 유전자/유도성 카세트 및 관련된 유전자 물질은 DSB에서 DNA의 복구를 위한 공여자 DNA를 형성하고, 표준 세포 복구 기구/경로를 이용하여 삽입된다. 파손이 시작되는 방식은 상기 언급된 바와 같이 손상을 복구시키기 위해 이용되는 경로를 변경시킬 것이다.
본 발명의 방법을 위해 전사 조절자 단백질 및 유도성 카세트는 별도의 벡터에 대해 공급될 수 있다. "벡터"는 유전자 물질이 세포에 인공적으로 보유되도록 비히클로서 사용되는 핵산 분자, 예컨대 DNA 분자이다. 벡터는 일반적으로 삽입부 (예컨대, 전사 조절자 단백질을 위한 유도성 카세트 또는 유전자) 및 벡터의 "백본"으로서 작용하는 더 큰 서열로 구성되는 핵산 서열이다. 벡터는 플라스미드, 미니써클, 또는 선형 DNA를 비롯한 임의의 적합한 방식을 가질 수 있다. 벡터는 적어도 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 전사 조절자 또는 유도성 카세트에 대한 유전자를, 관련 GSH에 유전자의 삽입을 가능하게 하는 최소 서열과 함께 포함한다. 임의적으로, 벡터는 또한 벡터, 예를 들어 박테리아의 증폭을 허용하는 복제 기점 (ori)을 갖는다. 추가로 또는 대안적으로, 벡터는 선별 마커, 예컨대 항생제 내성 유전자, 착색된 마커에 대한 유전자 및 자살 유전자를 포함한다.
실시예에서 사용된 벡터의 예가 도 20 내지 33에 도시된다.
본 발명의 방법에서 사용되는 세포는 임의의 인간 또는 동물 세포일 수 있다. 이는 바람직하게는 포유류 세포, 예컨대 설치류, 예컨대 마우스 및 래트; 유대류, 예컨대 캥거루 및 코알라; 비-인간 영장류, 예컨대 보노보, 침팬지, 여우원숭이, 긴팔원숭이 및 유인원; 낙타과, 예컨대 낙타 및 라마; 가축 동물, 예컨대 말, 돼지, 소, 버팔로, 들소, 염소, 양, 사슴, 순록, 당나귀, 밴팅, 야크, 닭, 오리 및 칠면조; 가정용 동물, 예컨대 고양이, 개, 토끼 및 기니 피그로부터의 세포이다. 세포는 바람직하게는 인간 세포이다. 특정한 측면에서, 세포는 바람직하게는 가축 동물로부터의 것이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 세포 유형은 GSH 부위로 유전자 물질의 삽입이 완료되었을 때 세포의 적용에 따라 좌우될 것이다.
조상 세포로부터 성숙 세포 유형을 생성하는 것을 목적으로 하는 경우에는, 변형된 세포가 줄기 세포, 바람직하게는 다분화능 줄기 세포이다. 다분화능 줄기 세포는 체내에서 거의 모든 세포로 분화되는 잠재력을 갖는다. 다분화능 줄기 세포의 몇몇 공급원이 있다. 배아 줄기 세포 (ES 세포)는 초기-단계 착상전 배아인 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 유래된 다분화능 줄기 세포이다. 유도된 다분화능 줄기 세포 (iPSC)는 배아 줄기 세포의 확정적인 성질을 유지하는데 중요한 유전자 및 인자를 발현하도록 함으로써 배아 줄기 세포-유사 상태로 유전적으로 재프로그래밍된 성체 세포이다. 2006년도에, 전사 인자를 코딩하는 4가지 특이적 유전자의 도입이 성체 세포를 다분화능 줄기 세포로 전환될 수 있음이 확인되었지만 (Takahashi, K; Yamanaka, S (2006), Cell 126 (4): 663-76), 후속 연구는 필요한 유전자의 개수를 감소/변경시켰다. Oct-3/4 및 특정한 개수의 Sox 유전자 패밀리가 유도 과정에 관여하는 잠재적으로 중요한 전사 조절자로서 확인되었다. Klf 패밀리, Myc 패밀리, Nanog 및 LIN28의 특정한 구성원을 비롯하여 추가의 유전자가 유도 효율을 증가시킬 수 있다. 재프로그래밍 인자에 함유될 수 있는 유전자의 예에는 Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, 베타-카테닌, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 및 Glis1이 포함되고, 이들 재프로그래밍 인자는 단일로 또는 그의 2가지 이상의 조합물로 사용된다.
추가의 연구, 예컨대 발달 또는 유전자 기능 연구를 위해 유전자 녹다운 또는 녹아웃을 이용하여 줄기 세포를 생성하는 것을 목적으로 하는 경우에는, 변형된 세포가 줄기 세포, 바람직하게는 다분화능 줄기 세포, 또는 성숙 세포 유형일 수 있다. 다분화능 줄기 세포의 공급원은 상기에서 논의되었다.
유도성 카세트의 삽입에 의해 변형된 세포가 인간 환자에서 사용되는 경우에는, 세포가 해당 개체로부터 유래된 iPSC인 것이 바람직할 수 있다. 이러한 자가유래 세포의 사용은 세포를 수용자에게 매칭할 필요성을 없앨 것이다. 대안적으로, 상업적으로 입수가능한 iPSC, 예컨대 위셀(WiCell®) (위셀 리서치 인스티튜트, 인크(WiCell Research Institute, Inc), 미국 위스콘신주)로부터 입수가능한 것들이 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 자가유래 또는 공여될 수 있는 조직-특이적 줄기 세포일 수 있다. 적합한 세포에는 외배반 줄기 세포, 유도된 신경 줄기 세포 및 다른 조직-특이적 줄기 세포가 포함된다.
특정한 실시양태에서, 사용된 세포가 배아 줄기 세포 또는 줄기 세포주인 것이 바람직할 수 있다. 수많은 배아 줄기 세포주가 현재 이용가능하며, 예를 들어 WA01 (H1) 및 WA09 (H9)는 위셀로부터 입수할 수 있고, KhES-1, KhES-2 및 KhES-3은 교토 대학 최첨단 의료 과학 협회 (Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University, 일본 교토)로부터 입수할 수 있다.
배아를 파괴하지 않고 배아 줄기 세포를 유래하는 것이 바람직할 수 있고, 특별하게는 세포는 인간이고, 이는 이러한 기술이 용이하게 이용가능하기 때문이다 (Chung, Young et al., Cell Stem Cell, Volume 2, Issue 2, 113 - 117). 배아를 파괴하지 않고 유래된 줄기 세포주 또한 이용가능하다. 한 측면에서, 본 발명은 인간 배아를 파괴하는 것을 포함하는 임의의 방법으로 확장되지 않는다.
본 발명의 바람직한 측면은 다분화능 줄기 세포에서 성숙 세포 유형으로의 포워드 프로그래밍이다. 따라서, 본 발명의 방법은 다분화능 줄기 세포로부터 성숙 세포 유형을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 이러한 측면에서, 제2 GSH에 삽입하기 위한 유도성 카세트는 바람직하게는 이전의 논의된 바와 같이 하나 이상의 마스터 조절자이다. 이들 유도성 카세트는 세포가 특정한 계통으로 프로그밍되는 것을 가능하게 하며, 성숙 세포 유형으로의 분화를 지시하기 위해 상이한 유도성 카세트가 사용될 것이다. 임의의 유형의 성숙 세포, 예컨대 비제한적으로 신경 세포, 근세포, 골세포, 연골세포, 상피 세포, 분비 세포 및/또는 혈액 세포가 고려된다.
본원의 본 발명자들은 사실상 임의의 성숙 세포 유형을 생성하기 위해 신속하고 효율적이며 확장가능한 방법을 개발하였다. 이러한 간단하고 저렴한 방법은 재생 의약에 대해 특별한 가치를 가질 것이다. 이전의 포워드 프로그래밍 기술은 Tet-On 시스템을 이용하였지만, 모든 물질을 하나의 벡터/부위 (올인원(all-in-one) Tet-On)에 포함시키려고 시도하거나 또는 유도성 카세트를 하나의 AAVS1 대립 유전자에 삽입하고 조절 시스템을 다른 AAVS1 대립 유전자에 삽입하려고 노력하였다 (DeKelver et al., 2010, Genome Res., 20, 1133-43 및 Qian et al., 2014, Stem Cells, 32, 1230-8). 놀랍게도, 본원에서 개발되고 기재된 이중 GSH 표적화 방법은 예측하지 못한 여러 이점을 갖는다. 제1 GSH에 삽입된 유전자와 제2 GSH에 삽입된 유도성 카세트의 유전자 서열 사이에는 잠재적인 프로모터 간섭이 없다. 두번째로, 각각의 부위에서 적은 물질이 삽입되어야 하기 때문에, 이는 벡터로부터의 더 큰 짐의 삽입을 가능하게 한다. 세번째로, 상기 방법은 안전하게 삽입된 카피의 개수를 최대화시킨다. 네번째로, 이는 더욱 융통성있는 설계를 가능하게 한다. 최종적으로, 이는 추가의 유전자 물질, 예컨대 리포터 유전자 및 miRNA 스위치가 삽입되는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 방법은 다분화능 세포로부터 성숙 세포를 제조하는 견고하고 효율적인 방식인 것으로 입증되었다.
유전자가 제1 GSH에 삽입되고, 트랜스진을 포함하는 유도성 카세트가 제2 GSH에 삽입된 경우, 다분화능 줄기 세포를 배양하여 포워드 프로그래밍이 일어나게 할 수 있다. 이들 배양 조건은 사용되는 다분화능 줄기 세포의 유형에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 궁극적인 성숙 세포 유형에 따라 좌우될 수 있다. 어떠한 배양 조건이 이용되건 간에, 외인성 물질은 유도성 카세트 내의 유전자 서열의 발현을 조절할 것이고, 연속적으로 공급된 다음, 이전에 논의된 바와 같이 그의 작동 방식에 따라 전사를 유도하기 위해 제거되거나 또는 전사가 필요할 때 공급될 수 있다.
줄기 세포를 프로그래밍하는 것을 목적으로 하는 경우에는, 마스터 조절자를 코딩하는 유도성 카세트의 공급과 함께 분화를 보조하기 위해 세포에 세포외 촉진을 제공하는 것이 유리할 수 있다. 세포성 재프로그래밍 전략은 마스터 조절자 또는 전사 인자 과발현을 세포외 신호전달 신호와 조합함으로서 강화될 수 있다. 따라서, 특정한 성숙 세포 유형의 발달에 관여하는 주요 신호전달 캐스케이드를 조절함으로써 분화전 인자에 대해 체계적인 스크리닝을 수행하는 것이 가능할 수 있다. 그 예는 실시예 3에서 확인된다.
한 측면에서, 본 발명은
다분화능 줄기 세포로부터 근세포를 제조하는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYOD1 유전자의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계이며, 여기서 상기 유도성 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고; 상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 단계, 및
레티노산의 존재하에 상기 세포를 배양하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
MYOD1 유전자는 근원성 분화 1 단백질을 코딩하는 유전자이다. 바람직하게는, 레티노산 (RA)은 전체-트랜스 RA이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 레티노산의 존재하에 다분화능 줄기 세포를 배양하는 것을 포함하는, MYOD1을 발현하는 다분화능 줄기 세포로부터 근세포를 제조하는 방법을 제공한다.
바람직하게는, RA는 전체-트랜스 RA이다. 바람직하게는, 세포는 과발현 MYOD1이다.
추가의 측면에서, 본 발명은
다분화능 줄기 세포로부터 희소돌기아교세포 근세포를 제조하는 방법이며,
a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
b) 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 SOX 10 유전자의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계이며, 여기서 상기 유도성 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고; 상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 단계, 및
레티노산의 존재하에 상기 세포를 배양하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
이를 위해 사용되는 세포는 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 세포가 동물인 경우에는, 동물이 상기 정의된 가축 동물인 것이 바람직하다.
SOX-10 유전자는 전사 인자 SOX-10을 코딩한다. 바람직하게는, 레티노산 (RA)은 전체-트랜스 RA이다.
본 발명의 방법에서 사용되는 세포가 다분화능인 경우에는, 생성된 세포가 마스터 조절자의 발현에 의해 원하는 성질을 갖는 계통 제한된-특이적 줄기 세포, 조상 세포 또는 성숙 세포 유형일 수 있다. 이들 계통-특이적 줄기 세포, 조상 또는 성숙 세포는 임의의 적합한 방식으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 성숙 세포는 적절한 경우 세포 유형에 따라 인간 또는 동물 신체로의 이식을 위해 직접적으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포는 유전자 발현에 대한 약물의 효과 및 약물과 특정한 유전자의 상호작용를 비롯한 연구를 위한 시험 물질을 형성할 수 있다. 연구를 위한 세포는 유전자 서열의 조절가능한 발현을 연구하기 위해 미지의 기능을 갖는 유전자 서열을 갖는 유도성 카세트를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 추가로, 이는 세포가 바람직한 물질, 예컨대 성장 인자 또는 사이토킨을 다량으로 생성하기 위해 사용되는 것을 가능하게 할 수 있다.
상이한 측면에서, 세포는 조직 조작에서 사용될 수 있다. 조직 조작은 조직을 대체하거나 또는 심지어 인간 또는 동물의 전체 장기를 대체하기 위해 사용될 수 있는 조직을 생성하는 것을 필요로 한다. 조직 조작 방법은 관련 기술분야의 기술자에게 공지되어 있으며, 세포가 조직/장기를 생성하기 위해 적용될 때 스캐폴드 (세포외 매트릭스)의 사용이 포함된다. 이들 방법을 이용하여 "인공" 호흡기관, 방광, 간, 췌장, 위, 장, 혈관, 심장 조직, 골, 골수, 점막 조직, 신경, 근육, 피부, 신장 또는 임의의 다른 조직 또는 장기를 생성할 수 있다. 조직을 생성하는 방법에는 조직을 제조하기 위해 세포를 직접 인쇄하는 것을 포함할 수 있는 삼차원 (3D) 인쇄로도 공지된 부가적인 제조가 포함된다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 임의의 측면에서 기재된 바와 같이 제조된 세포를 이용하여 조직을 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따라 제조된 세포를 이용하여 생성된 조직은 인간 또는 동물 신체로 이식하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 세포가 동물로부터의 것인 경우, 조직은 시험관내/배양육을 위해 사용될 수 있다. 배양육을 위한 일차 세포 유형은 근세포이다. 그러나, 이러한 조직은 본 발명의 방법에 따라 제조된 세포 유형들의 조합물을 사용하는 것을 포함한다. 이들은 근세포 (근육 세포), 혈관 세포, 혈액 세포 및 지방세포 (지방 세포)일 수 있다. 조작된 조직의 목적이 배양육을 위한 것이면, 세포를 가축 동물로부터 취할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 연구, 유전자 요법, 예컨대 유전자 백신, 시험관내 질환 모델의 제조 및 생체내 비-인간 모델의 제조를 비롯하여 다양한 이유로 다분화능 줄기 세포가 아닌 세포에 대해 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에서 사용되는 세포는 임의의 유형의 성체 줄기 세포일 수 있고, 이들은 전부는 아니지만 여러 세포 유형으로 발달할 수 있는 전문화되지 않은 세포이다. 성체 줄기 세포는 죽어가는 세포를 보충하고 손상된 조직을 재생하기 위해 분열하는, 체내에서 두루 발견되는 미분화된 세포이다. 이들은 체세포성 줄기 세포로도 공지되어 있으며, 다분화능을 갖지 않는다. 성체 줄기 세포는 여러 장기 및 조직, 예컨대 뇌, 골수, 말초 혈액, 혈관, 골격근, 피부, 치아, 심장, 소화관, 간, 난소 상피, 및 고환에서 확인되었다. 세포를 체세포성 줄기 세포로 표지하기 위해서는, 기술자는 단일 성체 줄기 세포가 유전적으로 동일한 세포주를 생성하여 조직의 모든 적절한 분화된 세포 유형으로 발생할 수 있음을 입증해야 한다. 추정 성체 줄기 세포가 실제로 줄기 세포임을 실험적으로 확인하기 위해, 세포는 배양물에서 유전적으로 동일한 이들 세포로 발생해야 하거나, 또는 이들 세포의 정제된 집단이 동물로 이식된 후에 조직을 다시 채워야 한다. 적합한 세포 유형에는 신경, 중간엽 및 내배엽 줄기 및 전구 세포가 포함되나 이로 제한되지 않는다.
대안적으로, 사용되는 세포는 성숙 세포 유형일 수 있다. 이러한 세포는 분화되고 전문화되었으며, 상이한 세포 유형으로 발달할 수는 없다. 성숙 세포 유형에는 신경 세포, 근세포, 골세포, 연골세포, 상피 세포, 분비 세포, 및/또는 혈액 세포가 포함되나 이로 제한되지 않는다. 성숙 세포 유형은 인간 또는 동물 신체로부터의 임의의 세포일 수 있다.
체세포성 줄기 세포 및 성숙 세포 유형은 본 발명에 따라 변형된 다음, 유전자 요법 또는 유전자 백신화와 같은 적용에서 사용될 수 있다. 유전자 요법은 치료 목적으로 세포의 핵에 외래 DNA를 의도적으로 삽입하는 것으로 정의될 수 있다. 이러한 정의에는 결함 유전자의 야생형 버전을 제공하기 위해 세포에 유전자 또는 유전자들을 제공하는 것, 표적 유전자 발현을 방해하는 RNA 분자에 대한 유전자를 첨가하는 것 (결함이 있을 수 있음), 자살 유전자 (예컨대, 무해한 전구약물 간시클로비르 (GCV)를 세포독성 약물로 전환시키는 효소 단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제 (HSV-tk) 및 시토신 데아미나제 (CD))를 제공하는 것, 면역화 또는 암 요법을 위한 DNA 백신 (예컨대, 세포 입양 면역요법) 및 치료 목적을 위해 세포로 유전자의 임의의 다른 제공이 포함된다.
전형적으로, 본 발명의 방법은 세포에서 전사를 위해, 특별하게는 DNA 백신에서 바람직하게는 발현을 위해 원하는 유전자 서열를 삽입하는데 사용될 수 있다. DNA 백신은 전형적으로 감염성 유기체의 DNA의 변형된 형태를 코딩한다. DNA 백신은 대상체에게 투여된 다음, 감염성 유기체의 선택된 단백질을 발현하고, 전형적으로 보호성인 해당 단백질에 대한 면역 반응을 개시한다. DNA 백신은 또한 암 면역요법 접근법에서 종양 항원을 코딩할 수 있다.
DNA 백신은 수많은 상태, 예컨대 비제한적으로 병원체, 예컨대 비제한적으로 진균, 바이러스, 예컨대 인간 유두종 바이러스 (HPV), HIV, HSV2/HSV1, 인플루엔자 바이러스 (유형 A, B 및 C), 폴리오 바이러스, RSV 바이러스, 리노바이러스, 로타바이러스, A형 간염 바이러스, 홍역 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 수두-대상포진 바이러스, 시토메갈로바이러스, 엡스타인-바르 바이러스, 아데노바이러스, 풍진 바이러스, 인간 T-세포 림프종 유형 I 바이러스 (HTLV-I), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), D형 간염 바이러스, 매독 바이러스, 지카 바이러스, 마르부르크 및 에볼라; 박테리아, 예컨대 뇌척수막염균, 헤모필루스 인플루엔자 (유형 b); 및 기생충 병원체에 의한 암, 알러지, 독성 및 감염을 치료 또는 예방하기 위한 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. DNA 백신은 임의의 적합한 병원체로부터의 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 항원은 인간 또는 수의학적 질환을 일으키는 병원체로부터의 것일 수 있고, 특히 바이러스 병원체로부터의 것일 수 있다.
GSH에 삽입된 DNA 백신은 또한 종양 항원을 코딩하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 종양 관련된 항원의 예에는 암-항원, 예컨대 MAGE 패밀리의 구성원 (MAGE 1, 2, 3 등), NY-ESO-I 및 SSX-2, 분화 항원, 예컨대 티로시나제, gplOO, PSA, Her-2 및 CEA, 돌연변이된 자가-항원 및 바이러스 종양 항원, 예컨대 종양발생 HPV 유형으로부터의 E6 및/또는 E7이 포함되나 이로 제한되지 않는다. 특정한 종양 항원의 추가의 예에는 MART-I, Melan-A, p97, 베타-HCG, GaINAc, MAGE-I, MAGE-2, MAGE-4, MAGE-12, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, PlA, EpCam, 흑색종 항원 gp75, Hker 8, 고분자량 흑색종 항원, Kl 9, Tyrl, Tyr2, pMel 17 유전자 패밀리의 구성원, c-Met, PSM (전립선 뮤신 항원), PSMA (전립선 특이적 막인 항원), 전립선 분비 단백질, 알파-페토단백질, CA 125, CA 19.9, TAG-72, BRCA-I 및 BRCA-2 항원이 포함된다.
삽입된 유전자 서열은 다른 유형의 치료적 DNA 분자를 생성할 수 있다. 예를 들어, 이러한 DNA 분자는 기능적 유전자를 발현하기 위해 사용될 수 있으며, 대상체는 해당 유전자의 기능이상 형태에 의해 초래되는 유전 장애를 갖는다. 이러한 질환의 예에는 뒤센(Duchenne) 근이영양증, 낭성 섬유증, 고쉐(Gaucher) 질환, 및 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍이 포함된다. 유전자 요법이 유용할 수 있는 다른 질환에는 염증성 장애, 자가면역, 만성 및 감염성 질환, 예컨대 AIDS, 암, 신경 질환, 심혈관 질환, 고콜레스테롤혈증, 다양한 혈액 장애, 예컨대 다양한 빈혈, 지중해 빈혈 및 혈우병, 및 기종이 포함된다. 고형 종양의 치료를 위해, 독성 펩티드를 코딩하는 유전자 (즉, 화학요법제, 예컨대 리신, 디프테리아 독소 및 코브라독 인자), 종양 저해자 유전자, 예컨대 p53, 형질전환 종양 유전자에 대해 안티센스인 mRNA 서열을 코딩하는 유전자, 항신생물성 펩티드, 예컨대 종양 괴사 인자 (TNF) 및 다른 사이토킨, 또는 형질전환 종양 유전자의 트랜스우성(transdominant) 음성 돌연변이체가 발현될 수 있다.
다른 유형의 치료적 DNA 분자 또한 고려된다. 예를 들어, 활성인 비-코딩 RNA 형태, 예를 들어 소형 간섭 RNA (siRNA)로 전사되는 DNA 분자를 삽입할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 유도성 카세트 내에서 비-코딩 RNA를 이용하여 내인성 유전자 발현을 녹다운시키거나 또는 내인성 유전자를 녹아웃시키는 방법으로 확장된다.
따라서, 본 발명의 방법을 이용하여, 조절가능하게 전사될 수 있는 유도성 카세트 내에 유전자 서열을 특이적이고 안정하게 삽입할 수 있다. 이는 체세포성 줄기 세포 및 성숙 세포 유형에서 수많은 이점을 갖는다. 이는 더욱 밀접하게 조절되는 유전자 요법 접근법을 가능하게 하여, 중요한 유전자가 방해되지 않도록 보장하고, 임의의 불리한 효과가 발생하는 경우에는 유도성 카세트의 발현을 중단시키는 것을 가능하게 한다. 이는 또한 유전자 기능 및 발달을 조사하기 위해 밀접하게 조절되는 내인성 유전자 녹다운 또는 녹아웃을 가능하게 한다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성된 세포로 확장된다. 세포는 제1 게놈 안전한 하버 부위에서 전사 조절자 단백질을 포함하고, 제2 유전자 안전한 하버 부위에서 전사 조절자 단백질에 의해 조절되는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 서열을 포함하도록 변형된 것으로 정의될 수 있다. 2가지 GSH는 상이하고 구별된다. 바람직하게는, 세포는 두 삽입 부위 모두에서 동형접합성이다. 모든 요소는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 임의의 방법에 따라 생성된 세포는 진단 및 치료 방법에 적용된다. 세포를 시험관 내에서 사용하여, 세포 발달을 연구하고, 새로운 약물에 대한 시험 시스템을 제공하고, 스크리닝 방법의 개발을 가능하게 하고, 치료 섭생법을 자세히 실험하고, 진단 시험 등을 제공할 수 있다. 이들의 사용은 본 발명의 일부를 형성한다. 대안적으로, 세포를 진단 또는 치료 목적을 위해 인간 또는 동물 환자에게 이식할 수 있다. 요법에서 세포의 사용 또한 본 발명에 포함된다. 세포는 동종이계성일 수 있거나 (즉, 제거되고 변형되어 동일한 개체로 되돌아간 성숙 세포) 또는 공여자 (예컨대, 줄기 세포주)로부터의 것일 수 있다.
본원에서 언급된 모든 문헌은 본원에 참고로 포함된다.
서열
AAVS1 - NCBI 젠뱅크 S51329.1
서열식별번호(SEQ ID No) 1: Tet02 19n 서열
서열식별번호 2: hROSA 삽입 부위 게놈 서열
서열식별번호 3: STDtetR-nls (뉴클레오티드) 및 서열식별번호 4 - STDtetR-nls (아미노산)
서열식별번호 5: OPTtetR-nls (뉴클레오티드) 및 서열식별번호 6 - OPTtetR-nls (아미노산)
서열식별번호 7 내지 80: 표 3으로부터의 프라이머.
서열식별번호 81: 도 18B AAVS1 FWD; 서열식별번호 82: 도 18B AAVS1 REV
서열식별번호 83: 도 18B 추적자 FWD; 서열식별번호 84: 도 18B 추적자 REV
서열식별번호 85: 도 19E HI POL3 FWD; 서열식별번호 82: 도 19E HI POL3 REV
이는 hROSA26 삽입 부위에 대한 게놈 서열이며; 이는 5' 상동성 아암, 절단 부위 (굵게), 및 3' 상동성 아암을 포함한다: (서열식별번호 2)
Figure pct00001
STDtetR-nls: (서열식별번호 3 및 4)
N-말단 SV40 핵 국부화 신호를 함유하는 테트라시클린-민감성 억제자 단백질 (tetR)의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 (nls, 회색으로 강조함). 서열은 코돈 최적화 이전 또는 이후에 보고된다 (각각 STDtetR 및 OPTtetR). 점은 OPTtetR에 도입된 동의(synonymous) 돌연변이를 나타낸다.
Figure pct00002
최적화된 tetR에 대한 서열: OPTtetR-nls (서열식별번호 5 및 6):
Figure pct00003
본 발명은 이제 하기 비제한적인 실시예와 관련하여 기재될 것이다:
실시예
실시예에서 사용된 물질 및 방법:
hPSC 유지 배양 및 배엽 분화
피더- 및 혈청-무함유 hESC (H9 라인; 위셀) 및 hiPSC (Cheung et al., Nat. Biotechnol. 30, 165-173 (2012)) 배양을 수행하였다. 간략히, 세포를 젤라틴/MEF 배지-코팅된 배양 디쉬 [어드밴스드(Advanced) DMEM/F12 (90%, 깁코(Gibco)), 태아 소 혈청 (10%, 깁코), L-글루타민 (1 mM, 깁코), 2-머캅토에탄올 (0.1 mM, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)) 및 페니실린/스트렙토마이신 (1%, 깁코)으로 구성된 MEF-배지] 상에 플레이팅하고, 10ng/ml 액티빈-A 및 12ng/ml FGF2로 보충되고 화학적으로 한정된 배지 [CDM; IMDM (50%, 깁코), F12 (50%, 깁코), 농축된 지질 (100x, 깁코), 모노티오글리세롤 (450 μM, 시그마-알드리치), 인슐린 (7 ㎍/ml, 로쉐(Roche)), 트랜스페린 (15 ㎍/ml, 로쉐), 소 혈청 알부민 분획 V (5 mg/ml), 및 페니실린/스트렙토마이신 (1%)으로 구성됨]에서 배양하였다. 세포를 5-6 일마다 콜라게나제를 사용하여 작은 무리에서 계대시켰다.
hPSC에서 배엽으로의 분화를 내배엽, 측판 중배엽, 및 신경외배엽에 대해 이전에 공지된 관련 분화 프로토콜에 따라 부착성 hESC 배양물에서 유도하였다 (Touboul, T. et al. Hepatology 51, 1754-1765 (2010), Cheung et al., (2012) 및 Douvaras, P. et al. Stem Cell Reports 3, 250-259 (2014)). 간략히, hPSC를 FGF2 (20ng/ml), 액티빈-A (100ng/ml), BMP4 (10ng/ml, 마르코 하이보넨(Marko Hyvonen), 캠브릿지 대학 생화학과(Dept. of Biochemistry, University of Cambridge)), 및 LY-294002 (10 μM, 프로메가(Promega)) 3으로 보충된 CDM-PVA (인슐린 없이)에서 3 일 동안 배양함으로써 확정적인 내배엽을 유도하였다. 신경외배엽의 유도의 경우, hPSC를 SB-431542 (10 μM, 토크리스(Tocris)), LDN-193189 (0.1 μM, 토크리스) 및 RA (0.1 μM, 시그마) 4로 보충된 CDM-BSA에서 6 일 동안 배양하였다. hPSC를 FGF2 (20 ng/ml), 10ng/ml BMP4 (R&D), 및 LY294002 (10μM)로 보충된 CDMPVA에서 36 시간 동안 배양하고, 이후 3.5 일 동안 FGF2 (20ng/ml) 및 BMP4 (50ng/ml)로 보충된 CDM-PVA에서 배양함으로써 측판 중배엽을 수득하였다.
hESC의 분화. 계대 48 시간 후에 hESC의 부착성 배양물에서 분화를 개시하였다. 배지 교체는 일반적으로 매일 수행되었고, 부피를 세포 밀도에 대해 조정하였다. 선행 기술에서 이전에 기재된 방법을 이용하여 성숙 세포 유형을 수득하였다. 수득된 성숙 세포 유형에는 신경 세포, 골세포, 연골세포, 평활근, 심장 섬유아세포, 심근세포, 장, 췌장, 간세포, 담관세포 또는 폐가 포함되었다.
유전자 표적화 구축물 및 분자 클로닝
hROSA26 gRNA 및 Cas9n 발현 플라스미드의 설계 및 구축이 여기에 기재된다: hROSA26 유전자좌를 특이적으로 표적화하고 상동성 재조합을 이용하여 유도성 카세트를 삽입하는 CRISPR/Cas9n 기반 전략. 정확한 통합 부위에서 게놈 DSB를 유도하기 위해, CRISPR/Cas9 닉카제 시스템을 설계하였다. 단일 gRNA가 그의 게놈 표적 부위로 전달되는 흔히 사용되는 야생형 Cas9 뉴클레아제와는 대조적으로, D10A 돌연변이성 Cas9 닉카제 (Cas9n)는 한 쌍의 적당하게 설계된 gRNA에 의해 지정되어, 표적 DNA의 두 가닥 모두에서 단일-가닥 절단을 동시에 도입시킨다. 이 전략은 게놈 편집을 위해 필요한 염기의 개수를 효과적으로 배가시켜서, 특이성을 증가시킨다. 웹-기반 소프트웨어 "크리스퍼 디자인 툴(CRISPR Design Tool)"을 사용하여, 통합 부위에 근접하여 있는 crRNA-가이딩된 뉴클레아제에 대한 잠재적인 표적 부위를 정의하였다. 표적 부위 주변의 250 bp의 서열 스트레치 (실제 통합 부위의 각 부위에 대해 125 bp) 내에서, 최고 히트는 97의 "높은 품질" 스코어에 집합적으로 도달하는 한 쌍의 gRNA를 생성하였고, 예상된 오프-타겟 효과는 없었다. gRNA [gRNA-A 5'-GTCGAGTCGCTTCTCGATTA-(TGG)-3' 및 gRNA-B 5'-GGCGATGACGAGATCACGCG-(AGG)-3' (괄호 안에 PAM 부위)를 데 노보(de novo)로 합성하여, 발현 벡터에 라이게이션시켰다. 최종 플라스미드는 각각 2개의 gRNA, 및 Cas9n D10A-돌연변이체를 코딩하였다 (도 20 및 21).
Cas9n-유도된 DSB의 상동성 지정된 복구를 용이하게 하기 위해 주형 DNA로서 작용하는 공여자 플라스미드를 구축하였다. 2개의 hROSA26 상동성 아암을 고충실도 PCR 증폭에 의해 생성하였다. H9 hESC로부터 단리된 게놈 DNA는 주형으로서 작용하였다. 5' 및 3' 상동성 아암은 각각 904bp 및 869bp 길이를 가졌다. 후속적으로, 둘 다를 pUC19 벡터의 다중 클로닝 부위에 삽입하였다. hROSA26 유전자좌를 표적으로 하기 위해, 세포를 플라스미드, 2개의 gRNA/Cas9n 구축물 및 EGFP 공여자 플라스미드로 트랜스펙션시켰다 (도 22).
pR26_CAG-rtTA 표적화 벡터 (도 23)는 제3 세대 rtTA의 코딩 서열 (pLVX-Tet3G로부터 PCR-증폭됨)을 pR26_CAG-EGFP의 BamHI/MluI 부위에 클로닝하여, EGFP 서열을 교체함으로써 구축하였다. AAVS1 ZFN 발현 플라스미드는 코수케 유사 박사 (Dr. Kosuke Yusa, 웰컴-트러스트 생어 인스티튜트(Wellcome-Trust Sanger Institute))의 후한 선물이었다. 유도성 EGFP AAVS1 표적화 벡터는 깁슨 어셈블리 (Gibson Assembly, 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))에 의해 구축하였고, 3개의 삽입물을 pUC19 벡터의 다중 클로닝 부위의 EcoRI/HindIII 부위 (써모 피셔 사이언티픽)에 라이게이션시켰다: 제1 삽입물은 상류 AAVS1 상동성 아암, 스플라이스 수용자, T2A-부위 및 퓨로마이신 내성 카세트 (pTRE-EGFP로부터 PCR-증폭됨; 애드진(addgene) 22074, 루돌프 재니쉬(Rudolf Jaenisch)에 의해 기탁됨)를 포함하였다. 제2 삽입물은 유도성 TRE3G 프로모터 (pLVX-TRE3G로부터 PCR-증폭됨)를 함유하였다. 제3 삽입물은 EGFP 발현 카세트 및 AAVS1 하류 상동성 아암 (pTRE-EGFP로부터 PCR-증폭됨; 애드진 22074, 루돌프 재니쉬에 의해 기탁됨)을 포함하였다. 생성된 플라스미드는 pAAV_TRE-EGFP로 명명되었다 (도 32). pAAV_TRE-NGN2 및 pAAV_TRE-MYOD1 (도 33) 표적화 벡터는 각각 NGN2 및 MYOD1 코딩 서열 (NGN2: pLVX-TRE-NGN2로부터 PCR-증폭됨, 올리버 브뤼쓸(Oliver Brustle)로부터의 선물; MYOD1: 상업적으로 입수가능한 cDNA 플라스미드로부터 PCR-증폭됨, 오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems) MHS6278-202832821, 수탁: BC064493, 클론 ID: 5022419)을 pAAV_TRE-EGFP의 SpeI/EcoRI 부위에 클로닝하여 EGFP 서열을 교체함으로써 구축하였다.
유사한 방법을 이용하여 추가의 플라스미드 또한 생성하였고, 사용된 모든 플라스미드는 도 20 내지 33에 도시되어 있다. 이들 플라스미드는 생성되었거나 기부되었다. 실시예에서 사용된 플라스미드는 다음을 포함한다 (도 20 - 33의 순서로): pSpCas9n(BB),_R26-R, pSpCas9n(BB) (이들 두 플라스미드의 조합물은 염색체 3에서 THUMPDS3-AS1의 엑손 1과 2 사이에 있는 인트론에서 특이적 이중 가닥 파손을 유도하는 것으로 예측됨 (ROSA26 유전자좌)),_R26-L pR26_CAG_EGFP, pR26_CAG_rtTA, pZFN-AAVS1-L-ELD (아연 핑거 뉴클레아제 좌측), pZFN-AAVS1-R-KKR (아연 핑거 뉴클레아제 우측), pAAV_CAG_EGFP (공여자), pR26-Neo_CAG-OPTtetR (코돈-최적화된 tetR의 hROSA26 표적화), pAAV-Puro_iKD (유도성 shRNA의 AAVS1 표적화), pAAV-Neo_CAG-Cas9 (Cas9의 AAVS1 표적화), pAAV-Puro_siKO (유도성 gRNA의 AAVS1 표적화), pAAV-Puro_siKO-2TO (유도성 gRNA의 AAVS1 표적화, 프로모터에서 2개의 tet 오페론을 갖는 형태), pAAV_TRE-EGFP (EGFP 유도성 과발현, 부착됨) 및 pAAV_TRE-MYOD1 (근육에 대한 MYOD1 유도성 과발현).
유전자 표적화
유전자 녹다운 및 녹아웃을 위한 hROSA26 유전자좌 및 AAVS1의 표적화를 뉴클레오펙션에 의해 수행하였다. 인간 다분화능 줄기 세포 (PSC)를 TrypLE 셀렉트(Select, 깁코)에 의해 단일 세포로 분리하였고, 론자(Lonza) P3 일차 세포 4D-뉴클레오펙터 X 키트 및 론자 4D-뉴클레오펙터 시스템의 사이클 CA-137을 이용하여 2x106 세포를 뉴클레오펙션시켰다 (100㎕ 반응 부피; 총 12㎍의 DNA, 이는 마찬가지로 2개의 gRNA/Cas9n 플라스미드와 표적화 벡터 사이에서 분리됨). 뉴클레오펙션된 hPSC를 방사선 조사된 다중-약물 내성 (DR4) 마우스 배아 섬유아세포 상에 플레이팅하고, FGF2 (4ng/ml, 캠브릿지 대학 생화학과)로 보충된 KSR 배지 [어드밴스드 DMEM/F12 (80%), 녹아웃 혈청 대체제 (20%, 깁코), L-글루타민 (1 mM), 2-머캅토에탄올 (0.1 mM) 및 페니실린/스트렙토마이신 (1%)으로 구성됨]에서 배양하였다. 뉴클레오펙션 전후에 Y-27632 (5 μM, 토크리스)를 24 시간 동안 첨가하여 세포 생존을 촉진시켰다. 3-6 일 후에, 7-10 일 동안 G418 (50 ㎍/ml, 시그마-알드리치)을 첨가함으로써 네오마이신-내성 hPSC를 선별하였다. 후속적으로, 개별 클론을 채취하고, 피더-무함유 조건에서 확장시키고, 최종적으로 유전자형 분석에 의해 분석하였다.
AAVS1 유전자좌의 표적화 또한 리포펙션에 의해 수행하였다. 인간 PSC를 6-웰 플레이트에서 피더-무함유 조건하에 시딩하고, 계대 48 시간 후에 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션은 리포펙타민2000 (10 ㎕/웰, 써모 피셔 사이언티픽) 및 총 4 ㎍의 DNA (마찬가지로 2개의 AAVS1 ZFN 플라스미드와 표적화 벡터에서 분리됨)로 보충된 Opti-MEM (깁코)에서 24 시간 동안 수행하였다. 3-5 일 후에, 5-8 일 동안 퓨로마이신 (1 ㎍/ml, 시그마-알드리치)을 첨가함으로써 내성 hPSC를 선별하였다. 후속적으로, 개별 클론을 채취하고, 확장시키고, 유전자형 분석에 의해 분석하였다. 항생제 내성을 이용하여 클론 라인을 선별할 수 있다.
표적화 실험으로부터의 약물-내성 hPSC 클론을 게놈 PCR에 의해 스크리닝하여, 부위-특이적인 유도성 카세트 통합을 확인하고, 표적화된 대립 유전자의 개수를 측정하고, 오프-타겟 통합을 배제시켰다. PCR은 롱앰프(LongAmp) Taq DNA 폴리머라제 (뉴 잉글랜드 바이오랩스)를 이용하여 수행하였다. 표 2는 다양한 표적화 벡터를 위해 사용된 프라이머 조합을 보고한다. 모든 표적화 실험의 결과를 표 1에 요약하였다. 핵형 분석은 표준 G 밴딩 기술 (메디컬 제네틱스 서비스(Medical Genetics Service), 캠브릿지 대학 병원(Cambridge University Hospitals))에 의해 수행하였다. 염색체 분석을 위한 표적화된 인간 PSC를 제조하기 위해, 세포를 Y-27632 (5 μM, 토크리스) 및 KaryoMAX 콜세미드 (100 ng/ml, 깁코)로 보충된 새로운 배양 배지에서 +37℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, 세포를 단일 세포로서 수확하고, 세척하고, 펠렛화하였다. 저장성 0.055 M KCl-용액으로 5-10 분 동안 처리함으로써 염색체의 핵 팽창 및 전파를 달성하였다. 최종적으로, 세포를 메탄올 및 빙초산 (3:1 비)에 의해 고정시켰다.
OPTiKD의 경우, AAVS1 표적화를 이전에 기재된 바와 같이 리포펙션에 의해 수행하였다. 간략히, hPSC를 6-웰 플레이트에서 피더-무함유에 시딩하고, 세포 계대 48 시간 후에 Opti-MEM 배지 (깁코)에서 웰당 10 ㎕의 리포펙타민 2000을 사용하여 24 시간 동안 4 ㎍의 DNA (마찬가지로 2개의 AAVS1 ZFN 플라스미드와 표적화 벡터 사이에서 분리됨)에 의해 트랜스펙션시켰고, 모두 제조자의 지시에 따랐다. 4 일 후에, 1 ㎍ ml-1의 퓨로마이신을 배양 배지에 첨가하고, 개별 클론을 채취하고, 선별 7-10 일 후에 확장시켰다.
단일 부위 OPTiKO의 경우, AAVS1 표적화를 뉴클레오펙션에 의해 수행하였다. 16 시간 동안 10 μM Y-27632 (토크리스)로 사전-처리된 hESC를 아큐타제 (깁코)를 이용하여 2-8개 세포의 무리로 분리하고, 론자 P3 일차 세포 4D-뉴클레오펙터 X 키트 및 론자 4D-뉴클레오펙터 시스템의 사이클 CA-137을 이용하여 총 12 ㎍의 DNA (2개의 ZFN 플라스미드에 대해 각각 4 ㎍, 및 2개의 표적화 벡터에 대해 각각 2 ㎍)를 갖는 100 ㎕ 중에서 2 x 106 세포를 뉴클레오펙션시켰고, 모두 제조자의 지시에 따랐다. 뉴클레오펙션된 hESC를 방사선 조사된 DR4 (퓨로마이신 및 네오마이신 내성) 마우스 배아 섬유아세포의 피더 층에 플레이팅하고, 4 ng ml-1 FGF2 및 10 μM Y-27632로 보충된 KSR 배지에서 배양하였다 (이는 처음 24 시간 동안만 지속되었음). 4 일 후에, 퓨로마이신 및 네오마이신 내성 유전자 둘 다를 보유하는 hPSC 콜로니를 25 ㎍ ml-1 제네티신 (G418 술페이트, 깁코) 및 0.5 ㎍ ml-1 퓨로마이신에 의해 7-10 일 동안 선별하였다. 이어서, 개별 클론을 채취하고, 피더-무함유 조건에서 확장시켰다.
AAVS1-EGFP, ROSA26-EGFP, ROSA26-STDtetR, ROSA26-OPTtetR, 및 ROSA26-EGFPd2 hESC를 AAVS1 ZFN 또는 ROSA26 CRISPR/Cas9n 쌍을 갖는 표적화 벡터의 리포펙션 (AAVS1 유전자좌) 또는 뉴클레오펙션 (ROSA26 유전자좌)에 의해 생성하였다 (상기 기재됨). 2 ㎍ ml-1 블라스티시딘 S-HCl (깁코)을 pR26-Bsd_CAG-EGFPd2 플라스미드에 대해 사용하였다. ROSA26-rtTA 및 AAVS1-TRE-EGFP 트랜스진을 보유하는 유도성 EGFP 과발현 hESC의 생성은 다른 곳에서 기재된다. 간략히, 먼저 ROSA26 CRISPR/Cas9n 플라스미드에 의한 pR26-Neo_CAG-rtTA의 뉴클레오펙션, 이어서 AAVS1 ZFN 플라스미드에 의한 pAAVPuro_TRE-EGFP의 리포펙션을 이용하여 세포를 순차적으로 유전자 표적화시켰다.
유전자 표적화된 hPSC 클론 라인을 게놈 PCR에 의해 스크리닝하여, 부위-특이적인 표적화를 입증하고, 표적화된 대립 유전자의 개수를 측정하고, 표적화 플라스미드의 오프-타겟 통합을 배제시켰다 (도 16A 참고).
유도성 카세트 과발현
독시시클린 하이클레이트 (시그마-알드리치)를 배양 배지에 첨가함으로써 유도성 카세트 (각각 EGFP, NGN2, MYOD1 및 OLIG2-SOX10)의 과발현을 유도하였다. 달리 명시되지 않는다면, 독시시클린을 1 ㎍/ml의 최종 농도로 사용하였다. 독시시클린을 함유하는 배지를 빛으로부터 보호되도록 유지하고, 24 시간마다 교체하였다. 여기서 EGFP를 발현하는 세포는 OPTi-EGFP로 명명되고, NGN2를 발현하는 세포는 OPTi-NGN2로 명명되고, MYOD1을 발현하는 세포는 OPTi-MYOD1로 명명되고, OLIG2-SOX10을 발현하는 세포는 OPTi-OLIG2-SOX10으로 명명되었다.
유도성 유전자 녹아웃 및 녹다운
도면 설명 또는 실시예에서 달리 기재되지 않는다면, 테트라시클린 히드로클로라이드 (시그마-알드리치)를 1 ㎍ ml-1로 사용하여 유전자 녹다운 또는 녹아웃을 유도하였다.
뉴런의 유도
다분화능 OPTi-NGN2 세포를 TrypLE에 의해 단일 세포로 분리하고, 마트리겔 (35 ㎍/cm2, 사이언티픽 래버러토리 서플라이즈(Scientific Laboratory Supplies)) 코팅된 디쉬 상에서 12 웰 플레이트의 웰당 75.000 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 포워드 프로그래밍을 스플릿 24-48 시간 후에 개시하였다. 달리 명시되지 않는다면, 글루타맥스 (Glutamax, 100x, 깁코), 비필수 아미노산 (100x, 깁코), 2-머캅토에탄올 (50 μM), 페니실린/스트렙토마이신 (1%), 및 독시시클린 (1 ㎍/ml)으로 보충된 DMEM/F12 (깁코)에서 유도를 수행하였다. 유도 2 일 후에, 배지를 글루타맥스 (100x), B27 (50x, 깁코), BDNF (10 ng/ml, 페프로테크(Peprotech)), NT3 (10 ng/ml, 알앤디 시스템즈), 페니실린/스트렙토마이신 (1%), 및 독시시클린 (1 ㎍/ml)으로 보충된 뉴로바잘(Neurobasal)-배지로 교체하였다.
골격근세포의 유도
다분화능 OPTi-MYOD1 세포를 TrypLE에 의해 단일 세포로 분리하고, 젤라틴/MEF-배지 코팅된 디쉬 상에서 12 웰 플레이트의 웰당 100.000 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 포워드 프로그래밍을 스플릿 24-48 시간 후에 개시하였다. 달리 명시되지 않는다면, L-글루타민 (2 mM), 2-머캅토에탄올 (50 μM), 페니실린/스트렙토마이신 (1%), 인슐린 (7 ㎍/ml), 전체-트랜스 레티노산 (1 μM, 시그마-알드리치), 및 독시시클린 (1 ㎍/ml)으로 보충된 DMEM (시그마-알드리치)에서 유도를 수행하였다. 유도 5 일 후에, 배지를 CHIR99021 (3 μM, 토크리스) 및 열-불활성화된 말 혈청 (2%, 깁코)으로 보충하여 성숙을 강화시켰다.
희소돌기아교세포의 유도
다분화능 OLIG2-2A-SOX10 OPTi-OX hPSC를 젤라틴/MEF 코팅된 배양물 디쉬 상에서 콜로니로 성장시켰다. 유도를 시작하기 전에, 이들을 SB 및 LDN으로 밤새 처리하였다. 다음 날, 독시시클린 (1 ㎍/ml) 및 RA (0.1 μM)로 보충된 CDM에서 유도를 시작하였다. 유도 1 일 후에, PDL/라미닌 코팅된 배양물 디쉬 (12 웰-플레이트의 웰당 100.000 세포) 상에서 RA (0.1 μM), PM (1 μM), 및 Y-27632 (5 μM), PDGFaa (20 ng/ml, 페프로테크), FGF2 (5 ng/ml)로 보충된 CDM에서 세포를 스플릿시켰다. 다음 날, 세포를 글루타맥스 (100x), 비필수 아미노산 (100x), 2-머캅토에탄올 (1000x), 페니실린-스트렙토마이신 (100x), N2 보충제 (100x), B27 보충제 (50x), 인슐린 7 ㎍/ml (마르코 하이보넨(Marko Hyvonnen)), T3 60 ng/ml (시그마), 비오틴 100 ng/ml (시그마), db-cAMP 1 μM (시그마)으로 보충된 DMEM/F12로 구성된 희소돌기아교세포 배지로 교체하였다. 희소돌기아교세포 배지를 dox (1 ㎍/ml), PDGFaa (20 ng/ml), FGF2 (5 ng/ml), RA (0.1 μM) 및 PM (1 μM)으로 보충하였다. 유도 7 일 후에, RA 및 PM을 제거하였다. 유도된 세포를 증식 상태로 유지하기 위해, 세포를 미토겐 PDGFaa 및 FGF2의 지속적인 존재하에 4 일마다 계대시켰다 (24 웰 플레이트의 웰당 75.000 세포). 증식성 희소돌기아교세포 전구체의 분화를 위해, PDGFaa 및 FGF2를 제거하였다. 인간 재조합 NT3 (5 ng/㎕, 알앤디 시스템즈(R&D Systems))을 첨가하여, 세포 생존을 강화시켰다.
정량적인 실시간 PCR (qPCR)
젠일루트(GenElute) 포유류 총 RNA 미니프렙 키트(Miniprep Kit) 및 온-컬럼(On-Column) DNAse I 소화 세트 (시그마-알드리치)를 이용하여 RNA를 추출하였다. 맥시마 퍼스트 스트랜드(Maxima First Strand) cDNA 합성 키트 (써모 피셔 사이언티픽)를 이용하여 cDNA 합성을 수행하였다. 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) SYBR 녹색 PCR 마스터 믹스를 qPCR을 위해 사용하였다. 샘플을 어플라이드 바이오시스템즈 7500 신속 PCR 기계에서 작동시켰다. 모든 샘플을 기술적으로 이벌식으로 분석하였고, 하우스킵핑 유전자 포르포빌리노겐 데아미나제 1 (PBGD)에 대해 정규화하였다. 결과를 ΔΔCt 방법에 의해 분석하였다. 프라이머 서열에 대해서는 표 3을 참고한다.
유세포 분석
EGFP 발현의 분석을 위해, 세포를 TrypLE 셀렉트 (깁코)에 의해 37℃에서 5-10 분 동안 수확하여, 단일 세포 현탁액을 수득하였다. PBS로 세척한 후, 세포를 DAPI (10 ㎍/ml)로 보충된 빙온의 PBS에 재현탁시키고, 얼음 상에서 5 분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 시안(Cyan) ADP 유세포 분석기를 이용하여 분석하여, 생존가능한 세포의 EGFP 발현의 수준 (DAPI 음성)을 측정하였다. 미오신 중쇄 발현의 염색 및 분석을 위해, 세포를 TrypLE 셀렉트 (EGFP 발현 분석에 대한 것과 같음)에 의해 수확하고, PBS로 1회 세척하고, 고정시키고, 시토픽스/시토펌(Cytofix/Cytoperm) 용액 (비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))에 의해 투과화시켰다. 후속적으로, 세포를 세척하고, 3% 소 혈청 알부민 (BSA)으로 보충된 투과화/세척 완충제 (비디 바이오사이언시즈)에서 +4℃에서 밤새 차단시켰다. PE-접합된 항-MYH 항체 (표 4)에 의한 염색을 투과화/세척 완충제 중에서 어두운 곳에서 +4℃에서 1 시간 동안 수행하였다. 투과화/세척 완충제로 3회 세척한 후, 세포를 시안 ADP 유세포 분석기에 의해 분석하여, MHC 발현의 수준을 측정하였다. 데이터 분석은 플로우조(FlowJo) (v10) 및 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) (v6)에 의해 수행하였다.
웨스턴 블롯
전세포 단백질을 완전 프로테아제 억제제 (로쉐)로 보충된 셀라이틱(CelLytic) M (시그마-알드리치)에 의해 추출하고, 후속적으로 단백질 정량화 키트-래피드 (Protein Quantification Kit-Rapid, 시그마-알드리치)를 이용하여 정량화하였다. 단백질 전기영동을 NuPAGE LDS 샘플 완충제 및 4-12% NuPAGE 비스-트리스 프리캐스트 겔 (Bis-Tris Precast Gels, 인비트로겐(Invitrogen))에 의해 수행하였다. PVDF 상으로 단백질 운반 후, 0.05% 트윈-20 (PBST) 4% 밀크로 보충된 PBS로 실온에서 1 시간 동안 막을 차단시키고, PBST 4% 밀크 중에서 밤새 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 막을 PBST로 세척하고, PBST 4% 밀크 중에서 HRP-접합된 이차 항체 (시그마-알드리치)와 함께 인큐베이션하고, 피어스(Pierce) ECL2 웨스턴 블롯팅 기질 (써모 피셔 사이언티픽)과 함께 인큐베이션하고, 엑스-레이 수퍼 알엑스 필름즈 (X-Ray Super RX Films, 후지필름(Fujifilm))에 노출시켰다.
면역세포화학
세포를 4% 파라포름알데히드 (PBS 중에서 희석됨) 중에서 실온에서 20 분 동안 고정시키고, 후속적으로 PBS로 3회 세척하였다. 이어서, 세포를 10% 당나귀 혈청 (시그마-알드리치)으로 차단시키고, 0.3% 트리톤 X-100 (PBS 중에서 희석됨)에 의해 실온에서 20 분 동안 투과화시켰다. 후속적으로, 세포를 2% 당나귀 혈청 및 0.1% 트리톤 X-100 (PBS 중에서 희석됨) 중에서 적당히 희석된 일차 항체 (보충 실험 절차)와 함께 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 표면 항원 PDGFRA, A2B5 및 O4를 염색할 때 모든 단계 내내 트리톤-X를 생략하였다. PBS로 3회 세척한 후, 세포를 1% 당나귀 혈청으로 보충된 PBS 중에서 상응하는 당나귀 형광단-접합된 이차 항체 (알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 488, 555, 568, 및/또는 647)와 함께 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 핵을 4',6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI, 써모 피셔 사이언티픽)에 의해 가시화하였다. EGFP 발현 및 면역염색을 자이스(Zeiss) LSM 700 공초점 현미경 (레이카(Leica))을 이용하여 영상화하였다. 도립 올림푸스(Olympus) IX71 형광 현미경을 이용하여 3개 생물학적 복제물의 3개의 시야에서 적어도 50개의 무작위로 선별된 DAPI-양성 세포 중의 βIII-튜불린 발현을 측정함으로써 βIII-튜불린 양성 세포의 백분율을 계산하였다.
통계적 분석을 그래프패드 프리즘 (v6)에 의해 수행하였다. 복제물의 개수, 이용된 통계 검사, 및 검사 결과는 도면 설명에 기재되어 있다. 달리 명시되지 않는다면 데이터는 평균 ± SEM으로 제시된다.
실시예 1: EGFP의 이중 표적화
hPSC에서 유도성 과발현 플랫폼을 개발하기 위해, 본 발명자들은 Tet-ON 시스템의 2가지 성분을 2개의 상이한 GSH에 순차적으로 표적화하였다. 구성적으로 발현된 제3 세대 rtTA를 CRISPR/Cas9n-기반 표적화 전략을 이용하여 인간 ROSA26 (hROSA26) 유전자좌에 표적화하고, 유도성 EGFP 유도성 카세트를 AAVS1에 삽입하였다 (도 1a; 도 4a - c). hROSA26 및 AAVS1 표적화 둘 다 매우 효율적이었고 (도 4d-f, 표 1), hPSC 게놈 안정성, 자가-재생, 및 분화에 영향을 미치지 않았으며 (데이터는 도시되지 않음), 따라서 rtTA-의존성 세포 독성을 반박하였다.
이어서, 본 발명자들은 2개의 유도성 카세트 각각의 1개 또는 2개의 카피를 보유하는 이중 GSH-표적화된 클론을 선별하였다 (도 5a). rtTA의 동형접합성 표적화는 rtTA 단백질에 비해 대략 2배 더 높은 수준을 나타내었고 (도 5b), 이형접합성 rtTA 발현과 비교할 때 유도 이후 EGFP 수준 또한 유의하게 증가하였다 (도 5c-5e). 추가로, 유도성 EGFP 카세트의 동형접합성 표적화를 갖는 클론은 이형접합성 표적화를 갖는 라인과 비교할 때 더욱 높고 더욱 균일한 EGFP 수준을 나타내었다 (도 5c-5e). 중요하게는, 정확하게 표적화된 모든 라인은 견고한 유도성 EGFP 발현을 나타내었고, 이는 강력한 구성적인 CAG 프로모터에 비해 적어도 20배 더 높았다 (도 1b, 도 5c-e). 집합적으로, 이들 결과는 Tet-ON 시스템의 두 요소 모두의 2개의 카피를 표적화하는 것이 유도 이후 최대 발현을 나타낼 것이라는 본 발명자들의 초기 가설을 뒷받침한다. 유도 이후 대략 4 일째에 EGFP 수준의 피크에 도달하였고, 독시시클린 제거시 발현이 신속히 역전되었다 (도 1c). 더욱이, 독시시클린의 용량을 조정함으로써 EGFP 발현을 적정할 수 있었다 (도 1d). 중요하게는, 유도성 EGFP 발현은 hPSC에서 뿐만 아니라 배엽으로의 분화 동안에 매우 효율적이었다 (컬러 사진 데이터는 도시되지 않음, 도 6a-6d의 데이터). 최종적으로, 및 제3 세대 Tet-ON 시스템의 공지된 확실한 전사 조절과 일치하게, 독시시클린의 부재하에서는 각각 유세포 분석 및 qPCR에 의해 측정시 EGFP mRNA 또는 단백질의 검출가능한 백그라운드 발현이 없었다 (도 1b, 도 6d). 전반적으로, 이들 결과는, Tet-ON 시스템의 이중 GSH 표적화가 hPSC 및 그의 유도체에서 유도성 카세트의 최적의 발현을 위한 강력한 전략임을 정립하였다.
실시예 2: hESC 및 hiPSC로부터 흥분성 피질 뉴런의 유도
이전의 연구를 통해, 이들 세포가 hPSC에서 임의의 프로-뉴런 bHLH-인자 (ASCL1, NGN2, 또는 NEUROD1)의 렌티바이러스 과발현에 의해 용이하게 유도될 수 있음이 확인되었다. 따라서, 본 발명자들은 OPTi- NGN2 hPSC를 생성하였다 (도 2a, 표 1). NGN2 유도는 다분화능 인자의 신속한 하향조절 (도 7) 및 뉴런 전사 프로그램의 개시 (도 2b)를 일으켰다. 유도된 세포는 유도 이후 3 일만큼 초기에 뉴런 프로세스를 나타내었다 (데이터는 도시되지 않음). 1 주일 후에, 모든 세포는 뉴런 형태를 제시하였고, 전체-뉴런 마커 단백질, 예컨대 βIII-튜불린 및 MAP2를 발현하였다 (도 2c). 정량적인 RT-PCR은 전형적인 전뇌 마커, 예컨대 BRN2 및 FOXG1, 및 글루탐산성 뉴런, 예컨대 GRIA4 및 VGLUT2의 강력한 유도를 나타내었으며 (도 2b), 이는 흥분성 피질 뉴런 개체를 나타낸다. 집합적으로, 이들 결과는 전통적인 hPSC 분화 프로토콜에 비해 뉴런 생성의 속도 및 효율 둘 다에 있어서 극적인 개선, 및 전환분화 및 렌티바이러스-기반 포워드 프로그래밍 프로토콜 둘 다에 대한 효율 및 순도에 있어서 실질적인 증가를 입증하였다. 유사한 결과가 OPTi-NGN2 hiPSC에 의해 수득되었고, 이 방법의 견고성이 확인되었다. 최종적으로, 본 발명자들은 Opti-NGN2 hPSC의 연장된 배양 기간에 걸쳐 뉴런 유도의 효율에서 어떠한 하락도 관찰하지 않았다 (>25 계대, 도 2c). 전반적으로, 본 발명자들의 결과는, OPTi-NGN2 hPSC가 뉴런의 무제한적, 고도로 확장가능한, 신속한, 단일 단계, 바이러스-무함유, 및 거의 결정적인 생성에 대한 무한한 공급원으로 사용될 수 있음을 입증하였다.
실시예 3: 골격근세포의 생성
전사 인자 MYOD1은 다양한 체세포성 세포 유형에서 과발현될 때 근원성 전환분화를 유도하는 것으로 공지되었지만, hPSC가 MYOD1-유도된 근원성 포워드 프로그래밍을 진행하는 능력은 현재 논쟁 중이다. 본 발명자들은 OPTi-MYOD1 hPSC를 생성하였지만 (표 1), 본 발명자들은 독시시클린 처리 이후 MYOD1 발현의 유도가 hPSC에서 골격근세포로의 전환을 용이하게 하는 것으로 이전에 제안된 광범위한 배양 조건하에 3-5 일 내에 거의 완전한 세포 사멸을 일으켰음을 주목하였다. 세포 재프로그래밍 전략이 전사 인자 과발현과 세포외 신호전달 신호를 조합함으로써 강화될 수 있음이 널리 정립되어 있기 때문에, 본 발명자들은 원시선 형성, 체절형성 및 근육형성과 관련이 있는 주요 신호전달 캐스케이드를 조절함으로써 전근원성 인자에 대한 체계적인 스크리닝을 수행하였다. 본 발명자들은 MYOD1 과발현과 함께전체-트랜스 레티노산 (RA)의 첨가가 유도 이후 5 일째에 미오게닌 및 미오신 중쇄 (MHC) 이중-양성 근세포로의 신속하고 거의 완전한 전환을 일으켰음을 확인하였다. RA의 효과는 농도 의존성이며, RA-수용체 이소형 RARα 및 RARβ를 통해 매개되었고, 이는 발달 근육형성 동안에 RA 수용체의 발현 패턴과 일치하였다 (도 8). 이 효과는 MYOD1 과발현 메카니즘과는 무관한 것으로 여겨진다. 유도된 골격근세포는 전형적인 스핀들-유사의 신장된 형태를 나타내었고, 광범위한 세포 융합을 겪었으며, mRNA 및 단백질 수준 둘 다에서 강력한 근원성 마커 발현을 나타내었다 (도 3b, 도 9a - 9c). 나노몰 농도의 아세틸콜린 (ACh) 또는 선별성 ACh-수용체 효능제 카르바콜의 첨가는 완전한 근육 섬유 수축을 일으켰고, 이는 유도된 근세포의 기능성을 입증하였다. 유사한 결과가 Opti-MYOD1 hiPSC에 의해 수득되었다 (데이터는 도시되지 않음). 중요하게는, 근원성 유도 효율은 연장된 배양 기간에 걸쳐 감소하지 않았고 (>50 계대, 도 3d), 따라서 이 방법의 견고성 및 재현가능성을 입증하였다. 최종적으로, 본 발명자들은 MYOD1-유도성 카세트의 수준이 전환 효율과 양의 상관관계를 가짐을 주목하였으며, 이는 견고한 유전자-전달의 중요성, 및 렌티바이러스-매개된 재프로그래밍 접근법에 비해 이 방법의 우수성을 강조하였다 (도 10). 전반적으로, OPTi-MYOD1 포워드 프로그래밍 전략은 hPSC에서 골격근세포로의 가장 최근의 분화 프로토콜에 비해 대략 7배 더 빠르고 5배 더 효율적이었다. 이전의 포워드 프로그래밍 프로토콜에 비해 (Tanaka, A. et al. PLoS One 8, e61540 (2013) 및 Abujarour, R. et al. Stem Cells Transl. Med. 3, 149-60 (2014)), 이는 더욱 효율적이고 (>95% 대 30-80%), 무작위로 삽입된 유도성 카세트가 없고, 화학적으로 한정되고, 완전히 재현가능하며, 더욱 확장가능하다.
이들 발견은, hPSC에서 유도성 카세트 발현을 조절하는 이 방법이 균질한 세포 집단을 높은 처리 능력으로 대규모 제조하기 위한 무한한 공급원으로서 사용될 수 있음을 입증한다. 원하는 표적 세포의 유도 속도 및 순도는 현재 다른 방법에 비할 수가 없다.
실시예 4: 희소돌기아교세포 전구체 및 희소돌기아교세포의 생성:
바이시스트로닉 발현 카세트의 형태로 유도성 SOX10을 단독으로 또는 OLIG2과 함께 보유하는 OPTi-OX hPSC. SOX10 단독에 의해 유도된 세포가 유도 이후 10 일째에 희소돌기아교세포 전구체 (OPC) 마커 O4를 견고하게 발현하였지만, 이들 세포는 미엘린-발현 세포로 추가로 분화하는데 실패하였으며, 계속해서 사멸하였다. 대조적으로, OLIG2-SOX10 이중-과발현 세포는 유도 이후 20 일째에 O4-양성 조상 단계로부터 성숙 CNP/MBP-양성 표현형으로 용이하게 진행하였다. 더욱이, 추가의 마커 단백질 발현 분석을 통해, 미토겐 PDGFaa 및 FGF2로 보충된 희소돌기아교세포 배지에서 유도된 OPTi-OLIG2-SOX10 hPSC (Douvaras et al. 2014)가 먼저 OPC-유사 단계를 통해 계대하였으며, 이들은 매우 증식성이었고, PDGFRA, A2B5 및 O4를 공동 발현하였음을 확인하였다. 이들 세포는 매우 증식성이었고, 미토겐의 존재하에 배양함으로써 적어도 3회 계대 동안 유지될 수 있었다 (도 12b). 따라서, 본 발명자들은 이들 세포를 i-OPC (유도된 OPC)로 명명하였다. 현저하게, 미토겐을 제거한 후에 및 계속해서 독시시클린의 존재하에, i-OPC는 미엘린초를 형성할 수 있는 (데이터는 도시되지 않음) 주요 미엘린 단백질 CNP, PLP, MAG, MOG 및 MBP를 발현하는 성숙 희소돌기아교세포로 대략 1 주일 내에 용이하게 분화하였다 (도 12c-12d). 집합적으로, 이들 결과는, 본 발명이 희소돌기아교세포 전구체 및 희소돌기아교세포를 생성하기 위한 신규하고 견고하며 신속한 hPSC 포워드 프로그래밍 프로토콜의 개발을 가능하게 함을 입증하였다.
표 1: 유전자형 분석 결과의 요약:
Figure pct00004
(a) 부정확한 표적화: 표적화 증거 없음 (5'- 및 3'-통합 PCR에서 밴드 결여 및 유전자좌 PCR에서 WT 밴드 존재), 또는 표적화의 증거, 그러나 부정확한 크기의 5'- 또는 3'-통합 PCR.
(b) 플라스미드의 추가의 무작위 통합과 함께 정확한 온-타겟 통합 (3'-백본 PCR에서 밴드).
(c) 정확한 온-타겟 통합 (HET, 이형접합성; HOM, 동형접합성).
(d) 정확한 온-타겟 통합을 갖는 클론의 백분율 (추가의 오프-타겟 통합 없음)
(e) 정확한 온-타겟 통합을 갖는 클론의 백분율 (추가의 오프-타겟 통합이 있거나 없음)
* 3개의 숫자는 hESC에서 3회의 상이한 표적화 실험으로부터의 것이다.
표 2:
유전자형 분석 PCR에 사용된 프라이머의 목록
Figure pct00005
표 3: 정량적인 PCR을 위한 프라이머의 목록
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
표 4: 항체의 목록
Figure pct00009
Figure pct00010
실시예 5: TET-ON 유도성 녹다운 시스템
hPSC에서 최적화된 유도성 녹다운 플랫폼의 개발.
본 발명자들은 EGFP 트랜스진이 유도성 방식으로 침묵될 수 있는 것인 hESC 라인을 생성하였다 (도 14B). 이를 위해, 본 발명자들은 (1) CAG-tetR 발현 카세트를 ROSA26 유전자좌로 표적화하고; (2) CAG-EGFP 트랜스진 + 유도성 EGFP shRNA 카세트를 AAVS1 유전자좌로 표적화하였다 (도 14A,B). 높은 수준의 tetR 단백질을 더욱 강력하게 발현하기 위해 테트라시클린의 부재하에 shRNA 발현을 억제하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 다중-파라미터 RNA 및 박테리아 tetR cDNA 코돈 최적화를 수행하였고, 생성된 코돈-최적화된 tetR (OPTtetR)을 이용하여 새로운 EGFP 유도성 녹다운 hESC 라인을 생성하였다 (도 14B). 이 변형은 표준 서열과 비교할 때 tetR 발현의 10배 증가를 가능하게 하였다 (STDtetR; 도 14D). 추가로, OPTtetR의 동형접합성 발현은 효율적인 녹다운 유도를 완전히 보존하면서 shRNA 누출을 완전히 방지하는데 충분하였다 (도 14C). 중요하게는, 유도성 녹다운은 신속하고 가역적이며 용량 반응성이었다 (도 14E,F). 최종적으로, 유도성 hESC는 정상적인 핵형을 제시하였고 (데이터는 도시되지 않음), 이는 이들 라인을 생성하기 위해 필요한 게놈 조작이 그들의 유전자 안정성을 변경시키지 않았음을 입증한다.
이들 고무적인 결과를 기반으로 하여, 본 발명자들은 POU5F1/OCT4 또는 B2M에 대해 유도성 shRNA를 보유하는 hESC를 생성함으로써 내인성 유전자의 맥락에서 이 방법을 추가로 검증하였다 (데이터는 도시되지 않음). 현저하게, 분석한 모든 하위 라인 (각각의 유전자에 대해 6개)은 유의한 shRNA 누출없이 견고한 유도성 녹다운을 나타내었다. 테트라시클린 적정에 의해 OCT4를 부분적으로 또는 완전히 녹다운시키기 위한 최적의 농도를 확인하였다. 예상되는 바와 같이, OCT4의 강력한 감소는 구체적으로 신경외배엽 및 확정적인 내배엽 마커의 다분화능 및 유도를 상실시켰다. 유사한 결과가 20개 추가의 OCT4 유도성 녹다운 hESC 하위 라인에서 수득되었고, 이 방법의 견고성 및 재현가능성을 확인시켰다. 중요하게는, 강력하고 확실하게 조절된 녹다운을 갖는 hESC의 생성은, 표현형 분석이 세포의 혼합된 집단에 대한 항생제 선택 직후에 수행될 수 있도록 효율적이어서, 클론 단리를 위해 개별 콜로니를 채취할 필요가 완전히 없었다. 전반적으로, 이들 결과는, 최적화된 유도성 녹다운 시스템에 의한 GSH의 이중 표적화가 hPSC에서 유전자 발현을 조절하기 위한 강력한 방법임을 정립하였다. 이 접근법은 이후 OPTiKD (최적화된 유도성 녹다운)로 명명된다 (도 14A).
실시예 6
다양한 분화된 세포에서 유전자를 녹다운시키는 능력은 유도성 유전자 녹다운에 대한 이전의 시스템에 비해 유의한 진보를 나타낼 것이다. 이러한 가능성을 철저히 검사하기 위해, 본 발명자들은 OPTiKD 플랫폼이 3개의 배엽으로 분화된 hPSC에서 뿐만 아니라 13개의 완전히 분화된 세포 유형의 패널에서 EGFP 트랜스진을 녹다운시키는 능력을 분석하였다 (도 15A). 두 방법 모두의 경우, qPCR 분석은 시험한 모든 계통에서 EGFP 전사체의 강력한 유도성 녹다운을 입증하였다 (도 17). 현미경 관찰에 의해 EGFP 단백질 발현의 견고한 감소를 확인하였고, 유세포 분석은 대부분의 계통에 대해 70% 초과의 EGFP 형광 감소를 나타내었다 (데이터는 도시되지 않음).
실시예 7
hPSC에서 최적화된 유도성 CRISPR/Cas9 녹아웃 플랫폼의 개발
본 발명자들은 유도성 녹아웃 접근법의 개발에 관심을 돌렸다. 현재의 유도성 CRISPR/Cas9 방법은 구성적으로 발현된 gRNA의 존재하에 Cas9의 조건적 과발현에 의존한다. 이 경우에, Cas9 과발현의 조절은, 독시시클린 처리 이후 테트라시클린-조절된 역전사 촉진 인자 (rtTA)가 Pol II-의존성 테트라시클린 반응성 요소 (TRE) 프로모터 (다중 TET 오페론과 최소 CMV 프로모터 사이의 융합)를 활성화시키는 것인 TET-ON 방법에 의해 달성된다. 이 TET-ON 플랫폼이 특정한 인간 세포 유형에 성공적으로 적용되었지만, 본 발명자들은 심지어 AAVS1 GSH로 표적화된 후에도 이 유도성 시스템이 다중 계통 (예컨대, 심근세포, 간세포, 및 평활근 세포)으로의 hPSC 분화 동안에 침묵되었음을 관찰하였다 (데이터는 도시되지 않음). 본 발명자들은 유도성 shRNA 발현을 위해 개발된 것을 기반으로 하여 구성적으로 발현된 CAG 프로모터-유도된 Cas9와 유도성 gRNA 카세트를 조합함으로써 대안적인 중요한 방법의 개발 가능성을 연구하였다 (도 18A,B). 따라서, 본 발명자들은 형광 리포터 유전자가 유도성 방식으로 녹아웃될 수 있는 것인 hESC 라인을 생성하였다 (도 18C). 이를 위해, 본 발명자들은 AAVS1 유전자좌에서 유도성 EGFP gRNA 및 구성적인 Cas9 둘 다를 갖는 ROSA26-EGFPd2 리포터 hESC를 표적화하였고, 각각의 트랜스진은 2개의 대립 유전자 중 하나에 통합되었다. 이 이중 표적화 접근법은 신속하고 (<2 주), 효율적이었다 (두 트랜스진 모두를 함유하는 라인의 >90%). 현저하게, 개별 클론 하위 라인을 테트라시클린의 존재하에 성장시켰을 때, 본 발명자들은 모든 표적화된 라인에서 감소된 EGFPd2 발현을 관찰하였고, EGFPd2 동형접합성 세포는 테트라시클린 유도 이후 5 일만큼 초기에 리포터 유전자의 적어도 하나의 카피의 거의 균일한 상실을 나타내었다 (EGFPd2 형광에서의 50% 감소에 의해 입증됨). 테트라시클린으로의 장기간 처리는 75% 이하의 EGFPd2 동형접합성 세포에서 EGFPd2 형광의 점진적인 완전한 상실을 유도하였다 (데이터는 도시되지 않음). 흥미롭게도, 동일한 AAVS1 유전자좌로부터 동일한 EGFP gRNA 카세트의 2개 또는 3개의 카피의 공동-발현은 분석한 모든 클론 하위 라인에서 유도성 EGFPd2 녹아웃의 속도 및 효율을 유의하게 증가시키는데 충분하였다. 예를 들어, 동일한 gRNA의 3개의 카피의 동시 유도는 테트라시클린 처리 이후 현저한 95% 녹아웃 효율을 나타내었다. 중요하게는, 유도성 EGFPd2 녹아웃 hESC는 심지어 몇몇 gRNA 카피를 사용하였을 때에도 테트라시클린의 부재하에 장기간 배양 후에 EGFPd2 양성 세포의 비율 및 그들의 형광에서 임의의 유의한 감소를 나타내지 않았다. 이는 유도성 gRNA 발현이 확실하게 조절되었음을 입증한다. 최종적으로, EGFPd2에 대한 추가의 gRNA의 시험은, 유도성 녹아웃의 속도 및 효율이 gRNA에 대해 강력하게 의존적임을 나타내었다. 실제로, 최적의 서열은 유도 2 일 후에만 90%까지의 녹아웃을 가능하게 하였다. 중요하게는, 가장 효율적인 gRNA는 또한 조절되지 않는 EGFPd2 녹아웃을 나타내었지만, 훨씬 더 엄격한 전사 조절을 보장하기 위해 제2 TET 오페론을 유도성 H1 프로모터에 간단히 첨가함으로써 이러한 제한을 피할 수 있다. 집합적으로, 이들 결과는, 녹다운 시스템이 유도성 gRNA 발현을 뒷받침하도록 용이하게 용도 변경될 수 있고, 광범위한 gRNA 효능에 걸쳐 CRISPR/Cas9의 확실하게 조절된 활성을 가능하게 할 수 있음을 보여준다. 본 발명자들이 아는 한, 이는 유도성 gRNA 발현을 기반으로 하는 최초의 조건적 CRISPR/Cas9 접근법이다.
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65 aacagctgag ttccaaatga cc 22 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PLP Rev <400> 66 acggcaaagt tgtaagtggc 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POU3F2 (BRN2) Fw <400> 67 acccgcttta tcgaaggcaa 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POU3F2 (BRN2) Rev <400> 68 cctccataac ctcccccaga 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POU5F1 (OCT4) Fw <400> 69 gtggaggaag ctgacaacaa 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> POU5F1 (OCT4) Rev <400> 70 attctccagg ttgcctctca 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYR1 Fw <400> 71 caatcgccag aacggagaga 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RYR1 Rev <400> 72 gtcgtgttcc ctgtctgtgt 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC17A6 (VGLUT2) Fw <400> 73 gtagactggc aaccacctcc 20 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SLC17A6 (VGLUT2) Rev <400> 74 ccattccaaa gcttccgtag ac 22 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYP Fw <400> 75 acctcgggac tcaacacctc gg 22 <210> 76 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYP Rev <400> 76 gaaccacagg ttgccgaccc ag 22 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYN1 Fw <400> 77 ccctgggtgt ttgcccagat 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SYN1 Rev <400> 78 accacggggt acgttgtact 20 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TUBB3 Fw <400> 79 caaccagatc ggggccaagt t 21 <210> 80 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TUBB3 Rev <400> 80 ccgagtcgcc cacgtagtt 19 <210> 81 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVS1 targeting vector Fw <400> 81 gtgatagaga tccctggtgc aggtggactg actcacctgc acctgtttta ga 52 <210> 82 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAVSI targeting vector Rev <400> 82 actaaaacag gtgcaggtga gtcagtccac ctgcaccagg gatctctatc ac 52 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20 bp tracer Fw <220> <221> misc_feature <222> (5)..(24) <223> n = a or g or c or t, unknown or other <400> 83 tcccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24 <210> 84 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 20bp tracer Rev <220> <221> misc_feature <222> (5)..(24) <223> n = a or g or c or t, unknown or other <400> 84 aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24 <210> 85 <211> 268 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 POLIII Promoter H1-TO <400> 85 cgaacgctga cgtcatcaac ccgctccaag gaatcgcggg cccagtgtca ctaggcggga 60 acacccagcg cgcgtgcgcc ctggcaggaa gatggctgtg agggacaggg gagtggcgcc 120 ctgcaatatt tgcatgtcgc tatgtgttct gggaaatcac cataaacgtg aaatgtcttt 180 ggatttggga atcttataag ttccctatca gtgatagaga tccctggtgc aggtggactg 240 actcacctgc acctgtttta gagctaga 268 <210> 86 <211> 268 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 POLIII Promoter H1-2TO <400> 86 cgaacgctga cgtcatcaac ccgctccaag gaatcgcggg cccagtgtca ctaggcggga 60 acacccagcg cgcgtgcgcc ctggcaggaa gatggctgtg agggacaggg gagtggcgcc 120 ctgcaatatt tgcatgtcgc tatgtgttct gggaaatcac cataaacgtg aaatccctat 180 cagtgataga gacttataag ttccctatca gtgatagaga tccctggtgc aggtggactg 240 actcacctgc acctgtttta gagctaga 268

Claims (33)

  1. 세포에서 유전자 서열의 전사를 조절하는 방법이며,
    a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위(genetic safe harbour site)로의 표적화된 삽입 단계; 및
    b) 유도성 카세트의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
    를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 상기 유전자 서열을 포함하고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고;
    상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 유전자 서열이 트랜스진인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 유전자 서열이 비-코딩 RNA를 코딩하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 조절자 단백질의 활성이 외인성 공급 물질에 의해 조절되는 것인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 조절자 단백질이 구성적으로 발현되는 것인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 조절자 단백질이 테트라시클린 - 반응성 전사 활성자 단백질 (rtTa), 테트라시클린 억제자 (TetR), VgEcR 합성 수용체 또는 유전자 스위치 혼성체 전사 조절자 단백질, 및 그의 임의의 유도체 중 임의의 하나로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 조절자 단백질이 rtTA 또는 그의 임의의 유도체인 방법.
  8. 제5항에 있어서, tTA의 활성이 테트라시클린 또는 그의 유도체, 임의적으로 독시시클린에 의해 조절되는 것인 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 유도성 프로모터가 Tet 반응성 요소 (TRE)를 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 게놈 안전한 하버 부위가 hROSA26 유전자좌, AAVS1 유전자좌, CLYBL 유전자, CCR5 유전자 또는 HPRT 유전자 중 임의의 2가지로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 삽입이 세포의 둘 다의 염색체 상에서 일어나고/거나 상기 유도성 카세트의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 삽입이 세포의 둘 다의 염색체 상에서 일어나는 것인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 게놈 안전한 하버 부위에서 추가의 유전자 물질, 임의적으로
    a) 자살 유전자;
    b) 선별 마커;
    c) 리포터 유전자; 및/또는
    d) 비-코딩 RNA에 대한 유전자
    중 하나 이상이 삽입되는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 생체외에서 수행하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 다분화능 줄기 세포, 체세포성 줄기 세포 또는 성숙 세포로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다분화능 줄기 세포를 정의된 성숙 세포로 프로그래밍하기 위한 방법.
  16. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포가 다분화능 줄기 세포이고, 상기 유전자 서열이 하나 이상의 마스터 조절자, 임의적으로 전사 인자에 대한 트랜스진인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 유전자 서열의 전사가 세포를 정의된 성숙 세포 유형으로 포워드 프로그래밍(forward programming)시키는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 성숙 세포 유형이 하기 세포 유형: 신경 세포, 근세포, 골세포, 연골세포, 상피 세포, 분비 세포, 및/또는 혈액 세포 중 임의의 하나로부터 선택되는 것인 방법.
  19. 제14항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다분화능 줄기 세포가 유도된 다분화능 줄기 세포 (iPSC) 또는 배아 줄기 세포 (ESC)로부터 선택되는 것인 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 인간인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 유전자 요법의 목적을 위해 유전자 서열을 삽입하기 위한 방법이며, 임의적으로 유전자 서열이 야생형 단백질, 변형된 단백질, 항원, 효소, 선별 마커 또는 비-코딩 RNA 분자를 비롯한 단백질을 코딩하는 것인 방법.
  22. 제1항의 방법에 의해 제조된 세포.
  23. 제1 유전자 안전한 하버 부위에 삽입된, 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자, 및 제2 유전자 안전한 하버 부위에 삽입된, 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 유전자 서열을 포함하는 유도성 카세트를 포함하는 변형된 게놈을 갖는 세포이며, 상기 유도성 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고, 상기 제1 및 제2 부위는 상이한 것인 세포.
  24. 요법에서의 제22항 또는 제23항에 청구된 세포의 용도.
  25. 시험관내 진단을 위한 제22항 또는 제23항에 청구된 세포의 용도.
  26. 조직 조작, 임의적으로 배양육을 위한 제22항 또는 제23항에 청구된 세포의 용도.
  27. 다분화능 줄기 세포로부터 근세포를 제조하는 방법이며,
    a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
    b) 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 MYOD1 유전자의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계이며, 여기서 상기 유도성 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고, 상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 단계; 및
    레티노산의 존재하에 상기 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 방법.
  28. 다분화능 줄기 세포로부터 희소돌기아교세포를 제조하는 방법이며,
    a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
    b) 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 SOX-10 유전자의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계이며, 여기서 상기 유도성 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고, 상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 단계, 및
    레티노산의 존재하에 상기 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는 방법.
  29. 세포에서 내인성 유전자의 전사 및/또는 번역을 감소시키는 방법이며,
    a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
    b) 유도성 카세트의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
    를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 비-코딩 RNA 서열을 코딩하는 DNA를 포함하고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고, 상기 비-코딩 RNA 서열은 내인성 유전자의 전사 또는 번역을 저해하고;
    상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법.
  30. 세포에서 내인성 유전자를 녹아웃시키는 방법이며,
    a) 전사 조절자 단백질을 코딩하는 유전자 및 Cas9를 코딩하는 유전자의 제1 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계; 및
    b) 유도성 카세트의 제2 유전자 안전한 하버 부위로의 표적화된 삽입 단계
    를 포함하고, 여기서 상기 유도성 카세트는 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 가이드 RNA를 포함하고, 상기 프로모터는 전사 조절자 단백질에 의해 조절되고, 상기 gRNA 서열은 내인성 유전자를 표적으로 하고;
    상기 제1 및 제2 유전자 안전한 하버 부위는 상이한 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제21항 및 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 추가의 유도성 카세트 또는 트랜스진을 제1 및 제2 GSH와 상이한 추가의 GSH에 삽입하는 것인 방법.
  32. 서열식별번호 6과 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 상동성을 갖는 서열을 포함하는 최적화된 tetR 서열.
  33. MYOD1을 발현하는 다분화능 줄기 세포로부터 근세포를 제조하는 방법이며, 레티노산의 존재하에 상기 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
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