JP2023134465A - 制御可能な転写 - Google Patents

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Abstract

【課題】細胞内に少なくとも1つの誘導カセットを導入し、その誘導カセット内からの制御可能な転写を可能にする安定な方法を提供する。【解決手段】本方法は、任意の真核生物からの任意の細胞型に対して使用され得るが、動物多能性幹細胞又はヒト多能性幹細胞（hPSC）などの多能性幹細胞への誘導カセットの導入における特定の適用を有する。該誘導カセットは、それが含有する遺伝物質がサイレンシングされないか、又は挿入部位からの負の影響を受けず、遺伝物質の転写が制御されることを確実にするように制御可能に挿入される。【選択図】図４ａ－ｃ

Description

本発明は、細胞内に少なくとも1つの誘導カセットを導入し、その誘導カセット内から
の制御可能な転写を可能にする安定な方法に関する。本方法は、任意の真核生物からの任
意の細胞型に対して使用され得るが、動物多能性幹細胞又はヒト多能性幹細胞（hPSC）な
どの多能性幹細胞への誘導カセットの導入に特に適用される。該誘導カセットは、それが
含有する遺伝物質がサイレンシングされないか、又は挿入部位から負の影響を受けず、遺
伝物質の転写が制御されることを確実にするように制御可能に挿入される。
(発明の背景)
幹細胞研究は、ヒトの発達、再生医療、疾患のモデリング、創薬、及び細胞移植の研究
の大いなる見込みを保持している。また、幹細胞由来の細胞は、容易に利用できないヒト
細胞集団の生理学的及び病理学的応答の研究を可能にする。これは、遺伝子（及び非タン
パク質コーディングRNA-ncRNA内にコードされる調節機構の他の形態）の研究を伴う場合
が多い。残念ながら、ヒト細胞における遺伝情報の制御可能な転写又は発現は、特に困難
であることが証明されている。
また、再生医療、疾患のモデリング、創薬及び細胞移植のいくつかの重要な態様のため
に、簡単に入手しやすい供給源からの成熟ヒト細胞型の操作及び製造が必要とされる。ヒ
ト細胞における導入遺伝子の発現制御は、生物学的研究の基礎である。しかしながら、こ
れは、ヒト細胞では困難であることが証明された。また、創薬及び再生医療の目的に適す
る量並びに質での、多くの非常に望ましいヒト細胞型のインビトロ導出が実際に必要とさ
れている。所望の細胞型への幹細胞の有向分化が困難である場合が多いため、所望の細胞
型への細胞の直接再プログラミングを含む他のアプローチが現れた。特に、hPSCを含む多
能性幹細胞を成熟細胞型へ直接変換する方法として、フォワードプログラミングが、ヒト
細胞の誘導のための強力な戦略として認識されている。この再プログラミングは、幹細胞
を特定の成熟細胞型へ変換するために、重要な系統の転写因子（又はIncRNA及びマイクロ
RNAを含むノンコーディングRNA）の強制発現を伴う。また、この事情で、ヒト細胞におけ
る遺伝情報の制御可能な発現が挑戦されている。現在、利用可能なフォワードプログラミ
ング・プロトコルは、主に、細胞のレンチウイルス形質導入に基づいており、ランダムに
挿入された誘導カセットの多様な発現又は完全なサイレンシングをもたらす。これは、必
要な転写因子を発現する亜集団を単離するために、追加の精製工程をもたらす。したがっ
て、これらの方法のさらなる改良が明確に必要とされている。
導入遺伝子の誘導発現とは別に、機能喪失の研究を実行できるようにするために、細胞
内の遺伝子又は他のコード配列のノックダウン及びノックアウトを制御できることが非常
に望ましい。幹細胞及び成熟細胞型における機能喪失の研究は、ヒトの発達、疾患及び生
理を調節する機構を研究するための特有の機会を提供する。しかしながら、現在の技術は
、遺伝子発現の簡単かつ効率的な操作を可能にしない。遺伝子ノックダウンを誘発するた
めに誘導性低分子ヘアピン型RNA（shRNA）などの物質を幹細胞へ導入するための現在の技
術は、導入遺伝子のサイレンシング及び位置効果制限活性などの、上記のフォワード再プ
ログラミングに見られる多くの欠点に悩まされている。したがって、幹細胞における機能
喪失の研究を可能にする、幹細胞における誘導性遺伝子ノックアウト及びノックダウンが
必要とされている。
上記の方法の改良はいずれも、サイレンシング及び組込み部位に関連する他の負の影響
に対して耐性である導入遺伝子などの誘導カセット内に含有される遺伝物質の安定な転写
が達成されることを確実にしなければならない。サイレンシングは、DNAメチル化又はヒ
ストン修飾を含む複数のエピジェネティックな機構によって引き起こされ得る。レンチウ
イルス形質導入に基づく従来技術の方法を用いて、得られた細胞は、導入遺伝子が完全に
発現するか、部分的に発現するか、又はサイレンシングされる異種集団である。明らかに
、これは、多くの適用に望ましいものではない。ウイルスベクターは、その遺伝物質をゲ
ノムの転写活性領域に組込み、そのため、挿入変異誘発に起因する発癌事象の可能性を高
める傾向を示す。
多くの適用について、誘導カセットは、必要に応じてスイッチがオンになり、高レベル
を含む特定のレベルで転写され得るように、細胞内に挿入された遺伝物質の転写を制御す
ることが望ましい。これは、該誘導カセットの挿入がゲノム内でランダムである場合には
達成することはできない。
したがって、本発明者らは、細胞のゲノム内への誘導カセットの安定導入を可能にする
一方で、その誘導カセットの転写を制御することができる方法を開発した。これは、特に
、多能性幹細胞に該誘導カセットを導入して、挿入された遺伝物質の転写を制御すること
が望まれる細胞型ならどれも利点を有する。該誘導カセットは、転写ができる任意の遺伝
物質、例えば、導入遺伝子又はノンコーディングRNA（ncRNA）を含むことができる。該誘
導カセット内に含める物質は、導入遺伝子の発現又は遺伝子のノックダウン若しくはノッ
クアウトを含む、幹細胞から必要とされる効果によって決定される。
(発明の概要)
本発明者らは、本明細書に記載の二重ゲノムセーフハーバー標的化システムを用いるこ
とによって、誘導カセットを挿入し、その誘導カセット内の遺伝物質の転写を制御するこ
とが可能であることを見出した。挿入される遺伝物質のエピジェネティックなサイレンシ
ングのリスクが低減され、該誘導カセットを転写する細胞の均質な集団を得ることが可能
であるので、そのような方法は非常に望ましい。
したがって、本発明は、細胞内で遺伝子配列の転写を制御する方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
工程；及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記
誘導カセットが誘導プロモーターに作動可能に連結された前記遺伝子配列を含み、前記プ
ロモーターが該転写調節タンパク質によって調節される、前記工程、
を含み、
前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法に関する。
特異的なゲノムセーフハーバー部位（GSH）への誘導カセットの組込みは、ゲノムへの
ランダムな挿入よりも好ましい。GSHは、宿主細胞又は生物に悪影響を及ぼすことなく、
新たに組込まれたDNAの予測可能な発現に対応することができるヒトゲノムの遺伝子内又
は遺伝子外領域として以前に定義された。有用なセーフハーバーは、所望のレベルのタン
パク質（さらなる翻訳を介して）又はノンコーディングRNAを得るのに十分な挿入遺伝子
配列の転写を可能にしなければならない。GSHはまた、細胞に悪性形質転換をしやすくし
てはならず、細胞機能も変えてはならない(Sadelainらの文献, 2012, Nature Reviews Ca
ncer, 12(1), 51-8. doi:10.1038/nrc3179)。
第1の遺伝子セーフハーバー部位は、少なくとも1つの転写調節タンパク質コード遺伝子
を導入するために利用される。転写調節タンパク質（又は転写因子）は、遺伝子の遺伝子
転写を増加させる。ほとんどの転写調節因子は、遺伝子に作動可能に連結されたエンハン
サー又はプロモーター近位エレメントに結合するDNA結合タンパク質である。
いくつかの態様において、転写調節タンパク質は、構成的に発現され、永久的に細胞内
で発現する。したがって、転写調節タンパク質は、構成的プロモーターに作動可能に連結
され得る。構成的プロモーターは、成長及び発達の全ての段階で、ほとんどの組織及び細
胞内で均一に遺伝子発現を指示する。構成的プロモーターは、本発明の方法で使用される
場合、高レベルの遺伝子発現を付与する。
遺伝子を含むさらなる遺伝物質は、転写調節タンパク質を有する第1のGSHに挿入され得
る。そのような遺伝子は、例えば、転写調節タンパク質が正常に挿入されたことを示すた
めに使用することができる緑色蛍光タンパク質（GFP）などの1以上のマーカーを含み得る
。他の選択肢には、遺伝子編集を可能にする遺伝子、例えば、Cas9及び誘導体又はCasL及
び誘導体、並びに細胞において特異的遺伝子の内因性又は外因性発現をアッセイするため
に使用することができるレポーター配列が含まれる。
第2のGSHは、所望の遺伝子配列が誘導プロモーターに作動可能に連結された誘導カセッ
トを導入するために利用される。そのようなプロモーターは、転写調節タンパク質によっ
て正しく誘導された場合にのみ転写を可能にする。転写調節タンパク質は、細胞に外部か
ら供給される物質によって制御され得る。したがって、外因性物質の存在は、誘導プロモ
ーターからの発現を可能にするか、又は阻止し得る。そのような制御可能な発現の例には
Tet-ONシステムが含まれ、本明細書でさらに説明する。
さらなる誘導カセット（複数可）は、さらなるGSHに挿入され得、前記GSHは、上記の第
1及び第2のGSHとは別である。
1以上の遺伝子配列は、第2及び/又はさらなるGSH内から制御可能に転写され得る。実際
に、該誘導カセットは、GSHに挿入することが望まれ、その転写が制御可能に誘導される1
、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の遺伝子配列を含有し得る。
GSH又は複数のGSHに挿入することが望まれる遺伝子配列又は複数の遺伝子配列は、誘導
プロモーターに作動可能に連結されて、誘導カセット内に存在する。これらの遺伝子配列
は、プロモーターの活性が誘導された後、RNAに転写されることが可能である任意の適切
な配列であり得る。適切な遺伝子配列は、導入遺伝子（生成されるRNAがポリペプチドに
翻訳されるメッセンジャーRNA（mRNA）であるタンパク質コード遺伝子）、ノンコーディ
ングRNA（ncRNA - shRNA、アンチセンスRNA（asRNA）、ガイドRNA（gRNA）、マイクロRNA
（miRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、トランス作用RNA（tasiRNA）、アンタゴmir、アプ
タマー、miRNAスポンジ、及び任意の他の機能性RNAを含むが、これらに限定されない）を
含むが、これらに限定されない。
該誘導カセットは、第2又はさらなるGSHに挿入される追加の遺伝物質を含み得る。その
ような追加の遺伝物質は、転写が起きていることを示すために、緑色蛍光タンパク質（GF
P）などの1以上のマーカーを含み得る。或いは、又はさらに、抗生物質又は薬剤耐性遺伝
子などの遺伝子は、正常に挿入された誘導カセットの選択を可能にし得る。また、その機
能を研究するための特定の遺伝子又はその機能と干渉する配列の誘導発現が望ましい場合
がある。同様に、細胞の生物学的機能を増強若しくは妨害するための遺伝子の発現、又は
生物の他の部分の細胞に影響を与える遺伝子の発現は、成長因子、インスリンなどを含む
ペプチドホルモンの発現を含めて、望ましい場合がある。
技術的に、第1及び/又は第2のGSHへの挿入は、1つの染色体上、又は両方の染色体上で
起こり得る。GSHは、二倍体生物の両方の染色体上の同じ遺伝子座に存在する。誘導カセ
ット内に挿入された遺伝物質からの転写レベルの増加を可能にし、そのため、特に高いレ
ベルの転写を達成することができるので、両方の染色体内への挿入が有利である。
GSHへの挿入は、達成され得るGSHでのDNA二本鎖切断（DSB）のカスタマイズされた部位
特異的生成に基づいて、特定のGSHへの遺伝物質の特異的挿入を制御することができる。
次いで、該遺伝物質は、相同組換えなどの任意の適切な機構を用いて導入され得る。ゲノ
ム内に特異的DSBを作製する任意の方法を用いることができるが、好ましいシステムには
、CRISPR/Cas9及びその改変バージョン、ZFN及びTALENシステムが含まれる。
さらに、転写調節因子及び/又は誘導カセットの挿入は、可逆的であるように設計する
ことができ、挿入された遺伝物質は、必要に応じて、除去しても、かつ/又は代わりの転
写調節因子/誘導カセットと置換してもよい。転写調節因子及び/又は誘導カセットを置換
する方法は、本発明の一部を成す。そのような置換は、細胞培養物が1つの転写調節因子
及び/又は1つの誘導カセットで正常に改変された場合、かつ転写調節因子及び/又は誘導
カセットを置換することが望ましい場合に有用であり得る。これは、すでに成功した挿入
を活用して、より大きな挿入を行うことを可能にし得る。本発明のこの態様を実行するた
めに、挿入物は、挿入物の一部などの、GSHから挿入物の全部又は一部の除去を可能にす
る切断配列を含み得る。除去又は置換の好ましい方法には、組換え法が含まれる。
さらに、本発明は、GSHへの転写調節因子及び/又は誘導カセットの挿入に適するベクタ
ーに関する。
一態様において、本発明は、細胞における導入遺伝子の発現を制御する方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
工程;及び
b）誘導プロモーターに作動可能に連結された導入遺伝子の、第2の遺伝子セーフハーバー
部位への標的化挿入の工程であって、前記誘導プロモーターが該転写調節タンパク質によ
って調節される、前記工程、
を含み、
前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法を提供する。
本発明のこの態様において、前述の誘導カセットは、誘導プロモーターに作動可能に連
結された導入遺伝子を含む。本発明のこの態様において、誘導カセット内に含まれる所望
の遺伝子配列は、導入遺伝子、好ましくはタンパク質コード遺伝子である。したがって、
導入遺伝子の転写及び翻訳（発現）は、細胞内で制御され得る。本方法の利点は、必要な
場合に、導入遺伝子の過剰発現を可能にすることである。
さらに、本発明のこの態様において、さらなる同一の又は異なる導入遺伝子は、第1及
び第2のGSHと異なるさらなるGSHに挿入され得る。そのような導入遺伝子は、上記の誘導
プロモーターに作動可能に連結される。
一態様において、本発明は、細胞においてノンコーディングRNAの転写を制御する方法
であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
工程;及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記
誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたノンコーディングRNA配列を
コードするDNAを含み、前記プロモーターが該転写調節タンパク質によって調節される、
前記工程、
を含み、
前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法を提供する。
さらに、本発明のこの態様において、さらなる同一又は異なる誘導カセットは、第1及
び第2のGSHと異なるさらなるGSHに挿入され得る。そのような誘導カセットは、ノンコー
ディングRNA配列をコードするDNA又は誘導プロモーターに作動可能に連結された任意の他
の遺伝子配列を含み得、前記プロモーターが、該転写調節タンパク質によって調節される
。
より具体的には、この方法は、細胞における内因性遺伝子のノックダウンを可能にする
。したがって、本発明は、細胞内で内因性遺伝子の転写及び/又は翻訳を低下する方法で
あって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
工程;及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記
誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたノンコーディングRNA配列を
コードするDNAを含み、前記プロモーターが、該転写調節タンパク質によって調節され、
前記ノンコーディングRNA配列が、内因性遺伝子の転写又は翻訳を抑制する、前記工程、
を含み、
第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法を提供する。
さらに、本発明のこの態様において、さらなる同一又は異なる誘導カセットは、第1及
び第2のGSHと異なるさらなるGSHへ挿入され得る。そのような誘導カセットは、ノンコー
ディングRNA配列をコードするDNA又は誘導プロモーターに作動可能に連結された任意の他
の遺伝子配列を含み得、前記プロモーターが、該転写調節タンパク質によって調節される
。
任意の態様又は実施態様において、該内因性遺伝子は、タンパク質又はノンコーディン
グRNAをコードし得る。
本発明の上記の2つの態様において、該誘導カセット（複数可）は、ノンコーディングR
NA、すなわち、機能的であるが、タンパク質に翻訳されないRNAをコードするDNAを含む。
このノンコーディングRNAは、以前に説明したものなどの任意の適切なRNAであり得るが、
好ましくは、低分子ヘアピン型RNA（shRNA）である。本発明の後者の態様において、ノン
コーディングRNAは、一般的に、遺伝子の転写又は翻訳を阻止するか、又は発現を防止す
ることにより、任意の適切な方法で遺伝子ノックダウンを達成し得る。最終的には、前記
遺伝子の発現は、低下又は阻止されるが、遺伝子自体は無傷のままである。
或いは、該誘導カセットの配列内に含まれるノンコーディングRNAは、特に、遺伝子自
体を置換又は破壊するために、細胞内で内因性遺伝子をノックアウトするために使用する
ことができるRNAを含み得る。本発明のこの態様に使用することができる適切なノンコー
ディングRNAは、CRISPR/Cas9プラットフォームのエレメント、より具体的には、内因性遺
伝子を標的とするように向けられているガイドRNA（gRNA）を含む。
したがって、一態様において、本発明は、細胞内の内因性遺伝子をノックアウトする方
法であって、
a）転写調節タンパク質コード遺伝子及びCas9又はその誘導体をコードする遺伝子の、第1
の遺伝子セーフハーバー部位への標的化挿入の工程;及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記
誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたガイドRNAを含み、前記プロ
モーターが、該転写調節タンパク質によって調節され、前記gRNA配列が内因性遺伝子を標
的化する、前記工程、
を含み、
前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法を提供する。
さらに、本発明のこの態様において、さらなる同一又は異なる誘導カセットは、第1及
び第2のGSHと異なるさらなるGSHに挿入され得る。そのような誘導カセットは、誘導プロ
モーターに作動可能に連結された任意の遺伝子配列を含み得、前記プロモーターが、該転
写調節タンパク質によって調節される。
したがって、本発明の上記の態様において、gRNAの転写は制御可能に誘導される。
さらなる態様において、本発明は、細胞内で内因性遺伝子の転写及び/又は翻訳を低下
する方法であって、a）転写調節タンパク質コード遺伝子の、遺伝子セーフハーバー部位
の第1の対立遺伝子への標的化挿入の工程;及び
b）誘導カセットの、同じ遺伝子セーフハーバー部位の第2の対立遺伝子への標的化挿入の
工程であって、前記誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたノンコー
ディングRNA配列をコードするDNAを含み、前記プロモーターが、該転写調節タンパク質に
よって調節され、前記ノンコーディングRNA配列が、内因性遺伝子の転写又は翻訳を抑制
する、前記工程、
を含む、前記方法を提供する。
さらに、本発明は、細胞において内因性遺伝子をノックアウトする方法であって、
a）転写調節タンパク質コード遺伝子及びCas9又はその誘導体をコードする遺伝子の、遺
伝子セーフハーバー部位の第1の対立遺伝子への標的化挿入の工程;及び
b）誘導カセットの、同じ遺伝子セーフハーバー部位の第2の対立遺伝子への標的化挿入の
工程であって、前記誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたガイドRN
Aを含み、前記プロモーターが転写調節タンパク質によって調節され、前記gRNA配列が内
因性遺伝子を標的化する、前記工程、
を含む、前記方法を提供する。
そのような単一工程のノックアウト又はノックダウンは、新規であり、本発明の一部を
形成し得る。
一態様において、本発明は、多能性幹細胞のフォワードプログラミングの方法であって
、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
工程;及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記
誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結された重要な系統の転写因子コード
遺伝子配列を含み、前記誘導プロモーターが該転写調節タンパク質によって調節される、
前記工程、
を含み、
前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法を提供する。
さらなる又は追加の誘導カセット（複数可）は、第1及び第2のGSHとは別のさらなるGSH
に挿入され得る。
特定の成熟細胞型への多能性幹細胞のフォワードプログラミングは、非常に望ましいこ
とであり、本発明の二重標的化プラットフォームを用いて達成することができる。いくつ
かの細胞型の特定の方法を以下に記載する。
一態様において、本発明は、多能性幹細胞からの筋細胞の生成方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
工程;及び
b）誘導プロモーターに作動可能に連結されたMYOD1遺伝子の、第2の遺伝子セーフハーバ
ー部位への標的化挿入の工程であって、前記誘導プロモーターが該転写調節タンパク質に
よって調節される、前記工程、
を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なり、
前記細胞をレチノイン酸の存在下で培養することを含む、前記方法を提供する。
MYOD1遺伝子は、筋形成分化1タンパク質コード遺伝子である。好ましくは、レチノイン
酸（RA）は、オールトランスRAである。
別の態様において、本発明は、MYOD1を発現する多能性幹細胞からの筋細胞の生成方法
であって、レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法を提供する
。
好ましくは、RAは、オールトランスRAである。好ましくは、該細胞はMYOD1を過剰発現
している。
さらなる態様において、本発明は、多能性幹細胞からのオリゴデンドロサイトの生成方
法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
工程;及び
b）誘導プロモーターに作動可能に連結されたSOX 10、OLIG2、NKX2.2、及びNKX6.2遺伝子
の任意の組み合わせの、第2の遺伝子セーフハーバー部位への標的化挿入の工程であって
、前記誘導プロモーターが該転写調節タンパク質によって調節される、前記工程、
を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法を提供する。
SOX 10、OLIG2、NKX2.2、及びNKX6.2遺伝子は、それぞれ転写因子SOX 10、OLIG2、NKX2
.2、及びNKX6.2をコードする。
(a～d)：最適化された二重ゲノムセーフハーバー標的化過剰発現システムの検証。図1（a）hROSA26及びAAVS1遺伝子座のための遺伝子標的化ベクターの設計。HAR：相同性アーム、SA：スプライスアクセプター、T2A：T2Aリボソームスキッピングシグナル;Neo：ネオマイシン耐性遺伝子;Puro：ピューロマイシン耐性遺伝子;pA：ポリアデニル化シグナル;CAG：構成的に活性のあるCAGプロモーター;rtTA：第3世代のrtTA;TRE：誘導性Tet応答エレメント;EGFP：高感度緑色蛍光タンパク質。図1（b）フローサイトメトリー（蛍光強度中央値、MFI）によって検出されたEGFP発現hESCにおけるEGFP誘導及びレスキュー動態（図1（c））を示す。結果は、時点ごとに2つの生物学的複製からのものであり、平均値±SEMとして表されている。全ての値を、ドキシサイクリンの5日後（図では0日と称する）の最大蛍光強度に対して正規化した。図1（d）5日間のドキシサイクリンによる誘導後のEGFP発現hESCにおけるEGFP過剰発現に対するドキシサイクリン用量反応を示す。結果は、条件ごとに2つの生物学的複製からのものであり、平均値±SEMとして表されている。全ての値を、実験で測定された最大蛍光強度に対して正規化した。GSH標的化構成的CAG-EGFP hPSCにおけるEGFP発現レベル及びドキシサイクリンでの誘導後の二重GSH標的化誘導性TRE-EGFP hPSCにおけるEGFP発現レベル。野生型hPSC及び非誘導性TRE-EGFP細胞を陰性対照として含めた。 (a～d)：実験的アプローチの概要及びドキシサイクリン（dox）処理後の神経細胞（i-ニューロン）へのhPSCの迅速な単一工程変換の結果。図2（a）この変換の概略図であり、本発明に従ってNGN2で形質転換された細胞は、Dox処理後に神経細胞に分化するように誘導される。図2（b）は、定量的RT-PCR分析により示されたhESCからのiニューロン生成のフォワードプログラミング時間経過を示し、汎ニューロンマーカー遺伝子（MAP2、SYP）、前脳マーカー遺伝子（BRN2、FOXG1）及びグルタミン酸ニューロンマーカー遺伝子（VGLUT2、GRIA4）の時間的な発現パターンを示す。ドキシサイクリン処理の示された日に、細胞を分析した。値は、内因性ハウスキーピング遺伝子PBGDと比較して示され、多能性状態に対して正規化されている。結果は、時点ごとの3つの生物学的複製からのものであり、平均値±SEMとして表されている。図2（c）誘導の1週間後のhESCに由来するi-ニューロンにおける免疫染色によってβIIIチューブリン（TUBB3）陽性神経細胞の定量化を示す。未分化細胞を陰性対照（対照）として使用し、新たに単離したNGN2発現hESCにおける25回の継代後（+P25）のiニューロン生成について数字を報告する。図2（d）形態学的変化を示す一連の位相差画像を介したhESCからのiニューロン生成のフォワードプログラミング時間経過を示す細胞の写真である。 (a～d)：骨格筋細胞へのhPSCのフォワードプログラミング。図3aは、MYOD1の誘導性過剰発現及びレチノイン酸での処理による骨格筋細胞へのhPSCの迅速な単一工程変換の概略図を示す。図3bは、hESCからのi筋細胞生成中の筋細胞マーカー遺伝子の時間的発現パターンの定量的RT-PCR分析を示す。全ての値を、hPSCと比較して示す。結果は、時点ごとに3つの生物学的複製からのものであり、平均値±SEMとして表されている。図3（c）及び（d）は、誘導後10日の時点でのフローサイトメトリーによるMHC陽性細胞の定量化を示し、OPTi-MYOD1 hPSCが、延長した培養期間及びMYOD1システムの標的化組込み後の継代（p）後でさえそれらの筋原性効力を保持していることを示す。未分化細胞を陰性対照（対照）として使用し、新たに単離したOPTi-MYOD1 hESCにおける、又は50回の継代（+P50）後の同じ細胞におけるi筋細胞生成についての図を報告する。 (a～f)：二重GSH標的化Tet-ON過剰発現システムの標的化戦略。図4（a）は、hPSCにおけるhROSA26及びAAVS1遺伝子座の連続標的化のための実験的なワークフローを示す。キーワード：Cas9n：S.ピオゲネスからのD10Aニッカーゼ変異体Cas9エンドヌクレアーゼ;ZFN：ジンクフィンガーヌクレアーゼ;Neo：ネオマイシン;Puro：ピューロマイシン;rtTA：第3世代のリバーステトラサイクリントランス活性化因子。これは誘導性EGFP発現系（i-EGFP）を示す。図4（b）はhROSA26標的化戦略の概略図を示す。図4（c）は、AAVS1標的化戦略を示す。図4（b）及び（c）のキーワード：R26-prom：ROSA26遺伝子座プロモーター（THUMPD3-AS1遺伝子）;AAV-prom：AAVS1遺伝子座プロモーター（PPP1R12C遺伝子）;ZFN：ジンクフィンガーヌクレアーゼ;5'-HAR/3'-HAR：上流/下流相同性アーム。SA：スプライスアクセプター;T2A：T2Aペプチド;pA：ポリアデニル化シグナル;CAG：CMV初期エンハンサー、ニワトリβアクチン及びウサギβグロビンハイブリッドプロモーター;TRE：Tet応答エレメント;EGFP：高感度緑色蛍光タンパク質。図4（d）は、正しく標的化されたhROSA26及びAAVS1標的化hPSC株を識別するために使用される遺伝子型判定戦略の概略図を示す;GSH-prom：GSHプロモーター（それぞれhROSA26及びAAVS1）;WT：野生型;誘導カセット：標的化後に組込まれる全外因性配列。遺伝子座(locus)PCR：相同性アームに対応するゲノム配列の外側のゲノムDNAに排他的に結合する両方のプライマーを用いる標的遺伝子座にまたがるPCR。その高いGC含量により、CAGプロモーターは通常のPCRによって増幅することができないことに留意されたい。したがって、CAG含有発現カセットを正しく挿入すると、PCRアンプリコンが消失する。野生型バンドの存在は、非標的化対立遺伝子の存在を示す;野生型バンドの消失は、ホモ接合標的化を示す。5'-INT/3'-INT：PCR：それぞれ、5'及び3'挿入部位にまたがるPCR。正しいサイズのPCRアンプリコンは、正しい組込みを示す。3'BB PCR：相同性アーム/標的化ベクター骨格ジャンクションにまたがるPCR。PCR産物の存在は、ドナープラスミドの狙いが外れた非特異的組込みを示す。図4（e）は、選択されたhROSA26-CAG-rtTA標的化ヘテロ接合性（HET）及びホモ接合性（HOM）H9 hESCについての遺伝子型判定の結果を示すゲルの写真である。図4（f）は、選択されたAAVS1-TRE-EGFP標的化ヘテロ接合性（HET）及びホモ接合性（HOM）H9 hESCについての遺伝子型判定の結果を示すゲルの写真である。1kb+：1kbプラスDNAラダー;WT：野生型hESC;PL：標的化プラスミド;H2O：水対照。 （a～e）：hPSC二重GSH標的化に基づく最適化誘導性過剰発現プラットフォーム（OPTi-OX）の開発。図5（a）は、hROSA26とAAVS1遺伝子座の一方又は両方の対立遺伝子がそれぞれ正常に標的化されたかに応じて、二重GSH標的化誘導性EGFP H9 hESCを4つの実験群にプールしたことを示す。図5（b）は、正常に標的化されたヘテロ接合性及びホモ接合性H9 hROSA26-CAG-rtTA hESCでのウェスタンブロットによるrtTAタンパク質の検出を示す。ランダムなゲノム位置に第2世代のrtTAを保有するヒトESCを、対照試料として含めた。αチューブリン:ローディング対照。図5（c）は、図5（a）に記載の様々な二重GSH標的化誘導性EGFP hESCの代表的な例についてのフローサイトメトリー分析を示す。図5（d）は、図5（a）に記載の様々な二重GSH標的化誘導性EGFP hESCにおけるEGFP発現の蛍光強度中央値（MFI）を示す。細胞を、対照条件（無ドキシサイクリン、CTR）で、又はドキシサイクリン処理（DOX）の5日後にフローサイトメトリーによって分析した。各データポイントは、個々のクローン株を表す。CAG-EGFP hESC及び野生型（WT）hESCを比較のために含めた。ドキシサイクリン処理群の統計的分析（n=4～5、示されるように）は、EGFP発現レベルが、二重ホモ接合性クローンで最も高かったことを示した（ポストホックダネット検定と共に一方向ANOVA; F(2, 10)=25.34, p=0.0001; **** p＜0.0001; ** p=0.0026)。この条件を、さらなる実験のために選択した。図5（e）は、図5（a）に記載の様々な二重GSH標的化i-EGFP hESCにおけるEGFP+細胞の割合を示す。 （a～ｄ）：hPSCにおける及び胚葉分化中のOPTi-OXプラットフォームの特性評価。図6（a）は、正常に標的化された生hPSCにおけるEGFPレベル、及び5日間のドキシサイクリンでの処理後の三胚葉へのそれらの分化後のEGFPレベルのフローサイトメトリー分析を示す。取得設定を、誘導された高レベルのEGFP発現（DOX）を含むように設定した。非誘導性対照集団（CTR）は、左のy軸のすぐ隣に位置している。図6（b）及び図6（c）は、蛍光強度中央値（MFI）及びEGFP+細胞の割合を含む、6（a）のフローサイトメトリープロットの概要を示す。図6（d）は、ホモ接合性多能性幹細胞のEGFP mRNA発現レベル及び三胚葉への分化後のEGFP mRNA発現レベルの定量的RT-PCRの結果の棒グラフを示す。WT：野生型。 ヒトi-ニューロンの特性評価。定量的RT-PCRの結果は、ドキシサイクリンでの処理時に多能性因子NANOG及びOCT4の迅速な下方制御を示す。 筋細胞誘導中のRAシグナル伝達。この図は、筋細胞誘導中の6種のレチノイド及びレチノイド受容体のqPCR分析を示し、i-筋細胞誘導の過程を通して、RARα、RARβ及び全3つのRXRアイソフォームは発現するが、RARγは発現しないことを示す。Aはαであり、Bはβであり、Gはγである。 図9（a）～図9（c）:OPTi-MYOD1 hESCのヒトi-筋細胞への発達の特性評価。図9（a）は、誘導された筋細胞へのOPTI-MYOD1 hPSCのフォワードプログラミング時間経過を示す。Nikon Biostation IMタイムラプスシステムを用いて、30分ごとに取得した自動化位相差画像により形態学的変化が実証された。スケールバー：200μm。図9（b）は、OPTi-NGN2 hESCのドキシサイクリンでの処理時に多能性因子NANOG及びOCT4の迅速な下方制御を示すqPCRの結果を示す（左グラフ）。全5つの主要なヒト骨格筋細胞特異的筋細胞重鎖アイソフォーム（MYH遺伝子ファミリーによってコードされる）は、筋細胞フォワードプログラミング中に強く上方制御される（右グラフ）。これらには、胚の発達及び出生後の筋肉の発達の間に発現する2つのアイソフォーム（胚性アイソフォームMYH3;新生児アイソフォームMYH8）、及び通常、成人の骨格筋で発現する3つのアイソフォーム[低速けいれん（I型）繊維中のMYH7;高速けいれん疲労耐性（IIa型）繊維中のMYH2、及び高速で疲れやすい（IIx型）繊維中のMYH1]が含まれる。対照的に、ネコにおける高速けいれん、高速で疲れやすい筋細胞繊維中で構成しているMHCアイソフォームを表すMYH4は、ヒトにおいて有意な量（1％未満）で発現しておらず、フォワードプログラミング時間経過中に誘導もされない。図9（c）は、F-アクチン（AlexaFluor488共役ファロイジン毒素を介して可視化される）、神経細胞接着分子（NCAM）、デスミン(DES）、ミオシン重鎖（MYH）、タイチン（TTN）、α-アクチニン（ACTN2）及びトロポニンT（TNNT）を含む広範囲の典型的なマーカータンパク質を発現するが、筋芽細胞前駆細胞マーカーPAX3及びPAX7を発現しない誘導骨格筋細胞を示す。全ての試料をミオゲニン（MYOG）で対比染色した。スケールバー：50μm。DAPI：核染色。 これらの3つのグラフは、異なる濃度のドキシサイクリンでのOPTi-MYOD1 hPSCの誘導後2日の時点での全MYOD1、内因性MYOD1、及びMYOGについてのqPCRの結果を示す。異なる濃度のドキシサイクリンでの誘導後48時間の時点でのqPCRの結果を示す。発現を、内因性ハウスキーピング遺伝子PBGDに対してプロットする。 Tet-ONシステムの図。Tet-ONは、2つの成分からなる：上部に、構成的プロモーター（cP）がrtTA（リバーステトラサイクリントランス活性化因子）の発現を促進する活性化因子カセットが示されている。rtTAは、原核生物Tet抑制因子（TetR）の変異型と（単純ヘルペスウイルス由来の）転写トランス活性化因子ドメインVP16からなる融合タンパク質である。下部に、応答ドメインが示されている。これは、誘導プロモーター（TRE、Tet応答エレメント）及び関心のある遺伝子からなる。TREは、rtTAに応答する人工プロモーターである。7連続のtetオペロン（tetO7）及び強い最小CMVプロモーター（mCMV）からなり、それ自体は活性がなく、7つのtetオペロンへのrtTAの結合時にのみ転写機構を動員する。テトラサイクリン誘導体であるドキシサイクリンは、TREへの変異体TetRの結合に必要とされ、誘導カセット、この場合は、EGFPの発現をもたらす（pA：ポリアデニル化シグナル）。 （a～ｄ）オリゴデンドロサイトへのhPSCのフォワードプログラミング。図12（a）は、OPTi-OLIG2-SOX10 hPSCのオリゴデンドロサイト系譜細胞への急速変換（i-OPC及びi-OL）の実験的アプローチの概略図を示す。図12（b）は、4日ごとの3連続継代後のBrdU陽性細胞及びそれぞれ4日間続く、付随するBrdUパルスの定量化を示す（P=継代数）。図12（c）は、hPSCからのiオリゴデンドロサイト生成中のミエリン関連タンパク質（CNP、MAG、MBP、MOG、及びPLP）コード遺伝子の経時的発現パターンの定量的RT-PCR分析を示す。OPTi-OLIG2-SOX10 hPSCを、PDGF-aa及びFGF2を補ったオリゴデンドロサイト培地中で誘導した。誘導1週間後に、最終分化を可能にするために、マイトジェンを除去した。全ての値を、内因性ハウスキーピング遺伝子PBGDに対して多能性状態に正規化して示している。結果は、時点ごとに2～3つの生物学的複製からのものであり、平均値±SEMとして表されている。図12（d）は、誘導の20日後のOPTi-OLIG2-SOX10 hPSC由来のi-オリゴデンドロサイトにおける免疫染色によるCNP及びPLP陽性細胞の定量化を示す。未分化細胞を陰性対照として使用し、新たに単離したOPTi-NGN2 hPSC中の、50回の継代後（+P50）のi-オリゴデンドロサイトについての図を報告する。 本発明の原理の概略図である。基本的に、これは、本発明のコアにおける2つの異なる遺伝子セーフハーバー部位への挿入を示す。1つの挿入は、第2の挿入において誘導カセット内の遺伝子配列の発現を制御する。示すように、さらなる遺伝物質をポリシストロン性ベクター構築物に含めることができる。さらに、第1のGSH部位に配置される調節因子の制御下に複数の誘導カセット又は他の遺伝物質を置くことができるように、3以上の遺伝子セーフハーバー部位が標的化され得る。 （a～ｆ）は、hSPCの二重GSH標的化に基づく誘導性ノックダウンシステムの進歩を示す結果の図である。図14aは実験的なアプローチを示す。H1- H1プロモーター、TO- tetオペロン、tetR- テトラサイクリン抑制因子。図14bは、誘導性EGFP shRNAを用いてサイレンシングすることができるEFGPレポーター導入遺伝子を発現するhESCを得るために作製されたトランスジェニック対立遺伝子の概略図である。図14cは、誘導性EGFP shRNAとtetRの示された組み合わせで標的化したhESCにおける、5日間のテトラサイクリンの非存在下又は存在下でのEGFP発現を示す（STD= 野生型標準、OPT= コドン最適化）。EGFP shRNAを保有していない二重標的化hESCを陰性対照として使用した。tetもshRNAも含まない同じtetR株に対してn.s.=p＞0.05(有意でない)、**=p＞0.01、***=p＞0.001。図14dは、STD又はOPT tetRを発現するROSA26標的化hESCにおけるtetRの代表的なウェスタンブロットである。HET= ヘテロ接合標的化、HOM= ホモ接合標的化。STD tetRランダム組込みを有するhESCは陽性基準として示されているが、WT h9 hESCは陰性対照である。TUB4A4Aは、ローディング対照である。様々なタンパク質量を添加し、定量的な比較を容易にした。図14（E）：フローサイトメトリー（MFI）及びqPCR（mRNA）によって測定されるEGFP OPTiKD hESCにおけるEGFPノックダウン及びレスキュー動態。結果は、時点ごとに2つの独立した培養物からのものである。図14（F）：EGFP OPTiKD hESCにおけるEGFPノックダウンのテトラサイクリン用量反応曲線。半最大阻害濃度（IC50）を報告する。結果は、用量あたり2つの独立した培養物からのものであり、平均値を示す。 （a、b及びc）真正GSHとしてのROSA26及びAAVS1遺伝子座の検証。図15aは、分化中のGSH発現を試験するためのGSH EGFPレポーターhPSCの作製のための実験的なアプローチを示す。ニューロン、オリゴデンドロサイト、及びアストロサイトを、これらの細胞系統の混合物を含有するバルク培養で取得し、全ての他の細胞型を個別に作製した。図15bは、ROSA26及びAAVS1 EGFPレポータートランスジェニック対立遺伝子の概略図である。R26-prom：ROSA26遺伝子座プロモーター;AAV-prom：AAVS1遺伝子座プロモーター;5'-HAR/3'-HAR：上流/下流相同性アーム;SA：スプライスアクセプター;T2A：自己切断T2Aペプチド;Neo：ネオマイシン耐性;Puro：ピューロマイシン耐性;pA：ポリアデニル化シグナル;CAG：CAGプロモーター;EGFP：高感度緑色蛍光タンパク質。図15（C）：誘導性EGFP shRNAとtetR（野生型標準tetR、STDtetR、又はコドン最適化tetR、OPTtetR）の示された組み合わせで標的化したhESCにおける、5日間のテトラサイクリンの非存在下又は存在下でのEGFP発現。EGFP shRNAを保有していない二重標的化hESCを陰性対照として使用した。結果は、条件あたり2～3の個々の株からのものである（表1）。tetもshRNAも含まない同じtetR株に対してn.s.=p＞0.05(有意でない)、**=p＜0.01、***=p＜0.001(ポストホックHolm-Sidak比較と共にANOVA）。 （a～ｄ）ROSA26及びAAVS1 EGFPレポーターhESCの作製。図16（A）：ROSA26標的化アプローチ及び正確に標的株を同定するために使用される遺伝子型判定戦略の概略図。Cas9n：S.ピオゲネス(S. Pyogenes)からのD10Aニッカーゼ変異体Cas9エンドヌクレアーゼ。R26-prom：ROSA26遺伝子座プロモーター（THUMPD3-AS1遺伝子）;5'-HAR/3'-HAR：上流/下流相同性アーム;導入遺伝子：遺伝子標的化後に組込まれる領域;遺伝子座PCR:野生型ROSA26遺伝子座のPCR産物（非標的化対立遺伝子を示す）;遺伝子座PCR/対立遺伝子の喪失：標的化対立遺伝子のPCR産物/導入遺伝子がGCに富むCAGプロモーターを含有する場合に失敗するPCR（予想される導入遺伝子標的化を示す）;5'INT/3'INT PCR：導入遺伝子の5'末端/3'末端の組込み領域のPCR産物（予想される導入遺伝子標的化を示す）;5'BB/3'BB PCR：ベクター骨格の5'末端/3'末端のPCR産物（狙いが外れた非特異的なプラスミド組込みを示す）。同様の標的化戦略及び遺伝子型判定戦略をAAVS1遺伝子座標的化に適用したことに留意されたい。図16（B）：構成的EGFP（高感度緑色蛍光タンパク質）発現のための最善の戦略を試験するために作製されたROSA26トランスジェニック対立遺伝子の概略図。ENDO-EGFP：内因性ROSA26プロモーターによって促進されるEGFP（R26-prom;標的化ベクターpR26-Puro_ENDO-EGFP）;EF1α-EGFP：伸長因子1αプロモーターによって促進されるEGFP（標的化ベクターpR26-Neo_EF1α-EGFP）;CAG-EGFP：CAGプロモーターによって促進されるEGFP（標的化ベクターpR26-Neo_CAG-EGFP）;SA：スプライスアクセプター;Puro：ピューロマイシン耐性（ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ）;Neo：ネオマイシン耐性（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼII）;pA：ポリアデニル化シグナル。図16（C）：代表的なROSA26-EGFPレポーターhESCクローン株におけるEGFP陽性細胞（EGFP+;ゲートが示されている）の割合、及びEGFP蛍光強度中央値（MFI）、又は野生型H9 hESCのフローサイトメトリー定量化。図16（D）：ROSA26-EGFPレポーターhESCにおけるEGFP陽性細胞の割合。結果は、条件につき、ヘテロ接合ROSA26標的化を有する3つのクローンについてのものである。 hPSC分化後の最適化された誘導性ノックダウンプラットフォームの検証。プロットは、EGFP OPTiKD (iKD)及びsOPTiKD(siKD)hESCに由来する示される細胞型において、5日間のテトラサイクリンの非存在下（CTR）又は存在下（TET）でqPCRにより測定されるEGFP発現を示す。EGFPレベルを、各個々の系統について同じ株における対照条件に対して報告する。略語は、図15に記載の系統を示す（pluri：未分化）。結果は、条件ごとに2つの独立した培養物からのものである。 （a～ｄ）hPSCにおいて最適化された誘導性CRISPR/Cas9ノックアウトプラットフォームの開発。図18aは、誘導性ノックアウト（iKO）hPSCの作製のための実験的アプローチを示す。図18bは、誘導性gRNAカセットを有するAAVS1標的化ベクターを作製するためのクローニング手順の概略図を示す。図18cは、誘導性EGFP gRNA（EGFP sOPTiKO hESC）を用いてCRISPR/Cas9によってノックアウトすることができるEGFPd2レポーター導入遺伝子を発現するhESCを得るために作製されたトランスジェニック対立遺伝子を示す。Bsd：ブラストサイジン耐性;EGFPd2：不安定EGFP。図18（d）：図19c（gRNA 2-TO）及びb（gRNA 3-2TO）からのsOPTiKO細胞におけるEGFPd2誘導性ノックアウト動態のフローサイトメトリー定量化。EGFP陽性細胞の割合を、テトラサイクリンの添加後に毎日監視した。結果は、2つの独立した培養物からのものである。 （a～e）：hESCにおける最適化された誘導性CRISPR/Cas9ノックアウトプラットフォームの開発。（A～D）は、gRNA（2又は3）と誘導プロモーター（TO又は2TO、図19eを参照されたい）の示された組み合わせを保有するEGFPd2ホモ接合sOPTiKO hESCにおけるEGFPd2発現についての代表的なフローサイトメトリーを示す。標的化ベクター：pAAV-Puro_siKOEGFP-2（19a）、pAAV-Puro_siKO-2TO-EGFP-2（19b）、pAAV-Puro_siKO-EGFP-3（19c）、pAAV-Puro_siKO-2TO-EGFP-3（19d）。細胞を、5日間、テトラサイクリン（TET）の存在下で培養するか、又はテトラサイクリンの非存在下で対照（CTR）条件にて維持した。直接の目視比較を容易にするために、曲線下面積が提示された全試料について1（100％）に等しくなるようにヒストグラムを正規化したことに留意されたい。図19（e）：1つ又は2つのtetオペロンを含有するsOPTiKOシステム用の誘導性H1 Pol IIIプロモーターのヌクレオチド配列（それぞれH1-TO及びH1-2TO）。重要な配列の特徴を強調している。gRNAクローニングに用いた制限酵素切断部位を示す（図18B）。DSE：遠位配列エレメント。PSE：近位配列エレメント;TETO2：tetオペロン;+1：RNA転写の開始位置。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pSpCas9n(BB)_R26-R。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pSpCas9n(BB)_R26-L。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pR26_CAG_EGFP。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pR26_CAG_rtTA。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pZFN-AAVS1-L-ELD（ジンクフィンガーヌクレアーゼ左）。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pZFN-AAVS1-R-KKR（ジンクフィンガーヌクレアーゼ右）。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pAAV_CAG_EGFP（ドナー）。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pR26-Neo_CAG-OPTtetR（コドン最適化tetRのhROSA26標的化）。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pAAV-Puro_iKD（誘導性shRNAのAAVS1標的化）。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pAAV-Neo_CAG-Cas9（Cas9のAAVS1標的化）。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pAAV-Puro_siKO（誘導性gRNAのAAVS1標的化）。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pAAV-Puro_siKO-2TO（誘導性gRNAのAAVS1標的化、プロモーター内に2つのtetオペロンを有するバージョン）。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pAAV_TRE-EGFP（EGFP誘導性過剰発現、付属）。 本出願の実施例内で使用されるプラスミドマップの描写である。pAAV_TRE-MYOD1（筋肉用のMYOD1誘導性過剰発現）。
(詳細な説明)
本発明者らは、真核細胞、特に、多能性幹細胞及びその子孫における誘導カセット内に
含まれる遺伝子配列の誘導転写に有用である方法を開発した。
本方法は、特定の成熟細胞型の発達を促進する前記幹細胞内の誘導カセットの過剰発現
を経て、多能性幹細胞のフォワードプログラミングに特に適用可能である。さらに、機能
喪失を研究するか又はこれらの細胞における細胞の機能若しくは動作を変更するために、
細胞内の内因性機能のノックダウン又はノックアウトにも適用される。ノックダウン又は
ノックアウトは、タンパク質コード遺伝子又はノンコーディングRNAをコードするDNA配列
に適用され得る。いずれも、ノックアウト又はノックダウンにより、本発明の方法によっ
て標的化され得る。
この方法は、2以上のGSHに分けられる誘導転写のためのシステムを用いた、幹細胞のゲ
ノム内のセーフハーバー部位の少なくとも二重標的化に基づいている。しかしながら、こ
の方法は、幹細胞に限定されるものではなく、例えば、研究又は遺伝子治療において任意
の細胞型のゲノムを改変するために使用することができる。本発明の方法において、1つ
のGSHは、ゲノムの他の場所の異なるGSHに挿入される誘導カセット内に含有される遺伝子
配列の転写を誘導するのに必要な転写調節因子を含有するように改変される。転写調節因
子は、好ましくは構成的に発現する。外因性物質/薬剤は、転写調節タンパク質の活性を
制御し、そのため、誘導カセットの発現を制御するために供給されなければならないこと
が好ましい。少なくとも2つの別々のGSHが本発明の方法で使用されるので、各GSHが二倍
体生物の両方の染色体上に存在するので、可能性のある挿入遺伝子座は合計4つある。こ
れは、全4つの遺伝子座が本発明の方法を用いて改変される場合、細胞からの可能性のあ
る転写の量を増加させる。標的化挿入の様々な成果の一例を図5aに示す。さらに、本発明
の方法は、少なくとも2つの異なるGSH部位を使用する。さらなるGSH部位が、さらなる転
写調節因子、誘導カセット又は選択マーカー、抗生物質若しくは薬剤耐性遺伝子、CRISPR
/Cas9システムに関連する遺伝子又は未知の機能の遺伝子を含むが、これらに限定されな
い任意の他の遺伝物質を導入するために使用できることが理解される。
したがって、本発明は、細胞内の挿入遺伝子配列の発現を制御する方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子配列の標的化挿
入の工程;及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記
誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結された前記遺伝子配列を含み、前記
プロモーターが該転写調節タンパク質によって調節される、前記工程、
を含み、
前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法に関する。
さらに、本発明のこの態様において、さらなる同一又は異なる誘導カセットは、第1及
び第2のGSHと異なるさらなるGSHに挿入され得る。そのような誘導カセットは、本明細書
に記載されるとおりである。
遺伝子セーフハーバー部位内への特異的挿入は、ゲノムのより安全な改変であることが
期待されるので、ランダムなゲノム組込みを上回って好ましく、天然の遺伝子発現のサイ
レンシング又は癌細胞型をもたらす変異を引き起こすなどの望ましくない副作用をもたら
す可能性が低い。
遺伝子セーフハーバー（GSH）部位は、遺伝子又は他の遺伝物質が細胞又は挿入された
遺伝物質に対していかなる有害作用なく挿入され得るゲノム内の遺伝子座である。挿入遺
伝子配列の発現が隣接遺伝子からの任意のリードスルー発現によって乱されず、誘導カセ
ットの発現が内因性転写プログラムとの干渉を最小限にするGSH部位が、最も有益である
。特定の遺伝子座が、将来、GSH部位であるかどうかを決定するのを支援するより正式な
基準が提案されている(Papapetrouらの文献,2011,Nature Biotechnology, 29(1), 73-8.
doi:10.1038/nbt.1717.)。これらの基準には、（i）任意の遺伝子の5'末端から50kb以上
である部位、（ii）癌に関連する任意の遺伝子から300kb以上である部位、（iii）任意の
マイクロRNA（miRNA）から300kb以上である部位、（iv）転写ユニットの外側に位置する
部位、及び（v）超保存領域（UCR）の外側に位置する部位が含まれる。すでに特定された
GSHが基準の全てを満たしていないので、これらの提案される基準の全てを満たすことは
必要でない場合がある。適切なGSHは、これらの基準の少なくとも2、3、4又は全てを満た
すと考えられる。
さらなる部位は、天然遺伝子発現を中断することなく、ウイルスが自然に組込む部位を
探すことによって特定され得る。
任意の適切なGSH部位は、細胞に対して有害作用なく遺伝物質の挿入を可能にし、挿入
される遺伝物質の転写を可能にするという前提で、本発明の方法において使用することが
できる。当業者は、この単純化された基準を使用して、適切なGSH、及び/又は上記のより
正式な基準を特定し得る。
ヒトゲノムについては、いくつかのGSH部位が特定されており、これらには、AAVS1遺伝
子座、hROSA26遺伝子座及びCLYBL遺伝子が含まれる。CCR5遺伝子及びHPRT遺伝子もまた、
可能性のあるGSHとして討議され、さらなる調査により、これらの1以上はヒトゲノムにお
けるGSHとして特定され得る。
アデノ随伴ウイルス組込み部位1遺伝子座（AAVS1）は、ヒトの19番染色体上のタンパク
質ホスファターゼ1、調節サブユニット12C（PPP1R12C）遺伝子内に位置し、ヒト組織で均
一かつ遍在的に発現する。この部位は、AAV血清型2に特異的な組込み遺伝子座として機能
し、そのため、可能性のあるGSHとして特定された。AAVS1は、オープンクロマチン構造及
び誘導カセットのサイレンシングに対する抵抗を可能にする天然の染色体インスレーター
を含んでいるので、転写の良好な環境であることが示されている。PPP1R12C遺伝子の破壊
から生じる、細胞に対する既知の副作用はない。さらに、この部位に挿入された誘導カセ
ットは、多くの多様な細胞型において依然として転写活性状態である。したがって、AAVS
1は、GSHとみなされており、ヒトゲノムにおいて標的化遺伝子組換えに広く利用されてき
た。
hROSA26部位は、マウスのGSH（ROSA26-逆向きスプライスアクセプター部位＃26）との
配列類似性に基づいて特定された。オーソログ部位がヒトで特定されたが、この部位は、
誘導カセット挿入に一般的に使用されない。本発明者らは、hROSA26部位に特異的な標的
化システムを開発し、そのため、この遺伝子座に遺伝物質を挿入することができた。hROS
A26遺伝子座は、3番染色体（3p25.3）上にあり、Ensemblのデータベース内で見つけるこ
とができる（GenBank：CR624523）。組込み部位の正確なゲノム座標は、3:9396280-93963
03: Ensemblである。組込み部位は、THUMPD3の長いノンコーディングRNAのオープンリー
ディングフレーム（ORF）（逆の鎖）内にある。hROSA26部位は内因性プロモーターを有す
るので、挿入された遺伝物質はその内因性プロモーターを利用し得るか、或いは、プロモ
ーターに作動可能に連結されるように挿入され得る。
phiC31インテグラーゼ由来のファージの特定された組込みホットスポットの1つである
ので、13番染色体の長腕上のクエン酸リアーゼβ様（CLYBL）遺伝子のイントロン2を、適
切なGSHとして特定した。この遺伝子座にランダムに挿入された誘導カセットが安定して
発現することが研究によって実証された。このGSHでの誘導カセットの挿入は、局所的な
遺伝子発現を乱さないことが示された（Cerbibiらの文献, 2015, PLOS One, DOI:10.1371
）。したがって、CLYBLは、本発明で使用するのに適切であり得るGSHを提供する。
3番染色体（位置3p21.31）上に位置するCCR5は、HIV-1の主要な共受容体をコードする
遺伝子である。この部位をGSHとして使用するという考えは、悪影響を及ぼさないと思わ
れるが、HIV-1感染抵抗性の素因となるこの遺伝子中のヌル変異から生じる。第3のエキソ
ンを標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼが開発されたため、この遺伝子座における
遺伝物質の挿入が可能になった。CCR5の天然機能はまだ解明されなければいけないことを
考えると、この部位は、依然として本発明にとって有用であり得る推定GSHのままである
。
ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子は、プリ
ンサルベージ経路を介してプリンヌクレオチドの作製において中心的な役割を果たすトラ
ンスフェラーゼ酵素をコードする。したがって、この部位での挿入が正常な細胞機能を破
壊しないことを確実にするために、さらなる作業が必要とされる。しかしながら、それは
、GSH部位としては議論の余地がある。この部位での挿入は、遺伝子治療のための改変な
どの成熟細胞型にとってより適用可能になり得る。
他の生物におけるGSHが、特定され、マウスではROSA26、HRPT及びHipp11(H11)遺伝子座
を含む。哺乳類のゲノムは、擬似attP部位に基づくGSH部位を含み得る。そのような部位
については、attB部位を保有する誘導カセット含有プラスミドを擬似attP部位へ組込む能
力を有するので、ストレプトミセスファージ由来のリコンビナーゼであるhiC31インテグ
ラーゼが、非ウイルス挿入ツールとして開発された。
GSHはまた、植物のゲノム内に存在し、植物細胞の改変は、本発明の一部を成すことが
できる。GSHは、イネのゲノムにおいて特定されている（Cantosらの文献, Front. Plant
Sci., 26 June 2014, Volume 5, Article 302, http://dx.doi.org/10.3389/fpls.2014.0
0302）。
本発明の方法において、挿入は異なるGSHで生じるため、少なくとも2つのGSHが本発明
の方法に必要とされる。第1のGSHは、転写調節タンパク質の挿入により改変される。第2
のGSHは、誘導プロモーターに作動可能に連結された遺伝子配列を含む誘導カセットの挿
入により改変される。他の遺伝物質も、これらのエレメントのいずれか又は両方と共に挿
入され得る。誘導カセット内の誘導プロモーターに作動可能に連結された遺伝子配列は、
好ましくはDNA配列である。誘導カセットの遺伝子配列（複数可）は、RNA分子をコードす
るため、転写可能である。転写は、誘導プロモーターを用いて制御される。RNA分子は、
任意の配列のものであり得るが、好ましくは、タンパク質をコードするmRNA、shRNA又はg
RNAである。
第1のGSHは、任意の適切なGSH部位であり得る。任意に、それは、構成的に発現する内
因性プロモーターを有するGSHである。これは、挿入された転写調節タンパク質の構成的
発現をもたらす。適するGSHは、ヒト細胞用のhROSA26部位である。或いは、挿入される転
写調節タンパク質は、プロモーター、好ましくは、構成的プロモーターに作動可能に連結
される。構成的プロモーターは、hROSA26部位での挿入と組み合わせて使用することがで
きる。
転写調節タンパク質は、DNA、好ましくは、プロモーターの中又は近くに位置するDNA部
位に配列特異的に結合するタンパク質であり、転写装置のプロモーターへの結合、ひいて
は、該DNA配列の転写を促進する（転写活性化因子）か、又はこのプロセスを阻止する（
転写抑制因子）。そのような実体はまた、転写因子として知られている。
転写調節タンパク質が結合するDNA配列は、転写因子結合部位又は応答エレメントと呼
ばれ、これらは、調節DNA配列のプロモーターの中又は付近に見出される。
転写活性化タンパク質は、応答エレメントに結合し、遺伝子発現を促進する。そのよう
なタンパク質は、誘導カセットの発現を制御するための本発明の方法において好ましい。
転写抑制タンパク質は、応答エレメントに結合し、遺伝子発現を妨げる。
転写調節タンパク質は、物質の結合、他の転写因子との相互作用（例えば、ホモ若しく
はヘテロ二量体化）又は共調節タンパク質、リン酸化、及び/又はメチル化を含むいくつ
かの機構によって活性化又は不活性化され得る。転写調節因子は、活性化又は不活性化に
よって制御され得る。
転写調節タンパク質が転写活性化タンパク質である場合、転写活性化タンパク質は活性
化を必要とすることが好ましい。この活性化は、任意の適切な手段を介し得るが、転写調
節タンパク質は、外因性物質の細胞への添加を通して活性化されることが好ましい。細胞
への外因性物質の供給は、制御することができるため、転写調節タンパク質の活性化を制
御することができる。或いは、外因性物質は、転写調節タンパク質を不活性化するために
供給することができ、その後、転写調節タンパク質を活性化するために除去することがで
きる。
転写調節タンパク質が転写抑制タンパク質である場合、転写抑制タンパク質は不活性化
を必要とすることが好ましい。したがって、物質は、転写抑制タンパク質が転写を抑制す
るのを防ぐために供給され、したがって、転写が可能になる。
任意の適切な転写調節タンパク質は、好ましくは、活性可能又は不活性可能であるもの
が使用され得る。外因性物質が転写調節タンパク質を制御するために供給され得ることが
好ましい。そのような転写調節タンパク質はまた、誘導性転写調節タンパク質と呼ばれる
。
テトラサイクリンに制御される転写活性化は、抗生物質テトラサイクリン又はその誘導
体の1種（例えば、より安定であるドキシサイクリン）の存在下で、転写を可逆的に開始
するか又は止める誘導性遺伝子発現の方法である。このシステムでは、転写活性化タンパ
ク質は、テトラサイクリン応答性転写活性化タンパク質（rtTa）又はその誘導体である。
rtTAタンパク質は、特異的なTetOオペレーター配列でDNAに結合することができる。その
ようなTetO配列のいくつかの反復は、最小プロモーター（CMVプロモーターなど）の上流
に配置され、共にテトラサイクリン応答エレメント（TRE）を形成する。テトラサイクリ
ン又は誘導体の添加がrtTAタンパク質を活性化（Tet-On）又は不活性化（Tet-Off）する
かどうかに応じて、このシステムには2つの形態が存在する。
Tet-Offシステムにおいて、テトラサイクリン又はその誘導体は、rtTAに結合し、rtTA
を不活性化し、TRE配列に結合することができないようにさせ、それによって、TRE制御遺
伝子の転写を防止する。このシステムは、最初にBujardらの文献(1992). Proc. Natl. Ac
ad. Sci. U.S.A. 89 (12): 5547-51に記載された。
Tet-Onシステムは、2つの成分;（1）構成的に発現するテトラサイクリン応答性転写活
性化タンパク質（rtTa）及びrtTA感受性誘導プロモーター（Tet応答エレメント、TRE）で
構成されている。これは、テトラサイクリン又はドキシサイクリン（dox）を含むそのよ
り安定な誘導体と結合し、rtTaの活性化をもたらし、TRE配列に結合することを可能にし
、TRE制御遺伝子の発現を誘導し得る。この使用は、本発明の方法において好ましい場合
がある。このシステムは、図11に図示されている。
したがって、転写調節タンパク質は、このように、外部から供給される抗生物質テトラ
サイクリン又はその誘導体の1種によって活性化又は不活性化することができるテトラサ
イクリン応答性転写活性化タンパク質（rtTa）タンパク質であり得る。転写調節タンパク
質がrtTAである場合、第2のGSH部位に挿入される誘導プロモーターは、テトラサイクリン
応答エレメント（TRE）を含む。外部から供給される物質は、抗生物質テトラサイクリン
又はその誘導体の1種である。
変異体及び改変rtTaタンパク質は、本発明の方法で用いることができ、これらには、Te
t-On高度トランス活性化因子（rtTA2S-M2としても知られる）及びTet-On 3G(rtTA2S-S2由
来のrtTA-V16としても知られる）が含まれる。
テトラサイクリン応答エレメント（TRE）は、一般的に、最小プロモーターと共にスペ
ーサー配列により分離される19bpの細菌TetO配列の7回反復からなる。最小プロモーター
は任意の適切なプロモーターであり得るので、変異体及びTRE配列の改変が可能である。
好ましくは、最小プロモーターは、rtTa結合の非存在下で、0の又は最小限の発現レベル
を示す。したがって、第2のGSHに挿入される誘導プロモーターはTREを含み得る。
テトラサイクリン制御に基づく改変システムは、T-REx（商標）システム（Thermofishe
r Scientific）であり、その中の転写調節タンパク質は転写抑制タンパク質のTetRである
。このシステムの構成成分には、（i）強力なヒトサイトメガロウイルス最初期（CMV）プ
ロモーターを含む誘導プロモーター及び2つのテトラサイクリンオペレーター2（TetO2）
部位、及びTet抑制因子（TetR）が含まれる。TetO2配列は、2塩基対のスペーサーによっ
て分離される19ヌクレオチド配列
Figure 2023134465000002
 の2コピーからなる。テトラサイクリンの非存在下では、Tet抑制因子は、誘導プロモータ
ーの各TetO2配列に対して非常に高い親和性で結合するホモ二量体を形成し、プロモータ
ーからの転写を妨げる。添加されると、テトラサイクリンは、各Tet抑制因子のホモ二量
体に高い親和性で結合し、Tetオペレーターに結合できないようにさせる。Tet抑制因子：
テトラサイクリン複合体は、その後、Tetオペレーターから解離し、発現誘導を可能にす
る。この場合、転写調節タンパク質はTetRであり、誘導プロモーターは、2つのTetO2部位
を含む。外部から供給される物質は、テトラサイクリン又はその誘導体である。
本発明は、さらに、コドン最適化tetR（OPTtetR）に関する。これは、本明細書に記載
の任意の方法で、又は誘導促進が望まれる任意のさらなる使用のために使用され得る。こ
の実体は、細菌tetR cDNA配列のマルチパラメータ最適化を使用して作製された。OPTtetR
は、標準的な配列（STDtetR）と比較した時に、tetR発現において10倍の増加を可能にす
る。tetRのホモ接合性OPTtetR発現は、shRNA漏出を防止するのに十分であり、実施例では
ノックダウン誘導を維持する。OPTtetRの配列を、比較として示す標準配列と共に本明細
書に含める。この配列に対して少なくとも75％、80％、85％又は90％の相同性、より具体
的には、91、92、93、94、95、96、97又は99％の相同性を有する配列は、本明細書で特許
請求される。STDtetRとOPTtetRとの間で変わっていることが示された残基は、配列中に示
されており、これらの残基は、特性の改良に重要であると考えられるので、OPTtetRの任
意の誘導体において変更しないことが好ましい。いかなる誘導体も、任意に、示された位
置でこれらの改変を保持する。
他の誘導発現系が公知であり、本発明の方法において使用することができる。これらに
は、Agilent Technologies社の完全制御誘導システム(Complete Control Inducible syst
em)が含まれる。これは、キイロショウジョウバエ(Drosophila melongaster)エクジソン
受容体（EcR）の遺伝子とエクジソン受容体に対する結合部位を含む誘導プロモーターの
両方でトランスフェクトされた哺乳動物細胞内で転写を活性化することができる昆虫ホル
モンのエクジソン又はその類似体のポナステロンA（ponA）に基づく。EcRは、核内受容体
のレチノイドX受容体（RXR）ファミリーのメンバーである。ヒトでは、EcRは、エクジソ
ン応答エレメント（EcRE）に結合するRXRとヘテロ二量体を形成する。PonAの非存在下で
は、転写はヘテロ二量体によって抑制される。
したがって、該転写調節タンパク質は、エクジソン受容体又はその誘導体などの抑制タ
ンパク質であり得る。後者の例には、EcR、グルココルチコイド受容体のDNA結合ドメイン
と単純ヘルペスウイルスVP16の転写活性化ドメインの融合物であるAgilent technologies
社のVgEcR合成受容体が含まれる。該誘導プロモーターには、最小プロモーターと共にEcR
E配列又はその改変バージョンが含まれる。改変バージョンには、配列に変異を施したAgi
lent technologies社のE/GRE認識配列が含まれる。該E/GRE認識配列には、レチノイドX受
容体（RXR）の逆半分部位認識エレメント及びGR結合ドメインが含まれる。全てのパーミ
ュテーションにおいて、外部から供給される物質は、誘導プロモーターに対するEcR又は
その誘導体の抑制効果を取り除き、転写が生じるのを可能にするポナステロンAである。
或いは、誘導システムは、外部から供給される物質として合成ステロイドミフェプリス
トンに基づき得る。この状況では、酵母GAL4タンパク質のDNA結合ドメイン、ヒトプロゲ
ステロン受容体の切断されたリガンド結合ドメイン（LBD）及びヒトNF-κBの活性化ドメ
イン（AD）に基づくハイブリッド転写調節タンパク質が挿入される。このハイブリッド転
写調節タンパク質は、Thermofisher Scientific(Gene Switch（商標））から入手可能で
ある。ミフェプリストンは、ハイブリッドタンパク質を活性化し、活性化配列（UAS）及
びアデノウイルスE1b TATAボックスの上流にGAL4を含む誘導プロモーターからの転写を可
能にする。このシステムは、Wang, Y.らの文献(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,
8180-8184に記載されている。
したがって、該転写調節タンパク質は、活性化タンパク質又は抑制タンパク質のいずれ
かの任意の適切な調節タンパク質であり得る。適切な転写活性化タンパク質は、テトラサ
イクリン応答性転写活性化タンパク質（rtTa）又は遺伝子スイッチハイブリッド転写調節
タンパク質である。適切な抑制タンパク質には、rtTA、TetR又はEcRのTet-Offバージョン
が含まれる。該転写調節タンパク質は、必要に応じて、改変又は誘導体化され得る。
誘導プロモーターは、転写調節タンパク質との結合又は相互作用に適するエレメントを
含むことができる。転写調節タンパク質と誘導プロモーターの相互作用は、好ましくは、
外部から供給される物質によって制御される。
外部から供給される物質は、転写調節タンパク質と結合又は相互作用する任意の適切な
物質であり得る。適切な物質には、テトラサイクリン、ポナステロンA及びミフェプリス
トンが含まれる。
したがって、転写調節タンパク質コード遺伝子の第1のGSHへの挿入は、誘導プロモータ
ーに作動可能に連結され、第2の異なるGSH部位に挿入された誘導カセットを発現させるた
めの制御機構を提供する。
転写調節タンパク質遺伝子は、他の遺伝物質での挿入のために提供され得る。そのよう
な物質には、蛍光タンパク質及び発光タンパク質を含む視覚的に識別可能な特徴を誘導す
る遺伝子などのマーカー又はレポーター分子の遺伝子が含まれる。例には、青色光/UV光
下で発現細胞に緑色を発するようにさせるクラゲ緑色蛍光タンパク質（GFP）、ルシフェ
リンとの反応を触媒して、光を生成するルシフェラーゼ、遺伝子dsRedの赤色蛍光タンパ
ク質をコードする遺伝子が含まれる。そのようなマーカー又はレポーター遺伝子は、該レ
ポータータンパク質の存在が、挿入の成功を示す第1のGSHからのタンパク質発現を裏付け
るので有用である。選択マーカーは、さらに、抗生物質又は他の薬剤に対する耐性遺伝子
を含んでよい。内因性（又は外因性遺伝子）の発現の研究を可能にするマーカー又はレポ
ーター遺伝子配列も導入することができる。これには、目的の遺伝子の切除を可能にする
CasL、Cas9タンパク質、並びに、例えば、転写エンハンサー又は抑制因子として作用する
ことによって、他の遺伝子の発現変化を媒介するCas融合タンパク質を含むCasタンパク質
が含まれる。また、光遺伝学的ツール、タモキシフェン誘導性システムのERTなどの核内
受容体融合タンパク質、及びもっぱらデザイナー薬剤によって活性化されるデザイナー受
容体を含む分子ツールの非誘導発現が望ましい場合がある。さらに、ホルモンのオートク
リン又はパラクリン因子を含む、生物内の同じ細胞又は隣接細胞又はさらに遠い細胞の機
能を変えるシグナル伝達因子をコードする配列は、転写調節タンパク質と同じGSHから共
発現させることができる。
また、さらなる遺伝物質には、本明細書で説明するノンコーディングRNAをコードする
配列を含み得る。そのような遺伝物質の例には、遺伝子スイッチとして機能し得るmiRNA
の遺伝子が含まれる。
転写調節タンパク質コード遺伝子は構成的プロモーターに作動可能に連結されることが
好ましい。或いは、第1のGSHは、転写調節タンパク質遺伝子及び任意の関連する遺伝物質
の発現も促進することができる構成的プロモーターを既に有するように選択することがで
きる。構成的プロモーターは、持続的で高レベルの遺伝子発現を保証する。ヒトβアクチ
ンプロモーター（ACTB）、サイトメガロウイルス（CMV）、伸長因子1α（EF1α）、ホス
ホグリセリン酸キナーゼ（PGK）及びユビキチンC（UbC）を含む構成的プロモーターが一
般に使用される。CAGプロモーターは、高レベルの遺伝子発現を促進するために頻繁に使
用される強力な合成プロモーターであり、以下の配列：（C）サイトメガロウイルス（CMV
）初期エンハンサーエレメント、（A）ニワトリβ-アクチン遺伝子のプロモーター、第1
のエキソン及び第1のイントロン、並びに（G）ウサギβ-グロビン遺伝子のスプライスア
クセプターから構築された。
さらに、転写調節因子、及び任意のさらなる遺伝物質は、切断配列と共に提供され得る
。そのような配列は、特異的にDNAを切断することが可能な実体によって認識される配列
であり、制限酵素の標的配列である制限部位又はヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、リボザ
イム若しくは人工構築物などの他のDNA切断実体による認識のための配列を含む。少なく
とも1つの切断配列が含まれてもよいが、好ましくは2以上が存在する。これらの切断配列
は、挿入物の選択部分、又は挿入物の全てをGSHから選択的に除去することができるよう
な、挿入物中の任意の適切なポイントであり得る。したがって、本方法は、GSHから挿入
物若しくはその一部を除去及び/又は交換するために拡大適用することができる。したが
って、切断部位は、除去することが望まれ得る挿入物の一部/全てに隣接し得る。転写調
節因子及び/又はさらなる遺伝物質は、この方法を用いて除去され得る。
挿入物の一部は、挿入物の99％まで、すなわち、1～99％、90％、80％、70％、60％、5
0％、40％、30％、20％、10％又は10％未満の任意の部分であり得る。
切断部位が隣接する挿入物の部分は構成的プロモーターを含むことが好ましい場合があ
る。或いは、構成的プロモーターは、切断配列が隣接する部分に含まれない。
好ましい切断配列は、除去される挿入物の直接交換を可能にするように、Creリコンビ
ナーゼ用のloxP部位である。或いは又はさらに、切断配列は、Dreリコンビナーゼ用のrox
部位である。
第1のGSHでの挿入は、ゲノムの両方の遺伝子座で生じるため、各対立遺伝子は挿入によ
り改変されることが好ましい。これは、転写調節因子及び任意の関連遺伝物質をコードす
る遺伝子からのより多くの発現を可能にする。
第2のGSHは、任意の適切なGSH部位であり得る。挿入された誘導カセットの発現が転写
調節タンパク質の制御下にのみあるように、第2のGSH部位が内因性プロモーターに関連付
けられていないことが好ましい場合がある。
誘導カセットは、所望の遺伝子配列、好ましくは、細胞に導入されるべきDNA配列を含
む。ゲノムへの誘導カセットの導入は、遺伝子発現を可能にする遺伝子配列の付加又は内
因性発現のノックダウン/ノックアウトによってその細胞の表現型を変える可能性を有す
る。本発明の方法は、細胞における誘導カセット内の遺伝子配列（複数可）の制御可能な
転写を提供する。
挿入のための所望の遺伝子配列は、好ましくは、RNA分子をコードするDNA配列である。
RNA分子は、任意の配列であり得るが、好ましくはコーディングRNA又はノンコーディング
RNAである。コーディングRNA又はメッセンジャーRNAはポリペプチド配列をコードし、そ
のようなRNAの転写は、細胞内タンパク質の発現をもたらす。ノンコーディングRNAは、機
能的であり得、限定されないが、マイクロRNA、低分子干渉RNA、Piwi相互作用RNA、アン
チセンスRNA、核内低分子RNA、核小体低分子RNA、低分子カハール体RNA、Y RNA、エンハ
ンサーRNA、ガイドRNA、リボザイム、低分子ヘアピンRNA、低分子時間的RNA（Small temp
oral RNA）、トランス作用RNA、低分子干渉RNA及びサブゲノムメッセンジャーRNAを含み
得る。ノンコーディングRNAは、機能性RNAとしても知られ得る。RNAのいくつかの種類は
、自然界で調節され、例えば、mRNA又は遺伝子のDNAの一部と相補的であることによって
遺伝子発現を下方制御することができる。マイクロRNA（miRNA;21～22個のヌクレオチド
）が、真核生物において見出され、miRNA及び酵素のエフェクター複合体が、相補的なmRN
Aを切断するか、mRNAが翻訳されるのを阻止するか、又はその分解を促進することができ
るRNA干渉（RNAi）を介して作用する。RNAの別の種類の低分子干渉RNA（siRNA;20～25個
のヌクレオチド）は、miRNAに似た方法でRNA干渉を介して作用する。いくつかのmiRNA及
びsiRNAは、標的とする遺伝子をメチル化することによって、それらの遺伝子の転写を減
少又は増加させることができる。動物は、生殖系列細胞において活性があり、トランスポ
ゾンに対する防御であると考えられているPiwi相互作用RNA（piRNA;29～30個のヌクレオ
チド）を有する。多くの原核生物は、RNA干渉と同様の調節システムであるCRISPR RNAを
有し、そのようなシステムにはガイドRNA（gRNA）が含まれる。アンチセンスRNAは普及し
ており、ほとんどが遺伝子を下方制御するが、いくつかは、転写の活性化因子である。ア
ンチセンスRNAは、mRNAに結合して、酵素により分解される二本鎖RNAを形成することによ
って作用することができる。真核生物において遺伝子を調節する多くの長いノンコーディ
ングRNAが存在し、そのようなRNAの1つは、雌の哺乳動物において1つのX染色体を覆い、
それを不活性化するXistである。したがって、本発明の方法で使用することができる機能
性RNAは多数存在する。
したがって、該誘導カセットは、タンパク質コード遺伝子である遺伝子配列を含んでよ
い。この遺伝子は、細胞内に天然に存在しないか、又は細胞内に天然に存在し得るが、そ
の遺伝子の制御可能な発現が必要とされる。或いは、該誘導カセットは、特に、遺伝子治
療目的又は疾患モデルの導出のための、細胞内に存在する遺伝子の変異バージョン、改変
バージョン又は正しいバージョンであり得る。したがって、該誘導カセットは、同じ種の
異なる生物由来の導入遺伝子（すなわち、ヒト由来の遺伝子の疾患/変異バージョン、若
しくはヒト由来の野生型遺伝子）を含むか、又は異なる種に由来し得る。
任意の態様又は実施態様において、該誘導カセット内に含まれる遺伝子配列は、合成配
列であり得る。
該誘導カセットは、細胞のゲノムに挿入することが望まれる任意の適切な遺伝子配列を
含んでよい。したがって、該遺伝子配列は、タンパク質生成物をコードする遺伝子又は機
能を有するリボ核酸（RNA）（核内低分子RNA（snRNA）、アンチセンスRNA、マイクロRNA
（miRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、トランスファーRNA（tRNA）並びにCRISPR-RNA（cr
RNA）及びガイドRNA（gRNA）を含む他のノンコーディングRNA（ncRNA）など)に転写され
る配列であり得る。
したがって、該誘導カセットは、その転写が細胞内で制御することが望まれる任意の遺
伝子配列を含んでよい。以下でさらに説明するように、選される遺伝子配列は、細胞型及
び改変後の細胞の用途に依存する。
例えば、遺伝子治療法については、誘導カセットの構成成分として野生型遺伝子配列を
提供することが望ましい場合がある。この状況において、該遺伝子配列は、任意のヒト又
は動物のタンパク質コード遺伝子であり得る。タンパク質コード遺伝子の例には、ヒトβ
グロビン遺伝子、ヒトリポタンパク質リパーゼ（LPL）遺伝子、CHM遺伝子及びより多くの
遺伝子によってコードされるヒトのRabエスコートタンパク質1が含まれる。或いは、該誘
導カセットは、BDNF、GDF、NGF、IGF、FGFを含む成長因子及び/又はプロペプチドを切断
して活性型を形成することができる酵素を発現し得る。遺伝子治療はまた、アンチセンス
RNA、miRNA、siRNA又は細胞内で別の遺伝子の発現に干渉するRNAのいずれかの種類をコー
ドする遺伝子配列を含む誘導カセットの発現によって達成され得る。
或いは、該細胞が幹細胞である場合、該誘導カセットは、本明細書ではマスター調節因
子と略される重要な系統特異的マスター調節因子をコードする遺伝子配列を含むことがで
きる。マスター調節因子は、転写因子、転写調節因子、サイトカイン受容体又はシグナル
伝達分子などのうちの1以上であり得る。マスター調節因子は、それを発現する細胞の系
統に影響を与える発現遺伝子である。マスター調節因子のネットワークは、細胞の系統が
決定されることを必要とする場合がある。本明細書で使用される場合、発達している系統
又は細胞型の開始時に発現するマスター調節遺伝子は、直接又は遺伝子発現変化のカスケ
ードを介して複数の下流の遺伝子を調節することによってその系統の特異性に関与する。
マスター調節因子は、発現すると、他の系統を形成するように運命づけられた細胞の運命
を再指定する能力を有する。マスター調節因子の例には、筋原性転写因子のMyoD及び造血
転写因子SCLが含まれる。特に、マスター調節因子には、
神経系統：オリゴデンドロサイト：SOX10、OLIG2、NKX2.2、NKX6.2;アストロサイト：NFI
A、NFIB、及びSOX9;ニューロン：Ascl1、ニューロゲニン、及びニューロD、Pax6、Neurog
2、Ascl1、Dlx2、及びNeuroD1;赤血球及び巨核球を含む造血細胞: GATA1、FLI1及びTAL1
間葉系系統：骨格筋：MYOD;心筋細胞：Gata4、Mef2c、Baf60c及びTbx5;骨：L-Myc（RXOL
）Runx2、オステリックス、Oct4;軟骨：c-Myc Klf4、SOX9;及びブラウン脂肪細胞：C/EBP
-β及びc-Myc
内胚葉
膵臓の細胞型：PDX1及びGATA6
幹細胞：胚盤葉上層SC：Oct4、Sox2、Klf4及びc-Myc
が含まれるが、これらに限定されない。
或いは又はさらに、遺伝子配列又はさらなる遺伝物質は、制御可能な発現によって細胞
に対する発現の効果を調べることができるような、その機能を調査する必要がある遺伝子
であり得る。該遺伝子は、細胞が細胞移植で使用されるために成長因子及び/又はサイト
カインを含み得、かつ/又は該遺伝子は、レポーターアッセイの構成成分であり得る。
さらに、該遺伝子配列は、その機能が内因性遺伝子の発現をノックダウンすることであ
るノンコーディングRNAをコードするか、又は細胞内でノンコーディングRNAをコードする
DNA配列であり得る。或いは、該遺伝子配列は、内因性遺伝子のノックアウトをもたらすC
RISPR-Cas9システム用のガイドRNAをコードし得る。
したがって、本発明の方法は、細胞内で内因性遺伝子の発現をノックダウンする方法に
及ぶ。本方法は、前述のとおりであり、該誘導カセットは、誘導プロモーターに作動可能
に連結されたノンコーディングRNAをコードする遺伝子配列を含み、該ノンコーディングR
NAは、前記内因性遺伝子の発現を抑制する。該ノンコーディングRNAは、RNA干渉及びアン
チセンスRNAを含む任意の適切な手段により遺伝子発現を抑制し得る。したがって、該遺
伝子配列は、内因性遺伝子のメッセンジャーRNAに干渉することができるshRNAをコードし
得る。
内因性遺伝子発現の低下は、部分的又は完全であり得る - すなわち、発現は、ノンコ
ーディングRNAの転写の誘導前の細胞と比較して50、55、65、70、75、80、85、90、91、9
2、93、94、95、96、97、98、99又は100％の低下であり得る。
遺伝子ノックアウト用の任意の他の適切なシステムが使用され得るが、本発明の方法は
また、CRIPSR-Cas9システムにより細胞内で内因性遺伝子をノックアウトする方法に及ぶ
。この状況において、Cas9遺伝子は、構成的に発現するため、転写調節因子の遺伝子を有
する第1のGSHに含まれることが好ましい。gRNAコード遺伝子配列は、第2のGSHに挿入され
る誘導カセットに含まれてもよい。gRNAは、Cas9結合に必要な足場の配列及び改変される
ゲノム標的を定義する約20個のヌクレオチド標的配列で構成された短い合成RNAである。
したがって、Cas9のゲノム標的は、gRNAに存在する標的配列を単に変更することによって
変更することができる。そのようなシステムの主な用途は、遺伝子をノックアウトするた
めに、内因性遺伝子を標的とするgRNAを設計することであるが、標的遺伝子を選択的に活
性化又は抑制し、特異的DNA領域を精製し、さらにはDNAを画像化するように改変すること
もできる。全ての可能な用途が想定される。
該誘導カセットは、誘導プロモーターに作動可能に連結された遺伝子配列を含む。「プ
ロモーター」は、ポリヌクレオチドの転写を開始及び調節するヌクレオチド配列である。
「誘導プロモーター」は、プロモーターに作動可能に連結された遺伝子配列の発現が、分
析物、補因子、調節タンパク質などによって制御されるヌクレオチド配列である。本発明
の場合には、該制御は、転写調節タンパク質により行われる。用語「プロモーター」又は
「制御エレメント」には、全長プロモーター領域及びこれらの領域の機能的（例えば、転
写又は翻訳を制御する）セグメントが含まれることが意図される。「作動可能に連結され
た」は、そのように記載される構成成分がその通常の機能を行うように構成されているエ
レメントの配置を指す。したがって、遺伝子配列に作動可能に連結された所定のプロモー
ターは、適切な酵素が存在する場合に、その配列の発現をもたらすことが可能である。プ
ロモーターは、配列の発現を指示するように機能する限り、該配列に隣接する必要はない
。したがって、例えば、翻訳されないが転写される配列の介在は、プロモーター配列と遺
伝子配列の間に存在することができ、該プロモーター配列は、なお、該遺伝子配列に「作
動可能に連結された」とみなすことができる。したがって、「作動可能に連結された」と
いう用語は、転写複合体によるプロモーターエレメントの認識の際に、誘導カセットの転
写の開始を可能にする、誘導カセット内のプロモーターエレメント及び遺伝子配列の任意
の間隔又は方向を包含することが意図される。
さらに、他の遺伝物質も、該誘導プロモーターに作動可能に連結され得る。さらなる遺
伝物質は、マーカー又はレポーター遺伝子などの遺伝子、RNAコード配列、遺伝物質を含
み得る。そのようなさらなる遺伝物質については以前に説明した。いくつかの状況では、
該誘導カセットに自殺遺伝子を含むことが望ましい場合があるが、遺伝子配列自体が癌遺
伝子治療のための自殺遺伝子であってはならない。該自殺遺伝子は、誘導カセット内の同
じ誘導プロモーターを使用し得るか、又は別々の制御を可能にするための別々の誘導プロ
モーターであり得る。そのような遺伝子は、特定の条件が満たされた場合、ドナー/トラ
ンスフェクト細胞を破壊できることが望ましい遺伝子治療の状況において有用であり得る
。自殺遺伝子は、細胞にアポトーシスを引き起こすか、或いは動作させるために外部供給
の補因子又は共薬剤を必要とし得るタンパク質を発現する遺伝子である。補因子又は共薬
剤は、自殺遺伝子の生成物によって高度に細胞傷害性の実体に変換され得る。
さらに、該誘導カセットは、切断配列を含んでよい。そのような配列は、特異的にDNA
を切断することが可能な実体によって認識される配列であり、制限酵素用の標的配列であ
る制限部位又はヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、リボザイム又は人工構築物などの他のDN
A切断実体による認識のための配列を含む。少なくとも1つの切断配列が含まれ得るが、好
ましくは2以上が存在する。これらの切断配列は、カセットの選択部分、又はカセット全
体をGSHから選択的に除去することができるような、カセット内の任意の適切なポイント
であり得る。したがって、本方法は、カセット又はその一部のGSHからの除去及び/又は交
換に及ぶことができる。したがって、該切断部位は、除去することが望まれ得る遺伝子配
列の一部/全てに隣接し得る。本方法は、該誘導カセット及び/又はさらなる遺伝物質の除
去をもたらし得る。
該カセットの一部は、該カセットの99％まで、すなわち、1～99％、90％、80％、70％
、60％、50％、40％、30％、20％、10％又は10％未満の任意の部分であり得る。
切断部位が隣接する挿入部分は、遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモーターを含
むことが好ましい場合がある。或いは、遺伝子配列に作動可能に連結されたプロモーター
は、切断配列が隣接する部分には含まれない。
好ましい切断配列は、除去される挿入物の直接交換を可能にするように、Creリコンビ
ナーゼ用のloxP部位である。或いは又はさらに、該切断部位は、Dreリコンビナーゼ用のr
ox部位であり得る。
転写調節タンパク質及び誘導カセットは、任意の関連する遺伝物質と共に、細胞のゲノ
ム内の異なるGSHに挿入される。
GSHへの挿入は、好ましくは、特に、前述のGSHの配列内である。特異的配列へのポリヌ
クレオチドの挿入のための任意の適切な技術が使用され得、いくつかは当技術分野で説明
されている。適切な技術には、所望の位置で切断を導入し、ベクターのギャップへの組換
えを可能にする任意の方法が含まれる。したがって、標的部位特異的ゲノム改変に重要な
第1の工程は、改変されるべきゲノム遺伝子座に二本鎖DNA切断（DSB）を作ることである
。別々の細胞の修復機構を、DSBを修復するために、かつ所望の配列を導入するために利
用することができ、これらは、エラーをより起こしやすい非相同末端結合修復（NHEJ）、
及び誘導カセットを挿入するために使用することができるドナーDNA鋳型によって媒介さ
れる相同組換え修復（HR）である。
いくつかの技術が、ゲノム内にカスタマイズされた部位特異的DSB生成を可能にするた
めに存在する。これらの多くは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因
子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）又はクラスター化して規則的な配置の短い回文
配列リピート(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/CRISPR関
連タンパク質（CRISPR/Cas9）システムなどのカスタマイズされたエンドヌクレアーゼの
使用を伴う(Gaj, Tらの文献,「ゲノム遺伝子工学のためのZFN、TALEN、及びCRISPR/Casベ
ースの方法(ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering)」 Tr
ends Biotechnol, 31:397-405, July 2013)。
ジンクフィンガーヌクレアーゼは、制限酵素FokIのヌクレアーゼドメインとジンクフィ
ンガーDNA結合ドメインの融合によって作製される人工酵素である。後者は、DNAを切断す
るために、二量体化しなければならない非特異的切断ドメインを有する。これは、2つのZ
FNモノマーがFokIドメインの二量体化を可能にし、DNAを切断するために必要とされるこ
とを意味する。DNA結合ドメインは、目的の任意のゲノム配列を標的とするように設計さ
れ得、その各々が標的配列中の3つの隣接ヌクレオチドを認識するCys2His2ジンクフィン
ガーのタンデムアレイである。2つの結合部位は、FokIドメインの最適な二量体化を可能
にするために、5～7bpほど分離されている。したがって、該酵素は、特異的部位でDNAを
切断することができ、標的特異性は、二本鎖切断を達成するために、2つの近接DNA結合事
象が生じなければならないことを確実にすることによって増す。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ、又はTALENは、二量体転写因子/ヌクレア
ーゼである。それらは、DNA切断ドメイン（ヌクレアーゼ）にTALエフェクターDNA結合ド
メインを融合することにより作製される。転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、実
質的に任意の所望のDNA配列に結合するように工学処理することができるので、ヌクレア
ーゼと組み合わせた場合、DNAは、特異的位置で切断することができる。TALエフェクター
は、キサントモナス細菌によって分泌されるタンパク質であり、そのDNA結合ドメインは
、12番目及び13番目のアミノ酸が異なる高度に保存された33～34アミノ酸の反復配列を含
有する。これらの2つの位置は、非常に多様であり、特異的ヌクレオチドの認識と強い相
関を示す。アミノ酸配列とDNA認識の間のこの直接的な関係によって、2つの可変位置に適
切な残基を含有するリピートセグメントの組み合わせを選択することによって、特異的DN
A結合ドメインの工学処理が可能になった。したがって、TALENは、その各々が単一ヌクレ
オチドを標的とする33～35個のアミノ酸モジュールのアレイから構築されている。モジュ
ールのアレイを選択することによって、ほとんどの任意の配列が標的化され得る。再び、
使用されるヌクレアーゼはFokI又はその誘導体であり得る。
CRISPR機構の3つの種類が特定され、そのうちのII型が最も研究されている。CRISPR/Ca
s9システム（II型）はCas9ヌクレアーゼを利用して、短いガイドRNAによって決定される
部位でDNAに二本鎖切断を作る。CRISPR/Casシステムは、外因性遺伝子エレメントに対す
る耐性を付与する原核生物の免疫システムである。CRISPRは、塩基配列の短い反復を含有
する原核生物DNAのセグメントである。各反復には、外因性遺伝子エレメントへの事前曝
露からの「プロトスペーサーDNA」の短いセグメントが続く。CRISPRスペーサーは、RNA干
渉を使用して、外因性遺伝子エレメントを認識し、切断する。CRISPR免疫応答は、2つの
工程：CRISPR-RNA（crRNA）生合成及びcrRNA誘導干渉を通して生じる。crRNA分子は、プ
ロトスペーサーDNAから転写された可変配列及びCRISPリピートで構成されている。次いで
、各crRNA分子は、トランス活性化CRISPR RNA（tracrRNA）として知られている第2のRNA
とハイブリダイズし、これら2つは共に、最終的には、ヌクレアーゼCas9と複合体を形成
する。プロトスペーサーDNAにコードされるcrRNAの部分は、プロトスペーサー隣接モチー
フ（PAM）として知られる短い配列に隣接している場合に、相補的標的DNA配列を切断する
ようにCas9に指示する。この天然システムは、多くの他の適用の中で、ゲノムDNAの特異
的部位でのDSB切断を導入するために設計及び利用されてきた。特に、ストレプトコッカ
ス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)からのCRIPSR II型システムが使用され得る。
最も単純な場合、CRISPR/Cas9システムは、ゲノム編集を提供するために、細胞に送達さ
れる2つの成分：Cas9ヌクレアーゼ自体及び低分子ガイドRNA（gRNA）を含む。gRNAは、カ
スタマイズされた部位特異的crRNA（標的配列指向）と標準化されたtracrRNAの融合物で
ある。
DSBが行われた後、標的遺伝子座と相同性を有するドナー鋳型が供給され、該DSBは、正
確な挿入がなされるのを可能にする相同指向性修復（HDR）経路によって修復され得る。
このシステムの誘導体も可能性がある。ニッカーゼ活性のみを有するCas9D10AなどのCa
s9の変異型も利用可能である。これは、一方のDNA鎖のみを切断することを意味し、NHEJ
を活性化しない。その代わりに、相同修復鋳型を提供する場合に、DNA修復は、高忠実性H
DR経路のみを介して行われる。Cas9D10A(Cong L.らの文献,(2013) Science, 339, 819-82
3)は、標的部位の反対鎖上の隣接領域に相補的な2つのsgRNAと共に隣接DNAニックを作製
するように設計された一対のCas9複合体において使用され、これは特に有利であり得る。
二本鎖DNA切断を作製するためのエレメントは、細胞内での発現用のプラスミドなどの1
以上のベクター中に導入され得る。
したがって、遺伝子/誘導カセットを挿入するために、ゲノム内に特異的標的化二本鎖
切断を作製する方法はいずれも、本発明の方法で使用することができる。該遺伝子/誘導
カセットを挿入する方法は、ZFN、TALEN及び/又はCRISPR/Cas9システム又はそれらの任意
の誘導体のいずれか1以上を利用することが好ましい場合がある。
DSBが任意の適切な手段によってなされた後、以下に記載のように、挿入のための遺伝
子/誘導カセットが任意の適切な方法で供給され得る。該遺伝子/誘導カセット及び関連遺
伝物質は、DSBでのDNA修復用のドナーDNAを形成し、標準的な細胞修復機構/経路を用いて
挿入される。切断が開始される方法は、上述のように、損傷修復のためにどの経路が使用
されるかによって変わる。
該転写調節タンパク質及び該誘導カセットは、別々のベクター上に、本発明の方法のた
めに供給され得る。「ベクター」は、細胞内に遺伝物質を人工的に運ぶためのビヒクルと
して使用されるDNA分子などの核酸分子である。該ベクターは、一般的に、挿入物（誘導
カセット又は転写調節タンパク質の遺伝子など）及びベクターの「骨格」として機能する
より大きな配列からなる核酸配列である。該ベクターは、プラスミド、ミニサークル、又
は直鎖状DNAを含む任意の適切な構成であり得る。該ベクターは、関連GSHへの遺伝子の挿
入を可能にするための最小配列と共に、少なくとも転写調節因子の遺伝子又は誘導プロモ
ーターに作動可能に連結された誘導カセットを含む。任意に、該ベクターはまた、例えば
、細菌内でベクターの増幅を可能にする複製開始点（ori）を所有する。さらに、又は或
いは、該ベクターは、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカー、着色マーカーの遺伝子及
び自殺遺伝子を含む。
実施例で使用するベクターの例を、図20～33に図示する。
本発明の方法で使用する細胞は、任意のヒト又は動物の細胞であり得る。それは、好ま
しくは、マウス及びラットなどのげっ歯類;カンガルー及びコアラなど有袋類;ボノボ、チ
ンパンジー、キツネザル、テナガザル及び類人猿などの非ヒト霊長類;ラクダ及びラマな
どのラクダ類;ウマ、ブタ、ウシ、水牛、バイソン、ヤギ、ヒツジ、シカ、トナカイ、ロ
バ、バンテン、ヤク、ニワトリ、アヒル及び七面鳥などの家畜動物;ネコ、イヌ、ウサギ
及びモルモットなどの飼いならされた動物に由来する細胞などの哺乳動物細胞である。該
細胞は、好ましくはヒト細胞である。特定の態様において、該細胞は、好ましくは家畜動
物由来のものである。
本発明の方法で使用される細胞の種類は、GSH部位への遺伝物質の挿入が完了した時点
での細胞の適用に依存する。
目的が前駆細胞から成熟細胞型を生成することである場合、改変される細胞は、幹細胞
、好ましくは、多能性幹細胞である。多能性幹細胞は、体内のほぼ全ての細胞に分化する
能力を有する。多能性幹細胞の供給源はいくつかある。胚性幹細胞（ES細胞）は、早期の
着床前胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する多能性幹細胞である。人工多能性幹細胞（
iPSC）は、胚性幹細胞の決定的な特性を維持するのに重要な遺伝子及び因子を発現するこ
とを余儀なくされることにより、胚性幹細胞様状態に遺伝的に再プログラミングされた成
体細胞である。2006年に、転写因子をコードする4つの特定の遺伝子の導入が、成体細胞
を多能性幹細胞に変換できることが示された(Takahashi, K; Yamanaka, S (2006), Cell
126 (4): 663-76)が、その後の研究により、必要とされる遺伝子の数が低下/変更された
。Oct-3/4及びSox遺伝子ファミリーのいくつかのメンバーが、誘導プロセスに関与する潜
在的に重要な転写調節因子として特定された。Klfファミリー、Mycファミリー、Nanog、
及びLIN28のいくつかのメンバーを含むさらなる遺伝子は、誘導効率を向上させ得る。再
プログラミング因子に含有され得る遺伝子の例には、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15
、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、T
cl1、beta-カテニン、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3及びGlis1が含まれ、
これらの再プログラミング因子は、単独で、又はその2種以上の組み合わせで使用され得
る。
目的が、発達又は遺伝子機能研究などのさらなる研究のためにノックダウン又はノック
アウトされた遺伝子を有する幹細胞を生成することである場合、改変される細胞は、幹細
胞、好ましくは、多能性幹細胞、又は成熟細胞型であり得る。多能性幹細胞の供給源は、
上述されている。
誘導カセットの挿入によって改変された細胞がヒトの患者において使用される場合、該
細胞は、その個体由来のiPSCであることが好ましい場合がある。そのような自家細胞の使
用は、細胞をレシピエントに適合させる必要性を取り除く。或いは、WiCell（商標）(WiC
ell Research Institute, Inc, Wisconsin, US)から入手可能なものなどの市販のiPSCが
使用され得る。或いは、該細胞は、自己でもあり得るか又は提供され得る組織特異的幹細
胞であり得る。適切な細胞には、胚盤葉上層幹細胞、誘導された神経幹細胞及び他の組織
特異的幹細胞が含まれる。
特定の実施態様において、使用される細胞は、胚性幹細胞又は幹細胞株であることが好
ましい場合がある。多数の胚性幹細胞株が今や利用可能であり、例えば、WA01(H1)及びWA
09(H9)は、WiCellから入手することができ、KhES-1、KhES-2、及びKhES-3は、京都大学再
生医科学研究所(Kyoto, Japan)から入手することができる。
そのような技術は容易に利用可能であるので、胚性幹細胞は、特に、細胞がヒトである
場合に、胚を破壊することなく導出されることが好ましい場合がある(Chung, Youngらの
文献, Cell Stem Cell,2巻, Issue 2,113-117)。胚を破壊せずに導出された幹細胞株も利
用可能である。一態様において、本発明は、ヒト胚の破壊を伴う方法までは及ばない。
本発明の好ましい態様は、多能性幹細胞の成熟細胞型へのフォワードプログラミングで
ある。したがって、本発明の方法は、多能性幹細胞からの成熟細胞型の製造に使用するこ
とができる。前述のとおり、本発明のこの態様において、第2のGSHへの挿入用の誘導カセ
ットは、好ましくは、1以上のマスター調節因子である。これらの誘導カセットは、細胞
が特定の系統にプログラムされるのを可能にし得、異なる誘導カセットが、成熟細胞型へ
の分化を指示するために使用される。神経細胞、筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、上皮細胞、
分泌細胞、及び/又は血液細胞を含むが、これらに限定されない成熟細胞のいずれかの種
類が企図される。
本出願の発明者らは、実質的に任意の成熟細胞型を作製するための迅速で、効率的かつ
スケーラブルな方法を開発した。そのような単純で、安価な方法は、再生医療のための特
定の価値を有する。以前のフォワードプログラミング技術はTet-Onシステムを利用するが
、1つのベクター/部位に全ての物質を含める試み（オールインワンのTet-On）、又は該誘
導カセットを1つのAAVS1対立遺伝子に挿入し、制御システムを他のAAVS1対立遺伝子に挿
入する試みがなされた(DeKelverらの文献, 2010, Genome Res., 20, 1133-43及びQianら
の文献, 2014, Stem Cells, 32, 1230-8)。驚くべきことに、開発し、本明細書に記載し
た二重GSH標的化方法は、多くの予期せぬ利点を有する。第1のGSHに挿入される遺伝子と
第2のGSHに挿入される誘導カセットの遺伝子配列との間に電位プロモーター干渉は存在し
ない。第2に、各部位に挿入される必要がある物質が少ないため、ベクターからのより大
きなカーゴの挿入を可能にする。第3に、本方法は、安全に挿入されるコピー数を最大化
する。第4に、本方法は、より高い設計の柔軟性を可能にする。最後に、本方法は、レポ
ーター遺伝子及びmiRNAスイッチを含むさらなる遺伝物質が挿入されるのを可能にする。
本発明の方法は、多能性細胞から成熟細胞を製造するロバストで効率的な方法であること
が実証されている。
遺伝子が第1のGSHに挿入され、導入遺伝子を含む誘導カセットが第2のGSHに挿入される
と、多能性幹細胞は、フォワードプログラミングが起こるのを可能にするために培養され
得る。これらの培養条件は、使用される多能性幹細胞の種類に特異的であり得るか、又は
最終的な成熟細胞型に依存し得る。どんな培養条件が使用されても、外因性物質は、該誘
導カセット内の遺伝子配列の発現を制御し、転写を誘導するために連続的に供給され、そ
の後除去されるか、又は前述のように、その作用様式に依存して、転写が必要とされる時
に供給され得る。
目的が幹細胞をプログラムすることである場合、マスター調節因子をコードする誘導カ
セットの供給と共に分化を補助するために、その細胞に細部外刺激を提供することは有利
であり得る。細胞再プログラミング戦略は、細胞外シグナル伝達の合図とマスター調節因
子又は転写因子の過剰発現を組み合わせることにより向上させることができる。したがっ
て、その特定の成熟細胞型の発達に関与する主要なシグナル伝達カスケードを調節するこ
とによって、分化促進因子の系統的なスクリーニングを行うことが可能であり得る。これ
の例は、実施例3に示されている。
一態様において、本発明は、多能性幹細胞からの筋細胞の生成方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
工程；及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への、誘導プロモーターに作動可能に連結されたMYOD
1遺伝子の標的化挿入の工程であって、前記誘導プロモーターが該転写調節タンパク質に
よって調節される、前記工程、
を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なり、
レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法を提供する。
MYOD1遺伝子は、筋形成分化1タンパク質コード遺伝子である。好ましくは、レチノイン
酸（RA）は、オールトランスRAである。
別の態様において、本発明は、MYOD1を発現する多能性幹細胞からの筋細胞の生成方法
であって、レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法を提供する
。
好ましくは、RAはオールトランスRAである。好ましくは、該細胞はMYOD1を過剰発現し
ている。
さらなる態様において、本発明は、多能性幹細胞からのオリゴデンドロサイト筋細胞の
生成方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
工程；及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への、誘導プロモーターに作動可能に連結されたSOX
10遺伝子の標的化挿入の工程であって、前記誘導プロモーターが該転写調節タンパク質に
よって調節される、前記工程、
を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なり、
レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法を提供する。
このために使用される細胞は、動物又はヒト細胞であり得る。該細胞が動物である場合
、該動物は以前に定義した家畜動物であることが好ましい。
SOX 10遺伝子は転写因子SOX 10をコードする。好ましくは、レチノイン酸（RA）はオー
ルトランスRAである。
本発明の方法において使用される細胞は多能性であり、得られた細胞は、マスター調節
因子の発現により、系統制限された特異的幹細胞、前駆細胞、又は所望の特性を有する成
熟細胞型であり得る。これらの系統特異的幹細胞、前駆細胞又は成熟細胞は、任意の適切
な様式で使用され得る。例えば、該成熟細胞は、細胞型に応じて、ヒト又は動物の体内へ
の移植のために直接使用され得る。或いは、該細胞は、遺伝子発現に対する薬剤の効果及
び特定の遺伝子と薬剤の相互作用を含む研究のための試験材料となり得る。研究用の細胞
は、その遺伝子配列の制御可能な発現を調べるために、機能未知の遺伝子配列を有する誘
導カセットの使用を伴うことができる。さらに、それは、成長因子又はサイトカインなど
の望ましい材料を大量に生成するために該細胞が使用されるのを可能にし得る。
異なる態様において、該細胞は、組織工学で使用され得る。組織工学は、ヒト若しくは
動物の組織又は臓器全体でさえ置換するのに使用できる組織の作製を必要とする。組織工
学の方法は、当業者に知られているが、組織/臓器を作製するために細胞が適用される足
場（細胞外マトリックス）の使用を含む。これらの方法は、「人工の」気管、膀胱、肝臓
、膵臓、胃、腸、血管、心臓組織、骨、骨髄、粘膜組織、神経、筋肉、皮膚、腎臓又は任
意の他の組織若しくは臓器を作製するために使用することができる。組織を作製する方法
は、別の方法として、組織を作るために細胞を直接印刷することを伴い得る三次元（3D）
印刷として知られている積層造形を含んでもよい。したがって、本発明は、本発明の任意
の態様に記載するように、生成された細胞を用いて組織を作製する方法を提供する。
本発明の方法にしたがって作られた細胞を用いて作製された組織は、ヒト又は動物の体
内への移植のために使用され得る。或いは、該細胞が動物由来である場合、該組織は、イ
ンビトロ/培養肉に使用され得る。培養肉の主要な細胞型は筋細胞である。しかしながら
、そのような組織は、本発明の方法にしたがって作られた細胞型の組み合わせの使用を伴
い得る。これらは、筋細胞（筋肉の細胞）、血管細胞、血液細胞及び脂肪細胞（脂肪の細
胞）であり得る。改変組織の目的が培養肉のためのものである場合、該細胞は、家畜動物
から採取され得る。
本発明の方法はまた、研究、遺伝子ワクチンを含む遺伝子治療、インビトロ疾患モデル
の生成及び非ヒトインビボモデルの生成を含む様々な理由のために、多能性幹細胞ではな
い細胞にて行われてもよい。
したがって、本発明の方法で使用される細胞は、成体幹細胞の任意の種類であり得る。
これらは、多くではあるが、全てではない細胞型に発達することができる未分化細胞であ
る。成体幹細胞は、分裂して、死細胞を補い、損傷した組織を再生する体全体に見られる
未分化細胞である。体性幹細胞としても知られているように、それらは多能性ではない。
成体幹細胞は、脳、骨髄、末梢血、血管、骨格筋、皮膚、歯、心臓、腸、肝臓、卵巣上皮
、及び精巣を含む、多くの臓器及び組織で特定されている。体性幹細胞の細胞を標識する
ために、当業者は、単一の成体幹細胞が、組織の全ての適切な分化細胞型を生じさせる遺
伝的に同一の細胞株を作製することができることを実証しなければならない。推定成体幹
細胞が実際に幹細胞であることを実験的に確認するために、該細胞が、培養物中にこれら
の遺伝的に同一の細胞を生じさせるか、又はこれらの細胞の精製された集団が、動物への
移植後に組織を再配置しなければならない。適切な細胞型には、神経、間葉及び内胚葉の
幹細胞及び前駆細胞が含まれるが、これらに限定されない。
或いは、使用される細胞は成熟細胞型であり得る。そのような細胞は、分化及び特殊化
しており、異なる細胞型に発達することはできない。成熟細胞型には、神経細胞、筋細胞
、骨細胞、軟骨細胞、上皮細胞、分泌細胞、及び/又は血液細胞が含まれるが、これらに
限定されない。成熟細胞型は、ヒト又は動物の身体由来の任意の細胞であり得る。
体性幹細胞及び成熟細胞型は、本発明にしたがって改変され、次いで、遺伝子治療又は
遺伝子ワクチン接種などの適用に使用され得る。遺伝子治療は、治療目的での細胞核への
外来DNAの意図的な挿入として定義され得る。そのような定義には、欠陥遺伝子の野生型
バージョンを提供するための細胞への遺伝子又は複数の遺伝子の提供、標的遺伝子の発現
に干渉するRNA分子の遺伝子の添加（欠陥であり得る）、自殺遺伝子(無害なプロドラッグ
のガンシクロビル（GCV）を細胞傷害性薬剤に変換する酵素の単純ヘルペスウイルスチミ
ジンキナーゼ（HSV-tk）及びシトシンデアミナーゼ（CD）など)、免疫又は癌治療のため
のDNAワクチン（養子免疫療法を含む）の提供及び治療目的のための細胞への任意の他の
遺伝子の提供が含まれる。
典型的には、本発明の方法は、特に、DNAワクチンにおいて、細胞内での転写、好まし
くは、発現のための所望の遺伝子配列の挿入に使用され得る。DNAワクチンは、典型的に
は、感染性生物のDNAの改変型をコードする。DNAワクチンは、感染性生物の選択されたタ
ンパク質を発現する対象に投与され、典型的には保護的であるタンパク質に対して免疫応
答を開始させる。DNAワクチンはまた、癌免疫療法のアプローチにおいて腫瘍抗原をコー
ドし得る。
DNAワクチンは、、癌、アレルギー、毒性、並びに、限定されないが、真菌、ヒトパピ
ローマウイルス（HPV）、HIV、HSV2/HSV1、インフルエンザウイルス（A、B及びC型）、ポ
リオウイルス、RSVウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、A型肝炎ウイルス、麻疹ウ
イルス、パラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、サイ
トメガロウイルス、エプスタイン-バーウイルス、アデノウイルス、風疹ウイルス、ヒトT
細胞リンパ腫のI型ウイルス（HTLV-I）、B型肝炎ウイルス（HBV）、C型肝炎ウイルス（HC
V）、D型肝炎ウイルス、ポックスウイルス、ジカウイルス、マールブルグ及びエボラを含
むウイルス;髄膜炎菌、ヘモフィルス・インフルエンザ（b型）を含む細菌;及び寄生性病
原体などの病原体による感染症を含むが、これらに限定されないいくつかの病態の治療又
は予防のための抗原をコードする核酸配列を含み得る。DNAワクチンは、任意の適切な病
原体由来の抗原をコードする核酸配列を含み得る。該抗原は、ヒト又は動物の疾患に関与
する病原体に由来し、特に、ウイルス病原体に由来し得る。
GSHに挿入されたDNAワクチンはまた、腫瘍抗原をコードする核酸配列を含んでよい。腫
瘍関連抗原の例には、MAGEファミリーのメンバー(MAGE 1、2、3など)、NY-ESO-I及びSSX-
2などの癌抗原、チロシナーゼ、gplOO、PSA、Her-2及びCEAなどの分化抗原、変異自己抗
原並びに発癌性HPV型由来のE6及び/又はE7などのウイルス腫瘍抗原が含まれるが、これら
に限定されない。特定の腫瘍抗原のさらなる例には、MART-I、Melan-A、p97、beta-HCG、
GaINAc、MAGE-I、MAGE-2、MAGE-4、MAGE-12、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC18、CEA、DDC
、PlA、EpCam、メラノーマ抗原gp75、Hker 8、高分子量黒色腫抗原、Kl 9、Tyrl、Tyr2、
pMel 17遺伝子ファミリーのメンバー、c-Met、PSM（前立腺ムチン抗原）、PSMA（前立腺
特異的膜抗原）、前立腺分泌タンパク質、α-フェトプロテイン、CA 125、CA 19.9、TAG-
72、BRCA-I及びBRCA-2抗原が含まれる。
挿入された遺伝子配列は、治療用DNA分子の他の種類を生成し得る。例えば、そのよう
なDNA分子は、対象がその遺伝子の機能不全バージョンによって引き起こされる遺伝性疾
患を有する機能的遺伝子を発現するために使用することができる。そのような疾患の例に
は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、及びアデノシンデア
ミナーゼ（ADA）欠損症が含まれる。遺伝子治療が有用であり得る他の疾患には、AIDS、
癌、神経疾患、心血管疾患、高コレステロール血症、様々な貧血、サラセミア及び血友病
、及び肺気腫を含む様々な血液疾患などの疾患を含む、炎症性疾患、自己免疫疾患、慢性
疾患及び感染性疾患が含まれる。固形腫瘍の治療については、毒性ペプチド（すなわち、
リシン、ジフテリア毒素及びコブラ毒因子などの化学療法剤）をコードする遺伝子、p53
などの腫瘍抑制遺伝子、形質転換癌遺伝子に対するアンチセンスであるmRNA配列をコード
する遺伝子、腫瘍壊死因子（TNF）及び他のサイトカインなどの抗腫瘍ペプチド、又は形
質転換癌遺伝子のトランスドミナントネガティブ変異体が発現し得る。
他の種類の治療用DNA分子も企図される。例えば、活性のあるノンコーディングRNA型に
転写されるDNA分子、例えば、低分子干渉RNA（siRNA）が挿入され得る。したがって、本
発明の方法は、内因性遺伝子の発現をノックダウンするか又は誘導カセット内のノンコー
ディングRNAを用いて内因性遺伝子をノックアウトする方法に及ぶ。
したがって、本発明の方法は、制御可能に転写され得る誘導カセット内に特異的かつ安
定的に遺伝子配列を挿入するために使用され得る。これは、体性幹細胞及び成熟細胞型に
おける多数の利点を有する。それは、重要な遺伝子が破壊されないことを確実にし、副作
用が発生した場合に誘導カセットの発現を止めることが可能であるより厳密に制御された
遺伝子治療アプローチを可能にする。それはまた、遺伝子機能及び発達を調べるために、
緊密に調整された内因性遺伝子のノックダウン又はノックアウトを可能にする。
本発明は、本発明の方法により生成される細胞に及ぶ。該細胞は、転写調節タンパク質
を含むための第1のゲノムセーフハーバー部位及び該転写調節タンパク質によって調節さ
れる誘導プロモーターに作動可能に連結された遺伝子配列を含むための第2の遺伝子セー
フハーバー部位で改変されると定義され得る。2つのGSHは、異なり、別々のものである。
好ましくは、該細胞は、両方の挿入部位でホモ接合性である。全てのエレメントは前述の
とおりである。
本発明の方法のいずれかにしたがって生成される細胞は、診断方法及び治療方法で適用
される。該細胞は、細胞の発達を研究し、新薬のための試験システムを提供し、スクリー
ニング方法の開発を可能にし、治療計画を精査し、診断テストを提供するなどのためにイ
ンビトロで使用され得る。これらの使用は、本発明の一部を成す。或いは、該細胞は、診
断目的又は治療目的のために、ヒト又は動物の患者に移植され得る。治療中の細胞の使用
も本発明に含まれる。該細胞は、同種異系（すなわち、除去され、改変され、同じ個体に
戻される成熟細胞）又は（幹細胞株を含む）ドナーに由来し得る。
本明細書で言及する全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列
AAVS1 - NCBI GenBank S51329.1
配列番号1：Tet02 19n配列
配列番号2：hROSA挿入部位ゲノム配列
配列番号3：STDtetR-nls(ヌクレオチド)及び配列番号4- STDtetR-nls(アミノ酸)
配列番号5：OPTtetR-nls(ヌクレオチド)及び配列番号6- OPTtetR-nls(アミノ酸)
配列番号7～80：表3からのプライマー
配列番号81：図18B AAVS1 FWD;配列番号82:図18B AAVS1 REV
配列番号83：図18B トレーサーFWD;配列番号84:図18B トレーサーREV
配列番号85：図19E HI POL3 FWD;配列番号82:図19E HI POL3 REV
これは、hROSA26挿入部位のゲノム配列である。それは、5'相同性アーム、切断部位（
太字）、及び3' 相同性アームを含む:（配列番号2）。
Figure 2023134465000003
STDtetR-nls(配列番号3及び4)
N末端SV40核局在化シグナル（nls、灰色で強調した）を含有するテトラサイクリン感受
性抑制タンパク質（tetR）のヌクレオチド配列及びアミノ酸配列。コドン最適化前又は後
のいずれかの配列を報告する(それぞれSTDtetR及びOPTtetR)。ドットは、OPTtetRに導入
された同義変異を示す。
Figure 2023134465000004
最適化されたtetR: OPTtetR-nls(配列番号5及び6)の配列
Figure 2023134465000005
本発明を、これから、以下の非限定的な実施例に関連して説明する。
実施例
実施例で使用した材料及び方法:
hPSCの維持培養及び胚葉分化
フィーダーも、血清も含まないhESC（H9株;WiCell）及びhiPSC（Cheungらの文献, Nat.
Biotechnol. 30, 165-173 (2012)）の培養を行った。簡単に説明すると、細胞を、ゼラ
チン/MEF培地コーティング培養皿上に播種した[MEF-培地は、アドバンストDMEM/F12（90
％, Gibco）、ウシ胎児血清（10％, Gibco）、L-グルタミン（1mM, Gibco）、2-メルカプ
トエタノール(0.1mM, Sigma-Aldrich)及びペニシリン/ストレプトマイシン（1％, Gibco
）からなっていた]、10ng/mlのアクチビンA及び12ng/mlのFGF2を補充した、化学的に定義
された培地[CDM、IMDM(50%, Gibco)、F12(50%, Gibco)、濃縮脂質（100倍, Gibco)、モノ
チオグリセロール（450μM, Sigma-Aldrich）、インスリン（7μg/ml, Roche)、トランス
フェリン(15μg/ml, Roche)、ウシ血清アルブミンフラクションV（5mg/ml）、及びペニシ
リン/ストレプトマイシン（1％）]中で培養した。細胞を、5～6日ごとにコラゲナーゼを
使用して小さな塊で継代した。
内胚葉、側板中胚葉、及び神経外胚葉のための、以前に公開された指向分化プロトコル
に従って、hPSCの胚葉への分化を接着hESC培養物中で誘導した(Touboul, T.らの文献, He
patology 51, 1754-1765 (2010), Cheungらの文献,(2012)及びDouvaras, P.らの文献, St
em Cell Reports 3, 250-259 (2014))。簡単に説明すると、胚体内胚葉は、FGF2(20ng/ml
)、アクチビンA(100ng/ml)、BMP4(10ng/ml、Marko Hyvonen、ケンブリッジ大学生化学科(
Dept. of Biochemistry, University of Cambridge)、及びLY-294002(10μM, Promega)を
補充したCDM-PVA(インスリンなし)中で3日間、hPSCを培養することによって得た。3.神経
外胚葉の誘導のために、SB-431542(10μM, Tocris)、LDN-193189(0.1μM, Tocris)及びRA
(0.1μM, Sigma)を補充したCDM-BSA中で、hPSCを6日間培養した。4.側板中胚葉を、FGF2(
20ng/ml)、10ng/mlのBMP4(R&D)、及びLY294002(10μM)を補充したCDMPVA中でhPSCを36時
間培養し、その3.5日後に、FGF2(20ng/ml)及びBMP4(50ng/ml)を補充したCDM-PVA中で培養
することにより得た。
hESCの分化
分化を、継代後48時間の時点で、hESCの接着培養物中で開始した。培地交換は、一般的
に毎日行い、細胞密度に対して量を調整した。成熟細胞型を、当技術分野で以前に記載さ
れた方法を用いて得た。得られた成熟細胞型には、神経細胞、骨細胞、軟骨細胞、平滑筋
、心臓線維芽細胞、心筋細胞、腸、膵臓、肝細胞、胆管又は肺が含まれた。
遺伝子標的化構築物及び分子クローニング
hROSA26 gRNA及びCas9n発現プラスミドの設計並びに構築は、本明細書:hROSA26遺伝子
座を特異的に標的化し、相同組換えを用いた誘導カセットを挿入するためのCRISPR/Cas9n
に基づく戦略に記載されている。正しい組込み部位でゲノムDSBを誘導するために、CRISP
R/Cas9ニッカーゼシステムを設計した。単一gRNAによってそのゲノム標的部位へ導かれる
一般的に使用される野生型Cas9ヌクレアーゼとは対照的に、D10A変異体Cas9ニッカーゼ（
Cas9n）は、適切に設計されたgRNAの対によって、標的DNAの両方の鎖上で一本鎖切断を同
時に導入するように指示される。この戦略は、ゲノム編集に必要な塩基の数を効果的に倍
増することにより、特異性を増加させる。ウェブベースのソフトウェア「CRISPR設計ツー
ル」を用いて、組込み部位に近いcrRNA誘導性ヌクレアーゼのための潜在的な標的部位を
定義した。標的部位の周囲の250 bpの配列ストレッチ（実際の組込み部位の各部位上で12
5 bp）内に、トップヒットは、標的化効果が予測されない97の「高品質」スコアに集合的
に達したgRNAの対であった。gRNA
Figure 2023134465000006
 （括弧内はPAM部位）を、新規で合成し、発現ベクターにライゲーションした。最終的な
プラスミドは、それぞれ2つのgRNAのいずれか、及びCas9n D10A変異体をコードする（図2
0及び21）。
Cas9n誘導性DSBの相同性指向修復を促進するための鋳型DNAとして機能するドナープラ
スミドを構築した。2つのhROSA26相同性アームを、高忠実度PCR増幅によって作製した。H
9 hESCから単離したゲノムDNAは鋳型として機能した。5'及び3'相同性アームは、それぞ
れ、長さが904bp及び869bpであった。両方を、その後、pUC19ベクターのマルチクローニ
ング部位に挿入した。hROSA26遺伝子座を標的化するために、細胞をプラスミドの2つのgR
NA/Cas9n構築物及びEGFPドナープラスミドでトランスフェクトした（図22）。
pR26_CAG-rtTA標的化ベクター（図23）を、第3世代のrtTA(pLVX-Tet3GからPCR増幅した
)のコード配列をpR26_CAG-EGFPのBamHI/MluI部位にクローニングし、したがって、EGFP配
列を置換することによって構築した。AAVS1 ZFN発現プラスミドは、Kosuke Yusa博士(Wel
lcome-Trust Sanger Institute)の寛大な贈り物であった。誘導性EGFP AAVS1標的化ベク
ターは、Gibson Assembly (New England Biolabs)によって構築され、その中で3つの挿入
物は、pUC19ベクター(Thermo Fisher Scientific)のマルチクローニング部位のEcoRI/Hin
dIII部位にライゲーションされていた。第1の挿入物は、上流にAAVS1相同性アーム、スプ
ライスアクセプター、T2A部位及びピューロマイシン耐性カセット（Rudolf Jaenischによ
って預けられたpTRE-EGFP; addgene 22074からPCR増幅した）を含んでいた。第2の挿入物
は、誘導性TRE3Gプロモーター（pLVX-TRE3GからPCR増幅した）を含有していた。第3の挿
入物は、EGFP発現カセット及びAAVS1下流相同性アーム（Rudolf Jaenischによって預けら
れたpTRE-EGFP; addgene 22074からPCR増幅した）を含んでいた。得られたプラスミドを
、pAAV_TRE-EGFPと名付けた（図32）。NGN2及びMYOD1コード配列それぞれ(NGN2: Oliver
Brustleからの贈り物のpLVX-TRE-NGN2からPCR増幅した;MYOD1: 市販のcDNAプラスミド(Op
en Biosystems MHS6278-202832821, Accession: BC064493, Clone ID: 5022419)からPCR
増幅した)を、pAAV_TRE-EGFPのSpeI/EcoRI部位にクローニングし、したがって、EGFP配列
を置換することによってpAAV_TRE-NGN2及びpAAV_TRE-MYOD1（図33）標的化ベクターを構
築した。
さらなるプラスミドを同様の方法を用いて作製し、使用した全てのプラスミドを図20～
33に示す。これらのプラスミドは、作製するか、又は寛大に寄贈されたものであった。実
施例で使用したプラスミドには、（図20～33の順序で）、pSpCas9n(BB),_R26-R, pSpCas
9n(BB)（これら2つのプラスミドの組み合わせは、3番染色体上のTHUMPDS3-AS1（ROSA26遺
伝子座）のエキソン1とエキソン2の間のイントロンにおいて特異的な二本鎖切断を誘導す
ることが予測される）、R26-L pR26_CAG_EGFP、pR26_CAG_rtTA、pZFN-AAVS1-L-ELD(ジン
クフィンガーヌクレアーゼ左)、pZFN-AAVS1-R-KKR(ジンクフィンガーヌクレアーゼ右)、p
AAV_CAG_EGFP(ドナー)、pR26-Neo_CAG-OPTtetR(コドン最適化tetRのhROSA26標的化)、pAA
V-Puro_iKD（誘導性shRNAのAAVS1標的化）、pAAV-Neo_CAG-Cas9(Cas9のAAVS1標的化)、pA
AV-Puro_siKO(誘導性gRNAのAAVS1標的化)、pAAV-Puro_siKO-2TO(誘導性gRNAのAAVS1標的
化、プロモーター内に2つのtetオペロンを有するバージョン)、pAAV_TRE-EGFP (EGFP誘導
性過剰発現、付属)及びpAAV_TRE-MYOD1（筋肉用のMYOD1誘導性過剰発現）が含まれる。
遺伝子標的化
遺伝子のノックダウン及びノックアウトのためのhROSA26遺伝子座並びにAAVS1の標的化
をヌクレオフェクションにより行った。ヒト多能性幹細胞（PSC）を、TrypLEセレクト(Gi
bco)を用いて単一細胞に解離し、2×106個の細胞を、ロンザP3初代細胞4Dヌクレオフェク
ターXキット(Lonza P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit)及びLonza 4Dヌクレオフェ
クターシステム(Nucleofector System)のサイクルCA-137を用いてヌクレオフェクトした
（100μl反応量;合計12μgのDNA、これを2つのgRNA/Cas9nプラスミド及び標的化ベクター
に等しく分け与えた）。ヌクレオフェクトしたhPSCを、照射した多剤耐性（DR4）マウス
胚線維芽細胞上に播種し、FGF2（4ng/ml、ケンブリッジ大学生化学科）を補充したKSR培
地[アドバンストDMEM/F12（80％）、ノックアウト血清代替物（20％, Gibco）、L-グルタ
ミン（1mM）、2-メルカプトエタノール（0.1mM）及びペニシリン/ストレプトマイシン（1
％）からなる]中で培養した。Y-27632(5μM, Tocris)を、ヌクレオフェクション前後24時
間添加し、細胞の生存を促進した。3～6日後、ネオマイシン耐性hPSCを、7～10日間、G41
8（50μg/ml、Sigma-Aldrich）を添加することにより選択した。その後、個々のクローン
を採取し、フィーダーを含まない条件で増殖させ、最終的に遺伝子型解析により分析した
。
AAVS1遺伝子座の標的化も、リポフェクションにより行った。ヒトPSCを、6ウェルプレ
ート中で、フィーダーを含まない条件で播種し、継代後48時間の時点でトランスフェクト
した。トランスフェクションを、リポフェクタミン2000(10μl/ウェル, Thermo Fisher S
cientific)を補充したOpti-MEM (Gibco)中で、合計4μgのDNA（2つのAAVS1 ZFNプラスミ
ドと標的化ベクターに均等に分け与えた）で24時間行った。3～5日後、耐性hPSCを、5～8
日間、ピューロマイシン（1μg/ml, Sigma-Aldrich）を添加することにより選択した。そ
の後、個々のクローンを採取し、増殖させ、遺伝子型判定により分析した。抗生物質耐性
は、クローン株を選択するために使用することができる。
標的化実験からの薬剤耐性hPSCクローンを、部位特異的誘導カセット組込みを検証する
ためのゲノムPCRによってスクリーニングし、標的対立遺伝子の数を決定し、狙いが外れ
た組込みを除外した。PCRを、LongAmp Taq DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を
用いて行った。表2は、様々なターゲッティングベクターに使用されるプライマーの組み
合わせを報告する。全ての標的化実験の結果を表1にまとめる。核型分析を、標準的なGバ
ンディング技術によって行った（ケンブリッジ大学病院メディカル遺伝サービス(Medical
Genetics Service, Cambridge University Hospitals)）。染色体分析用の標的化ヒトPS
Cを調製するために、細胞を、Y-27632(5μM, Tocris)及びKaryoMAXコルセミド(Colcemid)
(100ng/ml, Gibco)を補充した新鮮な培養培地中で+37℃で、4時間インキュベートした。
その後、細胞を、単一細胞として回収し、洗浄し、ペレット化した。5～10分間、低張0.0
55MのKCl溶液で処理することにより、核の膨張及び染色体の広がりを達成した。最後に、
細胞をメタノール及び氷酢酸で固定した（比3：1）。
OPTiKDのために、AAVS1標的化を、前述のようにリポフェクションにより行った。簡単
に説明すると、全て製造業者の説明書にしたがって、hPSCを、フィーダーを含まない6ウ
ェルプレートに播種し、Opti-MEM培地(Gibco)中リポフェクタミン2000を1ウェル当たり10
μl用いて、細胞継代後48時間の時点で、4μgのDNAで24時間トランスフェクトした（2つ
のAAVS1 ZFNプラスミドと標的化ベクターに均等に分け与えた）。4日後、1μg/mlのピュ
ーロマイシンを培地に添加し、個々のクローンを採取し、選択の7～10日後に増殖させた
。
単一部位OPTiKOについては、AAVS1の標的化をヌクレオフェクションにより行った。全
て製造業者の説明書にしたがって、10μMのY-27632(Tocris)で16時間前処理したhESCを、
Accutase (Gibco)を用いて2～8個の細胞の凝集塊に解離し、2×106個の細胞を、ロンザP3
初代細胞4DヌクレオフェクターXキット及びLonza 4Dヌクレオフェクターシステムのサイ
クルCA-137を用いて、100μl中合計12μgのDNA(2つのZFNプラスミドについては各々4μg
、2つの標的化ベクターについては各々2μg)でヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクト
したhESCを、照射したDR4（ピューロマイシン及びネオマイシン耐性）マウス胚線維芽細
胞のフィーダー層上に播種し、4ng/mlのFGF2及び10μMのY-27632を補充したKSR培地で培
養した（最初の24時間についてはこの最後のみ）。4日後、ピューロマイシン及びネオマ
イシン耐性遺伝子の両方を保有するhPSCコロニーを、25μg/ml-1ジェネティシン（G418硫
酸塩、Gibco）及び0.5μg/ml-1ピューロマイシンで7～10日間選択した。その後、個々の
クローンを採取し、フィーダーを含まない条件で増殖させた。
AAVS1-EGFP、ROSA26-EGFP、ROSA26-STDtetR、ROSA26-OPTtetR、及びROSA26-EGFPd2のhE
SCを、AAVS1 ZFN又はROSA26 CRISPR/Cas9n対(上記の)を有する標的化ベクターのリポフェ
クション（AAVS1遺伝子座）又はヌクレオフェクション（ROSA26遺伝子座）によって作製
した。2μg/ml-1ブラストサイジンS-HCl（Gibco）を、pR26-Bsd_CAG-EGFPd2プラスミドの
ために使用した。ROSA26-rtTA及びAAVS1-TRE-EGFP導入遺伝子を保有する誘導性EGFP過剰
発現hESCの作製については、他の場所に記載されている。簡単に説明すると、細胞を、最
初に、ROSA26 CRISPR/Cas9nプラスミドでpR26-Neo_CAG-rtTAのヌクレオフェクションによ
って、次いで、AAVS1 ZFNプラスミドでpAAVPuro_TRE-EGFPのリポフェクションによって順
次遺伝子標的化した。
遺伝子標的化hPSCクローン株をゲノムPCRによってスクリーニングし、部位特異的な標
的化を確認し、標的化される対立遺伝子の数を決定し、標的化プラスミドの狙いが外れた
組込みを除外した（図16Aを参照されたい）。
誘導カセットの過剰発現
誘導カセット(それぞれ、EGFP、NGN2、MYOD1及びOLIG2-SOX10）の過剰発現を、培地に
ドキシサイクリン水和物（Sigma-Aldrich）を添加することによって誘導した。特に記載
しない限り、ドキシサイクリンを1μg/mlの最終濃度で使用した。ドキシサイクリン含有
培地を、光から保護された状態で、24時間ごとに交換した。EGFP発現細胞を、本明細書で
はOPTi-EGFPと呼び、NGN2を発現するものをOPTi-NGN2と呼び、MYOD1発現細胞をOPTi-MYOD
1と呼び、OLIG2-SOX10発現細胞をOPTi-OLIG2-SOX10と呼ぶ。
誘導性遺伝子ノックアウト及びノックダウン
特に図の説明文又は実施例に記載しない限り、テトラサイクリン塩酸塩（Sigma-Aldric
h）を1μg/mlで使用し、遺伝子ノックダウン又はノックアウトを誘導した。ニューロンの
誘導。多能性OPTi-NGN2細胞を、TrypLEで単一の細胞に解離し、12ウェルプレートの1ウェ
ル当たり75,000個の細胞密度でマトリゲル(35μg/cm2, Scientific Laboratory Supplies
)コーティング皿上に播種した。フォワードプログラミングを、分割後24～48時間の時点
で開始した。特に明記しない限り、グルタマックス（100倍、Gibco）、非必須アミノ酸（
100倍、Gibco）、2-メルカプトエタノール（50μM）、ペニシリン/ストレプトマイシン（
1％）、及びドキシサイクリン（1μg/ml）を補充したDMEM/F12（Gibco）中で誘導を行っ
た。誘導の2日後、培地を、グルタマックス（100倍）、B27（50倍、Gibco）、BDNF（10ng
/ml、Peprotech）、NT3（10ng/ml、R＆D Systems）、ペニシリン/ストレプトマイシン（1
％）、及びドキシサイクリン（1μg/ml）を補充したNeurobasal培地に切り替えた。
骨格筋細胞の誘導
多能性OPTi-MYOD1細胞を、TrypLEで単一細胞に解離し、12ウェルプレートの1ウェルあ
たり100,000個の細胞密度でゼラチン/MEF培地コーティング皿上に播種した。フォワード
プログラミングを、分割後24～48時間の時点で開始した。特に明記しない限り、L-グルタ
ミン（2mM）、2-メルカプトエタノール（50μM）、ペニシリン/ストレプトマイシン（1％
）、インスリン（7μg/ml）、オールトランスレチノイン酸（1μM、Sigma-Aldrich）、及
びドキシサイクリン（1μg/ml）を補充したDMEM（Sigma-Aldrich）中で誘導を行った。誘
導の5日後、培地にCHIR99021(3μM, Tocris)及び熱不活性化ウマ血清（2％、Gibco）を補
充し、成熟を強化した。
オリゴデンドロサイトの誘導
多能性OLIG2-2A-SOX10 OPTi-OX hPSCを、ゼラチン/MEFコーティング培養皿上で、コロ
ニーで増殖させた。誘導開始前に、それらを、一晩、SB及びLDNで処理した。翌日、ドキ
シサイクリン（1μg/ml）及びRA（0.1μM）を補充したCDM中で誘導を開始した。誘導後1
日目に、PDL/ラミニンコーティング培養皿（12ウェルプレートの1ウェルあたり100,000個
の細胞）上の、RA（0.1μM）、PM(1μM)、及びY-27632(5μM)、PDGFaa(20ng/ml, Peprote
ch)、FGF2(5ng/ml)を補充したCDM中で細胞を分割した。翌日、細胞を、グルタマックス（
100倍）、非必須アミノ酸（100倍）、2-メルカプトエタノール（1000倍）、ペニシリン-
ストレプトマイシン（100倍）、N2サプリメント（100倍）、B27サプリメント（50倍）、
インスリン7μg/ml(Marko Hyvonnen)、T3 60ng/ml(Sigma)、ビオチン100ng/ml(Sigma)、d
b-cAMP 1μM(Sigma)を補充したDMEM/F12からなるオリゴデンドロサイト培地に切り替えた
。オリゴデンドロサイト培地に、dox(1μg/ml)、PDGFaa(20ng/ml)、FGF2(5ng/ml)、RA(0.
1μM)及びPM(1μM)を補充した。誘導の7日後に、RA及びPMを除去した。増殖状態で誘導細
胞を維持するために、細胞を、マイトジェンPDGFaa及びFGF2の継続的存在下で4日毎に継
代した（24ウェルプレートの1ウェル当たり75,000個の細胞）。増殖性オリゴデンドロサ
イト前駆体の分化のために、PDGFaa及びFGF2を除去した。ヒト組換えNT3（5ng/μl、R＆D
Systems）を添加し、細胞の生存を高めた。
定量リアルタイムPCR（qPCR）
RNAを、GenElute哺乳類トータルRNAミニプレップキット(GenElute Mammalian Total RN
A Miniprep Kit)及びオンカラムDNAse I消化セット(On-Column DNAse I Digestion Set)
（Sigma-Aldrich社）を用いて抽出した。cDNA合成を、マキシマファーストストランドcDN
A合成キット(Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit) (Thermo Fisher Scientific)を
用いて行った。アプライドバイオシステムズSYBRグリーンPCRマスターミックス(Applied
Biosystems SYBR Green PCR Master Mix)を、qPCRのために使用した。試料を、Applied B
iosystems 7500高速PCR機に流した。全ての試料を技術的重複で分析し、ハウスキーピン
グ遺伝子ポルホビリノゲンデアミナーゼ1（PBGD）に対して正規化した。結果を、ΔΔCt
法を用いて分析した。プライマー配列については表3を参照されたい。
フローサイトメトリー
EGFP発現細胞の分析のために、細胞を37℃で、5～10分、TrypLEセレクト(Gibco)を用い
て回収し、単一細胞懸濁液を得た。PBSでの洗浄後、細胞を、DAPI（10μg/ml）を補充し
た氷冷PBSに再懸濁し、氷上で5分間インキュベートした。細胞を、シアンADPフローサイ
トメーターを用いて分析し、生細胞（DAPI陰性）のEGFP発現のレベルを決定した。染色及
びミオシン重鎖発現の分析のために、細胞を、TrypLEセレクトを用いて（EGFP発現解析に
関して）収集し、PBSで1回洗浄し、固定し、Cytofix/Cytoperm溶液(BD Biosciences)で透
過処理した。その後、細胞を洗浄し、3％ウシ血清アルブミン（BSA）を補充したPerm/洗
浄緩衝液(BD Biosciences)で一晩、+4℃でブロッキングした。PE結合抗MYH抗体（表4）で
の染色を、暗所で、+4℃で、1時間、Perm/洗浄緩衝液中で行った。Perm/洗浄緩衝液で3回
洗浄した後、細胞をシアンADPフローサイトメーターで分析し、MHC発現のレベルを決定し
た。データ解析を、FlowJo（v10）及びグラフパッドプリズム（v6）を用いて行った。
ウェスタンブロット
全細胞タンパク質を、完全プロテアーゼ阻害剤（Roche）を補充したCelLytic M (Sigma
-Aldrich)で抽出し、その後、タンパク質定量キット-ラピッド（Sigma-Aldrich）を用い
ることによって定量した。タンパク質電気泳動を、NuPAGE LDS試料緩衝液及び4～12％のN
uPAGEビス-トリスプレキャストゲル（Invitrogen）を用いて行った。PVDF上へのタンパク
の転写後、膜を、0.05％のTween-20（PBST）、4％ミルクを補充したPBSで、室温で1時間
ブロッキングし、PBST 4％ミルク中で一次抗体と一晩インキュベートした。膜を、PBSTで
洗浄し、PBST 4％ミルク中でHRP結合二次抗体（Sigma-Aldrich）とインキュベートし、Pi
erce ECL2ウェスタンブロッティング基質（Thermo Fisher Scientific）とインキュベー
トし、X線スーパーRXフィルム（Fujifilm）に感光させた。
免疫細胞化学
細胞を室温で、20分間（PBSで希釈した）4％パラホルムアルデヒドで固定し、その後、
PBSで3回洗浄した。次いで、細胞を、10％ロバ血清（Sigma-Aldrich）でブロッキングし
、室温で、20分間（PBSで希釈した）0.3％トリトンX-100で透過処理した。その後、細胞
を4℃で一晩、2％ロバ血清及び0.1％トリトンX-100（PBSで希釈した）中で適切に希釈し
た一次抗体とインキュベートした（補足的な実験手順）。表面抗原PDGFRA、A2B5、及びO4
を染色する場合、全ての工程でトリトンXを取り除いた。PBSで3回洗浄した後、1％ロバ血
清を補充したPBS中の対応するロバフルオロフォア結合二次抗体(Alexa Fluor 488、555、
568、及び/又は647)で、細胞を室温で1時間インキュベートした。核を、4',6-ジアミジノ
-2-フェニルインドール（DAPI、Thermo Fisher Scientific）を用いて可視化した。EGFP
発現及び免疫染色を、Zeiss LSM 700共焦点顕微鏡（Leica）を用いて画像化した。βIII
チューブリン陽性細胞の割合を、反転オリンパスIX71蛍光顕微鏡(inverted Olympus IX71
fluorescence microscope)を用いて、3つの生物学的反復の3つの視野内の少なくとも50
個のランダムに選択されたDAPI陽性細胞内のβIIIチューブリン発現を決定することによ
り算出した。
統計分析を、グラフパッドプリズム（v6）を用いて行った。反復の数、使用した統計的
検定、及び試験結果は、図の説明文に記載されている。特に明記しない限り、データは平
均値±SEMとして提示されている。
実施例1：EGFPの二重標的化
hPSCにおける誘導性過剰発現プラットフォームを開発するために、発明者らは、2つの
異なるGSHにTet-ONシステムの2つの成分を順番に標的化した。構成的に発現する第3世代
のrtTAを、CRISPR/Cas9nベースの標的化戦略を使用してヒトROSA26（hROSA26）遺伝子座
に標的化し、誘導性EGFP誘導カセットをAAVS1に挿入した（図1a;図4a～c）。hROSA26とAA
VS1の両方の標的化は、非常に効率的であり（図4d～f、表1）、hPSCゲノム安定性、自己
再生、及び分化（データ示さず）に影響を及ぼさず、したがって、rtTA依存性細胞毒性に
対して相反しなかった。
次に、発明者らは、2つの誘導カセットの各々の1又は2コピーのいずれかを保有する二
重GSH標的化クローンを選択した（図5a）。rtTAのホモ接合標的化は、約2倍より高いレベ
ルのrtTAタンパク質をもたらし（図5b）、また、ヘテロ接合rtTA発現と比較して、誘導後
にEGFPレベルを大幅に増加させた（図5c～5e）。さらに、誘導性EGFPカセットのホモ接合
標的化を有するクローンは、ヘテロ接合標的化を有する株と比較してより高く、より均一
なEGFPレベルを示した（図5c～5e）。重要なことに、全ての正しく標的化された株がロバ
ストな誘導性EGFP発現を示し、強力な構成的CAGプロモーターと比較して少なくとも20倍
高かった（図1b、図5c～e）。まとめると、これらの結果は、Tet-ONシステムの両方のエ
レメントの2コピーの標的化は、誘導後に最大発現をもたらすという発明者らの最初の仮
説を支持する。EGFPレベルのピークは、誘導後約4日目に達し、ドキシサイクリンの除去
時に、発現は素早く逆転した（図1c）。また、EGFP発現は、ドキシサイクリンの用量を調
節することにより滴定することができる（図1d）。重要なことに、誘導性EGFP発現は、hP
SCにおいて非常に効率的であるだけでなく、胚葉への分化の間も非常に効率的であった（
カラー写真データは示さず、図6ａ～6dのデータ）。最後に、第3世代のTet-ONシステムの
既知の厳しい転写制御と一致して、それぞれ、フローサイトメトリー及びqPCRによって同
定されるように、ドキシサイクリンの非存在下で、EGFP mRNA又はタンパク質の検出可能
なバックグラウンド発現はなかった（図1b、図6d）。全体的に、これらの結果から、Tet-
ONシステムの二重GSH標的化は、hPSC及びその誘導体における誘導カセットの最適な発現
のための強力な戦略であることが確立された。
実施例2：hESC及びhiPSCからの興奮性皮質ニューロンの誘導
以前の研究により、これらの細胞が、hPSCにおけるプロニューロンbHLH因子（ASCL1、N
GN2、又はNEUROD1）のいずれかのレンチウイルス過剰発現によって容易に誘導され得るこ
とが示された。したがって、発明者らはOPTi- NGN2 hPSCを作製した（図2a、表1）。NGN2
誘導は、多能性因子の迅速な下方制御（図7）及びニューロン転写プログラムの開始（図2
b）をもたらした。誘導後3日ほどで早くも誘導細胞は神経突起を示した（データは示さず
）。1週間後、全細胞は、ニューロン形態を示し、βIIIチューブリン及びMAP2などの汎神
経マーカータンパク質を発現した（図2c）。定量RT-PCRにより、BRN2及びFOXG1などの典
型的な前脳マーカーの、並びに興奮性皮質ニューロンのアイデンティティを示すGRIA4及
びVGLUT2を含むグルタミン酸作動性ニューロンの強力な誘導が明らかになった（図2b）。
まとめると、これらの結果から、従来のhPSC分化プロトコルと比較してニューロン生成に
おける速度と効率の両方の劇的な改善、並びに分化転換及びレンチウイルスベースのフォ
ワードプログラミング・プロトコルの両方に関して効率及び純度の実質的な上昇が実証さ
れた。同様の結果が、OPTi-NGN2 hiPSCで得られ、この方法のロバスト性が確認された。
最後に、発明者らは、Opti-NGN2 hPSCの延長された培養期間にわたって、神経誘導の効率
においていかなる低下も観察しなかった（25回を超える継代、図2c）。全体的に、発明者
らの結果から、OPTi-NGN2 hPSCは、ニューロンの無制限、拡張性の高い、迅速な、単一工
程の、ウイルスフリーで、ほぼ確定的な作製のための尽きることのない源として使用する
ことができることが実証された。
実施例3：骨格筋細胞の作製
転写因子MYOD1は、様々な体細胞型で過剰発現した場合、筋原性分化転換を誘導するこ
とが知られているが、MYOD1誘導性筋原フォワードプログラミングを受けるhPSCの能力は
、現在議論されている。発明者らは、OPTi-MYOD1 hPSCを作製した（表1）が、ドキシサイ
クリン処理後のMYOD1発現の誘導が、hPSCの骨格筋細胞への変換を促進することが以前に
示唆された幅広い培養条件で、3～5日以内にほぼ完全な細胞死をもたらしたことに気づい
た。細胞の再プログラミング戦略は、細胞外シグナル伝達合図と転写因子の過剰発現を組
み合わせることにより向上させることができることが広く確立されているので、発明者ら
は、原始線条の形成、体節形成、及び筋形成に関与している主要なシグナル伝達カスケー
ドを調節することによって、プロ筋原性因子の系統的なスクリーニングを行った。発明者
らは、MYOD1過剰発現と併せて、全トランスレチノイン酸（RA）の添加により、誘導後5日
までに、ミオゲニン及びミオシン重鎖（MHC）ダブル陽性筋細胞への迅速かつほぼ完全な
変換が生じたことを発見した。RAの効果は、濃度依存性で、RA受容体アイソフォームRAR
α及びRARβを介して媒介され、発達筋形成中のRA受容体の発現パターンと一致した（図8
）。この効果は、MYOD1過剰発現の機構に依存しないと考えられる。誘導された骨格筋細
胞は、典型的な紡錘状の細長い形態を示し、広範な細胞融合を受け、mRNAとタンパク質の
両方のレベルで強い筋形成マーカー発現を示した（図3b、図9a～9c）。ナノモル濃度のア
セチルコリン（ACh）又は選択的ACh受容体アゴニストのカルバコールを添加すると、完全
な筋線維の収縮が生じ、誘導される筋細胞の機能性が実証された。同様の結果が、Opti-M
YOD1 hiPSCで得られた（データは示さず）。重要なことに、筋原性誘導効率は、延長され
た培養期間（50回を超える継代、図3d）にわたって減少せず、したがって、この方法のロ
バスト性及び再現性が実証された。最後に、発明者らは、MYOD1誘導カセットのレベルが
変換効率と正に相関し、ロバストな遺伝子送達の重要性及びレンチウイルス媒介性の再プ
ログラミングアプローチを超えるこの方法の優位性を強調することに気づいた（図10）。
全体的に、OPTi-MYOD1フォワードプログラミング戦略は、hPSCの骨格筋細胞への最新分化
プロトコルよりも約7倍速く、5倍より効率的である。以前のフォワードプログラミング・
プロトコル(Tanaka, A.らの文献、PLoS One 8, e61540 (2013)及びAbujarour, R.らの文
献、Stem Cells Transl. Med. 3, 149-60 (2014))と比較して、それは、より効率的で(95
%超対30～80%)、ランダムに挿入された誘導カセットを含まず、化学的に定義され、完全
に再現可能であり、かつよりスケーラブルである。
これらの知見は、hPSCにおいて誘導カセット発現を制御するこの方法が、ハイスループ
ット及び均一な細胞集団の大規模製造のための尽きることのない源として使用できること
を実証する。誘導の速度及び所望の標的細胞の純度は、現在、他の方法の追随を許さない
。
実施例4：オリゴデンドロサイト前駆体及びオリゴデンドロサイトの作製：
単独で、又はバイシストロン性発現カセットの形態でOLIG2と組み合わせて誘導性SOX 1
0を保有するOPTi-OX hPSC。SOX 10単独で誘導された細胞は、誘導の10日後にオリゴデン
ドロサイト前駆体（OPC）マーカーO4をロバストに発現したが、これらの細胞は、ミエリ
ン発現細胞にさらに分化することができず、徐々に死亡した。これとは対照的に、OLIG2-
SOX10二重過剰発現細胞は、誘導後20日でO4陽性前駆段階から成熟CNP/MBP陽性表現型に容
易に進んだ。また、さらなるマーカータンパク質の発現解析により、マイトジェンPDGFaa
及びFGF2を補充したオリゴデンドロサイト培地中で誘導されたOPTi-OLIG2-SOX10 hPSC(Do
uvarasらの文献、2014)が、高度に増殖性で、PDGFRA、A2B5、及びO4を共発現するOPC様段
階を最初に通過したことが確認された。これらの細胞は、高度に増殖性であり、マイトジ
ェンの存在下で培養することにより、少なくとも3回の継代の間維持することができた（
図12b）。したがって、発明者らは、これらの細胞を、誘導されたOPCに対してi-OPCと命
名した。注目すべきことに、マイトジェンの除去後及びドキシサイクリンの継続的な存在
下で、i-OPCは、ミエリン鞘形成可能である（データは示さず）主要ミエリンタンパク質C
NP、PLP、MAG、MOG及びMBPを発現する成熟オリゴデンドロサイトに約1週間で容易に分化
した（図12c～12d）。まとめると、これらの結果から、本発明は、オリゴデンドロサイト
前駆体及びオリゴデンドロサイトの作製のための新規で、ロバストかつ迅速なhPSCフォワ
ードプログラミング・プロトコルの開発を可能にしたことが実証された。
表1：遺伝子型判定結果のまとめ
Figure 2023134465000007
 （a）不完全な標的化：標的化の証拠なし(5'及び3'-組込みPCRにおけるバンドの欠如並び
に遺伝子座PCRにおけるWTバンドの存在）又は標的化の証拠はあるが5'-又は3'-組込みPCR
の不完全なサイズ
（b）プラスミドのさらなるランダム組込みでの正しい狙い通りの組込み（3'-バックボー
ンPCRのバンド）
（c）正しい狙い通りの組込み（HET、ヘテロ接合;HOM、ホモ接合）
（d）正しい狙い通りの組込み有するクローンの割合（狙いが外れたさらなる組込みを伴
わない）
（e）正しい狙い通りの組込み有するクローンの割合(狙いが外れたさらなる組込みを伴う
か又は伴わない）
*3つの数字は、hESCにおける3つの異なる標的化実験からのものである。
表2：遺伝子型判定PCRに用いたプライマーのリスト
Figure 2023134465000008
表3：定量PCR用のプライマーのリスト
Figure 2023134465000009
Figure 2023134465000010
Figure 2023134465000011
表4：抗体のリスト
Figure 2023134465000012
Figure 2023134465000013
実施例5：TET-ON誘導性ノックダウンシステム
hPSCで最適化された誘導性ノックダウンプラットフォームの開発
発明者らは、EGFP導入遺伝子が誘導性の方法でサイレンシングすることができるhESC株
を作製した（図14B）。そのため、発明者らは、（1）ROSA26遺伝子座へのCAG-tetR発現カ
セット;及び（2）AAVS1遺伝子座へのCAG-EGFP導入遺伝子プラス誘導性EGFP shRNAカセッ
トを標的化した（図14A、B）。テトラサイクリンの非存在下で、より高いレベルのtetRタ
ンパク質を発現させると、より強くshRNA発現が抑制される。このために、発明者らは、
細菌tetR cDNAのマルチパラメータRNA及びコドン最適化を行い、得られたコドン最適化te
tR（OPTtetR）を使用して、新たなEGFP誘導性ノックダウンhESC株を作製した（図14B）。
この改変は、標準配列と比較した場合、tetR発現において10倍の増加を可能にした（STDt
etR;図14D）。さらに、OPTtetRのホモ接合性発現は、shRNAの漏出を完全に防止するのに
十分である一方で、効率的なノックダウン誘導を完全に維持した（図14C）。注目すべき
は、誘導性ノックダウンは、迅速で、可逆的で、かつ用量反応性であった（図14E、F）。
最後に、誘導性hESCは正常な核型を示し（データは示さず）、これらの株を作製するのに
必要なゲノム工学が遺伝的安定性を変更しないことが実証された。
これらの有望な結果に基づいて、発明者らは、さらに、POU5F1/OCT4又はB2Mに対して誘
導性shRNAを保有するhESCを作製することによって、内因性遺伝子との関連で、この方法
を検証した（データは示さず）。注目すべきことに、分析した全ての亜株（各遺伝子につ
いて6種）は、顕著なshRNA漏出なく、ロバストな誘導性ノックダウンを示した。テトラサ
イクリン滴定により、OCT4を部分的又は完全にノックダウンするために最適濃度を特定し
た。予想通り、OCT4の激しい減少は、多能性の喪失並びに神経外胚葉及び胚体内胚葉マー
カーの誘導を特異的にもたらした。同様の結果が、20の追加のOCT4誘導性ノックダウンhE
SC亜株で得られ、この方法のロバスト性及び再現性が確認された。重要なことに、ノック
ダウンが強力かつ厳密に調節されているhESCの作製は、細胞の混合集団における抗生物質
選択の直後に表現型分析を行い、それによって、クローン単離に対して個々のコロニーを
採取する必要性を完全に避けることができるほど十分に効率的であった。全体的に、これ
らの結果から、最適化された誘導性ノックダウンシステムを有するGSHの二重標的化は、h
PSCにおける遺伝子発現を制御するための強力な方法であることが証明される。このアプ
ローチは、本明細書以下では、最適化した誘導性ノックダウンについてOPTiKDと呼ぶ（図
14A）。
実施例6
様々な分化した細胞において遺伝子をノックダウンする能力は、以前の誘導性遺伝子ノ
ックダウン用システムを超えて著しい進歩である。徹底的にこの可能性を試験するために
、発明者らは、三胚葉に分化したhPSCにおいて、並びに13種の完全に分化した細胞型のパ
ネルにおいてEGFP導入遺伝子をノックダウンするOPTiKDプラットフォームの有効性を分析
した（図15A）。両方の方法について、qPCR分析により、試験した全ての系統においてEGF
P転写物の強力かつ誘導性のノックダウンが実証された（図17）。顕微鏡観察は、EGFPタ
ンパク質発現におけるロバストな減少を確認し、フローサイトメトリーは、ほとんどの系
統について70％超のEGFP蛍光の減少を示した（データは示さず）。
実施例7
hPSCにおける最適化した誘導性CRISPR/Cas9ノックアウトプラットフォームの開発
発明者らは、誘導性ノックアウトアプローチを開発することに注意を向けた。現在の誘
導性CRISPR/Cas9方法は、構成的に発現するgRNAの存在下でのCas9の条件付き過剰発現に
依存する。この場合、Cas9過剰発現の制御は、ドキシサイクリン処理後に、テトラサイク
リンに制御される逆トランス活性化因子（rtTA）がPol II依存性テトラサイクリン応答エ
レメント（TRE）プロモーター（複数のTETオペロンと最小CMVプロモーターの融合物）を
活性化するTET-ON方法によって達成される。このTET-ONプラットフォームは、特定のヒト
細胞型に正常に適用されてきたが、発明者らは、この誘導システムが、AAVS1 GSHに標的
化した後でさえ、複数の系統（心筋細胞、肝細胞、及び平滑筋細胞を含む）へのhPSCの分
化中にサイレンシングされることを観察した(データは示さず）。発明者らは、誘導性shR
NA発現用に開発されたものに基づく誘導性gRNAカセットと構成的発現CAGプロモーター促
進Cas9を組み合わせることによって別の改良された方法を開発する可能性を検討した（図
18A、B）。したがって、発明者らは、蛍光レポーター遺伝子が誘導性の方法でノックアウ
トされ得るhESC株を作製した（図18C）。このために、発明者らは、各導入遺伝子が2つの
対立遺伝子の一方に組込まれているAAVS1遺伝子座の中に誘導性EGFP gRNAと構成的Cas9の
両方を有するROSA26-EGFPd2レポーターhESCを標的化した。この二重標的化アプローチは
、迅速で（2週間未満）かつ効率的（両方の導入遺伝子を含有する株の90％超）であった
。注目すべきことに、個々のクローン亜株をテトラサイクリンの存在下で増殖させた場合
に、発明者らは、標的株の全てにおいてEGFPd2発現の低下を観察し、EGFPd2ホモ接合細胞
は、テトラサイクリン誘導後、早ければ5日ほどでレポーター遺伝子の少なくとも1つのコ
ピーのほぼ均質な喪失を示した（EGFPd2蛍光の50％減少によって示されるように）。テト
ラサイクリンでの長期処理は、最大75％のEGFPd2ホモ接合細胞においてEGFPd2蛍光の進行
性の完全喪失をもたらした（データは示さず）。興味深いことに、同じAAVS1遺伝子座か
らの同じEGFP gRNAカセットの2又は3コピーのいずれかの同時発現は、分析した全てのク
ローン亜株において誘導性EGFPd2ノックアウトの速度及び効率を顕著に向上させるのに十
分であった。例えば、同じgRNAの3コピーの同時誘導が、テトラサイクリン処理後に、異
例の95％ノックアウト効率をもたらした。重要なことは、誘導性EGFPd2ノックアウトhESC
は、いくつかのgRNAコピーが使用されても、テトラサイクリンの非存在下での長期培養後
に、EGFPd2陽性細胞の割合も、それらの蛍光も顕著な減少を示さなかった。これから、誘
導性gRNA発現が厳密に制御されたことが実証された。最後に、EGFPd2に対するさらなるgR
NAの試験から、誘導性ノックアウトの速度及び効率が強くgRNAに依存していることが明ら
かになった。実際に、最適な配列は、誘導のわずか2日後に最大90％のノックアウトを可
能にした。注目すべきは、最も効率的なgRNAはまた、制御されないEGFPd2ノックアウトを
もたらしたが、この制限は、さらにストリンジェントな転写制御を確実にするために、誘
導性H1プロモーターに第2のTETオペロンを付加するだけで回避された。まとめると、これ
らの結果は、該ノックダウンシステムは、誘導性gRNA発現を支持し、広範囲のgRNA効力を
上回るRISPR/Cas9のしっかり制御された活性を可能にするように容易に再び目的を持たせ
ることができることを示す。発明者らの知る限り、これは、誘導性gRNA発現に基づく第1
の条件付きCRISPR/Cas9アプローチである。
実施例7
hPSCにおける最適化した誘導性CRISPR/Cas9ノックアウトプラットフォームの開発
発明者らは、誘導性ノックアウトアプローチを開発することに注意を向けた。現在の誘導性CRISPR/Cas9方法は、構成的に発現するgRNAの存在下でのCas9の条件付き過剰発現に依存する。この場合、Cas9過剰発現の制御は、ドキシサイクリン処理後に、テトラサイクリンに制御される逆トランス活性化因子（rtTA）がPol II依存性テトラサイクリン応答エレメント（TRE）プロモーター（複数のTETオペロンと最小CMVプロモーターの融合物）を活性化するTET-ON方法によって達成される。このTET-ONプラットフォームは、特定のヒト細胞型に正常に適用されてきたが、発明者らは、この誘導システムが、AAVS1 GSHに標的化した後でさえ、複数の系統（心筋細胞、肝細胞、及び平滑筋細胞を含む）へのhPSCの分化中にサイレンシングされることを観察した(データは示さず）。発明者らは、誘導性shRNA発現用に開発されたものに基づく誘導性gRNAカセットと構成的発現CAGプロモーター促進Cas9を組み合わせることによって別の改良された方法を開発する可能性を検討した（図18A、B）。したがって、発明者らは、蛍光レポーター遺伝子が誘導性の方法でノックアウトされ得るhESC株を作製した（図18C）。このために、発明者らは、各導入遺伝子が2つの対立遺伝子の一方に組込まれているAAVS1遺伝子座の中に誘導性EGFP gRNAと構成的Cas9の両方を有するROSA26-EGFPd2レポーターhESCを標的化した。この二重標的化アプローチは、迅速で（2週間未満）かつ効率的（両方の導入遺伝子を含有する株の90％超）であった。注目すべきことに、個々のクローン亜株をテトラサイクリンの存在下で増殖させた場合に、発明者らは、標的株の全てにおいてEGFPd2発現の低下を観察し、EGFPd2ホモ接合細胞は、テトラサイクリン誘導後、早ければ5日ほどでレポーター遺伝子の少なくとも1つのコピーのほぼ均質な喪失を示した（EGFPd2蛍光の50％減少によって示されるように）。テトラサイクリンでの長期処理は、最大75％のEGFPd2ホモ接合細胞においてEGFPd2蛍光の進行性の完全喪失をもたらした（データは示さず）。興味深いことに、同じAAVS1遺伝子座からの同じEGFP gRNAカセットの2又は3コピーのいずれかの同時発現は、分析した全てのクローン亜株において誘導性EGFPd2ノックアウトの速度及び効率を顕著に向上させるのに十分であった。例えば、同じgRNAの3コピーの同時誘導が、テトラサイクリン処理後に、異例の95％ノックアウト効率をもたらした。重要なことは、誘導性EGFPd2ノックアウトhESCは、いくつかのgRNAコピーが使用されても、テトラサイクリンの非存在下での長期培養後に、EGFPd2陽性細胞の割合も、それらの蛍光も顕著な減少を示さなかった。これから、誘導性gRNA発現が厳密に制御されたことが実証された。最後に、EGFPd2に対するさらなるgRNAの試験から、誘導性ノックアウトの速度及び効率が強くgRNAに依存していることが明らかになった。実際に、最適な配列は、誘導のわずか2日後に最大90％のノックアウトを可能にした。注目すべきは、最も効率的なgRNAはまた、制御されないEGFPd2ノックアウトをもたらしたが、この制限は、さらにストリンジェントな転写制御を確実にするために、誘導性H1プロモーターに第2のTETオペロンを付加するだけで回避された。まとめると、これらの結果は、該ノックダウンシステムは、誘導性gRNA発現を支持し、広範囲のgRNA効力を上回るRISPR/Cas9のしっかり制御された活性を可能にするように容易に再び目的を持たせることができることを示す。発明者らの知る限り、これは、誘導性gRNA発現に基づく第1の条件付きCRISPR/Cas9アプローチである。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様1）
細胞内で遺伝子配列の転写を制御する方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の工程；及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結された前記遺伝子配列を含み、前記プロモーターが前記転写調節タンパク質によって調節される、前記工程、
を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法。
（態様２）
前記遺伝子配列が導入遺伝子である、態様1記載の方法。
（態様３）
前記遺伝子配列が、ノンコーディングRNAをコードする、態様1記載の方法。
（態様４）
前記転写調節タンパク質の活性が、外部から供給される物質によって制御される、態様1～3のいずれか一項記載の方法。
（態様５）
前記転写調節タンパク質が構成的に発現する、態様1～4のいずれか一項記載の方法。
（態様６）
前記転写調節タンパク質が、テトラサイクリン応答性転写活性化タンパク質（rtTa）、テトラサイクリン抑制因子（TetR）、VgEcR合成受容体又は遺伝子スイッチハイブリッド転写調節タンパク質、及び任意のそれらの誘導体のいずれか1つから選択される、態様1～5のいずれか一項記載の方法。
（態様７）
前記転写調節タンパク質が、rtTA又はそれらの任意の誘導体である、態様1～6のいずれか一項記載の方法。
（態様８）
前記tTAの活性が、テトラサイクリン又はその誘導体、任意に、ドキシサイクリンによって制御される、態様5記載の方法。
（態様９）
前記誘導プロモーターが、Tet応答エレメント（TRE）を含む、態様7又は態様8記載の方法。
（態様1０）
前記第1及び第2のゲノムセーフハーバー部位が、hROSA26遺伝子座、AAVS1遺伝子座、CLYBL遺伝子、CCR5遺伝子又はHPRT遺伝子のいずれか2つから選択される、態様1～9のいずれか一項記載の方法。
（態様11）
第1の遺伝子セーフハーバー部位への前記転写調節タンパク質コード遺伝子の挿入が、前記細胞の両方の染色体で生じ、かつ/又は第2の遺伝子セーフハーバー部位への前記誘導カセットの挿入が前記細胞の両方の染色体上で生じる、態様1～10のいずれか一項記載の方法。
（態様1２）
さらなる遺伝物質が、第1及び/又は第2のゲノムセーフハーバー部位に挿入され、任意に、以下のもの:
a）自殺遺伝子;
b）選択マーカー;
c）レポーター遺伝子;及び/又は
d）ノンコーディングRNAの遺伝子
態様1～11のいずれか一項記載の方法。
（態様1３）
前記方法がエクスビボで行われる、態様1～12のいずれか一項記載の前記方法。
（態様1４）
前記細胞が多能性幹細胞、体性幹細胞又は成熟細胞から選択される、態様1～13のいずれか一項記載の方法。
（態様1５）
前記方法が、定義された成熟細胞への多能性幹細胞のプログラミングのためのものである、態様1又は態様2記載の方法。
（態様1６）
前記細胞が多能性幹細胞であり、前記遺伝子配列が、1以上のマスター調節因子、任意に、転写因子の導入遺伝子である、態様1又は態様2記載の方法。
（態様1７）
前記遺伝子配列の転写が、定義された成熟細胞型への前記細胞のフォワードプログラミングをもたらす、態様16記載の方法。
（態様1８）
前記成熟細胞型が、以下の細胞型:：神経細胞、筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、上皮細胞、分泌細胞、及び/又は血液細胞のいずれか1つから選択される、態様17記載の方法。
（態様1９）
前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（iPSC）又は胚性幹細胞（ESC）から選択される、態様14～18のいずれか一項記載の方法。
（態様２０）
前記細胞がヒトである、態様1～19のいずれか一項記載の方法。
（態様２1）
前記方法が、遺伝子治療の目的のための遺伝子配列の挿入のためであり、任意に、前記遺伝子配列が、野生型タンパク質、改変タンパク質、抗原、酵素、選択マーカー又はノンコーディングRNA分子を含むタンパク質をコードする、態様1記載の方法。
（態様２２）
態様1の方法によって作製される細胞。
（態様２３）
第1遺伝子セーフハーバー部位に挿入される転写調節タンパク質コード遺伝子;及び第2の遺伝子セーフハーバー部位に挿入される誘導プロモーターに作動可能に連結された遺伝子配列を含む誘導カセットを含む改変ゲノムを有する細胞であって、前記誘導プロモーターが、転写調節タンパク質によって調節され、前記第1及び第2の部位が異なる、前記細胞。
（態様２４）
治療における態様22又は態様23記載の細胞の使用。
（態様２５）
インビトロ診断のための、態様22又は23記載の細胞の使用。
（態様２６）
組織工学、任意に、培養肉のための、態様22又は23記載の細胞の使用。
（態様２７）
多能性幹細胞からの筋細胞の生成方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の工程；及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への、誘導プロモーターに作動可能に連結されたMYOD1遺伝子の標的化挿入の工程であって、前記誘導プロモーターが前記転写調節タンパク質によって調節される、前記工程、
を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なり、
レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
（態様２８）
多能性幹細胞からのオリゴデンドロサイトの生成方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の工程;及び
b）誘導プロモーターに作動可能に連結されたSOX 10遺伝子の、第2の遺伝子セーフハーバー部位への標的化挿入の工程であって、前記誘導プロモーターが転写調節タンパク質によって調節される、前記工程
を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なり、
レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
（態様２９）
細胞内で内因性遺伝子の転写及び/又は翻訳を低下させる方法であって、
a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の工程;及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたノンコーディングRNA配列をコードするDNAを含み、前記プロモーターが、転写調節タンパク質によって調節され、前記ノンコーディングRNA配列が、内因性遺伝子の転写又は翻訳を抑制する、前記工程、
を含み、
前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法。
（態様３０）
細胞内の内因性遺伝子をノックアウトする方法であって
a）転写調節タンパク質コード遺伝子及びCas9コード遺伝子の、第1の遺伝子セーフハーバー部位への標的化挿入の工程;及び
b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたガイドRNAを含み、前記プロモーターが前記転写調節タンパク質によって調節され、前記gRNA配列が内因性遺伝子を標的化する、前記工程、
を含み、
前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法。
（態様３１）
さらなる誘導カセット又は導入遺伝子が、前記第1及び第2のGSHと異なるさらなるGSHに挿入される、態様1～21又は27～29のいずれか一項記載の方法。
（態様３２）
配列番号6と80％、85％、90％、95％又は99％の相同性を有する配列を含む最適化tetR配列。
（態様３３）
MYOD1を発現する多能性幹細胞からの筋細胞の生成方法であって、レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。

Claims (33)

  1. 細胞内で遺伝子配列の転写を制御する方法であって、
    a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
    工程；及び
    b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記
    誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結された前記遺伝子配列を含み、前記
    プロモーターが前記転写調節タンパク質によって調節される、前記工程、
    を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法。
  2. 前記遺伝子配列が導入遺伝子である、請求項1記載の方法。
  3. 前記遺伝子配列が、ノンコーディングRNAをコードする、請求項1記載の方法。
  4. 前記転写調節タンパク質の活性が、外部から供給される物質によって制御される、請求
    項1～3のいずれか一項記載の方法。
  5. 前記転写調節タンパク質が構成的に発現する、請求項1～4のいずれか一項記載の方法。
  6. 前記転写調節タンパク質が、テトラサイクリン応答性転写活性化タンパク質（rtTa）、
    テトラサイクリン抑制因子（TetR）、VgEcR合成受容体又は遺伝子スイッチハイブリッド
    転写調節タンパク質、及び任意のそれらの誘導体のいずれか1つから選択される、請求項1
    ～5のいずれか一項記載の方法。
  7. 前記転写調節タンパク質が、rtTA又はそれらの任意の誘導体である、請求項1～6のいず
    れか一項記載の方法。
  8. 前記tTAの活性が、テトラサイクリン又はその誘導体、任意に、ドキシサイクリンによ
    って制御される、請求項5記載の方法。
  9. 前記誘導プロモーターが、Tet応答エレメント（TRE）を含む、請求項7又は請求項8記載
    の方法。
  10. 前記第1及び第2のゲノムセーフハーバー部位が、hROSA26遺伝子座、AAVS1遺伝子座、CL
    YBL遺伝子、CCR5遺伝子又はHPRT遺伝子のいずれか2つから選択される、請求項1～9のいず
    れか一項記載の方法。
  11. 第1の遺伝子セーフハーバー部位への前記転写調節タンパク質コード遺伝子の挿入が、
    前記細胞の両方の染色体で生じ、かつ/又は第2の遺伝子セーフハーバー部位への前記誘導
    カセットの挿入が前記細胞の両方の染色体上で生じる、請求項1～10のいずれか一項記載
    の方法。
  12. さらなる遺伝物質が、第1及び/又は第2のゲノムセーフハーバー部位に挿入され、任意
    に、以下のもの:
    a）自殺遺伝子;
    b）選択マーカー;
    c）レポーター遺伝子;及び/又は
    d）ノンコーディングRNAの遺伝子
    請求項1～11のいずれか一項記載の方法。
  13. 前記方法がエクスビボで行われる、請求項1～12のいずれか一項記載の前記方法。
  14. 前記細胞が多能性幹細胞、体性幹細胞又は成熟細胞から選択される、請求項1～13のい
    ずれか一項記載の方法。
  15. 前記方法が、定義された成熟細胞への多能性幹細胞のプログラミングのためのものであ
    る、請求項1又は請求項2記載の方法。
  16. 前記細胞が多能性幹細胞であり、前記遺伝子配列が、1以上のマスター調節因子、任意
    に、転写因子の導入遺伝子である、請求項1又は請求項2記載の方法。
  17. 前記遺伝子配列の転写が、定義された成熟細胞型への前記細胞のフォワードプログラミ
    ングをもたらす、請求項16記載の方法。
  18. 前記成熟細胞型が、以下の細胞型:：神経細胞、筋細胞、骨細胞、軟骨細胞、上皮細胞
    、分泌細胞、及び/又は血液細胞のいずれか1つから選択される、請求項17記載の方法。
  19. 前記多能性幹細胞が、人工多能性幹細胞（iPSC）又は胚性幹細胞（ESC）から選択され
    る、請求項14～18のいずれか一項記載の方法。
  20. 前記細胞がヒトである、請求項1～19のいずれか一項記載の方法。
  21. 前記方法が、遺伝子治療の目的のための遺伝子配列の挿入のためであり、任意に、前記
    遺伝子配列が、野生型タンパク質、改変タンパク質、抗原、酵素、選択マーカー又はノン
    コーディングRNA分子を含むタンパク質をコードする、請求項1記載の方法。
  22. 請求項1の方法によって作製される細胞。
  23. 第1遺伝子セーフハーバー部位に挿入される転写調節タンパク質コード遺伝子;及び第2
    の遺伝子セーフハーバー部位に挿入される誘導プロモーターに作動可能に連結された遺伝
    子配列を含む誘導カセットを含む改変ゲノムを有する細胞であって、前記誘導プロモータ
    ーが、転写調節タンパク質によって調節され、前記第1及び第2の部位が異なる、前記細胞
    。
  24. 治療における請求項22又は請求項23記載の細胞の使用。
  25. インビトロ診断のための、請求項22又は23記載の細胞の使用。
  26. 組織工学、任意に、培養肉のための、請求項22又は23記載の細胞の使用。
  27. 多能性幹細胞からの筋細胞の生成方法であって、
    a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
    工程；及び
    b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への、誘導プロモーターに作動可能に連結されたMYOD
    1遺伝子の標的化挿入の工程であって、前記誘導プロモーターが前記転写調節タンパク質
    によって調節される、前記工程、
    を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なり、
    レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
  28. 多能性幹細胞からのオリゴデンドロサイトの生成方法であって、
    a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
    工程;及び
    b）誘導プロモーターに作動可能に連結されたSOX 10遺伝子の、第2の遺伝子セーフハーバ
    ー部位への標的化挿入の工程であって、前記誘導プロモーターが転写調節タンパク質によ
    って調節される、前記工程
    を含み、前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なり、
    レチノイン酸の存在下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
  29. 細胞内で内因性遺伝子の転写及び/又は翻訳を低下させる方法であって、
    a）第1の遺伝子セーフハーバー部位への転写調節タンパク質コード遺伝子の標的化挿入の
    工程;及び
    b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記
    誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたノンコーディングRNA配列を
    コードするDNAを含み、前記プロモーターが、転写調節タンパク質によって調節され、前
    記ノンコーディングRNA配列が、内因性遺伝子の転写又は翻訳を抑制する、前記工程、
    を含み、
    前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法。
  30. 細胞内の内因性遺伝子をノックアウトする方法であって
    a）転写調節タンパク質コード遺伝子及びCas9コード遺伝子の、第1の遺伝子セーフハーバ
    ー部位への標的化挿入の工程;及び
    b）第2の遺伝子セーフハーバー部位への誘導カセットの標的化挿入の工程であって、前記
    誘導カセットが、誘導プロモーターに作動可能に連結されたガイドRNAを含み、前記プロ
    モーターが前記転写調節タンパク質によって調節され、前記gRNA配列が内因性遺伝子を標
    的化する、前記工程、
    を含み、
    前記第1及び第2の遺伝子セーフハーバー部位が異なる、前記方法。
  31. さらなる誘導カセット又は導入遺伝子が、前記第1及び第2のGSHと異なるさらなるGSHに
    挿入される、請求項1～21又は27～29のいずれか一項記載の方法。
  32. 配列番号6と80％、85％、90％、95％又は99％の相同性を有する配列を含む最適化tetR
    配列。
  33. MYOD1を発現する多能性幹細胞からの筋細胞の生成方法であって、レチノイン酸の存在
    下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
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