ES2918013T3 - Transcripción controlable - Google Patents

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Ludovic Vallier
Mark Kotter
Matthias Pawlowski
Alessandro Bertero
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Abstract

La presente invención se relaciona con un método estable para introducir al menos un cassette inducible en una célula y permitir la transcripción controlable desde ese casete inducible. El método puede usarse para cualquier tipo de célula, de cualquier organismo eucariota, pero tiene una aplicación particular en la introducción de casetes inducibles en células madre pluripotentes, como células madre pluripotentes animales o humanas (HPSC). El casete inducible se inserta controlablemente de tal manera que se asegure de que el material genético que contiene no esté silenciado o sujeto a influencias negativas del sitio de inserción, y la transcripción del material genético se controla. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Transcripción controlable
La presente invención se refiere a un procedimiento ex vivo estable para la introducción de por lo menos un casete inducible en una célula, y permitir la transcripción controlable desde dentro de ese casete inducible. El procedimiento se puede usar para cualquier tipo de célula, de cualquier organismo eucariótico, pero tiene una aplicación particular en la introducción de casetes inducibles en células madre pluripotentes, tales como células madre pluripotentes animales o humanas (hPSCs). El casete inducible se inserta de manera controlada de tal manera que se asegura que el material genético que contiene no sea silenciado o sometido a influencias negativas del sitio de inserción, y se controla la transcripción del material genético.
Antecedentes de la invención
La investigación de células madre mantiene la gran promesa de investigar el desarrollo humano, la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades, el descubrimiento de fármacos, y el trasplante de células. Más aún, las células derivadas de células madre permiten estudiar las respuestas fisiológicas y patológicas de las poblaciones de células humanas que no son accesibles fácilmente. A menudo esto conlleva el estudio de genes (y otras forma de mecanismos reguladores codificados en los ARNs no codificantes de proteínas - ARNnc). Desafortunadamente, la transcripción controlable o expresión de información genética en células humanas ha demostrado ser particularmente difícil.
Más aún, para muchos aspectos clave de la medicina regenerativa, el modelado de enfermedades, el descubrimiento de fármacos y el trasplante de células, se requiere la manipulación y fabricación de tipos de células humanas maduras de fuentes accesibles fácilmente. El control de la expresión de transgenes en células humanas es la base de la investigación biológica. Sin embargo, esto ha demostrado ser difícil en células humanas. Más aún, existe una necesidad real para la derivación in vitro de muchos tipos de células humanas altamente deseables en una cantidad y calidad adecuadas para fines de descubrimiento de fármacos y medicina regenerativa. Debido a que la diferenciación dirigida de las células madre en tipos de células deseadas a menudo es desafiante, han surgido otros enfoques, incluyendo la reprogramación directa de células en los tipos de células deseadas. En particular, la programación directa, como un procedimiento para convertir directamente las células madre pluripotentes, incluyendo hPSCs, a tipos de células maduras ha sido reconocida como una estrategia poderosa para la derivación de células humanas. Esta reprogramación implica la expresión forzada de factores de transcripción de linaje clave (o ARNs no codificantes, incluyendo ARNInc y microARN) para convertir la célula madre en un tipo particular de célula madura. También en este contexto, la expresión controlable de información genética en células humanas ha sido desafiante. Los protocolos de programación directa disponibles actualmente se basan en gran medida en la transducción lentiviral de células, lo que resulta en la expresión variegada o el silenciamiento completo de casetes inducibles insertados aleatoriamente. Esto resulta en etapas adicionales de purificación para aislar una subpopulación que expresa los factores de transcripción requeridos. Así, se requieren claramente refinamientos adicionales de estos procedimientos.
Aparte de la expresión inducible de transgenes, es muy deseable ser capaz de controlar la reducción de la expresión génica y la desactivación génica de genes u otras secuencias codificantes en las células, para permitir que se lleven a cabo estudios de pérdida de función. Los estudios de pérdida de función en células madre y tipos de células maduras proporcionan una oportunidad única de estudiar los mecanismos que regulan el desarrollo, las enfermedades y la fisiología humanas. Sin embargo, las técnicas actuales no permiten la manipulación fácil y eficiente de la expresión génica. Las técnicas actuales para introducir material tales como ARNs de horquilla corta inducible (ARNsh) en células madre para activar la reducción de la expresión génica del gen sufren de muchos de los inconvenientes vistos con la reprogramación directa discutida anteriormente, tal como el silenciamiento del transgén y efectos de posición que limitan la actividad. Así, existe una necesidad de desactivación génica y reducción de la expresión génica inducibles en genes en células madre que permitan estudios de pérdida de función en células madre.
Cualesquier refinamientos a los procedimientos anteriores debe asegurar que se logra la transcripción estable del material genético contenido dentro del casete inducible, tal como un transgén, que es resistente al silenciamiento y otras influencias negativas relacionadas con el sitio de integración. El silenciamiento puede ser provocado por múltiples mecanismos epigenéticos, incluyendo metilación de ADN o modificaciones de histona. Con los procedimientos de la técnica previa basados en la transducción lentiviral, las células obtenidas son una población heteróloga con el transgén expresado completamente, parcialmente o silenciado. Claramente, esto no es deseable para muchas aplicaciones. Los vectores virales demuestran una tendencia para integrar su material genético en áreas transcripcionalmente activas del genoma, aumentando así el potencial de eventos oncogénicos debido a la mutagénesis insercional.
Para muchas aplicaciones, es deseable controlar la transcripción de material genético insertado en una célula, de modo que un casete inducible se puede encender según se requiera y transcribirse a niveles particulares, incluyendo altos niveles. Esto no se puede lograr si la inserción del casete inducible es aleatoria en el genoma.
Los inventores así han desarrollado un procedimiento ex vivo para permitir la introducción estable de un casete inducible en el genoma de una célula, mientras es capaz de controlar la transcripción de ese casete inducible. Esto tiene beneficios en cualquier tipo de célula en la que se desee introducir un casete inducible y controlar la transcripción del material genético insertado, en particular en células madre pluripotentes. El casete inducible puede incluir cualquier material genético capaz de transcripción, por ejemplo un transgén o un ARN no codificante (ARNnc). El material incluido dentro del casete inducible será determinado por cuáles efectos se requieren de la célula madre, incluyendo la expresión de un transgén o reducción de la expresión génica o desactivación génica del gen.
Breve descripción de la invención
Los inventores han encontrado que es posible insertar un casete inducible y controlar la transcripción del material genético dentro de ese casete inducible al usar un sistema doble diana de anclaje seguro genómico. Ese procedimiento es altamente deseable, ya que hay una reducción en el riesgo de silenciamiento epigenético del material genético insertado, y es posible obtener una población homogénea de células que transcriben el casete inducible.
La presente invención así se refiere a un procedimiento ex vivo para controlar la transcripción de una secuencia genética en una célula, que comprende las etapas siguientes:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) inserción dirigida de un casete inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende dicha secuencia genética unida operativamente a un promotor inducible y dicho promotor es regulado por la proteína reguladora transcripcional;
donde dichos sitios de anclaje seguro genético primero y segundo son diferentes, y
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
La integración del casete inducible específicamente en los sitios de anclaje seguro genómico (GSHs) se prefieren sobre la inserción aleatoria en el genoma. Los GSHs han sido definidos previamente como “regiones intragénicas o extragénicas del genoma humano que son capaces de acomodar la expresión predecible de ADN recién integrado sin efectos adversos en la célula u organismo hospedero. Un anclaje seguro útil debe permitir suficiente transcripción de la secuencia genética insertada para producir niveles deseados de la proteína (via traducción adicional) o ARN no codificante. También, un GSH no debe predisponer las células a la transformación maligna ni alterar las funciones celulares” (Sadelain y col., 2012, Nature Reviews Cancer, 12(1), 51-8. doi:10.1038/nrc3179).
El primer sitio de anclaje seguro genético se utiliza para introducir un gen que codifica por lo menos una proteína reguladora transcripcional. Una proteína reguladora transcripcional (o factor de transcripción) aumenta la transcripción génica de un gen. La mayoría de los reguladores transcripcionales son proteínas de unión a ADN que se unen a mejoradores o elementos promotores-proximales unidos operativamente al gen.
En algunos aspectos, la proteína reguladora transcripcional se expresa constitutivamente, y se expresa permanentemente en una célula. La proteína reguladora transcripcional así se puede unir operativamente a un promotor constitutivo. Los promotores constitutivos dirigen la expresión génica uniformemente en la mayoría de los tejidos y células en todas las etapas de crecimiento y desarrollo. Los promotores constitutivos confieren altos niveles de expresión génica cuando se usan en los procedimientos de la presente invención.
Se puede insertar material genético adicional incluyendo genes en el primer GSH con la proteína reguladora transcripcional. Esos genes pueden incluir uno o más marcadores tal como proteína fluorescente verde (GFP) que puede usarse para mostrar, por ejemplo, que la proteína reguladora transcripcional ha sido insertada exitosamente. Otras opciones incluyen genes que permiten la edición de genes, por ejemplo Cas9 y derivados o CasL y derivados, y secuencas reporterar que se pueden usar para probar la expresión endógena o exógena de genes específicos en la célula.
El segundo GSH se utiliza para introducir un casete inducible donde la secuencia genética deseada está unida operativamente a un promotor inducible. Ese promotor permite la transcripción solo cuando se induce correctamente por la proteína reguladora transcripcional. La proteína reguladora transcripcional se puede controlar por una sustancia que se suministra exógenamente a la célula. Así, la presencia de la sustancia exógena puede permitir o bloquear la expresión del promotor inducible. Un ejemplo de esa expresión controlable es el sistema Tet-ON que se describe adicionalmente en esta invención.
Se pueden insertar casetes inducibles adicionales en GSHs adicionales, dichos GSHs son distintos del primero y segundo GSH mencionados anteriormente.
Una o más secuencias genéticas se pueden transcribir de manera controlada desde dentro del segundo GSH y/o el adicional. De hecho, el casete inducible puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 secuencias genéticas que se desean insertar en el GSH y cuya transcripción sea inducida de manera controlada.
La secuencia o secuencias genéticas que se desean insertar en el GSH o GSHs están presentes dentro del casete inducible, unidas operativamente a un promotor inducible. Estas secuencias genéticas pueden ser cualquier secuencia adecuada, que sean capaces de ser transcritas en el ARN una vez que la actividad del promotor ha sido inducida. Las secuencias genéticas adecuadas incluyen pero no se limitan a transgenes (genes que codifican proteínas, en los que el ARN producido es ARN mensajero (ARNm) se traduce en un polipéptido), ARN no codificante (ARNnc - incluyendo pero no limitado a ARNsh, ARN antisentido (ARNas), ARN guía (ARNg), microARN (miARN), ARN pequeño interferente (ARNsi), ARN trans-actuante (ARNtasi), antagomiros, aptámeros, esponjas de ARNmi, y cualquier otro ARN funcional).
Los casetes inducibles pueden incluir material genético adicional a ser insertado en el segundo GSH o el adicional. Ese material genético adicional puede incluir uno o marcadores tal como proteína fluorescente verde (GFP) para indicar que está ocurriendo la transcripción. Alternativamente, o adicionalmente, los genes tales como genes de resistencia a antibióticos o fármacos pueden permitir la selección de casetes inducibles insertados exitosamente. Más aún, puede ser deseable la expresión inducible de un gen particular para estudiar su función o de las secuencias que interferirán con su función. De igual manera, puede ser deseable la expresión de genes para mejorar u obstruir las funciones biológicas de la célula o influir en las células en otra parte del organismo, incluyendo la expresión de factores de crecimiento, hormonas peptídicas, incluyendo insulina etc.
Técnicamente, las inserciones en el primero y/o segundo GSH pueden ocurrir en un cromosoma, o en ambos cromosomas. El GSH existe en los mismos lugares genéticos en ambos cromosomas de organismos diploides. La inserción dentro de ambos cromosomas es ventajosa ya que puede permitir un aumento en el nivel de transcripción del material genético insertado dentro del casete inducible, logrando así niveles particularmente altos de transcripción.
Se pueden controlar las inserciones en los GSH mediante la inserción específica controlada de material genético en el GSH particular con base en la generación personalizada específica del sitio de rupturas de ADN de cadena doble (DSB) en el GSH. El material genético a continuación se puede introducir usando cualquier mecanismo adecuado, tal como recombinación homóloga. Se puede usar cualquier procedimiento de elaboración de un DSB específico en el genoma, pero los sistemas preferidos incluyen CRlSPR/Cas9 y versiones modificadas de los mismos, ZFNs y el sistema TALEN.
Además, la inserción del regulador transcripcional y/o casete inducible se puede diseñar para ser reversible y el material genético insertado se puede remover y/o reemplazar con y un regulador transcripcional/casete inducible alternativo según sea apropiado. Los procedimientos para reemplazar el regulador transcripcional y/o casete inducible forman parte de la invención. Ese reemplazo puede ser útil cuando un cultivo de células ha sido modificado exitosamente con un regulador transcripcional y/o un casete inducible, y es deseable reemplazar el regulador transcripcional y/o casete inducible. Esto toma ventaja de la inserción ya exitosa y puede permitir que se hagan inserciones más grandes. Para realizar este aspecto de la invención, las inserciones pueden incluir secuencias disociables para permitir la remoción de toda o parte de la inserción del GSH, tal como una porción de la inserción. Los procedimientos preferidos de remoción o reemplazo incluyen enfoques recombinatorios.
Además, la invención se refiere a vectores adecuados para la inserción del regulador transcripcional y/o casete inducible en el GSH.
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento ex vivo para controlar la expresión de un transgén en una célula, que comprende las etapas siguientes:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida de un transgén unido operativamente a un promotor inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho promotor inducible es regulado por la proteína reguladora transcripcional;
donde dichos sitios de anclaje seguro genético primero y segundo son diferentes, y
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
En este aspecto de la invención, el casete inducible descrito previamente comprende un transgén unido operativamente a un promotor inducible. En este aspecto de la invención, la secuencia genética deseada incluida dentro del casete inducible es un transgén, preferiblemente un gen que codifica una proteína. Así, la transcripción y traducción (expresión) del transgén se puede controlar dentro de la célula. La ventaja del presente procedimiento es que permite la sobre-expresón del transgén, si se requiere.
Además, en este aspecto de la invención, un transgén adicional idéntico o diferente se puede insertar en un GSH adicional, que es diferente del primero y segundo GSH. Ese transgén está unido operativamente a un promotor inducible como se describió anteriormente.
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento ex vivo para controlar la transcripción de un ARN no codificante en una célula, que comprende las etapas siguientes:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida de un casete inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende ADN que codifica una secuencia de ARN no codificante unida operativamente a un promotor inducible y dicho promotor es regulado por la proteína reguladora transcripcional;
donde dichos sitios de anclaje seguro genético primero y segundo son diferentes, y
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
Además, en este aspecto de la invención, un casete inducible adicional idéntico o diferente se puede insertar en un GSH adicional, que es diferente del primero y segundo GSH. Ese casete inducible puede comprender ADN que codifica una secuencia de ARN no codificante o cualquier otra secuencia genética unida operativamente a un promotor inducible y dicho promotor es regulado por la proteína reguladora transcripcional.
Más particularmente, este procedimiento permite la reducción de la expresión génica de un gen endógeno en la célula. Así, la presente invención proporciona un procedimiento ex vivo para reducir la transcripción y/o traducción de un gen endógeno en una célula, que comprende las etapas siguientes:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida de un casete inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende ADN que codifica una secuencia de ARN no codificante unida operativamente a un promotor inducible y dicho promotor es regulado por la proteína reguladora transcripcional y donde dicha secuencia de ARN no codificante suprime la transcripción o traducción de un gen endógeno;
donde dichos sitios de anclaje seguro genético primero y segundo son diferentes, y
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
Además, en este aspecto de la invención, un casete inducible adicional idéntico o diferente se puede insertar en un GSH adicional, que es diferente del primero y segundo GSH. Ese casete inducible puede comprender ADN que codifica una secuencia de ARN no codificante o cualquier otra secuencia genética unida operativamente a un promotor inducible y dicho promotor es regulado por la proteína reguladora transcripcional.
En cualquier aspecto o modalidad, el gen endógeno puede codificar una proteína o un ARN no codificante.
En los dos aspectos anteriores de la invención, el(los) casete(s) inducible(s) comprenden un ADN que codifica un ARN no codificante, es decir, un ARN que es funcional pero que no se traduce en proteína. Este ARN no codificante puede ser cualquier ARN adecuado, tales como esos discutidos previamente, pero es preferiblemente ARN de horquilla corta (ARNsh). En el último aspecto de la invención, el ARN no codificante puede efectuar la reducción de la expresión génica del gen en cualquier manera adecuada, al bloquear la transcripción o traducción del gen o prevenir la expresión en general. Finalmente, la expresión de dicho gen se reduce o bloquea, pero el gen mismo permanece intacto.
Alternativamente, el ARN no codificante comprendido dentro de la secuencia del casete inducible puede incluir ARNs que se pueden usar para desactivación génica de un gen endógeno en una célula, notablemente para reemplazar o interrumpir el gen mismo. Los ARNs no codificantes adecuados que se podrían usar para este aspecto de la invención incluyen elementos de la plataforma CRISPR/Cas9, más particularmente los ARNs guía (ARNg) que se dirigen para apuntar al gen endógeno.
Así, en un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento ex vivo para la desactivación génica de un gen endógeno en una célula, que comprende las etapas siguientes:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional y un gen que codifica Cas9 o un derivado del mismo en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida de un casete inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende un ARN guía unido operativamente a un promotor inducible y dicho promotor es regulado por la proteína reguladora transcripcional y donde dicha secuencia de ARNg se dirige al gen endógeno;
donde dichos sitios de anclaje seguro genético primero y segundo son diferentes, y
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
Además, en este aspecto de la invención, un casete inducible adicional idéntico o diferente se puede insertar en un GSH adicional, que es diferente del primero y segundo GSH. Ese casete inducible puede comprender cualquier secuencia genética unida operativamente a un promotor inducible y dicho promotor es regulado por la proteína reguladora transcripcional.
Así, en el aspecto anterior de la invención, la transcripción del ARNg se induce de manera controlada.
En esta invención se describe un procedimiento para reducir la transcripción y/o traducción de un gen endógeno en una célula, que comprende las etapas siguientes:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer alelo de un sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida de un casete inducible en un segundo alelo del mismo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende ADN que codifica una secuencia de ARN no codificante unida operativamente a un promotor inducible y dicho promotor es regulado por la proteína reguladora transcripcional y donde dicha secuencia de ARN no codificante suprime la transcripción o traducción de un gen endógeno.
En esta invención también se describe un procedimiento para la desactivación génica de un gen endógeno en una célula, que comprende las etapas siguientes:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional y un gen que codifica Cas9 o un derivado del mismo en un primer alelo de un sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida de un casete inducible en un segundo alelo del mismo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende un ARN guía unido operativamente a un promotor inducible y dicho promotor es regulado por la proteína reguladora transcripcional y donde dicha secuencia de ARNg se dirige al gen endógeno. Esas desactivaciones génicas o reducciones de expresión génica de una sola etapa son nuevas.
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento ex vivo para la programación directa de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida de un casete inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende una secuencia genética que codifica un factor de transcripción de linaje clave unido operativamente a un promotor inducible, dicho promotor inducible es regulado por la proteína reguladora transcripcional; y
donde dichos sitios de anclaje seguro genético primero y segundo son diferentes, y
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
Se puede(n) insertar casete(s) inducible(s) adicional(es) en GSHs adicionales distintos del primero y segundo GSH. La programación directa de células madre pluripotentes en tipos de células maduras particulares es altamente deseable y se puede lograr usando la plataforma de direccionamiento doble de la presente invención. Los procedimientos particulares para ciertos tipos de células se describen a continuación.
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento ex vivo para la producción de miocitos de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida del gen MYOD1 unido operativamente a un promotor inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho promotor inducible es regulado por la proteína reguladora transcripcional; donde dicho primero y segundo sitios de anclaje seguro genético son diferentes,
y cultivar dichas células en la presencia de ácido retinoico, donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
El gen MYOD1 es el gen que codifica la proteína 1 de Diferenciación Miogénica. Preferiblemente, el ácido retinoico (AR) es todo AR trans.
Preferiblemente, el AR es todo AR trans. Preferiblemente, las células sobre-expresan MYOD1.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento ex vivo para la producción de oligodendrocitos de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida de cualquier combinación de los genes SOX 10, OLIG2, NKX2.2, y NKX6.2 unidos operativamente a un promotor inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho promotor inducible es regulado por la proteína reguladora transcripcional; donde dicho primero y segundo sitios de anclaje seguro genético son diferentes,
y cultivar dichas células en la presencia de ácido retinoico,
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
Los genes SOX-10, OLIG2, NKX2.2, NKX6.2 codifican el factor de transcripción SOX-10, OLIG2, NKX2.2, y NKX6.2, respectivamente.
Breve descripción de las figuras
Las figuras 1A a 1D son la validación de un sistema doble de sobre-expresión dirigida de anclaje seguro genómico optimizado. Figura 1A Diseño de los vectores de direccionamiento del gen para los lugares hROSA26 y AAVS1. HAR: brazo de homología, SA: aceptor de empalme, T2A: T2A señal de salto ribosomal; Neo: gen de resistencia a neomicina; Puro: gen de resistencia a puromicina. pA: señal de poliadenilación; CAG: promotor CAG activo constitutivamente; rtTA: rtTA de tercera generación; TRE: Elemento Sensible a Tet inducible; EGFP: proteína fluorescente verde mejorada. La Figura 1B muestra la inducción de EGFP y la cinética de rescate (Figura 1C) en EGFP que expresa hESCs detectados por citometría de flujo (intensidad mediana de fluorescencia, MFI). Los resultados son de dos réplicas biológicas por punto de tiempo y se expresan como media ± SEM. Todos los valores se normalizaron a la intensidad máxima de fluorescencia después de 5 días de doxiciclina (referido como día 0 en la figura). La Figura 1D muestra la dosis-respuesta de Doxiciclina para la sobre-expresión de EGFP en EGFP que expresa hESCs después de inducción con doxiciclina por 5 días. Los resultados son de dos réplicas biológicas por condición, y se expresan como media ± SEM. Todos los valores se normalizaron a la intensidad máxima de fluorescencia medida en el experimento. Niveles de expresión de EGFP en hPSCs de CAG-EGFP constitutivos dirigidos a GSH y en hPSCs de TRE-EGFP inducibles dirigidos a GSH doble después de inducción con doxiciclina. Se incluyeron hPSCs de tipo silvestre y células TRE-EGFP no inducidas como controles negativos.
Las figuras 2A a 2D son un panorama general del enfoque experimental y resultados para la conversión rápida de etapa simple de hPSCs en células neuronales (i-Neuronas) después de tratamiento con doxiciclina (dox). La Figura 2A es un esquema de esta conversión, en la que las células transformadas de acuerdo con la invención con NGN2 se inducen para diferenciarse en células neuronales después de tratamiento de Dox. La Figura 2B demuestra el transcurso de tiempo de la programación directa de la generación de i-Neurona a partir de hESCs documentada por análisis de RT-PCR cuantitativo, que demuestra el patrón de expresión temporal de genes marcadores pan-neuronal (MAP2, SYP), cerebro anterior (Br N2, FOXG1) y neuronales glutamatérgicos (VGLUT2, GRIA4). Las células se analizaron en los días indicados de tratamiento de doxiciclina. Los valores se muestran con respecto al gen de mantenimiento endógeno PBGD y se normalizaron a las condiciones de pluripotencia. Los resultados son de tres réplicas biológicas por punto de tiempo y se expresan como media ± SEM.
La Figura 2C representa la cuantificación de células neuronales positivas a plIl-tubulina (TUBB3) por inmunotinción en i-Neuronas derivadas de hESCs después de una semana de inducción. Se usaron células no diferenciadas como control negativo (Control), y los números se reportan para la generación de i-Neurona en NGN2 recientemente aislado que expresa hESCs y después de 25 pasadas (+P25). La Figura 2D son fotografías de células que representan el transcurso de tiempo de la programación directa de la generación de i-Neurona a partir de hESCs vía imágenes de contraste de fase en serie que ilustran cambios morfológicos.
Las figuras 3A a 3D son programación directa de hPSCs en miocitos esqueléticos. La Figura 3A muestra un esquema de la conversión rápida de etapa simple de hPSCs en miocitos esqueléticos por sobre-expresión inducible de MYOD1 y tratamiento con ácido retinoico. La Figura 3B muestra análisis de RT-PCR cuantitativo del patrón de expresión temporal de genes marcadores de miocito durante la generación de i-Miocito de hESCs. Todos los valores se muestran con respecto a los hPSCs. Los resultados son de tres réplicas biológicas por punto de tiempo y se expresan como media ± SEM. Las Figuras 3C y 3D muestran la cuantificación de células positivas a MHC por citometría de flujo diez días después de la inducción demostrando que los hPSCs de OPTi-MYOD1 retienen su potencia miogénica incluso después de periodos de cultivo extendido y pasadas (p) después de la integración dirigida del sistema MYOD1. Se usaron células no diferenciadas como control negativo (Control), y las figuras se reportan para la generación de i-Miocitos en hESCs de OPTi-MYOD1 recién aisladas, o en las mismas células después de 50 pasadas (+P50).
Las figuras 4A a 4F son la strategia de direccionamiento para el sistema doble de sobre-expresión de Tet-ON diana de GSH. La Figura 4A representa el flujo de trabajo experimental para el direccionamiento secuencial de los lugares hROSA26 y AAVS1 en hPSCs. Clave: Cas9n: Endonucleasa Cas9 mutante de D10A nickasa de S. Pyogenes; ZFN: nucleasa de dedo de zinc; Neo: neomicina; Puro: puromicina; rtTA: Trans-Activador de tetraciclina inversa de tercera generación;. Esto representa un sistema de expresión de EGFP inducible (i-EGFP) La Figura 4B representa un esquema de la estrategia de direccionamiento de hROSA26. La Figura 4C representa la estrategia de direccionamiento de AAVS1. La clave para las figuras 4B y 4C: R26-prom: Promotor de lugar ROSA26 (gen THUMPD3-AS1); AAV-prom: Promotor de lugar AAVS1 (PPP1R12C gen); ZFN: nucleasas de dedo de zinc; 5'-Ha R/3'-HAR: brazo de homología en dirección 5'/en dirección 3'. SA: aceptor de empalme; T2A: T2A péptido; pA: señal de poliadenilación; CAG: Mejorador temprano de CMV, promotor híbrido de p-actina de pollo y p-globina de conejo; TRE: Elemento sensible a Tet; EGFP: proteína fluorescente verde mejorada. La Figura 4d representa el esquema de la estrategia de genotipificación usada para identificar líneas de hPSC diana a hROSA26 y AAVS1 apuntadas correctamente; GSH-prom: Promotor de GSH (hROSA26 y AAVS1, respectivamente); WT: tipo silvestre; casete inducible: secuencia exógena completa integrada después del direccionamiento. PCR de lugar: El PCR expandió el lugar diana con ambos cebadores uniéndose exclusivamente al ADN genómico fuera de la secuencia genómica correspondiente a los brazos de homología. Apreciar que debido a su alto contenido de GC el promotor de CAG no se puede amplificar por PCR de rutina. Por lo tanto, la inserción correcta del casete de expresión que contiene CAG resulta en la pérdida de in amplicón de PCR. La presencia de banda de tipo silvestre indica la presencia de alelos no dirigidos; la pérdida de la banda de tipo silvestre indica direccionamiento homocigoto. 5'-INT/3'-INT: PCRs: Los PCRs expandieron el sitio de inserción 5'- y 3'-, respectivamente. Los amplicones de PCR dimensionados correctamente indican la integración correcta. PCR de 3'BB: El PCR expandió la unión del brazo de homología/estructura principal del vector de direccionamiento. La presencia de un producto de PCR indica integración no específica fuera de la diana del plásmido del donador.
La Figura 4E es una fotografía en gel que muestra los resultados de genotipificación para hESCs de H9 heterocigotos (HET) y homocigotos (HOM) dirigidos a hROSA26-CAG-rtTA seleccionados. La Figura 4F es una fotografía en gel que muestra los resultados de genotipificación para hESCs de H9 heterocigotos (HET) y homocigotos (HOM) dirigidos a AAVS1-TRE-EGFP seleccionados. 1kb+: 1 kb más escalera de ADN; WT: tipo silvestre hESCs; PL: plásmido de direccionamiento; H2O: control de agua.
Las figuras 5A a 5E son el desarrollo de una plataforma de sobre-expresión inducible optimizada (OPTi-OX) basada en direccionamiento de GSH doble de hPSC. La Figura 5A muestra hESCs EGFP H9 inducibles dirigidos a GSH doble combinados en cuatro grupos experimentales dependiendo de si uno o ambos alelos de los lugares hROSA26 y AAVS1, respectivamente, se dirigieron exitosamente. La Figura 5B muestra la detección de la proteína de rtTA por transferencia Western en hESCs de H9 hROSA26-CAG-rtTA hetero- y homocigotos dirigidos exitosamente. Se incluyeron ESCs humanos portando un rtTA de segunda generación en una posición genómica aleatoria como muestra de control. a-tubulina: control de carga. La Figura 5C representa análisis de citometría de flujo para los ejemplos representativos de los diversos hESCs de EGFP inducibles dirigidos a GSH doble Figura 5A. La Figura 5D muestra la intensidad mediana de fluorescencia (MFI) de la expresión de EGFP en los diversos hESCs de EGFP inducibles dirigidos de GSH doble descritos en la Figura 5A. Las células se analizaron por citometría de flujo en condiciones de control (sin doxiciclina, CTR) o después de 5 días de tratamiento de doxiciclina (DOX). Cada punto de datos representa una línea clonal individual. Los hESCs de CAG-EGFP y hESCs de tipo silvestre (WT) se incluyeron para comparación. El análisis estadístico de los grupos tratados con doxiciclina (n=4-5, como se indica) demostraron que la expresión de los niveles de EGFP fueron los más altos en clones de homocigotos dobles (ANOVA de una vía con prueba de Dunnet post-hoc; F (2, 10) = 25.34, p=0.0001; **** p<0.0001; ** p=0.0026). Esta condición fue seleccionada para experimentos adicionales.
La Figura 5E muestra el porcentaje de células EGFP+ en los diversos hESCs de i-EGFP dirigidos de GSH doble descritos en la Figura 5(A).
Las figuras 6A a 6D son la caracterización de la plataforma OPTi-OX en hPSCs y durante la diferenciación de la capa germinal. La Figura 6A representa el análisis de citometría de flujo de los niveles de EGFP en hPSCs vivos dirigidos exitosamente y después de su diferenciación en el tratamiento de las tres capas germinales después de tratamiento con doxiciclina por cinco días. Las configuraciones de adquisición se establecieron para incluir los niveles altos de expresión inducida de EGFP (DOX,). Las poblaciones de control no inducidas (CTR) se ubican directamente al lado del eje e izquierdo. Las Figuras 6B y 6C muestran un resumen de los gráficos de citometría de flujo en la Figura 6A, incluyendo la intensidad mediana de fluorescencia (MFI) y el porcentaje de células EGFP+. La Figura 6D muestra un diagrama de barras de los resultados del RT-PCR cuantitativo de los niveles de expresión de ARNm de EGFP de células madre pluripotentes homocigotas y después de diferenciación en las tres capas germinales. WT: tipo silvestre;
La figura 7 es la caracterización de i-Neuronas humanas. Los resultados del RT-PCR cuantitativo demuestran una rápida sub-regulación de los factores de pluripotencia NANOG y OCT4 con el tratamiento con doxiciclina.
La figura 8 es la señalización de AR durante la inducción de miocito. Esta Figura muestra el análisis de qPCR de los seis retinoides y receptores retinoides durante la inducción de miocito que demustra la expresión de RARa, RARp y las tres isoformas de RXR, pero no de RARy a través de todo el transcurso de la inducción de i-miocito. A es a, B es p y G es y.
Las figuras 9A a 9C son la caracterización del desarrollo de hESCs de OPTi-MYOD1 en i-Miocitos humanos. La Figura 9A muestra el transcurso de tiempo de la programación directa de hPSCs de OPTi-MYODI en Miocitos inducidos. Los cambios morfológicos se documentaron con imágenes de contraste de fase automatizadas que se adquirieron cada 30min con un sistema de etapa de tiempo Nikon Biostación IM. Barras de escala: 200|jm. La Figura 9B representa los resultados de qPCR que demuestran la rápida sub-regulación de los factores de pluripotencia NANOG y OCT4 con el tratamiento con doxiciclina de hESCs de OPTi-NGN2 (gráfico izquierdo). Las cinco isoformas principales de cadena pesada de miocito específico de esqueleto humano (codificadas por la familia del gen MYH) se supra-regulan fuertemente durante la programación directa del miocito (gráfico derecho). Estos incluyen las dos isoformas que se expresan durante el desarrollo de músculo embrionario y posnatal (isoforma embrionaria MYH3; isoforma neonatal m YH8) y tres isoformas que se expresan normalmente en el músculo esquelético humano adulto [MYH7 en fibras de torcido lento (tipo I); MYH2 en fibras resistentes a fatiga de torcido rápido (tipo IIa), y MYH1 en fibras de fatiga rápida (tipo IIx)]. En contraste, el MYH4 que representa la isoforma de MHC constituyente en fibras de miocito de torcido rápido, de fatiga rápida en gatos no se expresa en cantidades significativas en humanos (<1%) y tampoco se induce a través de todo el transcurso del tiempo de la programación directa. La Figura 9C representa que los miocitos esqueléticos inducidos expresan un amplio intervalo de proteínas marcadoras típicas, incluyendo F-Actina (visualizada a través de la toxina Faloidina conjugada a AlexaFluor488), molécula de Adhesión a Célula Neura (NCAM), Desmina (DES), Cadena Pesada de Miosina (MYH), Titina (TTN), a-Actinina (ACTN2) y Troponina T (tNnT), pero no los marcadores de progenitor de mioblasto PAX3 y PAX7. Todas las muestras se contra-tiñeron con miogenina (MYOG). Barras de escala: 50pm. DAPI: tinción nuclear.
La figura 10 son estos tres gráficos representan los resultados del qPCR para el MYOD1 total, MYOD1 endógeno, y MYOG 2 días post-inducción de hPSCs de OPTi-MYOD1 con diferentes concentraciones de doxiciclina. Los resultados de qPCR se muestran 48h post-inducción con diferentes concentraciones de doxiciclina. La expresión se grafica con respecto al gen de mantenimiento endógeno PBGD.
La figura 11 es una representación del sistema Tet-ON. El Tet-ON consiste de dos componentes: En la parte superior se representa el casete activador, en el que un promotor constitutivo (cP) impulsa la expresión de rtTA (Trans-Activador de tetraciclina inversa). El RtTA es una proteína de fusión que consiste de una forma mutante del represor Tet procariótico (TetR) y el dominio trans-activador transcripcional VP16 (derivado del virus de herpes simple). Al fondo se representa el dominio del respondedor. Consiste de un promotor inducible (TRE, Elemento Sensible a Tet) y el gen de interés. El TRE es un promotor artificial sensible a rtTA. Consiste de 7 operones tet en serie (tetO7) y un promotor de CMV mínimo fuerte (mCMV), que por sí mismo no es activo y solo recluta la maquinaria transcripcional con la unión de rtTA a los siete operones tet. La doxiciclina, un derivado de tetraciclina, se requiere para la unión del TetR mutante al TRE, llevando a la expresión del casete inducible, en este caso EGFP. (pA: señal de poliadenilación).
Las figuras 12A a 12D son la programación directa de hPSCs en oligodendrocitos. La Figura 12A representa un esquema del enfoque experimental para la conversión rápida de hPSCs de OPTi-OLIG2-SOX10 en células de linaje de oligodendrocito (i-OPCs y i-OLs). La Figura 12B muestra la cuantificación de células positivas a BrdU después de 3 pasadas en serie cada 4 días y pulsos de BrdU concomitantes cada uno durando 4 días (P = número de pasada). La Figura 12C muestra el análisis de RT-PCR cuantitativo del patrón de expresión temporal de genes que codifican para las proteínas asociadas a mielina (CNP, MAG, MBP, MOG, y PLP) durante la generación de i-Oligodendrocito a partir de hPSCs. Los hPSCs OPTi-OLIG2-SOX10 se indujeron en medio de oligodendrocito suplementado con PDGFaa y FGF2. Después de una semana de inducción se retiraron los mitógenos para permitir la diferenciación terminal. Todos los valores se muestran con respecto al gen de mantenimiento endógeno PBGD y se normalizaron a las condiciones de pluripotencia. Los resultados son de 2 a 3 réplicas biológicas por punto de tiempo y se expresan como media ± SEM. La Figura 12D representa la cuantificación de células positivas a CNP y PLP por inmunotinción en i-oligodendrocitos derivados de hPSCs de OPTi-OLIG2-SOX10 después 20 días de inducción. Se usaron células sin diferenciar como control negativo, y las figuras se reportan para i-Oligodendrocitos en hPSCs de OPTi-NGN2 recién aislados y después 50 pasadas (+P50).
La Figura 13 es una representación esquemática de los principios de la presente invención. Esencialmente, esto representa la inserción en dos diferentes sitios de anclaje seguro genético en el núcleo de la presente invención. Una inserción controlas la expresión de la secuencia genética dentro del casete inducible en una segundo inserción. El material genético adicional se puede incluir en constructos de vector policistrónico como se muestra. Además, se pueden dirigir más den dos sitios de anclaje seguro genético, de modo que múltiples casetes inducibles u otro material genético se puede colocar bajo el control del modulador colocado en el primer sitio de GSH.
Las Figuras 14A a 14F son representaciones de los resultados que muestran el desarrollo de un sistema de reducción de la expresión génica inducible basado en direccionamiento de GSH doble de hSPCs. La Figura 14A muestra el enfoque experimental - H1 - H1 promotor, TO - operon tet, tetR - represor de tetraciclina. La Figura 14B es un esquema de los alelos transgénicos generados para obtener hESCs que expresan un transgén reportero de EFGP que podría ser silenciado usando un ARNsh de EGFP inducible. La Figura 14c muestra la expresión de EGFP en la ausencia o presencia de tetraciclina por 5 días en hESCs dirigidos con las combinaciones indicadas de ARNsh de EGFP inducible y tetR (STD = estándar de tipo silvestre, OPT = codón optimizado). Los hESCs doblemente dirigidos que no portaron el ARNsh de EGFP se usaron como controles negativos. n.s.=p>0.05 (no significativo), **=p>0.01, ***=p>0.001 VS misma línea tetR sin tet y sin ARNsh. La Figura 14D es una tranferencia western representativa para tetR en hESCs dirigidos a ROSA26 que expresa STD o OPT tetR. HET= direccionamiento a heterocigotos, HOM= direccionamiento a homocigotos. Los hESCs con integración aleatoria de STD tetR se muestran como una referencia positiva, mientras hESCs de WT h9 son controles negativos. La TUB4A4A es un control de carga. Se cargaron varias cantidades de proteína para facilitar la comparación cuantitativa. Figura 14E: La reducción de EGFP de la expresión génica y cinética de rescate en los hESCs de EGFP OPTiKD medidos por citometría de flujo (MFI) y qPCR (ARNm). Los resultados son de 2 cultivos independientes por punto de tiempo. Figura 14F: Curva de dosis-respuesta de tetraciclina para la reducción de la expresión génica de EGFP en hESCs de EGFP OPTiKD. Se reporta la concentración inhibidora máxima media (IC50). Los resultados son de 2 cultivos independientes por dosis, y se muestra la media.
Las figuras 15A, 15B y 15C son una validación de los lugares de ROSA26 y AAVS1 como GSH de buena fe. La Figura 15A muestra el enfoque experimental detrás de la generación de hPSCs reporteros de EGFP de GSH para probar la expresión de GSH durante la diferenciación. Las neuronas, oligodendrocitos, y astrocitos se obtuvieron en cultivos en volumen que contienen una mezcla de estos linajes celulares, mientras todos los otros tipos de células se generaron individualmente. La Figura 15B es un esquema de los alelos transgénicos reporteros de EGFP de ROSA26 y AAVS1. R26-prom: Promotor de lugar de ROSA26; AAV-prom: Promotor de lugar de AAVS1; 5'- HAR/3'-HAR: brazo de homología en dirección 5'/en dirección 3'; SA: aceptor de empalme; T2A: péptido T2A auto-disociante; Neo: resistencia a neomicina; Puro: resistencia a puromicina; pA: señal de poliadenilación; CAG: Promotor de CAG; EGFP: proteína fluorescente verde mejorada. Figura 15C: Expresión de EGFP en ausencia o presencia de tetraciclina por 5 días en hESCs diana con las combinaciones indicadas de ARNsh de EGFP inducible y tetR (tetR estándar de tipo silvestre, STDtetR, o tetR de codón optimizado, OPTtetR). Los hESCs doblemente dirigidos que no portaron el ARNsh de EGFP se usaron como controles negativos. Los resultados son de 2 a 3 líneas individuales por condición (tabla 1). n.s.=p>0.05 (no significativo), **=p<0.01,***=p<0.001 VS misma línea de tetR sin tet y sin ARNsh (ANOVA con comparaciones de Holm-Sidak post-hoc).
Las figuras 16A a 16D son una generación de hESCs reporteros de EGFP de ROSA26 y AAVS1. Figura 16A: Esquema del enfoque de direccionamiento de ROSA26 y de las estrategias de genotipificación usadas para identificar líneas dirigidas correctamente. Cas9n: Endonucleasa Cas9 mutante de D10A nickasa de S. Pyogenes. R26-prom: Promotor de lugar de ROSA26 (gen THUMPD3-AS1); 5'-HAR/3'-HAR: brazo de homología en dirección 5'/en dirección 3'; transgén: región integrada después del direccionamiento del gen; PCR de lugar: Producto de PCR del lugar de ROSA26 de tipo silvestre (indicando un alelo no diana); PCR de lugar/pérdida de alelo: El producto de PCR del aleo diana/PCR que falla si el transgén contiene el promotor CAG rico en GC (indicativo del direccionamiento esperado del transgén); 5' INT/3' INT PCR: Producto de pCr de la región de integración del extremo 5'/extremo 3' del transgén (indicativo del direccionamiento esperado del transgén); 5' BB/3' BB PCR: Producto de PCR de la estructura principal del vector de extremo 5'/extremo 3' (indicativo de integración de plásmido fuera de diana no específico). Apreciar que un direccionamiento similar y estrategias de genotipificación se aplicaron para el direccionamiento del lugar de AAVS1. Figura 16B: Esquema de los alelos transgénicos de ROSA26 generados para probar la mejor estrategia para la expresión de EGFP constitutivo (proteína fluorescente verde mejorada). ENDO-EGFP: EGFP impulsado por el promotor de ROSA26 endógeno (R26-prom; vector de direccionamiento pR26-Puro_ENDO-EGFP); EF1a-EGFP: El EGFP impulsado por el promotor 1a del factor de alargamiento (vector de direccionamiento pR26-Neo_EF1a-EGFP); CAG-Eg Fp : El EGFP impulsado por el promotor de CAG (vector de direccionamiento pR26-Neo_CAG-EGFP); sA: aceptor de empalme; Puro: resistencia a puromicina (puromicina N-acetiltransferasa); Neo: resistencia a neomicina (neomicina fosfotransferasa II); pA: señal de poliadenilación. Figura 16C: Cuantificación por citometría de flujo del porcentaje de células positivas a EGFP (EGFP+; se muestra la puerta), y de la intensidad mediana de fluorescencia de EGFP (MFI) en líneas clonales de hESC reportero de ROSA26-Eg Fp representativas, o hESCs de H9 de tipo silvestre.
Figura 16D: Porcentaje de células positivas a EGFP en hESCs reporteros de ROSA26-EGFP. Los resultados son para 3 clones con direccionamiento a ROSA26 heterocigotos por condición.
La figura 17 es una validación de las plataformas de reducción de la expresión génica inducible optimizadas después de diferenciación de hPSC. El gráfico muestra la expresión de EGFP medida por qPCR en ausencia (CTR) o presencia de tetraciclina por 5 días (TET) en los tipos de células indicados derivados de hESCs de EGFP OPTiKD (iKD) y sOPTiKD (siKD). Los niveles de EGFP se reportan con respecto a las condiciones de control en la misma línea para cada linaje individual. Las abreviaturas indican los linajes descritos en la Figura 15 (pluri: no diferenciado). Los resultados son de dos cultivos independientes por condición.
Las figuras 18A a 18D son un desarrollo de una plataforma de CRISPR/Cas9 inducible optimizada en hPSCs. La Figura 18A muestra el enfoque experimental para la generación de hPSCs de desactivación génica inducible (iKO). La Figura 18B representa un esquema del procedimiento de clonación para generar vectores de direccionamiento a AAVS1 con un casete inducible de ARNg. La Figura 18C muestra los alelos transgénicos generados para obtener los hESCs que expresa un transgén reportero de EGFPd2 que podría ser desactivado génicamente por CRISPR/Cas9 usando un ARNg de EGFP inducible (hESCs de EGFP sOpTiKO). Bsd: resistencia a blasticidina; EGFPd2: EGFP desestabilizado. Figura 18D: Cuantificación de citometría de Flujo de la cinética de desactivación génica inducible de EGFPd2 en células sOPTiKO de la Figura 19C (ARNg 2 - TO) y B (ARNg 3 - 2TO). El porcentaje de células positivas a EGFP fue monitoread diariamente después de la adición de tetraciclina. Los resultados son de 2 cultivos independientes.
Las figuras 19A a 19E son un desarrollo de una plataforma de desactivación génica de CRISPR/Cas9 inducible optimizada en hESCs. (Figuras 19A a 19D) representan la citometría de flujo representativa para la expresión de EGFPd2 en hESCs de EGFPd2 sOPTiKO homocigotos que portan las combinaciones indicadas de ARNg (2 o 3) y el promotor inducible (TO o 2TO, véase la figura 19E). Vectores de direccionamiento: pAAV-Puro_siKOEGFP-2 (Figura 19A), pAAV-Puro_siKO-2TO-EGFP-2 (Figura 19B), pAAV-Puro_siKO-EGFP-3 (Figura 19C), pAAV -Pu ro_s iKO-2TO-EGFP-3 (Figura 19D). Las células se cultivaron en la presencia de tetraciclina (TET) por 5 días, o se mantuvieron en condiciones de control (CTR) en la ausencia de tetraciclina. Apreciar que los histogramas han sido normalizados de modo que el área bajo la curva iguala a 1 (100%) para todas las muestras presentadas, para facilitar la comparación visual directa. Figura 19E: Secuencias de nucleótidos de promotores de H1 Pol III inducibles para el sistema sOPTiKO que contiene uno o dos operones tet (H1-TO y H1-2TO, respectivamente). Se resaltan las características de la secuencia clave. Los sitios cortados por la enzima de restricción usados para la clonación del ARNg se muestran (Figura 18B). DSE: elemento de secuencia distal; PSE: elemento de secuencia proximal; TETO2: operon tet; 1: posición de inicio de la transcripción de ARN.
Las Figuras 20 a 33 son representaciones de los mapas de varios plásmidos usados dentro de los Ejemplos de la presente solicitud. Estos son:
20) pSpCas9n(BB)_R26-R
21) pSpCas9n(BB)_R26-L
22) pR26_CAG_EGFP
23) pR26_CAG_rtTA
24) pZFN-AAVS1-L-ELD (nucleasa de dedo de zinc izquierdo)
25) pZFN-AAVS1-R-KKR (nucleasa de dedo de zinc derecho)
26) pAAV_CAG_EGFP (donador)
27) pR26-Neo_CAG-OPTtetR (direccionamiento de hROSA26 de tetR de codón optimizado)
28) pAAV-Puro_iKD (direccionamiento de AAVS1 de ARNsh inducible)
29) pAAV-Neo_CAG-Cas9 (direccionamiento de AAVS1 de Cas9)
30) pAAV-Puro_siKO (direccionamiento de AAVS1 de ARNg inducible,)
31) pAAV-Puro_siKO-2TO (direccionamiento de AAVS1 de ARNg inducible, versión con 2 operones tet en el promotor)
32) pAAV_TRE-EGFP ( sobre-expresión inducible de EGFP, unida)
33) pAAV_TRE-MYOD1 (sobre-expresión de MYOD1 inducible para el músculo)
Descripción detallada de la invención
Los inventores han desarrollado un procedimiento ex vivo que es útil para la transcripción inducible de secuencias genéticas comprendidas dentro de casetes inducibles en células eucarióticas, y específicamente células madre pluripotentes y su progenie.
Es particularmente aplicable a la programación directa de células madre pluripotentes, vía la sobre-expresión de casetes inducibles dentro de dicho célula madre que promueve el desarrollo de un particular tipo de célula madura. Además, también es aplicable a la reducción de la expresión génica o desactivación génica de las funciones endógenas dentro de la célula para estudiar la pérdida de la función o alterar las funciones celulares o el comportamiento en estas células. La reducción de la expresión génica o desactivación génica puede aplicar a los genes que condifican proteínas o a secuencias de ADN que codifican ARN no codificante. Puede ser la diana por los procedimientos de la presente invención ya sea por desactivación génica o por reducción de la expresión génica.
Este procedimiento se basa en el por lo menos direccionamiento doble de sitios de anclaje seguro en el genoma de la célula madre, con el sistema para la transcripción inducida dividido sobre dos o más GSH. Sin embargo, este procedimiento no se limita a las células madre, y se puede usar para modificar el genoma de cualquier tipo de célula, por ejemplo en investigación o en terapia génica. En los procedimientos de la invención se modifica un GSH para contener un regulador transcripcional que se requiere para inducir la transcripción de la secuencia genética contenida dentro del casete inducible insertado en un GSH diferente en otro lado en el genoma. El regulador transcripcional se expresa preferiblemente constitutivamente. Se prefiere que una sustancia/agente exógeno tenga que ser suministrado para controlar la actividad de la proteína reguladora transcripcional y así controlar la expresión del casete inducible. Ya que se usan por lo menos dos GSH separados en el procedimiento de la invención, hay un total de cuatro posibles lugares de inserción, ya que cada GSH existe en ambos cromosomas de un organismo diploide. Esto aumenta la cantidad de transcripción posible de la célula si los cuatro lugares se modifican usando el procedimiento de la invención. Un ejemplo de varios resultados de la inserción dirigida se muestra en la Figura 5A. Además, el procedimiento de la invención usa por lo menos dos diferentes sitios de GSH. Se entenderá que se podrían usar sitios de GSH adicionales para introducir reguladores transcripcionales adicionales, casetes inducibles o cualquier otro material genético incluyendo, pero no limitado a marcadores seleccionables, genes de resistencia a antibióticos o fármacos, genes relacionados al sistema CRISPR/Cas9 o genes de función desconocida.
Así, la presente invención se refiere a un procedimiento ex vivo para controlar la expresión de una secuencia genética insertada en una célula, que comprende las etapas siguientes:
a) la inserción dirigida de una secuencia genética que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida de un casete inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende dicha secuencia genética unida operativamente a un promotor inducible, y dicho promotor es regulado por la proteína reguladora transcripcional;
donde dichos sitios de anclaje seguro genético primero y segundo son diferentes, y
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
Además, en este aspecto de la invención, un casete inducible adicional idéntico o diferente se puede insertar en un GSH adicional, que es diferente del primero y segundo GSH. Ese casete inducible es como se describe en esta invención.
Se prefieren las inserciones específicamente dentro de sitios de anclaje seguro genético sobre la integración de genoma aleatorio, ya que se espera que sea una modificación más segura del genoma, y es menos probable que lleve a efectos secundarios indeseados tales como silenciamiento de la expresión del gen natural o provocar mutaciones que lleven a tipos de células cancerosas.
Un sitio de anclaje seguro genético (GSH) es un lugar dentro del genoma donde un gen u otro material genético se puede insertar sin ningún efecto dañino en la célula o en el material genético insertado. Lo más benéfico es un sitio de GSH en el que la expresión de la secuencia del gen insertado no se altera por ninguna expresión leída de parte a parte de genes vecinos y la expresión del casete inducible minimiza la interferencia con el programa de transcripción endógena. Se han propuesto criterios más formales que ayudan en la determinación de si un lugar particular es un sitio de GSH en el futuro (Papapetrou y col, 2011, Nature Biotechnology, 29(1), 73-8. doi:10.1038/nbt.1717.) Estos criterios incluyen un sitio que tiene (i) 50 kb o más desde el extremo 5' de cualquier gen, (ii) 300 kb o más desde cualquier gen relacionado a cáncer, (iii) 300 kb o más desde cualquier microRNA (miARN), (iv) ubicado fuera de una unidad de transcripción y (v) ubicado fuera de las regiones ultraconservadas (UCR). Puede no ser necesario satisfacer todos estos criterior propuestos, ya que el GSH ya identificado no cumple todos los criterios. Se piensa que un GSH adecuado cumplirá por lo menos 2, 3, 4 o todos de estos criterios.
Se pueden identificar sitios adicionales al buscar sitios donde los virus se integran naturalmente sin interrumpir la expresión génica natural.
Se puede usar cualquier GSH adecuado en el procedimiento de la invención, con base que el sitio permita la inserción de material genético sin efectos dañinos a la célula y permita la transcripción del material genético insertado. Los expertos en la técnica pueden usar estos criterios simplificados para identificar un GSH adecuado, y/o los criterior más formales establecidos anteriormente.
Para el genoma humano, se han identificado muchos sitios de GSH, y estos incluyen el lugar AAVS1, el lugar hROSA26 y el gen CLYBL. El gen CCR5 y el gen HPRT también han sido propuestos como posibles GSHs, e investigación adicional puede identificar uno o más de estos como GSHs en el genoma humano.
El lugar 1 del sitio de integración del virus adeno-asociado (AAVS1) se ubica dentro del gen de la subunidad 12C reguladora, proteína fosfatasa 1 (PPP1R12C) en el cromosoma 19 humano, que se expresa uniformemente y ubicuamente en tejidos humanos. Este sitio sirve como un lugar de integración específica para AAV serotipo 2, y así fue identificado como un posible GSH. El AAVS1 ha demostrado ser un entorno favorable para la transcripción, ya que comprende una estructura de cromatina abierta y aislantes cromosomales nativos que permiten la resistencia de los casetes inducibles contra el silenciamiento. No hay efectos adversos conocidos en la célula que resulten de la interrupción del gen PPP1R12C. Más aún, un casete inducible insertado en este sitio permanece activo transcripcionalmente en muchos diversos tipos de células. Así se considera que el AAVS1 es un GSH y ha sido utilizado ampliamente para la trangénesis dirigida en el genoma humano.
El sitio de hROSA26 ha sido identificado con base en la analogía de secuencia con un GSH de ratones (sitio #26 de aceptor de empalme orientado inverso de ROSA26). Aunque el sitio ortólogo ha sido identificado en humanos, este sitio no se usa comunmente para la inserción del casete inducible. Los presentes inventores han desarrollado un sistema de direccionamiento específicamente para el sitio de hROSA26 y así fueron capaces de insertar material genético en este lugar. El lugar hROSA26 es en el cromosoma 3 (3p25.3), y puede encontrarse dentro de la base de datos de Ensembl (GenBank:CR624523). Las coordenadas genómicas exactas del sitio de integración son 3:9396280-9396303: Ensembl. El sitio de integración cae dentro del marco de lectura abierto (ORF) del ARN no codificante largo de THUMPD3(cadena inversa). Ya que el sitio hROSA26 tiene un promotor endógeno, el material genético insertado puede tomar ventaja de ese promotor endógeno, o alternativamente se puede insertar unido operativamente a un promotor.
El intrón 2 del gen tipo Beta Citrato Liasa (CLYBL), en el brazo largo del cromosoma 13, fue identificado como un GSH adecuado ya que es uno de los puntos de interés de integración identificados de la phiC31 integrasa derivada de fago. Estudios han demostrado que los casetes inducibles insertados aleatoriamente en este lugar son estables y se expresan. Se ha demostrado que la inserción de casetes inducibles en este GSH no altera la expresión génica local (Cerbibi y col, 2015, PLOS One, DOI:10.1371). El CLYBL así proporciona un GSH que puede ser adecuado para uso en la presente invención.
El CCR5, que se ubica en el cromosoma 3 (posición 3p21.31) es un gen que codifica para el co-receptor principal de VIH-1. El interés en el uso de este sitio como un GSH surje de la mutación nula en este gen que parece no tener efectos adversos, pero predispone para la resistencia a infección de VIH-1. Se han desarrollado las nucleasas de dedo de zinc que apuntan al tercer exón, permitiendo así la inserción de material genético en este lugar. Dado que la función natural de CCR5 aún tiene que ser elucidada, el sito permanece un GSH aparente que puede tener utilidad para la presente invención.
El gen de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (HPRT) codifica una enzima transferasa que juega un papel central en la generación de nucleótidos de purina a través de la trayectoria de rescate de la purina. Así, se requiere trabajo adicional para asegurar que las inserciones en este sitio no alteran la función celular normal. Sin embargo, se ha propuesto como un sitio de GSH. Las inserciones en este sitio pueden ser más aplicables para tipos de células maduras, tal como modificación para terapia génica.
El GSH en otros organismos ha sido identificado e incluye los lugares ROSA26, HRPT e Hipp11 (H11) en ratones. Los genomas mamíferos pueden incluir sitios de GSH basados en pseudo-sitios de attP. Para esos sitios, la hiC31 integrasa, la recombinasa derivada de fago de Streptomyces, ha sido desarrollada como una herramienta de inserción no viral, porque tiene la habilidad de integrar un plásmido que contiene un casete inducible que porta un sitio de attB en pseudo-sitios de attP.
Los GSH también están presentes en los genomas de plantas, y la modificación de las células vegetales puede formar parte de la presente invención. Los GSH han sido identificados en los genomas de arroz (Cantos y col, Front. Plant Sci., 26 June 2014, Volume 5, Article 302, http://dx.doi.org/10.3389/fpls.2014.00302).
En los procedimientos de la invención, las inserciones ocurren en diferente GSH, así por lo menos se requieren dos GSH para el procedimiento de la invención. El primer GSH se modifica por la inserción de una proteína reguladora transcripcional. El segundo GSH se modifica por la inserción de un casete inducible que comprende una secuencia genética unida operativamente a un promotor inducible. También se puede insertar otro material genético con cualquiera o ambos de estos elementos. La secuencia genética unida operativamente a un promotor inducible dentro del casete inducible es preferiblemente una secuencia de ADN. La(s) secuencia(s) genética(s) del casete inducible codifican preferiblemente una molécula de ARN, y así son capaces de ser transcritas. La transcripción se controla usando el promotor inducible. La molécula de a Rn puede tener cualquier secuencia, pero es preferiblemente un ARNm que codifica una proteína, un ARNsh o un ARNg.
El primer GSH puede ser cualquier sitio GSH adecuado. Opcionalmente, es un GSH con un promotor endógeno que se expresa constitutivamente; que resultará en que la proteína reguladora transcripcional insertada se exprese constitutivamente. Un GSH adecuado es el sitio hROSA26 para células humanas. Alternativamente, la proteína reguladora transcripcional insertada se une operativamente a un promotor, preferiblemente un promotor constitutivo. Se puede usar un promotor constitutivo conjuntamente con una inserción en el sitio hROSA26.
Una proteína reguladora transcripcional es una proteína que se une al ADN, preferiblemente específicamente a la secuencia a un sitio de ADN ubicado en o cerca de un promotor, y ya sea que facilite la unión de la maquinaria de transcripción al promotor, y así la transcripción de la secuencia de ADN (un activador transcripcional) o que bloquee este procedimiento (un represor transcripcional). Esas entidades también se conocen como factores de transcripción.
La secuencia de ADN a la que se une una proteína reguladora transcripcional es llamada un sitio de unión de factor de transcripción o elemento de respuesta, y estos se encuentran en o cerca del promotor de la secuencia de ADN regulada.
Las proteínas del activador transcripcional se unen a un elemento de respuesta y promueven la expresión génica. Se prefieren esas proteínas en los procedimientos de la presente invención para controlar la expresión del casete inducible.
Las proteínas represoras transcripcionales se unen a un elemento de respuesta y previenen la expresión génica.
Las proteínas reguladoras transcripcionales pueden ser activadas o desactivadas por un número de mecanismos incluyendo la unión de una sustancia, interacción con otros factores de transcripción (por ejemplo, homo- o heterodimerización) o proteínas co-reguladoras, fosforilación, y/o metilación. El regulador transcripcional se puede controlar por activación o desactivación.
Si la proteína reguladora transcripcional es una proteína activadora transcripcional, se prefiere que la proteína activadora transcripcional requiera activación. Esta activación puede ser a través de cualquier medio adecuado, pero se prefiere que la proteína reguladora transcripcional sea activada a través de la adición a la célula de una sustancia exógena. El suministro de una sustancia exógena a la célula se puede controlar, y así la activación de la proteína reguladora transcripcional se puede controlar. Alternativamente, se puede suministrar una sustancia exógena para desactivar una proteína reguladora transcripcional, y luego retirar el suministro para activar la proteína reguladora transcripcional.
Si la proteína reguladora transcripcional es una proteína represora transcripcional, se prefiere que la proteína represora transcripcional requiera desactivación. Así, se suministra una sustancia para prevenir que la proteína represora transcripcional reprima la transcripción, y así se permite la transcripción.
Se puede usar cualquier proteína reguladora transcripcional adecuada, preferiblemente una que sea activable o desactivable. Se prefiere que una sustancia exógena se pueda suministrar para controlar la proteína reguladora transcripcional. Esas proteínas transcripcionales reguladoras también son llamadas proteínas reguladoras transcripcionales inducibles.
La Activación Transcripcional Controlada por Tetraciclina es un procedimiento de expresión génica inducible donde la transcripción se emcoemte o apaga reversiblemente en la presencia del antibiótico tetraciclina o uno de sus derivados (por ejemplo doxiciclina que es más estable). En este sistema, la proteína activadora transcripcional es proteína activadora transcripcional sensible a tetraciclina (rtTa) o un derivado de la misma. La proteína rtTA es capaz de unirse al ADN en secuencias operadoras de TetO específicas. Muchas repeticiones de esas secuencias de TetO se colocan en la dirección 5' de un promotor mínimo (tal como el promotor de CMV), que en conjunto forman un elemento de respuesta a tetraciclina (TRE). Existen dos formas de este sistema, dependiendo de si la adición de tetraciclina o un derivado activa (Tet-On) o desactiva (Tet-Off) la proteína rtTA.
En un sistema Tet-Off, la tetraciclina o un derivado de la misma se une a rtTA y desactiva el rtTA, volviéndolo incapaz de unirse a las secuencias de TRE, evitando de este modo la transcripción de los genes controlados por TRE. Este sistema fue descrito primero en Bujard, y col (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (12): 5547-51.
El sistema Tet-On está compuesto de dos componentes; (1) la proteína activadora transcripcional sensible a tetraciclina expresada constitutivamente (rtTa) y el promotor inducible sensible a rtTa (Elemento Sensible a Tet, TRE). Este se puede unir por la tetraciclina o sus derivados más estables, incluyendo doxiciclina (dox), resultando en la activación de rtTa, permiténdole unirse a las secuencias de TRE e induciendo la expresión de genes controlados por TRE. El uso de esto puede preferirse en el procedimiento de la invención. Este sistema se representa en la Figura 11.
Así, la proteína reguladora transcripcional puede ser la proteína activadora trasncripcional sensible a tetraciclina (rtTa), que se puede activar o desactivar por el antibiótico tetraciclina o uno de sus derivados, que se suministran exógenamente. Si la proteína reguladora transcripcional es rtTA, entonces el promotor inducible insertado en el segundo sitio de GSH incluye el elemento de respuesta a tetraciclina (TRE). La sustancia suministrada exógenamente es el antibiótico tetraciclina o uno de sus derivados.
Las variantes y proteínas de rtTa modificadas se pueden usar en los procedimientos de la invención, estas incluyen Transactivador Avanzado de Tet-On (también conocido como rtTA2S-M2) y Tet-On 3G (también conocido como rtTA-V16, derivado de rtTA2S-S2.
El elemento de respuesta a tetraciclina (TRE) generalmente consiste de 7 repeticiones de la secuencia de TetO bacteriana de 19bp separada por secuencias separadoras, junto con un promotor mínimo. Son posibles las variantes y modificaciones de la secuencia TRE, ya que el promotor mínimo puede ser cualquier promotor adecuado. Preferiblemente el promotor mínimo no muestra o muestra los mínimos niveles de expresión en la ausencia de unión a rtTa. El promotor inducible insertado en el segundo GSH puede así comprender un TRE.
Un sistema modificado basado en control de tetraciclina es el Sistema T-REx™ (Thermofisher Scientific), en el que la proteína reguladora transcripcional es una proteína represora transcripcional, TetR. Los componentes de este sistema incluyen (i) un promotor inducible que comprende un promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano fuerte (CMV) y dos sitios de operador 2 de tetraciclina (TetO2), y un represor de Tet (TetR). Las secuencias de TetO2 consisten de 2 copias de la secuencia de 19 nucleótidos, 5"-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3" separada por un separador 2 de pares de bases. En la ausencia de tetraciclina, el represor Tet forma un homodímero que se une con afinidad extremadamente alta a cada secuencia de TetO2 en el promotor inducible, y previene la transcripción del promotor. Una vez agregado, la tetraciclina se une con alta afinidad a cada homodímero del represor de Tet volviéndolo incapaz de unirse al operador Tet. El complejo de represor de Tet: tetraciclina a continuación se disocia del operador Tet y permite la inducción de la expresión. En este caso, la proteína reguladora transcripcional es TetR y el promotor inducible comprende dos sitios TetO2. La sustancia suministrada exógenamente es tetraciclina o un derivado de la misma.
También se describe un tetR de codón optimizado (OPTtetR). Este se puede usar en cualquier procedimiento descrito en esta invención, o para cualquier uso adicional donde es deseable la promoción inducible. Esta entidad fue generada usando la optimización de mulitparámetros de la secuencia de ADNc de tetR bacteriano. El OPTtetR permite un aumento de diez veces en la expresión de tetR cuando se compara con la secuencia estándar (STDtetR). La expresión de OPTtetR homocigoto de tetR fue suficiente para prevenir la filtración de ARNsh mientras se conserva la inducción de la reducción de la expresión génica en los Ejemplos. La secuencia para OPTtetR se incluye aquí, con la secuencia estándar mostrada como una comparación. Las secuencias con por lo menos 75%, 80%, 85% o 90% de homología para esta secuencia se reclaman de este modo, más particularmente 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 o 99% de homología. Los residuos que se demostró que cambiaron entre STDtetR y OPTtetR han sido indicados en las secuencias, y se prefiere que estos residuos no cambien en cualquier derivado de OPTtetR ya que se piensa que estos son importantes para las propiedades mejoradas. Cualquier derivado podría opcionalmente retener estas modificaciones en las posiciones indicadas.
Se conocen otros sistemas de expresión inducible y se pueden usar en el procedimiento de la invención. Estos incluyen el sistema Inducible de Control Completo de Agilent Technologies. Ese se basa en la homona de insecto ecdisona o su análogo ponasterona A (ponA) que puede activar la transcripción en células de mamíferos que son transfectadas con ambos del gen para el receptor de ecdisona Drosophila melongaster (EcR) y un promotor inducible que comprende un sitio de unión para el receptor de ecdisona. El EcR es un miembro de la familia del receptor de retinoide-X (RXR) de receptores nucleares. En humanos, el EcR forma un heterodímero con RXR que se une al elemento sensible a ecdisona (EcRE). En la ausencia de PonA, la transcripción es reprimida por el heterodímero.
Así, la proteína reguladora transcripcional puede ser una proteína represora, tal como un receptor de ecdisona o un derivado del mismo. Ejemplos del último incluyen el receptor sintético de VgEcR de Agilent technologies que es una fusión de EcR, el dominio de unión a ADN del receptor glutocorticoide y el dominio de activación transcripcional del Virus Herpes Simple VP16. El promotor inducible comprende la secuencia EcRE o versiones modificadas de la misma junto con un promotor mínimo. Las versiones modificadas incluyen la secuencia de reconocimiento de E/GRE de Agilent Technologies, en las que se han hecho las mutaciones a la secuencia. La secuencia de reconocimiento de E/GRE comprende elementos de reconocimiento de medio sitio invertidos para el receptor retinoide-X (RXR) y dominios de unión a GR. En todas las permutaciones, la sustancia suministrada exógenamente es ponasterona A, que remueve el efecto represor de EcR o sus derivados en el promotor inducible, y permite que se lleve a cabo la transcripción.
Alternativamente, los sistemas inducibles se pueden basar en el esteroide sintético mifepristona como la sustancia suministrada exógenamente. En este escenario, se inserta una proteína reguladora transcripcional híbrida, que se basa en el dominio de unión de ADN de la proteína GAL4 de levadura, un dominio de unión a ligando truncado (LBD) del receptor de progesterona humana y un dominio de activación (AD) del NF-kB humano. Esta proteína reguladora transcripcional híbrida está disponible de Thermofisher Scientific (Gene Switch™). La mifepristona activa la proteína híbrida, y permite la transcripción del promotor inducible que comprende secuencias activadoras en dirección 5' de GAL4 (UAS) y la caja de E1b TATA de adenovirus. Este sistema se describe en Wang, Y. y col (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180-8184.
La proteína reguladora transcripcional así puede ser cualquier proteína reguladora adecuada, una proteína ya sea activadora o represora. Las proteínas activadoras transcriptionales adecuadas son la proteína activadora transcripcional sensible a tetraciclina (rtTa) o la proteína reguladora transcripcional híbrida de Gene Switch. Las proteínas represoras adecuadas incluyen la versión de Tet-Off de rtTA, TetR o EcR. Las proteínas transcriptionales reguladoras se pueden modificar o derivatizar según se requiera.
El promotor inducible puede comprender elementos que son adecuados para la unión o interacción con la proteína reguladora transcripcional. La interacción de la proteína reguladora transcripcional con el promotor inducible se controla preferiblemente por la sustancia suministrada exógenamente.
La sustancia suministrada exógenamente puede ser cualquier sustancia adecuada que se une a o que interactúa con la proteína reguladora transcripcional. Las sustancias adecuadas incluyen tetraciclina, ponasterona A y mifepristona. Así, la inserción del gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en el primer GSH proporciona el mecanismo de control para la expresión del casete inducible que se une operativamente al promotor inducible y se inserta en un segundo sitio de GSH diferente.
El gen de la proteína reguladora transcripcional se puede proporcionar para inserción con otro material genético. Ese material incluye genes para marcadores o moléculas reporteras, tales como genes que inducencaracterísticas identificables visualmente incluyendo proteínas fluorescentes y luminiscentes. Ejemplos incluyen el gen que codifica la proteína fluorescente verde de medusa (GFP), que provoca que las células que la expresan brillen en color verde bajo luz azul/UV, luciferasa, que cataliza una reacción con luciferina para producir luz, y la proteína fluorescente roja del gen dsRed. Esos marcadores o genes reporteros son útiles, ya que la presencia de la proteína reportera confirma la expresión de la proteína del primer GSH, indicando una inserción exitosa. Los marcadores seleccionables pueden incluir además genes de resistencia a antibióticos u otros fármacos. Los marcadores o secuencias de gen reportero también se pueden introducir que permiten estudiar la expresión de endógenos (o genes exógenos). Esto incluye las proteínas Cas, incluyendo las proteínas CasL, Cas9 que habilitan la extirpación de los genes de interés, así como proteínas de fusión a Cas que median los cambios en la expresión de otros genes, por ejemplo al actuar como mejoradores o represores transcripcionales. Más aún, puede ser deseable la expresión no inducible de herramientas moleculares, incluyendo herramientas optogenéticas, proteínas de fusión de receptor nuclear, tales como los sitemas ERT indubibles de tamoxifen, y receptores de diseñador activados exclusivamente por fármacos de diseñador. Además, las secuencias que codifican factores de señalización que alteran la función de la misma célula o de vecina o incluso células distantes en un organismo, incluyendo factores autócrinos o parácrinos de hormonas se pueden co­ expresar del mismo GSH como la proteína reguladora transcripcional.
Además, el material genético adicional puede incluir secuencias que codifican el ARN no codificante, como se discute en esta invención. Ejemplos de ese material genético incluye genes para miARN, que puede funcionar como un interruptor genético.
Se prefiere que el gen que codifica la proteína reguladora transcripcional esté unido operativamente a un promotor constitutivo. Alternativamente, el primer GSH se puede seleccionar de modo que ya tenga un promotor constitutivo que también puede impulsar la expresión del gen de la proteína reguladora transcripcional y cualquier material genético asociado. Los promotores constitutivos aseguran la expresión génica sostenida y de alto nivel. Los promotores constitutivos usados comúnmente, incluyendo el promotor de p-actina humano (ACTB), citomegalovirus (CMV), factor de alargamiento-la, (EF1a), fosfoglicerato cinasa (PGK) y ubiquitinaC (UbC). El promotor de CAG es un promotor sintético fuerte usado frecuentemente para impulsar altos niveles de expresión génica y fue construido de las siguientes secuencias: (C) el elemento mejorador temprano de citomegalovirus (CMV), (A) el promotor, el primer exón y el primer intrón del gen beta-actina de gallina, y (G) el aceptor de empalme del gen de beta-globina de conejo.
Además, el regulador transcripcional, más cualquier material genético adicional se puede proporcionar junto con las secuencias disociables. Esas secuencias son secuencias que se reconocen por una entidad capaz de cortar específicamente ADN, e incluyen sitios de restricción, que son las secuencias diana para las enzimas de restricción o las secuencias para el reconocimiento por otras entidades de disociación de ADN, tales como nucleasas, recombinasas, ribozimas o constructos artificiales. Se puede incluir por lo menos una secuencia disociable, pero preferiblemente están presentes dos o más. Estas secuencias disociables pueden estar en cualquier punto adecuado en la inserción, de modo que una porción seleccionada de la inserción, o toda la inserción, se puede remover selectivamente del GSH. El procedimiento puede así extenderse para la remoción y/o reemplazo de la inserción o una porción del mismo del GSH. Los sitios disociables así pueden flanquear la parte/toda la inserción que puede ser deseable remover. El regulador transcripcional y/o el material genético adicional se puede remover usando este procedimiento.
Una porción de la inserción puede ser cualquier parte hasta 99% de la inserción - es decir 1-99%, 90%., 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o menos que 10%.
Se puede preferir que la porción de la inserción flanqueada por los sitios disociables incluya el promotor constitutivo. Alternativamente, el promotor constitutivo no se incluye en la porción flanqueada por las secuencias disociables.
Una secuencia disociable preferida es el sitio loxP para Cre recombinasa ya que permite el reemplazo directo de la inserción removida. Alternativamente o además, la secuencia disociable es el sitio rox para la Dre recombinasa.
Se prefiere que la inserción en el primer GSH ocurra en ambos lugares en el genoma, así cada alelo es modificado por la inserción. Esto permite una mayor expresión de gen que codifica el regulador transcripcional y cualquier material genético asociado.
El segundo GSH puede ser cualquier sitio de GSH adecuado. Se puede preferir que el segundo sitio de GSH no esté asociado con un promotor endógeno, de modo que la expresión del casete inducible insertado esté solo bajo el control de la proteína reguladora transcripcional.
Un casete inducible incluye una secuencia genética deseada, preferiblemente una secuencia de ADN, que va a ser transferida a una célula. La introducción de un casete inducible en el genoma tiene el potencial de cambiar el fenotipo de esa célula, ya sea por adición de una secuencia genética que permite la expresión génica o la reducción de la expresión génica /desactivación génica de la expresión endógena. Los procedimientos de la invención proporcionan la transcripcióin controlable de la(s) secuencia(s) genética(s) dentro del casete inducible en la célula.
La secuencia genética deseada para inserción es preferiblemente una secuencia de ADN que codifica una molécula de ARN. La molécula de ARN puede ser de cualquier secuencia, pero es preferiblemente ARN codificante o no codificante. El ARN codificante o mensajero codifica las secuencias de polipéptidos, y la transcripción de ese ARN lleva a la expresión de una proteína dentro de la célula. El ARN no codificante puede ser funcional y puede incluir sin limitación: MicroARN, ARN pequeño interferente, ARN de interacción con Piwi, ARN Antisentido, ARN nuclear pequeño, ARN nucleolar pequeño, ARN de Cuerpo Cajal Pequeño, ARN Y, ARNs mejoradores, ARN Guía, Ribozimas, ARN de horquilla pequeña, ARN temporal pequeño, a Rn Trans-actuante, ARN pequeño interferente y ARN mensajero subgenómico. El ARN no codificante también puede ser conocido como ARN funcional. Muchos tipos de ARN son de naturaleza reguladora, y, por ejemplo, puede sub-regular la expresión génica al ser complementario a una parte de un ARNm o un ADN del gen. Los MicroARNs (miARN; de 21 a 22 nucleótidos) se encuentran en eucariotas y actúan a través de ARN interferente (ARNi), donde un complejo efector de miARN y enzimas puede disociar el ARNm complementario, bloquear el ARNm de ser traducido, o acelerar su degradación. Otro tipo de ARN, ARNs pequeños interferentes (ARNsi; 20 a 25 nucleótidos) actúan a través de ARN interferente en un modo similar a los miARNs. Algunos miARNs y ARNsi pueden provocar que los genes a los que se dirigen sean metilados, disminuyendo o aumentando así la transcripción de esos genes. Los animales tienen ARNs que interactúan con Piwi (ARNpi; 29 a 30 nucleótidos) que son activos en células de línea germinal y se piensa que son una defensa contra transposones. Muchos procariotas tienen ARNs de CRISPR, un sistema regulador similar al ARN interferente, y ese sistema incluye ARN guía (ARNg). Los ARNs antisentido están diseminados; la mayoría dub-regula un gen, pero unos pocos son activadores de la transcripción. El ARN antisentido puede actuar por la unión a un ARNm, formando ARN de doble cadena que se degrada enzimáticamente. Hay muchos ARNs no codificantes largos que regulan genes en eucariotas, uno de esos ARN es Xist, que reviste un cromosoma X en mamíferos hembras y lo inactiva. Así, hay una multitud de ARNs funcionales que se pueden emplear en los procedimientos de la presente invención.
Así, el casete inducible puede incluir una secuencia genética que es un gen que codifica una proteína. Este gen puede no estar presente naturalmente en la célula, o puede ocurrir naturalmente en la célula, pero se requiere la expresión controlable de ese gen. Alternativamente, el casete inducible puede ser una versión mutada, modificada o corregida de un gen presente en la célula, particularmente para fines de terapia génica o la derivación de modelos de enfermedad. El casete inducible puede así incluir un transgén de un organismo diferente de la misma especie (es decir una versión enferma/mutada de un gen de un humano, o un gen tipo silvestre de un humano) o ser de una especie diferente.
En cualquier aspecto o modalidad, la secuencia genética comprendida dentro del casete inducible puede ser una secuencia sintética.
El casete inducible puede incluir cualquier secuencia genética adecuada que se desee insertar en el genoma de la célula. Por lo tanto, la secuencia genética puede ser un gen que codifica para un producto de proteína o una secuencia que se transcribe en ácido ribonucléico (ARN) que tiene una función (tal como ARN nuclear pequeño (ARNsn), ARN antisentido, micro ARN (miARN), ARN pequeño interferente (ARNsi), ARN de transferencia (ARNt) y otros a Rns no codificantes (ARNnc), incluyendo CRISPR-ARN (crARN) y a Rn guía (ARNg).
El casete inducible así puede incluir ser cualquier secuencia genética, cuya transcripción se desea controlar dentro de la célula. La secuencia genética elegida será dependiente del tipo de célula y el uso que se le dará a la célula después de la modificación, como se discute más adelante.
Por ejemplo, para los procedimientos de terapia génica, puede ser deseable proporcionar la secuencia génica de tipo silvestre como un componente del casete inducible. En este escenario, la secuencia genética puede ser cualquier gen que codifica una proteína humana o animal. Ejemplos de genes que codifican proteínas incluyen el gen 13-globina humana, gen de lipoproteína lipasa humana (LPL), la proteína 1 Rab escort en humanos codificada por el gen CHM y muchos más. Alternativamente, el casete inducible puede expresar factores de Crecimiento, incluyendo BDNF, GDF, NGF, IGF, FGF y/o enzimas que pueden disociar pro-péptidos para formar formas activas. La terapia génica también se puede lograr por la expresión de un casete inducible incluyendo una secuencia genética que codifica un ARN antisentido, un miARN, un ARNsi o cualquier tipo de ARN que interfieres con la expresión de otro gen dentro de la célula.
Alternativamente, si la célula es una célula madre, el casete inducible puede incluir una secuencia genética que codifica un regulador maestro específico de linaje clave, abreviado aquí como regulador maestro. Los reguladores maestros pueden ser uno o más de: factores de transcripción, reguladores transcripcionales, receptores de citocina o moléculas de señalización y lo similar. Un regulador maestro es un gen expresado que influye en el linaje de la célula que lo expresa. Puede ser que se requiera una red de reguladores maestros para que se determine el linaje de una célula. Como se usa en esta invención, un gen regulador maestro que se expresa al comienzo de un linaje de desarrollo o tipo de célula, participa en la especificación de ese linaje al regular múltiples genes en la dirección 3' ya sea directamente o a través de una cascada de cambios de expresión génica. Si se expresa el regulador maestro tiene la capacidad de re-especificar el destino de las células destinadas a formar otros linajes. Ejemplos de reguladores maestros incluyen el factor de transcripción miogénico MyoD y el factor de transcripción hematopoyético SCL. Particularmente, los reguladores maestros incluyen, pero no se limitan a:
Linajes neurales: Oligodendrocitos: SOX10, OLIG2, NKX2.2., NKX6.2; Astrocitos: NFIA, NFIB, y SOX9;
Neuronas: Ascll, neurogenina, y NeuroD, Pax6, Neurog2, Ascll, Dlx2, y NeuroDI; Células hematopoyéticas, incluyendo Eritrocitos y Megacariocitos: GATA1, FLI1 y TAL1
Linajes mesenquimales: Músculo esquelético: MYOD; Cardiomiocitos: Gata4, Mef2c, Baf60c y Tbx5; Hueso: L-Myc (RXOL) Runx2, Osterix, Oct4; Cartílago: c-Myc Klf4, SOX9; y Adipocitos Cafés: C/EBP-p y c-Myc
Endodermo
Tipos de células pancreáticas:PDX1 y GATA6.
Células madre: Epiblasto SC: Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc
Alternativamente, o además, la secuencia genética o material genético adicional pueden ser genes cuya función requiere investigación, de modo que la expresión controlable puede ver al efecto de la expresión en la célula; el gen puede incluir factores de crecimiento y/o citocinas para que las células sean usadas en el trasplante de células; y/o o el gen pueden ser componentes de un ensayo de reportero.
Además, la secuencia genética puede codificar ARN no codificante cuya función es la reducción de la expresión génica de la expresión de un gen endógeno o secuencia de ADN que codifica ARN no codificante en la célula. Alternativamente, la secuencia genética puede codificar el ARN guía para que el sistema de CRISPR-Cas9 efectúe la desactivación génica del gen endógeno.
Los procedimientos de la invención así se extienden a procedimientos ex vivo de reducción de la expresión de la expresión génica endógena dentro de una célula. Los procedimientos son como se describió previamente, y el casete inducible comprende una secuencia genética que codifica un ARN no codificante unido operativamente a un promotor inducible, donde el ARN no codificante suprime la expresión de dicho gen endógeno. El ARN no codificante puede suprimir la expresión génica por cualquier medio adecuado incluyendo ARN interferente y ARN antisentido. Así, la secuencia genética puede codificar un ARNsh que puede interferir con el ARN mensajero para el gen endógeno.
La reducción en la expresión génica endógena puede ser parcial o completa - es decir, la expresión puede ser 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100% reducida en comparación con la célula antes de la inducción de la transcripción del ARN no codificante.
Los procedimientos de la invención también se extienden a procedimientos ex vivo de desactivación génica de los genes endógenos dentro de una célula, por virtud del sistema de CRIPSR-Cas9, aunque se pueden usar cualesquier otros sistemas adecuados para la desactivación génica del gen. En este escenario, se prefiere que los genes de Cas9 se expresen constitutivamente, y así se incluyen en el primer GSH con el gen para el regulador transcripcional. Las secuencias genéticas que codifican los ARNg se pueden incluir en el casete inducible, que se inserta en el segundo GSH. El ARNg es un ARN sintético corto compuesto de una secuencia de andamio necesaria para la unión de Cas9 y una secuencia de direccionamiento de aproximadamente 20 nucleótidos que define la diana genómica a ser modificada. Así, la diana genómica de Cas9 puede ser cambiada al cambiar simplemente la secuencia de direccionamiento presente en el ARNg. Auqneu el uso primario de ese sistema es diseñar un ARNg para apuntar a un gen endógeno para la desactivación génica del gen, también se puede modificar para activar o reprimir por elección genes diana, purificar regiones específicas de ADN, e incluso dar una imagen del ADN. Se contemplan todos los usos posibles.
El casete inducible incluye una secuencia genética unida operativamente a un promotor inducible. Un "promotor' es una secuencia de nucleótidos que inicia y regula la transcripción de un polinucleótido. Un “promotor inducible” es una secuencia de nucleótidos donde se controla la expresión de una secuencia genética unida operativamente al promotor por un analito, co-factor, proteína reguladora, etc. En el caso de la presente invención, el control se efectúa por la proteína reguladora transcripcional. Se pretende que el término "promotor" o "elemento de control" incluya regiones promotoras de longitud completa y segmentos funcionales (por ejemplo controla transcripción o traducción) de estas regiones. "Unido operativamente" se refiere a un arreglo de elementos donde los componentes así descritos se configuran de modo que realizan su funcion normal. Así, un promotor dado unido operativamente a una secuencia genética es capaz de efectuar la expresión de esa secuencia cuando están presentes las enzimas apropiadas. El promotor no necesita estar contiguo con la secuencia, en tanto que funcione para dirigir la expresión del mismo. Así, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias de intervención no traducidas, aún así transcritas, entre la secuencia promotora y la secuencia genética y la secuencia promotora puede aún ser considerada "unida operativamente" a la secuencia genética. Así, el término "unido operativamente" pretende abarcar cualquier separación u orientación del elemento promotor y la secuencia genética en el casete inducible que permite la iniciación de la transcripción del casete inducible con el reconocimiento del elemento promotor por un complejo de transcripción.
Además, otro material genético también puede estar unido operativamente al promotor inducible. El material genético adicional puede incluir genes, secuencias codificantes para ARN, material genético, tales como marcadores o genes reporteros. Ese material genético adicional ha sido discutido previamente. En algunas circunstancias, puede ser deseable incluir un gen suicida en el casete inducible, si la secuencia genética misma no es un gen suicida para terapia génica de cáncer. El gen suicida puede usar el mismo promotor inducible dentro del casete inducible, o puede ser un promotor inducible separado para permitir un control separado. Ese gen puede ser útil en los escenarios de terapia génica donde es deseable ser capaz de destruír células de donador/transfectadas si se cumplen ciertas condiciones. Los genes suicidas son genes que expresan una proteína que provoca que la célula sufra apóptosis, o alternativamente puede requerir un co-factor o co-fármaco suministrado externamente para el trabajo. El co-factor o co-fármaco puede ser convertido por el producto del gen suicida en una entidad altamente citotóxica.
Además, el casete inducible puede incluir secuencias disociables. Esas secuencias son secuencias que se reconocen por una entidad capaz de cortar específicamente ADN, e incluyen sitios de restricción, que son las secuencias diana para las enzimas de restricción o las secuencias para el reconocimiento por otras entidades de disociación de ADN, tales como nucleasas, recombinasas, ribozimas o constructos artificiales. Se puede incluir por lo menos una secuencia disociable, pero preferiblemente están presentes dos o más. Estas secuencias disociables pueden estar en cualquier punto adecuado en el casete, de modo que una porción seleccionada del casete, o todo el casete, puede ser removido selectivamente del GSH. El procedimiento puede así extenderse a la remoción y/o reemplazo del casete o una porción del mismo del GSH. Los sitios disociables pueden así flanquear parte/toda la secuencia genética que puede ser deseable remover. El procedimiento puede resultar en la remoción del casete inducible y/o el material genético adicional.
Una porción del casete puede ser cualquier parte hasta 99% del casete - es decir 1-99%, 90%., 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% o menor que 10%.
Se puede preferir que la porción de la inserción flanqueada por los sitios disociables incluya el promotor unido operativamente a la secuencia genética. Alternativamente, el promotor unido operativamente a la secuencia genética no está incluido en la porción flanqueada por las secuencias disociables.
Una secuencia disociable preferida es el sitio loxP para Cre recombinasa ya que permite el reemplazo directo de la inserción removida. Alternativamente o además el sitio disociable puede ser el sitio rox para la Dre recombinasa.
La proteína reguladora transcripcional y el casete inducible, junto con cualquier material genético asociado, se insertab en diferentes GSH dentro del genoma de la célula.
Las inserciones en el GSH están preferiblemente específicamente dentro de la secuencia del GSH como se describió previamente. Se puede usar cualquier técnica adecuada para la inserción de un polinucleótido en una secuencia específica, y muchas se describen en la técnica. Las técnicas adecuadas incluyen cualquier procedimiento que introduce una ruptura en la ubicación deseada y permite la recombinación del vector en el espacio. Así, un primer etapa crucial para la modificación genpomica específica de sitio diana es la creación de una ruptura del a Dn de cadena doble (DSB) en el lugar genómico a ser modificado. Se pueden explotar distintos mecanismos de reparación celular para reparar el DSB y para introducir la secuencia deseada, y estos son reparaciones de unión de extremo no homólogo (NHEJ), que es más propenso a error; y reparación de recombinación homóloga (HR) mediada por una plantilla de ADN de donador, que se puede usar para insertar casetes inducibles.
Existen muchas técnicas para permitir la generación personalizada específica de sitio de DSB en el genoma. Muchos de estas involucran el uso de endonucleasas personalizadas, tales como nucleasas de dedo de zinc (ZFNs), nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción (TALENs) o el sistema de repeticiones palindrómicas cortas interespaciadas regularmente agrupadas/proteína asociada a CRISPR (CRISPR/Cas9) (Gaj, T, y col “ZFN, TALEN, y CRISPR/Cas-based methods for genome engineering,” Trends Biotechnol, 31:397-405, julio de 2013).
Las nucleasas de dedo de zinc son enzimas artificiales que se generan por fusión de un dominio de unión de ADN de dedo de zinc al dominio de nucleasa de la enzima de restricción FokI. La última tiene un dominio de disociación no específico que se debe dimerizar para disociar el ADN. Esto significa que se requieren dos de los monómeros de ZFN para permitir la dimerización de los dominios de FokI y para disociar el ADN. El dominio de unión a ADN puede ser diseñado para apuntar a cualquier secuencia genómica de interés, es un arreglo en tándem de dedos de zinc de Cys2His2, cada uno de los cuales reconoce tres nucleótidos contiguos en la secuencia diana. Los dos sitios de unión están separados por 5-7bp para permitir la dimerización óptima de los dominios de FokI. La enzima así es capaz de disociar ADN en un sitio específico, y se aumenta la especificidad de la diana al asegurar que deben ocurrir dos eventos de unión a ADN próximal para lograr una ruptura de la cadena doble.
Las nucleasas efectoras de tipo activador de transcripción, o TALENs, son factor de transcripción/nucleasas diméricas. Se elaboran al fusionar un dominio de unión de ADN efector de TAL a un dominio de disociación de ADN (una nucleasa). Los efectores de tipo activador de transcripción (TALEs) pueden ser diseñados para unirse prácticamente a cualquier secuencia de ADN deseada, de modo que cuando se combina con una nucleasa, el ADN puede ser cortado en ubicaciones específicas. Los efectores TAL son proteínas que son secretadas por la bacteria Xanthomonas, cuyo dominio de unión a ADN contiene una secuencia repetida altamente conservada de 33 a 34 aminoácidos con el 12° y 13° aminoácidos divergentes. Estas dos posiciones son altamente variables y muestran una fuerte correlación con reconocimiento específico de nucleótidos. Esta relación directa entre la secuencia de aminoácidos y el reconocimiento de ADN ha permitido el diseño de dominios de unión de ADN específicos para la selección de una combinación de segmentos repetidos que contienen residuos apropiados en las dos posiciones variables. Los TALENs son así construidos de arreglos de 33 a 35 módulos de aminoácidos, cada uno de los cuales se dirige a un solo nucleótido. Al seleccionar el arreglo de los módulos, casi cualquier secuencia puede ser diana. De nuevo, la nucleasa usada puede ser FokI o un derivado del mismo.
Se han identificado tres tipos de mecanismos de CRISPR, de los cuales el tipo II es el más estudiado. El sistema de CRISPR/Cas9 (tipo II) utiliza la nucleasa Cas9 para hacer una ruptura de la cadena doble en el ADN en un sitio determinado por un ARN guía corto. El sistema de CRISPR/Cas es un sistema inmune procariótico que confiere resistencia a elementos genéticos extraños. El CRISPR son segmentos de ADN procariótico que contiene repeticiones cortas de secuencias de bases. Cada repetición es seguida por segmentos cortos de "ADN protoespaciador" de exposiciones previas a elementos genéticos extraños. Los espaciadores CRISPR reconocen y cortan los elementos genéticos exógenos usando ARN interferente. La respuesta inmune de CRISPR ocurre a través de dos etapas: Biogénesis de CRISPR-ARN (crARN) e interferencia guiada de crARN. Las moléculas de crARN están compuestas de una secuencia variable transcrita del ADN protoespaciador y una repetición CRISP. Cada molécula de crARN luego se hibridiza con un segundo ARN, conocido como el CRISPR ARN trans-activador (tracrARN) y juntos estos dos eventualmente forman un complejo con la nucleasa Cas9. La sección codificada del ADN protoespaciador del crARN dirige Cas9 para disociar las secuencias de ADN diana complementarias, si están adyacentes a secuencias cortas conocidas como motivos adyacentes al protoespaciador (PAMs). Este sistema natural ha sido diseñado y explotado para introducir rupturas de DSB en sitios específicos en el ADN genómico, entre muchas otras aplicaciones. En particular, se puede usar el sistema de CRIPSR tipo II de Streptococcuspyogenes. En su forma más simple, el sistema CRISPR/Cas9 comprende dos componentes que son suministrados a la célula para proporcionar edición del genoma: la nucleasa Cas9 misma y un ARN guía pequeño (ARNg). El ARNg es una fusión de un crARN específico de sitio personalizado (dirigido a la secuencia diana) y un tracrARN estandarizado.
Una vez que se ha elaborado un DSB, se suministra una plantilla de donador con homología al sitio diana; el DSB puede ser reparado por la trayectoria de reparación dirigida a homología (HDR) que permite hacer inserciones precisas.
También son posibles los derivados de este sistema. Están disponibles las formas mutantes de Cas9, tal como Cas9D10A, con solo actividad de nickasa. Esto significa que solo disocia una cadena del ADN, y no activa NHEJ. En cambio, cuando se proporciona con una plantilla de reparación homóloga, las reparaciones del ADN se realizan vía solo la trayectoria de HDR de alta fidelidad. Cas9D10A (Cong L., y col. (2013) Science, 339, 819-823) se puede usar en los complejos de Cas9 apareados diseñados para generar mellas adyacentes en el ADN conjuntamente con dos sgARNs complementarios al área adyacente en cadenas opuestas del sitio diana, lo que puede ser particularmente ventajoso.
Los elementos para elaborar la ruptura del ADN de cadena doble se pueden introducir en uno o más vectores tales como plásmidos para la expresión en la célula.
Así, cualquier procedimiento de formar, rupturas de cadena doble específicas, diana en el genoma para efecutar la inserción de un gen/casete inducible se puede usar en el procedimiento de la invención. Se puede preferir que el procedimiento para insertar el gen/casete inducible utilice cualquiera uno o más de los sistemas ZFNs, TALENs y/o CRISPR/Cas9 o cualquier derivado de los mismos.
Una vez que el DSB ha sido formado por cualquier medio apropiado, el gen/casete inducible para inserción se puede suministrar de cualquier modo adecuado como se describe a continuación. El gen/casete inducible y material genético asociado forman el ADN de donador para reparación del ADN en el DSB y se insertan usando maquinarias/trayectorias estándar de reparación celular. El cómo se inicie la ruptura alterará qué trayectoria se use para reparar el daño, como se indicó anteriormente.
La proteína reguladora transcripcional y el casete inducible se pueden suministrar para el procedimiento de la invención en vectores separados. Un “vector” es una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula de ADN, que se usa como un vehículo para portar artificialmente material genético dentro de una célula. El vector es generalmente un secuencia de ácidos nucleicos que consiste de un inserto (tal como un casete inducible o gen para una proteína reguladora transcripcional) y una secuencia más larga que sirve como la "estructura principal" del vector. El vector puede estar en cualquier formato adecuado, incluyendo plásmidos, minicírculo, o ADN lineal. El vector comprende por lo menos al gen para el regulador transcripcional o casete inducible unido operativamente a un promotor inducible, junto con las secuencias mínimas para permitir la inserción de los genes en el GSH relevante. Opcionalmente, los vectores también poseen un origen de replicación (ori) que permite la amplificación del vector, por ejemplo en bacterias. Además, o alternativamente, el vector incluye marcadores seleccionables tales como genes de resistencia a antibióticos, genes para marcadores coloreados y genes suicidas.
Ejemplos de los vectores usados en los ejemplos se representan en las Figuras 20 a 33.
La célula usada en el procedimiento de la invención puede ser cualquier célula humana o animal. Es preferiblemente una célula de mamífero, tal como una célula de un roedor, tales como ratones y ratas; marsupiales tales como canguros y koalas; primates no humanos tales como un bonobo, chimpancé, lemur, gibón y simios; camélidos tales como camellos y llamas; animales de ganado tales como caballos, cerdos, vacas, búfalos, bisontes, cabras, ovejas, venados, renos, burros, toros, yaks, pollos, patos y pavos; animales domésticos tales como gatos, perros, conejos y cobayos. La célula es preferiblemente una célula humana. En ciertos aspectos, la célula es preferiblemente uno de un animal de ganado.
El tipo de célula usado en el procedimiento de la invención dependerá de la aplicación de la célula una vez que se completa la inserción del material genético en el sitio de GSH.
Cuando el objetivo es producir tipos de células maduras a partir de células progenitoras, la célula que se modifica es una célula madre, preferiblemente una célula madre pluripotente. Las células madre pluripotentes tiene el potencial de diferenciarse en casi cualquier célula en el cuerpo. Hay muchas fuentes de células madre pluripotentes. Las células madre embionarias (células ES) son células madre pluripotentes derivadas de la masa de células internas de un blastocito, un embrión de pre-implantación de etapa temprana. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSCs) son células adultas que han sido reprogramadas genéticamente a un estado de tipo célula madre embrionaria al ser forzada a expresar genes y factores importantes para mantener las propiedades definitorias de las células madre embrionarias. En 2006 se demostró que la introducción de cuatro genes específicos que codifican factores de transcripción podrían convertir las células adultas en células madre pluripotentes (Takahashi, K; Yamanaka, S (2006), Cell 126 (4): 663-76), pero trabajo subsecuente ha reducido/alterado el número de genes que son requeridos. Oct-3/4 y ciertos miembros de la familia del gen Sox han diso identificados como reguladores transcripcionales potencialmente cruciales involucrados en el procedimiento de inducción. Genes adicionales incluyendo ciertos miembros de la familia Klf, la familia Myc, Nanog, y LIN28, pueden aumenbtar la eficiencia de inducción. Ejemplos de los genes que pueden estar contenidos en los faactores de reprogramación incluyen Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-catenina, Lin28b, Salll, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 y G lis l, y estos factores de reprogramación se pueden usar solos, o en combinación de dos o más tipos de los mismos.
Cuando el objetivo es producir células madre con una reducción de la expresión génica o desactivación génica del gen para investigación adicional, tal como estudios de desarrollo o de función de genes, la célula que se modifica puede ser una célula madre, preferiblemente una célula madre pluripotente, o un tipo de célula madura. Las fuentes de células madre pluripotentes se discuten anteriormente.
Si las células modificadas por inserción de un casete inducible se van a usar en un paciente humano, se puede preferir que la célula sea un iPSC derivado de ese individuo. Ese uso de células autólogas podría remover la necesidad de igualar las células a un receptor. Alternativamente, se pueden usar las iPSC disponibles comercialmente, tales como esas disponibles de WiCell® (WiCell Research Institute, Inc, Wisconsin, US). Alternativamente, las células pueden ser una célula madre específica de tejido que también puede ser autóloga o donada. Las células adecuadas incluyen células madre de epiblastos, células madre neurales inducidas y otras células madre específicas de tejido.
En ciertas modalidades, se puede preferir que la célula usada sea una célula madre embrionaria o línea de célula madre. Ahora están disponibles numerosas líneas de células madre embrionarias, por ejemplo, WA01 (H1) y WA09 (H9) se pueden obtener de WiCell, y KhES-1, KhES-2, y KhES-3 se pueden obtener del Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (Kyoto, Japón).
Se puede preferir que la célula madre embrionaria se derive sin destrucción del embrión, particularmente cuando las células son humanas, ya que esas técnicas están disponibles fácilmente (Chung, Young y col., Cell Stem Cell, Volumen 2, Edición 2, 113 - 117.) También están disponibles las líneas de células madre que han sido derivadas sin destruir un embrión. En un aspecto, la invención no se extiende a cualquiera de los procedimientos que involucran la destrucción de embriones humanos.
Un aspecto preferido de la presente invención es la programación directa de células madre pluripotentes en tipos de células maduras. Así, el procedimiento de la invención se puede usar para la fabricación de tipos de células maduras de células madre pluripotentes. En este aspecto de la invención, el casete inducible para la inserción en el segundo GSH es preferiblemente uno o más reguladores maestros como se discutió previamente. Estos casetes inducibles pueden habilitar que la célula sea programada en un linaje particular, y se usarán diferentes casetes inducibles para dirigir la diferenciación en tipos de células maduras. Se contempla cualquier tipo de célula madura, incluyendo pero no limitado a células nerviosas, miocitos, osteocitos, condrocitos, células epiteliales, células secretoras, y/o células sanguíneas.
Los inventores de la presente solicitud han desarrollado un procedimiento rápido, eficiente y escalable para la generación de virtualmente cualquier tipo de célula madura. Ese procedimiento simple y barato tendrá un valor particular para la medicina regenerativa. Las técnicas previas de programación directa utilizaron el sistema Tet-On, pero intentaron incluir todo el material en un vector/sitio (El Tet-On todo en uno) o trataron de insertar el casete inducible en un alelo de AAVS1 y el sistema de control en el otro alelo de AAVS1 (DeKelver y col, 2010, Genome Res., 20, 1133-43 y Qian y col, 2014, Stem Cells, 32, 1230-8). Sorprendentemente, el procedimiento de direccionamiento de GSH doble desarrollado y descrito aquí tiene muchas ventajas no previstas. No existe una interferencia del promotor potencial entre el gen insertado en el primer GSH y la secuencia genética del casete inducible insertado en el segundo GSH. En segundo lugar, permite la inserción de grandes cargas de los vectores, ya que se requiere insertar menos material en cada sitio. En tercer lugar, el procedimiento maximiza el número de copias insertadas de modo seguro. En cuarto lugar, permite una mayor flexibilidad en el diseño. Finalmente, permite que se inserte material genético adicional, incluyendo genes reporteros e interruptores de miARN. El procedimiento de la invención ha demostrado ser una manera robusta y eficiente de fabricar células maduras a partir de células pluripotentes.
Una vez que el gen ha sido insertado en el primer GSH y el casete inducible que comprende un transgén ha sido insertado en el segundo GSH, las células madre pluripotentes pueden ser cultivadas para permitir que se lleve a cabo la programación directa. Estas condiciones de cultivo pueden ser específicas para el tipo de célula madre pluripotente que se usa, o pueden depender del tipo final de célula madura. Cualesquiera que sean las condiciones de cultivo que se usan, la sustancia exógena controlará la expresión de la secuencia genética dentro del casete inducible; y ya sea puede suministrarse continuamente y luego retirarse para inducir la transcripción o suministrarse como transcripción si se requiere, dependiendo de su modo de acción, como se discutió previamente.
Si el objetivo es programar una célula madre, puede ser ventajoso proporcionar a esa célula con avisos extracelulares para ayudar a la diferenciación en conjunto con el suministro de casetes inducibles que codifican reguladores maestros. Las estrategias de reprogramación celular se pueden mejorar al combinar la sobre-expresión del regulador maestro o factor de transcripción con pistas de señalización extracelular. Así, puede ser posible realizar la búsqueda sistemática para los factores de pro-diferenciación al modular las cascadas de señalización principales que están implicadas en el desarrollo de ese tipo particular de célula madura. Un ejemplo de esto se ve en el Ejemplo 3.
En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de miocitos de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida del gen MYOD1 unido operativamente a un promotor inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho promotor inducible es regulado por la proteína reguladora transcripcional; donde dicho primero y segundo sitios de anclaje seguro genético son diferentes,
y cultivar dichas células en la presencia de ácido retinoico,
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
El gen MYOD1 es el gen que codifica la proteína 1 de Diferenciación Miogénica. Preferiblemente, el ácido retinoico (AR) es todo AR trans.
Preferiblemente, el AR es todo AR trans. Preferiblemente, la célula sobre-expresa MYOD1.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un procedimiento ex vivo para la producción de oligodendrocitos Miocitos a partir de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
a) la inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y
b) la inserción dirigida del gen SOX 10 unido operativamente a un promotor inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho promotor inducible es regulado por la proteína reguladora transcripcional; donde dicho primero y segundo sitios de anclaje seguro genético son diferentes,
y cultivar dichas células en la presencia de ácido retinoico,
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
Las células usadas para esto pueden ser células animales o humanas. Si las células son animales, se prefiere que el animal sea un animal de ganado como se definió previamente.
El gen SOX-10 codifica el factor de transcripción SOX-10. Preferiblemente, el ácido retinoico (AR) es todo AR trans.
Cuando la célula usada en los procedimientos de la invención es pluripotente, la célula resultante puede ser una célula madre específica de linaje restringido, célula progenitora o un tipo de célula madura con las propiedades deseadas, por la expresión de un regulador maestro. Estas células madre específicas de linaje, células progenitoras o células maduras se pueden usar en cualquier modo adecuado. Por ejemplo, las células maduras se pueden usar directamente para el trasplante en un cuerpo humano o animal, según sea apropiado para el tipo de célula. Alternativamente, las células pueden formar un material de prueba para investigación, incluyendo los efectos de fármacos en la expresión génica y la interacción de fármacos con un gen particular. Las células para investigación pueden involucrar el uso de un casete inducible con una secuencia genética de función desconocida, para estudiar la expresión controlable de esa secuencia genética. Además, puede habilitar a las células a ser usadas para producir grandes cantidades de materiales deseables, tales como factores de crecimiento o citocinas.
En un aspecto diferente, las células se pueden usar en el diseño de tejidos. El diseño de tejidos requiere la generación de tejido que se podría usar para reemplazar tejidos o incluso órganos completos de un humano o animal. Los procedimientos de diseño de tejidos son conocidos por los expertos en la técnica, pero incluyen el uso de un andamio (una matriz extracelular) con la que las células se aplican para generar tejidos/órganos. Estos procedimientos se pueden usar para generar una tráquea, vejiga, hígado, páncreas, estómago, intestinos, vasos sanguíneos, tejido cardíaco, hueso, médula ósea, tejido mucosal, nervios, músculo, piel, riñones “artificiales” o cualquier otro tejido u órgano. Los procedimientos para la generación de tejidos pueden incluir fabricación aditiva, conocida de otro modo como impresión tridimensional (3D), que puede involucrar imprimir directamente las células para formar tejidos. La presente invención así proporciona un procedimiento para la generación de tejidos usando las células producidas como se describe en cualquier aspecto de la invención.
Los tejidos generados usando células elaboradas de acuerdo con los procedimientos de la presente invención se pueden usar para el trasplante en el cuerpo humano o animal. Alternativamente, si las células son de un animal, los tejidos se pueden usar para carne in vitro/cultivada. El tipo principal de células para carne cultivada es miocitos. Ese tejido puede, sin embargo, involucrar el uso de una combinación de tipos de células made de acuerdo con los procedimientos de la invención. Estos pueden ser miocitos (células de músculo), células de vasos sanguíneos, células sanguíneas y adipocitos (células grasas). Si el objetivo del tejido diseñado es para carne cultivada, entonces la célula puede ser tomada de un animal de ganado.
Los procedimientos de la invención también se pueden realizar en células que no son células madre pluripotentes, por una variedad de razones, incluyendo investigación, terapia génica incluyendo vacunas genéticas, producción de modelos de enfermedad in vitro y producción de modelos in vivo no humanos.
Las células usadas en el procedimiento de la invención pueden así ser cualquier tipo de células madre adultas; estas son células no especializadas que se pueden desarrollar en muchos, pero no en todos, los tipos de células. Las células madre adultas son células no diferenciadas encontradas a través de todo el cuerpo que se dividen para reponer las células que se mueren y regenerar tejidos dañados. También conocidas como células madre somáticas, no son pluripotentes. Las células madre adultas han sido identificadas en muchos órganos y tejidos, incluyendo cerebro, médula ósea, sangre periférica, vasos sanguíneos, músculo esquelético, piel, dientes, corazón, intestinos, hígado, epitelio del ovario, y testículos. Para etiquetar una célula como una célula madre somática, la persona experta debe demostrar que una sola célula madre adulta puede generar una línea de células idénticas genéticamente que entonces dan lugar a todos los tipos de céluilas apropiadas diferenciadas del tejido. Para confirmar experimentalmente que una célula madre adulta supuesta es en efecto una célula madre, la célula debe ya sea dar lugar a estas células idénticas genéticamente en cultivo, o una población purificada de estas células debe repoblar el tejido después del trasplante en un animal. Los tipos adecuados de células incluyen, pero no se limitan a células madre y precursoras neurales, mesenquimales y endodérmicas.
Alternativamente, las células usadas pueden ser un tipo de célula madura. Esas células son diferenciadas y especializadas y no son capaces de desarrollarse en un tipo de célula diferente. Los tipos de células maduras incluyen, pero no se limitan a células nerviosas, miocitos, osteocitos, condrocitos, células epiteliales, células secretoras, y/o células sanguíneas. Los tipos de células maduras podrían ser cualquier célula del cuerpo humano o animal.
Las células madre somáticas y tipos de células maduras se pueden modificar de acuerdo con la presente invención y luego usarse para aplicaciones tales como terapia génica o vacunación genética. La terapia génica puede ser definida como la inserción intencional de ADN extraño en el núcleo de una célula con intención terapéutica. Esa definición incluye la provisión de un gen o genes a una célula para proporcionar una versión de tipo silvestre de un gen fallado, la adición de genes para moléculas de ARN que interfieren con la expresión génica diana (que puede ser defectuosa), la provision de genes suicidas (tales como las enzimas del virus de herpes simple timidina cinasa (HSV-tk) y citosina desaminasa (CD) que convierten el profármaco inofensivo ganciclovir (GCV) en un fármaco citotóxico), vacunas de ADN para inmunización o terapia de cáncer (incluyendo inmunoterapia adoptiva celular) y cualquier otra provision de genes a una célula para fines terapéuticos.
Típicamente, el procedimiento de la invención se puede usar para la inserción de una secuencia genética deseada para transcripción en una célula, preferiblemente expresión, particularmente en vacunas de ADN. Las vacunas de ADN típicamente codifican una forma modificada de un ADN de organismo infeccioso. Las vacunas de ADN se administran a un sujeto donde expresan la proteína seleccionada del organismo infeccioso, iniciando una respuesta inmune contra esa proteína que es típicamente protectora. Las vacunas de ADN también pueden codificar un antígeno de tumor en un enfoque de inmunoterapia de cáncer.
Una vacuna de ADN puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno para el tratamiento 0 prevención de un número de condiciones incluyendo pero no limitado a cáncer, alergias, toxicidad e infección por un patógeno tal como, pero no limitado a, hongos, virus incluyendo Virus del Papiloma Humano (HPV), HIV, HSV2/HSV1, Virus de la Influenza (tipos A, B y C), Virus de Polio, Virus de RSV, Rinovirus, Rotavirus, Virus de Hepatitis A, Virus de Sarampión, Virus de Parainfluenza, Virus de Paperas, Virus de Varicela-Zoster virus, Citomegalovirus, Virus de Epstein- Barr, Adenovirus, Virus de Rubeola, Virus de linfoma de linfocitos T humanos tipo 1 (HTLV-I), Virus de Hepatitis B (HBV), Virus de Hepatitis C (HCV), Virus de Hepatitis D, Virus de Varicela, Virus de Zika, Marburg y Ebola; bacterias incluyendo Meningococo, Influenza hemofílica (tipo b); y patógenos parasitarios. Las vacunas de ADN pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica un antígeno de cualquier patógeno adecuado. El antígeno puede ser de un patógeno responsable de una enfermedad humana o veterinaria y en particular puede ser de un patógeno viral.
Las vacunas de ADN insertadas en el GSH también pueden comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica antígenos de tumor. Ejemplos de antígenos asociados a tumor incluyen, pero no se limitan a, antígenos de cáncer tales como los miembros de la familia de MAGE (MAGE 1,2, 3 etc.), NY-ESO-I y SSX-2, antígenos de diferenciación tales como tirosinasa, gplOO, PSA, Her-2 y CEA, antígenos auto-mutados y antígenos de tumor viral tal como E6 y/o E7 de tipos de HPV oncogénico. Ejemplos adicionales de antígenos de tumor particular incluyen MART-I, Melan-A, p97, beta-HCG, GaINAc, MAGE-I, MAGE-2, MAGE-4, MAGE-12, MUCl, MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, PlA, EpCam, antígeno de melanoma gp75, Hker 8, antígeno de melanoma de alto peso molecular, Kl 9, Tyrl, Tyr2, miembros de la familia del gen pMel 17, c-Met, PSM (antígeno de mucina prostática), PSMA (antigeno de membrana específico de próstata), proteína secretora de próstata, alfa-fetoproteína, antígeno de CA 125, CA 19.9, TAG-72, BRCA-I y BRCA-2.
La secuencia genética insertada puede producir otros tipos de moléculas de ADN terapéutico. Por ejemplo, esas moléculas de ADN se pueden usar para expresar un gen funcional cuando un sujeto tiene un trastorno genético provocado por una versión disfuncional de ese gen. Ejemplos de esas enfermedades incluyen distrofia muscular de Duchenne, fibrosis quística, Enfermedad de Gaucher, y deficiencia de adenosina desaminasa (ADA). Otras enfermedades donde puede ser útil la terapia génica incluyen enfermedades inflamatorias, autoinmunes, crónicas e infecciosas, incluyendo esos trastornos como SIDA, cáncer, enfermedades enurológicas, enfermedad cardiovascular, hipercolestemia, varios trastornos sanguíneos incluyendo varias anemias, talasemia y hemofilia, y enfisema. Para el tratamiento de tumores sólidos, se pueden expresar los genes que codifican péptidos tóxicos (es decir, agentes quimioterapéuticos tales como ricina, toxina de difteria y factor del veneno de cobra), genes supresores de tumor tales como p53, genes que codifican secuencias de ARNm que son antisentido para transformar oncogenes, péptidos antineoplásicos tales como factor de necrosis de tumor (t Nf ) y otras citocinas, o mutantes negativos transdominantes de oncogenes transformantes.
También se contemplan otros tipos de moléculas terapéuticas de ADN. Por ejemplo, se pueden insertar las moléculas de ADN que se transcriben en una forma de ARN no codificante, activa, por ejemplo un ARN interferente pequeño (ARNsi). Los procedimientos de la invención así se extienden a procedimientos de reducción de la expresión de la expresión génica endógena o la desactivación génica de los genes endógenos usando ARNs no codificantes dentro del casete inducible.
Así, el procedimiento de la invención se puede usar para insertar específicamente y establemente una secuencia genética dentro del casete inducible que puede ser transcrito de manera controlable. Esto tiene muchas ventajas en células madre somáticas y tipos de células maduras. Permite enfoques de terapia génica regulados más de cerca, asegurando que los genes críticos no son interrumpidos y permite que la expresión del casete inducible sea apagado si ocurren cualesquier efectos adversos. También permite reducción de la expresión génica o desactivación génica para el gen endógeno regulado de cerca, para interrogar la función y desarrollo del gen.
La invención se extiende a las células producidas por el procedimiento de la invención. Las células se pueden definir como siendo modificadas en un primer sitio de anclaje seguro genómico para incluir una proteína reguladora transcripcional y en un segundo sitio de anclaje seguro genético para incluir una secuencia genética unida operativamente a un promotor inducible que es regulado por la proteína reguladora transcripcional. Los dos GSH son diferentes y distintos. Preferiblemente las células son homocigotos en ambos sitios de inserción. Todos los elementos son como se describió previamente.
Las células producidas de acuerdo con cualquiera de los procedimientos de la invención tienen aplicaciones en procedimientos de diagnóstico y terapéuticos. Las células se pueden usar in vitro para estudiar el desarrollo celular, proporcionar sistema de prueba para fármacos nuevos, habilitar que se desarrollen procedimientos de investigación, ecrutinar regímenes terapéuticos, proporcionar pruebas de diagnóstico y lo similar. Estos usos forman parte de la presente invención. Alternativamente, las células se pueden trasplantar en un paciente humano o animal para fines de diagnóstico o terapéuticos. El use de las células en terapia también se incluye en la presente invención. Las células pueden ser alogenéicas (es decir células maduras removidas, modificadas y regresadas al mismo individuo) o de un donador (incluyendo una línea de célula madre).
Secuencias:
AAVS1 - NCBI GenBank S51329.1
SEQ ID No 1 : Secuencia de Tet02 19n
SEQ ID No 2 : secuencia genómica del sitio de inserción de hROSA
SEQ ID No 3 : STDtetR-nls (nucleótido) y SEQ ID No 4 - STDtetR-nls (aminoácido)
SEQ ID No 5 : OPTtetR-nls (nucleótido) y SEQ ID No6 - OPTtetR-nls (aminoácido)
SEQ ID No 7 a 80: Cebadores de la tabla 3.
SEQ ID No 81: Figura 18B AAVS1 FWD; SEQ ID No 82: Fig 18B AAVS1 REV
SEQ ID No 83: Figura 18B trazador FWD; SEQ ID No 84: Fig 18B trazador REV
SEQ ID No 85: Figura 19E HI POL3 FWD; SEQ ID No 82: Fig 19E HI POL3 REV
Esta es la secuencia genómica del sitio de inserción de hROSA26; incluye el brazo de homología en 5', el sitio de corte (negritas), y el brazo de homología en 3’: (SEQ ID NO 2) GCTCGAAACCGGACGGAGCCATTGCTCTCGCAGAGGGAGGAGCGCTTCCGGCTAGCCTCTTGTCGCCGATTGGCCGTTTC TCCTCCCGCCGTGTGTGAAAACACAAATGGCGTATTCTGGTTGGAGTAAAGCTCCTGTCAGTTACGCCGTCGGGAGTACG CAGCCGCTTAGCGACTCTCGCGTTGCCCCCTGGGTGGGGCGGGTAGGTAGGTGGGGTGTAGAGATGCTGGGTGTGCGG GCGCGGCCGGCCTCCTGCGGCGGGAGGGGAGGGTCAGTGAAATCGGCTCTGGCGCGGGCGTCCTCCCACCCTCCCCTTC CTTCGGGGGAGTCGGTTTACCCGCCGCCTGCTTGTCTTCGACACCTGATTGGCTGTCGAAGCTGTGGGACCGGGCCCTTG CTACTGGCTCGAGTCTCACATGAGCGAAACCACTGCGCGGGGCGCGGGGGTGGCGGGGAGGCGGGCGTTGGTACGGTC CTCCCCGAGGCCGAGCGCCGCAGTGTCTGGCCCCGCGCCCCTGCGCAACGTGGCAGGAAGCGCGCGCTGGAGGCGGGG GCGGGCTGCCGGCCGAGACTTCTGGATGGCGGCGGCCGCGGCTCCGCCCCGGGTTCCCACCGCCTGAAGGGCGAGACA AGCCCGACCTGCTACAGGCACTCGTGGGGGTGGGGGAGGAGCGGGGGTCGGTCCGGCTGGTTTGTGGGTGGGAGGCG CTTGTTCTCCAAAAACCGGCGCGAGCTGCAATCCTGAGGGAGCTGCGGTGGAGGAGGTGGAGAGAAGGCCGCACCCTTC TGGGCAGGGGGAGGGGAGTGCCGCAATACCTTTATGGGAGTTCTCTGCTGCCTCCCGTCTTGTAAGGACCGCCCTGGGC CTGGAAGAAGCCCTCCCTCCTTTCCTCCTCGCGTGATCTCGTCATCGCCTCCATGTCGAGTCGCTTCTCGATTATGGGCGG GATTCTTTTGCCTAGGCTTAAGGGGCTAACTTGGTCCCTGGGCGTTGCCCTGCAGGGGAGTGAGCAGCTGTAAGATTTGA GGGGCGACTCCGATTAGTTTATCTTCCCACGGACTAGAGTTGGTGTCGAGGTTATTGTAATAAGGGTGGGGTAGGGAAA TGGAGCTTAGTCATTCACCTGGGGCTGATTTTATGCAACGAGACTGCGGATTATCACTACTTATCATmTGGAGCATTTTT CTAGAGACAGACATAAAGCATGATCACCTGAGTTTTATACCATTTGAGACCCTTGCTGCACCACCAAAGTGTAGCATCAGG TT AAAT CTT AAT AG AAAAATTTT AG CTTTT GCTT G AG AAACCAGTG CTT CC CTCCCT CACCCT CT CT CC CCAGG CTCTCTACC CCTTTGCATCCCTACCAGGCATCTTAGCAACTCTCACTCATACTTGATCCCATTTTCCATTTGTTGTACTTGCTCCTCTAGTAT TCAGACATAGCACTAGCTTTCTCCCTCTCTTGATCTTGGGTAGCCTGGTGTCTCGCGAAACCAGACAGATTGGTTCCACCAC AAATTAAGGCTTGAGCTGGGGCTTGACTCTTACCCAGCAGTGCmTATTCCTCCCTAGTTCACGTTCTTAAATGTTTATCTT GATTTTCATTTTATCCI1111CCTTAGCTGGGATTCTGTCCCTGACCGTCTTCACAGTCCAGGTGATCTTGACTACTGCTTTA CAGAGAATTGGATCTGAGGTTAGGCAACATCTCCCI 111 ICTTCCTCTAAATACCTCTCATTTCTGTTCTTACCAGTTAGTAA CTGATCTCAGATGCCTGTGTGATAGCTTCC
STDtetR-nls: (SEQ ID No 3 y 4)
Secuencias de nucleótido y aminoácido de la proteína represora sensible a tetraciclina (tetR) que contiene una señal de locaclización nuclear de SV40 N-terminal (nls, resaltada en gris). Las secuencias se reportan ya sea antes o después de la optimización del codón (STDtetR y OPTtetR, respectivamente). Los puntos indican las mutaciones sinónimas introducidas en el OPTtetR.
Figure imgf000025_0001
La secuencia para el tetR optimizado: OPTtetR-nls (SEQ ID NO 5 y 6):
Figure imgf000026_0001
La invención será descrita ahora en relación a los siguientes ejemplos no limitativos:
Ejemplos
Materiales y Procedimientos usados en los Ejemplos:
Cultivo de mantenimiento de hPSC y diferenciación de capa germinal
Se realizó el cultivo de hESC de alimentador y libre de suero (línea H9; WiCell) y hiPSC (Cheung y col, Nat. Biotechnol.
30, 165-173 (2012)). Brevemente, las células fueron colocadas en placas en cajas de cultivo revestidas con medio de gelatina/MEF [el medio MEF consistió de DMEM/F12 Avanzado (90%, Gibco), suero bovino fetal (10%, Gibco), L-Glutamina (1 mM, Gibco), 2-Mercaptoetanol (0.1 mM, Sigma-Aldrich) y Penicilina/Estreptomicina (1%, Gibco)], y se cultivaron en medio químicamente definido [CDM, que consiste de IMDM (50%, Gibco), F12 (50%, Gibco), lípidos concentrados (100x, Gibco), monotioglicerol (450 pM, Sigma-Aldrich), insulina (7 pg/ml, Roche), transferrina (15 pg/ml, Roche), albúmina de suero bovino fracción V (5 mg/ml), y Penicilina/Estreptomicina (1%)] suplementado con 10ng/ml Activina-A y 12ng/ml FGF2. Las células fueron pasadas en agrupamientos pequeños usando colagenasa cada 5 a 6 días.
La diferenciación de los hPSCs en las capas germinales se indujo en cultivos de hESC adherentes de acuerdo con protocolos de diferenciación dirigida publicados previamente para endodermo, mesodermo de placa lateral, y neuroectodermo (Touboul, T. y col. Hepatology 51, 1754-1765 (2010), Cheung y col, (2012) y Douvaras, P. y col. Stem Cell Reports 3, 250-259 (2014).) Brevemente, el endodermo definitivo se derivó al cultivar hPSCs por 3 días en CDM-PVA (sin insulina) suplementado con FGF2 (20ng/ml), Activina-A (100ng/ml), BMP4 (10ng/ml, Marko Hyvonen, Dept. de Biochemistry, Universidad de Cambridge), y LY-294002 (10 pM, Promega) 3. Para la derivación de neuroectodermo, se cultivaron hPSCs por 6 días en CDM-BSA suplementado con SB-431542 (10 pM, Tocris), LDN-193189 (0.1 pM, Tocris) y AR (0.1 pM, Sigma) 4. El mesodermo de placa lateral se obtuvo al cultivar hPSCs por 36h en CDMPVA suplementado con FGF2 (20 ng/ml), 10ng/ml BMP4 (R&D), y LY294002 (10pM), y por 3.5 días subsecuentes en CDM-PVA suplementado con FGF2 (20ng/ml) y BMP4 (50ng/ml).
Diferenciación de hESCs. La diferenciación se inició en cultivos adherentes de hESCs 48h después de las pasadas. Los cambios de medio fueron realizados generalmente diario, y los volúmenes fueron ajustados para la densidad celular. Los tipos de células maduras fueron obtenidos usando procedimientos descritos previamente en la técnica. Los tipos de células maduras obtenidos incluyeron células neurales, osteocitos, condrocitos, músculo liso, fibroblastos cardíacos, cardiomiocitos, intestino, páncreas, hepatocitos, colangiocitos o pulmón.
Constructos de direccionamiento de gen y clonación molecular
El diseño y construcción de los plásmidos de expresión de hROSA26 ARNg y Cas9n se describen aquí: Una estrategia basada en CRISPR/Cas9n para apuntar específicamente al lugar de hROSA26 y para insertar casetes inducibles usando recombinación homóloga. Para inducir un DSB genómico en el sito correcto de integración, se diseñó un sistema de CRISPR/Cas9 nickasa. En contraste a la nucleasa Cas9 de tipo silvestre usada comúnmente que sede deja por un único ARNg en su sitio diana genómico, el mutante D10A Cas9 nickasa (Cas9n) se dirige por un par de ARNg diseñados apropiadamente para introducir simultáneamente cortes de una sola cadena en ambas cadenas del ADN diana. Esta estrategia duplica eficazmente el número de bases requeridas para la edición del genoma y de este modo aumenta la especificidad. Se usó el software con base en la red “CRISPR Design Tool” para definir sitios diana potenciales para las nucleasas guiadas por crARN que están cerca al sitio de integración. Dentro de un alcance de secuencia de 250 bp alrededor del sitio diana (125 bp en cada sitio del sitio de integración real), el acierto superior produjo un par de ARNg que colectivamente alcanzaron una puntuación de “alta calidad” de 97, sin predicción de efectos fuera de diana. Los ARNg [ARNg-A 5'-GTCGAGTCGCTTCTCGATTA-(TGG)-3' y ARNg-B 5'-GGCGATGACGAGATCACGCG-(AGG)-3' (sitios PAM en paréntesis) fueron sintetizados de novo y ligados en vectores expresión. Los plásmidos finales codifican para cualquiera de los dos ARNg, respectivamente, y el mutante Cas9n D10A (Figuras 20 y 21).
Un plásmido de donador se construyó que sirve como un ADN de plantilla para facilitar la reparación dirigida a homología de un DSB inducido por Cas9n. Se generaron dos brazos de homología deOSA26 por amplificación de PCR de alta fidelidad. El ADN genómico que se aisló de hESCs de H9 sirvió como una plantilla. Los brazos de homología de 5' y 3' tuvieron 904bp y 869bp en longitud, respectivamente. Ambos fueron subsecuentemente insertados en el sitio de clonación múltiple del vector pUC19. Para apuntar al lugar de hROSA26, las células fueron transfectadas con el plásmido, los dos el constructo de ARNg/Cas9n y el plásmido de donador de EGFP (Figura 22)
El vector de direccionamiento pR26_CAG-rtTA (Figura 23) se construyó por clonación de la secuencia codificante de un rtTA de tercera generación (amplificado por Pc R de pLVX-Tet3G) en los sitios BamHI/MluI de pR26_CAG-EGFP reemplazando así la secuencia de EGFP. Los plásmidos de expresión de AAVS1 ZFN fueron un regalo generoso del Dr. Kosuke Yusa (Instituto Wellcome-Trust Sanger). El vector de direccionamiento de EGFP AAVS1 inducible se construyó por Gibson Assembly (New England Biolabs) en el que se ligaron tres inserto en los sitios EcoRI/HindIII del sitio de clonación múltiple del vector pUC19 (Thermo Fisher Scientific): El primer inserto comprendió el brazo de homología de AAVS1 en dirección 5', un aceptor de empalme, un sitio T2A y el casete de resistencia a puromicina (amplificado por PCR de pTRE-EGFP; addgene 22074, depositado por Rudolf Jaenisch). El segundo inserto contuvo el promotor de TRE3G inducible (amplificado por PCR de pLVX-TRE3G). El tercer inserto comprendió la expresión del casete de EGFP y el brazo de homología de AAVS1 en dirección 3' (amplificado por PCR de pTRE-EGFP; addgene 22074, depositado por Rudolf Jaenisch). El plásmido resultante se denominó pAAV_TRE-EGFP (Figura 32). Los vectores de direccionamiento pAAV_TRE-NGN2 y pAAV_TRE-MYOD1 (Figura 33) fueron construidos por clonación de la secuencia codificante NGN2 y MYOD1, respectivamente (NGN2: amplificado por PCR de pLVX-TRE-NGN2, regalo de Oliver Brüstle; MYOD1: amplificado por PCR de un plásmido de ADNc disponible comercialmente, Open Biosystems MHS6278-202832821, Acceso: BC064493, ID de Clon: 5022419) en los sitios SpeI/EcoRI de pAAV_TRE-EGFP, reemplazando así la secuencia de EGFP.
También se crearon plásmidos adicionales usando procedimientos similares, y todos los plásmidos usados se representan en las Figuras 20 a 33. Estos plásmidos fueron ya sea creados o donados generosamente. Los plásmidos usados en los ejemplos incluyen (en orden de las figuras 20 a 33): pSpCas9n(BB),_R26-R, pSpCas9n(BB) (se predice que la combinación de estos dos plásmidos induce una ruptura de cadena doble específica en el intrón entre los exones 1 y 2 de THUMPDS3-AS1 en el cromosoma 3 (lugar ROSA26)),_R26-L pR26_CAG_EGFP, pR26_CAG_rtTA, pZFN-AAVS1-L-ELD (nucleasa de dedo de zinc izquierda), pZFN-AAVS1-R-KKR (nucleasa de dedo de zinc derecha), pAAV_CAG_EGFP (donador), pR26-Neo_CAG-OPTtetR (direccionamiento de hROSA26 de terR de codónoptimizado), pAAV-Puro_iKD (direccionamiento de AAVS1 de ARNsh inducible), pAAV-Neo_CAG-Cas9 (direccionamiento de AAVS1 de Cas9), pAAV-Puro_siKO (direccionamiento de AAVS1 de ARNg inducible,), pAAV-Puro_siKO-2TO (direccionamiento de AAVS1 de ARNg inducible, versión con 2 operones tet en el promotor), pAAV_TRE-EGFP ( sobre-expresión inducible de EGFP, unida) y pAAV_TRE-MYOD1 (sobre-expresión inducible de MYOD1 para músculo).
Direccionamiento del gen
El direccionamiento del lugar hROSA26 y el AAVS1 para reducción de la expresión génica y desactivación génica del gen se realizó por nucleofección. Células madre pluripotentes humanas (PSCs) fueron disociadas a células simples con TrypLE Select (Gibco), y 2x106 células fueron nucleofectadas (100jl de volumen de reacción; total de 12|jg de ADN, que se dividió igualmente entre los dos plásmidos de ARNg/Cas9n y el vector de direccionamiento) usando el Kit Lonza P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X y el ciclo CA-137 del Sistema Lonza 4D-Nucleofector. Se colocaron en placas hPSCs Nucleofectadas sobre fibroblastos embrionarios de ratón resistentes a fármacos múltiples (DR4) y se cultivaron en medio KSR [que consiste de DMEM/F12 Avanzado (80%), reemplazador de suero de desactivación génica (20%, Gibco), L-Glutamina (1 mM), 2-Mercaptoetanol (0.1 mM) y Penicilina/Estreptomicina (1%)] suplementado con FGF2 (4ng/ml, Departamento de Bioquímica, Universidad de Cambridge). Se agregó Y-27632 (5 pM, Tocris) por 24h antes y después de la nucleofección para promover la supervivencia celular. Después de 3 a 6 días, se seleccionaron los hPSCs resistentes a neomicina al agregar G418 (50 jg/ml, Sigma-Aldrich) por 7 a 10 días.
Subsecuentemente, se escogieron clones individuales, se expandieron en condiciones libres de alimentador y finalmente se analizaron por genotipificación.
El direccionamiento del lugar AAVS1 también se realizó por lipofección. Los PSCs humanos se sembraron en condiciones libres de alimentador en placas de 6 pocillos, y se transfectaron 48h después de la pasada. La transfección se realizó en Opti-MEM (Gibco) suplementado con Lipofectamina2000 (10 pl/pocillo, Thermo Fisher Scientific) y un total de 4 |jg de ADN (dividido igualmente entre los dos plásmidos de AAVS1 z Fn y el vector de direccionamiento) por 24h. Después de 3 a 5 días, los hPSCs resistentes fueron seleccionados al agregar puromicina (1 jg/ml, Sigma-Aldrich) por 5 a 8 días. Subsecuentemente, se escogieron clones individuales, se expandieron y analizaron por genotipificación. Se puede usar resistencia a antibióticos para seleccionar las líneas clonales.
Los clones de hPSC resistentes a fármacos de experimentos de direccionamiento fueron investigados por PCR genómico para verificar la integración del casete inducible específico de sitio, para determinar el número de alelos diana, y para excluir las integraciones fuera de diana. Los PCRs fueron realizados con LongAmp Taq ADN Polimerasa (New England Biolabs). La Tabla 2 reporta las primeras combinaciones usadas para los diversos vectores de direccionamiento. Los resultados de todos los experimentos de direccionamiento se resumen en la Tabla 1. Se realizó análisis de cariotipo por técnicas de bandas G estándar (Medical Genetics Service, Cambridge University Hospitals). Para preparar los PSCs humanos diana para análisis de cromosoma, las células fueron incubadas en medio de cultivo fresco suplementado con Y-27632 (5 pM, Tocris) y KaryoMAX Colcemid (100 ng/ml, Gibco) por 4h a 37°C. Subsecuentemente, las células fueron cosechadas como células simples, lavadas, y pelletizadas. Se logró el hinchamiento del núcleo y la diseminación de los cromosomas por tratamiento con solución hipotónica de KCl 0.055 M por 5 a 10 minutos. Finalmente, las células se fijaron con metanol y ácido acético glacial (relación 3:1).
Para OPTiKD, el direccionamiento de AAVS1 se realizó por lipofección como se describió previamente. Brevemente, los hPSCs fueron sembradas en placas de 6 pocillos libres de alimentación, y transfectadas 48 h después de la etapa de las células con 4 jg de ADN (dividido igualmente entre los dos plásmidos AAVS1 ZFN y el vector de direccionamiento) usando 10 j l por pocillo de Lipofectamina 2000 en medio Opti-MEM (Gibco) por 24 h, todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de 4 días, se agregó 1 jg ml-1 de Puromicina al medio de cultivo, y se escogieron clones individuales y se expandieron después de 7 a 10 días de la selección.
Para un solo sitio OPTiKO, el direccionamiento de AAVS1 se realizó por nucleofección. hESCs pre-tratados por 16 h con Y-27632 10 jM (Tocris) fueron disociados a agrupamientos de 2 a 8 células usando Accutase (Gibco), y 2 x 106 células fueron nucleofectadas en 100 j l con un total de 12 jg de ADN (4 jg para cada uno de los dos plásmidos ZFN, y 2 jg cada uno de los dos vectores de direccionamiento) usando el kit Lonza P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X y el ciclo CA-137 en un sistema Lonza 4D-Nucleofector, todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los hESCs nucleofectados fueron colocados en placas sobre una capa de alimentador de DR4 irradiado (resistente a puromicina y neomicina) fibroblastos embrionarios de ratón y se cultivaron en medio KSR suplementado con 4 ng ml-1 FGF2 y Y-27632 10 jM (este último solo por las primeras 24 h). Después de 4 días, las colonias de hPSC portando tanto el gen de resistencia a puromicina como el de resistencia a neomicina fueron seleccionados por 7 a 10 días con 25 jg ml-1 de Geneticin (G418 Sulfate, Gibco) y 0.5 jg ml-1 Puromicina. Entonces se eligieron clones individuales y se expandieron en condiciones libres de alimentador.
hESCs de AAVS1-EGFP, ROSA26-EGFP, ROSA26-STDtetR, ROSA26-OPTtetR, y ROSA26-EGFPd2 fueron generados por lipofección (lugar AAVS1) o nucleofección (lugar ROSA26) de los vectores de direccionamiento con pares AAVS1 ZFN o ROSA26 CRISPR/Cas9n (como se describió anteriormente). Se usó 2 jg ml-1 Blasticidin S-HCl (Gibco) para el plásmido pR26-Bsd_CAG-EGFPd2. La generación de hESCs de sobre-expresión de EGFP inducible que portan transgenes ROSA26-rtTA y AAVS1-TRE-EGFP se describe en algún otro lado. Brievemente, las células fueron primero la diana del gen secuencialmente por nucleofección de pR26-Neo_CAG-rtTA con plásmidos ROSA26 CRISPR/Cas9n, luego por lipofección de pAAVPuro_ TRE-EGFP con plásmidos AAVS1 ZFN.
Se investigaron las líneas clonales de hPSC diana gel gen por PCR genómico para verificar el direccionamiento específico de sitio, determinar el número de alelos diana, y excluir las integraciones fuera de diana del plásmido de direccionamiento (véase la Figura 16A).
Sobre-expresión del casete inducible
La sobre-expresión de casetes inducibles (EGFP, NGN2, MYOD1 y OLIG2-SOX10, respectivamente) se indujo al agregar hiclato de doxiciclina (Sigma-Aldrich) al medio de cultivo. A menos que se indique de otro modo se usó doxiciclina a una concentración final de 1 jg/ml. El medio que contiene doxiciclina se mantuvo protegido, y se cambió cada 24 horas. Las células que expresan EGFP son en esta invención denominadas OPTi-EGFP, esas que expresan NGN2 son denominadas OPTi-NGN2, las células que expresan MYOD1 son llamadas OPTi-MYOD1 y las células que expresan OLIG2-SOX10 son llamadas OPTi- OLlG2-SOX10.
Desactivación génica y reducción de la expresión génica del gen inducible
A menos que se describa de otro modo en las leyendas de las Figuras o Ejemplos, se usó clorhidrato de tetraciclina (sigma-Aldrich) a 1 |jg mM para inducir la reducción de la expresión génica o desactivación génica del gen.
Inducción de neuronas
Células OPTi-NGN2 pluripotentes fueron disociadas en células simples con TrypLE y se colocaron en placas sobre cajas revestidas de Matrigel (35 pg/cm2, Scientific Laboratory Supplies) a una densidad de 75.000 células por pocillo de una placa de 12 pocillos. Se inició la programación directa 24 a 48 horas después de la división. A menos que se indique de otro modo, la inducción se realizó en DMEM/F12 (Gibco) suplementado con Glutamax (100x, Gibco), Aminoácidos No Esenciales (100x, Gibco), 2-Mercaptoetanol (50 pM), Penicilina/Estreptomicina (1%), y doxiciclina (1 pg/ml). Después 2 días de inducción, se cambió el medio a medio Neurobasal suplementado con Glutamax (100x), B27 (50x, Gibco), BDNF (10 ng/ml, Peprotech), NT3 (10 ng/ml, R&D Systems), Penicilina/Estreptomicina (1%), y doxiciclina (1 pg/ml).
Inducción de miocitos esqueléticos
Células OPTi-MYOD1 pluripotentes fueron disociadas en células simples con TrypLE y se colocaron en placas sobre cajas revestidas de gelatina/medio MEF a una densidad de 100.000 células por pocillo de una placa de 12 pocillos. Se inició la programación directa 24 a 48 horas después de la división. A menos que se indique de otro modo, la inducción fue realizada en DMEM (Sigma-Aldrich) suplementado con L-Glutamina (2 mM), 2-Mercaptoetanol (50 pM), Penicilina/Estreptomicina (1%), insulina (7 pg/ml), ácido retinoico todo trans (1 pM, Sigma-Aldrich), y doxiciclina (1 pg/ml). Después 5 días de inducción, el medio fue suplementado con CHIR99021 (3 pM, Tocris) y suero de caballo inactivado por calor (2%, Gibco) para aumentar la maduración.
Inducción de Oligodendrocitos
hPSCs OLIG2-2A-SOX10 OPTi-OX pluripotentes fueron cultivados en colonias en cajas de cultivo revestidas con gelatina/MEF. Antes de comenzar la inducción fueron tratados con SB y LDN durante la noche. El día siguiente la inducción se inició en CDM suplementado con doxiciclina (1 jg/m l) y a R (0.1 jM ). Un día después de la inducción, las células fueron divididas en Cd M suplementado con AR (0.1 pM), PM (1 jM ), y Y-27632 (5 jM ), PDGFaa (20 ng/ml, Peprotech), FGF2 (5 ng/ml) sobre cajas de cultivo revestidas con PDL/laminina (100.000 células por pocillo de una placa de 12 pocillos). El día siguiente las células fueron cambiadas a medio de oligodendrocito que consiste de DMEM/F12, suplementado con Glutamax (100x), Aminoácidos No Esenciales (100x), 2-Mercaptoetanol (1000x), Penicilina-Estreptomicina (100x), Suplemento N2 (100x), Suplemento B27 (50x), Insulina 7 jg/m l (Marko Hyvonnen), T3 60 ng/ml (Sigma), Biotina 100 ng/ml (Sigma), db-cAMP 1 jM (Sigma). El medio de oligodendrocito fue suplementado con dox (1 jg/ml), PDGFaa (20 ng/ml), FGF2 (5 ng/ml), AR (0.1 jM ) y PM (1 jM ). Siete días post­ inducción se retiraron el a R y PM. Para mantener a las células inducidas en un estado proliferativo, las células fueron pasadas cada 4 días (75.000 células por pocillo de una placa de 24 pocillos) en la presencia continua de los mitógenos PDGFaa y FGF2. Para la diferenciación de precursores de oligodendrocito proliferativo, se retiraron el PDGFaa y FGF2. NT3 recombinante humano (5 ng/jl, R&D Systems) se agregó para aumentar la supervivencia celular.
PCR Cuantitativo en tiempo real (qPCR)
El ARN se extrajo usando el kit GenElute Mammalian Total ARN Miniprep Kit y el Equipo de On-Column DNAse I Digestion (Sigma-Aldrich). La síntesis de ADNc se realizó con el Kit Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific). Se usó Applied Biosystems SYBR Green PCR Master Mix para el qPCR. Las muestras fueron corridas en la máquina de p Cr rápido Applied Biosystems 7500. Todas las muestras fueron analizadas en duplicados técnicos y normalizadas al gen de mantenimiento Porfobilinogen Desaminasa 1 (PBGD). Los resultados fueron analizados con el procedimiento AACt. Véase la Tabla 3 para las secuencias del cebador.
Citometría de flujo
Para el análisis de expresión de EGFP las células fueron cosechadas con TrypLE Select (Gibco) por 5 a 10 minutos a 37°C para obtener una suspensión de una célula. Después de un lavado con PBS, las células fueron resuspendidas en PBS enfriado en hielo suplementado con DAPI (10 jg/ml), e incubadas por 5 minutos en hielo. Las células fueron analizadas usando un citómetro de flujo Cyan ADP para determinar los niveles de expresión de EGFP de células viables (negativo a DAPI). Para la tinción y análisis de la expresión de cadena pesada de miosina las células fueron cosechadas con TrypLE Select (como para el análisis de expresión de EGFP), lavadas una vez con PBS, y fijadas y permeabilizadas con solución de Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). Subsecuentemente, las células fueron lavadas y bloqueadas en regulador de Perm/Wash (BD Biosciences) suplementado con albúmina de suero bovino al 3% (BSA) a 4°C durante la noche. La tinción con un anticuerpo anti-MYH conjugado a PE (Tabla 4) se realizó en regulador Perm/Wash por 1h a 4°C en la oscuridad. Después de tres lavadas con regulador Perm/Wash las células fueron analizadas con un citómetro de flujo Cyan ADP para determinar los niveles de expresión de MHC. Se realizó el análisis de datos con FlowJo (v10) y Graphpad Prism (v6).
Transferencia Western
Se extrajo la proteína de la célula entera con CelLytic M (Sigma-Aldrich) suplementado con Inhibidor de Proteasa Completo (Roche), y subsecuentemente se cuantificó usando el Kit rápido de Cuantificación de Proteínas (Sigma-Aldrich). Se realizó electroforesis de proteínas con Regulador de Muestra NuPAGE LDS y 4-12% de Geles NuPAGE Bis-Tris Precast (Invitrogen). Después de la transferencia de la proteína en PVDF, las membranas fueron bloqueadas con PBS suplementado con 0.05% Tween-20 (PBST) 4% de leche por 1h a temperatura ambiente, y se incubaron con anticuerpos primarios durante la noche en PBST 4% de leche. Las membranas fueron lavadas con PBST, incubadas con anticuerpos secundarios conjugados a HRP (Sigma-Aldrich) en PBST 4% leche, incubadas con Sustrato de Transferencia Western Pierce ECL2 (Thermo Fisher Scientific), y expuestas a Películas de Rayos X Super RX (Fujifilm).
Inmunocitoquímica
Las células fueron fijadas en paraformaldehído al 4% (diluido en PBS) por 20 minutos a temperatura ambiente y subsecuentemente lavadas tres veces con PBS. Las células fueron luego bloqueadas con suero de burro al 10% (Sigma-Aldrich) y permeabilizadas con Triton X-100 al 0.3% (diluido en PBS) por 20 minutos a temperatura ambiente. Subsecuentemente, las células fueron incubadas con anticuerpos primarios apropiadamente diluidos (procedimiento experimentales complementarios) en suero de burro al 2% y Triton X-100 al 0.1% (diluido en PBS) a 4°C durante la noche. Se omitió el Triton-X a través de todas las etapas cuando se tiñó el antígeno de superficie PDGFRA, A2B5, y O4. Después de tres lavadas con PBS, las células fueron incubadas por 1 hora a temperatura ambiente con correspondientes anticuerpos secundarios conjugados a fluoróforo de burro (Alexa Fluor 488, 555, 568, y/o 647) en PBS suplementado con suero de burro al 1%. Los nucleos fueron visualizados con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Thermo Fisher Scientific). La expresión de EGFP y la inmunotinción fueron sometidas a formación de imagen usando un microscopio confocal Zeiss LSM 700 (Leica). El porcentaje de células positivas a pIII-tubulina fue calculado al determinar la expresión de pIII-tubulina en por lo menos 50 células positivas a DAPI seleccionadas aleatoriamente en 3 campos visuales de 3 réplicas biológicas usando un microscopio invertido de fluorescencia Olympus IX71.
Se realizó el análisis estadístico con GraphPad Prism (v6). El número de réplicas, la prueba estadística usada, y los resultados de la prueba se describen en las leyendas de las Figuras. A menos que se indique de otro modo los datos se presentan como media ± SEM.
Ejemplo 1: Direccionamiento doble de EGFP
Para desarrollar una plataforma de sobre-expresión inducible en hPSCs, nosotros apuntamos secuencialmente a los dos componentes del sistema Tet-ON en dos diferentes GSHs. Un rtTA de tercera generación expresado constitutivamente fue la diana en el lugar de ROSA26 humano (hROSA26) al usar una estrategia de direccionamiento basada en CRISPR/Cas9n y un casete inducible de EGFP inducible se insertó en el AAVS1 (Figura 1A; Figuras 4A a 4C). Ambos direccionamientos a hROSA26 y AAVS1 fueron altamente eficientes (Figuras 4D a 4F, Tabla 1) y no afectaron la estabilidad genómica de hPSC, auto-renovación, y diferenciación (no se muestran datos), argumentando por lo tanto contra la toxicidad celular dependiente de rtTA.
Luego se seleccionaron clones diana de GSH doble que portaron ya sea una o dos copias de cada uno de los dos casetes inducibles (Figura 5A). El direccionamiento homocigoto del rtTA resultó en aproximadamente niveles dos veces más altos de proteína rtTA (Figura 5B), y también en un aumento significativo en los niveles de EGFP después de la inducción, cuando se comparó con la expresión de rtTA heterocigoto (Figuras 5C a 5E). Además, los clones con direccionamiento homocigoto del casete de EGFP inducible mostró niveles más altos y más homogéneos de EGFP en comparación con las líneas con direccionamiento heterocigoto (Figuras 5C a 5E). De importancia, todas las líneas dirigidas correctamente mostraron una expresión de EGFP inducible robusta, que fue por lo menos veinte veces más alta en comparación con el promotor de CAG constitutivo fuerte (Figura 1B, Figuras 5C a 5E). Colectivamente, estos resultados soportan nuestra hipótesis inicial de que el direccionamiento de dos copias de ambos elementos del sistema Tet-ON podría resultar en la máxima expresión después de la inducción. El pico de los niveles de EGFP fue alcanzado aproximadamente cuatro días después de la inducción, y la expresión fue revertida rápidamente con el retiro de la doxiciclina (Figura 1C). Más aún, la expresión de EGFP podría ser titulada al ajustar la dosis de doxiciclina (Figura 1D). De importancia, la expresión de EGFP inducible no solo fue altamente eficiente en hPSCs, sino también durante la diferenciación en las capas germinales (no se muestran datos fotográficos a color, datos en las Figuras 6A a 6D). Finalmente, y en concordancia con el control transcripcional fuerte conocido de los sitemas Tet-ON de tercera generación, no hubo expresión de fondo detectable de ARNm de EGFP o proteína en la ausencia de doxiciclina según se determinó por citometría de flujo y qPCR, respectivamente (Figura 1B, Figura 6D). Sobre todo, estos resultados establecieron que el direccionamiento de GSH doble del sistema Tet-ON es una estrategia poderosa para la expresión óptima de casetes inducibles en hPSCs y sus derivados.
Ejemplo 2: Derivación de neuronas corticales excitatorias de hESC y hiPSC
Estudios previos mostraron que estas células puede ser derivadas fácilmente por sobre-expresión lentiviral de cualquiera de los factores pro-neuronales bHLH (ASCL1, NGN2, o NEUROD1) en hPSCs. Por lo tanto, nosotros generamos hPSCs de OPTi- NGN2 (Figura 2A, Tabla 1). La inducción de NGN2 resultó en la rápida sub-regulación de factores de pluripotencia (Figura 7) y el inicio de un programa transcripcional neuronal (Figura 2B). Las células inducidas exhibieron procedimientos neuronales tan tempranamente como tres días post-inducción (datos no mostrados). Después de una semana, todas las células presentaron una morfología neuronal y expresaron proteínas marcadoras pan-neuronales, tales como pMI-tubulina y MAP2 (Figura 2C). El RT-PCR cuantitativo reveló una fuerte inducción de marcadores de cerebro anterior típicos tales como BRN2 y FOXG1, y de neuronas glutamatérgicas incluyendo GRIA4 y VGLUT2 (Figura 2B), indicativo de una identidad neuronal cortical excitatoria. Colectivamente, estos resultados demostraron una mejora dramática tanto en velocidad como en eficiencia en la generación de neuronas en comparación con los protocolos tradicionales de diferenciación de hPSC, y un aumento sustancial en la eficiencia y pureza con respecto a ambos protocolos de programación directa basados en transdiferenciación y lentivirales. Resultados similares fueron obtenidos con hiPSCs de OPTi-NGN2, confirmando la robustez de este procedimiento. Finalmente, no observamos ninguna caída en la eficiencia de inducción neuronal durante periodos de cultivo extendidos de hPSCs Opti-NGN2 (>25 pasadas, Figura 2C). Sobre todo, nuestros resultados demostraron que los hPSCs OPTi-NGN2 se pueden usar como una fuente inagotable de generación casi determinística, libre de virus, de una sola etapa, rápida, altamente escalable, y no limitada de neuronas.
Ejemplo 3: Generación de miocitos esqueléticos
El factor de transcripción MYOD1 es conocido por inducir transdiferenciación miogénica cuando se sobre-expresa en una variedad de tipos de células somáticas, sin embargo, la capacidad de los hPSCs de sufrir programación directa miogenética inducida por MYOD1 está en debate actualmente. Nosotros generamos hPSCs OPTi -MYOD1 (Tabla 1), pero notamos que la inducción de la expresión de MYOD1 después de tratamiento de doxiciclina resultó en muerte celular casi completa dentro de 3 a 5 días en un amplio intervalo de condiciones de cultivo que fueron sugeridas previamente para facilitar la conversión de hPSCs en miocitos esqueléticos. Ya que está ampliamente establecido que se pueden mejorar las estrategias de reprogramación celular al combinar la sobre-expresión de factor de transcripción con pistas de señalización extracelular, nosotros realizamos una clasificación sistemática para factores promiogénicos al modular las cascadas de señalización principales que están implicadas en la formación de rasgos primitivos, somitogénesis, y miogénesis. Nosotros encontramos que la adición de ácido retinoico todo trans (AR) conjuntamente con la sobre-expresión de MYOD1 resultó en la conversión rápida y casi completa en miocitos positivos dobles de cadea pesada de miosina (MHC) y miogenina por el día 5 después de inducción. El efecto de AR fue dependiente de la concentración y mediada a través de las isoformas del receptor de AR RARa y RARp, consistente con el patrón de expresión de los receptores de AR durante la miogénesis de desarrollo (Figura 8). Se piensa que este efecto es independiente del mecanismo de sobre-expresión de MYOD1. Los miocitos esqueléticos inducidos presentaron una morfología alargada, de tipo husillo típica, que sufrió fusión celular extensa y exhibió fuerte expresión de marcador miogénico en ambos niveles de ARNm y de proteína (Figura 3B, Figura 9a a 9C). La adición de concentraciones nanomolares de acetilcolina (ACh) o el agonista del receptor de ACh selectivo carbacol resultó en la contracción completa de la fibra muscular, demostrando la funcionalidad de los miocitos inducidos. Se obtuvieron resultados similares con hiPSCs Opti-MYODI (datos no mostrados). De importancia, la eficiencia de inducción miogénica no disminuyó durante periodos de cultivo extendidos (>50 pasadas, Figura 3D), así que demuestran la robustez y reproducibilidad de este procedimiento. Finalmente, nosotros notamos que los niveles del casete inducible de MYOD1 se correlacionaron positivamente con la eficiencia de conversión, lo que resalta la importancia de un suministro robusto del gen y la superioridad de este procedimiento durante los enfoques de reprogramación mediada por lentivirus (Figura 10). Sobre todo, la estrategia de programación directa de OPTi-MYOD1 es aproximadamente siete veces más rápida y cinco veces más eficiente que la mayoría de los protocolos de diferenciación más recientes de hPSCs en miocitos esqueléticos. en comparación con protocolos previos de programación directa (Tanaka, A. y col. PLoS One 8, e61540 (2013) y Abujarour, R. y col. Stem Cells Transí. Med. 3, 149-60 (2014)) es más eficiente (>95% contra 30-80%), libre de casetes inducibles insertados aleatoriamente, químicamente definidos, completamente reproducibles, y más escalables.
Estos hallazgos demuestran que este procedimiento de controlar la expresión del casete inducible en hPSCs se puede usar como una fuente inagotable para la fabricación de alto rendimiento y a gran escala de poblaciones homogéneas de células. La velocidad de inducción y la pureza de las células diana deseadas actualmente no tienen rival por los otros procedimientos.
Ejemplo 4: Generación de precursores de Oligodendrocitos y de Oligodendrocitos
hPSCs OPTi-OX que portan SOX10 inducible ya sea solo o en combinación con OLIG2 en forma de un casete de expresión bicistrónico. Aunque las células inducidas con SOX10 solo expresaron robustamente el marcador O4 del precursor de oligodendrocito (OPC) después 10 días de inducción, estas células fallaron en diferenciarse más en células que expresan mielina y murieron progresivamente. En contraste, las células de doble sobre-expresión de OLIG2-SOX10 progresaron fácilmente de una etapa progenitora positiva a O4 en un fenotipo maduro positivo a CNP/MBP a los 20 días post-inducción. Más aún, un análisis adicional de expresión de proteína marcadora confirmó que los hPSCs de OPTi-OLIG2-SOX10 se indujeron en medio de oligodendrocito (Douvaras y col.2014) suplementado con los mitógenos PDGFaa y el FGF2 primero pasó a través de una etapa tipo OPC en las que fueron altamente proliferativas y en la que ellas co-expresaron PDGFRA, A2B5, y O4. Estas células fueron altamente proliferativas y se pudieron mantener por lo menos por tres pasadas (Figura 12B) al cultivarlas en la presencia de mitógenos. Nosotros por lo tanto llamamos a estas células i-OPCs, por OPCs inducidas. Notablemente, después de retirar los mitógenos y en la presencia contina de doxiciclina, las i-OPCs fácilmente se diferenciaron en aproximadamente una semana en oligodendrocitos maduros que expresan las proteínas mielinas principales CNP, PLP, MAG, MOG y MBP (Figura 12C a 12D) que fueron capaces de formación de revestimiento de mielina (datos no mostrados). Colectivamente, estos resultados demostraron que la invención permitió el desarrollo de un protocolo de programación directa de hPSC nuevo, robusto y rápido para la generación de precursores de oligodendrocitos y oligodendrocitos.
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Tabla 2
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T l Li r r P R ni iv
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Tabla 4 Lista de anticuer os
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Ejemplo 5: Sistema de reducción de la expresión génica inducible TET-ON
Desarrollo de una plataforma de reducción de la expresión génica inducible optimizada en hPSCs.
Nosotros generamos líneas hESC en las que se pudo silenciar un transgén de EGFP en un modo inducible (Figura 14B). Para eso, nosotros apuntamos a: (1) un casete de expresión de CAG-tetR en el lugar ROSA26; y (2) un transgén CAG-EGFP más un casete de ARNsh de EGFP inducible en el lugar AAVS1 (Figura 14A, 14B). Para expresar niveles más altos de la proteína tetR para reprimir más fuertemente la expresión de ARNsh en la ausencia de tetraciclina. Para esto, nosotros realizamos un ARN de parámetros múltiples y optimización de codón del ADNc de tetR bacteriano, y usamos el tetR de codón optimizado resultante (OPTtetR) para generar nuevas líneas de hESC de reducción de la expresión génica inducible de EGFP (Figura 14B). Esta modificación permitió un aumento de diez veces en la expresión de tetR cuando se compara con la secuencia estándar (STDtetR; Figura 14D). Además, la expresión homocigota del OPTtetR fue suficiente para prevenir completamente la filtración del ARNsh mientras conservó completamente la inducción de la reducción de la expresión génica eficiente (Figura 14C). De apreciar, la reducción de la expresión génica inducible fue rápida, reversible, y sensible a la dosis (Figura 14E, 14F). Finalmente, los hESCs inducibles presentaron un cariotipo normal (datos no mostrados), que demuestran que el diseño del genoma necesario para crear estas líneas no altera su estabilidad genética.
Con base en estos resultados motivantes, nosotros validamos además este procedimiento en el contexto de genes endógenos al genera hESCs que portan ARNsh inducibles contra POU5F1/OCT4 o B2M (datos no mostrados). Notablemente, todas las sublíneas analizadas (6 por cada gen) mostraron una reducción de la expresión génica inducible robusta sin filtración significativa de ARNsh. La titulación de tetraciclina identificó las concentraciones óptimas para la reducción de la expresión génica de OCT4 parcial o completamente. Como se esperaba, una fuerte disminución en OCT4 específicamente resultó en la pérdida de pluripotencia y la inducción de neuroectodermo y marcadores definitivos de endodermo. Se obtuvieron resultados similares con 20 sublíneas adicionales de hESC de reducción de la expresión génica inducible de OCT4, confirmando la robustez y reproducibilidad de este procedimiento. De importancia, la generación de hESCs con la reducción de la expresión génica fuerte y muy regulada fue tan eficiente que el análisis fenotípico pudo realizarse inmediatamente después de la selección de antibiótico en una población mixta de células, derivando de este modo completamente la necesidad de escoger colonias individuales para aislamiento clonal. Sobre todo, estos resultados establecen que el direccionamiento doble de GSHs con un sistema de reducción de la expresión génica inducible optimizado es un procedimiento poderoso para controlar la expresión génica en hPSCs. Este enfoque es llamado en lo sucesivo OPTiKD, por reducción de la expresión génica inducible OPTimizada (Figura 14A).
Ejemplo 6
La capacidad de reducción de la expresión génica de genes en una variedad de células diferenciadas podría representar un avance significativo sobre los sistemas previos para la reducción de la expresión génica de genes inducibles. Para probar perfectamente esta posibilidad, nosotros analizamos la eficacia de la plataforma OPTiKD para la reducción de la expresión génica de un transgén de EGFP en hPSCs diferenciados en las tres capas germinales, así como en un panel de trece tipos de células completamente diferenciados (Figura 15A). Para ambos procedimientos, los análisis de qPCR demostraron una fuerte e inducible reducción de la expresión génica de transcritos de EGFP en todos los linajes probados (Figura 17). Las observaciones microscópicas confirmaron la disminución robusta en la expresión de la proteína de EGFP, y la citometría de flujo mostró una disminución de fluorescencia de EGFP por más de 70% para la mayoría de los linajes (datos no mostrados).
Ejemplo 7
Desarrollo de una plataforma de CRISPR/Cas9 inducible optimizada en hPSCs.
Volteamos nuestra atención al desarrollo de un enfoque de desactivación génica inducible. Los procedimientos actuales de CRISPR/Cas9 inducible se basan en la sobre-expresión condicional de Cas9 en la presencia de un ARNg expresado constitutivamente. En este caso, el control de la sobre-expresión de Cas9 se logra por un procedimiento de TET-ON en el que después de tratamiento de doxiciclina un transactivador inverso controlado de tetraciclina (rtTA) activa un promotor de elemento sensible a tetraciclina dependiente de Pol II (TRE) (una fusión entre múltiples operones de TET y un promotor mínimo de CMV). Mientras esta plataforma de TET-ON ha sido aplicada exitosamente a ciertos tipos de células humanas, nosotros observamos que este sistema inducible es silenciado durante la diferenciación de hPSC en múltiples linajes (incluyendo cardiomiocitos, hepatocitos, y células de músculo liso), incluso después del direccionamiento en el GHS de AAVS1 (datos no mostrados). Nosotros exploramos la posibilidad de desarrollar una alternativa y de mejorar el procedimiento al combinar un Cas9 impulsado por promotor CAG expresado constitutivamente con un casete inducible de ARNg basado en el uno desarrollado para la expresión de ARNsh inducible (Figura 18A, 18B). Nosotros por lo tante generamos las líneas hESCs en las que un gen reportero fluorescente pudo ser desactivado génicamente en un modo inducible (Figura 18C). Para esto, nosotros apuntamos a hESCs reporteros de ROSA26-EGFPd2 con ambos de un ARNg de EGFP inducible y un Cas9 constitutivo en el lugar AAVS1, cada transgén siendo integrado en uno de los dos alelos. Este enfoque de direccionamiento doble fue rápido (<2 semanas) y eficiente (>90% de líneas que contienen ambos transgenes. Notablemente, cuando las sublíneas clonales individuales fueron cultivadas en la presencia de tetraciclina observamos la expresión disminuida de EGFPd2 en todas las líneas diana, y las células homocigotas de EGFPd2 mostraron una pérdida casi homogenénea de por lo menos una copia del gen reportero tan temprano como cinco días después de la inducción de tetraciclina (como se demuestra por la reducción del 50% en la fluorescencia de EGFPd2). El tratamiento prolongado con tetraciclina llevó a una pérdida completa progresiva de fluorescencia de EGFPd2 en hasta 75% de células homocigotas de EGFPd2 (datos no mostrados). De modo interesante, la co-expresión de cualquiera dos o tres copias del mismo casete de ARNg de EGFP del mismo lugar AAVS1 fue suficiente para aumentar significativamente la velocidad y eficiencia de la desactivación génica de EGFPd2 inducible en todas las sublíneas clonales analizadas. Por ejemplo, la inducción simultánea de tres copias del mismo ARNg resultó en una eficiencia de desactivación génica notable de 95% después de tratamiento de tetraciclina. De importancia, los hESCs de desactivación génica de EGFPd2 inducible no mostraron ninguna disminución significativa en la proporción de células positivas a EGFPd2 ni en su fluorescencia después de cultivo prolongado en la ausencia de tetraciclina, incluso cuando se usaron muchas copias de ARNg. Esto demostró que se controló fuertemente la expresión del ARNg inducible. Finalmente, las pruebas de ARNg adicionales contra EGFPd2 reveló que la velocidad y eficiencia de la desactivación génica inducible se basó

Claims (20)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento ex vivo para controlar la transcripción de una secuencia genética en una célula que comprende
a) inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y.
b) inserción dirigida de un casete inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende dicha secuencia genética operativamente vinculada a un promotor inducible, y dicho promotor está regulado por la proteína reguladora transcripcional;
donde dichos sitios de anclaje seguro genéticos primero y segundo son diferentes, y.
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
2. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia genética es un transgen o codifica un ARN no codificado.
3. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque la actividad de dicha proteína reguladora transcripcional es controlada por una sustancia suministrada de manera exógena.
4. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicha proteína reguladora transcripcional se expresa constitutivamente.
5. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, donde dicha proteína reguladora transcripcional es seleccionada de cualquiera de: Tetraciclina - proteína reactiva del activador transcripcional (rtTa), el represor de tetraciclina (TetrR), el receptor sintético VgECR o una proteína reguladora transcripcional híbrida que comprende un dominio de unión del ADN de la proteína de la levadura Gal4, un dominio de unión del ligando truncado del receptor humano de la progesterona y un dominio de activación del NF-kB humano.
6. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en la reivindicación 5, caracterizado porque la actividad de rtTA es controlada por tetraciclina o un derivado de la misma, opcionalmente doxiciclina, y donde el promotor inducible incluye un elemento sensible de Tet (TRE).
7. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, donde dichos sitios de anclaje seguro genómico primero y segundo se seleccionan de cualquiera de los dos locus hROSA26, el locus AAVS1, el gen CLYBL o el gen c Cr 5.
8. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque se inserta material genético adicional en el primer y/o segundo sitios de anclaje seguro genómico, opcionalmente uno o más de los siguientes:
a) gen suicida;
b) marcador seleccionable;
c) gen reportero; y/o
d) gen para un a Rn no codificado.
9. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque dicha célula es seleccionada de una célula madre pluripotente, una célula madre somática o una célula madura.
10. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en cualquier reivindicación anterior, caracterizado porque dicha célula es una célula humana, de marsupial, no humana de primate, de camélido o de animal de ganado.
11. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque dicho procedimiento es para la programación de células madre pluripotentes en células maduras definidas.
12. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque dicha célula es una célula madre pluripotente y dicha secuencia genética es un transgen para uno o más reguladores maestros, opcionalmente un factor de transcripción, y opcionalmente donde la transcripción de dicha secuencia genética resulta en la programación hacia adelante de la célula en un tipo de célula madura definida.
13. Un procedimiento ex vivo como se reivindica en la reivindicación 1, caracterizado porque dicho procedimiento es para la inserción de una secuencia genética para los propósitos de terapia génica, opcionalmente donde la secuencia genética codifica una proteína incluyendo una proteína de tipo silvestre, una proteína modificada, un antígeno, una enzima, un marcador seleccionable o una molécula de ARN sin codificación.
14. Una célula hecha por el procedimiento de la reivindicación 1.
15. Una célula con un genoma modificado que comprende un gen insertado que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y un casete inducible insertado que comprende una secuencia genética operativamente ligada a un promotor inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho promotor inducible es regulado por la proteína reguladora transcripcional y dicho primero y segundo sitios son diferentes.
16. Una célula tal como se reivindica en la reivindicación 14 o en la reivindicación 15, para uso en terapia, o el uso de una célula como se reivindica en la reivindicación 14 o en la reivindicación 15 para diagnóstico in vitro o para ingeniería tisular.
17. Un procedimiento ex vivo para la producción de miocitos a partir de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
a) inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y.
b) la inserción dirigida del gen MYOD1 operativamente ligado a un promotor inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho promotor inducible es regulado por la proteína reguladora transcripcional; donde dicho primero y segundo sitios de anclaje seguro genético son diferentes,
y cultivar dichas células en presencia de ácido retinoico,
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
18. Un procedimiento ex vivo para la producción de oligodendrocitos a partir de células madre pluripotentes, que comprende las etapas de:
a) inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y.
b) la inserción dirigida del gen SOX-10 operativamente ligado a un promotor inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho promotor inducible es regulado por la proteína reguladora transcripcional; donde dicho primero y segundo sitios de anclaje seguro genético son diferentes,
y cultivar dichas células en presencia de ácido retinoico,
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
19. Un procedimiento ex vivo para reducir la transcripción y/o traducción de un gen endógeno en una célula, que comprende las siguientes etapas:
a) inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional en un primer sitio de anclaje seguro genético; y.
b) la inserción dirigida de un casete inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende ADN codificando una secuencia de ARN no codificante operativamente ligada a un promotor inducible y dicho promotor está regulado por la proteína reguladora transcripcional y donde dicha secuencia de ARN no codificante suprime la transcripción o traducción de un gen endógeno;
donde dichos sitios de anclaje seguro genéticos primero y segundo son diferentes, y.
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
20. Un procedimiento ex vivo para extraer un gen endógeno en una célula, que comprende las siguientes etapas:
a) inserción dirigida de un gen que codifica una proteína reguladora transcripcional y un gen que codifica Cas9 en un primer sitio de anclaje seguro genético; y.
b) inserción dirigida de un casete inducible en un segundo sitio de anclaje seguro genético, donde dicho casete inducible comprende un ARN guía operativamente ligado a un promotor inducible y dicho promotor está regulado por la proteína reguladora transcripcional y donde dicha secuencia de ARNg apunta al gen endógeno;
donde dichos sitios de anclaje seguro genéticos primero y segundo son diferentes, y.
donde el procedimiento no comprende un procedimiento para modificar la identidad genética de la línea germinal de un ser humano.
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