KR20180130574A - 신규 b7-h3-결합 분자, 그것의 항체 약물 콘쥬게이트 및 그것의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 및 비-인간 B7-H3에 결합할 수 있는 신규 B7-H3-결합 분자, 및 특히 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰거스 원숭이)의 B7-H3과 교차반응하는 이러한 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인간화된 및/또는 수혜 대상에 투여시 감소된 면역원성을 나타내도록 탈면역화된 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄(VH)를 포함하는 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 특히 (i) 이러한 B7-H3-결합 가변 도메인 및 (ii) 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 포함하는, 이중특이적 디아바디, BiTe, 이중특이적 항체, 3가 결합 분자 등을 비롯한, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 B7-H3-결합 분자 중 어느 것을 함유하는 제약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 B7-H3-결합 분자 중 어느 것의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 적어도 하나의 약물 부분에 콘쥬게이트된 인간화된 항-인간 B7-H3 항체의 인간 B7-H3 결합 도메인을 포함하는 분자에 관한 것이다("B7-H3-ADC"). 본 발명은 또한 이러한 B7-H3-ADC를 함유하는 제약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 B7-H3-ADC 중 어느 것의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규 B7-H3-결합 분자, 그것의 항체 약물 콘쥬게이트 및 그것의 사용 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 미국 특허 출원 일련번호 62/432,314(2016년 12월 9일에 출원됨; 계류 중), 62/323,249(2016년 4월 15일에 출원됨; 계류 중), 62/323,228(2016년 4월 15일에 출원됨; 계류 중)의 우선권을 주장하며, 각 출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열목록에 대한 참조
본 출원은 37 C.F.R. 1.821 et seq.에 따라 하나 이상의 서열목록을 포함하고 이들은 컴퓨터 판독가능 매체로 개시되며(파일명: 1301 0143-0144PCT_ST25.txt, 2017년 3월 28일 생성, 크기 104,762바이트), 이 파일은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 인간 및 비-인간 B7-H3에 결합할 수 있는 신규 B7-H3-결합 분자, 및 특히 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰거스 원숭이)의 B7-H3과 교차반응하는 이러한 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인간화된 및/또는 수혜 대상에 투여시 감소된 면역원성을 나타내도록 탈면역화된 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄(VH)를 포함하는 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 특히 (i) 이러한 B7-H3-결합 가변 도메인 및 (ii) 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 포함하는, 이중특이적 디아바디, BiTe, 이중특이적 항체, 3가 결합 분자 등을 비롯한, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 B7-H3-결합 분자 중 어느 것을 함유하는 제약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 B7-H3-결합 분자 중 어느 것의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 적어도 하나의 약물 부분에 콘쥬게이트된 인간화된 항-인간 B7-H3 항체의 인간 B7-H3 결합 도메인을 포함하는 분자에 관한 것이다("B7-H3-ADC"). 본 발명은 또한 이러한 B7-H3-ADC를 함유하는 제약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 B7-H3-ADC 중 어느 것의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다.
종양의 성장 및 전이는 숙주의 면역감시를 피하고 숙주의 방어기전을 극복하는 능력에 크게 의존한다. 대부분의 종양은 숙주 면역시스템에 의해 다양한 정도로 인식될 수 있는 항원을 발현하지만, 많은 경우 이펙터 T 세포의 비효과적인 활성화 때문에 충분하지 않은 면역 반응이 도출된다(Khawli L.A. et al.(2008) "Cytokine, Chemokine, and Co-Stimulatory Fusion Proteins for the Immunotherapy of Solid Tumors," Exper. Pharmacol. 181:291-328).
I. B7 수퍼패밀리 및 B7-H3
B7-H3은 B7-CD28 수퍼패밀리의 일원이며 항원-제시 세포 상에서 발현된다. 그것은 T 세포와 결합하지만, 이러한 T 세포의 표면의 B7-H3 대응-수용체는 아직 충분히 특성화되지 않았다.
B7-H3은 주된 인간 형태가 2개의 세포외 탠덤 IgV-IgC 도메인을 함유한다는 점에서 독특하다(즉, IgV-IgC-IgV-IgC)(Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). 단지 2개의 Ig 도메인(IgV-IgC)을 포함하는 것으로 처음에는 생각되었지만 4개의 면역글로불린 세포외 도메인 변이체("4Ig-B7-H3")가 확인되었고 이 단백질의 더 흔한 인간 형태인 것으로 판명되었다(Sharpe, A.H. et al. (2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). 그러나, 천연 뮤린 형태(2Ig) 및 인간 4Ig 형태는 유사한 기능을 나타낸다(Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 105(30):10277-10278). 4Ig-B7-H3 분자는 암세포의 NK-세포-매개 세포용해를 억제한다(Castriconi, R. et al. "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis," Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 101(34): 12640-12645). 인간 B7-H3(2Ig 형태)은 활성화된 T 세포 상의 잠정 수용체와 결합함으로써 T-세포 활성화 및 IFN-γ 생성을 촉진한다는 것이 보고되었고(Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production," Nature Immunol. 2:269-274), 더욱 최근 연구는 뮤린 및 인간 B7-H3의 억제성 역할을 지적하고 있다(Prasad, D.V., et al. (2004) "Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells, J Immunol. 173:2500-2506; Leitner, J., et al. (2009) "B7-H3 Is A Potent Inhibitor Of Human T-Cell Activation: No Evidence For B7-H3 And TREML2 Interaction." Eur. J. Immunol. 39:1754-1764; Veenstra, R.G., et al.(2015) "B7-H3 expression in Dnor T Cells and Host Cells Negatively Regulates Acute Graft-Versus-Host Disease Lethality," Blood 125: 3335-3346). B7-H3 mRNA 발현은 심장, 간, 고환, 폐, 간, 췌장, 전립선, 결장 및 골아세포에서 발견되었다(Collins, M. et al. (2005) "The B7 Family Of Immune-Regulatory Ligands," Genome Biol. 6:223.1-223.7). 단백질 수준에서는 B7-H3가 인간의 간, 폐, 방광, 고환, 전립선, 유방, 태반 및 림프양 기관에서 발견되었다(Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278).
B7-H3은 휴지기 B 또는 T 세포, 단구, 또는 수지상 세포에서는 발현되지 않지만, IFN-γ에 의해 수지상 세포에서, GM-CSF에 의해 단구에서 유도된다(Sharpe, A.H. et al.(2002) "The B7-CD28 Superfamily," Nature Rev. Immunol. 2:116-126). B7-H3의 작용 방식은 복잡하며, 이 단백질은 T 세포 공-자극 및 공-억제를 모두 매개한다고 보고된다(Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278; Martin-Orozco, N. et al. (2007)"Inhibitory Costimulation And Anti-Tumor Immunity," Semin. Cancer Biol. 17(4):288-298; Subudhi, S.K. et al. (2005) "The Balance Of Immune Responses: Costimulation Verse Coinhibition," J. Mol. Med. 83:193-202). B7-H3은 T 세포의 공-억제를 매개하기 위해 아직 확인되지 않은 수용체(들)와 결합한다. 이에 더하여, B7-H3은 미지의 수용체(들)와의 상호작용을 통해서 NK-세포 및 골아세포을 억제한다(Hofmeyer, K. et al.(2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105(30):10277-10278). 억제는 T 세포 수용체(TCR)가 유전자 전사를 조절하는 주요 신호화 경로의 일원과의 상호작용을 통해 작동할 수 있다(예를 들어, NFTA, NF-κB, 또는 AP-1 인자). B7-H3은 또한 생체내에서 Th1, Th2, 또는 Th17을 억제한다고 생각된다(Prasad, D.V. et al. (2004) "Murine B7-H3 Is A Negative Regulator Of T Cells," J. Immunol. 173:2500-2506; Fukushima, A. et al. (2007) "B7-H3 Regulates The Development Of Experimental Allergic Conjunc-tivitis In Mice," Immunol. Lett. 113:52-57; Yi. K.H. et al. (2009) "Fine Tuning The Immune Response Through B7-H3 And B7-H4," Immunol. Rev. 229:145-151).
II. B7-H3 발현 종양
B7-H3은 또한 다양한 암세포(예를 들어, 신경아세포종, 위암, 난소암, 비소세포 폐암 등, 예를 들어 Modak, S., et al. (2001) "Monoclonal antibody 8H9 targets a novel cell surface antigen expressed by a wide spectrum of human solid tumors," Cancer Res 61:4048-54 참조)에서 발현되고 암 줄기-유사 세포에서 배양된다고 알려져 있다. 몇몇 독립적인 영구는 인간 악성 종양 세포가 B7-H3 단백질의 발현에서 현저한 증가를 나타내고 이런 증가된 발현은 증가된 질환 심각성과 관련되었음을 밝혔고(Zang, X. et al. (2007) "The B7 Family And Cancer Therapy: Costimulation And Coinhibition," Clin. Cancer Res. 13:5271-5279; Sun, Y., et al. (2006) "B7-H3 and B7-H4 expression in non-small-cell lung cancer," Lung Cancer 53:143-51; Tekle C., et al.(2012) "B7-H3 Contributes To The Metastatic Capacity Of Melanoma Cells By Modulation Of Known Metastasis-Associated Genes" Int. J. Cancer 130:2282-90; Wang L. et al.(2013) "B7-H3 Mediated Tumor Immunology: Friend Or Foe," Int. J. Cancer 134(12):2764-2771), 이는 B7-H3이 면역 회피 경로로서 종양에 의해 이용된다는 것을 시사한다(Hofmeyer, K. et al. (2008) "The Contrasting Role Of B7-H3," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 105 (30):10277-10278).
B7-H3 단백질 발현은 또한 종양 셀라인에서 면역조직화학적으로 검출되었다(Chapoval, A. et al. (2001) "B7-H3: A Costimulatory Molecule For T Cell Activation and IFN-γ Production," Nature Immunol. 2:269-274; Saatian, B. et al. (2004) "Expression Of Genes For B7-H3 And Other T Cell Ligands By Nasal Epithelial Cells During Differentiation And Activation," Amer. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 287:L217-L225; Mather, J. et al, WO 2004/001381; Castriconi et al. (2004) "Identification Of 4Ig-B7-H3 As A Neuroblastoma-Associated Molecule That Exerts A Protective Role From An NK Cell-Mediated Lysis," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 101(34):12640-12645); Sun, M. et al. (2002) "Characterization of Mouse and Human B7-H3 Genes," J. Immunol. 168: 6294-6297).
면역 시스템을 억제하는데 있어서 B7-H3의 역할과 인간 종양에서 B7-H3의 증가된 발현은 이 분자가 암의 치료를 위한 치료 표적으로서 기능할 수 있음을 시사했다. 따라서, 종양을 치료하고 및/또는 면역 반응을 상향조절하기 위한 항-B7-H3 항체 및 B7-H3 발현을 조정하는 다른 분자의 사용이 제안되었다(Loo, D. et al. (2012) "Development of an Fc-Enhanced Anti-B7-H3 Monoclonal Antibody with Potent Antitumor Activity," Clin Cancer Res; 18: 3834-3845; Ahmed, M. et al. (2015) "Humanized Affinity-Matured Monoclonal Antibody 8H9 Has Potent Anti-Tumor Activity and Binds to FG Loop of B7-H3," J. Biol. Chem.　290: 30018-30029; Nagase-Zembutsu, A. et al. (2016) "Development of DS-5573a: A novel afucosylated monoclonal antibody directed at B7-H3 with potent antitumor activity," Cancer Sci. 2016, doi: 10.1111/cas.12915; Modak, S. et al. (March 1999) "Disialoganglioside GD2 And Antigen 8H9: Potential Targets For Antibody-Based Immunotherapy Against Desmoplastic Small Round Cell Tumor (DSRCT) And Rhabdomyosarcoma (RMS)," Proceedings Of The American Association For Cancer Research Annual Meeting, Vol. 40:474 (90th Annual Meeting Of The American Association For Cancer Research; Philadelphia, Pennsylvania, US; April 10-14, 1999; Modak, S. et al. (March 2000) "Radioimmunotargeting To Human Rhabdomyosarcoma Using Monoclonal Antibody 8H9," Proc. Am. Assoc. Cancer Res.41:724; Modak, S. et al. (2001) "Monoclonal Antibody 8H9 Targets A Novel Cell Surface Antigen Expressed By A Wide Spectrum Of Human Solid Tumors," Cancer Res. 61(10):4048-4054; Steinberger, P. et al. (2004) "Molecular Characterization of Human 4Ig-B7-H3, a Member of the B7 Family with Four Ig-Like Domains," J. Immunol. 172(4):2352-2359; Xu, H. et al. (2009) "MicroRNA miR-29 Modulates Expression of Immunoinhibitory Molecule B7-H3: Potential Implications for Immune Based Therapy of Human Solid Tumors," Cancer Res. 69(15):5275-6281 참조; 또한 미국특허 7,279,567, 7,358,354, 7,368,554, 7,527,969,7,718,774, 8,216,570, 8,779,098, 8,802,091, 9,150,656, 미국 특허공개 2002/0168762; 2005/0202536, 2008/0081346, 2008/0116219, 2009/0018315, 2009/0022747, 2009/0087416, 2013/0078234, 2015/0274838, PCT 공보 WO 2008/066691; WO 2006/016276; WO 2008/116219; WO 04/001381, WO 2001/094413, WO 2002/10187, WO 2002/32375, WO 2004/093894, WO 2006/016276, WO 2008/116219,WO 2011/109400; 및 EP 1292619B 참조).
모든 이러한 선행한 성공에도, B7-H3을 발현하는 종양 세포를 표적화해서 죽이는 추가의 치료제에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명은 이 목적 및 다른 목적에 관한 것이다.
본 발명은 인간 및 비-인간 B7-H3에 결합할 수 있는 신규 B7-H3-결합 분자, 및 특히 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰거스 원숭이)의 B7-H3과 교차반응하는 이러한 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인간화된 및/또는 수혜 대상에 투여시 감소된 면역원성을 나타내도록 탈면역화된 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄(VH)를 포함하는 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 특히 (i) 이러한 B7-H3-결합 가변 도메인 및 (ii) 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 포함하는, 이중특이적 디아바디, BiTe, 이중특이적 항체, 3가 결합 분자 등을 비롯한, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 B7-H3-결합 분자 중 어느 것을 함유하는 제약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 B7-H3-결합 분자 중 어느 것의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 적어도 하나의 약물 부분에 콘쥬게이트된 인간화된 항-인간 B7-H3 항체의 인간 B7-H3 결합 도메인을 포함하는 분자에 관한 것이다("B7-H3-ADC"). 본 발명은 또한 이러한 B7-H3-ADC를 함유하는 제약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 B7-H3-ADC 중 어느 것의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다.
상세하게, 본 발명의 한 양태는 가변 경쇄(VL) 도메인 및 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함하는 B7-H3-결합 분자를 제공하며, 상기 가변 중쇄 도메인은 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인을 포함하고, 상기 가변 경쇄 도메인은 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, 및 CDRL3 도메인을 포함하며, 상기 도메인 중 적어도 3개, 상기 도메인 중 적어도 4개, 상기 도메인 중 적어도 5개 또는 상기 도메인 전부는 아래와 같이 구성된 군으로부터 선택된다:
(1) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
(2) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
(3) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
(4) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
(5) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
(6) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인.
본 발명은 추가로 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, 및 CDRL3 도메인을 포함하는 상기 가변 경쇄(VL) 도메인, 및 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인을 포함하는 상기 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함하는 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이며, 여기서
(1) 상기 CDRH1 도메인은 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하고;
(2) 상기 CDRH2 도메인은 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하며;
(3) 상기 CDRH3 도메인은 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, 및 CDRL3 도메인을 포함하는 상기 가변 경쇄(VL) 도메인, 및 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인을 포함하는 상기 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함하는 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이며, 여기서
(1) 상기 CDRL1 도메인은 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하고;
(2) 상기 CDRL2 도메인은 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하며;
(3) 상기 CDRL3 도메인은 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명은 추가로 상기 가변 중쇄(VH) 도메인이 SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 상기 가변 경쇄(VL) 도메인이 SEQ ID NO:22 또는 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며 상기 VL 도메인이 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며 상기 VH 도메인이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며 상기 VL 도메인이 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하고 상기 VH 도메인이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다.
더 나아가, 본 발명은 분자가 항체 또는 그것의 에피토프-결합 단편인 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이다. 본 발명은 또한 분자가 이중특이적 항체 또는 디아바디, 특히 각각 N-말단과 C-말단을 가진 2개, 3개, 4개 또는 5개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 디아바디, 또는 디아바디 복합체인 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이며, 여기서 이러한 폴리펩타이드 사슬은 하나 이상의 공유 결합, 및 특히 하나 이상의 공유 이황화물 결합을 통해 함께 회합된다. 본 발명은 추가로 분자가 3가 결합 분자인, 및 특히 3가 결합 분자가 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 공유 결합된 복합체인 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가 분자가 Fc 도메인인 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 분자가 디아바디이고 알부민-결합 도메인, 및 특히 탈면역화된 알부민-결합 도메인인 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이다.
더 나아가, 본 발명은 Fc 도메인을 추가로 포함하는 모든 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이며, 특히 여기서 Fc 도메인은 FcγR에 대한 변이체 Fc 도메인의 친화성을 감소시키고 및/또는 B7-H3-결합 분자의 혈청 반감기를 증진시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 Fc 도메인이며, 및 더 구체적으로 변형은 아래와 같이 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 치환을 포함한다:
(a) L234A;
(b) L235A;
(c) L234A 및 L235A;
(d) M252Y; M252Y 및 S254T;
(e) M252Y 및 T256E;
(f) M252Y, S254T 및 T256E; 및
(g) K288D 및 H435K;
여기서 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른 것이다.
더 나아가, 본 발명은 분자가 이중특이적인 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이며, 특히 분자가 B7-H3의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 2개의 에피토프-결합 부위 및 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 2개의 에피토프-결합 부위를 포함하는 구체예, 또는 분자가 B7-H3의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 하나의 에피토프-결합 부위 및 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 하나의 에피토프-결합 부위를 포함하는 구체예에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 분자가 3가 결합 분자인 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이며, 특히 분자가 B7-H3의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 하나의 에피토프-결합 부위, 이펙터 세포의 표면에 존재하는 제1 분자의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 하나의 에피토프-결합 부위, 및 이펙터 세포의 표면에 존재하는 제2 분자의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 하나의 에피토프-결합 부위를 포함하는 구체예에 관한 것으로서, 여기서 이러한 제1 및 제2 분자는 B7-H3이 아니다.
더 나아가, 본 발명은 분자가 B7-H3와 제2 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이며, 특히 제2 에피토프가 이펙터 세포의 표면에 존재하는 제2 분자의 에피토프인 구체예에 관한 것이다(특히 여기서 제2 에피토프는 CD2, CD3, CD8, CD16, TCR, 또는 NKG2D의 에피토프이고, 가장 구체적으로 제2 에피토프는 CD3의 에피토프이다). 본 발명은 추가로 이펙터 세포가 세포독성 T-세포 또는 자연살해(NK) 세포인 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 분자가 또한 제3 에피토프에 결합할 수 있는 이러한 B7-H3-결합 분자의 구체예에 관한 것이며, 특히 제3 에피토프가 CD8의 에피토프인 구체예에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가 분자가 B7-H3을 발현하는 세포 및 세포독성 T 세포의 합동 결합을 매개하는 이러한 분자의 구체예에 관한 것이다.
더 나아가, 본 발명은 상기 설명된 B7-H3-결합 분자 중 어느 것의 유효량과 제약학상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서, 또는 B7-H3의 발현을 특징으로 하는 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 상기 설명된 B7-H3-결합 분자 중 어느 것의 사용에 관한 것이며, 특히 여기서 B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태는 암이고, 및 더 구체적으로 여기서 암은 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 부신암, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, B-세포 암, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 섬유성 골 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비종양증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경집 종양, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부 조직 육종, 편평세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 전이성 갑상선암 및 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
본 발명의 제2 양태는 적어도 하나의 약물 부분에 콘쥬게이트된 인간화된 항-인간 B7-H3 항체의 인간 B7-H3 결합 도메인을 포함하는 분자에 관한 것이다("B7-H3-ADC"). 본 발명은 또한 이러한 B7-H3-ADC를 함유하는 제약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 B7-H3-ADC 중 어느 것의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다.
상세하게, 본 발명은 아래의 식을 포함하는 항-B7-H3 항체 약물 콘쥬게이트(B7-H3-ADC)를 제공한다:
Ab-(LM)m-(D)n,
여기서:
Ab는 인간화된 가변 중쇄(VH) 도메인 및 인간화된 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 B7-H3에 결합하는 항체이거나, 또는 그것의 B7-H3-결합 단편이고;
D는 세포독성 약물 부분이고;
LM은 Ab와 D를 공유 연결하는 링커 분자이고;
m은 0과 n 사이의 정수로서 B7-H3-ADC의 링커 분자의 수를 나타내고;
n은 1과 10 사이의 정수로서 ADC에 공유 연결된 세포독성 약물 부분의 수를 표시한다.
더 나아가, 본 발명은 링커 분자 LM이 부재하고(즉, m = 0)는 이러한 B7-H3-ADC, 및 1개를 초과하는 링커 분자 LM(즉, m이 2에서부터 n까지의 정수이다)을 지닌 B7-H3-ADC를 제공하며, 그 각각에서 링커 분자 LM은 세포독성 약물 부분 D를 이러한 B7-H3-ADC의 Ab에 공유 연결한다. 본 발명은 더 나아가 Ab가 1개를 초과하는 링커 분자 LM에 공유 연결된 이러한 B7-H3-ADC를 제공하며, 여기서 모든 이러한 링커 분자는 동일하다. 이러한 B7-H3-ADC의 Ab에 공유 연결된 세포독성 약물 부분 D는 모두 동일할 수 있거나 또는 2, 3, 4개 또는 그 이상의 동일하지 않은 세포독성 약물 부분 D를 포함할 수 있다. 본 발명은 더 나아가 Ab가 1개를 초과하는 링커 분자 LM에 공유 연결된 이러한 B7-H3-ADC를 제공하며, 여기서 모든 이러한 링커 분자는 동일하지 않다. 이러한 B7-H3-ADC의 Ab에 공유 연결된 세포독성 약물 부분 D는 모두 동일할 수 있거나 또는 2, 3, 4개 또는 그 이상의 동일하지 않은 세포독성 약물 부분 D를 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 아래와 같은 B7-H3-ADC를 제공한다:
(A) (i) 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:99의 아미노산 서열을 포함하고,
(ii) 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:104의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(B) (i) 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하고,
(ii) 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(C) (i) 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하고,
(ii) 인간화된 VH 도메인은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:99의 아미노산 서열을 포함하고 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:104의 아미노산 서열을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하고 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하고 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 Ab가 항체 또는 항체의 항원 결합 단편인 이러한 B7-H3-ADC를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 B7-H3-ADC가 인간 IgG(특히 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)의 Fc 도메인을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 B7-H3-ADC가 아래와 같은 것을 포함하는 변이체 Fc 도메인을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공한다:
(a) FcγR에 대한 변이체 FC 도메인의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형; 및/또는
(b) 변이체 Fc 도메인의 혈청 반감기를 증진시키는 하나 이상의 아미노산 변형.
더 나아가, 본 발명은 변이체 Fc 도메인을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공하며, 여기서 FcγR에 대한 변이체 Fc 도메인의 친화성을 감소시키는 변형은 치환 L234A; L235A; 또는 L234A 및 L235A를 포함하고, 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스를 따른 것이다.
더 나아가, 본 발명은 변이체 Fc 도메인을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공하며, 여기서 변이체 Fc 도메인의 혈청 반감기를 증진시키는 변형은 치환 M252Y; M252Y 및 S254T; M252Y 및 T256E; M252Y, S254T 및 T256E; 또는 K288D 및 H435K을 포함하고, 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스를 따른 것이다.
더 나아가, 본 발명은 LM 중 적어도 하나가 링커 분자이고, 특히 LM 링커 분자가 펩타이드계 링커 및/또는 절단가능한 링커인 이러한 B7-H3-ADC를 제공한다.
더 나아가, 본 발명은 분자가 아래의 식을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공한다:
Ab - [V-(W)k-(X)1-A] - D
여기서:
V는 절단가능한 LM 링커 분자이고,
(W)k-(X)1-A는 l,(4+2n)-제거를 통해 자기 제거하는, 신장된, 자기-제거 스페이서 시스템이고,
W 및 X는 각각 l,(4+2n) 전자 연쇄반응 스페이서로서 동일하거나 상이하고,
A는 식 (Y)m의 스페이서 기로서 Y가 l,(4+2n) 전자 연쇄반응 스페이서인 기, 또는 식 U의 기로서 고리화 제거 스페이서 기이고,
k, l 및 m은 독립적으로 0(포함됨) 내지 5(포함된)의 정수이고, n은 0(포함됨) 내지 10(포함됨)의 정수이며, 단
A가 (Y)m일 때 k+l+m ≥ 1, 및
만일 k+l+m = 1이면 n > 1;
A가 U일 때 k+1 ≥ 1이다.
W, X, 및 Y는 독립적으로 아래의 식:
Figure pct00001
또는
Figure pct00002
을 가진 화합물로부터 선택된다:
여기서:
Q는 -R5C=CR6-, S, O, NR5, -R5C=N-, 또는 -N=CR5-이고,
P는 NR7, O 또는 S이고,
a, b, 및 c는 독립적으로 0(포함됨) 내지 5(포함됨)의 정수이고;
I, F 및 G는 독립적으로 아래의 식을 가진 화합물로부터 선택되고:
Figure pct00003
여기서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C3-20 헤테로사이클릴, C5-20 아릴, C1-6 알콕시, 하이드록시(OH), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(SRx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP-(=0)(ORx)2)를 표시하며, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 독립적으로 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 치환체 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 또는 R9 중 둘 이상은 선택적으로 서로 연결되어 하나 이상의 지방족 또는 방향족 환형 구조를 형성하며;
U는 아래의 식을 가진 화합물로부터 선택된다:
Figure pct00004
여기서:
a, b 및 c는 독립적으로 0 또는 1의 정수가 되도록 선택되며; 단 a + b + c = 2 또는 3이고;
R1 및/또는 R2는 독립적으로 H, C1-6 알킬을 표시하며, 알킬은 선택적으로 다음의 군: 하이드록시(OH), 에테르(ORx), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(S-Rx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP(=0)(ORx)2) 중 하나 이상으로 치환되고, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되며,
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 독립적으로 H, C1-6 알킬, C3-20 헤테로사이클릴, C5-20 아릴, C1-6 알콕시, 하이드록시(OH), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(S-Rx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP(=0)(ORx)2)를 표시하며, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 치환체 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중 둘 이상은 선택적으로 서로 연결되어 하나 이상의 지방족 또는 방향족 환형 구조를 형성한다.
더 나아가, 본 발명은 LM 링커 분자가 아래의 것을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공한다:
(1) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
(2) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
(3) p-암모신남일옥시카보닐;
(4) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
(5) p-아미노-벤질옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
(6) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
(7) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐;
(8) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
(9) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p아미노벤질옥시카보닐;
(10) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐;
(11) p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
(12) p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
(13) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
(14) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
(15) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)-카보닐;
(16) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
(17) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질;
(18) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질;
(19) p-아미노신남일;
(20) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질;
(21) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노신남일;
(22) p-아미노-신남일옥시카보닐-p-아미노신남일;
(23) p-아미노페닐펜타디엔일;
(24) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노신남일;
(25) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노벤질; 또는
(26) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노페닐펜타디엔일.
더 나아가, 본 발명은 LM 링커 분자가 Ab의 폴리펩타이드 사슬의 아미노산의 측쇄에 콘쥬게이트되고 Ab와 세포독성 약물 부분 D의 분자를 결합시키는 이러한 B7-H3-ADC를 제공하며, 특히 여기서 세포독성 약물 부분 D는 사이토톡신, 방사성동위원소, 면역조정제, 사이토카인, 림포카인, 케모카인, 성장인자, 종양괴사인자, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, siRNA, RNAi, 마이크로RNA, 광활성 치료제, 항신생혈관제, 친-세포자살제, 펩타이드, 지질, 탄수화물, 킬레이트화제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 LM 링커 분자가 Ab의 폴리펩타이드 사슬의 아미노산의 측쇄에 콘쥬게이트되고 Ab와 세포독성 약물 부분 D의 분자를 결합시키는 이러한 B7-H3-ADC를 제공하며, 특히 여기서 세포독성 약물 부분 D는 튜불리신(특히 튜불리신 A, 튜불리신 B, 튜불리신 C, 및 튜불리신 D로 구성되는 군으로부터 선택된 튜불리신 사이토톡신), 아우리스타틴(특히 MMAE(N-메틸발린-발린-돌라이소로이신-돌라프로인-노르에페드린) 및 MMAF(N-메틸발린-발린-돌라이소로이신-돌라프로인-페닐알라닌)로 구성되는 군으로부터 선택된 아우리스타틴 사이토톡신), 메이탄시노이드(마이탄신, DM1 및 DM4로 구성되는 군으로부터 선택된 메이탄시노이드 사이토톡신), 칼리키아미신(특히 칼리키아미신 γ1, 칼리키아미신 β1Br, 칼리키아미신 γ1Br, 칼리키아미신 α2I, 칼리키아미신 α3I, 칼리키아미신 β1I, 칼리키아미신 γ1I, 및 칼리키아미신 Δ1I로 구성되는 군으로부터 선택된 칼리키아미신 사이토톡신), 피롤로벤조디아제핀(특히 바다스툭시맙 탈리린, SJG-136, SG2000, SG2285 및 SG2274로 구성되는 군으로부터 선택된 피롤로벤조디아제핀 사이토톡신), 및 듀오카르마이신(특히 듀오카르마이신 사이토톡신이고, 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 B1, 듀오카르마이신 B2, 듀오카르마이신 C1, 듀오카르마이신 C2, 듀오카르마이신 D, 듀오카르마이신 SA, CC-1065, 아도젤레신, 비젤레신, 카젤레신(U-80244) 및 스피로-듀오카르마이신(DUBA)으로 구성되는 군으로부터 선택된다)으로 구성되는 군으로부터 선택된 사이토톡신을 포함한다.
더 나아가, 본 발명은 상기 설명된 B7-H3-ADC 중 어느 것의 유효량과 제약학상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서, 또는 B7-H3의 발현을 특징으로 하는 질환 또는 상태를 치료하는 방법에서 상기 설명된 B7-H3-ACD 중 어느 것의 사용에 관한 것이며, 특히 여기서 B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태는 암이고, 및 더 구체적으로 여기서 암은 급성 골수성 백혈병, 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 섬유성 골 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 간세포 암종, 교모세포종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병, 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암, 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 악성중피종, 다발성 내분비종양증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 인두암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경집 종양, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 신장 세포 암종, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부 조직 육종, 편평세포암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 전이성 갑상선암 및 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
도 1은 각각 E-코일 또는 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 가진 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 두 개의 에피토프-결합 부위를 갖는 대표적인 공유 결합된 디아바디의 개략도를 제공한다(대안의 헤테로다이머-촉진 도메인은 아래 제공된다). 시스테인 잔기는 도 3B에서 도시된 바와 같이 링커 및/또는 헤테로다이머-촉진 도메인에 존재할 수 있다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영(shading) 또는 채움(fill) 패턴을 사용하여 도시된다.
도 2는 회합된 사슬이 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 형성하도록, 각각 CH2 및 CH3 도메인을 가진 두 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 두 개의 에피토프-결합 부위를 갖는 대표적인 공유 결합된 디아바디 분자의 개략도를 제공한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 채움 패턴을 사용하여 도시된다.
도 3a 내지 3c는 폴리펩타이드 사슬의 두 개의 쌍(즉, 총 네 개의 폴리펩타이드 사슬)으로 구성된 네 개의 에피토프-결합 부위를 가진 대표적인 공유 결합된 4가 디아바디를 도시하는 개략도를 제공한다. 각각의 쌍의 하나의 폴리펩타이드는, 회합된 사슬이 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 형성하도록, CH2 및 CH3 도메인을 가지고 있다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 채움 패턴을 사용하여 도시된다. 폴리펩타이드 사슬의 두 개의 쌍은 동일한 것일 수도 있다. 폴리펩타이드 사슬의 두 개의 쌍이 동일하고 VL 및 VH 도메인이 상이한 에피토프를 인식하는 이러한 구체예에서(도 3a-3b에서 도시된 바와 같음), 결과로 생긴 분자는 네 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있으며 각각의 결합된 에피토프에 대하여 이중특이적이고 2가이다. VL 및 VH 도메인이 동일한 에피토프를 인식하는(예를 들어, 동일한 VL 도메인 CDR 및 동일한 VH 도메인 CDR이 두 사슬에서 사용된다) 이러한 구체예에서, 결과로 생긴 분자는 네 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있으며 단일 에피토프에 대하여 단일 특이적이고 4가이다. 대안으로, 폴리펩타이드의 두 개의 쌍은 다를 수도 있다. 폴리펩타이드 사슬의 두 개의 쌍이 상이하고 폴리펩타이드 각각의 쌍의 VL 및 VH 도메인이 상이한 에피토프를 인식하는 이러한 구체예에서(도 3c에서 상이한 음영 및 패턴에 의해 도시된 바와 같음), 결과로 생긴 분자는 네 개의 에피토프-결합 부위를 가지고 있으며 각각의 결합된 에피토프에 대하여 사중특이적이고 1가이다. 도 3a는 시스테인 잔기을 포함하는 펩타이드 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 Fc 도메인-함유 디아바디를 나타낸다. 도 3b는 시스테인 잔기 및 링커(선택적으로 시스테인 잔기를 가짐)를 포함하는 E-코일 및 K-코일 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하는 Fc 도메인-함유 디아바디를 도시한다. 도 3c는 항체 CH1 및 CL 도메인을 함유하는 Fc 영역-함유 디아바디를 도시한다.
도 4a 및 4b는 세 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 두 개의 에피토프-결합 부위를 갖는 대표적인 공유 결합된 디아바디 분자의 개략도를 제공한다. 폴리펩타이드 사슬 중 두 개는, 회합된 사슬이 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 형성하도록, CH2 및 CH3 도메인을 가지고 있다. VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 헤테로다이머-촉진 도메인을 더 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 채움 패턴을 사용하여 도시된다.
도 5는 다섯 개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 네 개의 에피토프-결합 부위를 가진 대표적인 공유 결합된 디아바디 분자의 개략도를 제공한다. 폴리펩타이드 사슬 중 두 개는, 회합된 사슬이 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함한 Fc 도메인을 형성하도록, CH2 및 CH3 도메인을 가지고 있다. 결합된 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 사슬은 헤테로다이머-촉진 도메인을 더 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 채움 패턴을 사용하여 도시된다.
도 6a 내지 6f는 세 개의 에피토프-결합 부위를 가진 대표적인 Fc 도메인-함유 3가 결합 분자의 개략도를 제공한다. 도 6a 및 6b는 각각 두 개의 디아바디-형 결합 도메인 및 디아바디-형 결합 도메인이 Fc 영역에 대하여 N-말단 또는 C-말단인 상이한 도메인 방향을 갖는 Fab-형 결합 도메인을 포함하는 3가 결합 분자의 도메인을 개략적으로 도시한다. 도 6a 및 6b에서 분자는 네 개의 사슬을 포함한다. 도 6c 및 6d는 각각 Fc 도메인에 대하여 N-말단인 두 개의 디아바디-형 결합 도메인, 및 경쇄 및 중쇄가 폴리펩타이드 링커 스페이서, 또는 scFv-형 결합 도메인을 통해 결합되는 Fab-형 결합 도메인을 포함하는 3가 결합 분자의 도메인을 개략적으로 도시한다. 도 6e 및 6f에서 3가 결합 분자는 각각 Fc 도메인에 대하여 C-말단인 두 개의 디아바디-형 결합 도메인, 및 경쇄와 중쇄가 폴리펩타이드 스페이서를 통해 결합된 Fab-형 결합 도메인, 또는 scFv-형 결합 도메인을 포함하는 3가 결합 분자의 도메인을 개략적으로 도시한다. 도 6c 내지 6f의 3가 결합 분자는 세 개의 사슬을 포함한다. 동일한 에피토프를 인식하는 VL 및 VH 도메인은 동일한 음영 또는 채움 패턴을 사용하여 도시된다.
도 7은 Hs700T 췌장암 세포에 내재화될 수 있는 항-B7-H3 항체에 대한 스크린 결과를 도시한다.
도 8a-8j는 B7-H3 발현 JIMT-1 유방암 세포(도 8a), MDA-MB-468 유방암 세포(도 8b), A375.52 흑색종 세포(도 8c), Calu-6 비소세포 폐암 세포(도 8d), NCI-H1703 비소세포 폐암 세포(도 8e), NCI-H1975 비소세포 폐암 세포(도 8f), PA-1 난소암 세포(도 8g), Hs700T 췌장암 세포(도 8h), DU145 전립선암 세포(도 8i), 및 B7-H3 음성 Raji B 세포 림프종 세포(도 8j)에 대한 시험관내 세포독성을 매개할 수 있는 본 발명의 B7-H3-ADC의 능력에 대한 연구 결과를 도시한다.
도 9는 CD1 누드 마우스 모델에서 포유류 지방체에 이식된 MDA-MB-468 유방암 종양 세포에 대한 생체내 세포독성을 매개할 수 있는 본 발명의 B7-H3-ADC의 능력에 대한 연구 결과를 도시한다. 제25일에(화살표로 도시됨) 10 mg/kg chmAb-B-vc-MMAE, chmAb-C-vc-MMAE, 및 chmAb-D-vc-MMAE 또는 비히클 단독으로 복강내 치료된 마우스에 대한 종양 성장 곡선이 제시된다.
도 10a-10c는 CD1 누드 마우스 모델에서 피하 이식된 NCI-H1703 비소세포 폐암 종양 세포에 대한 생체내 세포독성을 매개할 수 있는 본 발명의 B7-H3-ADC의 능력에 대한 연구 결과를 도시한다. 제25일에(화살표로 도시됨) 10 mg/kg(도 10a), 3 mg/kg(도 10b), 1 mg/kg(도 10c) chmAb-B-vc-MMAE, chmAb-C-vc-MMAE, 및 chmAb-D-vc-MMAE 10 mg/kg 또는 비히클 단독으로 복강내 치료된 마우스에 대한 종양 성장 곡선이 제시된다.
도 11a-11c는 CD1 누드 마우스 모델에서 피하 이식된 PA-1 난소암 종양 세포에 대한 생체내 세포독성을 매개할 수 있는 본 발명의 B7-H3-ADC의 능력에 대한 연구 결과를 도시한다. 제42일에(화살표로 도시됨) 10 mg/kg(도 11a), 3 mg/kg(도 11b), 1 mg/kg(도 11c) chmAb-B-vc-MMAE, chmAb-C-vc-MMAE, 및 chmAb-D-vc-MMAE 10 mg/kg 또는 비히클 단독으로 복강내 치료된 마우스에 대한 종양 성장 곡선이 제시된다.
도 12a-12c는 CD1 누드 마우스 모델에서 피하 이식된 Calu-6 비소세포 폐암 종양 세포에 대한 생체내 세포독성을 매개할 수 있는 본 발명의 B7-H3-ADC의 능력에 대한 연구 결과를 도시한다. 제20일에(화살표로 도시됨) 10 mg/kg(도 12a), 3 mg/kg(도 12b), 1 mg/kg(도 12c) chmAb-B-vc-MMAE, chmAb-C-vc-MMAE, 및 chmAb-D-vc-MMAE 10 mg/kg 또는 비히클 단독으로 복강내 치료된 마우스에 대한 종양 성장 곡선이 제시된다.
도 13a-13c는 CD1 누드 마우스 모델에서 피하 이식된 A375.S2 흑색종 세포에 대한 생체내 세포독성을 매개할 수 있는 본 발명의 B7-H3-ADC의 능력에 대한 연구 결과를 도시한다. 제30일에(화살표로 도시됨) 10 mg/kg(도 13a), 3 mg/kg(도 13b), 1 mg/kg(도 13c) chmAb-B-vc-MMAE, chmAb-C-vc-MMAE, 및 chmAb-D-vc-MMAE 10 mg/kg 또는 비히클 단독으로 복강내 치료된 마우스에 대한 종양 성장 곡선이 제시된다.
도 14a-14c는 B7-H3-ADC 분자의 약동학적 안정성에 대한 연구 결과를 도시한다. chmAb-B(도 14a), chmAb-C(도 14b) 및 chmAb-D(도 14c)로부터 유래된 총 항체(원) 및 무손상 B7-H3-ADC(사각)에 대한 혈청 항체 농도 곡선이 제시된다.
도 15a-15c는 절단가능한 링커를 통해서 그것의 Ab 부분의 아미노산 잔기에 결합된 예시적인 듀오카르마이신 부분(DUBA)을 가진 hmAb-C B7-H3-ADC에 의한 생물학적 활성의 보유를 도시한다("hmAb-C-DUBA"). 도 15a, Calu-6 세포; 도 15b, NCI-H1703 세포; 도 15c, Hs700T 세포. 대조군 분자는 CD20에 결합하고 DUBA에 콘쥬게이트된다("Ctrl-DUBA").
도 16은 Calu-6 비소세포 폐 암종 세포에 대한 hmAb-C-DUBA의 효능의 생체내 연구 결과를 도시한다. hmAb-C-DUBA가 Calu-6 비소세포 폐 암종 세포가 피하 접종된 마우스의 그룹(n=5)에 도입되었다. hmAb-C-DUBA의 용량(1 mg/kg x 3, 3 mg/kg x 3, 또는 6 mg/kg x 3)이 접종 후 제24, 31, 38 및 45일에(화살표로 도시됨) 마우스에 복강내 제공되었고, 동물들은 최대 62일 동안 종양 용적에 대해 평가되었다.
도 17은 Calu-6 비소세포 폐 암종 세포에 대한 hmAb-C-DUBA의 효능의 생체내 연구 결과를 도시한다. hmAb-C-DUBA가 Calu-6 비소세포 폐 암종 세포가 피하 접종된 마우스의 그룹(n=7)에 도입되었다. hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA의 한 용량(3 mg/kg 또는 10 mg/kg)이 접종 후 제20일에(화살표로 도시됨) 마우스에 제공되었고, 동물들은 최대 55일 동안 종양 용적에 대해 평가되었다.
도 18은 PA-1 난소 암종 세포에 대한 hmAb-C-DUBA의 효능의 생체내 연구 결과를 도시한다. hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA가 PA-1 난소 암종 세포가 피하 접종된 마우스의 그룹(n=6)에 도입되었다. hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA의 한 용량(1 mg/kg 3 mg/kg 또는 10 mg/kg)이 접종 후 제25일에(화살표로 도시됨) 마우스에 제공되었고, 동물들은 최대 60일 동안 종양 용적에 대해 평가되었다.
도 19는 A375.S2 흑색종 세포에 대한 hmAb-C-DUBA의 효능의 생체내 연구 결과를 도시한다. hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA가 A375.S2 흑색종 세포가 피하 접종된 마우스의 그룹(n=7)에 도입되었다. hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA의 한 용량(1 mg/kg 또는 3 mg/kg)이 접종 후 제25일에(화살표로 도시됨) 마우스에 제공되었고, 동물들은 최대 60일 동안 종양 용적에 대해 평가되었다.
도 20a-20d는 MDA-MB468 유방 암종 세포의 지방체 이종이식편에 대한 hmAb-C-DUBA의 효능의 생체내 연구 결과를 도시한다. hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA가 포유류 지방체에 MDA-MB468 유방 암종 세포의 접종 후 제70, 74 및 78일에 마우스의 그룹에 복강내 투여되었다. 제70일에 hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA의 한 용량(3 mg/ kg 또는 6 mg/kg의 단일 용량) 또는 제70, 74 및 78일에(화살표로 도시됨) 3 mg/kg의 3회 용량이 접종 후 제공되었고, 동물들은 최대 110일 동안 종양 용적에 대해 평가되었다. 도 20a는 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA 6 mg/kg(단일 용량)에 대한 결과를 도시한다. 도 20b는 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA 3 mg/kg(단일 용량)에 대한 결과를 도시한다. 도 20c는 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA 3 mg/kg(3회 용량)에 대한 결과를 도시한다. 도 20d는 모든 결과를 하나의 그래프에 도시한다.
도 21a-21d는 PA-1 난소 암종 세포의 피하 이식된 이종이식편에 대한 hmAb-C-DUBA의 효능의 생체내 연구 결과를 도시한다. hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA는 접종 후 제24일에 복강내 투여되거나(3 mg/kg, 6 mg/kg 또는 10 mg/kg의 단일 용량), 또는 10 mg/kg hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA 2회 용량(접종 후 제24일 및 제28일에) 또는 6 mg/kg hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA 4회 용량(접종 후 제24, 28, 31 및 35일에)이 투여되었다. 동물들은 최대 70일 동안 종양 용적에 대해 평가되었다. 도 21a는 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA 10 mg/kg(단일 또는 중복 용량)에 대한 결과를 도시한다. 도 21b는 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA 6 mg/kg(단일 또는 4회 용량)에 대한 결과를 도시한다. 도 21c는 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA 3 mg/kg(단일 용량)에 대한 결과를 도시한다. 도 21d는 모든 결과를 하나의 그래프에 도시한다.
도 22는 마우스에 chmAb-C-DUBA를 투여한 약동학을 도시한다. 이 도면은 3 mg/kg(n=3)에서 chmAb-C-DUBA의 총 인간 IgG 및 무손상 ADC를 도시한다.
도 23a-23b는 사이노몰거스 원숭이에 hmAb-C-DUBA를 투여한 약동학을 도시한다. 이 도면은 1 mg/kg(1 수컷; 1 암컷), 3 mg/kg(1 수컷; 1 암컷), 10 mg/kg(1 수컷; 1 암컷) 또는 27 mg/kg(2 수컷; 2 암컷))에서 hmAb-C-DUBA의 총 인간 IgG(도 23a) 및 무손상 ADC(도 23b)를 도시한다.
본 발명은 인간 및 비-인간 B7-H3에 결합할 수 있는 신규 B7-H3-결합 분자, 및 특히 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰거스 원숭이)의 B7-H3과 교차반응하는 이러한 분자에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 인간화된 및/또는 수혜 대상에 투여시 감소된 면역원성을 나타내도록 탈면역화된 가변 경쇄 및/또는 가변 중쇄(VH)를 포함하는 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 특히 (i) 이러한 B7-H3-결합 가변 도메인 및 (ii) 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프에 결합할 수 있는 도메인을 포함하는, 이중특이적 디아바디, BiTe, 이중특이적 항체, 3가 결합 분자 등을 비롯한, 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 B7-H3-결합 분자 중 어느 것을 함유하는 제약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 B7-H3-결합 분자 중 어느 것의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 적어도 하나의 약물 부분에 콘쥬게이트된 인간화된 항-인간 B7-H3 항체의 인간 B7-H3 결합 도메인을 포함하는 분자에 관한 것이다("B7-H3-ADC"). 본 발명은 또한 이러한 B7-H3-ADC를 함유하는 제약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 B7-H3-ADC 중 어느 것의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 적어도 하나의 약물 부분에 콘쥬게이트된 인간화된 항-인간 B7-H3 항체의 인간 B7-H3 결합 도메인을 포함하는 분자에 관한 것이다(B7-H3-ADC). 본 발명은 또한 이러한 B7-H3-ADC를 함유하는 제약학적 조성물, 및 암 및 다른 질환 및 상태의 치료에서 이러한 B7-H3-ADC 중 어느 것의 사용을 수반하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 B7-H3-ADC는 아래의 식을 포함한다:
Ab-(LM)m-(D)n,
여기서:
Ab는 인간화된 가변 중쇄(VH) 도메인 및 인간화된 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 B7-H3에 결합하는 항체이거나, 또는 그것의 B7-H3-결합 단편이고;
D는 세포독성 약물 부분이고;
LM은 Ab와 D를 공유 연결하는 결합 또는 링커 분자이고;
m은 0과 n 사이의 정수로서 B7-H3-ADC의 링커 분자의 수를 나타내고;
n은 1과 10 사이의 정수로서 B7-H3-ADC 분자에 공유 연결된 세포독성 약물 부분의 수를 표시한다.
I. 항체 및 그것들의 결합 도메인
본 발명의 항체는 면역글로불린 분자의 가변 도메인에 위치한, 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해, 탄수화물, 폴리뉴클레오타이드, 지질, 폴리펩타이드 등과 같은 표적에 특이적 결합할 수 있는 면역글로불린 분자이다. 따라서, 본 발명의 B7-H3-ADC 분자는 B7-H3에 결합하는 항체 또는 그것의 B7-H3-결합 단편을 포함한다. 본원에서 사용된 용어 "항체" 및 "항체들"은 단클론성 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화된 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 다클론성 항체, 낙타화된 항체, 단쇄 Fv(scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 이황화물-결합 이중특이적 Fv(sdFv), 인트라바디 및 상기의 것들 중 어느 것의 에피토프-결합 단편을 말한다. 특히, 용어 "항체"는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적으로 활성인 단편들, 즉 에피토프-결합 부위를 함유하는 분자들을 포함한다. 면역글로불린 분자들은 임의의 종류(예컨대 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예컨대 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다. 항체는 이러한 분자 상에 특정 도메인 또는 부분 또는 입체형태("에피토프")의 존재로 인해 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 비-단백질 분자에 면역특이적으로 결합할 수 있다(또는 "면역특이적 방식"으로 이러한 분자에 결합할 수 있다). 에피토프-함유 분자는 면역원성 활성을 가질 수 있어서, 동물에서 항체 생성 반응을 유도할 수 있고; 그런 분자는 "항원"으로 언급된다. 지난 수십 년 동안 항체의 치료 가능성에 다시 관심이 모아졌고, 항체는 생명공학-유도 약물의 선두 클래스의 일원이 되었다(Chan C.E. et al.(2009) "The Use Of Antibodies In The Treatment Of Infectious Diseases," Singapore Med. J. 50(7):663-666). 200개가 넘는 항체-기반 약물이 사용할 수 있게 승인되었거나 개발 중이다.
본원에서 사용된 대로, 항체, 디아바디 또는 다른 에피토프-결합 분자는 만약 그것이 더 빈번하게, 더 빠르게, 더 긴 기간으로 및/또는 더 큰 친화성으로 대안의 에피토프에 관하여 그 에피토프와 반응하거나 회합한다면 또 다른 분자(즉 에피토프)의 영역에 "면역특이적으로" 결합한다고 말할 수 있다. 예를 들어, 바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항체는 그것이 다른 바이러스 에피토프 또는 비-바이러스 에피토프에 면역특이적으로 결합한 것보다 더 큰 친화성, 결합력으로, 더 빠르게 및/또는 더 긴 기간 동안 이 바이러스 에피토프에 결합하는 항체이다. 또한, 이 정의를 판독함으로써, 예를 들어 제1 표적에 면역특이적으로 결합하는 항체(또는 모이어티 또는 에피토프)는 제2 표적에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 결합하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 이와 같이, "면역특이적 결합"은 반드시 (비록 그것이 포함할 수 있긴 하지만) 배타적인 결합을 필요로 하지는 않는다. 일반적으로, 그러나 반드시는 아니지만, 결합에 대한 언급은 "면역특이적" 결합을 의미한다. 두 분자는 만약 그런 결합이 그것들의 각각의 리간드에 결합하는 수용체와의 특이성을 나타낸다면, 서로 "물성특이적" 방식으로 결합할 수 있다고 말할 수 있다.
용어 "단클론성 항체"는 단클론성 항체가 항원의 선택적 결합에 관여하는 아미노산들(자연적으로 발생하는 또는 자연적으로 발생하지 않는)로 구성되는 균일한 항체 집단을 나타낸다. 단클론성 항체는 단일 에피토프(또는 항원성 부위)에 대해 지시되는, 고도로 특이적이다. 용어 "단클론성 항체"는 온전한 단클론성 항체들 및 전장 단클론성 항체들뿐만 아니라 그것들의 단편(예컨대 Fab, Fab', F(ab')2 Fv 등), 단쇄(scFv), 결합 분자, 그것들의 돌연변이, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화된 단클론성 항체, 키메라 단클론성 항체, 및 필요한 특이성 및 항원에 대한 결합 능력의 항원 인식 부위를 포함하는 면역글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 구성을 포함한다. 항체의 공급원 또는 그것이 만들어지는 방식(예컨대 하이브리도마, 파지 선택, 재조합체 발현, 형질전환 동물 등에 의한)과 관련하여 제한되게 하려는 의도는 없다. 용어는 전체 면역글로불린뿐 아니라 "항체"의 정의 하에서 상기 기술된 단편 등을 포함한다. 단클론성 항체의 제조 방법은 업계에 공지되어 있다. 이용될 수 있는 한 방법은 Kohler G. et al.(1975) "Continuous Cultures Of FusedCells Secreting Antibody Of Predefined Specificity," Nature 256:495-497의 방법 또는 그 변형이다. 전형적으로, 단클론성 항체는 마우스, 래트 또는 토끼에서 개발된다. 항체는 원하는 에피토프를 함유한 세포, 세포 추출물, 또는 단백질 제제의 면역원성 양으로 동물을 면역화시킴으로써 생산된다. 면역원은 1차 세포, 배양 세포주, 암성 세포, 단백질, 펩타이드, 핵산, 또는 조직일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 면역화에 사용된 세포는 면역원으로서 사용하기 전에 일정 기간(예를 들어, 적어도 24시간) 배양될 수 있다. 세포는 그 자체로 또는 비-변성 보조제, 예컨대 Ribi와 조합하여 면역원으로 사용될 수 있다(예를 들어, Jennings V.M.(1995) "Review of Selected Adjuvants Used in Antibody Production," ILAR J. 37(3):119-125 참조). 일반적으로, 세포는 면역원으로서 사용될 때 온전하게 유지되어야 하고 바람직하게는 살아있어야 한다. 온전한 세포는 파괴된 세포보다 면역화된 동물에 의해 항원이 더 잘 검출되게 할 수 있다. 변성 또는 엄격한 보조제, 예를 들어, 프로인트 보조제(Freud's adjuvant)의 사용은 세포를 파괴시킬 수도 있으며 그러므로 권장되지 않는다. 면역원은 주기적인 간격으로, 예컨대 격주로, 또는 매주 여러 번 투여될 수도 있거나, 또는 동물에서(예를 들어, 조직 재조합체에서) 생존력을 유지하는 방법으로 투여될 수도 있다. 대안으로, 기존의 단클론성 항체 및 원하는 병원성 에피토프에 대하여 면역특이적인 임의의 다른 동등한 항체가 서열분석되어 업계에 공지된 임의의 방법에 의해 재조합적으로 생산될 수 있다. 한 구체예에서, 이러한 항체가 서열분석된 다음 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현 또는 증식을 위해 벡터로 클로닝된다. 관심있는 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포 내 벡터에서 유지될 수 있으며 그 다음에 숙주 세포는 향후 사용을 위해 확장되어 냉동될 수 있다. 이러한 항체의 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체의 친화성, 또는 다른 특징을 개선하기 위해 본 발명의 단일특이적 또는 다중특이적 (예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적 및 사중특이적) 분자뿐 아니라 친화도 최적화된 키메라 항체, 인간화된 항체 및/또는 개화된(caninized) 항체를 생성하기 위한 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체를 인간화하는 데 있어 일반적인 원리는 항체의 항원-결합 부분의 기본 서열을 유지하는 한편, 항체의 비-인간 나머지를 인간 항체 서열로 바꿔치기하는 것을 포함한다.
천연 항체(예컨대 IgG 항체)는 두 중쇄와 복합체를 형성한 두 경쇄로 구성된다. 각각의 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인(CL)을 함유한다. 각각의 중쇄는 하나의 가변 도메인(VH), 3개의 불변 도메인(CH1, CH2 및 CH3), 및 CH1과 CH2 도메인 사이에 위치한 "힌지" 영역("H")을 함유한다. 천연 발생 면역글로불린(예컨대 IgG)의 기본적인 구조 단위는 그러므로 두 경쇄 및 두 중쇄를 가진 테트라머이고, 보통 약 150,000 Da의 당단백질로 표시된다. 각 사슬의 아미노-말단("N-말단") 부분은 주로 항원 인식에 기여하는 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산의 가변 도메인을 포함한다. 각 사슬의 카르복시-말단("C-말단") 부분은 불변 영역을 규정하는데, 경쇄는 하나의 단일 불변 도메인을 가지고 중쇄는 보통 3개의 불변 도메인 및 힌지 도메인을 가진다. 그러므로, IgG 분자의 경쇄의 구조는 n-VL-CL-c이고 IgG 중쇄의 구조는 n-VH-CH1-H-CH2-CH3-c이다(n 및 c는 각각 폴리펩타이드의 N-말단 및 C-말단을 나타낸다).
A. 항체 가변 도메인의 특징
IgG 분자의 가변 도메인은 에피토프와 접촉하는 잔기를 함유하는 상보성 결정 영역(CDR), 및 그런 접촉을 허용하기 위해 일반적으로 CDR 루프의 구조를 유지하고 위치를 결정하는, 프레임워크 분절("FR")로서 언급되는 비-CDR 분절로 구성된다(비록 특정 프레임워크 잔기가 또한 항원과 접촉할 수 있긴 하다). 그러므로, VL 및 VH 도메인은 구조 n-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4-c를 가진다. 항체의 경쇄의 제1, 제2 및 제3 CDR인(또는 그것들로서 작용할 수 있는) 폴리펩타이드는 본원에서 각각 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인으로 표시된다. 유사하게, 항체의 중쇄의 제1, 제2 및 제3 CDR인(또는 그것들로서 작용할 수 있는) 폴리펩타이드는 본원에서 각각 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인으로 표시된다. 그러므로, 용어 CDRL1 도메인, CDRL2 도메인, CDRL3 도메인, CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인은 단백질 안으로 통합될 때 단백질이 RMJS 단백질이 경쇄 및 중쇄를 가지는 항체이거나 디아바디이거나 또는 단쇄 결합 분자(예컨대 scFv, BiTe, 등)거나, 또는 다른 종류의 단백질이거나에 관계없이 특이적 에피토프에 결합할 수 있게 되는 것을 유발하는 폴리펩타이드를 나타낸다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "에피토프-결합 단편"은 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있는 분자의 단편을 의미한다. 에피토프-결합 단편은 항체의 CDR 도메인을 임의의 1, 2, 3, 4 또는 5개 함유할 수 있거나, 또는 항체의 CDR 도메인을 6개 전부 함유할 수 있고, 이러한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있긴 하지만, 이러한 항체와 상이한 이러한 에피토프를 향한 면역특이성, 친화성 또는 선택성을 나타낼 수 있다. 그러나, 바람직하게, 에피토프-결합 단편은 이러한 항체의 6개의 모든 CDR 도메인을 함유할 것이다. 항체의 에피토프-결합 단편은 단일 폴리펩타이드 사슬(예컨대 scFv)일 수 있거나, 또는 각각 아미노 말단 및 카르복시 말단을 가지는 둘 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다(예를 들어, 디아바디, Fab 단편, F(ab')2 단편 등). 구체적으로 주지되지 않는다면, 본원에서 설명된 단백질 분자의 도메인들의 순서는 "N-말단에서 C-말단" 방향이다.
본 발명은 특히 이 발명의 인간화된 항-B7-H3-VL 및/또는 VH 도메인을 포함하는 단쇄 가변 도메인 단편("scFv") 및 그것을 포함하는 다중특이적 결합 분자를 포함한다. 단쇄 가변 도메인 단편은 짧은 "링커" 펩타이드를 사용하여 함께 연결된 VL 및 VH 도메인을 포함한다. 이러한 링커는 추가의 기능을 제공하도록, 예컨대 약물의 부착을 허용하도록 또는 고체 담지체(support)에의 부착을 허용하도록 변형될 수 있다. 단쇄 변이체는 재조합 또는 합성 방식으로 생성될 수 있다. scFv의 합성 제조에서는 자동화된 합성장치가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 제조에서는 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포, 진핵생물, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포, 또는 원핵생물, 예컨대 이. 콜리(E. coli)에 도입될 수 있다. 관심의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드들의 라이게이션과 같은 통상의 조작에 의해 제조될 수 있다. 결과의 scFv는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 분리될 수 있다.
또한, 본 발명은 특히 본 발명의 B7-H3 항체의 인간화된 변이체의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3, 또는 VL 도메인 및/또는 VH 도메인, 뿐만 아니라 그것을 포함하는 다중특이적 결합 분자를 포함한다. 용어 "인간화된" 항체는 일반적으로 재조합 기법을 사용하여 제조되는, 비-인간 종으로부터의 면역글로불린의 에피토프-결합 부위 및 인간 면역글로불린의 구조 및/또는 서열에 기초한 분자의 나머지 면역글로불린 구조를 가진 키메라 분자를 나타낸다. 본 발명의 항-B7-H3 항체는 특히 항체 mAb-A, mAb-B, mAb-C 또는 mAb-D의 인간화된, 키메라 또는 개화된 변이체를 포함한다. 이러한 항체들의 가변 도메인의 폴리뉴클레오타이드 서열은 그런 유도체를 생성하고 그런 항체들의 친화성 또는 다른 특징을 개선하기 위하여 유전자 조작에 사용될 수 있다. 항체를 인간화하는데 있어서 일반적인 원칙은 항체의 에피토프-결합 부분의 기본 서열을 유지하는 한편, 항체의 비-인간 나머지를 인간 항체 서열과 바꾸는 것을 포함한다. 단클론성 항체를 인간화하는 데에는 일반적으로 네 단계가 있다. 이것들은 다음과 같다: (1) 시작 항체 경쇄 및 중쇄 가변 도메인의 뉴클레오타이드 및 예상된 아미노산 서열을 결정하는 단계 (2) 인간화된 항체 또는 개화된 항체를 설계하는 단계, 즉, 인간화 또는 개화 과정 중에 어떤 항체 프레임워크 영역을 사용할지를 결정하는 단계 (3) 실제 인간화 또는 개화 방법/기법 및 (4) 인간화된 항체의 트랜스펙션 및 발현 단계. 예를 들어 미국특허 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 및 6,331,415 참조.
에피토프-결합 부위는 불변 도메인 위에 융합된 완전한 가변 도메인 또는 적절한 프레임워크 영역에 이식된 이러한 가변 도메인의 상보성 결정 영역(CDR)만을 포함할 수 있다. 에피토프-결합 도메인은 야생형이거나 또는 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 변형될 수 있다. 이것은 인간 개체에서 면역원으로서 불변 영역을 제거하지만 외래 가변 도메인에 대한 면역 반응의 가능성은 남는다(LoBuglio A.F. et al.(1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 86:4220-4224). 다른 접근법은 인간-유래 불변 영역을 제공하는 것뿐만 아니라, 가능한 인간 형태에 가깝도록 가변 영역을 재형상화하기 위해 가변 도메인을 변형시키는 것에도 초점을 맞추고 있다. 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 도메인은 주어진 종에서 상대적으로 보존되어 있고 추정상 CDR에 대한 스캐폴딩(scaffolding)을 제공하는 4개의 프레임워크 영역(FR)에 의해 플랭킹된, 문제의 항원에 반응하여 달라지고 결합 능력을 결정하는 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 함유한 것으로 알려져 있다. 비-인간 항체가 특정 항원에 대하여 제조될 때, 가변 도메인은 변형될 인간 항체에 존재하는 FR 상에 비-인간 항체로부터 유래된 CDR을 이식함으로써 "재형상화" 또는 "인간화"될 수 있다. 다양한 항체에 대한 이 접근법의 적용은 문헌에서 보고되었다: Sato K. et al.(1993) Cancer Res 53:851-856. Riechmann L. et al.(1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen M. et al.(1988) "Reshaping Human-Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity" Science 239:1534-1536; Kettle-borough C.A. et al.(1991) "Humanization Of A Mouse Monoclonal Antibody By CDR-Grafting: The Importance Of Framework Residues On Loop Conformation," Protein Engineering 4:773-3783; Maeda H. et al.(1991) "Construction Of Res-haped HumanAntibodies With HIV-Neutralizing Activity," HumanAntibodies Hybri-doma 2:124-134; Gorman S.D. et al.(1991) "Reshaping A Therapeutic CD4 Anti-body," Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 88:4181-4185; Tempest P.R. et al.(1991) "Reshaping A Human Monoclonal Antibody To Inhibit HumanRespiratory Syncytial Virus Infection in vivo," Bio/Technology 9:266-271; Co M.S. et al.(1991) "Humanized Antibodies For Antiviral Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 88:2869-2873; Carter P. et al.(1992) "Humanization Of An Anti-p185her2 Anti-body For HumanCancer Therapy," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89:4285-4289; 및 Co M.S. et al.(1992) "Chimeric And HumanizedAntibodies With Specificity For The CD33 Antigen," J. Immunol. 148:1149-1154. 일부 구체예에서, 인간화된 항체는 모든 CDR 서열(예를 들어, 마우스 항체의 6개의 CDR 모두를 함유한 인간화된 마우스 항체)을 보존하고 있다. 다른 구체예에서, 인간화된 항체는 원래의 항체와 비교하여 서열이 상이한 하나 이상의 CDR(1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)을 갖는다.
설치류 또는 변형된 설치류 가변 도메인 및 인간 불변 도메인에 융합된 관련 상보성 결정 영역(CDR)을 갖는 키메라 항체를 포함하여, 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 에피토프-결합 부위를 포함하는 많은 "인간화된" 항체 분자가 설명되어 있다(예를 들어, Winter et al.(1991) "Man-made Antibodies," Nature 349:293-299; Lobuglio et al.(1989) "Mouse/Human Chimeric Monoclonal Antibody In Man: Kinetics And Immune Response," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:4220-4224 (1989), Shaw et al.(1987) "Characterization Of A Mouse/Human Chimeric Mono-clonal Antibody (17-1A) To A Colon Cancer Tumor-AssociatedAntigen," J Immunol 138:4534-4538 및 Brown et al.(1987) "Tumor-SpecificGenetically Engineered Murine/HumanChimeric Monoclonal Antibody," Cancer Res. 47:3577-3583 참조). 다른 참고문헌은 적절한 인간 항체 불변 도메인과의 융합 전에 인간 지지 프레임워크 영역(FR)에 이식된 설치류 CDR을 설명한다(예를 들어, Riechmann L. et al.(1988) "Reshaping Human Antibodies for Therapy," Nature 332:323-327; Verhoeyen M. et al.(1988) "Reshaping Human Antibodies: Grafting An Antilysozyme Activity," Science 239:1534-1536; 및 Jones et al.(1986) "Replacing The Complementarity-Determining Regions In A HumanAntibody With Those From A Mouse," Nature 321: 522-525 참조). 또 다른 참고문헌은 재조합으로 덧붙여진 설치류 프레임워크 영역에 의해 지지되는 설치류 CDR을 설명한다. 예를 들어, 유럽특허 공개 519,596 참조. 이 "인간화된" 분자들은 인간 수혜자에서 상기 모이어티의 치료적 적용의 기간 및 유효성을 제한하는, 설치류 항-인간 항체 분자에 대한 원치않는 면역학적 반응을 최소화하도록 설계된다. 이용될 수 있는 다른 항체 인간화 방법은 Daugherty et al.(1991) "Polymerase Chain Reaction Facilitates The Cloning, CDR-Grafting, And Rapid Expression Of A Murine Monoclonal Antibody Directed Against The CD18 Component Of Leukocyte Integrins," Nucl.Acids Res. 19:2471-2476 및 미국특허 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 및 5,866,692에서 개시된다.
B. 항체 불변 도메인의 특징
1. 경쇄의 불변 도메인
상기 나타낸 대로, 항체의 각 경쇄는 가변 도메인(VL)과 불변 도메인(CL)을 함유한다.
바람직한 CL 도메인은 인간 IgG CL 카파 도메인이다. 예시적인 인간 CL 카파 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:1)이다:
Figure pct00005
대안으로, 예시적인 CL 도메인은 인간 IgG CL 람다 도메인이다. 예시적인 인간 CL 람다 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:2)이다:
Figure pct00006
2. 중쇄의 불변 도메인
상기 나타낸 대로, 항체의 중쇄는 CH1, 힌지 도메인, CH2 및 CH3 불변 도메인을 포함할 수 있다. 항체의 두 중쇄의 CH1 도메인은 항체의 경쇄의 "CL" 불변 영역과 복합체를 이루며, 중간의 힌지 도메인을 통해 중쇄 CH2 도메인에 부착된다.
예시적인 CH1 도메인은 인간 IgG1 CH1 도메인이다. 예시적인 인간 IgG1 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:3)이다:
Figure pct00007
예시적인 CH1 도메인은 인간 IgG2 CH1 도메인이다. 예시적인 인간 IgG2 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:4)이다:
Figure pct00008
예시적인 CH1 도메인은 인간 IgG3 CH1 도메인이다. 예시적인 인간 IgG3 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:5)이다:
Figure pct00009
예시적인 CH1 도메인은 인간 IgG4 CH1 도메인이다. 예시적인 인간 IgG4 CH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:6)이다:
Figure pct00010
예시적인 힌지 도메인은 인간 IgG1 힌지 도메인이다. 예시적인 인간 IgG1 힌지 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:7)이다: EPKSCDKTHTCPPCP
다른 예시적인 힌지 도메인은 인간 IgG2 힌지 도메인이다. 예시적인 인간 IgG2 힌지 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:8)이다: ERKCCVECPPCP
다른 예시적인 힌지 도메인은 인간 IgG3 힌지 도메인이다. 예시적인 인간 IgG3 힌지 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:9)이다:
Figure pct00011
다른 예시적인 힌지 도메인은 인간 IgG4 힌지 도메인이다. 예시적인 인간 IgG4 힌지 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:10)이다: ESKYGPPCPSCP. 본원에서 설명된 대로, IgG4 힌지 도메인은 S228P 치환과 같은 안정화 돌연변이를 포함할 수 있다. 예시적인 S228P-안정화된 인간 IgG4 힌지 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:11)이다: ESKYGPPCPPCP.
항체의 두 중쇄의 CH2 및 CH3 도메인은 상호작용하여 "Fc 도메인"을 형성하고, 이것은 제한은 아니지만 Fc 감마 수용체(FcγR)를 포함하는 세포 Fc 수용체에 의해 인식되는 도메인이다. 본원에서 사용된 대로, 용어 "Fc 도메인"은 IgG 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. Fc 도메인은 그것의 아미노산 서열이 다른 IgG 이소타입(isotype)에 비해 특정 이소타입과 가장 상동성인 경우 그 특정한 IgG 이소타입, 부류 또는 하위부류를 가진다고 말한다. 진단에서 이들의 공지된 사용에 더하여, 항체는 치료제로서도 유용한 것으로 밝혀졌다.
본 명세서 전체에서 IgG 중쇄의 불변 영역의 잔기의 넘버링은 본원에 참고로 분명히 포함된, Kabat et al, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, H1, MD(1991)("Kabat")에서와 같은 EU 인덱스를 따른다. 용어 "Kabat에서와 같은 EU 인덱스"는 인간 IgG1 EU 항체의 불변 도메인의 넘버링을 말한다. 면역글로불린의 성숙한 중쇄와 경쇄의 가변 도메인으로부터의 아미노산은 그 사슬에서 아미노산의 위치에 의해 지정된다. Kabat은 항체에 대해 수많은 아미노산 서열을 설명했고 각 하위군에 대해 아미노산 컨센서스 서열을 확인했고 각 아미노산에 잔기 번호를 부여했으며, CDR이 Kabat에 의해 정의된 대로 확인된다(Chothia C. & Lesk A. M.((1987) "Canonical structures for the hyper-variable regions of immunoglobulins," J. Mol. Biol. 196:901-917에 의해 정의된 CDRH1은 먼저 5개 잔기에서 시작한다는 것이 이해될 것이다). Kabat의 넘버링은 해당 항체를 보존된 아미노산을 참조하여 Kabat의 컨센서스 서열 중 하나와 정렬함으로써 그의 개론에 포함되지 않은 항체로 확장될 수 있다. 잔기 번호를 부여하는 이 방법은 본 분야의 표준이 되었으며, 키메라 또는 인간화된 변이체를 포함하는 상이한 항체에서 동등한 위치에 있는 아미노산을 쉽게 확인한다. 예를 들어, 인간 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산은 마우스 항체 경쇄의 위치 50에 있는 아미노산과 동등한 위치를 점유한다.
예시적인 인간 IgG1의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:12)이고, Kabat에서 제시된 대로 EU 인덱스에 의해 넘버링되며, 여기서 X는 리신(K)이거나 부재한다:
Figure pct00012
예시적인 인간 IgG2의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:13)이고, Kabat에서 제시된 대로 EU 인덱스에 의해 넘버링되며, 여기서 X는 리신(K)이거나 부재한다:
Figure pct00013
예시적인 인간 IgG3의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:14)이고, Kabat에서 제시된 대로 EU 인덱스에 의해 넘버링되며, 여기서 X는 리신(K)이거나 부재한다:
Figure pct00014
예시적인 인간 IgG4의 CH2-CH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:15)이고, Kabat에서 제시된 대로 EU 인덱스에 의해 넘버링되며, 여기서 X는 리신(K)이거나 부재한다:
Figure pct00015
항체 불변 영역 내 많은 상이한 위치(예를 들어, Kabat에서 제시된 EU 인덱스에 의해 넘버링된 대로, 제한은 아니지만, 위치 270, 272, 312, 315, 356 및 358을 포함하는 Fc 위치)에서 다형성이 관찰되었으며, 따라서 제시된 서열과 선행 기술의 서열 사이에 약간의 차이가 존재할 수 있다. 인간 면역글로불린의 다형성 형태는 잘 특성화되어 있다. 현재, 18개의 Gm 알로타입(allotype)이 공지되어 있다: G1m(1, 2, 3, 17) 또는 G1m(a, x, f, z), G2m(23) 또는 G2m(n), G3m(5, 6, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 21, 24, 26, 27, 28) 또는 G3m(b1, c3, b3, b0, b3, b4, s, t, g1, c5, u, v, g5)(Lefranc et al. "The HumanIgG Subclasses: Molecular Analysis Of Structure, FunctionAnd Regulation," Pergamon, Oxford, pp. 43-78(1990); Lefranc G. et al., 1979, Hum. Genet.: 50, 199-211). 구체적으로 본 발명의 항체는 임의의 면역글로불린 유전자의 임의의 알로타입, 이소알로타입, 또는 하플로타입(haplotype)을 포함할 수 있고, 본원에서 제공된 서열의 알로타입, 이소알로타입 또는 하플로타입에 제한되는 것은 아닌 것으로 생각된다. 게다가, 일부 발현 시스템에서 CH3 도메인의 C-말단 아미노산 잔기(상기 볼드체)는 번역 후 제거될 수 있다. 따라서, CH3 도메인의 C-말단 잔기는 본 발명의 B7-H3-결합 분자(B7-H3-ADC 분자를 포함함)에서 선택적인 아미노산 잔기이다. 구체적으로, CH3 도메인의 C-말단 잔기가 없는 B7-H3-결합 분자(B7-H3-ADC 분자를 포함함)가 본 발명에 포함된다. 또한, CH3 도메인의 C-말단 리신 잔기를 포함하는 이러한 구성물이 본 발명에 구체적으로 포함된다.
전통적인 면역 기능에서 항체-항원 복합체와 면역 시스템의 세포의 상호작용은 항체 의존적 세포독성, 비만 세포 탈과립화 및 식세포작용과 같은 이펙터 기능에서부터 림프구 증식 및 항체 분비의 조절과 같은 면역조정 신호에 이르는 범위의 광범위한 반응을 가져온다. 이들 상호작용은 모두 항체 또는 면역 복합체의 Fc 도메인과 조혈세포 상의 전문화된 세포 표면 수용체, 및 특히 많은 종류의 면역 시스템 세포(예를 들어, B 림프구, 소포성 수지상세포, 자연살해 세포, 대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구 및 비만 세포)의 표면에서 발견된 수용체(단독으로 "Fc 감마 수용체", "FcγR", 및 집합적으로 "FcγRs"라고 한다)의 결합을 통해서 개시된다. 이러한 수용체는 "세포외" 부분(이것은 따라서 Fc 도메인과 라이게이션할 수 있다), "경막" 부분(이것은 세포막을 통해서 연장된다), 및 "세포질" 부분(세포 내부에 위치된다)을 가진다.
항체 및 면역 복합체에 의해 촉발된 세포 반응의 다양성은 세 가지 Fc 수용체: FcγRI(CD64), CD32A(FcγRIIA), FcγRIIB(CD32B), CD16A(FcγRIIIA) 및 CD16B (FcγRIIIB)의 구조적 이종성으로 인한 결과이다. FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A) 및 FcγRIII(CD16)은 활성화 수용체로서 이들과 Fc 도메인의 라이게이션은 면역 시스템을 활성화하거나 면역 반응을 증진시킨다. 반대로, FcγRIIB(CD32B)는 억제 수용체이다; Fc 도메인과의 라이게이션은 면역 반응을 억제하거나 기존의 면역 반응을 둔화시킨다. 게다가, Fc 도메인과 신생아 Fc 수용체(FcRn)의 상호작용은 엔도솜으로부터 세포 표면으로 IgG 분자의 재순환을 매개하고 그것을 혈액으로 방출한다. IgG1(SEQ ID NO:12), IgG2(SEQ ID NO:13), IgG3(SEQ ID NO:14) 및 IgG4(SEQ ID NO: 15)의 예시적인 야생형 Fc 도메인의 아미노산 서열은 상기 제시된다.
CD16은 활성화 Fc 수용체, FcγRIIIA(CD16A) 및 FcγRIIIB(CD16B)의 유전자명이다. CD16은 호중구, 호산구, 자연살해(NK) 세포 및 조직 대식세포에 의해 발현되며 응집된 모노머가 아닌 인간 IgG에 결합한다(Peltz G.A. et al.(1989) "Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromo-somal Locus Of Two Fc Receptors For IgG," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86(3):1013-1017; Bachanova V. et al.(2014) "NK Cells In Therapy Of Cancer," Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141; Miller J.S.(2013) "Therapeutic Applica-tions: Natural Killer Cells In The Clinic," Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253; Youinou P. et al.(2002) "Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Diseases," Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19; Peipp M. et al.(2002) "Bispecific Antibodies Targeting Cancer Cells," Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511). 이들 수용체는 IgG 항체의 Fc 부분에 결합함으로써 사이토카인의 방출을 촉발한다. 이러한 항체가 외래 세포(예를 들어, 종양 세포)의 항원에 결합된다면, 이러한 방출은 종양 세포의 살해를 매개한다. 이러한 살해는 항체-의존적이기 때문에 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC)이라고 명명된다.
CD32A(FcγRIIA)(Brandsma A.M.(2015) "Fc Receptor Inside-Out Signaling And Possible Impact On Antibody Therapy," Immunol Rev. 268(1):74-87; van Sorge N.M. et al.(2003) "Fcgammar Polymorphisms: Implications For Function, Disease Susceptibility And Immunotherapy," Tissue Antigens 61(3):189-202; Selvaraj P. et al.(2004) "Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors," Immunol. Res. 29(1-3):219-230) 및 CD64(FcγRI)(Lu S. et al.(2015) "Structural Mechanism Of High Affinity FcγRI recognition Of Immunoglobulin G," Immunol. Rev. 268(1):192-200; Swisher J.F. et al.(2015) "The Many Faces Of FcγRI: Implications For Therapeutic Antibody Function," Immunol. Rev. 268(1):160-174; Thepen T. et al.(2009) "Fcgamma Receptor 1 (CD64), A Target Beyond Cancer," Curr. Pharm. Des. 15(23):2712-2718; Rouard H. et al.(1997) "Fc Receptors As Targets For Immunotherapy," Int. Rev. Immunol. 16(1-2):147-185)는 대식세포, 호중구, 호산구 및 수지상세포에서 발현되는 활성화 Fc 수용체이다(그리고 CD32A는 혈소판과 랑게르한스 세포에서도 발현된다). 반면에, CD32B(FcγRIIB)는 B 림프구(대식세포, 호중구 및 호산구) 상의 억제 Fc 수용체이다(Stop-forth R.J. et al.(2016) "Regulation of Monoclonal Antibody Immunotherapy by FcγRIIB," J. Clin. Immunol. [2016 Feb 27 Epub], pp. 1-7; Bruhns P. et al. (2009) "Specificity And Affinity Of Human Fcgamma Receptors And Their Poly-morphic Variants For Human IgG Subclasses," Blood. 113(16):3716-3725; White A.L. et al.(2014) "FcγRIIB As A Key Determinant Of Agonistic Antibody Effi-cacy," Curr. Top. Microbiol. Immunol. 382:355-372; Selvaraj P. et al.(2004) "Functional Regulation Of Human Neutrophil Fc Gamma Receptors," Immunol. Res. 29(1-3):219-230).
정반대 기능을 매개하는 상이한 FcγR들의 능력은 이들의 구조적 차이를 반영하며, 특히 FcγR이 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프("ITAM") 또는 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프("ITIM")를 지니는 지의 여부를 반영한다. 이들 구조물에 상이한 세포질 효소의 충원은 FcγR-매개 세포 반응 성과를 좌우한다. ITAM-함유 FcγR은 FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA를 포함하고, Fc 도메인(예를 들어, 면역 복합체에 존재하는 응집된 Fc 도메인)에 결합되었을 때 면역 시스템을 활성화한다. FcγRIIB는 현재 유일하게 알려진 천연 ITIM-함유 FcγR이다; 이것은 응집된 Fc 도메인에 결합되었을 때 면역 시스템을 둔화시키거나 억제하는 작용을 한다. 인간 호중구는 FcγRIIA 유전자를 발현한다. 면역 복합체 또는 특이적 항체 교차결합을 통한 FcγRIIA 군집화(clustering)는 ITAM 인산화를 촉진하는 수용체-관련 키나아제와 함께 ITAM을 응집시키는 역할을 한다. ITAM 인산화는 Syk 키나제에 대한 도킹(docking) 부위로서 작용하며, 이것의 활성화는 하류 기질(예를 들어, PI3K)의 활성화를 가져온다. 세포 활성화는 전염증성 매개인자의 방출을 초래한다. FcγRIIB 유전자는 B 림프구에서 발현된다; 그것의 세포외 도메인은 FcγRIIA와 96% 동일하고 구별 불가능한 방식으로 IgG 복합체에 결합한다. FcγRIIB의 세포질 도메인에 ITIM의 존재는 FcγR의 이런 억제 하위부류를 한정한다. 최근에 이 억제의 분자적 기초가 확립되었다. FcγR의 활성화와 함께 동시-라이게이션되었을 때, FcγRIIB의 ITIM은 인산화되고 이노시톨 폴리포스페이트 5'-포스파타아제의 SH2 도메인(SHIP)을 유인하며, 이것은 ITAM-함유 FcγR-매개 티로신 키나아제 활성화의 결과로서 방출된 포스포이노시톨 메신저를 가수분해하여, 결과적으로 세포내 Ca++의 유입을 방지한다. 따라서, FcγRIIB의 교차결합은 FcγR 라이게이션에 대한 활성화 반응을 둔화시키고 세포 반응성을 억제하며, B-세포 활성화를 중단시키고, 따라서 B-세포 증식 및 항체 분비가 중단된다.
II. 이중특이적 항체, 다중특이적 디아바디 및 DART® 디아바디
항체가 항원의 에피토프에 결합하는 능력은 항체의 VL 및 VH 도메인의 존재 및 아미노산 서열에 의존한다. 항체의 경쇄와 중쇄의 상호작용, 및 특히 그것의 VL과 VH 도메인의 상호작용은 IgG와 같은 천연 항체의 2개의 에피토프-결합 부위 중 하나를 형성한다. 천연 항체는 오직 하나의 에피토프 종에 결합할 수 있지만(즉, 이들은 단일 특이적이다), 이들은 해당 종의 다중 카피에 결합할 수 있다(즉, 이가 또는 다가를 나타낸다).
항체의 기능성은 2개의 별개의 분리된 항원(또는 동일한 항원의 상이한 에피토프)에 동시에 결합할 수 있는 다중특이적 항체-기반 분자를 생성함으로써 및/또는 동일한 에피토프 및/또는 항원에 대해 더 높은 원자가(즉, 2개 이상의 결합 부위)를 가진 항체-기반 분자를 생성함으로써 향상될 수 있다.
천연 항체를 능가하는 능력을 가진 분자를 제공하기 위해, 매우 다양한 재조합 이중특이적 항체 형식이 개발되었으며(예를 들어, PCT 공보 WO 2008/003116, WO 2009/132876, WO 2008/003103, WO 2007/146968, WO 2009/018386, WO 2012/009544, WO 2013/070565), 이들의 대부분은 추가의 에피토프-결합 단편(예를 들어, scFv, VL, VH 등)을 항체 코어(IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM)에, 또는 그 안에 융합시키거나 다수의 에피토프-결합 단편(예를 들어, 2개의 Fab 단편 또는 scFv)을 융합시키기 위해 링커 펩타이드를 사용한다. 대안의 형식은 에피토프-결합 단편(예를 들어, scFv, VL, VH 등)을 다이머화 도메인, 예컨대 CH2-CH3 도메인 또는 대안의 폴리펩타이드에 융합시키기 위해 링커 펩타이드를 사용한다(WO 2005/070966, WO 2006 /107786A WO 2006/107617A, WO 2007/046893). PCT 공보 WO 2013/174873, WO 2011/ 133886 및 WO 2010/136172는 CL 및 CH1 도메인이 각각의 천연 위치에서 바뀌고 VL 및 VH 도메인이 다양화됨으로써(WO 2008/027236; WO 2010/108127) 둘 이상의 항원에 결합할 수 있게 된 삼중특이적 항체를 개시한다. PCT 공보 WO 2013/163427 및 WO 2013/119903은 결합 도메인을 포함하는 융합 단백질 애덕트를 함유하도록 CH2 도메인을 변형시키는 것을 개시한다. PCT 공보 WO 2010/028797, WO2010028796 및 WO 2010/028795는 3가 결합 분자를 형성하기 위해 Fc 도메인이 추가적인 VL 및 VH 도메인으로 대체된 재조합 항체를 개시한다. PCT 공보 WO 2003/025018 및 WO 2003 /012069는 개별 사슬이 scFv 도메인을 함유하는 재조합 디아바디를 개시한다. PCT 공보 WO 2013/006544는 단일 폴리펩타이드 사슬로서 합성된 다음 헤테로다이머 구조를 얻기 위해 단백질 가수분해되된 다가 Fab 분자를 개시한다. PCT 공보 WO 2014 /022540, WO 2013/003652, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2011/086091, WO 2008/024188, WO 2007/024715, WO 2007/075270, WO 1998/002463, WO 1992/022583 및 WO 1991/003493은 추가의 결합 도메인 또는 작용기를 항체 또는 항체 일부에 추가하는 것(예를 들어, 디아바디를 항체의 경쇄에 추가하는 것, 또는 추가의 VL 및 VH 도메인을 항체의 경쇄 및 중쇄에 추가하는 것, 또는 이종성 융합 단백질을 추가하거나 또는 다수의 Fab 도메인을 서로 연결하는 것)을 개시한다.
당업계는 추가로 둘 이상의 상이한 에피토프 종에 결합할 수 있다는 점에서(즉, 2가 또는 다가에 더하여 이중특이성 또는 다중특이성을 나타냄) 이러한 천연 항체와 상이한 디아바디를 생산하는 능력에 주목했다(예를 들어, Holliger et al. (1993) "'Diabodies': Small Bivalent And Bispecific Antibody Fragments," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 90:6444-6448; US 2004/0058400(Hollinger et al.); US 2004/0220388/WO 02/02781(Mertens et al.); Alt et al.(1999) FEBS Lett. 454(1-2):90-94; Lu D. et al.(2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280 (20):19665-19672; WO 02/02781(Mertens et al.); Olafsen T. et al.(2004) "Cova-lent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Applications," Protein Eng. Des. Sel. 17 (1):21-27; Wu A. et al.(2001) "Multimerization Of A Chimeric Anti-CD20 Single Chain Fv-Fv Fusion Protein Is Mediated Through Viable Domain Exchange," Protein Engineering 14(2):1025-1033; Asano et al.(2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683 J. Biochem. 76(8):992; Takemura S. et al.(2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding Sys-tem," Protein Eng. 13(8):583-588; Baeuerle P.A. et al.(2009) "Bispecific T-Cell Engaging Antibodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944 참조).
디아바디의 설계는 단쇄 가변 도메인 단편(scFv)이라고 알려진 항체 유도체를 기반으로 한다. 이러한 분자는 짧은 결합 펩타이드를 사용하여 경쇄 및/또는 중쇄 가변 도메인을 연결함으로써 제조된다. Bird et al.(1988)("Single-Chain Anti-gen-Binding Proteins," Science 242:423-426)은 한 가변 도메인의 카르복시 말단과 다른 가변 도메인의 아미노 말단 사이에 대략 3.5nm의 다리를 만드는 결합 펩타이드의 예를 설명한다. 다른 서열의 링커들이 설계되고 사용되었다(Bird et al. (1988) "Single-Chain Antigen-Binding Proteins," Science 242:423-426). 링커는 차례로 추가의 기능, 예컨대 약물의 부착 또는 고체 담지체에의 부착을 위해 변형될 수 있다. 단쇄 변이체는 재조합 또는 합성 방식으로 제조될 수 있다. scFv의 합성 제조를 위해 자동화된 합성장치가 사용될 수 있다. scFv의 재조합 제조를 위해 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 적합한 플라스미드가 적합한 숙주 세포, 진핵생물, 예컨대 효모, 식물, 곤충 또는 포유류 세포, 또는 원핵생물, 예컨대 이. 콜리에 도입될 수 있다. 관심의 scFv를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 폴리뉴클레오타이드들의 라이게이션과 같은 통상의 조작에 의해 제조될 수 있다. 결과의 scFv는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 분리될 수 있다.
이중특이적 결합 분자(예를 들어, 비-단일특이적 디아바디)의 제공은, 제한은 아니지만, 상이한 에피토프들을 발현하는 상이한 세포들을 동시-라이게이션 및/또는 동시-편재화하기에 충분한 "트랜스" 결합 능력 및/또는 동일한 세포에 의해 발현된 상이한 분자들을 동시-라이게이션 및/또는 동시-편재화하기에 충분한 "시스" 결합 능력을 포함하는, 항체를 능가하는 유의한 이점을 제공한다. 따라서, 이중특이적 결합 분자(예를 들어, 비-단일특이적 디아바디)는 치료법 및 면역진단을 포함하는 광범위한 용도를 가진다. 이중특이성은 다양한 용도에서 디아바디의 설계 및 조작에 큰 유연성을 허용하며, 이는 멀티머 항원에 대한 증진된 친화성, 상이한 항원들의 교차결합, 및 두 표적 항원의 존재에 따른 특이적 세포 타입에 대해 지시된 표적화를 제공한다. 증가된 원자가, 낮은 해리 속도 및 순환으로부터 빠른 클리어런스(작은 크기, ~50 kDa 이하의 디아바디에 대해)로 인해, 당업계에 알려진 디아바디 분자는 또한 종양 영상화 분야에서 특정한 용도가 밝혀졌다(Fitzgerald et al.(1997) "Improved Tumour Targeting By Disulphide Stabilized Diabodies Expr-essed In Pichia pastoris," Protein Eng. 10:1221-1225).
이중특이적 디아바디를 생성하는 능력은, 예를 들어 상이한 세포의 표면에 존재하는 수용체의 동시-라이게이션에 의해, 두 세포를 함께 동시-라이게이션하는데 있어 ("트랜스" 방식으로) 이들의 사용을 초래했다(예를 들어, 세포독성 T-세포와 종양 세포의 교차결합)(Staerz et al.(1985) "Hybrid Antibodies Can Target Sites For Attack By T Cells," Nature 314:628-631, 및 Holliger et al.(1996) "Specific Killing Of Lymphoma Cells By Cytotoxic T-Cells Mediated By A Bi-specific Diabody," Protein Eng. 9:299-305; Marvin et al.(2005) "Recombinant Approaches To IgG-Like Bispecific Antibodies," Acta Pharmacol. Sin. 26:649-658). 대안으로(또는 추가로), 이중특이적(또는 삼중- 또는 다중특이적) 디아바디는 동일한 세포의 표면에 존재하는 수용체 등과 같은 분자들을 동시-라이게이션하는데 ("시스" 방식으로) 사용될 수 있다. 상이한 세포 및/또는 수용체의 동시-라이게이션은 이펙터 기능 및/또는 면역 세포 신호화를 조정하는데 유용하다. 에피토프-결합 부위를 포함하는 다중특이적 분자(예를 들어, 이중특이적 디아바디)는 임의의 면역 세포의 표면 결정인자, 예컨대 CD2, CD3, CD8, CD16, T-세포 수용체(TCR), NKG2D 등에 대해 지시될 수 있으며, 이들은 T 림프구, 자연살해(NK) 세포, 항원 제시 세포 또는 다른 단핵 세포에서 발현된다. 특히, 면역 이펙터 세포 상에 존재하는 세포 표면 수용체에 대해 지시된 에피토프-결합 부위는 재지시된 세포 살해를 매개할 수 있는 다중특이적 결합 분자의 생성에 유용하다,
그러나, 상기 이점은 상당한 비용이 든다. 이러한 비-단일특이적 디아바디의 형성은 둘 이상의 별개의 상이한 폴리펩타이드의 성공적인 조립을 필요로 한다(즉, 이러한 형성은 디아바디가 상이한 폴리펩타이드 사슬 종들의 헤테로다이머화를 통해 형성되는 것이 필요하다). 이 사실은 동일한 폴리펩타이드 사슬의 호모다이머화를 통해 형성되는 단일특이적 디아바디와는 대조적이다. 비-단일특이적 디아바디를 형성하기 위해서는 적어도 2개의 유사하지 않은 폴리펩타이드(즉, 2개의 폴리펩타이드 종)가 제공되어야 하기 때문에, 그리고 이러한 폴리펩타이드의 호모다이머화는 비활성 분자를 초래하기 때문에(Takemura S. et al.(2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588), 이러한 폴리펩타이드의 생성은 동일한 종의 폴리펩타이드 간 공유결합을 방지하기 위한 방식으로(즉, 호모다이머화를 방지하도록) 달성되어야 한다(Takemura S. et al.(2000) "Construction Of A Diabody (Small Rec-ombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13 (8):583-588). 따라서, 당업계는 이러한 폴리펩타이드의 비-공유 회합을 교시했다(예를 들어, Olafsen et al.(2004) "Covalent Disulfide-Linked Anti-CEA Diabody Allows Site-Specific Conjugation And Radiolabeling For Tumor Targeting Appli-cations," Prot. Engr. Des. Sel. 17:21-27; Asano et al.(2004) "A Diabody For Cancer Immunotherapy And Its Functional Enhancement By Fusion Of Human Fc Domain," Abstract 3P-683, J. Biochem. 76(8):992; Takemura S. et al.(2000) "Construction Of A Diabody (Small Recombinant Bispecific Antibody) Using A Refolding System," Protein Eng. 13(8):583-588; Lu D. et al.(2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
그러나, 당업계는 비-공유 회합된 폴리펩타이드로 구성된 이중특이적 디아바디가 불안정하고 비-기능적 모노머로 쉽게 해리된다는 것을 알았다(예를 들어, Lu D. et al.(2005) "A Fully Human Recombinant IgG-Like Bispecific Antibody To Both The Epidermal Growth Factor Receptor And The Insulin-Like Growth Factor Receptor For Enhanced Antitumor Activity," J. Biol. Chem. 280(20):19665-19672 참조).
이 난관에 직면하여, 당업계는 DART® 디아바디라고 불리는 안정한, 공유결합된 헤테로다이머 비-단일특이적 디아바디를 개발하는데 성공했다; 예를 들어, 미국특허공개 2013-0295121, 2010-0174053, 2009-0060910; 유럽특허공개 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공보 WO 2012/162068; WO 2012/ 018687; WO 2010/080538; 및 Sloan D.D. et al.(2015) "Targeting HIV Reservoir in Infected CD4 T Cells by Dual-Affinity Re-targeting Molecules (DARTs) that Bind HIV Envelope and Recruit Cytotoxic T Cells," PLoS Pathog. 11(11): e1005233. doi: 10.1371/journal.ppat.1005233; Al Hussaini M. et al.(2015) "Targeting CD123 In AML Using A T-Cell Directed Dual-Affinity Re-Targeting (DART®) Platform," Blood pii: blood-2014-05-575704; Chichili G.R. et al. (2015) "A CD3xCD123 Bispecific DART For Redirecting Host T Cells To Myelo-genous Leukemia: Preclinical Activity And Safety In Nonhuman Primates," Sci. Transl. Med. 7(289):289ra82; Moore P.A. et al.(2011) "Application Of Dual Affinity Retargeting Molecules To Achieve Optimal Redirected T-Cell Killing Of B-Cell Lymphoma," Blood 117(17):4542-4551; Veri M.C. et al.(2010) "Thera-peutic Control Of B Cell Activation Via Recruitment Of Fcgamma Receptor IIb (CD32B) Inhibitory Function With A Novel Bispecific Antibody Scaffold," Arth-ritis Rheum. 62(7):1933-1943; Johnson S. et al.(2010) "Effector Cell Recruit-ment With Novel Fv-Based Dual-Affinity Re-Targeting Protein Leads To Potent Tumor Cytolysis And in vivo B-Cell Depletion," J. Mol. Biol. 399(3):436-449 참조. 이러한 디아바디는 공유결합으로 복합체가 형성된 둘 이상의 폴리펩타이드를 포함하고, 이황화물 결합이 형성되는 것을 허용함으로써 이러한 폴리펩타이드 사슬의 하나 이상의 쌍을 서로 공유 결합시키는 이용된 폴리펩타이드 종의 각각에 하나 이상의 시스테인 잔기를 조작해 넣는 것을 포함한다. 예를 들어, 이러한 구성물의 C-말단에 시스테인 잔기의 추가는 관련된 폴리펩타이드 사슬 간 이황화물 결합을 허용하고, 이는 디아바디의 결합 특징을 방해하지 않으면서 결과의 헤테로다이머를 안정화한다는 것이 밝혀졌다.
이러한 분자의 많은 변형이 설명되었으며(예를 들어, 미국특허 공개 2015/ 0175697; 2014/0255407; 2014/0099318; 2013/0295121; 2010/0174053, 2009/0060910 및 2007/0004909; 유럽특허공개 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221; EP 1868650; 및 PCT 공보 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538; WO 2006/113665 참조) 본원에서 제공된다.
"TandAbs"라고도 하는, 제한은 아니지만 4가 탠덤 항체를 포함하는 4가 분자가 바람직하지만 Fc는 필요하지 않은 용도를 위한 대안의 구성물이 당업계에 알려져 있으며(예를 들어, 미국특허 공개 2005-0079170, 2007-0031436, 2010-0099853, 2011-020667, 2013-0189263; 유럽특허 공개 EP 1078004, EP 2371866, EP 2361936 및 EP 1293514; PCT 공보 WO 1999/057150, WO 2003/025018, 및 WO 2013/013700 참조), 이것은 각각 VH1, VL2, VH2, 및 VL2 도메인을 지닌, 두 동일한 폴리펩타이드 사슬의 호모다이머화에 의해 형성된다.
최근, 2개의 디아바디-타입 결합 도메인과 하나의 비-디아바디-타입 도메인과 Fc 도메인을 통합한 3가 구조가 설명되었다(예를 들어 PCT 공보 WO 2015/184207 및 WO 2015/184203 참조). 이러한 3가 결합 분자는 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적 분자를 생성하는데 이용될 수 있다. 3개의 상이한 에피토프를 결합하는 능력은 증진된 능력을 제공한다.
III. 인간 B7-H3
인간 B7-H3은 "4Ig" 형태 및 "2Ig" 형태로 존재한다. 인간 B7-H3의 대표적인 "4Ig" 형태의 아미노산 서열(밑줄 친, 29개 아미노산 잔기 신호 서열을 포함함)은 NCBI Sequence NP_001019907에 의해 제공된다(SEQ ID NO: 16, 밑줄 친, 29개 아미노산 잔기 신호 서열):
Figure pct00016
인간 B7-H3의 "2Ig" 형태의 아미노산 서열은 인간 B7-H3의 "4Ig" 형태 내에 완전히 포함된다. 인간 B7-H3의 대표적인 "2Ig" 형태의 아미노산 서열(밑줄 친, 29개 아미노산 잔기 신호 서열을 포함함)은 NCBI Sequence NP_079516(SEQ ID NO:17)에 의해 제공된다:
Figure pct00017
특정 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-결합 분자(예를 들어, scFv, 항체, 이중특이적 디아바디 등)는 아래의 기준 중 어느 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개를 특징으로 한다:
(1) 암 세포의 표면에서 내인성 발현된 인간 B7-H3과 면역특이적으로 결합하는 능력;
(2) 비-인간 영장류 B7-H3(예를 들어, 사이노몰거스 원숭이의 B7-H3)과 특이적으로 결합;
(3) 1 nM 이하의 평형 결합 상수(KD)로 인간 B7-H3과 특이적으로 결합;
(4) 1 nM 이하의 평형 결합 상수(KD)로 비-인간 영장류 B7-H3과 특이적으로 결합;
(5) 1 x 106 M-1 min-1 이상의 온 레이트(on rate)(ka)로 인간 B7-H3과 특이적으로 결합;
(6) 1 x 106 M-1 min-1 이상의 온 레이트(ka)로 비-인간 영장류 B7-H3과 특이적으로 결합;
(7) 15 x 10-4 min-1 이하의 오프 레이트(off rate)(kd)로 인간 B7-H3과 특이적으로 결합;
(8) 15 x 10-4 min-1 이하의 오프 레이트(kd)로 인간 B7-H3과 특이적으로 결합;
(9) 재지시된 세포 살해(예를 들어, B7-H3를 발현하는 암 세포의 살해)를 매개하는 능력.
본원에서 설명된 대로, B7-H3-결합 분자의 결합 상수는, 예를 들어 BIACORE® 분석을 통해 표면 플라스몬 공명을 사용하여 결정될 수 있다. 표면 플라스몬 공명 데이터는 1:1 랑뮈르 결합 모델(동시다발적 ka kd)에 피팅될 수 있고, 평형 결합 상수 KD는 속도 상수 kd/ka의 비로부터 계산된다. 이러한 결합 상수는 1가 B7-H3-결합 분자(즉, 단일 B7-H3 에피토프-결합 부위를 포함하는 분자), 2가 B7-H3-결합 분자(즉, 2개의 B7-H3 에피토프-결합 부위를 포함하는 분자), 또는 더 높은 원자가를 가진 B7-H3-결합 분자(예를 들어, 3개, 4개, 또는 그 이상의 B7-H3 에피토프-결합 부위를 포함하는 분자)에 대해 결정될 수 있다.
본원에서 사용된 대로, "재지시된 세포 살해"는 이펙터 및 표적 세포의 표면에 존재하는 결합 에피토프에 의해 표적 세포의 위치에 면역 이펙터 세포(예를 들어, T-세포, NK 세포 등)를 편재화시킴으로써 표적 세포(예를 들어, 암 세포)의 살해를 매개하는 분자의 능력을 말하며, 결과적으로 표적 세포는 살해된다. 재지시된 세포 살해 활성을 매개하는 B7-H3-결합 분자(예를 들어, 이중특이적 B7-H3 x CD3-결합 분자)의 능력은 세포독성 T 림프구(CTL) 분석을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 분석은 당업계에 잘 공지되어 있으며 바람직한 분석이 아래 설명된다.
본 발명은 특히 인간 B7-H3 폴리펩타이드의 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 항-B7-H3 가변 도메인(즉, VL 및/또는 VH 도메인)을 포함하는 B7-H3-결합 분자(예를 들어, 항체, 디아바디, 3가 결합 분자 등)를 포함한다. 달리 나타내지 않는다면, 모든 이러한 B7-H3-결합 분자는 인간 B7-H3에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 본원에서 사용된 대로, 이러한 B7-H3 가변 도메인은 각각 "항-B7-H3-VL" 및 "항-B7-H3-VH"라고 언급된다.
IV. 뮤린 항-인간 B7-H3 항체 및 이들의 인간화된 유도체
"mAb-A," "mAb-B," "mAb-C" 및 "mAb-D"로 지정된 4개의 예시적인 항-B7-H3 항체가 인간 B7-H3을 발현하는 세포, B7-H3 폴리펩타이드 또는 그것의 펩타이드 에피토프로의 면역화를 통해서 생산된 하이브리도마 세포로부터 분리되었다. "mAb-B," "mAb-C" 및 "mAb-D" 항체는 인간화되었다.
항체 "mAb-C" 및 "mAb-D"는 사이노몰거스 원숭이의 B7-H3과 교차반응성인 것으로 판명되었다. mAb-C 및 mAb-D의 VL 및 VH 도메인의 아미노산 서열은 아래 제공된다. 한 구체예에서, 본 발명의 바람직한 항-인간 B7-H3-결합 분자는 뮤린 항-B7-H3 단클론성 항체 mAb-D, 키메라 단클론성 항체 mAb-D("chmAb-D") 또는 인간화된 단클론성 항체 mAb-C 또는 mAb-D("hmAb-C" 또는 "hmAb-D")의 VH 도메인의 CDRH 중 1개, 2개 또는 3개 전부 및/또는 VL 도메인의 CDRL 중 1개, 2개 또는 3개 전부를 지닌다. 이러한 바람직한 항-인간 B7-H3-결합 분자는 이중특이적(또는 다중특이적) 항체, 키메라 또는 인간화된 항체, BiTe, 디아바디 등을 포함하고, 이러한 결합 분자는 변이체 Fc 도메인을 가진다. 본 발명은 B7-H3 결합 분자, 및 특히 B7-H3-ADC를 형성하기 위한 mAb-A, mAb-B, mAb-C 또는 mAb-D 중 어느 것의 사용을 포함한다.
A. 뮤린 항-인간 B7-H3 항체 mAb -A
"mAb-A"로 지정된 뮤린 항-B7-H3 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:95)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00018
"mAb-A"의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:96)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00019
B. 뮤린 항-인간 B7-H3 항체 mAb -B
"mAb-B"로 지정된 뮤린 항-B7-H3 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:97)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00020
"mAb-B"의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:98)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00021
C. 인간화된 항-인간 B7-H3 항체 hmAb -B
hmAb-B의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:99)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00022
일부 구체예에서, hmAb-B의 CDRL1의 아미노산 서열(RASQ D IS N YLN)(SEQ ID NO: 100)은 아미노산 서열 RASQ S IS S YLN(SEQ ID NO:101)을 가진 대안의 CDRL1로 대체될 수 있다. 마찬가지로, hmAb-B의 CDRL2의 아미노산 서열(YTSRL H S)(SEQ ID NO:102)은 아미노산 서열 YTSRL Q S(SEQ ID NO:103)을 가진 대안의 CDRL2로 대체될 수 있다.
hmAb-B의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:104)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00023
일부 구체예에서, hmAb-B의 CDRH2의 아미노산 서열(TIYPG D GDTRYTQKF K G)(SEQ ID NO:105)은아미노산 서열 TIYPG G GDTRYTQKF Q G(SEQ ID NO:106)을 가진 대안의 CDRL2로 대체될 수 있다.
D. 뮤린 항-인간 B7-H3 항체 mAb -C
"mAb-C"로 지정된 뮤린 항-B7-H3 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:18)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00024
"mAb-C"의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:19)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00025
E. 인간화된 항-인간 B7-H3 항체 hmAb -C
항-B7-H3 항체 mAb-C의 가변 도메인이 인간화되었다. 일부 예에서, 대안의 인간화된 가변 도메인은 결합 활성을 최적화하고 및/또는 항원성 에피토프를 제거하고 및/또는 잠재적으로 불안정한 아미노산 잔기를 제거함으로써 생성되었다.
"hmAb-C"의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:20)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00026
"hmAb-C"의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:21)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00027
F. 뮤린 항-인간 B7-H3 항체 mAb -D
"mAb-D"로 지정된 뮤린 항-B7-H3 항체의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:22)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00028
"mAb-D"의 CDRL1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:23): KASQNVDTNVA이다.
"mAb-D"의 CDRL2 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:24): SASYRYS이다.
"mAb-D"의 CDRL3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:25): QQYNNYPFT이다.
"mAb-D"의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:26)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00029
"mAb-D"의 CDRH1 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:27): SFGMH이다.
"mAb-D"의 CDRH2 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:28): YISSGSGTIYYADTVKG이다.
"mAb-D"의 CDRH3 도메인의 아미노산 서열은 (SEQ ID NO:29): HGYRYEGFDY이다.
G. 인간화된 항-인간 B7-H3 항체 mAb -D
항-B7-H3 항체 mAb-D의 가변 도메인이 인간화되었다. 일부 예에서, 대안의 인간화된 가변 도메인은 결합 활성을 최적화하고 및/또는 항원성 에피토프를 제거하고 및/또는 잠재적으로 불안정한 아미노산 잔기를 제거함으로써 생성되었다.
hmAb-D의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:30)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00030
hmAb-D의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:31)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00031
V. 키메라 항원 수용체
본 발명의 B7-H3-결합 분자는 단쇄 가변 단편("항-B7-H3-scFvs") 또는 키메라 항원 수용체("항-B7-H3-CARs")와 같은 단일특이적 단쇄 분자일 수 있다. 상기 논의된 대로, scFv는 짧은 링커 펩타이드를 통해 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인을 함께 연결함으로써 제조된다. 제1 세대 CAR은 전형적으로 CD3ζ-사슬로부터의 세포내 도메인을 가지며, 이것은 내인성 TCR로부터의 신호의 일차 전달자이다. 제2 세대 CAR은 다양한 공자극 단백질 수용체(예를 들어, CD28, 41BB, ICOS 등)로부터 CAR의 세포질 꼬리를 향한 추가의 세포내 신호화 도메인을 가지며, 이로써 T-세포에 대해 추가의 신호를 제공할 수 있다. 제3 세대 CAR은 CD3z-CD28-41BB 또는 CD3z-CD28-OX40와 같이 다수의 신호화 도메인을 조합하고, 이로써 효능을 강화할 수 있다(Tettamanti, S. et al. (2013) "Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor," Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) "Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells," Blood 123(15):2343-2354; Mardiros A. et al.(2013) "T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia," Blood 122:3138-3148; Pizzitola I. et al. (2014) "Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo," Leukemia doi:10.1038/leu.2014.62).
본 발명의 항-B7-H3-CAR은 수용체의 세포내 도메인에 융합된 항-B7-H3-scFv를 포함한다. 항-B7-H3-scFv의 가변 경쇄 및 가변 중쇄 도메인은 바람직하게 hmAb-C VL(SEQ ID NO:20) 및 hmAb-C VH(SEQ ID NO:21)이거나, 또는 바람직하게 hmAb-D VL(SEQ ID NO:30) 및 hmAb-D VH(SEQ ID NO:31)이다.
본 발명의 항-B7-H3-CAR의 세포내 도메인은 바람직하게 41BB-CD3ζ, b2c-CD3ζ, CD28, CD28-4-1BB-CD3ζ, CD28-CD3ζ, CD28-FcεRIγ, CD28mut-CD3ζ, CD28-OX40-CD3ζ, CD28-OX40-CD3ζ, CD3ζ, CD4-CD3ζ, CD4-FcεRIγ, CD8-CD3ζ, FceRIγ, FcεRIγCAIX, Heregulin-CD3ζ, IL-13-CD3ζ, 또는 Ly49H-CD3ζ 중 어느 것의 세포내 도메인으로부터 선택된다(Tettamanti S. et al.(2013) "Targeting Of Acute Myeloid Leukaemia By Cytokine-Induced Killer Cells Redirected With A Novel CD123-Specific Chimeric Antigen Receptor," Br. J. Haematol. 161:389-401; Gill, S. et al. (2014) "Efficacy Against Human Acute Myeloid Leukemia And Myeloablation Of Normal Hematopoiesis In A Mouse Model Using Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells," Blood 123(15):2343-2354; Mardiros, A. et al. (2013) "T Cells Expressing CD123-Specific Chimeric Antigen Receptors Exhibit Specific Cytolytic Effector Functions And Antitumor Effects Against Human Acute Myeloid Leukemia," Blood 122:3138-3148; Pizzitola, I. et al. (2014) "Chimeric Antigen Receptors Against CD33/CD123 Antigens Efficiently Target Primary Acute Myeloid Leukemia Cells in vivo," Leukemia doi:10.1038/leu.2014. 62).
VI. 다중특이적 B7-H3-결합 분자
본 발명은 또한 에피토프-결합 부위(바람직하게 본 발명의 항-B7-H3-VH 도메인의 CDRH 중 1, 2 또는 모든 3개 및/또는 본 발명의 항-B7-H3-VL의 CDRL 중 1, 2 또는 모든 3개, 또는 이러한 항-B7-H3-VH 도메인 및/또는 이러한 항-B7-H3-VL 도메인)를 포함하고 제2 에피토프에 면역특이적으로 결합하는 제2 에피토프-결합 부위를 더 포함하는 다중특이적(예를 들어, 이중특이적, 삼중특이적 등) B7-H3-결합 분자에 관한 것이며, 여기서 이러한 제2 에피토프는 (i) B7-H3의 상이한 에피토프, 또는 (ii) B7-H3이 아닌 분자의 에피토프이다. 이러한 다중특이적 B7-H3-결합 분자는 바람직하게 표적 세포 또는 표적 타입에 특유한 항원의 세트를 인식하는 에피토프-결합 부위의 조합을 포함한다. 특히, 본 발명은 B7-H3의 에피토프와 이펙터 세포, 특히 T 림프구, 자연살해(NK) 세포 또는 다른 단핵 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프에 결합할 수 있는 다중특이적 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 이러한 B7-H3-결합 분자는 CD2, CD3, CD8, CD16, T-세포 수용체(TCR), 또는 NKG2D에 면역특이적으로 결합하는 에피토프-결합 부위를 포함하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 한 구체예는 "제1 에피토프" 및 "제2 에피토프"에 결합할 수 있는 이중특이적 B7-H3-결합 분자에 관한 것이며, 이러한 에피토프는 서로 동일하지 않다. 이러한 이중특이적 분자는 제1 에피토프에 결합할 수 있는 "VL1"/"VH1" 도메인, 및 제2 에피토프에 결합할 수 있는 "VL2"/"VH2" 도메인을 포함한다. "VL1" 및 VH1"이란 명칭은 각각 이러한 이중특이적 분자의 "제1" 에피토프에 결합하는 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 표시한다. 유사하게, "VL2" 및 VH2"란 명칭은 각각 이러한 이중특이적 분자의 "제2" 에피토프에 결합하는 가변 경쇄 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 표시한다. 그것은 제2 에피토프에 대해 제1 에피토프로서 특정한 에피토프가 지정되는지의 여부와 무관하다; 이러한 명칭은 단지 본 발명의 결합 분자의 폴리펩타이드 사슬의 도메인의 존재와 배향에 관해서만 관련성을 가진다. 한 구체예에서, 이러한 에피토프 중 하나는 인간 B7-H3의 에피토프이고, 나머지 하나는 B7-H3의 상이한 에피토프이거나, 또는 B7-H3가 아닌 분자의 에피토프이다. 특정 구체예에서, 이러한 에피토프 중 하나는 인간 B7-H3의 에피토프이고, 나머지 하나는 이펙터 세포, 예컨대 T 림프구, 자연살해(NK) 세포 또는 다른 단핵 세포의 표면에 존재하는 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD16, T-세포 수용체(TCR), NKG2D 등)의 에피토프이다. 특정 구체예에서, 이중특이적 분자는 2개를 초과하는 에피토프-결합 부위를 포함한다. 이러한 이중특이적 분자는 B7-H3의 적어도 하나의 에피토프 및 B7-H3가 아닌 분자의 적어도 하나의 에피토프와 결합할 것이고, B7-H3의 추가의 에피토프 및/또는 B7-H3가 아닌 분자의 추가의 에피토프와 더 결합할 수 있다.
본 발명은 특히 B7-H3의 적어도 하나의 에피토프 및 B7-H3가 아닌 제2 분자의 적어도 하나의 에피토프와 배위 결합할 수 있도록 만드는 항체의 에피토프-결합 단편(예를 들어, VL 및 VH 도메인)을 지닌 이중특이적, 삼중특이적 및 다중특이적 B7-H3-결합 분자(예를 들어, 이중특이적 항체, 이중특이적 디아바디, 삼중특이적 결합 분자 등)에 관한 것이다. 이러한 분자의 폴리펩타이드 도메인의 VL 및 VH 도메인의 선택은 이러한 다중특이적 B7-H3-결합 분자를 구성하는 폴리펩타이드 사슬이 B7-H3의 적어도 하나의 에피토프에 특이적인 적어도 하나의 기능적 에피토프-결합 부위와 B7-H3가 아닌 분자의 적어도 하나의 에피토프에 특이적인 적어도 하나의 기능적 에피토프-결합 부위를 형성하도록 조립되는 방식으로 조화된다. 바람직하게, 다중특이적 B7-H3-결합 분자는 여기 제공된 대로, 본 발명의 항-B7-H3-VH 도메인의 CDRH 중 1, 2 또는 3개 모두 및/또는 본 발명의 항-B7-H3-VL 도메인의 CDRL 중 1, 2 또는 3개 모두, 또는 이러한 항-B7-H3-VH 도메인 및/또는 이러한 항-B7-H3-VL 도메인을 포함한다.
A. 이중특이적 항체
본 발명은 B7-H3의 에피토프와 B7-H3가 아닌 분자의 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 항체를 포함한다. 일부 구체예에서, B7-H3와 B7-H3가 아닌 제2 분자에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 항체는, 각각 그 전체가 여기 참고로 포함되는 PCT 공개 WO 1998/002463, WO 2005/070966, WO 2006/107786 WO 2007/ 024715, WO 2007/075270, WO 2006/107617, WO 2007/046893, WO 2007/146968, WO 2008/003103, WO 2008/003116, WO 2008/027236, WO 2008/024188, WO 2009/132876, WO 2009/018386, WO 2010/028797, WO2010028796, WO 2010/028795, WO 2010/108127, WO 2010/136172, WO 2011/086091, WO 2011/133886, WO 2012/009544, WO 2013/ 003652, WO 2013/070565, WO 2012/162583, WO 2012/156430, WO 2013/174873, 및 WO 2014/022540에 설명된 방법 중 어느 것을 사용하여 제조된다.
B. Fc 도메인을 결여한 이중특이적 디아바디
본 발명의 한 구체예는 제1 에피토프와 제2 에피토프에 결합할 수 있는 이중특이적 디아바디에 관한 것이며, 여기서 제1 에피토프는 인간 B7-H3의 에피토프이고, 제2는 에피토프는 B7-H3가 아닌 분자, 바람직하게 이펙터 세포, 예컨대 T 림프구, 자연살해(NK) 세포 또는 다른 단핵 세포의 표면에 존재하는 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD16, T-세포 수용체(TCR), NKG2D 등)의 에피토프이다. 이러한 디아바디는 폴리펩타이드 사슬이 서로 공유 결합하여 B7-H3의 에피토프와 제2 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 공유 회합된 디아바디를 형성하는 것을 허용하는 서열을 가진 제1 폴리펩타이드 사슬 및 제2 폴리펩타이드 사슬을 포함하고, 가장 바람직하게는 그것으로 이루어진다.
이중특이적 디아바디의 이러한 구체예의 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 제1 또는 제2 에피토프 중 어느 하나(즉, VLanti -B7-H3- VL 또는 VLEpitope 2)에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인, 제1 개재 스페이서 펩타이드(링커 1), 제2 에피토프(이러한 제1 폴리펩타이드 사슬이 VLanti -B7-H3- VL를 함유하는 경우) 또는 B7-H3(이러한 제1 폴리펩타이드 사슬이 VLEpitope 2를 함유하는 경우) 중 어느 하나에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인, 선택적으로 시스테인 잔기를 함유하는 제2 개제 스페이서 펩타이드(링커 2), 헤테로다이머-촉진 도메인 및 C-말단을 포함한다(도 1).
이중특이적 디아바디의 이 구체예의 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단, 제1 또는 제2 에피토프 중 어느 하나(즉, VLanti -B7-H3- VL 또는 VLEpitope 2, 및 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬에 포함되도록 선택되지 않는 VL 도메인)에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VL 도메인, 개재 스페이서 펩타이드(링커 1), 제2 에피토프(이러한 제2 폴리펩타이드 사슬이 VLanti -B7-H3- VL를 함유하는 경우) 또는 B7-H3(이러한 제2 폴리펩타이드 사슬이 VLEpitope 2를 함유하는 경우) 중 어느 하나에 결합할 수 있는 단클론성 항체의 VH 도메인, 선택적으로 시스테인 잔기를 함유하는 제2 개제 스페이서 펩타이드(링커 2), 헤테로다이머-촉진 도메인 및 C-말단을 포함한다(도 1).
제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 제2 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인과 상호작용하여 제1 항원(즉, B7-H3 또는 제2 에피토프를 함유하는 분자)에 특이적인 제1 기능적 에피토프-결합 부위를 형성한다. 마찬가지로, 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인은 제1 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인과 상호작용하여 제2 항원(즉, 제2 에피토프를 포함하는 분자 또는 B7-H3)에 특이적인 제2 기능적 에피토프-결합 부위를 형성한다. 따라서, 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인의 선택은 디아바디의 두 폴리펩타이드 사슬이 전체적으로 B7-H3의 에피토프와 제2 에피토프에 모두 결합할 수 있는 VL 및 VH 도메인을 포함하도록 조화된다(즉, 이들은 전체적으로 VLanti -B7-H3- VL/VHanti -B7-H3- VH 및 VLEpitope 2/VHEpitope 2를 포함한다).
가장 바람직하게, 개재 스페이서 펩타이드(즉, 이러한 VL 및 VH 도메인을 분리하는)의 길이는 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인이 서로 결합하는 것을 실질적으로 또는 완전히 방지하도록 선택된다(예를 들어, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9개의 개재 링커 아미노산 잔기로 구성된다). 따라서, 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 실질적으로 또는 완전히 서로 결합할 수 없다. 마찬가지로, 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 실질적으로 또는 완전히 서로 결합할 수 없다. 바람직한 개재 스페이서 펩타이드(링커 1)는 서열 (SEQ ID NO:32): GGGSGGGG을 가진다.
제2 개재 스페이서 펩타이드("링커 2")의 길이 및 조성은 이러한 다이머화를 촉진하는 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인(즉, "헤테로다이머-촉진 도메인")의 선택에 기초하여 선택된다. 전형적으로, 제2 개재 스페이서 펩타이드(링커 2)는 3-20개 아미노산 잔기를 포함할 것이다. 특히, 이용된 헤테로다이머-촉진 도메인(들)이 시스테인 잔기를 포함하는/포함하지 않는 경우, 시스테인-함유 제2 개재 스페이서 펩타이드(링커 2)가 이용된다. 시스테인-함유 제2 개재 스페이서 펩타이드(링커 2)는 1, 2, 3 또는 그 이상의 시스테인을 함유할 것이다. 바람직한 시스테인-함유 스페이서 펩타이드(링커 2)는 서열 GGCGGG(SEQ ID NO:33)을 가진다. 대안으로, 링커 2는 시스테인을 포함하지 않고(예를 들어, GGG, GGGS(SEQ ID NO:34), LGGGSG(SEQ ID NO:35), GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:36), ASTKG(SEQ ID NO:37), LEPKSS(SEQ ID NO: 38), APSSS(SEQ ID NO:39) 등), 아래 설명된 대로 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 도메인이 사용된다. 선택적으로, 시스테인-함유 링커 2와 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진 도메인이 둘 다 사용된다.
헤테로다이머-촉진 도메인은 하나의 폴리펩타이드 사슬에 대해 GVEPKSC(SEQ ID NO:40) 또는 VEPKSC (SEQ ID NO:41) 또는 AEPKSC(SEQ ID NO:42)이고 나머지 하나의 폴리펩타이드 사슬에 대해 GFNRGEC(SEQ ID NO:43) 또는 FNRGEC(SEQ ID NO:44)일 수 있다(US2007/0004909).
바람직한 구체예에서, 헤테로다이머-촉진 도메인은 반대 전하의 탠덤하게 반복된 코일 도메인을 포함할 것이며, 예를 들어 글루타메이트 잔기가 pH 7에서 음전하를 형성하는 "E-코일" 나선 도메인(SEQ ID NO:45: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K), 및 리신 잔기가 pH 7에서 양전하를 형성하는 "K-코일" 도메인(SEQ ID NO:46: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)이 있다. 이러한 하전된 도메인의 존재는 제1 및 제2 폴리펩타이드 사이의 회합을 촉진하고, 따라서 헤테로다이머 형성을 증진시킨다. 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하도록 된 상기 설명된 E-코일 및 K-코일 서열의 변형을 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인이 이용될 수 있다. 이러한 시스테인 잔기의 존재는 하나의 폴리펩타이드 사슬에 존재하는 코일이 다른 폴리펩타이드 사슬에 존재하는 상보성 코일과 공유 결합되는 것을 허용하며, 이로써 폴리펩타이드 사슬이 서로 공유 결합하고 디아바디의 안정성이 증가한다. 특히 바람직한 예는 아미노산 서열 E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K(SEQ ID NO:47)을 가진 변형된 E-코일, 및 아미노산 서열 K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E(SEQ ID NO:48)을 가진 변형된 K-코일을 포함하는 헤테로다이머-촉진 도메인이다.
WO 2012/018687에 개시된 대로, 디아바디의 생체내 약동학적 특성을 개선하기 위해, 디아바디는 디아바디의 말단 중 하나 이상에 혈청-결합 단백질의 폴리펩타이드 부분을 함유하도록 변형될 수 있다. 가장 바람직하게, 혈청-결합 단백질의 이러한 폴리펩타이드 부분은 디아바디의 폴리펩타이드 사슬의 C-말단에 설치될 수 있다. 알부민이 혈장에 가장 풍부한 단백질이며 인체에서 19일의 반감기를 가진다. 알부민은 다른 단백질에 비-공유 결합하는 것을 허용하는 몇 개의 작은 분자 결합 부위를 지니며, 이로써 이들의 혈청 반감기가 연장된다. 스트렙토코쿠스 균주 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3(ABD3)은 안정한 3-나선 번들을 형성하는 46개의 아미노산 잔기로 구성되고 광범위한 알부민-결합 특이성을 가진다(Johansson, M.U. et al. (2002) "Structure, Specificity, And Mode Of Interaction For Bacterial Albumin-Binding Modules," J. Biol. Chem. 277(10):8114-8120. 따라서, 디아바디의 생체내 약동학적 특성을 개선하기 위한 혈청-결합 단백질의 특히 바람직한 폴리펩타이드 부분은 스트렙토코쿠스 단백질 G로부터의 알부민-결합 도메인(ABD)이고, 더 바람직하게는 스트렙토코쿠스 균주 G148의 단백질 G의 알부민-결합 도메인 3(ABD3)(SEQ ID NO:49): LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLIDNAKS AEGVKALIDE ILAALP이다.
WO 2012/162068(여기 참고로 포함됨)에 개시된 대로, SEQ ID NO:49의 "탈면역화된" 변이체는 MHC II형 결합을 약화 또는 제거하는 능력을 가진다. 조합 돌연변이 결과에 기초하여, 다음의 치환 조합이 이러한 탈면역화된 ABC를 형성하기 위한 바람직한 치환인 것으로 생각된다: 66D/70S +71A; 66S/70S +71A; 66S/70S +79A; 64A/65A/71A; 64A/65A/71A+66S; 64A/65A/71A+66D; 64A/65A/71A+66E; 64A/65A/79A + 66S; 64A/65A/79A+66D; 64A/65A/79A+66E. 변이체 ABC는 변형 L64A, I65A 및 D79A 또는 변형 N66S, T70S 및 D79A를 가진다. 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI D 66NAK S 70 A 71EGVKALIDE ILAALP (SEQ ID NO:50),
또는 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKN A 64 A 65NNAKT VEGVKALI A 79E ILAALP(SEQ ID NO:51),
또는 아미노산 서열:
LAEAKVLANR ELDKYGVSDY YKNLI S 66NAK S 70 VEGVKALI A 79E ILAALP(SEQ ID NO:52),
을 가진 탈면역화된 변이체 AB가 이러한 탈면역화된 ABD가 실질적으로 야생형 결합을 나타내면서 약화된 MHC II형 결합을 제공하기 때문에 특히 바람직하다. 따라서, ABD를 가진 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은 이러한 폴리펩타이드 사슬의 E-코일(또는 K-코일) 도메인에 대해 C-말단에 바람직하게 위치됨으로써 E-코일(또는 K-코일) 도메인과 ABD(이것은 바람직하게 탈면역화된 ABD이다) 사이에 개재하게 된 제3 링커(링커 3)를 함유한다. 이러한 링커 3의 바람직한 서열은 SEQ ID NO:34: GGGS이다.
C. Fc 도메인을 함유하는 다중특이적 디아바디
본 발명의 한 구체예는 B7-H3의 에피토프와 Fc 도메인을 포함하는 제2 에피토프(즉, B7-H3의 상이한 에피토프 또는 B7-H3가 아닌 분자의 에피토프)에 동시에 결합할 수 있는 다중특이적 디아바디에 관한 것이다. 디아바디 사슬의 복합체화가 Fc 도메인의 형성을 가져오도록 디아바디 폴리펩타이드 사슬 중 한쪽 또는 양쪽에 IgG CH2-CH3 도메인을 부가하는 것은 생물학적 반감기를 증가시키고 및/또는 디아바디의 원자가를 변경한다. 이러한 디아바디는 폴리펩타이드 사슬이 서로 공유 결합됨으로써 B7-H3의 에피토프와 제2 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 공유 회합된 디아바디를 형성할 수 있는 서열을 가진 2개 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 디아바디 폴리펩타이드의 양쪽에 IgG CH2-CH3 도메인의 통합은 2개 사슬 이중특이적 Fc-영역-함유 디아바디의 형성을 허용할 것이다(도 2).
대안으로, 디아바디 폴리펩타이드 중 단지 한쪽에 IgG CH2-CH3 도메인의 통합은 더 복잡한 4개 사슬 이중특이적 Fc 도메인-함유 디아바디의 형성을 허용할 것이다(도 3a-3c). 도 3c는 불변 경쇄(CL) 도메인 및 불변 중쇄 CH1 도메인을 지닌 대표적인 4개 사슬 디아바디를 도시하지만, 이러한 도메인의 단편뿐만 아니라 다른 폴리펩타이드도 대안으로서 이용될 수 있다(예를 들어, 도 3a 및 3b, 미국 특허공개 2013-0295121; 2010-0174053 및 2009-0060910; 유럽 특허공개 EP 2714079; EP 2601216; EP 2376109; EP 2158221 및 PCT 공보 WO 2012/162068; WO 2012/018687; WO 2010/080538 참조). 따라서, 예를 들어 CH1 도메인 대신, 인간 IgG의 힌지 도메인으로부터 유래된, 아미노산 서열 GVEPKSC(SEQ ID NO:40), VEPKSC(SEQ ID NO:41), 또는 AEPKSC(SEQ ID NO:42)을 가진 펩타이드를 사용할 수 있고, CL 도메인 대신, 인간 카파 경쇄의 C-말단 6개 아미노산, GFNRGEC(SEQ ID NO:43) 또는 FNRGEC(SEQ ID NO:44)을 이용할 수 있다. 4개 사슬 디아바디를 함유하는 대표적인 펩타이드가 도 3a에 도시된다. 대안으로, 또는 추가로, "E-코일" 나선 도메인(SEQ ID NO:45: E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K 또는 SEQ ID NO:47: E VAAC E K- E VAAL E K- E VAAL E K- E VAAL E K); 및 "K-코일" 도메인(SEQ ID NO:46: K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E 또는 SEQ ID NO:48: K VAAC K E- K VAAL K E- K VAAL K E- K VAAL K E)과 같은 반대 전하의 탠덤 코일 도메인을 포함하는 펩타이드를 이용할 수 있다. 4개 사슬 디아바디를 함유하는 대표적인 코일 도메인은 도 3b에 도시된다.
본 발명의 Fc 도메인-함유 분자는 추가의 개재 스페이서 펩타이드(링커)를 포함할 수 있고, 일반적으로 이러한 링커는 헤테로다이머-촉진 도메인(예를 들어, E-코일 또는 K-코일)과 CH2-CH3 도메인 사이에 및/또는 CH2-CH3 도메인과 가변 도메인(즉, VH 또는 VL) 사이에 포함될 것이다. 전형적으로, 추가의 링커는 3-20개 아미노산 잔기를 포함할 것이고, 선택적으로 IgG 힌지 도메인의 전부 또는 일부를 함유할 수 있다(바람직하게 IgG 힌지 도메인의 시스테인-함유 부분). 본 발명의 Fc 도메인-함유 디아바디 분자에서 이용될 수 있는 링커는 GGGS(SEQ ID NO:34), LGGGSG(SEQ ID NO:35), GGGSGGGSGGG(SEQ ID NO:36), ASTKG(SEQ ID NO:37), LEPKSS (SEQ ID NO:38), APSSS(SEQ ID NO:39), APSSSPME(SEQ ID NO:53), VEPKSADKTHTCPPCP (SEQ ID NO:54), LEPKSADKTHTCPPC(SEQ ID NO:55), DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:56), GGC, 및 GGG를 포함한다. LEPKSS(SEQ ID NO:38)는 클로닝의 용이성을 위해 GGG 또는 GGC 대신 사용될 수 있다. 추가로, 아미노산 GGG, 또는 LEPKSS(SEQ ID NO:38)의 바로 뒤에 DKTHTCPPCP(SEQ ID NO:56)가 위치됨으로써 교대 링커 GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:57); 및 LEPKSSDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:58)를 형성할 수 있다. 본 발명의 이중특이적 Fc 도메인-함유 분자는 링커에 더하여 또는 링커를 대신하여 IgG 힌지 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 힌지 도메인은 IgG1로부터의 EPKSCDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:7), IgG2로부터의 ERKCCVECPPCP(SEQ ID NO:8), IgG4로부터의 ESKYGPPCPSCP(SEQ ID NO:10), 및 ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:11), 가닥 교환을 감소시키기 위해 안정화 S228P 치환(Kabat에 제시된 EU 인덱스에 의해 넘버링)을 포함하는 IgG4 힌지 변이체를 포함한다.
도 3a-3c에 제공된 대로, 본 발명의 Fc 도메인-함유 디아바디는 4개의 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 디아바디 사슬의 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬은 3개의 도메인: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인, (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인, 및 (iv) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 제2 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인, 및 (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하며, 여기서 헤테로다이머-촉진 도메인은 제1/제3 폴리펩타이드 사슬과 제2/제4 폴리펩타이드 사슬의 다이머화를 촉진한다. 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인, 및 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 VL 및/또는 VH 도메인은 동일하거나 상이할 수 있고, 단일특이적, 이중특이적 또는 사중특이적인 4가 결합을 허용할 수 있다. 명칭 "VL3" 및 "VH3"은 각각 이러한 디아바디의 제3" 에피토프에 결합하는 경쇄 가변 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 표시한다. 유사하게, 명칭 "VL4" 및 "VH4"는 각각 이러한 디아바디의 "제4" 에피토프에 결합하는 경쇄 가변 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 표시한다. 본 발명의 대표적인 4개 사슬 이중특이적 Fc 도메인-함유 디아바디의 폴리펩타이드 사슬의 일반적인 구조가 표 1에 제공된다.
Figure pct00032
특정 구체예에서, 본 발명의 디아바디는 4개의 총 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이중특이적, 4가(즉, 4개의 에피토프-결합 부위를 지닌), Fc-함유 디아바디이다(도 3a-3c). 본 발명의 이중특이적, 4가 Fc-함유 디아바디는 B7-H3에 면역특이적인 2개의 에피토프-결합 부위(이들은 B7-H3의 동일한 에피토프에 또는 B7-H3의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다), 및 제2 분자에 면역특이적인 2개의 에피토프-결합 부위(이들은 제2 분자의 동일한 에피토프에 또는 제2 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다)를 포함한다. 바람직하게, 제2 분자는 이펙터 세포, 예컨대 T 림프구, 자연살해(NK) 세포 또는 다른 단핵 세포의 표면에 존재하는 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD16, T-세포 수용체(TCR), NKG2D 등)이다.
추가의 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 디아바디는 3개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드는 3개의 도메인: (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 이러한 디아바디의 제2 폴리펩타이드 서열은 (i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인 및 (iii) 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화 및 공유 결합을 촉진하는 도메인을 함유한다. 이러한 디아바디의 제3 폴리펩타이드는 CH2-CH3 서열을 포함한다. 따라서, 이러한 디아바디의 제1 및 제2 폴리펩타이드는 함께 회합하여 제1 항원(즉, B7-H3 또는 제2 에피토프를 포함하는 분자)에 결합할 수 있는 VL1/VH1 에피토프-결합 부위, 및 제2 항원(즉, 제2 에피토프를 함유하는 분자 또는 B7-H3)에 결합할 수 있는 VL2/VH2 에피토프-결합 부위를 형성한다. 제1 및 제2 폴리펩타이드는 각각의 제3 도메인에 있는 시스테인 잔기를 수반하는 이황화물 결합을 통해서 서로 결합된다. 주목할 점은 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬이 서로 복합체를 이루어 이황화물 결합을 통해 안정화된 Fc 도메인을 형성한다는 것이다. 도 4a 및 4b는 이러한 디아바디의 구조를 예시한다. 이러한 Fc-영역-함유 디아바디는 두 가지 배향 중 어느 하나를 가질 수 있다(표 2).
Figure pct00033
특정 구체예에서, 본 발명의 디아바디는 3개의 총 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이중특이적, 2가(즉, 2개의 에피토프-결합 부위를 지닌), Fc-함유 디아바디이다(도 4a-4b). 본 발명의 이중특이적, 2가 Fc-함유 디아바디는 B7-H3에 면역특이적인 하나의 에피토프-결합 부위, 및 제2 분자에 면역특이적인 하나의 에피토프-결합 부위를 포함한다. 바람직하게, 제2 분자는 이펙터 세포, 예컨대 T 림프구, 자연살해(NK) 세포 또는 다른 단핵 세포의 표면에 존재하는 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD16, T-세포 수용체(TCR), NKG2D 등)이다.
추가의 구체예에서, Fc 도메인-함유 디아바디는 총 5개의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 5개 폴리펩타이드 사슬 중 2개는 동일한 아미노산 서열을 가진다. 이러한 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은 (i) VH1-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 제1 폴리펩타이드 사슬은 VH1 및 중쇄 불변 영역을 함유하는 항체의 중쇄일 수 있다. 이러한 디아바디의 제2 및 제5 폴리펩타이드 사슬은 (i) VL1-함유 도메인 및 (ii) CL-함유 도메인을 함유한다. 이러한 디아바디의 제2 및/또는 제5 폴리펩타이드 사슬은 제1/제3 폴리펩타이드 사슬의 VH1에 상보성인 VL1을 함유하는 항체의 경쇄일 수 있다. 제1, 제2 및/또는 제5 폴리펩타이드 사슬은 자연발생 항체로부터 분리될 수 있다. 대안으로, 이들은 재조합 방식으로 구성될 수 있다. 이러한 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬은 (i) VH1-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인, (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인, (iv) VL2-함유 도메인, (v) VH3-함유 도메인 및 (vi) 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유하고, 여기서 헤테로다이머-촉진 도메인은 제3 사슬과 제4 사슬의 다이머화를 촉진한다. 이러한 디아바디의 제4 폴리펩타이드는 (i) VL3-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인 및 (iii) 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬과의 헤테로다이머화 및 공유 결합을 촉진하는 도메인을 함유한다.
따라서, 이러한 디아바디의 제1 및 제2, 그리고 제3 및 제5 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제1 에피토프와 결합할 수 있는 2개의 VL1/VH1 에피토프-결합 부위를 형성한다. 이러한 디아바디의 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제2 에피토프와 결합할 수 있는 VL2/VH2 에피토프-결합 부위, 및 제3 에피토프와 결합할 수 있는 VL3/VH3 결합 부위를 형성한다. 제1 및 제3 폴리펩타이드는 이들 각각의 불변 영역에 있는 시스테인 잔기를 수반하는 이황화물 결합을 통해서 서로 결합된다. 주목할 점은 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬이 서로 복합체를 이루어 Fc 도메인을 형성한다는 것이다. 이러한 다중특이적 디아바디는 증진된 효능을 가진다. 도 5는 이러한 디아바디의 구조를 예시한다. VL1/VH1, VL2/VH2, 및 VL3/VH3 도메인은 동일하거나 상이할 수 있으며, 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적인 결합을 허용할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 본원에서 제공된 대로, 이들 도메인은 바람직하게 B7-H3의 에피토프, 제2 분자의 에피토프 및 선택적으로 제3 분자의 에피토프에 결합하도록 선택된다.
폴리펩타이드 사슬의 VL 및 VH 도메인은 원하는 에피토프에 특이적인 VL/VH 결합 부위를 형성하도록 선택된다. 폴리펩타이드 사슬의 회합에 의해 형성된 VL/VH 결합 부위는 동일하거나 상이할 수 있으며, 단일특이적, 이중특이적, 삼중특이적 또는 사중특이적인 4가 결합을 허용한다. 특히, VL 및 VH 도메인은 다가 디아바디가 제1 에피토프에 대한 2개의 결합 부위와 제2 에피토프에 대한 2개의 결합 부위, 또는 제1 에피토프에 대한 3개의 결합 부위와 제2 에피토프에 대한 하나의 결합 부위, 또는 제1 에피토프에 대한 2개의 결합 부위, 제2 에피토프에 대한 하나의 결합 부위 및 제3 에피토프에 대한 하나의 결합 부위를 포함할 수 있도록 선택될 수 있다(도 5에 묘사된 대로). 본 발명의 대표적인 5개 사슬 Fc 도메인-함유 디아바디의 폴리펩타이드 사슬의 일반적인 구조가 표 3에 제공된다.
Figure pct00034
특정 구체예에서, 본 발명의 디아바디는 B7-H3에 면역특이적인 2개의 에피토프-결합 부위(이들은 B7-H3의 동일한 에피토프 또는 B7-H3의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다), 및 제2 분자에 특이적인 2개의 에피토프-결합 부위(이들은 제2 분자의 동일한 에피토프 또는 제2 분자의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다)를 가진 5개의 총 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 이중특이적, 4가(즉, 4개의 에피토프-결합 부위를 지닌), Fc-함유 디아바디이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 이중특이적, 4가, Fc-함유 디아바디는 B7-H3에 면역특이적인 3개의 에피토프-결합 부위(이들은 B7-H3의 동일한 에피토프 또는 B7-H3의 2개 또는 3개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다), 및 제2 분자에 특이적인 하나의 에피토프-결합 부위를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 이중특이적, 4가, Fc-함유 디아바디는 B7-H3에 면역특이적인 하나의 에피토프-결합 부위, 및 제2 분자에 특이적인 3개의 에피토프-결합 부위(이들은 제2 분자의 동일한 에피토프 또는 제2 분자의 2개 또는 3개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다)를 포함한다. 상기 제공된 대로, VL 및 VH 도메인은 삼중특이적 결합을 허용하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 삼중특이적, 4가, Fc-함유 디아바디를 포함한다. 본 발명의 삼중특이적, 4가, Fc-함유 디아바디는 B7-H3에 면역특이적인 2개의 에피토프-결합 부위, 제2 분자에 면역특이적인 하나의 에피토프-결합 부위, 및 제3 분자에 면역특이적인 하나의 에피토프-결합 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 제2 분자는 이펙터 세포, 예컨대 T 림프구, 자연살해(NK) 세포 또는 다른 단핵 세포의 표면에 존재하는 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD16, T-세포 수용체(TCR), NKG2D등)이다. 특정 구체예에서, 제2 분자는 CD3이고 제3 분자는 CD8이다.
D. Fc 도메인을 함유하는 3가 결합 분자
본 발명의 추가의 구체예는 제1 에피토프, 제2 에피토프 및 제3 에피토프에 동시에 결합할 수 있는 Fc 도메인을 포함하는 3가 결합 분자에 관한 것이며, 여기서 이러한 에피토프 중 적어도 하나는 서로 동일하지 않다. 이러한 3개 결합 분자는 3개의 에피토프-결합 부위를 포함하고, 이들 중 2개는 결합 부위 A와 결합 부위 B를 제공하는 디아바디-타입 결합 도메인이며, 이들 중 하나는 결합 부위 C를 제공하는 Fab-타입 결합 도메인, 또는 scFv-타입 결합 도메인이다(예를 들어, 도 6a-6f 및 PCT 공보 PCT/US15/33081; 및 PCT/US15/33076 참조). 따라서, 이러한 3가 결합 분자는 이러한 3가 결합 분자의 제1 에피토프에 결합할 수 있는 "VL1"/"VH1"와 제2 에피토프에 결합할 수 있는 "VL2"/"VH2"와 제3 에피토프에 결합할 수 있는 "VL3"/ "VH3"를 포함한다. "디아바디-타입 결합 도메인"은 상기 설명된 것과 같은 디아바디, 특히 DART® 디아바디에 존재하는 에피토프-결합 부위의 종류이다. "Fab-타입 결합 도메인" 및 "scFv-타입 결합 도메인"의 각각은 면역글로불린 경쇄의 VL 도메인과 면역글로불린 중쇄의 상보성 VH 도메인의 상호작용에 의해 형성된다. Fab-타입 결합 도메인은 Fab-타입 결합 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩타이드 사슬은 단지 하나의 에피토프-결합 부위를 포함하고, 디아바디-타입 결합 도메인을 형성하는 2개의 폴리펩타이드 사슬은 적어도 2개의 에피토프-결합 부위를 포함한다는 점에서 디아바디-타입 결합 도메인과 상이하다. 유사하게, scFv-타입 결합 도메인도 역시 이들이 단지 하나의 에피토프-결합 부위를 포함한다는 점에서 디아바디-타입 결합 도메인과 상이하다. 따라서, 여기 사용된 Fab-타입, 및 scFv-타입 결합 도메인은 디아바디-타입 결합 도메인과 구별된다.
전형적으로, 본 발명의 3가 결합 분자는 4개의 상이한 폴리펩타이드 사슬을 포함할 것이지만(도 6a-6b 참조), 이 분자는 예를 들어 이러한 폴리펩타이드 사슬들이 서로 융합되거나(예를 들어, 펩타이드 결합을 통해), 또는 이러한 폴리펩타이드 사슬들이 나눠져 추가의 폴리펩타이드 사슬을 형성하거나, 또는 이황화물 결합을 통해서 더 적은 또는 추가의 폴리펩타이드 사슬이 회합됨으로써 더 적거나 더 많은 수의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다. 도 6c-6f는 3개의 폴리펩타이드 사슬을 가진 이러한 분자를 도식적으로 묘사함으로써 본 발명의 이 양태를 예시한다. 도 6a-6f에 제공된 대로, 본 발명의 3개 결합 분자는 디아바디-타입 결합 도메인이 Fc 도메인에 대해 N-말단이거나(도 6a, 6c 및 6d) 또는 C-말단인(도 6b, 6e 및 6f)인 대안의 배향들을 가질 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 이러한 3가 결합 분자의 제1 폴리펩타이드 사슬은 (i) VL1-함유 도메인, (ii) VH2-함유 도메인, (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인 및 (iv) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. VL1 및 VL2 도메인은 표 3에 제시된 대로 CH2-CH3-함유 도메인에 대해 N-말단 또는 C-말단에 위치된다(또한, 도 6a 및 6b 참조). 이러한 구체예의 제2 폴리펩타이드 사슬은(i) VL2-함유 도메인, (ii) VH1-함유 도메인, 및 (iii) 헤테로다이머-촉진 도메인을 함유한다. 이러한 구체예의 제3 폴리펩타이드 사슬은 (i) VH3-함유 도메인, (ii) CH1-함유 도메인 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인을 함유한다. 제3 폴리펩타이드 사슬은 VH3을 함유하는 항체의 중쇄 및 중쇄 불변 영역, 또는 이러한 도메인을 함유하는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 구체예의 제4 폴리펩타이드는 (i) VL3-함유 도메인 및 (ii) CL-함유 도메인을 함유한다. 제4 폴리펩타이드 사슬은 제3 폴리펩타이드 사슬의 VH3에 상보성인 VL3을 함유하는 항체의 경쇄, 또는 이러한 도메인을 함유하는 폴리펩타이드일 수 있다. 제3 또는 제4 폴리펩타이드 사슬은 자연 발생 항체로부터 분리될 수 있다. 대안으로, 이들은 재조합 방식으로, 합성 방식으로, 또는 다른 수단에 의해 구성될 수 있다.
제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬의 경쇄 가변 도메인은 VL1/VH2(또는 VL2/VH1) 도메인이 함께 제1 또는 제2 에피토프에 결합할 수 있는 에피토프-결합 부위를 형성할 수 있기에는 너무 짧은 길이를 가진 개재 스페이서 펩타이드에 의해 이러한 폴리펩타이드 사슬의 중쇄 가변 도메인으로부터 분리된다. 이 목적을 위한 바람직한 개재 스페이서 펩타이드(링커 1)는 서열 (SEQ ID NO:32): GGGSGGGG를 가진다. 3가 결합 분자의 다른 도메인은, 선택적으로 시스테인 잔기를 포함하는 하나 이상의 개재 스페이서 펩타이드(링커)에 의해 분리될 수 있다. 특히, 상기 제공된 대로, 이러한 링커는 가변 도메인(즉, VH 또는 VL)과 펩타이드 헤테로다이머-촉진 도메인(예를 들어, E-코일 또는 K-코일) 사이에 그리고 이러한 헤테로다이머-촉진 도메인(예를 들어, E-코일 또는 K-코일)과 CH2-CH3 도메인 사이에 포함될 것이다. 3가 결합 분자의 생성을 위해 유용한 예시적인 링커가 상기 제공되며, 또한 PCT 출원 PCT/US15/33081; 및 PCT/US15/33076에 제공된다. 따라서, 이러한 3가 결합 분자의 제1 및 제2 폴리펩타이드 사슬은 함께 회합하여 제1 에피토프에 결합할 수 있는 VL1/VH1 결합 부위, 뿐만 아니라 제2 에피토프에 결합할 수 있는 VL2/VH2 결합 부위를 형성할 수 있다. 이러한 3가 결합 분자의 제3 및 제4 폴리펩타이드 사슬은 함께 결합하여 제3 에피토프에 결합할 수 있는 VL3/VH3 결합 부위를 형성할 수 있다.
상기 설명된 대로, 본 발명의 3가 결합 분자는 3개의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 3가 결합 분자는 제4 폴리펩타이드 N-말단의 도메인을 제3 폴리펩타이드의 VH3-함유 도메인에 연결함으로써 얻어질 수 있다(예를 들어, 개재 스페이서 펩타이드(링커 4)를 사용하여). 대안으로, 다음의 도메인을 함유하는 본 발명의 3가 결합 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬이 이용된다: (i) VL3-함유 도메인, (ii) VH3-함유 도메인, 및 (iii) CH2-CH3 서열을 함유하는 도메인, 여기서 VL3 및 VH3는 이들 도메인의 회합을 허용하여 에피토프-결합 부위를 형성할 수 있는 충분한 길이(적어도 9개 이상의 아미노산 잔기)의 개재 스페이서 펩타이드에 의해 서로 이격된다. 이 목적을 위한 한 바람직한 개재 스페이서 펩타이드는 서열: GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:59)을 가진다.
이러한 3가 결합 분자의 VL1/VH1, VL2/VH2, 및 VL3/VH3 도메인은 상이할 수 있으며, 이로써 단일특이적, 이중특이적 또는 삼중특이적인 결합을 허용할 수 있다. 특히, VL 및 VH 도메인은 3가 결합 도메인이 제1 에피토프에 대한 2개의 결합 부위와 제2 에피토프에 대한 하나의 결합 부위, 또는 제1 에피토프에 대한 하나의 결합 부위와 제2 에피토프에 대한 2개의 결합 부위, 또는 제1 에피토프에 대한 하나의 결합 부위, 제2 에피토프에 대한 하나의 결합 부위 및 제3 에피토프에 대한 하나의 결합 부위를 포함하도록 선택될 수 있다.
그러나, 본원에서 제공된 대로, 이들 도메인은 바람직하게는 B7-H3의 에피토프, 제2 분자의 에피토프, 및 제3 분자의 에피토프에 결합하도록 선택된다. 특정 구체예에서, 제2 분자는 이펙터 세포, 예컨대 T 림프구, 자연살해(NK) 세포 또는 다른 단핵 세포의 표면에 존재하는 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD16, T-세포 수용체(TCR), NKG2D 등)이다. 특정 구체예에서, 제3 분자는 CD8이다.
본 발명의 대표적인 3가 결합 분자의 폴리펩타이드 사슬의 일반적인 구조가 도 6a-6f 및 표 4에 제공된다.
Figure pct00035
본 발명의 한 구체예는 B7-H3에 대한 2개의 에피토프-결합 부위 및 제2 분자에 대한 하나의 에피토프-결합 부위를 포함하는 3가 결합 분자에 관한 것이다. B7-H3에 대한 2개의 에피토프-결합 부위는 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 다른 구체예는 B7-H3에 대한 하나의 에피토프-결합 부위 및 제2 분자에 대한 2개의 에피토프-결합 부위를 포함하는 3가 결합 분자에 관한 것이다. 제2 분자에 대한 2개의 에피토프-결합 부위는 제2 분자의 동일한 에피토프 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 본 발명의 추가의 구체예는 B7-H3에 대한 하나의 에피토프-결합 부위, 제2 분자에 대한 에피토프-결합 부위 및 제3 분자에 대한 에피토프-결합 부위를 포함하는 삼중특이적 3가 결합 분자에 관한 것이다. 특정 구체예에서, 제2 분자는 이펙터 세포, 예컨대 T 림프구, 자연살해(NK) 세포 또는 다른 단핵 세포의 표면에 존재하는 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD16, T-세포 수용체(TCR), NKG2D 등)이다. 특정 구체예에서, 제2 분자는 CD3이고 제3 분자는 CD8이다. 상기 제공된 대로, 이러한 3가 결합 분자는 3개, 4개, 5개, 또는 그 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함할 수 있다.
VII. Fc 도메인의 변형
본 발명의 Fc 도메인-함유 분자(예를 들어, 항체, 디아바디, 3가 결합 분자 등)의 Fc 도메인은 완전한 Fc 도메인(예를 들어, 완전한 IgG Fc 도메인) 또는 단지 Fc 도메인의 단편을 포함할 수 있다. 선택적으로, 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 Fc 도메인은 C-말단 리신 아미노산 잔기를 결여한다.
전통적인 면역 기능에서, 항체-항원 복합체와 면역 시스템의 세포의 상호작용은 이펙터 기능, 예컨대 항체 의존성 세포독성, 비만 세포 과립화 및 포식작용에서부터 면역조정 신호, 예컨대 림프구 증식 및 항체 분비의 조절에 이르는 범위의 광범위한 반응을 가져온다. 이들 상호작용은 모두 조혈세포 상의 특수화된 세포 표면 수용체에 항체 또는 면역 복합체의 Fc 도메인의 결합을 통해서 개시된다. 항체 및 면역 복합체에 의해 촉발되는 세포 반응의 다양성은 3개의 Fc 수용체: FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)의 구조적 비균질성으로 인한 결과이다. FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32A) 및 FcγRIII(CD16)는 활성화(즉, 면역 시스템 증진) 수용체이고, FcγRIIB(CD32B)는 억제(즉, 면역 시스템 감퇴) 수용체이다. 이에 더하여, 신생아 Fc 수용체(FcRn)과의 상호작용은 엔도솜으로부터 세포 표면으로 IgG 분자의 재순환을 매개하고 혈액으로 방출한다. 예시적인 야생형 IgG1(SEQ ID NO:12), IgG2(SEQ ID NO:13), IgG3(SEQ ID NO:14) 및 IgG4(SEQ ID NO:15) 의 아미노산 서열이 상기 제시된다.
Fc 도메인의 변형은 변경된 표현형, 예를 들어 변경된 혈청 반감기, 변경된 안정성, 세포 효소에 대한 변경된 감수성 또는 변경된 이펙터 기능을 초래할 수 있다. 따라서, 예를 들어 암의 치료에서 이러한 분자의 효능을 증진시키기 위해, 이펙터 기능과 관련하여 본 발명의 Fc 도메인-함유 B7-H3-결합 분자를 변형하는 것이 바람직할 수 있다. 이펙터 기능의 감소 또는 제거가 특정한 경우, 예를 들어 작용 메커니즘이 차단 또는 길항작용을 수반하지만 표적 항원을 지닌 세포의 사멸은 수반하지 않는 경우 바람직할 수 있다. 증가된 이펙터 기능은 일반적으로 바람직하지 않은 세포, 예컨대 FcγR가 낮은 수준으로 발현되는 종양 세포 및 외래 세포, 예를 들어 낮은 수준의 FcγRIIB를 가진 종양-특이적 B 세포(예를 들어, 비호지킨 림프종, CLL 및 버킷 림프종)에 대해 지시되었을 때 바람직하다. 이러한 부여된 또는 변경된 이펙터 기능 활성을 지닌 본 발명의 분자는 이펙터 기능 활성의 증진된 효능이 바람직한 질환, 장애 또는 감염의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
따라서, 특정 구체예에서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 Fc 도메인은 조작된 변이체 Fc 도메인일 수 있다. 본 발명의 이중특이적 Fc 도메인-함유 분자의 Fc 도메인은 하나 이상의 Fc 수용체(예를 들어, FcγR(들))에 결합할 수 있는 능력을 지닐 수 있지만, 더 바람직하게 이러한 변이체 Fc 도메인은 FcγRIA(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 또는 FcγRIIIB(CD16b)에 대한 변경된 결합을 가지며(야생형 Fc 도메인에 의해 나타난 결합에 비해), 예를 들어 활성화 수용체에 대해 증진된 결합을 가지거나 및/또는 억제 수용체(들)에 대해 결합할 수 있는 능력이 실질적으로 감소되거나 또는 없어질 것이다. 따라서, 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 Fc 도메인은 완전한 Fc 도메인의 CH2 도메인의 일부 또는 전부 및/또는 CH3 도메인의 일부 또는 전부를 포함할 수 있거나, 또는 변이체 CH2 및/또는 변이체 CH3 서열을 포함할 수 있다(예를 들어, 완전한 Fc 도메인의 CH2 또는 CH3 도메인에 대해서 하나 이상의 삽입 및/또는 하나 이상의 결실을 포함할 수 있다). 이러한 Fc 도메인은 비-Fc 폴리펩타이드 부분을 포함할 수 있거나, 또는 비자연적인 완전한 Fc 도메인의 일부를 포함할 수 있거나, 또는 CH2 및/또는 CH3 도메인의 비-자연발생 배향을 포함할 수 있다(예컨대 예를 들어 2개의 CH2 도메인 또는 2개의 CH3 도메인, 또는 N-말단에서 C-말단 방향으로, CH2 도메인에 연결된 CH3 도메인 등).
활성화 수용체(예를 들어, FcγRIIA(CD16A))대한 결합을 증가시키고 억제 수용체(예를 들어, FcγRIIB(CD32B))에 대한 결합을 감소시키는 변형을 포함하는, 이펙터 기능을 변경하는 것으로 확인된 Fc 도메인 변형이 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, Stavenhagen J.B. et al.(2007) "Fc Optimization Of Therapeutic Anti-bodies Enhances Their Ability To Kill Tumor Cells In Vitro And Controls Tumor Expansion In Vivo Via Low-Affinity Activating Fcgamma Receptors," Cancer Res. 57(18):8882-8890 참조). 표 5는 활성화 수용체에 대한 결합을 증가시키고 및/또는 억제 수용체에 대한 결합을 감소시키는 예시적인 변형의 예시적인 단일, 이중, 삼중, 사중 및 오중 치환을 나열한다(넘버링 및 치환은 SEQ ID NO:12의 아미노산 서열에 대한 것이다).
Figure pct00036
CD32B에 대한 감소된 결합 및/또는 CD16A에 대한 증가된 결합을 가진 인간 IgG1 Fc 도메인의 예시적인 변이체는 F243L, R292P, Y300L, V305I 또는 P296L 치환을 함유한다. 이들 아미노산 치환은 임의의 조합으로 인간 IgG1 Fc 도메인에 존재할 수 있다. 한 구체예에서, 변이체 인간 IgG1 Fc 도메인은 F243L, R292P 및 Y300L 치환을 함유한다. 다른 구체예에서, 변이체 인간 IgG1 Fc 도메인은 F243L, R292P, Y300L, V305I 및 P296L 치환을 함유한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-결합 분자의 Fc 도메인은 (야생형 IgG1 Fc 도메인(SEQ ID NO:12)에 의해 나타나는 결합에 비해) FcγRIA(CD64), FcγRIIA (CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 또는 FcγRIIIB (CD16b)에 대해 감소된 결합을 나타내는 것이(또는 실질적으로 결합을 나타내지 않는 것이) 바람직하다. 특정 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 감소된 ADCC 이펙터 기능을 나타내는 IgG Fc 도메인을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 이러한 B7-H3-결합 분자의 CH2-CH3 도메인은 치환: L234A, L235A, D265A, N297Q, 및 N297G 중 임의의 1, 2, 3 또는 4개를 포함한다. 다른 구체예에서, CH2-CH3 도메인은 N297Q 치환, N297G 치환, L234A 및 L235A 치환 또는 D265A 치환을 함유하며, 이들 돌연변이는 FcR 결합을 없앤다. 대안으로, (야생형 IgG1 Fc 도메인(SEQ ID NO:12)에 의해 나타나는 결합 및 이펙터 기능에 비해) FcγRIIIA(CD16a)에 대한 감소된(실질적으로 없는) 결합 및/또는 감소된 이펙터 기능을 본래 나타내는 자연발생 Fc 도메인의 CH2-CH3 도메인이 이용된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 IgG2 Fc 도메인(SEQ ID NO:13) 또는 IgG4 Fc 도메인(SEQ ID NO:4)을 포함한다. IgG4 Fc 도메인이 이용될 때, 본 발명은 또한 상기 설명된 힌지 도메인 S228P 치환과 같은, 안정화 돌연변이의 도입을 포함한다(예를 들어, SEQ ID NO:11 참조). N297G, N297Q, L234A, L235A 및 D265A 치환은 이펙터 기능을 없애기 때문에, 이펙터 기능을 원하는 환경에서는 이들 치환은 이용되지 않는 것이 바람직하다.
감소된 또는 제거된 이펙터 기능을 가진 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 바람직한 IgG1 서열은 치환 L234A/L235A을 포함할 것이다(SEQ ID NO:60):
Figure pct00037
여기서 X는 리신(K)이거나 부재한다.
Fc 도메인을 포함하는 단백질의 혈청 반감기는 FcRn에 대한 Fc 도메인의 결합 친화성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "반감기"는 투여 후 분자의 평균 생존 시간의 척도인 분자의 약동학적 특성을 의미한다. 반감기는 대상의 신체(예를 들어, 인간 환자 또는 다른 포유류) 또는 그것의 특정 구획으로부터 분자의 기지량의 50퍼센트(50%)를 제거하는데 필요한 시간으로서 표시될 수 있으며, 예를 들어 혈청에서, 즉 순환 반감기로서, 또는 다른 조직에서 측정된다. 일반적으로, 반감기의 증가는 투여된 분자에 대해 순환 중 평균 체류 시간(MRT)의 증가를 가져온다.
일부 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 변이체 Fc 도메인을 포함하며, 상기 변이체 Fc 도메인은 야생형 Fc 도메인에 비해 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하고, 이로써 상기 분자는 (야생형 Fc 도메인을 포함하는 분자에 비해) 증가된 반감기를 가진다. 일부 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 변이체 IgG Fc 도메인을 포함하며, 상기 변이체 Fc 도메인은 238, 250, 252, 254, 256, 257, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424, 428, 433, 434, 435, 및 436으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 위치에 반감기 연장 아미노산 치환을 포함한다. Fc 도메인-함유 분자의 반감기를 증가시킬 수 있는 다수의 돌연변이가 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 M252Y, S254T, T256E, 및 이들의 조합을 포함한다. 예를 들어, 미국특허 6,277,375, 7,083,784; 7,217,797, 8,088,376; 미국특허 공개 2002/0147311; 2007/0148164; 및 PCT 공보 WO 98/23289; WO 2009/058492; 및 WO 2010/033279에 설명된 돌연변이를 참조하며, 이들은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 또한, 증진된 반감기를 가진 B7-H3-결합 분자는 Fc 도메인 잔기 250, 252, 254, 256, 257, 288, 307, 308, 309, 311, 378, 428, 433, 434, 435 및 436 중 둘이상에 치환을 포함하는 변이체 Fc 도메인을 지닌 것들을 포함한다. 특히, 둘 이상의 치환은 T250Q, M252Y, S254T, T256E, K288D, T307Q, V308P, A378V, M428L, N434A, H435K, 및 Y436I로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 아래의 치환을 포함하는 변이체 IgG Fc 도메인을 지닌다:
(A) M252Y, S254T 및 T256E;
(B) M252Y 및 S254T;
(C) M252Y 및 T256E;
(D) T250Q 및 M428L;
(E) T307Q 및 N434A;
(F) A378V 및 N434A;
(G) N434A 및 Y436I;
(H) V308P 및 N434A; 또는
(I) K288D 및 H435K.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 치환: M252Y, S254T 및 T256E 중 임의의 1, 2 또는 3개를 포함하는 변이체 IgG Fc 도메인을 지닌다. 더 나아가, 본 발명은 아래의 돌연변이를 포함하는 변이체 Fc 도메인을 지닌 B7-H3-결합 분자를 포함한다:
(A) 이펙터 기능 및/또는 FcγR을 변경하는 하나 이상의 돌연변이; 및
(B) 혈청 반감기를 연장하는 하나 이상의 돌연변이.
Fc 도메인-함유 제1 및 제3 폴리펩타이드 사슬이 동일하지 않은 특정 항체, 디아바디 및 3가 결합 분자의 경우, 2개의 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인 사이에서 또는 2개의 제3 폴리펩타이드 사슬의 CH2-CH3 도메인 사이에서 발생하는 호모다이머화를 감소시키거나 방지하는 것이 바람직하다. 이러한 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및/또는 CH3 도메인은 서열이 동일해야 할 필요가 없으며, 유익하게는 두 폴리펩타이드 사슬 사이에 복합체화가 이루어지도록 변형된다. 예를 들어, 아미노산 치환(바람직하게는 "놉"을 형성하는 벌크한 측쇄를 포함하는 아미노산으로의 치환, 예를 들어 트립토판)이 CH2 또는 CH3 도메인에 도입될 수 있고, 이로써 입체 장해가 유사하게 돌연변이된 도메인과의 상호작용을 방지하고 돌연변이된 도메인이 상보성, 또는 수용적 돌연변이가 조작되어 넣어진 도메인, 즉 "홀"(예를 들어, 글리신으로의 치환)과 쌍을 이루도록 할 것이다. 이러한 세트의 돌연변이는 Fc 도메인을 형성하는 CH2-CH3 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드 쌍에 조작되어 넣어짐으로써 헤테로다이머화가 이루어질 수 있다. 호모다이머화에 비해 헤테로다이머화를 선호하도록 단백질을 조작하는 방법은 특히 면역글로불린-유사 분자의 조작과 관련하여 당업계에 잘 알려져 있으며 본원에 포함된다(예를 들어, Ridgway et al.(1996) "'Knobs-Into-Holes' Engineering Of Antibody CH3 Domains For Heavy Chain Heterodimerization," Protein Engr. 9:617-621, Atwell et al.(1997) "Sta-ble Heterodimers From Remodeling The Domain Interface Of A Homodimer Using A Phage Display Library," J. Mol. Biol. 270:26-35, 및 Xie et al.(2005) "A New Format Of Bispecific Antibody:Highly Efficient Heterodimerization, Expression And Tumor Cell Lysis," J. Immunol. Methods 296:95-101 참조; 이들은 각각 그 전체가 본원에 참고로 포함된다).
바람직한 놉은 변형 T366W를 함유하도록 IgG Fc 도메인을 변형함으로써 생성된다. 바람직한 홀은 변형 T366S, L368A 및 Y407V를 함유하도록 IgG Fc 도메인을 변형함으로써 생성된다. 최종 이중특이적 헤테로다이머 Fc 도메인-함유 분자로부터 홀-보유 제3 폴리펩타이드 사슬 호모다이머를 정제하는데 도움이 되도록, 제3 폴리펩타이드 사슬의 홀-보유 CH2 및 CH3 도메인의 단백질 A 결합 부위는 바람직하게 위치 435에서의 아미노산 치환(H435R)에 의해 돌연변이된다. 따라서, 홀-보유 제3 폴리펩타이드 사슬 호모다이머는 단백질 A와 결합하지 않을 것이고, 이중특이적 헤테로다이머는 제1 폴리펩타이드 사슬 상의 단백질 A 결합 부위를 통해서 단백질 A와 결합하는 능력을 보유할 것이다. 대안의 구체예에서, 홀-보유 제3 폴리펩타이드 사슬은 위치 434 및 435에서의 아미노산 치환(N434A/N435K)을 통합할 수 있다.
본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 제1 폴리펩타이드 사슬의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 바람직한 IgG 아미노산 서열은 "놉-보유" 서열(SEQ ID NO:61)을 가질 것이다:
Figure pct00038
여기서 X는 리신(K)이거나 또는 부재한다.
2개의 폴리펩타이드 사슬을 가진 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 제2 폴리펩타이드 사슬(또는 3개, 4개, 또는 5개 폴리펩타이드 사슬을 가진 Fc 도메인-함유 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬)의 CH2 및 CH3 도메인에 대한 바람직한 IgG 아미노산 서열은 "홀-보유" 서열(SEQ ID NO:62)을 가질 것이다:
Figure pct00039
여기서 X는 리신(K)이거나 또는 부재한다.
주지된 대로, SEQ ID NO:61, 및 SEQ ID NO:62의 CH2-CH3 도메인은 위치 234에 알라닌 치환, 및 235에 알라닌 치환을 포함하며, 이로써 (야생형 Fc 도메인(SEQ ID NO:12)에 의해 나타나는 결합에 비해) FcγRIA(CD64), FcγRIIA(CD32A), FcγRIIB(CD32B), FcγRIIIA(CD16a) 또는 FcγRIIIB(CD16b)에 대해 감소된 결합을 나타내는(또는 실질적으로 결합을 나타내지 않는) Fc 도메인을 형성한다. 또한, 본 발명은 야생형 알라닌 잔기, Fc 도메인의 이펙터 기능 및/또는 FγR 결합 활성을 변형하는 대안의 및/또는 추가의 치환을 포함하는 이러한 CH2-CH3 도메인을 포함한다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 반감기 연장 아미노산 치환을 더 포함하는 이러한 CH2-CH3 도메인을 포함한다. 특히, 본 발명은 M252Y/S254T/T256E를 더 포함하는 이러한 홀-보유 및 이러한 놉-보유 CH2-CH3 도메인을 포함한다.
제1 폴리펩타이드 사슬은 SEQ ID NO:61의 것과 같은, "놉-보유" CH2-CH3 서열을 가지게 되는 것이 바람직하다. 그러나, 인정된 대로, "홀-보유" CH2-CH3 도메인(예를 들어, SEQ ID NO:62)도 제1 폴리펩타이드 사슬에 이용될 수 있었으며, 이 경우 "놉-보유" CH2-CH3 도메인(예를 들어, SEQ ID NO:61)은 2개의 폴리펩타이드 사슬을 가진 본 발명의 Fc 도메인-함유 분자의 제2 폴리펩타이드 사슬에(또는 3개, 4개, 또는 5개 폴리펩타이드 사슬을 가진 Fc 도메인-함유 분자의 제3 폴리펩타이드 사슬에) 이용될 수 있다
다른 구체예에서, 본 발명은 그 전체가 본원에 참고로 포함되는 PCT 공보 WO 2007/110205; WO 2011/143545; WO 2012/058768; WO 2013/06867에 개시된 것들과 같은, 당업계에 공지된 돌연변이를 사용하여 호모다이머화보다 헤테로다이머화를 선호하도록 조작된 CH2 및/또는 CH3 도메인을 포함하는 B7-H3-결합 분자를 포함한다.
VIII. 이펙터 세포 결합 능력
본원에서 제공된 대로, B7-H3-ADC 분자를 포함하는, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 표적 세포 또는 조직 타입에 특유한 일련의 항원을 인식하는 에피토프-결합 부위들의 조합을 포함하도록 조작될 수 있다. 특히, 본 발명은 B7-H3의 에피토프와 T 림프구, 자연살해(NK) 세포 또는 다른 단핵 세포와 같은 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프에 결합할 수 있는 다중특이적 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 CD2, CD3, CD8, CD16, T-세포 수용체(TCR), 또는 NKG2D에 면역특이적으로 결합하는 에피토프-결합 부위를 포함하도록 구성될 수 있다. 본 발명은 또한 CD3의 에피토프와 CD8의 에피토프에 결합할 수 있는 삼중특이적 B7-H3-결합 분자에 관한 것이다(예를 들어, PCT 공보 WO 2015/ 026894 참조).
A. CD2 결합 능력
한 구체예에서, 본 발명의 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 B7-H3-결합 분자는 B7-H3의 에피토프 및 CD2의 에피토프에 결합할 수 있다. CD2는 T 세포 및 자연살해(NK) 세포의 표면에서 발견되는 세포 유착 분자이다. CD2는 NK 세포 세포독성을 증진시키며, 아마 NK 세포 나노튜브 형성의 촉진제일 것이다(Mace, E.M. et al.(2014) "Cell Biological Steps and Checkpoints in Accessing NK Cell Cytotoxicity," Immunol. Cell. Biol. 92(3):245-255; Comerci C.J. et al.(2012) "CD2 Promotes Human Natural Killer Cell Membrane Nanotube Formation," PLoS One 7(10):e47664: 1-12). CD2에 특이적으로 결합하는 분자는 항-CD2 항체 "Lo-CD2a"를 포함한다.
Lo-CD2a(ATCC Accession No: 11423)의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:63)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00040
Lo-CD2a(ATCC Accession No: 11423)의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:64)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00041
B. CD3 결합 능력
한 구체예에서, 본 발명의 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 B7-H3-결합 분자는 B7-H3의 에피토프 및 CD3의 에피토프에 결합할 수 있다. CD3는 4개의 독립된 사슬로 이루어진 T-세포 공-수용체이다(Wucherpfennig K.W. et al.(2010) "Structural Biology Of The T-Cell Receptor: Insights Into Receptor Assembly, Ligand Recognition, And Initiation Of Signaling," Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2(4):a005140; pages 1-14). 포유류에서 이 복합체는 CD3γ 사슬, CD3δ 사슬 및 2개의 CD3ε 사슬을 함유한다. 이들 사슬은 T-세포 수용체(TCR)라고 알려진 분자와 회합하여 T 림프구에서 활성화 신호를 생성한다. CD3의 부재하에서는 TCR이 적절히 조립되지 않고 퇴화된다(Thomas S. et al.(2010) "Molecular Immunology Lessons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2): 170-177). CD3은 모든 성숙한 T-세포의 막에 결합되는 것으로 밝혀졌고 사실상 다른 세포 타입에는 결합되지 않는다(Janeway C.A. et al.(2005) In: Immunobiology: The Immune System In Health And Disease," 6th ed. Garland Science Publishing, NY, pp. 214- 216; Sun Z. J. et al.(2001) "Mechanisms Contributing To T Cell Receptor Signaling And Assembly Revealed By The Solution Structure Of An Ectodomain Fragment Of The CD3ε:γ Heterodimer," Cell 105(7):913-923; Kuhns M.S. et al.(2006) "Deconstructing The Form And Function Of The TCR/CD3 Complex," Immunity. 2006 Feb;24(2):133-139). CD3에 특이적으로 결합하는 분자는 항-CD3 항체 "CD3 mAb-1" 및 "OKT3"을 포함한다. 항-CD3 항체 CD3 mAb-1은 비-인간 영장류(예를 들어, 사이노몰거스 원숭이)에 결합할 수 있다.
CD3 mAb-1의 VH 도메인 VH(1)의 아미노산 서열(SEQ ID NO:65)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00042
CD3 mAb-1의 대안의 VH 도메인 VH(2)의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:66)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 단일 밑줄로 표시된다; CD3 mAb-1 VH(1)의 VH 도메인(SEQ ID NO:65)과의 차이는 이중 밑줄로 표시된다):
Figure pct00043
CD3 mAb-1의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQID NO:67)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00044
본 발명에 따른 기능적 CD3-결합 분자를 형성하기 위해 CD3 mAb-1의 VH 도메인 VH(1)(SEQ ID NO:65)이 CD3 mAb-1의 VL 도메인(SEQ ID NO:67)과 함께 사용될 수 있다. 마찬가지로, 본 발명에 따른 기능적 CD3-결합 분자를 형성하기 위해 CD3 mAb-1의 VH 도메인 VH(2)(SEQ ID NO:66)이 CD3 mAb-1의 VL 도메인(SEQ ID NO:67)과 함께 사용될 수 있다.
아래 논의된 대로, 본 발명을 더 잘 예시하기 위해 이중특이적 B7-H3 x CD3-결합 분자가 제조되었다. B7-H3 x CD3 구성물의 일부에는 CD3 mAb-1의 변이체가 이용되었다. 변이체 "CD3 mAb-1(D65G)"는 CD3 mAb-1의 VL 도메인(SEQ ID NO:67) 및 D65G 치환(Kabat 위치 65, SEQ ID NO:65의 잔기 68에 상응함)을 가진 CD3 mAb-1의 VH 도메인을 포함한다. CD3 mAb-1(D65G)의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO: 68)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시되고, 치환된 위치(D65G)는 이중 밑줄로 표시된다):
Figure pct00045
대안으로, CD3mAb-1의 친화성 변이체가 포함될 수 있다. 변이체는 "CD3 mAb-1 Low"로 지정된 저 친화성 변이체 및 "CD3 mAb-1 Fast"로 지정된 더 빠른 오프 레이트를 가진 변이체를 포함한다. CD3 mAb-1의 VL 도메인(SEQ ID NO:67)이 CD3 mAb-1 Low 및 CD3 mAb1 Fast에 공통되며 상기 제공된다. CD3 mAb-1 Low 및 CD3 mAb-1 Fast의 각각의 VH 도메인의 아미노산 서열은 아래 제공된다.
항-인간 CD3 mAb-1 Low의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:69)이 아래 제공된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다; CD3 mAb-1 VH(1)의 VH 도메인(SEQ ID NO: 65)과의 차이는 이중 밑줄로 표시된다):
Figure pct00046
항-인간 CD3 mAb-1 Fast의 VH 사슬 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:70)이 아래 제공된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다; CD3 mAb-1 VH(1)의 VH 도메인(SEQ ID NO: 65)과의 차이는 이중 밑줄로 표시된다):
Figure pct00047
이용될 수 있는 다른 항-CD3 항체는 항체 뮤로노납-CD3 "OKT3"이다(Xu et al.(2000) "In Vitro Characterization Of Five Humanized OKT3 Effector Function Variant Antibodies," Cell. Immunol. 200:16-26; Norman D.J.(1995) "Mechanisms Of Action And Overview Of OKT3," Ther. Drug Monit. 17(6):615-620; Canafax D.M. et al.(1987) "Monoclonal Antilymphocyte Antibody (OKT3) Treatment Of Acute Renal Allograft Rejection," Pharmacotherapy 7(4):121-124; Swinnen L.J. et al(1993) "OKT3 Monoclonal Antibodies Induce Interleukin-6 And Interleukin-10: A Possible Cause Of Lymphoproliferative Disorders Associated With Trans-plantation," Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2(4):670-678).
OKT3의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:71)이 아래 제시된다((CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00048
OKT3의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:72)이 아래 제시된다((CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00049
이용될 수 있는 추가의 항-CD3 항체는, 제한은 아니지만, PCT 공보 WO 2008/ 119566; 및 WO 2005/118635에 설명된 것들을 포함한다.
C. CD8 결합 능력
한 구체예에서, 본 발명의 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 B7-H3-결합 분자는 B7-H3의 에피토프 및 CD8의 에피토프에 결합할 수 있다. CD8은 세포독성 T-세포에서 발현된 2개의 독립된 사슬로 이루어진 T-세포 공-수용체이다(Leahy D.J.(1995) "A Structural View of CD4 and CD8," FASEB J., 9:17-25). CD8+ T-세포의 활성화는 표적 세포의 표면에 배열된 항원:주 조직적합성 I형(MHC I) 분자 복합체와 CD8+ T-세포의 표면에 배열된 CD8과 T-세포 수용체의 복합체 사이의 공-자극 상호작용을 통해서 매개된다는 것이 밝혀졌다(Gao G. and Jakobsen B.(2000). "Molecular interactions of coreceptor CD8 and MHC classI: the molecular basis for functional coordination with the T-Cell Receptor".　Immunol Today　21: 630-636). 특정한 면역 시스템 세포에 의해서만 발현되는 MHC II 분자와 달리, MHC I 분자는 매우 광범위하게 발현된다. 따라서, 세포독성 T-세포는 광범위한 세포 타입에 결합할 수 있다. 활성화된 세포독성 T-세포는 사이토톡신 퍼포린, 그랜자임 및 그래눌리신의 방출을 통해서 세포 살해를 매개한다. CD8에 특이적으로 결합하는 항체는 항-CD8 항체 "OKT8" 및 "TRX2"를 포함한다.
OKT8의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:73)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00050
OKT8의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:74)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00051
TRX2의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:75)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00052
TRX2의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:76)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00053
D. CD16 결합 능력
한 구체예에서, 본 발명의 다중특이적 B7-H3-결합 분자는 B7-H3의 에피토프 및 CD16의 에피토프에 결합할 수 있다. CD16은 FcγRIIIA 수용체이다. CD16은 호중구, 호산구, 자연살해(NK) 세포, 및 응집된 모노머가 아닌 인간 IgG에 결합하는 조직 대식세포에 의해 발현된다(Peltz G.A. et al.(1989) "Human Fc Gamma RIII: Cloning, Expression, And Identification Of The Chromosomal Locus Of Two Fc Receptors For IgG," Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 86(3):1013-1017; Bachanova V. et al.(2014) "NK Cells In Therapy Of Cancer," Crit. Rev. Oncog. 19(1-2):133-141; Miller J.S.(2013) "Therapeutic Applications: Natural Killer Cells In The Clinic," Hematology Am. Soc. Hematol. Educ. Program. 2013:247-253; Youinou P. et al.(2002) "Pathogenic Effects Of Anti-Fc Gamma Receptor IIIB (CD16) On Polymorphonuclear Neutrophils In Non-Organ-Specific Autoimmune Dis-eases," Autoimmun Rev. 1(1-2):13-19; Peipp M. et al.(2002) "Bispecific Anti-bodies Targeting Cancer Cells," Biochem. Soc. Trans. 30(4):507-511). CD16에 특이적으로 결합하는 분자는 항-CD16 항체 "3G8" 및 "A9"를 포함한다. 인간화된 A9 항체는 PCT 공보 WO 03/101485에 설명된다.
3G8의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:77)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00054
3G8의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:78)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00055
A9의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:79)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00056
A9의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:80)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00057
이용될 수 있는 추가의 항-CD19 항체는, 제한은 아니지만, PCT 공보 WO 03/ 101485; 및 WO 2006/125668에 설명된 것들을 포함한다.
E. TCR 결합 능력
한 구체예에서, 본 발명의 이중특이적, 삼중특이적 또는 다중특이적 B7-H3-결합 분자는 B7-H3의 에피토프 및 T 세포 수용체(TCR)의 에피토프에 결합할 수 있다. T 세포 수용체는 CD4+ 또는 CD8+ 세포에 의해 자생적으로 발현되고 이러한 세포가 항원-제시 세포의 I형 또는 II형 MHC 단백질에 의해 결합되고 제시되는 항원성 펩타이드를 인식하는 것을 허용한다. TCR에 의한 pMHC(펩타이드-MHC) 복합체의 인식은 사이토카인의 생성 및 항원-제시 세포의 세포용해를 초래하는 세포 면역반응의 전파를 개시한다(예를 들어, Armstrong K.M. et al.(2008) "Conformational Changes And Flexibility In T-Cell Receptor Recognition Of Peptide-MHC Comp-lexes," Biochem. J. 415(Pt 2):183-196; Willemsen R.(2008) "Selection Of Human Antibody Fragments Directed Against Tumor T-Cell Epitopes For Adoptive T-Cell Therapy," Cytometry A. 73(11):1093-1099; Beier K.C. et al.(2007) "Master Swi-tches Of T-Cell Activation And Differentiation," Eur. Respir. J. 29:804-812; Mallone R. et al.(2005) "Targeting T Lymphocytes For Immune Monitoring And Intervention In Autoimmune Diabetes," Am. J. Ther. 12(6):534-550 참조). CD3는 TCR에 결합하는 수용체이다(Thomas S. et al.(2010) "Molecular Immunology Less-ons From Therapeutic T-Cell Receptor Gene Transfer," Immunology 129(2):170-177; Guy C.S. et al.(2009) "Organization Of Proximal Signal Initiation At The TCR:CD3 Complex," Immunol. Rev. 232(1):7-21; St. Clair E.W.(Epub 2009 Oct 12) "Novel Targeted Therapies For Autoimmunity," Curr. Opin. Immunol. 21(6):648-657; Baeuerle P.A. et al.(Epub 2009 Jun 9) "Bispecific T-Cell Engaging Anti-bodies For Cancer Therapy," Cancer Res. 69(12):4941-4944; Smith-Garvin J.E. et al.(2009) "T Cell Activation," Annu. Rev. Immunol. 27:591-619; Renders L. et al.(2003) "Engineered CD3 Antibodies For Immunosuppression," Clin. Exp. Immunol. 133(3):307-309).
T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 분자는 항-TCR 항체 "BMA 031"을 포함한다(EP 0403156; Kurrle R. et al.(1989) "BMA 031 - A TCR-Specific Monoclonal Antibody For Clinical Application," Transplant Proc. 21(1 Pt 1):1017-1019; Nashan B. et al.(1987) "Fine Specificity Of A Panel Of Antibodies Against The TCR/CD3 Complex," Transplant Proc. 19(5):4270-4272; Shearman C.W. et al(1991) "Construction, Expression, And Biologic Activity Of Murine/Human Chimeric Antibodies With Specificity For The Human α/β T Cell," J. Immunol. 146 (3):928-935; Shearman C.W. et al.(1991) "Construction, Expression And Charac-terization of Humanized Antibodies Directed Against The Human α/β T Cell Receptor," J. Immunol. 147(12):4366-4373).
BMA 031의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:81)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00058
BMA 031의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:82)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00059
F. NKG2D 결합 능력
한 구체예에서, 본 발명의 다중특이적 B7-H3-결합 분자는 B7-H3의 에피토프 및 NKG2D 수용체의 에피토프에 결합할 수 있다. NKG2D 수용체는 모든 인간(및 다른 포유류) 자연살해 세포(Bauer S. et al.(1999) "Activation Of NK Cells And T Cells By NKG2D, A Receptor For Stress-Inducible MICA," Science 285(5428):727-729; Jamieson A.M. et al.(2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1):19-29) 및 모든 CD8+ T 세포(Groh, V. et al. (2001) "Costimulation Of CD8αβ T Cells By NKG2D Via Engagement By MIC Induced On Virus-Infected Cells," Nat. Immunol. 2 (3):255-260; Jamieson A.M. et al.(2002) "The Role Of The NKG2D Immunoreceptor In Immune Cell Activation And Natural Killing," Immunity 17(1):19-29)에서 발현된다. 이러한 결합 리간드, 및 특히 정상 세포에서는 발현되지 않는 것들은 레티노산 조기 유도형 유전자-1(RAE-1)의 생성물인 조직적합성 60(H60) 분자, 및 뮤린 UL16-결합 단백질-유사 전사체 1(MULT1)을 포함한다(Raulet D.H.(2003) "Roles Of The NKG2D Immunoreceptor And Its Ligands," Nature Rev. Immunol. 3:781-790; Coudert J.D. et al.(2005) "Altered NKG2D Function In NK Cells Induced By Chronic Exposure To Altered NKG2D Ligand-Expressing Tumor Cells," Blood 106: 1711-1717). NKG2D 수용체에 특이적으로 결합하는 분자는 항-NKG2D 항체 "KYK-1.0" 및 "KYK-2.0"을 포함한다(Kwong K.Y. et al.(2008) "Generation, Affinity Matura-tion, And Characterization Of A Human Anti-Human NKG2D Monoclonal Antibody With Dual Antagonistic And Agonistic Activity," J. Mol. Biol. 384:1143-1156; 및 PCT/US09/54911).
KYK-1.0의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:83)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00060
KYK-1.0의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:84)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00061
KYK-2.0의 VH 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:85)이 아래 제시된다(CDRH 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00062
KYK-2.0의 VL 도메인의 아미노산 서열(SEQ ID NO:86)이 아래 제시된다(CDRL 잔기는 밑줄로 표시된다):
Figure pct00063
IX. 다중특이적 B7-H3-결합 분자
A. B7-H3 x CD3 이중특이적 2개 사슬 디아바디
상기 설명된 B7-H3 결합 분자의 VL 및 VH 도메인은 2개의 공유 결합된 폴리펩타이드 사슬로 이루어진 B7-H3 x CD3 이중특이적 디아바디를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 이 양태를 예시하기 위해, 상기 설명된 항-B7-H3 mAb-D 항체의 VL 및 VH 도메인이 2개의 공유 결합된 폴리펩타이드 사슬로 이루어지고 mAb-D의 상기 논의된 뮤린 또는 인간화된 VL 및 VH 도메인을 포함하는 B7-H3 x CD3 이중특이적 디아바디를 구성하는데 사용된다. 이러한 B7-H3 x CD3 이중특이적 디아바디의 일반적인 구조 및 아미노산 서열이 아래 제공된다.
하나의 예시적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 2개 사슬 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단; 항-B7-H3 항체의 VL 도메인(예를 들어, mAb-D VL(SEQ ID NO:22) 또는 hmAb-D VL(SEQ ID NO:30)); 개재 스페이서 펩타이드(링커 1: GGGSGGGG(SEQ ID NO:32)); 항-CD3 항체의 VH 도메인(예를 들어, CD3 mAb 1(D65G)(SEQ ID NO:68)); 시스테인-함유 개재 스페이서 펩타이드(링커 2: GGCGGG(SEQ ID NO:33)); 헤테로다이머-촉진(예를 들어, E-코일) 도메인(EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:45)); 및 C-말단을 포함한다.
이러한 예시적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 2개 사슬 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단; 상응하는 항-CD3 항체의 VL 도메인(예를 들어, 제1 폴리펩타이드 사슬의 VH 도메인과 함께 CD3-결합 부위를 형성하는 VL 도메인, 예를 들어 CD3 mAb-1의 VL 도메인(SEQ ID NO:67); 개재 스페이서 펩타이드(링커 1: GGGSGGGG(SEQ ID NO:32)); 상응하는 항-B7-H3 항체의 VH 도메인(예를 들어, 제1 폴리펩타이드 사슬의 VL 도메인과 함께 B7-H3-결합 부위를 형성하는 VH 도메인, 예를 들어 mAb-D VH(SEQ ID NO:26) 또는 hmAb-D VH(SEQ ID NO:31)); 시스테인-함유 개재 스페이서 펩타이드(링커 2: GGCGGG(SEQ ID NO:33)); 헤테로다이머-촉진(예를 들어, K-코일) 도메인(KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO:46)); 및 C-말단을 포함한다.
본원에서 제공된 대로, 대안의 링커 및/또는 대안의 헤테로다이머-촉진 도메인이 이러한 디아바디의 생성에서 이용될 수 있다. 예를 들어, 대안의 예시적인 B7-H3 x CD3 2개 사슬 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단; 항-B7-H3 항체의 VL 도메인; 개재 스페이서 펩타이드(링커 1: GGGSGGGG(SEQ ID NO:32)); 항-CD3 항체의 또는 상응하는 항-CD3 항체의 VH 도메인; 개재 스페이서 펩타이드(링커 2: ASTKG(SEQ ID NO:37)); 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진(예를 들어, K-코일) 도메인(KVAACKE-KVAALKE-KVAALKE-KVAALKE(SEQ ID NO: 46)); 및 C-말단을 포함할 수 있다. 이러한 대안의 예시적인 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬은, N-말단에서 C-말단 방향으로, N-말단; 상응하는 항-CD3 항체의 VL 도메인;개재 스페이서 펩타이드(링커 1: GGGSGGGG(SEQ ID NO:32)); 상응하는 항-B7-H3 항체의 VH 도메인(예를 들어, mAb-D VH(SEQ ID NO:26) 또는 hmAb-D VH(SEQ ID NO:31)); 개재 스페이서 펩타이드(링커 2: ASTKG(SEQ ID NO:37)); 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진(예를 들어, E-코일)도메인(EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK (SEQ ID NO: 47)); 및 C-말단을 포함할 수 있다.
1. DART-D1
hmAb-C의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 대표적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 2개 사슬 디아바디(DART-D1)가 구성된다.
DART-D1의 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열(SEQ ID NO:87)이 아래 제시된다(hmAb-C VL 도메인의 서열(SEQ ID NO:20)에 밑줄이 쳐진다):
Figure pct00064
DART-D1의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열(SEQ ID NO:88)이 아래 제시된다(hmAb-C VH 도메인의 서열(SEQ ID NO:21)에 밑줄이 쳐진다):
Figure pct00065
2. DART-D2
hmAb-D의 VH 및 VL 도메인을 포함하는 대표적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 2개 사슬 디아바디(DART-D2)가 구성된다.
DART-D2의 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열(SEQ ID NO:89)이 아래 제시된다(hmAb-D VL 도메인의 서열(SEQ ID NO:30)에 밑줄이 쳐진다):
Figure pct00066
DART-D2의 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열(SEQ ID NO:90)이 아래 제시된다(hmAb-D VH 도메인의 서열(SEQ ID NO:31)에 밑줄이 쳐진다):
Figure pct00067
본원에서 제공된 교시에 비추어 상이한 도메인 배향, VH 도메인, VL 도메인, 링커 및/또는 헤테로다이머 촉진 도메인이 대안의 B7-H3 x CD3 이중특이적 2개 사슬 디아바디를 생성하기 위해 이용될 수 있다는 것이 인정될 것이다.
B. B7-H3 x CD3 이중특이적 3개 사슬 디아바디
3개 사슬을 가지고 Fc 도메인을 지닌 B7-H3 x CD3 디아바디는 B7-H3에 특이적인 하나의 결합 부위(hmAb-D의 인간화된 VH 및 VL 도메인을 포함하는)와 CD3에 특이적인 하나의 결합 부위(CD3 mAb 1(D65G)의 VL 및 VH 도메인을 포함하는)를 갖도록 생성된다. 이 디아바디는 "DART-D3"로 지칭된다.
예시적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 3개 사슬 DART-D3 디아바디의 제1 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로 N-말단; 항-B7-H3 항체의 VL 도메인 (hmAb-D VH(SEQ ID NO:30); 개재 스페이서 펩타이드(링커 1: GGGSGGGG(SEQ ID NO:32)); CD3 mAb-1(D65G)의 VH 도메인(SEQ ID NO:68); 개재 스페이서 펩타이드(링커 2: ASTKG(SEQ ID NO:37)); 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진(E-코일) 도메인 (EVAACEK-EVAALEK-EVAALEK-EVAALEK(SEQ ID NO:47)); 개재 스페이서 펩타이드(링커 3: GGGDKTHTCPPCP(SEQ ID NO:57)); 놉-보유 IgG1 CH2-CH3 도메인(SEQ ID NO:61); 및 C-말단을 포함한다. 이 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:61의 C-말단 리신 잔기(즉, SEQ ID NO:61의 X)을 암호화할 수 있지만, 상기 논의된 대로 이 리신 잔기는 일부 발현 시스템에서는 번역 후 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 리신 잔기를 함유하는 이러한 제1 폴리펩타이드 사슬(즉, SEQ ID NO:61, 여기서 X는 리신이다), 뿐만 아니라 이러한 리신 잔기를 결여하는 제1 폴리펩타이드 사슬(즉, SEQ ID NO:6, 여기서 X는 부재한다)을 포함한다. 이러한 제1 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열(SEQ ID NO:91)이 아래 제공된다(hmAb-D VL 도메인의 서열(SEQ ID NO:30)에 밑줄이 쳐진다):
Figure pct00068
여기서 X는 리신(K)이거나 부재한다.
예시적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 3개 사슬 DART-D3 디아바디의 제2 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향으로 N-말단; CD3 mAb-1의 VL 도메인(SEQ ID NO:67); 개재 스페이서 펩타이드(링커 1: GGGSGGGG(SEQ ID NO:32)); 항-B7-H3 항체의 VH 도메인(hmAb-D VH(SEQ ID NO:31); 개재 스페이서 펩타이드(링커 2: ASTKG (SEQ ID NO:37)); 시스테인-함유 헤테로다이머-촉진(K-코일) 도메인(KVAACKE - KVAAL KE - KVAAL KE - KVAAL KE(SEQ ID NO:48)); 및 C-말단을 포함한다. 이러한 제2 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열(SEQ ID NO:92)이 아래 제공된다(hmAb-D VH 도메인의 서열(SEQ ID NO:31)에 밑줄이 쳐진다):
Figure pct00069
예시적인 B7-H3 x CD3 이중특이적 3개 사슬 DART-D3 디아바디의 제3 폴리펩타이드 사슬은 N-말단에서 C-말단 방향을 N-말단; 스페이서 펩타이드(DKTHTCPPCP (SEQ ID NO:56)); 홀-보유 IgGl CH2-CH3 도메인(SEQ ID NO:62); 및 C-말단을 포함한다. 이 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:62의 C-말단 리신 잔기(즉, SEQ ID NO:62의 X)을 암호화할 수 있지만, 상기 논의된 대로 리신 잔기는 일부 발현 시스템에서는 번역 후 제거될 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 리신 잔기를 함유하는 이러한 제3 폴리펩타이드 사슬(즉, SEQ ID NO:62, 여기서 X는 리신이다), 뿐만 아니라 이러한 리신 잔기를 결여하는 제3 폴리펩타이드 사슬(즉, SEQ ID NO:62, 여기서 X는 부재한다)을 포함한다. 이러한 제3 폴리펩타이드 사슬의 아미노산 서열(SEQ ID NO:93)이 아래 제공된다:
Figure pct00070
여기서 X는 리신(K)이거나 부재한다.
본원에서 제공된 교시에 비추어 상이한 도메인 배향, VH 도메인, VL 도메인, 링커 및/또는 헤테로다이머 촉진 도메인은 대안의 B7-H3 x CD3 이중특이적 3개 사슬 디아바디를 생성하기 위해 이용될 수 있다. 특히, hmAb-C의 VH 도메인 및 VL 도메인(SEQ ID NO:20-21)이 이용될 수 있다.
C. B7-H3 x CD3 x CD8 3가 결합 분자
예시적인 3가 "B7-H3 x CD3 x CD8" 결합 분자는 B7-H3에 특이적인 하나의 결합 부위(상기 설명된 대로, 모 및/또는 인간화된 항-B7-H3-VL 도메인 및 상응하는 항-B7-H3-VH 도메인을 포함하는), CD3에 특이적인 하나의 결합 부위(예를 들어, CD3 mAb-1의 VL 도메인(SEQ ID NO:67) 및 항-CD3 항체(예를 들어, CD3 mAb 1(D65G)의 VH 도메인(SEQ ID NO:68)을 포함하는), 및 CD8에 특이적인 하나의 결합 부위(예를 들어, TRX2의 VH 및 VL 도메인(각각 SEQ ID NO:75 및 76)을 포함하는)을 가진다. 이러한 3가 결합 분자는 2개의 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, 도 6E, 및 도 6F 참조), 3개의 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, 도 6C 및 도 6D 참조), 4개의 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, 도 6A 및 도 6B 참조), 또는 5개의 폴리펩타이드 사슬(예를 들어, 도 5 참조)을 가질 수 있다.
X. 제조 방법
본 발명의 B7-H3-결합 분자는 가장 바람직하게 당업계에 잘 공지된 대로 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 분자의 재조합 발현을 통해서 생성된다.
본 발명의 폴리펩타이드는 고체상 펩타이드 합성을 사용하여 편리하게 제조될 수 있다(Merrifield, B. (1986) "Solid Phase Synthesis" Science 232(4748): 341-347; Houghten, R.A. (1985) "General Method For The Rapid Solid-Phase Synthesis Of Large Numbers Of Peptides: Specificity Of Antigen-Antibody Interaction At The Level Of Individual Amino Acids," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 82(15):5131-5135; Ganesan, A. (2006) "Solid-Phase Synthesis In The Twenty-First Century," Mini Rev. Med. Chem. 6(1):3-10).
대안으로, 항체는 재조합 방식으로 제조되고 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 발현될 수 있다. 항체는 먼저 숙주 동물로부터 제조된 항체를 분리하고 유전자 서열을 획득하고 이 유전자 서열을 사용하여 숙주 세포(예를 들어, CHO 세포)에서 재조합 방식으로 항체를 발현함으로써 재조합 방식으로 제조될 수 있다. 이용될 수 있는 다른 방법은 식물(예를 들어, 담배) 또는 트랜스제닉 밀크에서 항체 서열을 발현하는 것이다. 식물이나 밀크에서 재조합 방식으로 항체를 발현하기 위한 적합한 방법이 개시되었다(예를 들어, Peeters et al. (2001) "Production Of Antibodies and Antibody Fragments In Plants," Vaccine 19:2756; Lonberg, N. et al. (1995) "Human Antibodies From Transgenic Mice," Int. Rev. Immunol 13:65-93; 및 Pollock et al. (1999) "Transgenic Milk As A Method For The Production Of Recombinant Antibodies," J. Immunol Methods 231:147-157 참조). 예를 들어, 인간화된 항체, 단쇄 항체 등의 항체의 유도체를 제조하기 위한 적합한 방법이 당업계에 공지되고 상기 설명되었다. 다른 대안으로, 항체는 파지 디스플레이 기술에 의해 재조합 방식으로 제조될 수 있다(예를 들어, 미국특허 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 6,265,150; 및 Winter, G. et al. (1994) "Making Antibodies By Phage Display Technology," Annu. Rev. Immunol. 12.433-455 참조).
관심의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 본 발명의 B7-H3-결합 분자의 폴리펩타이드 사슬을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)를 함유하는 벡터가 전기천공, 염화칼슘, 염화루비듐, 인산칼슘, DEAE-덱스트란, 또는 다른 물질을 이용한 트랜스펙션; 미소추진 충돌; 리포펙션; 및 주입(예를 들어, 벡터가 우두 바이러스와 같은 감염원인 경우)을 포함하는 다수의 적절한 수단 중 임의의 것에 의해 숙주 세포에 도입될 수 있다. 벡터 또는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 선택은 주로 숙주 세포의 특징에 따를 것이다.
이종성 DNA를 과발현할 수 있는 임의의 숙주 세포가 관심의 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현하기 위한 목적에서 사용될 수 있다. 적합한 포유류 숙주 세포의 비제한적 예는, 제한은 아니지만, COS, HeLa, 및 CHO 세포를 포함한다.
본 발명은 본 발명의 B7-H3-결합 분자의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 과정에 의해 제조될 수 있다. 폴리펩타이드는 항체의 단백질 가수분해 또는 다른 변성에 의해, 상기 설명된 것과 같은 재조합 방법에 의해(예를 들어, 단일 또는 융합 폴리펩타이드) 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 항체의 폴리펩타이드, 특히 최대 약 50개 아미노산의 짧은 폴리펩타이드는 화학적 합성에 의해 편리하게 제조된다. 화학적 합성 방법은 당업계에 공지되어 있고 상업적으로 이용할 수 있다.
본 발명은 이러한 분자의 특성에 유의한 영향을 미치지 않는 기능적으로 동등한 폴리펩타이드뿐만 아니라 증진되거나 감소된 활성을 가진 변이체를 포함하는, B7-H3-결합 분자의 변이체를 포함한다. 폴리펩타이드의 변형은 당업계에서 통상적으로 실시되며 여기 상세히 설명될 필요가 없다. 변형된 폴리펩타이드의 예는 아미노산 잔기의 보존적 치환, 기능적 활성을 유의하게 해롭게 변화시키지 않는 아미노산의 하나 이상의 결실 또는 부가, 또는 화학적 유사체의 사용을 가진 폴리펩타이드를 포함한다. 서로 보존적으로 치환될 수 있는 아미노산 잔기는, 제한은 아니지만, 글리신/알라닌; 세린/트레오닌; 발린/이소로이신/로이신; 아스파라긴/글루타민; 아스파르트산/글루탐산; 리신/아르기닌; 및 페닐알라닌/티로신을 포함한다. 이들 폴리펩타이드는 또한 글리코실화 및 비-글리코실화 폴리펩타이드, 뿐만 아니라 다른 번역 후 변형, 예컨대 예를 들어 상이한 당에 의한 글리코실화, 아세틸화 및 포스포릴화를 가진 폴리펩타이드를 포함한다. 바람직하게, 아미노산 치환은 보존적일 수 있으며, 즉 치환된 아미노산은 원래 아미노산과 유사한 화학적 특성을 지닐 수 있다. 이러한 보존적 치환은 당업계에 알려져 있고 예들이 상기 제공되었다. 아미노산 변형은 하나 이상의 아미노산의 변화 또는 변형에서부터 가변 도메인과 같은 영역의 완전한 재설계에 이르는 범위일 수 있다. 가변 도메인의 변화는 결합 친화성 및/또는 특이성을 변경할 수 있다. 다른 변형 방법은, 제한은 아니지만 효소적 수단, 산화성 치환 및 킬레이션을 포함하는 당업계에 공지된 커플링 기술의 사용을 포함한다. 변형은, 예를 들어 방사성면역분석을 위한 방사성활성 부분의 부착과 같은, 면역분석을 위한 표지의 부착을 위해 사용될 수 있다. 변형된 폴리펩타이드는 당업계에 확립된 과정을 사용하여 제조되며, 당업계에 공지된 표준 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 항-B7-H3-VL 및/또는 VH 중 하나 이상을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄, 중쇄 또는 경쇄와 중쇄를 모두 포함하는 융합 폴리펩타이드가 제공된다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩타이드는 이종성 면역글로불린 불변 영역을 함유한다. 다른 구체예에서, 융합 폴리펩타이드는 공공 기탁된 하이브리도마로부터 제조된 항체의 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 가변 도메인을 함유한다. 본 발명의 목적을 위해, 항체 융합 단백질은 B7-H3에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 폴리펩타이드 도메인 및 자생 분자, 예를 들어 다른 영역으로부터의 이종성 서열이나 상동성 서열에서는 부착되지 않는 다른 아미노산 서열을 함유한다.
본 발명은 특히 진단 또는 치료 부분에 콘쥬게이트된 B7-H3-결합 분자(예를 들어, 항체, 디아바디, 3가 결합 분자 등)를 포함한다. 진단 목적을 위해, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 검출가능한 물질에 결합될 수 있다. 이러한 B7-H3-결합 분자는 특정 치료법의 효능을 결정하는 것과 같은, 임상 시험 과정의 일부로서 질환의 발생이나 진행을 모니터링 및/또는 예측하는데 유용하다. 검출가능한 물질의 예는 다양한 효소(예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다아제, 베타-갈락토시다아제 등), 치환기(예를 들어, 아비딘/바이오틴), 형광 물질(예를 들어, 움벨리페론, 플루오레세인 또는 피코에리트린), 발광 물질(예를 들어, 루미놀), 생물발광 물질(예를 들어, 루시페라아제 또는 에쿼린), 방사성활성 물질(예를 들어, 탄소-14, 망간-54, 스트론튬-85 또는 아연-65), 양전자 방출 금속, 및 비-방사성활성 상자성 금속 이온을 포함한다. 검출가능한 물질은 B7-H3-결합 분자에 직접 또는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 중간체(예를 들어, 링커)를 통해서 간접적으로 결합되거나 콘쥬게이트될 수 있다.
치료적 목적을 위해, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 사이토톡신(예를 들어, 세포활동억제제 또는 살세포제)와 같은 치료 부분, 치료제 또는 방사성활성 금속 이온, 예를 들어 알파-에미터에 콘쥬게이트될 수 있다. 사이토톡신 또는 세포독성제는, 예를 들어 슈도모나스 외독소, 디프테리아 독소, 보툴리넘 독소 A에서 F, 리신 아브린, 사포린, 및 이러한 제제의 세포독성 단편과 같은 세포에 유해한 임의의 제제를 포함한다. 치료제는 장애를 예방적으로 또는 치료적으로 치료할 수 있는 치료 효과를 가진 임의의 제제를 포함한다. 이러한 치료제는 화학적 치료제, 단백질 또는 폴리펩타이드 치료제일 수 있으며, 원하는 생물학적 활성을 지니고 주어진 생물학적 반응을 변형하는 치료제를 포함한다. 치료제의 예들은 알킬화제, 혈관형성 억제제, 항유사분열제, 호르몬 치료제, 및 세포 증식 장애의 치료에 유용한 항체를 포함한다. 치료 부분은 B7-H3-결합 분자에 직접 또는 당업계에 공지된 기술을 사용하여 중간체(예를 들어, 링커)를 통해서 간접적으로 결합되거나 콘쥬게이트될 수 있다.
XI. 항체 약물 콘쥬게이트
본 발명은 치료적 항-인간 B7-H3 항체(또는 그것의 B7-H3 결합 도메인), 및 특히 약물에 콘쥬게이트된, 상기 설명된 항-인간 B7-H3 또는 그것의 B7-H3 결합 도메인("B7-H3-ADC" 분자) 중 어느 것에 관한 것이다. 이러한 B7-H3-ADC는 특히 암의 치료에서, 항-인간 B7-H3 치료법의 세포독성을 증진시킨다. 상기 나타낸 대로, 본 발명의 B7-H3-ADC 분자는 아래의 식을 포함한다:
Ab-(LM)m-(D)n,
여기서:
Ab는 인간화된 가변 중쇄(VH) 도메인 및 인간화된 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 B7-H3에 결합하는 항체이거나, 또는 그것의 B7-H3-결합 단편이고;
D는 세포독성 약물 부분이고;
LM은 Ab와 D를 공유 연결하는 링커 분자이고;
m은 0과 n 사이의 정수로서 B7-H3-ADC의 링커 분자의 수를 나타내고;
n은 1과 10 사이의 정수로서 ADC에 공유 연결된 세포독성 약물 부분의 수를 표시한다.
바람직한 구체예에서, B7-H3-ADC는 B7-H3을 발현하는 종양 세포에 결합할 것이고, 다음에 수용체-매개 세포내섭취를 통해서 이러한 세포에 내재화될 것이다. 일단 리소좀 내로 들어가면 B7-H3-ADC는 바람직하게 분해되고, 이로써 세포 내부로 세포독성 약물 부분의 방출을 야기하며, 그 결과 세포사가 일어난다. 인정되는 대로, 세포사의 작용 메커니즘은 사용된 세포독성 약물의 부류 등에 기초하여 다양할 수 있다(예를 들어, 메이탄시노이드 및 아우리스타틴과 같은 튜불린 중합 억제제에 의한 세포분열의 파괴, 칼키아마이신 및 듀오카르마이신과 같은 DNA 상호작용제에 의한 DNA 손상). 자유로운 약물이 종양 환경으로 방출될 때 방관자 효과라고 알려진 과정에서 세포를 죽임으로써 이웃한 암세포가 또한 사멸될 수 있다(Panowski, S. et al. (2014) "Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy " mAbs 6(l):34-45; Kovtun, Y.V. et al.(2006) "Antibody-Drug Conjugates Designed To Eradicate Tumors With Homogeneous and heterogeneous Expression Of The Target Antigen," Cancer Res. 66:3214-3221).
본 발명의 B7-H3-ADC는 Fc 도메인을 포함할 수 있고, 이것은 자연 발생 Fc 도메인일 수 있거나 또는 자연 발생 Fc 도메인과 하나 이상 차이를 가진 서열을 가질 수 있고, 완전한 Fc 도메인(예를 들어, 완전한 IgG Fc 도메인) 또는 완전한 Fc 도메인의 단지 일부일 수 있다. 이러한 Fc 도메인은 임의의 이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)을 가질 수 있다. 이러한 Fc 도메인은 CH3 도메인의 C-말단 리신 잔기를 포함할 수 있거나 또는 결여할 수 있다. 본 발명의 B7-H3-ADC는 CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인을 더 포함할 수 있다. 존재할 때, CH1 도메인 및/또는 힌지 도메인은 임의의 이소타입(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)을 가질 수 있고, 바람직하게는 원하는 Fc 도메인과 동일한 이소타입을 가질 것이다.
A. 본 발명의 예시적인 링커 분자
따라서, 본 발명은 특히 링커 분자 LM이 부재하는 B7-H3-ADC(즉, m = 0), 및 1개를 초과하는 링커 분자 LM을 가진 B7-H3-ADC(즉, m이 2 내지 n의 정수, 여기서 n은 2 내지 10의 정수이다)를 고려하며, 링커 분자 LM은 각각 세포독성 약물 부분 D를 각 B7-H3-ADC의 Ab에 공유 연결한다.
더 나아가, 본 발명은 Ab가 1개를 초과하는 링커 분자 LM에 의해 공유 연결된 B7-H3-ADC를 제공하며, 여기서 모든 이러한 링커 분자는 동일하다. 이러한 B7-H3-ADC의 Ab에 공유 연결된 세포독성 약물 부분 D는 모두 동일할 수 있거나, 또는 2, 3, 4 또는 그 이상의 독립적인 상이한 세포독성 약물 부분 D를 포함할 수 있다.
더 나아가, 본 발명은 Ab가 1개를 초과하는 링커 분자 LM에 의해 공유 연결된 B7-H3-ADC를 제공하며, 여기서 모든 이러한 링커 분자는 동일하지 않고 독립적으로 상이할 수 있다. 이러한 B7-H3-ADC의 Ab에 공유 연결된 세포독성 약물 부분 D는 모두 동일할 수 있거나, 또는 2, 3, 4 또는 그 이상의 독립적인 상이한 세포독성 약물 부분 D를 포함할 수 있다.
인간 B7-H3에 결합하는 항체의 예시적인 인간화된 VH 및 VL 도메인, 및 본 발명의 B7-H3-ADC에 포함될 수 있는 예시적인 인간 항체 불변 도메인은 상기 제공된다. 상기 언급된 대로, 본 발명의 B7-H3-ADC는 추가로 적어도 하나의 세포독성 약물 부분을 포함하고, 이것은 바람직하게 이러한 VH 도메인 또는 VL 도메인 및/또는 불변 도메인의 아미노산 잔기의 측쇄의 원자에, 직접, 또는 측쇄 원자와 약물 부분 사이에 삽입된 링커 분자를 통해, 바람직하게 공유 연결된다. 링커 분자는 비-펩타이드 분자, 또는 비-펩타이드 부분과 펩타이드 부분을 포함하는 분자일 수 있거나, 또는 그것은 오로지 아미노산 잔기로만 이루어진 분자일 수 있다. 임의의 이러한 링커 분자의 아미노산 잔기는 자연발생 아미노산 잔기의 D-버전, p-아세틸페닐알라닌, 셀레노시스테인 등을 포함하여 자연발생 또는 비-자연발생 아미노산 잔기를 함유할 수 있다. 선택적으로 또는 추가로, 원하는 측쇄(예를 들어, -CH2-SH 측쇄, -CH2-OH 측쇄, -CH(CH2)-SH 측쇄, -CH2-CH2-S-CH3 측쇄; -CH2-C(O)-NH2 측쇄, -CH2-CH2-C(O)-NH2 측쇄, -CH2-C(O)OH- 측쇄, CH2-CH2-C(O)OH- 측쇄, -CH2-CH2-CH2-CH2-NH2 측쇄, -CH2-CH2-CH2-NH-C(NH2)2 측쇄, 이미다졸 측쇄, 벤질 측쇄, 페놀 측쇄, 인돌 측쇄 등)을 가진 특정한 잔기가 본 발명의 B7-H3-ADC에 조작될 수 있다.
링커 분자는 생리학적 조건에서 절단이 불가능할 수 있으며, 예를 들어 가수분해 안정한 부분, 예를 들어 티오에테르 링커 또는 힌더드 이황화물 링커로 이루어진다. 가수분해 안정한 링커는 실질적으로 물에서 안정하고, 제한은 아니지만 연장된 시간 기간 동안 생리학적 조건에서 유용한 pH 값에서 물과 반응하지 않는다. 반면, 가수분해 불안정한 또는 분해가능한 링커는 물이나 예를 들어 혈액을 포함하는 수성 용액에서 분해될 수 있다.
대안으로, 링커 분자는 절단가능하거나 절단가능한 부분을 함유할 수 있다. 이러한 절단가능한 부분의 예로는 산 불안정 링커(예를 들어, 하이드라진 결합을 형성하는 4-(4'-아세틸페녹시)부탄산 링커), 절단가능한 이황화물 링커(환원 세포내 환경에서 절단되는), 및 프로테아제 절단가능한 링커를 포함한다. 산 불안정 링커는 혈액에서 만나는 pH 수준에서 안정적이도록 설계되지만 리소좀의 낮은 pH 환경과 만다면 불안정하게 되어 분해된다. 프로테아제 절단가능한 링커는 또한 혈액/혈장에서 안정하도록 설계되지만 리소좀 효소에 의한 절단시에 암세포에서 리소좀 내부에 자유 약물을 빠르게 방출한다(Panowski, S. et al. (2014) "Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy," mAbs 6(l):34-45). 대안으로, 링커 분자는 효소-절단가능한-기질일 수 있거나, 또는 절단가능한 펩타이드(예를 들어, 리소좀 효소에 의해 선택적으로 절단되는 발린-시트룰린 디펩타이드 파라-아미노벤질알코올 링커(cAC10-mc-vc-PABA)와 같은 절단가능한 디펩타이드)를 함유할 수 있다. 적합한 절단가능한 링커는 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 de Groot, Franciscus M.H., et al. (2002) "Design, Synthesis, and Biological Evaluation of a Dual Tumor-Specific Motive Containing Integrin-Targeted Plasmin-Cleavable Doxorubicin Prodrug,'" Molecular Cancer Therapeutics, 1:901-911; Dubowchik et al., (2002) "Doxorubicin Immunoconjugates Containing Bivalent, Lysosomally-Cleavable Dipeptide Linkages." Bioorganic & Medicinal Chemistry Lettersl2: 1529-1532; 미국특허 5547667; 6,214,345; 7,585,491; 7,754,681; 8,080,250; 8,461,117; 및 WO 02/083180를 참조한다.
효소적으로 불안정한 또는 분해가능한 링커가 사용될 수 있다. 이러한 링커는 하나 이상의 효소에 의해 분해된다. 단지 예로서, PEG 및 관련 중합체는 중합체 백본 또는 중합체 주쇄와 중합체 분자의 하나 이상의 말단 작용기 사이의 링커 기에 분해가능한 링커 분자를 포함할 수 있다. 이러한 분해가능한 링커 분자(들)은 PEG 카복실산 또는 활성화된 PEG 카복실산과 생물학적 활성제 상의 알코올 기의 반응에 의해 형성된 에스테르 결합을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니며, 이러한 에스테르 기는 일반적으로 생리학적 조건하에 가수분해되어 생물학적 활성제를 방출한다. 다른 가수분해 분해가능한 링커 분자는 카보네이트 결합을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다; 아민과 알데하이드의 반응으로부터 생성된 이민 결합; 알코올과 포스페이트 기를 반응시켜 형성된 인산 에스테르 결합; 하이드라지드와 알데하이드의 반응 생성물인 하이드라존 결합; 알데하이드와 알코올의 반응 생성물인 아세탈 결합; 포르메이트와 알코올의 반응 생성물인 오르토에스테르 결합; 제한은 아니지만 PEG와 같은 중합체 말단 및 펩타이드의 카복시 기를 포함하는 아민 기에 의해 형성된 펩타이드 결합; 및 제한은 아니지만 중합체 말단에 올리고뉴클레오타이드의 5' 하이드록실 기를 포함하는 포스포라미다이트 기에 의해 형성된 올리고뉴클레오타이드 링커 기를 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 링커 분자는 PCT 공보 WO 02/083180에 개시된 것과 같은, 아래 식을 가진 절단가능한 링커 분자, V-(W)k-(X)i-A일 수 있거나, 또는 그것을 포함할 수 있다:
Ab - [V-(W)k-(X)1-A] - D
여기서:
V는 절단가능한 LM 링커 분자이고,
(W)k-(X)1-A는 l,(4+2n)-제거를 통해 자기 제거하는, 신장된, 자기-제거 스페이서 시스템이고,
W 및 X는 각각 l,(4+2n) 전자 연쇄반응 스페이서로서 동일하거나 상이하고,
A는 식 (Y)m의 스페이서 기로서 Y가 l,(4+2n) 전자 연쇄반응 스페이서인 기, 또는 식 U의 기로서 고리화 제거 스페이서 기이고,
k, l 및 m은 독립적으로 0(포함됨) 내지 5(포함된)의 정수이고, n은 0(포함됨) 내지 10(포함됨)의 정수이며, 단
A가 (Y)m일 때 k+l+m ≥ 1, 및
만일 k+l+m = 1이면 n > 1;
A가 U일 때 k+1 ≥ 1이다.
W, X, 및 Y는 독립적으로 아래의 식:
Figure pct00071
또는
Figure pct00072
을 가진 화합물로부터 선택된다:
여기서:
Q는 -R5C=CR6-, S, O, NR5, -R5C=N-, 또는 -N=CR5-이고,
P는 NR7, O 또는 S이고,
a, b, 및 c는 독립적으로 0(포함됨) 내지 5(포함됨)의 정수이고;
I, F 및 G는 독립적으로 아래의 식을 가진 화합물로부터 선택되고:
Figure pct00073
여기서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C3-20 헤테로사이클릴, C5-20 아릴, C1-6 알콕시, 하이드록시(OH), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(SRx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP-(=0)(ORx)2)를 표시하며, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 독립적으로 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 치환체 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 또는 R9 중 둘 이상은 선택적으로 서로 연결되어 하나 이상의 지방족 또는 방향족 환형 구조를 형성하며;
U는 아래의 식을 가진 화합물로부터 선택된다:
Figure pct00074
여기서:
a, b 및 c는 독립적으로 0 또는 1의 정수가 되도록 선택되며; 단 a + b + c = 2 또는 3이고;
R1 및/또는 R2는 독립적으로 H, C1-6 알킬을 표시하며, 알킬은 선택적으로 다음의 군: 하이드록시(OH), 에테르(ORx), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(S-Rx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP(=0)(ORx)2) 중 하나 이상으로 치환되고, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되며,
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 독립적으로 H, C1-6 알킬, C3-20 헤테로사이클릴, C5-20 아릴, C1-6 알콕시, 하이드록시(OH), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(S-Rx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP(=0)(ORx)2)를 표시하며, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 치환체 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중 둘 이상은 선택적으로 서로 연결되어 하나 이상의 지방족 또는 방향족 환형 구조를 형성한다.
더 나아가, 본 발명은 LM 링커 분자가 아래의 것을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공한다:
p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
p-암모신남일옥시카보닐;
p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
p-아미노-벤질옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐;
p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p아미노벤질옥시카보닐;
p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐;
p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)-카보닐;
p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질;
p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질;
p-아미노신남일;
p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질;
p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노신남일;
p-아미노-신남일옥시카보닐-p-아미노신남일;
p-아미노페닐펜타디엔일;
p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노신남일;
p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노벤질; 또는
p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노페닐펜타디엔일.
일부 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-ADC는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 세포독성 약물 부분을 포함하며, 이들은 동일할 수 있거나 또는 독립적으로 B7-H3-ADC의 다른 세포독성 약물 부분과 동일하거나 상이할 수 있다. 한 구체예에서, 각각의 이러한 세포독성 약물 부분은 별도의 링커 분자를 통해 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab에 콘쥬게이트된다. 대안으로, 1개를 초과하는 세포독성 약물 부분이 동일한 링커 분자를 통해 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab에 부착될 수 있다.
세포독성 약물 부분은 당업계에 공지된 수단에 의해 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab에 콘쥬게이트될 수 있다(예를 들어, Yao, H. et al. (2016) "Methods to Design 및 Synthesize Antibody-Drug Conjugates (ADC)," Intl. J. Molec. Sci. 17(194): 1-16); Behrens C. R. et al.(2014) "Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies," mAbs 6(l):46-53; Bouchard, H. et al. (2014) "Antibody-Drug Conjugates - A New Wave Of Cancer Drugs," Bioorganic & Medicinal Chem. Lett 24:5357-5363 참조). 시스테인의 티올 기, 리신, 글루타민 또는 아르기닌의 아미노 측쇄 기, 또는 글루타메이트 또는 아스파르테이트의 카복실 기가 링커 분자-세포독성 약물 부분(LM-D)과 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab를 콘쥬게이트하는데 이용될 수 있다. 자생 항체는 수많은 리신 콘쥬게이션 부위를 함유하고, 따라서 항체당 다수의 콘쥬게이트된 분자를 연결할 수 있다. 실제로, 펩타이드 맵핑은 대략 20개의 상이한 리신 잔기에서 중쇄와 경쇄 양쪽에서 콘쥬게이션이 일어난다는 것을 결정했다(mAb당 40개 리신). 따라서, 100만개를 초과하는 상이한 ADC 종이 생성될 수 있다. 시스테인 콘쥬게이션은 1 내지 4개의 사슬간 이황화물 결합의 환원 후 발생하고, 따라서 콘쥬게이션은 자생 VL 및 VH 도메인에서 8개의 노출된 설프하이드릴 기에만 제한된다. 그러나, 원한다면, 추가의 반응성(예를 들어, 리신, 시스테인, 셀레노시스테인 등) 잔기가 항체에 조작될 수 있다(예를 들어, VL 도메인 및/또는 VH 도메인 및/또는 불변 도메인 내에). 예를 들어, 하나 이상의 자생 아미노산 잔기가 시스테인 잔기로 치환될 수 있다. 비자생 아미노산(예를 들어, p-아세틸페닐알라닌)는 앰버 중단 코돈 억제인자 tRNA/aaRS 쌍을 사용하여 항체에 유전적으로 포함될 수 있다(예를 들어, Behrens CR, and Liu B.(2014) "Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies," mAbs 6(l):46-53. doi: 10.4161/mabs.26632; Panowksi, S., et al.(2014) "Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy," mAbs, 6(1), 34-45, doi: 10.4161/mabs.27022; 및 WO 2008/070593 참조). 대안으로 또는 추가로, 효소(예를 들어, 글리코트랜스페라아제)가 링커 분자-세포독성 약물 부분(LM-D)과 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab를 콘쥬게이트하는데 이용될 수 있다. 글리코트랜스페라아제 플랫폼은 항체의 글리코실화 부위에 당 부분을 부착하며(예를 들어, 인간 IgG 항체의 Fc 도메인의 위치 N297), 이것은 이어서 본 발명의 링커 분자로 작용하고 세포독성 약물 부분(D)과 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab를 콘쥬게이트할 수 있다. 대안으로, 트랜스글루타미나아제가 자유 아민 기와 글루타민 측쇄 기 사이에 공유 결합의 형성을 촉매하는데 사용될 수 있다.
이러한 목적을 위해 바람직한 것은 상업적으로 이용가능한 스트렙토베르티실리움 모바라엔세(Streptoverticillium mobaraense)로부터의 트랜스글루타미나아제(mTG)이다(Pasternack, R. et al. (1998) "Bacterial Pro-Transglutaminase From Streptoverticillium mobaraense - Purification, Characterisation and Sequence Of The Zymogen," Eur. J. Biochem. 257(3): 570-576; Yokoyama, K. et al. (2004) "Properties 및 Applications Of Microbial Transglutaminase," Appl. Microbiol. Biotechnol. 64:447-454). 이 효소는 글루코실화된 항체의 Fc 도메인에서 자연발생 글루타민 잔기를 인식하지 못하지만, VL 도메인 및/또는 VH 도메인 및/또는 불변 도메인에 조작될 수 있는 테트라펩타이드 LLQL은 인식한다(SEQ ID NO: 94)(Jeger, S. et al. (2010) "Site-Specific and Stoichiometric Modification Of Antibodies By Bacterial Transglutaminase," Angew Chem. Int. Ed. Engl. 49:9995-9997). 이러한 생각은 Panowski, S. et al.(2014) "Site-Specific Antibody Drug Conjugates For Cancer Therapy," mAbs 6(l):34-45에 의해 검토되었다.
B. 본 발명의 예시적인 세포독성 약물 부분
일부 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-AD의 세포독성 약물 부분은 사이토톡신, 방사성동위원소, 면역조정제, 사이토카인, 림포카인, 케모카인, 성장인자, 종양괴사인자, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오타이드, DNA 분자, RNA 분자, siRNA 분자, RNAi 분자, 마이크로RNA 분자, 광활성 치료제, 항신생혈관제, 친-세포자살제, 펩타이드, 지질, 탄수화물, 킬레이트화제, 또는 이들의 조합을 포함한다.
1. 튜불리신 세포독성 약물 부분
본 발명의 B7-H3-ADC는 튜불리신 세포독성 약물 부분을 포함할 수 있다:
Figure pct00075
Figure pct00076
튜불리신은 미코박테리아 종으로부터 분리된 천연 산물류의 일원이다(Sasse et al.(2000) "Tubulysins, New Cytostatic Peptides From Myxobacteria Acting On Microtubuli. Production, Isolation, Physico-Chemical And Biological Proper-ties," J. Antibiot. 53:879-885). 세포골격 상호작용제로서 튜불리신은 튜불린 중합을 억제하고 세포 사이클의 중단 및 세포자살을 초래하는 유사분열 저해물질이다(Steinmetz et al.(2004) "Isolation, Crystal And Solution Structure Determi-nation, And Biosynthesis Of Tubulysins-Powerful Inhibitors Of Tubulin Polyme-rization From Myxobacteria," Chem. Int. Ed. 43:4888-4892; Khalil et al.(2006) "Mechanism Of Action Of Tubulysin, An Antimitotic Peptide From Myxobacteria," ChemBioChem. 7:678-683; Kaur et al.(2006) "Biological Evaluation Of Tubulysin A: A Potential Anticancer And Antiangiogenic Natural Product," Biochem. J. 396:235-242). 튜불리신은 매우 효능있는 세포독성 분자로서 임상적으로 관련된 전통적인 화학치료제, 예를 들어 에포틸론, 파클리탁셀 및 빈블라스틴의 세포 성장 억제를 넘어선다. 또한, 이들은 다중약물 내성 셀라인에도 효능이 있다(Domling A. et al.(2005) "Myxobacterial Epothilones And Tubulysins As Promising Anti-cancer Agents," Mol. Diversity 9:141-147). 이들 화합물은 낮은 피코몰 범위의 IC50 값에서 일단의 암 셀라인에 대해 시험되었을 때 높은 세포독성을 나타낸다; 따라서, 이들은 항암 치료제로서 관심을 받고 있다. 예를 들어, WO 2012/019123, WO 2015/157594 참조. 튜불리신 콘쥬게이트는, 예를 들어 미국특허 7,776,814에 개시된다. 일부 구체예에서, 튜불리신 분자 또는 그것의 유도체가 프로드러그이다.
2. 아우리스타틴 세포독성 약물 부분
대안으로 또는 추가로, 본 발명의 B7-H3-ADC는 아우리스타틴 세포독성 약물 부분(예를 들어, MMAE(N-메틸발린-발린-돌라이소로이신-돌라프로인-노르에페드린) 및 MMAF(N-메틸발린-발린-돌라이소로이신-돌라프로인-페닐알라닌))을 포함할 수 있다. 돌라스타틴은 원래 군소 돌라벨라 오리큘라리아(Dolabella auricularia)의 구성성분으로서 발견되었으며, 아우리스타틴(예를 들어, 모노메틸 아우리스타틴 E 및 F)이라고도 알려진 유도체를 생성하도록 변형되었다. 돌라스타틴 및 아우리스타틴은 α-튜불린 상의 빈카 알카로이드 결합 부위와 상호작용하여 그것의 중합을 차단한다. 이들은 미세소관 역학, GTP 가수분해, 및 핵과 세포 분열을 방해하는 것으로 알려졌고(Woyke et al., Antimicrob. Agents and Chemother. 45:3580-3584(2001)), 항암 활성을 가진다(미국특허 5,663,149, 6,884,869, 7,964,566). 아우리스타틴 약물 부분은 펩티드 약물 부분의 N(아미노) 말단 또는 C(카복실) 말단을 통해 항체에 부착될 수 있다(예를 들어, WO 2002/088172 참조). 일부 구체예에서, 아우리스타틴 또는 돌라스타틴 분자, 변이체 또는 그것의 유도체가 프로드러그이다. MMAE는 자생 시스테인 측쇄 티올의 변형을 통해서 단백질에 콘쥬게이트될 수 있다(Senter P.D. et al.(2012) "The Discovery and Development Of Brentuximab Vedotin For Use In Relapsed Hodgkin Lymphoma and Systemic Anaplastic Large Cell Lymphoma," Nat. Biotechnol. 30:631-637; van de Donk N.W. et al.(2012) "Brentuximab vedotin," MAbs 4:458-465). 이 방법은 환원제(예를 들어, 디티오트레이톨(DTT) 또는 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP))에 의한 시스테인 잔기의 하나 이상의 용매-노출된 이황화물 결합의 환원 후 결과의 티올의 말레이미드-함유 약물에 의한 변형을 수반한다(Behrens C.R. et al.(2014) "Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies," mAbs 6(1):46-53).
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Figure pct00077
이 방식으로 콘쥬게이트될 수 있는 예시적인 세포독성 약물은 카텝신 B 프로테아제 절단 부위25(VC: 발린, 시트룰린)와 말레이미드 기(MC: 말레이미도카프로일)와 세포독성 약물(MMAE) 사이의 자기-희생성 링커(PAB: 파라-아미노벤질옥시카보닐)를 통합한다(Doronina S.O. et al.(2003) "Development Of Potent Monoclonal Antibody Auristatin Conjugates For Cancer Therapy," Nat. Biotechnol. 21:778-784).
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Figure pct00078
대안으로, 아우리스타틴 세포독성 약물 부분은 AcLys-VC-PAB-MMAD(아세틸리신발린시트룰린-p-아미노벤질옥시카보닐-모노메틸돌라스타틴)일 수 있는데, 이것은 아세틸화된 리신 잔기의 측쇄와 글루타민 측쇄 사이의 부위-특이적 반응을 촉매하는 효소 미생물 트랜스글루타미나아제를 사용하여 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab 부분의 VL 도메인 및/또는 VH 도메인 및/또는 불변 도메인의 글루타민 잔기의 H2 측쇄 기에 콘쥬게이트될 수 있다.
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Figure pct00079
대안으로, p-아세틸페닐알라닌이 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab 부분의 VL 도메인 및/또는 VH 도메인 및/또는 불변 도메인에 통합된 다음 옥심 라이게이션을 통해서 이러한 도메인에 아우리스타틴 F-옥시아민을 콘쥬게이트하는데 이용될 수 있다.
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Figure pct00080
3. 메이탄시노이드 세포독성 약물 부분
대안으로 또는 추가로, 본 발명의 B7-H3-ADC는 메이탄시노이드 세포독성 약물 부분, 예를 들어 염소화된 벤젠 고리 발색단에 부착된 19-원 앤사매크롤라이드 구조를 특징으로 하는 앤사마이신 항생물질을 포함할 수 있다. 메이탄시노이드는 튜불린 중합을 억제함으로써 작용하는 유사분열 억제제이다. 동아프리카의 관목 메이테누스 세라타(Maytenus serrata)로부터 메이탄신이 최초로 분리되었다(미국특허 3,896,111). 이어서, 특정한 미생물이 또한 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄시놀 및 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생성한다는 것이 발견되었다(미국특허 4,151,042). 합성 메이탄시놀 및 그것의 유도체 및 유사체는, 예를 들어 미국특허 4,137,230 및 4,248,870에 개시된다. 메이탄시노이드 약물 부분은 이들이 (i) 발효나 화학적 변형에 의해 발효 생성물의 유도체의 제조가 상대적으로 쉽고, (ii) 비-이황화물 링커를 통한 항체에의 콘쥬게이션에 적합한 작용기로의 유도체화가 쉽고, (iii) 혈장에서 안정하고, (iv) 다양한 종양 셀라인에 대해 효과적이라는 점에서 항체 약물 콘쥬게이트에서 매력적인 약물 부분이다. 메이탄시노이드를 함유하는 면역콘쥬게이트, 그것의 제조 방법, 및 그들의 치료적 용도는, 예를 들어 미국특허 5,208,020 및 5,416,064 및 유럽특허 EP 0425235B1; Liu C. et al.(1996) "Eradication Of Large Colon Tumor Xenografts By Targeted Delivery Of Maytansinoids," Proc. Natl. Acad. Sci.(U.S.A.) 93:8618-8623(DM1로 지정된 메이탄시노이드를 포함하는 면역콘쥬게이트 설명) 및 Chari R.V. et al.(1992) "Immunoconjugates Containing Novel Maytansinoids: Promising Anticancer Drugs," Cancer Research 52:127-131에 개시된다.
메이탄신, DM1 및 DM4는 예시적인 메이탄시노이드 세포독성 약물 부분이다.
Figure pct00081
메이탄신은 리신 또는 글루타민 측쇄와의 반응에 의해 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab 부분에 콘쥬게이트될 수 있다. DM1 및 DM4는 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab 부분의 VL 도메인 및/또는 VH 도메인 및/또는 불변 도메인의 글루타메이트 또는 아스파르테이트 잔기의 COOH 측쇄에 콘쥬게이트될 수 있다(Behrens C.R. et al.(2014) "Methods For Site-Specific Drug Conjugation To Antibodies," mAbs 6(1):46-53; Bouchard H. et al.(2014) "Antibody-Drug Conjugates - A New Wave Of Cancer Drugs," Bioorganic & Medicinal Chem. Lett 24:5357-5363 참조).
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Figure pct00082
트라스투주맙 엠탄신(아도-트라스투주맙 엠탄신 T-DM1, 상표명 KADCYLA®)은 메이탄시노이드 메르탄신(DM1)에 콘쥬게이트된 단클론성 항체 트라스투주맙(HER-CEPTLN®)으로 구성된 항체-약물 콘쥬게이트이다. 예를 들어 LoRusso et al.(2011) "Trastuzumab Emtansine: A Unique Antibody-Drug Conjugate In Development For Human Epidermal Growth Factor Receptor 2-Positive Cancer," Clin. Cancer Res. 20:6437-6447 참조. 유전자조작된 티오-트라스투주맙-DM1 ADC가 또한 Junutual et al.(2010) "Engineered Thio-Trastuzumab-DM1 Conjugate With An Improved Therap-eutic Index To Target Human Epidermal GrowthFactor Receptor 2-Positive Breast Cancer," Clin, Cancer Res. 16:4769-4778에 설명되었다. 일부 구체예에서, 메이탄시노이드 분자, 변이체, 또는 그것의 유도체가 프로드러그이다.
4. 칼리키아미신 세포독성 약물 부분
대안으로 또는 추가로, 본 발명의 B7-H3-ADC는 칼리키아미신 세포독성 약물 부분을 포함할 수 있다.
Figure pct00083
설명된 칼리키아미신-기반 항체 콘쥬게이트는 트리설파이드 모 화합물의 디설파이드 버전이다. N-아세틸-c-칼리키아미신 디메틸 하이드라지드(CalichDMH)를 사용한 2 커플링 전략이 현재까지 보고되었다: (i) 하이드라지드; 및 (ii) 아미드 커플링(Bouchard H. et al.(2014) "Antibody-Drug Conjugates - A New Wave Of Cancer Drugs," Bioorganic & Medicinal Chem. Lett 24:5357-5363).
엔다이인(enediyne) 항종양 항생물질의 칼리키아미신 패밀리는 아-피코몰 농도에서 이중-가닥 DNA 브레이크를 생성할 수 있다. 칼리키아미신은 박테리아 마이크로모노스포라 에키노스포라(Micromonospora echinospora)로부터 유래된 엔다이인 항생물질류이며, 칼리키아미신 γ1가 가장 유명하다. 다른 칼리키아미신은 β1Br, γ1Br, α2I, α3I, β1I, γ1I, 및 Δ1I이다(Lee M.D. et al.(1989) "Caliche-amicins, A Novel Family Of Antitumor Antibiotics. 3. Isolation, Purification And Characterization Of Calicheamicins Beta 1Br, Gamma 1Br, Alpha 2I, Alpha 3I, Beta 1I, Gamma 1I And Delta 1I.," J. Antibiotics 42(7):1070-1087 참조). 칼리키아미신 패밀리의 콘쥬게이트의 제조에 관해 미국특허 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296을 참조한다. 사용될 수 있는 칼리키아미신의 구조 유사체는, 제한은 아니지만 γ1I, α2I, α3I, N-아세틸-γ1I, PSAG 및 θ11을 포함한다(Hinman et al.(1993) "Preparation And Characterization Of Monoclonal Antibody Conjugates Of The Calicheamicins: A Novel And Potent Family Of Antitumor Antibiotics," Cancer Research 53:3336-3342(1993), Lode et al.(1998) "Targeted Therapy With A Novel Enediyene Antib-iotic Calicheamicin Theta(I)1 Effectively Suppresses Growth And Dissemination Of Liver Metastases In A Syngeneic Model Of Murine Neuroblastoma," Cancer Research 58:2925-2928(1998)). 일부 구체예에서, 칼리키아미신 분자, 변이체, 또는 그것의 유도체가 프로드러그이다.
5. 피롤로벤조디아제핀 세포독성 약물 부분
대안으로 또는 추가로, 본 발명의 B7-H3-ADC는 피롤로벤조디아제핀 약물 부분을 포함할 수 있다(예를 들어, 천연 피롤로벤조디아제핀 및 SJG-136, 그것이 유도체).
Figure pct00084
바람직한 피롤로벤조디아제핀 약물 부분은 바다스툭시맙 탈리린(SGN-CD33A; Seattle Genetics)이다.
[반응도 6]
Figure pct00085
피롤로벤조디아제핀(PBD)은 항생물질 활성 또는 항-종양 활성을 가진 천연 산물류이다. 이들은 방선균류(actinomycetes)에 의해 자연적으로 생성된다. 이들은 DNA 알킬화 화합물이고 일부는 서열-선택적이다. 다수의 PBD 및 이들의 유도체가 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어 PBD 다이머(예를 들어, SJG-136 또는 SG2000), C2-불포화 PBD 다이머, C2 아릴 치환을 보유한 피롤로벤조디아제핀 다이머(예를 들어, SG2285), 가수분해에 의해 활성화되는 PBD 다이머 프로드러그(예를 들어, SG-2285), 및 폴리피롤-PBD(예를 들어, SG2274)가 있다. PBD는 WO 2000/012507, WO 2007/039752, WO 2005/110423, WO 2005/085251, WO 2005/040170 및 WO 2014/057119에 더 설명된다. 일부 구체예에서, PBD 분자, 변이체, 또는 그것의 유도체는 프로그러그이다.
6. 듀오카르마이신 세포독성 약물 부분
대안으로 또는 추가로, 본 발명의 B7-H3-ADC는 듀오카르마이신 약물 부분을 포함할 수 있다. 듀오카르마이신은 스트렙토미세스(Streptomyces) 박테리아로부터 최초로 분리된 일련의 관련된 천연 산물들의 일원이며, 이들은 효능있는 항종양 항생물질이다(Dokter W. et al.(2014) "Preclinical Profile of the HER2-Targeting ADC SYD983/SYD985: Introduction of a New Duocarmycin-Based Linker-Drug Plat-form," Mol. Cancer Ther. 13(11):2618-2629; Boger D.L. et al.(1991) "Duocar-mycins - A New Class Of Sequence Selective DNA Minor Groove 알킬ating Agents" Chemtracts: Organic Chemistry 4(5):329-349(1991); Tercel et al.(2013) "The Cytotoxicity Of Duocarmycin Analogues Is Mediated Through 알킬ation Of DNA, Not Aldehyde Dehydrogenase 1: A Comment," Chem. Int. Ed. Engl. 52(21): 5442-5446; Boger D.L. et al.(1995) "CC-1065 and The Duocarmycins: Unraveling The Keys To A New Class Of Naturally Derived DNA 알킬ating Agents," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92(9):3642-3649; Cacciari B. et al.(2000) "CC-1065 and The Duocarmycins: Recent Developments," Expert Opinion on Therapeutic Patents 10(12):1853-1871 참조).
천연 듀오카르마이신은 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 B1, 듀오카르마이신 B2, 듀오카르마이신 C1, 듀오카르마이신 C2, 듀오카르마이신 D, 듀오카르마이신 SA, 및 CC-1065를 포함한다(PCT 공보 WO 2010/062171; Martin D.G. et al.(1980) "Structure Of CC-1065(NSC 298223) A New Antitumor Antibiotic," J. Antibiotics 33:902-903; Boger D.L. et al.(1995) "CC-1065 and The Duocarmycins: Unraveling The Keys To A New Class Of Naturally Derived DNA 알킬ating Agents," Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 92:3642-3649).
Figure pct00086
적합한 합성 듀오카르마이신 유사체는 아도젤레신, 비젤레신, 카젤레신(U-80244) 및 스피로-듀오카르마이신(DUBA)을 포함한다(Dokter W. et al.(2014) "Pre-clinical Profile of the HER2-Targeting ADC SYD983/SYD985: Introduction of a New Duocarmycin-Based Linker-Drug Platform," Mol. Cancer Ther. 13(11):2618-2629; Elgersma R.C. et al.(2014) "Design, Synthesis, and Evaluation of Linker -Duocarmycin Payloads: Toward Selection of HER2 - Targeting Antibody - Drug Conjugate SYD985," Mol. Pharmaceut. 12:1813-1835).
Figure pct00087
추가의 합성 듀오카르마이신 유사체는 PCT 공보 WO 2010/062171에 개시된 것들 및 특히 아래 식:
Figure pct00088
을 가진 이러한 유사체 또는 그것의 제약학상 허용되는 염, 수화물, 또는 용매화합물을 포함하고, 여기서 DB는 DNA-결합 부분이며 아래 식들로 구성되는 군으로부터 선택된다:
Figure pct00089
여기서,
R은 이탈기이고;
R2, R2', R3, R3', R4, R4', R12, 및 R19는 독립적으로 H, OH, SH, NH2, N3, NO2, NO, CF3, CN, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, halogen, Ra, SRa, S(O)Ra, S(O)2Ra, S(O)ORa, S(O)2ORa, OS(O)Ra, OS(O)2Ra, OS(O)ORa, OS(O)2ORa, ORa, NHRa, N(Ra)Rb, +N(Ra)(Rb)Rc, P(O)(ORa)(ORb), OP(O)(ORa)(ORb), SiRaRbRc, C(O)Ra, C(O)ORa, C(O)N(Ra)Rb, OC(O)Ra, OC(O)ORa, OC(O)N(Ra)Rb, N(Ra)C(O)Rb, N(Ra)C(O)ORb, 및 N(Ra)C(O)N(Rb)Rc로부터 선택되며, Ra, Rb, 및 Rc는 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 C1-3 알킬 또는 C1-3 헤테로알킬로부터 선택되거나, 또는 R3 + R3' 및/또는 R4 + R4'는 독립적으로 =O, =S, =NOR18, =C(R18)R18', 및 =NR18로부터 선택되고, R18 및 R18'는 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 C1-3 알킬로부터 선택되며, R2, R2', R3, R3', R4, R4' 및 R12 중 2개 이상은 선택적으로 하나 이상의 결합에 의해 이어져서 하나 이상의 선택적으로 치환된 탄소환 및/또는 헤테로환을 형성하고;
X2는 O, C(R14)(R14'), 및 NR14'로부터 선택되며, R14 및 R14'는 R7에 대해 정의된 것과 동일한 의미를 가지고 독립적으로 선택되거나, 또는 R14' 및 R7'이 부재하고 그 결과 R7' 및 R14'를 보유하도록 지정된 원자들 사이에 이중결합이 생기고;
R5, R5', R6, R6', R7, 및 R7'은 독립적으로 H, OH, SH, NH2, N3, NO2, NO, CF3, CN, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, 할로겐, Re, SRe, S(O)Re, S(O)2Re, S(O)ORe, S(O)2ORe, OS(O)Re, OS(O)2Re, OS(O)ORe, OS(O)2ORe, ORe, NHRe, N(Re)Rf, +N(Re)(Rf)Rg, P(O)(ORe)(ORf), OP(O)(ORe)(ORf), SiReRfRg, C(O)Re, C(O)ORe, C(O)N(Re)Rf, OC(O)Re, OC(O)ORe, OC(O)N(Re)Rf, N(Re)C(O)Rf, N(Re)C(O)ORf, N(Re)C(O)N(Rf)Rg, 및 수용성 기로부터 선택되며,
여기서
Re, Rf, 및 Rg는 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 (CH2CH2O)eeCH2CH2X13Re1, C1-15 알킬, C1-15 헤테로알킬, C3-15 사이클로알킬, C1-15 헤테로사이클로알킬, C5-15 아릴, 또는 C1-15 헤테로아릴로부터 선택되고, 여기서 ee는 1 내지 1000으로부터 선택되며, X13은 O, S, 및 NRf1로부터 선택되고, Rf1 및 Re1은 독립적으로 H 및 C1-3 알킬로부터 선택되며, Re, Rf, 및/또는 Rg에서 선택적인 치환체 중 1개 이상은 수용성 기이고, Re, Rf, 및 Rg 중 2개 이상은 선택적으로 하나 이상의 결합에 의해 이어져서 하나 이상의 선택적으로 치환된 탄소환 및/또는 헤테로환을 형성하거나,
또는R5 + R5' 및/또는 R6 + R6' 및/또는 R7 + R7'은 독립적으로 =O, =S, =NORe3, =C(Re3)Re4, 및 =NRe3으로부터 선택되며, Re3 및 Re4 는 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 C1-3 알킬로부터 선택되거나, 또는 R5' + R6' 및/또는 R6' + R7' 및/또는 R7' + R14'는 부재하고 그 결과 각각 R5' + R6' 및/또는 R6' + R7' 및/또는 R7' + R14'를 보유하도록 지정된 원자들 사이에 이중결합이 생기며, R5, R5', R6, R6', R7, R7', R14 및 R14' 중 2개 이상은 하나 이상의 결합에 의해 이어져서 하나 이상의 선택적으로 치환된 탄소환 및/또는 헤테로환을 형성하고;
X1는 O, S, 및 NR로부터 선택되며, R은 H 및 선택적으로 치환된 C1-8 알킬 또는 C1-8 헤테로알킬로부터 선택되고 임의의 다른 치환체와 이어지지 않으며;
X3은 O, S, C(R15)R15', -C(R15)(R15')-C(R15'')(R15''')-, -N(R15)-N(R15')-, -C(R15)(R15')-N(R15")-, -N(R15")-C(R15)(R15')-, -C(R15)(R15')-O-, -O-C(R15)(R15')-, -C(R15)(R15')-S-, -S-C(R15)(R15')-, -C(R15)=C(R15')-, =C(R15)-C(R15')=, -N= C(R15')-, =N-C(R15')=, -C(R15)=N-, =C(R15)-N=, -N=N-, =N-N=, CR15, N, NR15로부터 선택되거나, DB1 및 DB2에서 -X3-은 -X3a 및 X3b-을 표시하고, X3a은 X34에 연결되고 X34와 X4 사이에 이중 결합이 존재하며, X3b은 X11에 연결되고, X3a 는 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 (CH2CH2O)eeCH2CH2X13Re1, C1-8 알킬, 또는 C1-8 헤테로알킬로부터 선택되며 임의의 다른 치환체와 이어지지 않고;
X4는 O, S, C(R16)R16', NR16, N, 및 CR16으로부터 선택되고;
X5는 O, S, C(R17)R17', NOR17, 및 NR17로부터 선택되며, R17 및 R17'은 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 C1-8 알킬 또는 C1-8 헤테로알킬로부터 선택되고 임의의 다른 치환체와 이어지지 않으며;
X6은 CR11, CR11(R11'), N, NR11, O, 및 S로부터 선택되고;
X7은 CR8, CR8(R8'), N, NR8, O, 및 S로부터 선택되고;
X8은 CR9, CR9(R9'), N, NR9, O, 및 S로부터 선택되고;
X9는 CR10, CR10(R10'), N, NR10, O, 및 S로부터 선택되고;
X10은 CR20, CR20(R20'), N, NR20, O, 및 S로부터 선택되고;
X11은 C, CR21, 및 N으로부터 선택되거나, 또는 X11-X3b는 CR21, CR21(R21'), N, NR21, O, 및 S로부터 선택되고;
X12는 C, CR22, 및 N으로부터 선택되고;
X6*, X7*, X8*, X9*, X10*, 및 X11*은 각각 X6, X7, X8, X9, X10, 및 X11에 대해 정의된 것과 동일한 의미를 가지며 독립적으로 선택되고;
X34는 C, CR23, 및 N으로부터 선택되고;
DB6 및 DB7에서 X11*의 고리 B 원자는 고리 A의 고리 원자와 연결되고, 이로써 DB6 및 DB7에서 고리 A와 고리 B는 단일결합을 통해 직접 연결되며;
점선 이중결합은 나타낸 결합이 단일결합 또는 비-축적, 선택적으로 비편재화된 이중결합일 수 있음을 의미하고;
R8, R8', R9, R9', R10, R10', R11, R11', R15, R15', R15", R15", R16, R16', R20, R20', R21, R21', R22, 및 R23은 각각 독립적으로 H, OH, SH, NH2, N3, NO2, NO, CF3, CN, C(O)NH2, C(O)H, C(O)OH, halogen, Rh, SRh, S(O)Rh, S(O)2Rh, S(O)ORh, S(O)2ORh, OS(O)Rh, OS(O)2Rh, OS(O)ORh, OS(O)2ORh, ORh, NHRh, N(Rh)Ri, +N(Rh)(Ri)Rj, P(O)(ORh)(ORi), OP(O)(ORh)(ORi), SiRhRiRj, C(O)Rh, C(O)ORh, C(O)N(Rh)Ri, OC(O)Rh, OC(O)ORh, OC(O)N(Rh)Ri, N(Rh)C(O)Ri, N(Rh)C(O)ORi, N(Rh)C(O)N(Ri)Rj, 및 수용성 기로부터 선택되며,
여기서
Rh, Ri, 및 Rj는 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 (CH2CH2O)eeCH2CH2X13Re1, C1-15 알킬, C1-15 헤테로알킬, C3-15 사이클로알킬, C1-15 헤테로사이클로알킬, C5-15 아릴, 또는 C1-15 헤테로아릴로부터 선택되고, Rh, Ri, 및/또는 Rj에서 선택적인 치환체 중 1개 이상은 선택적으로 수용성 기이고, Rh, Ri, 및 Rj 중 2개 이상은 선택적으로 하나 이상의 결합에 의해 이어져서 하나 이상의 선택적으로 치환된 탄소환 및/또는 헤테로환을 형성하거나,
또는 R8 + R8' 및/또는 R9 + R9' 및/또는 R10 + R10' 및/또는 R11 + R11' 및/또는 R15 + R15' 및/또는 R15" + R15'" 및/또는 R16 + R16' 및/또는 R20 + R20' 및/또는 R21 + R21'은 독립적으로 =0, =S, =NORh1, =C(Rhl)Rh2, 및 =NRhl로부터 선택되며, Rhl 및 Rh2는 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 C1-3 알킬로부터 선택되고, R8, R8', R9, R9', R10, R10', R11, R11', R15, R15', R15", R15'", R16, R20, R20', R21, R21', R22, 및 R23 중 2개 이상은 하나 이상의 결합에 의해 이어져서 하나 이상의 선택적으로 치환된 탄소환 및/또는 헤테로환을 형성하고;
R8b 및 R9b는 독립적으로 선택되며 임의의 다른 치환체와 이어지지 않을 수 있다는 것을 제외하고 R8와 동일한 의미를 가지고;
R4 및 R4' 중 하나와 R16 및 R16' 중 하나는 하나 이상의 결합에 의해 이어져서 하나 이상의 선택적으로 치환된 탄소환 및/또는 헤테로환을 형성할 수 있고;
R2, R2', R3, 및 R3' 중 하나와 R5 및 R5' 중 하나는 하나 이상의 결합에 의해 이어져서 하나 이상의 선택적으로 치환된 탄소환 및/또는 헤테로환을 형성할 수 있고;
a 및 b는 독립적으로 0 및 1로부터 선택되고;
DB 부분은 DAI, DA2, DAI', 또는 DA2' 부분을 포함하지 않고
DB1에서 고리 B는 헤테로환이고;
만일 DB1에서 X3이 -X3a 및 X3b-을 표시하고 고리 B가 방향족이면, 상기 고리 B에서 2개의 인접한 치환체가 이어져서 상기 고리 B에 융합된 선택적으로 치환된 탄소환 또는 헤테로환을 형성하고;
만일 DB2에서 X3이 -X3a 및 X3b-를 표시하고 고리 B가 방향족이면, 상기 고리 B에서 2개의 인접한 치환체가 이어져서 상기 고리 B에 융합된 선택적으로 치환된 헤테로환, 상기 고리 B에 융합된 선택적으로 치환된 비-방향족 탄소환, 또는 상기 고리 B에 융합된 치환된 방향족 탄소환을 형성하며, 거기에 하이드록실 기, 1차 아미노 기, 또는 2차 아미노 기를 함유하는 적어도 하나의 치환체가 부착되고, 1차 또는 2차 아민은 방향족 고리 시스템의 고리 원자도 아니고 아미드의 일부도 아니며;
만일 DB2에서 고리 A가 6-원 방향족 고리이면, 고리 B에 융합된 고리를 형성하기 위해 고리 B에서 치환체들이 이어지지 않고;
DB8에서 고리 A의 2개의 인접한 치환체가 이어져서 상기 고리 A에 융합된 선택적으로 치환된 탄소환 또는 헤테로환을 형성함으로써 더 이상의 고리가 융합되지 않는 2환 부분을 형성하고; DB9에서 고리 A는 상기 고리 A에 융합된 임의의 고리와 함께 적어도 2개의 고리 헤테로원자를 함유한다.
상기 설명된 링커 분자들은 상기 나타낸 대로 티올-말레이미드 화학을 사용하여 시스테인 티올 기에 콘쥬게이트될 수 있다. 일부 구체예에서, 세포독성 듀오카르마이신 약물 부분은 프로드러그이다. 예를 들어, 프로드러그, vc-seco-DUBA는 절단가능한 펩타이드 부분을 통해 말레이미드 링커 부분에 연결된 자기-제거 부분에 콘쥬게이트될 수 있다.
[반응도 7]
Figure pct00090
이 분자의 말레이미드 링커 부분이 본 발명의 B7-H3-ADC의 Ab 부분의 VL 도메인 및/또는 VH 도메인 및/또는 불변 도메인의 시스테인 잔기의 티올 기에 콘쥬게이트될 수 있다. 절단가능한 펩타이드 부분의 후속 단백질 가수분해성 절단이 있고 그후 자기-제거 부분의 자발적 제거가 뒤따름으로써 seco-DUBA가 방출되며, 이것은 자발적으로 재배열되어 활성 약물인 DUBA를 형성한다.
[반응도 8]
Figure pct00091
(Dokter W. et al.(2014) Preclinical Profile of the HER2-Targeting ADC SYD983/SYD985: Introduction of a New Duocarmycin-Based Linker-Drug Platform," Mol. Cancer Ther. 13(11):2618-2629 참조).
B7-H3-듀오카르마이신 약물 부분 콘쥬게이트의 제조를 위한 바람직한 방법으로서 Elgersma R.C. et al.(2014) "Design, Synthesis, and Evaluation of Linker-Duocarmycin Payloads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Conju-gate SYD985," Mol. Pharmaceut. 12:1813-1835 또는 WO 2011/133039에 의한 방법이 이용될 것이다. 따라서, 항-B7-H3 항체 또는 항체 단편의 VL 또는 VH 사슬의 티올-함유 기가 말레이미드 링커 부분 - 절단가능한 펩타이드 부분 - 자기-제거 부분을 통해서 seco-DUBA 또는 다른 프로드러그에 콘쥬게이트된다(반응도 9A).
[반응도 9A]
Figure pct00092
본 발명은 DUBA 프로드러그와 관련하여 예시되지만, 다른 프로드러그들, 예를 들어 CC-1065도 반응도 9B에 나타낸 대로 대안으로서 이용될 수 있다.
[반응도 9B]
Figure pct00093
절단가능한 펩타이드 부분의 절단 및 자기-제거 부분의 제거시에 프로드러그 부분이 Winstein 스피로고리화(spirocyclization)를 거쳐서 활성 약물이 얻어진다고 생각된다(예를 들어, 반응도 9C에 나타낸 대로 seco-DUBA로부터 DUBA).
[반응도 9C]
Figure pct00094
seco-DUBA는 상응하는 DNA-알킬화 및 DNA 결합 부분으로부터 제조된다(예를 들어, Elgersma R.C. et al.(2014) "Design, Synthesis and Evaluation of Linker-Duocarmycin Pay loads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Con-jugate SYD985," Mol. Pharmaceut. 12:1813-1835에 의해 설명된 1,2,9,9a-테트라하이드로사이클로프로파-[c]벤조[e]인돌-4-온 프레임워크)(Boger D.L. et al.(1989) "Total Synthesis and Evaluation of (±)-N-(tert-Butoxycarbonyl)-CBI, (±)-CBI-CDPIl, and (±)-CBI-CDPI2: CC-1065 Functional Agents Incorporating the Equivalent 1,2,9,9a-Tetrahydrocyclopropa[1,2-c]benz[1,2-e]indol-4-one(CBI) Left-Hand Subunit," J. Am. Chem. Soc. 111:6461-6463; Boger D.L. et al.(1992) "DNA alkylation Properties of Enhanced Functional Analogs of CC-1065 Incor-porating the 1,2,9,9a-Tetrahydrocyclopropa[1,2-c]benz[1,2-e]indol-4-one(CBI) alkylation Subunit," J. Am. Chem. Soc. 114:5487-5496 참조).
반응도 9D는 DUBA를 위한 DNA-알킬화 부분의 합성을 나타냄으로써 본 발명을 예시한다. 따라서, o-톨루알데하이드(1)와 디메틸석시네이트(2)가 반응되어 Stobbe 축합을 통해 산(3a/3b)의 혼합물이 생성된다. 산의 혼합물의 고리 닫힘은 트리플루오로아세트산 무수물에 의해 달성될 수 있고 알코올(4)이 얻어지며, 이것은 이어서 염화벤질로 보호되어 벤질에테르(5)가 얻어진다. 메틸에스테르 기의 후속 가수분해는 카복실산(6)을 제공하고, 이것은 이어서 톨루엔과 tert-부틸알코올의 혼합물 중에서 Curtius 재배열되어 카바메이트(7)를 제공한다. N-브로모석신이미드로의 브롬화는 브롬화물(8)을 제공한다. 칼륨 tert-부톡사이드의 존재하에 (S)-글리시딜 노실레이트로 브롬화물(8)이 알킬화됨으로써 에폭사이드(9)가 얻어진다. n-부틸리튬과의 반응은 원하는 화합물(10)과 탈브롬화된, 재배열된 유도체(11)의 혼합물을 제공한다. 원하는 화합물(10)의 수율은 용매로서 테트라하이드로푸란이 사용되고 반응 온도가 -25에서 -20℃ 사이에서 유지될 때 더 높다. 이들 조건에서 원하는 화합물(10)과 탈브롬화된 재배열된 유도체(11)는 대략 1:1 비로 얻어질 수 있다. p-톨루엔설폰산에 의한 워크업은 탈브롬화된 재배열된 유도체(11)의 (7)로의 전환을 가져오며, 이것은 원하는 화합물(10)의 회수를 돕는다. (10)에서 하이드록실 기의 메실화 후 염화리튬을 사용한 염화물 치환은 핵심 중간체(12)를 제공한다.
[반응도 9D]
Figure pct00095
반응도 9E는 DUBA를 위한 DNA-결합 부분의 합성을 나타냄으로써 본 발명을 예시한다. 따라서, Chichibabin 고리화 반응이 에틸 브로모피루베이트(13)와 5-니트로피리딘-2-아민(14) 사이에 진행됨으로써 니트로 화합물(15)이 얻어진다. 산 조건에서 아연에 의한 니트로 기의 환원은 아민(16)을 제공한다. 클로로메틸 메틸 에테르와의 반응 후 에스테르 가수분해를 통해서 메틸 4-하이드록시벤조에이트로부터 제조된, 메톡시메틸(MOM)-보호된 4-하이드록시벤조산(17)과의 커플링은 에틸에스테르(18)를 제공하며, 이것은 수성 1,4-디옥산 중에서 수산화나트륨으로 가수분해될 수 있고, 이로써 산(19)이 얻어진다.
[반응도 9E]
Figure pct00096
다음에, seco-DUBA가 DNA-알킬화 유닛(12)과 DNA-결합 부분(19)으로부터 합성된다. tert-부톡시카보닐(Boc) 보호기가 산 조건하에 (12)로부터 제거됨으로써 아민(20)이 형성된다. 아민(20)과 화합물(19)의 EDC-매개 커플링은 보호된 화합물(21)을 제공하며, 이것은 이어서 연속적인 두 단계에서 완전히 탈보호된다(Pd/C, NH4HCO2, MeOH/THF, 3시간, 90%, (22) 수득, 다음에 HC1, 1,4-디옥산/물, 1h, 95%, HCl 염으로서 seco-DUBA(23) 수득(반응도 9F)).
[반응도 9F]
Figure pct00097
다른 약물, 예를 들어 CC-1065의 프로드러그는, 예를 들어 WO 2010/062171에 설명된 대로 합성될 수 있다.
프로드러그 부분은 바람직하게 반응도 9G에 따라서 ADC의 나머지 부분에 연결된다. 말레이미드 링커 빌딩 블록은 (24)와 2-(2-아미노에톡시)에탄올(25) 사이의 축합 반응으로부터 시작하여 알코올(26)을 수득함으로써 합성되었고, 이것은 이어서 4-니트로페닐 클로로포메이트와의 반응을 통해서 반응성 카보네이트(27)로 전환되었다. Dubowchik G.M. et al.(2002) "Cathepsin B-Labile Dipeptide Linkers For Lysosomal Release Of Doxorubicin From Internalizing Immunoconjugates: Model Studies Of Enzymatic Drug Release and Antigen-Specific In Vitro Anti-cancer Activity," Bioconjugate Chem. 13:855-869에 따라서 제조된, H-발린-시트룰린-PABA(28)에 (27)의 커플링은 링커(29)의 형성을 가져오며, 이것을 비스(4-니트로페닐)카보네이트로 처리하여 활성화된 링커(30)를 수득했다.
[반응도 9G]
Figure pct00098
반응도 9H에 나타낸 대로, seco-DUBA-MOM (22)는 두 단계 콘쥬게이션을 위해 변형된다. 4-니트로페닐 클로로포메이트 및 tert-부틸메틸(2-(메틸아미노)에틸)카바메이트(31)에 의한 (22)의 연속 처리는 화합물(32)을 제공한다. 트리플루오로아세트산(TFA)에 의한 (32)에서 Boc 및 MOM 보호기의 제거는 TFA 염으로서 (33)을 제공했다.
[반응도 9H]
Figure pct00099
ADC는 약간 염기성 조건에서 활성화된 링커(30)와 고리화 스페이서-듀오카르마이신 구성물(33)의 반응을 통해서 합성되었다. 이들 조건에서는 고리화 스페이서의 자기-제거 및 그에 따른 3a의 형성이 억제되었다(반응도 9I).
[반응도 9I]
Figure pct00100
이 과정은 mAb당 평균 2개의 자유 티올 기를 생성하며, 이는 평균 약물-대-항체-비율(DAR)이 약 2이고 고분자량 종들과 잔류 미콘쥬게이트 듀오카르마이신 부분이 적은 양으로 있는 B7-H3-ADC의 통계적 분포를 가져온다.
합성 단계의 순서는 원하는 대로 변경될 수 있다. 바람직하게, 사용된 방법은 상기 설명된 반응도 9A-9I의 것일 것이다.
XII. 본 발명의 B7-H3-결합 분자의 사용
본 발명은 본 발명의 B7-H3-결합 분자(예를 들어, 항체, 이중특이적 항체, 이중특이적 디아바디, 3가 결합 분자, B7-H3-ADC 등), 이러한 분자로부터 유래된 폴리펩타이드, 이러한 분자 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드, 및 본원에서 설명된 다른 제제들을 포함하는, 제약학적 조성물을 포함하는, 조성물을 포함한다.
본원에서 제공된 바와 같은, 본원에서 제공된 항-B7-H3-VL 및/또는 VH 도메인을 포함하는, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 세포의 표면에 존재하는 B7-H3에 결합하는 능력을 가지며, 항체-의존적 세포-매개 세포독성(ADCC) 및/또는 보체 의존적 세포독성(CDC)을 유도하고 및/또는 재지시된 세포 살해(예를 들어, 재지시된 T-세포 세포독성)를 매개한다. 임의의 작용 메커니즘과 결부되어야 하는 것은 아니지만, 본 발명의 B7-H3-ADC 분자는 종양 세포에 의해 발현된 B7-H3과 결합시에 내재화되고 콘쥬게이트된 사이토톡신의 작용을 통해서 종양 세포의 살해를 매개한다.
따라서, 본원에서 제공된 항-B7-H3-VL 및/또는 VH 도메인을 포함하는, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 임의의 질환 또는 상태를 치료하는 능력을 가진다. 상기 논의된 대로, B7-H3은 덜 분화된 형태를 나타내는 고 등급 종양과 관련된 다수의 혈액 및 고상 악성물에서 발현되는 암-배아 항원이고 불량한 임상 성과와 상관관계가 있다. 따라서, 제한은 아니지만, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 암, 특히 B7-H3의 발현을 특징으로 하는 암의 진단이나 치료에서 이용될 수 있다.
본 발명의 B7-H3-결합 분자에 의해 치료될 수 있는 암은 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 부신암, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, B-세포 암, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 섬유성 골 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 교모세포종, 악성 혈액암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병), 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암(NSCLC)), 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 중피종 인두암, 다발성 내분비종양증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경집 종양, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 소아의 소 원형 청색 세포 종양(신경아세포종 및 횡문근육종 포함), 연부 조직 육종, 편평세포암(예를 들어, 두경부의 편평세포암(SCCHN), 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 갑상선암(예를 들어, 전이성 갑상선암) 및 자궁암의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암 세포의 존재를 특징으로 하는 암을 포함한다.
특히, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모양 세포 백혈병, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 중피종 인두암, 비-호지킨 림프종, 소 림프구성 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 신장 세포 암종, 소아의 소 원형 청색 세포 종양(신경아세포종 및 횡문근육종 포함), 편평세포암(예를 들어, 두경부의 편평세포암(SCCHN), 고환암, 갑상선암(예를 들어, 전이성 갑상선암) 및 자궁암의 치료에서 사용될 수 있다.
본 발명의 이중특이적 B7-H3-결합 분자는 이러한 분자(예를 들어, CD2, CD3, CD8, CD16, T 세포 수용체(TCR), KG2D 등)의 2차 특이성을 발현하는 종양 세포의 재지시된 살해를 촉진함으로써 B7-H3에 의해 제공된 암 치료법을 강화한다. 이러한 B7-H3-결합 분자는 암의 치료에 특히 유용하다.
치료법에서 이들의 활용에 더하여, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 탈착가능하게 표지되고 암의 진단이나 종양 및 종양 세포의 영상화에서 사용될 수 있다.
XIII. 제약학적 조성물
본 발명의 조성물은 제약학적 조성물의 제조에 유용한 대량의 약물 조성물(예를 들어, 불순물 또는 비-멸균 조성물) 및 단위 투약 형태의 제조에 사용될 수 있는 제약학적 조성물(즉, 대상 또는 환자에게 투여하기에 적합한 조성물)을 포함한다. 이러한 조성물은 본 발명의 B7-H3-결합 분자, 또는 이러한 제제와 제약학상 허용되는 담체의 조합의 예방적 또는 치료적 유효량을 포함한다. 바람직하게, 본 발명의 조성물은 본 발명의 B7-H3-결합 분자와 제약학상 허용되는 담체의 예방적 또는 치료적 유효량을 포함한다. 본 발명은 또한 추가로 특정 암 항원에 특이적인 제2 치료 항체(예를 들어, 종양-특이적 단클론성 항체), 및 제약학상 허용되는 담체를 포함하는 이러한 제약학적 조성물을 포함한다.
특정 구체예에서, 용어 "제약학상 허용되는"은 미국 연방정부 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 및 더 특별하게는 인간에서의 사용에 대하여 일반적으로 인정되는 다른 약전에 나열되어 있는 것을 의미한다. 용어 "담체"는 치료제와 함께 투여되는 희석제, 보조제(예컨대, 프로인트 보조제(완전 및 불완전), 부형제 또는 비히클을 말한다.
일반적으로, 본 발명의 조성물의 성분은, 예를 들어, 활성제의 양을 표시하는 앰플 또는 봉지(sachette)와 같은 용봉된(hermetically sealed) 용기 내 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서, 별도로 공급되거나 단위 투약 형태로 함께 혼합된다. 조성물이 주입에 의해 투여되어야 하는 경우, 그것은 멸균된 제약학적 등급의 물 또는 식염수를 함유한 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사로 투여되는 경우, 투여 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 멸균된 주사용수 또는 식염수의 앰플이 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 이러한 제약학상 허용되는 담체와 함께 또는 단독으로, 본 발명의 B7-H3-결합 분자로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 제약학적 팩(pack) 또는 키트를 제공한다. 추가로, 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 또는 치료제가 또한 제약학적 팩 또는 키트에 포함될 수 있다. 또한, 본 발명은 본 발명의 제약학적 조성물의 성분들 중 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 제약학적 팩 또는 키트를 제공한다. 제약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태의 통지가 이러한 용기(들)와 선택적으로 연관될 수 있으며, 이 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 기관의 승인을 반영한다.
본 발명은 상기 방법에 사용될 수 있는 키트를 제공한다. 키트는 B7-H3-ADC를 포함하는, 본 발명의 B7-H3-결합 분자 중 어느 것을 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 용기에, 암의 치료에 유용한 하나 이상의 다른 예방제 및/또는 치료제를 더 포함할 수 있다.
XIV . 투여 방법
본 발명의 융합 단백질 또는 콘쥬게이트된 분자, 또는 본 발명의 융합 단백질 또는 콘쥬게이트된 분자를 포함하는 제약학적 조성물의 유효량을 대상에게 투여함으로써 질환, 장애 또는 감염과 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방 및 개선을 위한 본 발명의 조성물이 제공될 수 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 조성물은 실질적으로 정제된다(즉, 효과를 제한하거나 원치않는 부작용을 유발하는 물질이 실질적으로 없다). 특정 구체예에서, 대상은 동물, 바람직하게는 포유동물, 예컨대 비-영장류(예컨대, 소, 말, 고양이, 개, 설치류, 등) 또는 영장류(예컨대, 사이노몰거스 원숭이와 같은 원숭이, 인간 등)이다. 바람직한 구체예에서, 대상은 인간이다.
다양한 전달 시스템, 예를 들어 리포솜 캡슐화, 미립자, 마이크로캡슐, 항체나 융합 단백질 발현가능한 재조합 세포, 수용체-매개 세포내섭취(endocytosis)(예를 들어, Wu et al.(1987) "Receptor-Mediated In Vitro Gene Transformation By A Soluble DNA Carrier System," J. Biol. Chem. 262:4429-4432 참조), 레트로바이러스나 다른 벡터의 일부로서 핵산의 구성 등이 공지되어 있으며 본 발명의 조성물을 투여하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 분자를 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하), 경막외, 및 점막(예를 들어, 비강내 및 경구 경로)을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 구체예에서, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 근육내, 정맥내, 또는 피하 투여된다. 조성물은 임의의 편리한 경로에 의해, 예를 들면 주입 또는 볼루스 주사(bolus injection)에 의해, 상피 또는 점막피부 라이닝(lining)(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성 또는 국소적일 수 있다. 이에 더하여, 예를 들어 흡입기 또는 분무기, 및 연무제가 들어있는 제형의 사용에 의한 폐 투여가 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 미국특허 6,019,968; 5,985,320; 5,985,309; 5,934,272; 5,874,064; 5,855,913; 5,290,540; 및 4,880,078; 및 PCT 공개 WO 92/19244; WO 97/32572; WO 97/44013; WO 98/31346; 및 WO 99/66903을 참조하고, 이것들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 B7-H3-결합 분자의 제조물이 분자의 양을 표시하는 용봉된 용기, 예컨대 앰플 또는 봉지에 포장된다는 것을 제공한다. 한 구체예에서, 이러한 분자는 용봉된 용기 내에서 멸균된 동결건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급되고, 예를 들어 대상에게 투여하기에 적절한 농도로 물 또는 식염수로 복원될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 B7-H3-결합 분자는 용봉된 용기 내에 건조한 멸균 동결건조 분말로서 공급된다.
본 발명의 B7-H3-결합 분자의 동결건조된 제조물은 원래의 용기에서 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야 하고 분자는 복원된 후 12시간 내, 바람직하게는 6시간 내, 5시간 내, 3시간 내, 또는 1시간 내에 투여되어야 한다. 대안의 구체예에서, 이러한 분자는 분자, 융합 단백질 또는 콘쥬게이트된 분자의 양 및 농도를 표시하는 용봉된 용기 내에 액체 형태로 공급된다. 바람직하게, 이러한 B7-H3-결합 분자는 액체 형태로 제공될 때 용봉된 용기로 공급된다.
장애와 관련된 하나 이상의 증상의 치료, 예방 또는 개선에 효과적일 본 발명의 이러한 제조물의 양은 표준 임상 기법으로 결정될 수 있다. 제형에서 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로, 및 상태의 심각도에 따라 달라질 것이며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 유효량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추정될 수 있다.
본원에서 사용된 대로, 제약학적 조성물의 "유효량"은 제한은 아니지만, 질환으로부터 유발되는 증상의 감소, 감염의 증상(예를 들어, 바이러스 로드, 열, 통증, 패혈증 등) 또는 암의 증상(예를 들어, 암세포의 증식, 종양 존재, 종양 전이 등)을 약화시켜서, 질환으로 고통받고 있는 것들의 삶의 질의 증가, 질환을 치료하는데 필요한 다른 약물의 용량 감소, 표적화 및/또는 내재화를 통해 또 다른 약물의 효과 향상, 질환의 진행의 지연 및/또는 개체의 생존 연장과 같은 임상 결과를 포함하는, 이로운 또는 원하는 결과를 얻기에 충분한 양이다.
유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서, 약물, 화합물 또는 제약학적 조성물의 유효량은, 직접적으로 또는 간접적으로, 바이러스 존재의 증식(또는 효과)를 감소시키고 바이러스 질환의 발생을 감소시키고 및/또는 지연시키기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 약물, 화합물 또는 제약학적 조성물의 유효량은 또 다른 약물, 화합물 또는 제약학적 조성물과 함께 달성될 수 있거나 달성되지 않을 수 있다. 따라서, "유효량"은 하나 이상의 화학치료제의 투여의 맥락에서 고려될 수 있고, 하나 이상의 다른 제제와 함께, 원하는 결과가 달성될 수 있거나 달성된 경우, 단일 제제는 유효량으로 제공된 것으로 간주될 수 있다. 개개의 요구는 각기 다르지만, 각 구성성분의 유효량의 최적의 범위의 결정은 당업자의 기술 범위 내에 있다.
발명에 의해 포함되는 B7-H3-결합 분자에 대하여, 환자에게 투여되는 투약량은 바람직하게 수혜 대상의 체중(kg)을 기준으로 결정된다. 본 발명에 의해 포함되는 B7-H3-결합 분자에 대하여, 환자에게 투여되는 투약량은 전형적으로 대상의 체중을 기준으로 약 0.01 ㎍/kg 내지 약 30 mg/kg 또는 그 이상이다.
본 발명의 B7-H3-결합 분자의 투약량 및 투여 빈도는 예를 들어, 지질화와 같은 변형에 의해 분자의 흡수 및 조직 침투를 향상시킴으로써 감소되거나 변화될 수 있다.
환자에게 투여되는 본 발명의 B7-H3-결합 분자의 투약량은 단일 제제 치료법으로서의 사용에 대하여 계산될 수 있다. 대안으로, 분자는 다른 치료적 조성물과 조합하여 사용될 수 있으며 환자에게 투여되는 투약량은 상기 분자가 단일 제제 치료법으로서 사용될 때보다 더 적다.
본 발명의 제약학적 조성물은 치료가 필요한 부위에 국소 투여될 수 있다; 이것은, 예를 들면, 그리고 제한이 아니라, 국소적 주입, 주사, 또는 이식물에 의해 달성될 수 있으며, 상기 이식물은 실라스틱 막, 또는 섬유와 같은 막을 포함하는 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴 재료이다. 바람직하게, 본 발명의 분자를 투여할 때, 분자를 흡수하지 않는 재료를 사용하기 위해 주의를 기울여야 한다.
발명의 조성물은 소포, 특히 리포솜으로 전달될 수 있다(Langer(1990) "New Methods Of Drug Delivery," Science 249:1527-1533); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365(1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327 참조).
본 발명의 B7-H3-결합 분자의 치료적 또는 예방적 유효량에 의한 대상의 치료는 1회 치료를 포함할 수 있거나, 또는 바람직하게는, 일련의 치료를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 대상은 약 1 내지 10주, 바람직하게 2 내지 8주, 더 바람직하게 약 3 내지 7주 동안, 및 더 바람직하게 약 4, 5, 또는 6주 동안 주 1회 이러한 디아바디로 치료된다. 본 발명의 제약학적 조성물은 하루 한 번 투여될 수 있고, 이러한 투여는 주 1회, 주 2회, 격주 1회, 월 1회, 6주마다 1회, 매 2개월에 1회, 연 2회 또는 연 1회 발생한다. 대안으로, 본 발명의 제약학적 조성물은 하루 2회 투여될 수 있고, 이러한 투여는 주 1회, 주2 회, 매 2개월에 1회, 연 2회 또는 연 1회 등이다. 치료에 사용된 분자의 유효량은 특정 치료의 과정 동안에 증가하거나 감소할 수 있다는 것이 인정될 것이다.
XV . 본 발명의 구체예
본 발명은 특히 아래의 구체예(EA 및 EB)에 관한 것이다:
EA1. 아래의 식을 포함하는 항-B7-H3 항체 약물 콘쥬게이트(B7-H3-ADC):
Ab-(LM)m-(D)n,
여기서:
Ab는 인간화된 가변 중쇄(VH) 도메인 및 인간화된 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 B7-H3에 결합하는 항체이거나, 또는 그것의 B7-H3-결합 단편이고;
D는 세포독성 약물 부분이고;
LM은 Ab와 D를 공유 연결하는 결합 또는 링커 분자이고;
m은 0과 n 사이의 정수로서 B7-H3-ADC의 링커 분자의 수를 나타내고;
n은 1과 10 사이의 정수로서 B7-H3-ADC 분자에 공유 연결된 세포독성 약물 부분의 수를 표시한다.
EA2.
(A) (i) 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:99의 아미노산 서열을 포함하고,
(ii) 상기 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:104의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(B) (i) 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하고,
(ii) 상기 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
(C) (i) 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하고,
(ii) 상기 인간화된 VH 도메인은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는, EA1의 B7-H3-ADC.
EA3. 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:99의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:104의 아미노산 서열을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공하는, EA1의 B7-H3-ADC.
EA4. 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC를 제공하는, EA1의 B7-H3-ADC.
EA5. 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 이러한 B7-H3-ADC, EA1의 B7-H3-ADC.
EA6. 상기 Ab가 항체인, EA1-EA5의 B7-H3-ADC.
EA7. 상기 Ab가 항체의 항원 결합 단편인, EA1-EA5의 B7-H3-ADC.
EA8. 상기 B7-H3-ADC가 인간 IgG의 Fc 도메인을 포함하는, EA1-EA7의 B7-H3-ADC.
EA9. 상기 인간 IgG가 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인, EA8의 B7-H3-ADC.
EA10. 상기 Fc 도메인이
(a) FcγR에 대한 변이체 FC 도메인의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형; 및/또는
(b) 변이체 Fc 도메인의 혈청 반감기를 증진시키는 하나 이상의 아미노산 변형
을 포함하는 변이체 Fc 도메인인, EA8 또는 EA9의 B7-H3-ADC.
EA11. FcγR에 대한 변이체 Fc 도메인의 친화성을 감소시키는 상기 변형은 치환 L234A; L235A; 또는 L234A 및 L235A를 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스를 따른 것인, EA10의 B7-H3-ADC.
EA12. 변이체 Fc 도메인의 혈청 반감기를 증진시키는 상기 변형은 치환 M252Y; M252Y 및 S254T; M252Y 및 T256E; M252Y, S254T 및 T256E; 또는 K288D 및 H435K을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스를 따른 것인, EA10 또는 EA11의 B7-H3-ADC.
EA13. 상기 LM 중 적어도 하나가 링커 분자인, EA1-EA12의 B7-H3-ADC.
EA14. 상기 LM 링커 분자가 펩타이드계 링커인, EA13의 B7-H3-ADC.
EA15. 상기 LM 링커 분자가 절단가능한 링커인, EA13의 B7-H3-ADC.
EA16. 상기 분자는 아래의 식을 포함하는, EA15의 B7-H3-ADC.
Ab - [V-(W)k-(X)1-A] - D
여기서:
V는 상기 절단가능한 LM 링커 분자이고,
(W)k-(X)1-A는 l,(4+2n)-제거를 통해 자기 제거하는, 신장된, 자기-제거 스페이서 시스템이고,
W 및 X는 각각 l,(4+2n) 전자 연쇄반응 스페이서로서 동일하거나 상이하고,
A는 식 (Y)m의 스페이서 기로서 Y가 l,(4+2n) 전자 연쇄반응 스페이서인 기, 또는 식 U의 기로서 고리화 제거 스페이서 기이고,
k, l 및 m은 독립적으로 0(포함됨) 내지 5(포함된)의 정수이고, n은 0(포함됨) 내지 10(포함됨)의 정수이며, 단
A가 (Y)m일 때 k+l+m ≥ 1, 및
만일 k+l+m = 1이면 n > 1;
A가 U일 때 k+1 ≥ 1이다.
W, X, 및 Y는 독립적으로 아래의 식:
Figure pct00101
또는
Figure pct00102
을 가진 화합물로부터 선택된다:
여기서:
Q는 -R5C=CR6-, S, O, NR5, -R5C=N-, 또는 -N=CR5-이고,
P는 NR7, O 또는 S이고,
a, b, 및 c는 독립적으로 0(포함됨) 내지 5(포함됨)의 정수이고;
I, F 및 G는 독립적으로 아래의 식을 가진 화합물로부터 선택되고:
Figure pct00103
여기서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C3-20 헤테로사이클릴, C5-20 아릴, C1-6 알콕시, 하이드록시(OH), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(SRx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP-(=0)(ORx)2)를 표시하며, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 독립적으로 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 치환체 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 또는 R9 중 둘 이상은 선택적으로 서로 연결되어 하나 이상의 지방족 또는 방향족 환형 구조를 형성하며;
U는 아래의 식을 가진 화합물로부터 선택된다:
Figure pct00104
여기서:
a, b 및 c는 독립적으로 0 또는 1의 정수가 되도록 선택되며; 단 a + b + c = 2 또는 3이고;
R1 및/또는 R2는 독립적으로 H, C1-6 알킬을 표시하며, 상기 알킬은 선택적으로 다음의 군: 하이드록시(OH), 에테르(ORx), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(S-Rx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP(=0)(ORx)2) 중 하나 이상으로 치환되고, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되며,
R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 독립적으로 H, C1-6 알킬, C3-20 헤테로사이클릴, C5-20 아릴, C1-6 알콕시, 하이드록시(OH), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(S-Rx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP(=0)(ORx)2)를 표시하며, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 치환체 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중 둘 이상은 선택적으로 서로 연결되어 하나 이상의 지방족 또는 방향족 환형 구조를 형성한다.
EA17. 상기 LM 링커 분자는 아래의 것을 포함하는, EA16의 B7-H3-ADC.
(1) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
(2) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
(3) p-암모신남일옥시카보닐;
(4) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
(5) p-아미노-벤질옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
(6) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
(7) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐;
(8) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
(9) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p아미노벤질옥시카보닐;
(10) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐;
(11) p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
(12) p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
(13) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
(14) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
(15) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)-카보닐;
(16) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
(17) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질;
(18) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질;
(19) p-아미노신남일;
(20) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질;
(21) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노신남일;
(22) p-아미노-신남일옥시카보닐-p-아미노신남일;
(23) p-아미노페닐펜타디엔일;
(24) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노신남일;
(25) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노벤질; 또는
(26) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노페닐펜타디엔일.
EA18. 상기 LM 링커 분자가 Ab의 폴리펩타이드 사슬의 아미노산의 측쇄에 콘쥬게이트되고 상기 Ab와 상기 세포독성 약물 부분 D의 분자를 결합시키는, EA13-EA17의 B7-H3-ADC.
EA19. 상기 세포독성 약물 부분 D는 사이토톡신, 방사성동위원소, 면역조정제, 사이토카인, 림포카인, 케모카인, 성장인자, 종양괴사인자, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, siRNA, RNAi, 마이크로RNA, 광활성 치료제, 항신생혈관제, 친-세포자살제, 펩타이드, 지질, 탄수화물, 킬레이트화제, 또는 이들의 조합을 포함하는, EA1-EA18의 B7-H3-ADC.
EA20. 상기 세포독성 약물 부분 D는 사이토톡신이고, 튜불리신, 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 칼리키아미신, 피롤로벤조디아제핀 및 듀오카르마이신으로 구성되는 군으로부터 선택되는, EA19의 B7-H3-ADC.
EA21. 상기 세포독성 약물 부분 D는 튜불리신 사이토톡신을 포함하고, 튜불리신 A, 튜불리신 B, 튜불리신 C, 및 튜불리신 D로 구성되는 군으로부터 선택되는, EA19의 B7-H3-ADC.
EA22. 상기 세포독성 약물 부분 D는 아우리스타틴 사이토톡신을 포함하고, MMAE(N-메틸발린-발린-돌라이소로이신-돌라프로인-노르에페드린) 및 MMAF(N-메틸발린-발린-돌라이소로이신-돌라프로인-페닐알라닌)로 구성되는 군으로부터 선택되는, EA19의 B7-H3-ADC.
EA23. 상기 세포독성 약물 부분 D는 메이탄시노이드 사이토톡신을 포함하고, 마이탄신, DM1 및 DM4로 구성되는 군으로부터 선택되는, EA19의 B7-H3-ADC.
EA24. 상기 세포독성 약물 부분 D는 칼리키아미신 사이토톡신을 포함하고, 칼리키아미신 γ1, 칼리키아미신 β1Br, 칼리키아미신 γ1Br, 칼리키아미신 α2I, 칼리키아미신 α3I, 칼리키아미신 β1I, 칼리키아미신 γ1I, 및 칼리키아미신 Δ1I로 구성되는 군으로부터 선택되는, EA19의 B7-H3-ADC.
EA25. 상기 세포독성 약물 부분 D는 피롤로벤조디아제핀 사이토톡신을 포함하고, 바다스툭시맙 탈리린, SJG-136, SG2000, SG2285 및 SG2274로 구성되는 군으로부터 선택되는, EA19의 B7-H3-ADC.
EA26. 상기 세포독성 약물 부분 D는 듀오카르마이신 사이토톡신을 포함하고, 듀오카르마이신 사이토톡신이고, 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 B1, 듀오카르마이신 B2, 듀오카르마이신 C1, 듀오카르마이신 C2, 듀오카르마이신 D, 듀오카르마이신 SA, CC-1065, 아도젤레신, 비젤레신, 카젤레신(U-80244) 및 스피로-듀오카르마이신(DUBA)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, EA19의 B7-H3-ADC.
EA27. 상기 LM 링커 분자는 환원된 사슬간 이황화물을 통해서 상기 Ab에 공유 결합되는, EA1-EA26의 B7-H3-ADC.
EA28. EA1-EA27 중 어느 것의 B7-H3-ADC의 유효량과 제약학상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물.
EA29. B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서 EA1-EA27 중 어느 것의 B7-H3-ADC 또는 EA28의 제약학적 조성물의 사용.
EA30. B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 상기 질환 또는 상태는 암인, EA29의 사용.
EA31. 상기 암은 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 부신암, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, B-세포 암, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 섬유성 골 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 교모세포종, 악성 혈액암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병), 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암(NSCLC)), 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 중피종 인두암, 다발성 내분비종양증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경집 종양, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 소아의 소 원형 청색 세포 종양(신경아세포종 및 횡문근육종 포함), 연부 조직 육종, 편평세포암(예를 들어, 두경부의 편평세포암(SCCHN), 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 갑상선암(예를 들어, 전이성 갑상선암) 및 자궁암의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암 세포의 존재를 특징으로 하는, EA30의 사용.
EA31. 상기 암은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모양 세포 백혈병, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 중피종 인두암, 비-호지킨 림프종, 소 림프구성 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 신장 세포 암종, 소아의 소 원형 청색 세포 종양(신경아세포종 및 횡문근육종 포함), 편평세포암(예를 들어, 두경부의 편평세포암(SCCHN), 고환암, 갑상선암(예를 들어, 전이성 갑상선암) 및 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, EA30의 사용.
EB1. CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인을 포함하는 가변 경쇄(VL) 도메인, 및 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인을 포함하는 가변 중쇄(VH) 도메인을 포함하고,
(1) 상기 CDRH1 도메인은 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하고;
(2) 상기 CDRH2 도메인은 SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하며;
(3) 상기 CDRH3 도메인은 SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는, B7-B7-결합 분자.
EB2. CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인을 포함하는 상기 VL 도메인, 및 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인을 포함하는 상기 VH 도메인을 포함하고,
(1) 상기 CDRL1 도메인은 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하고;
(2) 상기 CDRL2 도메인은 SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하며;
(3) 상기 CDRL3 도메인은 SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는, EB1의 B7-B7-결합 분자.
EB3. CDRL1 도메인, CDRL2 도메인 및 CDRL3 도메인을 포함하는 상기 VL 도메인, 및 CDRH1 도메인, CDRH2 도메인 및 CDRH3 도메인을 포함하는 상기 VH 도메인을 포함하고, 상기 도메인들이 아래로 구성되는 군으로부터 선택되는, EB1의 B7-B7-결합 분자.
(1) SEQ ID NO:27의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1 도메인;
(2) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2 도메인;
(3) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 도메인;
(4) SEQ ID NO:23의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1 도메인;
(5) SEQ ID NO:24의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2 도메인; 및
(6) SEQ ID NO:25의 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 도메인.
EB4. 상기 VH 도메인이 SEQ ID NO:26 또는 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는, EB1-EB3 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB5. 상기 VL 도메인이 SEQ ID NO:22 또는 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하는, EB1-EB4 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB6. VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며 상기 VL 도메인이 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하는 B7-H3-결합 분자.
EB7. VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며 상기 VH 도메인이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 B7-H3-결합 분자.
EB8. VL 도메인 및 VH 도메인을 포함하며 상기 VL 도메인이 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하고 상기 VH 도메인이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 B7-H3-결합 분자.
EB9. 상기 분자가 항체 또는 그것의 항원-결합 단편인, EB1-EB8 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB10. 상기 분자가
(a) 이중특이적 항체; 또는
(b) 디아바디, 상기 디아바디는 2개, 3개, 4개 또는 5개의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 공유 결합된 복합체이고; 또는
(c) 3가 결합 분자, 상기 3가 결합 분자는 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 폴리펩타이드 사슬을 포함하는 공유 결합된 복합체인, EB1-EB8 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB11. 상기 분자가 Fc 도메인을 포함하는, EB1-EB10 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB12. 상기 분자가 디아바디이고 알부민-결합 도메인(ABD)을 포함하는, EB10의 B7-B7-결합 분자.
EB13. 상기 Fc 도메인은
(a) FcγR에 대한 변이체 Fc 도메인의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형; 및/또는
(b) 변이체 Fc 도메인의 혈청 반감기를 증진시키는 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 변이체 Fc 도메인인, EB11의 B7-B7-결합 분자.
EB14. FcγR에 대한 변이체 Fc 도메인의 친화성을 감소시키는 상기 변형은 L234A; L235A; 또는 L234A 및 L235A의 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같은 EU 인덱스를 따른 것인, EB13의 B7-B7-결합 분자.
EB15. 변이체 Fc 도메인의 혈청 반감기를 증진시키는 하나 이상의 변형은 M252Y; M252Y 및 S254T; M252Y 및 T256E; M252Y, S254T 및 T256E; 또는 K288D 및 H435K의 치환을 포함하고, 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스에 따른 것인, EB13 또는 EB14의 B7-B7-결합 분자.
EB16. 상기 분자는 이중특이적이고 B7-H3의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 2개의 에피토프-결합 부위 및 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 2개의 에피토프-결합 부위를 포함하는, EB1-EB15 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB17. 상기 분자는 이중특이적이고 B7-H3의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 하나의 에피토프-결합 부위 및 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 하나의 에피토프-결합 부위를 포함하는, EB1-EB15 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB18. 상기 분자는 삼중특이적이고,
(a) B7-H3의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 하나의 에피토프-결합 부위;
(b) 이펙터 세포의 표면에 존재하는 제1 분자의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 하나의 에피토프-결합 부위; 및
(c) 이펙터 세포의 표면에 존재하는 제2 분자의 에피토프에 면역특이적 결합할 수 있는 하나의 에피토프-결합 부위를 포함하는, EB1-EB15 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB19. 상기 분자는 B7-H3와 이펙터 세포의 표면에 존재하는 분자에 동시에 결합할 수 있는, EB1-EB8 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB20. 이펙터 세포의 표면에 존재하는 상기 분자는 CD2, CD3, CD8, TCR, 또는 NKG2D인, EB1-EB18 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB21. 상기 이펙터 세포는 세포독성 T-세포, 또는 자연살해(NK) 세포인, EB1-EB20 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB22. 이펙터 세포의 표면에 존재하는 상기 분자는 CD3인, EB16-EB21 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB23. 이펙터 세포의 표면에 존재하는 상기 제1 분자는 CD3이고, 이펙터 세포의 표면에 존재하는 상기 제2 분자는 CD8인, EB18의 B7-B7-결합 분자.
EB24. 상기 분자는 B7-H3을 발현하는 세포와 세포독성 T 세포의 합동 결합을 매개하는, EB16-EB23 중 어느 하나의 B7-B7-결합 분자.
EB25. EB1-EB24 중 어느 것의 B7-H3-결합 분자의 유효량과 제약학상 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물.
EB26. B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서 EB1-EB24 중 어느 것의 B7-H3-결합 분자 또는 EB26의 제약학적 조성물의 사용.
EB27. B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 상기 질환 또는 상태는 암인, EB26의 사용.
EB28. 상기 암은 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 부신암, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, B-세포 암, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 섬유성 골 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 교모세포종, 악성 혈액암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병), 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암(NSCLC)), 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 중피종 인두암, 다발성 내분비종양증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경집 종양, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 소아의 소 원형 청색 세포 종양(신경아세포종 및 횡문근육종 포함), 연부 조직 육종, 편평세포암(예를 들어, 두경부의 편평세포암(SCCHN), 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 갑상선암(예를 들어, 전이성 갑상선암) 및 자궁암의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암 세포의 존재를 특징으로 하는, EB27의 사용.
EB29. 상기 암은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모양 세포 백혈병, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 중피종 인두암, 비-호지킨 림프종, 소 림프구성 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 신장 세포 암종, 소아의 소 원형 청색 세포 종양(신경아세포종 및 횡문근육종 포함), 편평세포암(예를 들어, 두경부의 편평세포암(SCCHN), 고환암, 갑상선암(예를 들어, 전이성 갑상선암) 및 자궁암으로 구성되는 군으로부터 선택되는, EB27의 사용.
실시예
이제 본 발명이 일반적으로 설명되며 아래의 실시예를 참조하여 더 쉽게 이해될 것이다. 아래의 실시예는 본 발명의 진단 또는 치료 방법에서 조성물에 대한 다양한 방법을 예시한다. 실시예는 본 발명의 범위를 예시하기 위한 것으로서 어떤 식으로도 그것을 제한하지 않는다.
실시예 1
항-B7-H3 항체의 생성, 인간화 및 특성화
이미 설명된 대로 생육성 인간 태아 선조 세포 또는 종양 개시/암 단계-유사 세포(CSLCs)를 가지고 마우스의 면역화를 통해서 단클론성 항체를 생성했다(Loo et al.(2007) "The glycotope-specific RAV12 monoclonal antibody induces oncosis in vitro and has antitumor activity against gastrointestinal adenocarcinoma tumor xenografts in vivo" Mol Cancer Ther;6:856-65). 암-특이적 mAb에 대한 IHC 스크린은 매우 차등적인 종양-대-정상 조직 결합을 가진 일군의 항-B7-H3(CD276) 반응성 mAb를 확인했다. 제조자의 프로토콜(Advanced Targeting Systems)에 따라서 1:1 또는 10:1 Fab-ZAP:테스트 mAb 비로 사포린-콘쥬게이트된 항-마우스 Fab를 사용한 제5일 분석에서 수행된 내재화 분석을 사용하여 효과적으로 내재화된 항-B7-H3 항체의 하위군을 확인했다. 도 7에 도시된 대로, "mAb-C" 및 "mAb-D"로 지정된 항-B7-H3 항체를 포함하는 다수의 항-B7-H3 항체가 효과적으로 내재화되었다.
상기 설명된 뮤린 항-B7-H3 mAb인 mAb-B, mAb-C 및 mAb-D를 사용하여, 도메인의 CDRLS 및 CDRHS가 인간 프레임워크 도메인에 융합된 인간화된 VL 및 VH 도메인을 형성한다. 다음에, 인간화된 VH 및 VL 도메인을 사용하여 카파 경쇄 불변 영역(즉, SEQ ID NO:1) 및 IgG1 CHI, 힌지, 및 Fc 도메인(즉, SEQ ID NO:3, 6, 12)을 가진 인간화된 경쇄를 생성한다. 인간화된 항체는 "hmAb-B", "hmAb-C" 및 "hmAb-D"로 지정했다.
인간화된 VL 및 VH 도메인의 아미노산 서열은 상기 제공된다. hmAb-B의 CDR은 상기 설명된 대로 대안의 인간화된 VL 및 VH 도메인을 생성하도록 변형될 수 있다는 것이 주지될 것이다. hmAb-C 및 hmAb-D의 전체 인간화된 경쇄 및 중쇄의 아미노산 서열은 상기 제공된다.
가용성 인간 또는 사이노몰거스 B7-H3(4Ig)-His 택 융합 단백질(각각 shB7-H3-His 또는 scB7-H3-His)을 고정된 항체 위를 통과시키는 Biacore 분석을 사용하여 인간화된 항체의 결합 동태학을 조사했다. 간단히, 각 인간화된 항체를 고정된 Fab2 염소 항-인간 Fc 표면에 포착하고 shB7-H3-His 또는 scB7-H3-his(6.25-100Nm)와 함께 인큐베이션했으며, Biacore 분석을 통해서 결합의 동태학을 결정했다. 2가 결합 핏을 사용하여 이들 연구로부터 계산된 ka, kd 및 KD가 표 6에 제시된다. 이 결과는 인간화된 항체들이 일정 범위의 친화성으로 인간 및 사이노몰거스 원숭이 B7-H3에 의해 결합한다는 것을 증명한다.
Figure pct00105
면역조직화학(IHC)에 의해 인간화된 항체의 조직 교차반응성을 검사했다. 표 7은 나타낸 항체 농도로 인간화된 항-B7-H3 항체를 사용하여 정상 인간 조직, 인간 종양 조직, 인간 암 셀라인, 및 B7-H3을 발현하거나 발현하지 않는 CHO 셀라인에 대해 수행된 몇몇 IHC 연구에서의 발견을 요약한다. 이들 연구에서 점수 기준이 표 8에 제공된다.
Figure pct00106
Figure pct00107
이들 결과는 모든 인간화된 항체가 수많은 B7-H3 양성 종양 세포에 대해 결합을 나타낸다는 것을 증명한다. hmAb-B는 시험된 조건에서 가장 큰 종양 반응성을 나타내고 간세포 및 부신 조직에 대해서는 정상 조직 반응성을 나타냈다. hmAb-C는 hmAb-B와 비교하여 다소 감소된 종양 반응성을 나타내고, 정상 간세포와 실질적으로 적은 반응성을 나타내며 더 적은 독립적 샘플에 대해 반응성을 나타낸다. hmAb-D는 종양 및 정상 조직에 대해 전체적으로 감소된 반응성을 나타낸다. 항체들은 사이노몰거스 원숭이 조직에 비슷한 교차반응성을 나타내지만, hmAb-D는 이들 IHC 연구에서 적은 강도로 결합한다. 표적을 벗어난 독성을 최소화하기 위해 hmAb-C 및 hmAb-D가 본 발명의 B7-H3-ADC 분자의 생성을 위해 바람직할 수 있다.
실시예 2
B7-H3- ADC의 생성
상기 설명된 뮤린 항-B7-H3 mAb인 mAb-A, mAb-B, mAb-C 및 mAb-D를 사용하여 항체의 VL 도메인이 인간 경쇄 카파 불변 영역(SEQ ID NO:1)에 융합되고 항체의 VH 도메인이 인간 IgG1 CH1-Hinge-CH2-CH3 불변 영역(각각 SEQ ID NO:3, 7, 및 12)에 융합된 키메라 항체를 형성했다. 키메라화된 항체("chmAb-A", "chmAb-B", "chmAb-C" 및 "chmAb-D")를, 상기 논의된 대로, 절단가능한 아우리스타틴 E 링커/페이로드 "vc-MMAE"(Concortis Biosystems)와 함께 B7-H3 결합 도메인과의 시스테인-콘쥬게이션을 통해서 B7-H3-ADC로 전환시켰다.
실시예 3
B7-H3- ADC는 효능있는 시험관내 활성을 나타낸다
본 발명의 B7-H3-ADC의 항-종양 활성을 증명하기 위해, 상기 설명된 B7-H3-ADC(MMAE)를 B7-H3-발현 JIMT-1 유방암 세포, MDA-MB-468 유방암 세포, A375.52 흑색종 세포, Calu-6 비소세포 폐암 세포, NCI-H1703 비소세포 폐암 세포, NCI-H1975 비소세포 폐암 세포, PA-1 난소암 세포, Hs700T 췌장암 세포, DU145 전립선암 세포, 또는 B7-H3-음성 Raji B 세포 림프종 세포와 함께 1-100,000 pM의 농도 범위로 인큐베이션하고 7일 후에 시험관내 세포독성을 정량했다. 간단히, B7-H3-ADC 및 대조군을 희석하고 마이크로타이터 플레이터에 플레이팅하고 5000개의 세포를 각 웰에 첨가하고 4-7일 동안 37℃에서 인큐베이션한다. 플레이트에 Alamar Blue 시약(예를 들어, BioRad/ThermoFisher/Invitrogen)을 첨가하고 제조자의 프로토콜에 따라서 판독한다. 이들 세포에 존재하는 항체 결합 부위의 수를 Bangs QFACS™ 키트를 사용하여 결정했다.
이 연구로부터의 세포독성 곡선이 도 8A-8J에 제시된다. IC50 값을 결정했고 표 9에 제공된다. 이들 연구의 결과는 시험된 내재화 항-B7-H3 항체의 각각이 B7-H3-발현 종양 세포에 대해 용량-의존적 시험관내 세포독성을 나타냈음을 증명한다. 항체들은 일정 범위의 효능을 나타냈다. 이들 분석에서 상대적인 효능은 chmAb-C > chmAb-B > chmAb-D > chmAb-A였다.
Figure pct00108
실시예 4
B7-H3- ADC는 효능있는 생체내 활성을 나타낸다
본 발명의 B7-H3-ADC의 항-종양 활성을 더 증명하기 위해, 상이한 종양 셀라인을 사용하여 CD1 누드 마우스 모델에서 상기 설명된 chmAb-B B7-H3-ADC, chmAb-C B7-H3-ADC 및/또는 chmAb-D B7-H3-ADC(MMAE) 분자를 생체내 독성에 대해 평가했다. 간단히, ~5 x 106 종양 세포(1:1 배지 및 MATRIGEL®에 현탁됨)를 CD1 누드 마우스(Charles River Laboratories)의 옆구리에 피하 이식했다. 종양이 대략 150㎣의 용적에 도달했을 때 마우스를 무작위화하고 B7-H3-ADC 또는 대조군 비히클을 복강내 투여했다. 이들 연구에서 B7-H3-ADC 또는 대조군 비히클의 1회 용량이 투여되었다(qdx1). 전자 캘리퍼로 직교 측정하여 종양을 주 2회 측정했고, 종양 용적[(길이 x 너비 x 높이)/2]을 계산했다. (대조군에 대한) 종양 용적을 계산했다("T/C"). 치료된 동물의 종양 용적이 연구 기간 동안 ≤5㎣까지 감소했다는 것이 발견되면 이 발견을 완전 반응("CR")을 표시하는 것으로 간주했다.
MDA -MB-468 유방암 종양 세포에 대한 생체내 활성
포유류 지방체 이식된 MDA-MB-468 유방암 종양 세포와 관련한 이 연구의 결과가 표 10 및 도 9에 제시되며, MDA-MB-468 종양 세포에 대한 반응성을 나타낸다.
Figure pct00109
NCI-H1703 비소세포 폐암 종양 세포에 대한 생체내 활성
피하 이식된 NCI-HI 703 비소세포 폐암 종양 세포와 관련한 이 연구의 결과가 표 11 및 도 1OA-1OC에 제시되며, NCI-H1703 종양 세포에 대한 반응성을 나타낸다.
Figure pct00110
PA-1 난소암 종양 세포에 대한 생체내 활성
피하 이식된 PA-1 난소암 종양 세포와 관련한 이 연구의 결과가 표 12 및 도 11A-11C에 제시되며, PA-1 종양 세포에 대한 반응성을 나타낸다.
Figure pct00111
Calu -6 비소세포 폐암 종양 세포에 대한 생체내 활성
피하 이식된 Calu-6 비소세포 폐암 종양 세포와 관련한 이 연구의 결과가 표 13 및 도 12A-12C에 제시되며, Calu-6 종양 세포에 대한 반응성을 나타낸다.
Figure pct00112
A375.S2 흑색종 종양 세포에 대한 생체내 활성
피하 이식된 A375.S2 흑색종 종양 세포와 관련한 이 연구의 결과가 표 14 및 도 13A-13C에 제시되며, A375.S2 흑색종 세포에 대한 반응성을 나타낸다.
Figure pct00113
이들 연구의 결과는 시험된 B7-H3-ADC의 각각이 유방암, 폐암 및 난소암뿐만 아니라 흑색종의 뮤린 이종이식편 모델에서 B7-H3-양성 종양에 대해 유의한 용량-의존적 생체내 항-종양 활성을 나타냈음을 증명한다.
이러한 분자를 5 mg/kg의 단일 용량으로 복강내 투여함으로써 비-종양 보유 CD1 누드 마우스에서 상기 B7-H3-ADC(MMAE) 분자의 약동학을 평가했다. 10일의 기간에 걸쳐서 혈액 샘플을 채취하고 혈청에 대해 샌드위치 ELISA를 수행하여 총 항체 및 무손상 B7-H3-ADC 농도를 정량했다.
chmAb-B B7-H3 ADC, chmAb-C B7-H3 ADC 및 chmAb-D B7-H3 ADC와 관련하여 이 연구의 대표적인 결과가 도 14A-14C 및 표 15에 제시되며, B7-H3-ADC 분자는 매우 안정하고 대략 2.2-3.6일의 반감기를 나타낸다는 것을 보여준다. 이 콘쥬게이트의 반감기는 콘쥬게이트되지 않은 분자의 반감기와 비슷했고, 이는 B7-H3-ADC 분자가 마우스에서 매우 안정하다는 것을 증명한다.
Figure pct00114
실시예 5
절단가능한 링커- 듀오카르마이신 부분을 가진 B7-H3- ADC
상기 설명된 대로(반응도 9A-9I 참조), 그리고 Elgersma R.C. et al.(2014) "Design, Synthesis and Evaluation of Linker-Duocarmycin Payloads: Toward Selection of HER2-Targeting Antibody-Drug Conjugate SYD985," Mol. Pharmaceut. 12:1813-1835에 설명된 대로, 환원된 사슬간 이황화물을 통해 항체에 콘쥬게이트된 절단가능한 링커를 통해서 Ab 부분의 아미노산 잔기에 예시적인 듀오카르마이신 부분(DUBA)이 연결된 B7-H3-ADC를 구성했다("hmAb-C B7-H3-ADC")(또한 WO 02/083180; WO 2010/062171; WO 2011/133039; WO 2015/104359; 및 WO 2015/185142 참조). 평균 약물 대 항체 비율(DAR)은 약 2-4, 전형적으로 약 2.7이다. 정확한 DAR은 각 제조마다 변할 수 있다는 것이 이해될 것이다. 합성 단계의 순서는 원하는 대로 변경될 수 있다. 바람직하게, 사용된 방법은 상기 설명된 대로 반응도 9A-9I에 따를 것이며, 링커-DUBA는 환원된 사슬간 이황화물을 통해서 항체에 콘쥬게이션된다.
실시예 6
절단가능한 링커- 듀오카르마이신 부분을 가진 B7-H3- ADC는 생물학적 활성을 보유한다
상기 설명된 hmAb-C B7-H3-ADC(절단가능한 링커를 통해서 그것의 Ab 부분의 아미노산 잔기에 연결된 예시적인 듀오카르마이신 부분(DUB A)을 가진)("hmAb-C-DUBA")를 7일 동안 세포와 함께 인큐베이션했고, 생육성을 본질적으로 상기 설명된 대로 Alamar 블루 분석을 사용하여 결정했다. 도 15A-15C에 도시된 대로, hmAb-C-DUBA 구성물은 B7-H3 양성 종양 세포에 대한 그것의 세포독성 활성에 의해 증명된 대로 생물학적 활성을 보유했다. 유사한 결과가 듀오카르마이신에 연결된 상기 설명된 chmAb-C("chmAb-C-DUBA")에 대해서도 관찰되었다.
이 연구 및 아래 설명된 추가의 연구에서, DUBA에 콘쥬게이트된 관련없는 항원(CD20)에 결합하는 분자("Ctrl-DUBA")를 설치류 혈장에 존재하는 설치류-특이적 카복시에스테라아제 CES1c로 인한 비-특이적 생체내 활성을 설명하기 위한 비-결합 대조군 ADC로 사용했다.
실시예 7
B7-H3- ADC는 효능있는 생체내 항-종양 활성을 나타낸다
이 분자의 생체내 효능을 평가하기 위해 다중용량 연구를 시작했다. Calu-6 비소세포 폐 암종 세포를 본질적으로 상기 설명된 대로 마우스의 그룹(n=5)에 피하 이식했고, 그 다음에 마우스는 접종 후 제24, 31, 38 및 45일에(화살표로 표시됨) hmAb-C-DUBA(1 mg/kg x 3, 3 mg/kg x 3, 또는 6 mg/kg x 3)의 용량을 받았으며, 동물을 최대 62일 동안 종양 용적에 대해 평가했다(본질적으로 상기 설명된 대로). 도 16에 도시된 대로, hmAb-C-DUBA의 모든 세 개의 시험된 용량은 종양 용적을 감소시키거나 제거하는데 효과적인 것으로 입증되었다. Calu-6 세포는 2+의 IHC 점수를 나타냈고, 세포당 항체 결합 부위(ABC)가 표 9에 보고된다.
2차 생체내 연구에서(본질적으로 상기 설명된 대로 수행됨), Calu-6 비소세포 폐 암종 세포를 마우스의 그룹(n=7)에 피하 이식했고, 그 다음에 마우스는 제20일에(화살표로 표시됨) hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA(3 mg/kg 또는 10 mg/kg)의 단일 용량을 받았다. 표 16과 도 17에 그 결과를 요약하며, hmAb-C-DUBA의 제공이 종양 용적을 유의하게 감소시켰음을 나타낸다.
Figure pct00115
3차 생체내 연구에서(본질적으로 상기 설명된 대로 수행됨), PA-1 난소 암종 세포를 마우스의 그룹(n=6)에 피하 이식했고, 그 다음에 마우스는 제25일에(화살표로 표시됨) hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA(1 mg/kg, 6 mg/kg 또는 10 mg/kg)의 단일 용량을 받았다. 표 17과 도 18에 그 결과를 요약하며, hmAb-C-DUBA의 제공이 종양 용적을 유의하게 감소시켰고 치료된 동물의 최대 절반에서 완전한 경감을 달성했음을 나타낸다.
Figure pct00116
또한, A375.S2 흑색종 세포에 대해 효능있는 생체내 활성을 관찰했다. 이러한 세포를 마우스의 그룹(n=7)에 피하 이식했고(본질적으로 상기 설명된 대로), 그 다음에 마우스는 제25일에(화살표로 표시됨) hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA(1 mg/kg 또는 3 mg/kg)의 단일 용량을 받았다. 표 18과 도 19에 그 결과를 요약하며, hmAb-C-DUBA의 제공이 종양 용적을 유의하게 감소시켰고 시험된 더 높은 용량에서 치료된 동물의 5/7에서 완전한 경감을 달성했음을 나타낸다.
Figure pct00117
MDA-MB468 유방 암종 세포에 대해 효능있는 생체내 활성을 관찰했다. 이러한 세포를 마우스 그룹(n=5)의 포유류 지방체에 이식했고(본질적으로 상기 설명된 대로), 그 다음에 마우스는 제70일에(화살표로 표시됨) hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA (3 mg/kg 또는 6 mg/kg)의 단일 용량 또는 hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA(3 mg/kg (화살표로 표시됨)의 3회 용량을 받았다. 동물을 최대 110일 동안 종양 용적에 대해 평가했다(본질적으로 상기 설명된 대로). MDA-MB468 세포는 2+의 IHC 점수를 나타냈고, ABC는 표 9에 보고된다. 표 19 및 도 20A-20D에 그 결과를 요약하다. 도 20A는 6 mg/kg(단일 용량)의 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA에 대한 결과를 도시한다. 도 20B는 3 mg/kg(단일 용량)의 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA에 대한 결과를 도시한다. 도 20C는 3 mg/kg(3회 용량)의 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA에 대한 결과를 도시한다. 도 20D는 모든 결과를 하나의 그래프에 도시한다. 이 데이터는 hmAb-C-DUBA의 제공이 종양 용적을 유의하게 감소시켰고 시험된 더 높은 용량에서 치료된 동물의 4/5에서 완전한 경감을 달성했다는 것과 복제물의 제공이 치료 성과를 현저히 개선시켰다는 것을 나타낸다.
Figure pct00118
추가의 연구에서, PA-1 난소 암종 세포(1:1 배지 및 MATRIGEL®에 현탁된 ~5 x 106 종양 세포)의 이종이식편을 마우스의 그룹에 피하 도입했고, 그 다음에 마우스는 접종 후 제24일에 hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA의 용량(3 mg/kg, 6 mg/kg 또는 10 mg/kg의 단일 용량) 또는 10 mg/kg hmAb-C-DUBA의 2회 용량(접종 후 제24일 및 28일) 또는 6 mg/kg hmAb-C-DUBA의 4회 용량(접종 후 제24, 28, 31 및 35일)을 받았다. 동물을 최대 70일 동안 종양 용적에 대해 평가했다(본질적으로 상기 설명된 대로). PA-1 세포는 2+의 IHC 점수를 나타냈고 ABC는 표 9에 보고된다. 도 21A-21D에 그 결과를 요약한다. 도 21A는 10 mg/kg(단일 또는 2회 용량)의 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA에 대한 결과를 도시한다. 도 21B는 6 mg/kg(단일 또는 4회 용량)의 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA에 대한 결과를 도시한다. 도 21C는 3 mg/kg(단일 용량)의 비히클, hmAb-C-DUBA 또는 Ctrl-DUBA에 대한 결과를 도시한다. 도 21D는 모든 결과를 하나의 그래프에 도시한다. 이 데이터는 hmAb-C-DUBA의 제공이 치료된 동물에서 종양 용적을 유의하게 감소시켰음을 나타낸다.
실시예 8
B7-H3- ADC의 약동학
각각 한 번의 chmAb-C-DUBA(5 mg/kg)의 정맥내 용량을 받은 마우스(n=3)에서 총 IgG 또는 무손상 ADC 곡선의 로그/선형 플롯을 사용하여 상기 설명된 chmAb-C-DUBA의 약동학을 조사했다. 그 결과가 도 22에 도시된다.
각각 한 번의 hmAb-C-DUBA(1 mg/kg(1 수컷; 1 암컷), 3 mg/kg(1 수컷; 1 암컷), 10 mg/kg(1 수컷; 1 암컷) 또는 27 mg/kg(2 수컷; 2 암컷))의 정맥내 용량을 사이노몰거스 원숭이에서 총 IgG 또는 무손상 ADC 곡선의 로그/선형 플롯을 사용하여 hmAb-C-DUBA의 약동학을 조사했다. 그 결과가 도 23A(총 IgG) 및 도 23B(무손상 ADC)에 도시된다.
이들 연구에서 총 IgG는 ELISA에 의해 결정했다. 간단히, 혈청 샘플, 표준물질 및 대조군을 염소 항-인간 IgG(H+L)로 코팅된 마이크로타이터 플레이트에 포착했다. 세척 후, 플레이트를 퍼옥시다아제-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG Fc와 함께 인큐베이션했다. 세척 후, 플레이트를 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 사용하여 전개시키고 인산으로 반응을 중단시키고 405nM에서 플레이트를 판독했다. 테스트 샘플에서 총 IgG를 표준 곡선으로부터 계산했다. 또한, 무손상 ADC는 ELISA에 의해 결정했다. 간단히, 마우스 항-듀오카르마이신 mAb를 마이크로타이터 플레이트 위에 고정시켰다. 세척 후, 플레이트를 퍼옥시다아제-콘쥬게이트된 염소 항-인간 IgG Fc와 함께 인큐베이션했다. 세척 후, 플레이트를 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB) 기질을 사용하여 전개시키고 인산으로 반응을 중단시키고 405nM에서 플레이트를 판독했다. 테스트 샘플에서 무손상 ADC를 표준 곡선으로부터 계산했다.
이러한 데이터를 비교함으로써 뮤린 5 mg/kg와 사이노몰거스 원숭이 3 mg/kg 및 10 mg/kg 용량에 대한 약동학적 변수를 추론했고 표 20에 요약된다(여기서 AUC Last는 기점에서 마지막 데이터 포인트까지 곡선 아래 면적을 표시한다). 마우스에서 무손상 ADC의 노출은 설치류-특이적 카복시에스테라아제 CES1c로 인해 제한된다. 이들 데이터는 전임상 환경에서 큰 치료 지수를 나타낸다.
Figure pct00119
실시예 9
항-B7-H3 디아바디의 특성화
재지시된 세포 살해 및/또는 세포 표면 B7-H3을 발현하는 표적 세포로부터 사이토카인 방출을 매개하는 능력을 결정하기 위해 B7-H3 x CD3 이중특이적 2-쇄 및 3-쇄 디아바디를 평가한다. 재지시된 세포 살해는 세포독성 T 림프구(CTL) 분석을 사용하여 검사한다. 간단히, B7-H3 x CD3 이중특이적 디아바디(또는 B7-H3 대신 무관한 항원에 결합하는 음성 대조군 디아바디)를 이펙터 팬 T-세포 및 표적 B7-H3-발현 종양 세포와 함께 10:1의 이펙터 대 표적 세포 비로 24시간 동안 인큐베이션한다. 손상된 세포에 의한 배지로의 락테이트 탈수소효소(LDH)의 방출을 측정함으로써 세포독성(즉, 세포 살해) 퍼센트를 결정한다. 사이토카인 방출도 유사한 방식을 사용하여 검사한다. 간단히, B7-H3 x CD3 이중특이적 디아바디(또는 B7-H3-결합 부위를 결여한 음성 대조군 디아바디)를 이펙터 PBMC 세포와만 함께 또는 표적 종양 세포(예를 들어, SK-MES-1 폐 암종 세포)의 존재하에 10:1 또는 30:1의 이펙터 대 표적 세포 비로 24시간 동안 인큐베이션하고 IFNγ, TNF-α, 및 IL-10의 방출을 결정한다. 이 분석은 재지시된 세포 살해 및 사이토카인 방출을 매개하는 B7-H3 x CD3 이중특이적 디아바디의 능력을 나타낸다.
본 명세서에서 언급된 모든 공보 및 특허는 각각의 개별적인 공보 또는 특허 출원이 그 전문이 참조로 포함되는 것으로 구체적으로 및 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 참조로 본원에 포함된다. 발명이 그것의 특정 구체예들과 관련하여 기술되었지만, 추가로 변형될 수 있고 일반적으로, 발명의 원리를 따르는 본 출원이 임의의 변화, 사용 또는 개조를 다 포함하고 본 개시로부터의 그런 일탈을 발명이 속하는 기술분야 내에서 공지된 또는 관례적인 실시에 포함되는 것으로서 및 지금까지 설명된 필수적인 특징에 적용될 수 있는 것으로서 포함하는 것으로 의도된 것이 인지될 것이다.

Claims (32)

  1. 아래의 식을 포함하는 항-B7-H3 항체 약물 콘쥬게이트(B7-H3-ADC):
    Ab-(LM)m-(D)n,
    여기서:
    Ab는 인간화된 가변 중쇄(VH) 도메인 및 인간화된 가변 경쇄(VL) 도메인을 포함하는 B7-H3에 결합하는 항체이거나, 또는 그것의 B7-H3-결합 단편이고;
    D는 세포독성 약물 부분이고;
    LM은 Ab와 D를 공유 연결하는 결합 또는 링커 분자이고;
    m은 0과 n 사이의 정수로서 B7-H3-ADC의 링커 분자의 수를 나타내고;
    n은 1과 10 사이의 정수로서 B7-H3-ADC 분자에 공유 연결된 세포독성 약물 부분의 수를 표시한다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    (A) (i) 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:99의 아미노산 서열을 포함하고,
    (ii) 상기 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:104의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (B) (i) 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하고,
    (ii) 상기 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
    (C) (i) 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하고,
    (ii) 상기 인간화된 VH 도메인은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:99의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:104의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:20의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:21의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 인간화된 VL 도메인이 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열을 포함하고 상기 인간화된 VH 도메인이 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ab가 항체인 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  7. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Ab가 항체의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B7-H3-ADC가 인간 IgG의 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 인간 IgG가 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4인 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 상기 Fc 도메인이:
    (a) FcγR에 대한 변이체 FC 도메인의 친화성을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 변형; 및/또는
    (b) 변이체 Fc 도메인의 혈청 반감기를 증진시키는 하나 이상의 아미노산 변형
    을 포함하는 변이체 Fc 도메인인 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  11. 제 10 항에 있어서, FcγR에 대한 변이체 Fc 도메인의 친화성을 감소시키는 상기 변형이 L234A; L235A; 또는 L234A 및 L235A의 치환을 포함하고, 여기서 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스를 따르는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 변이체 Fc 도메인의 혈청 반감기를 증진시키는 상기 변형은 M252Y; M252Y 및 S254T; M252Y 및 T256E; M252Y, S254T 및 T256E; 또는 K288D 및 H435K의 치환을 포함하고, 여기서 상기 넘버링은 Kabat에서와 같이 EU 인덱스를 따르는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LM 중 적어도 하나가 링커 분자인 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 LM 링커 분자는 펩타이드계 링커인 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 LM 링커 분자는 절단가능한 링커인 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 분자가 아래의 식을 포함하는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC:
    Ab - [V-(W)k-(X)1-A] - D
    여기서:
    V는 상기 절단가능한 LM 링커 분자이고,
    (W)k-(X)1-A는 l,(4+2n)-제거를 통해 자기 제거하는, 신장된, 자기-제거 스페이서 시스템이고,
    W 및 X는 각각 l,(4+2n) 전자 연쇄반응 스페이서로서 동일하거나 상이하고,
    A는 식 (Y)m의 스페이서 기로서 Y가 l,(4+2n) 전자 연쇄반응 스페이서인 기, 또는 식 U의 기로서 고리화 제거 스페이서 기이고,
    k, l 및 m은 독립적으로 0(포함됨) 내지 5(포함된)의 정수이고, n은 0(포함됨) 내지 10(포함됨)의 정수이며, 단
    A가 (Y)m일 때 k+l+m ≥ 1, 및
    만일 k+l+m = 1이면 n > 1;
    A가 U일 때 k+1 ≥ 1이다.
    W, X, 및 Y는 독립적으로 아래의 식:
    Figure pct00120

    또는
    Figure pct00121

    을 가진 화합물로부터 선택된다:
    여기서:
    Q는 -R5C=CR6-, S, O, NR5, -R5C=N-, 또는 -N=CR5-이고,
    P는 NR7, O 또는 S이고,
    a, b, 및 c는 독립적으로 0(포함됨) 내지 5(포함됨)의 정수이고;
    I, F 및 G는 독립적으로 아래의 식을 가진 화합물로부터 선택되고:
    Figure pct00122

    여기서 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 및 R9는 독립적으로 H, C1-6 알킬, C3-20 헤테로사이클릴, C5-20 아릴, C1-6 알콕시, 하이드록시(OH), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(SRx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP-(=0)(ORx)2)를 표시하며, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 독립적으로 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 치환체 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, 또는 R9 중 둘 이상은 선택적으로 서로 연결되어 하나 이상의 지방족 또는 방향족 환형 구조를 형성하며;
    U는 아래의 식을 가진 화합물로부터 선택된다:
    Figure pct00123

    여기서:
    a, b 및 c는 독립적으로 0 또는 1의 정수가 되도록 선택되며; 단 a + b + c = 2 또는 3이고;
    R1 및/또는 R2는 독립적으로 H, C1-6 알킬을 표시하며, 상기 알킬은 선택적으로 다음의 군: 하이드록시(OH), 에테르(ORx), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(S-Rx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP(=0)(ORx)2) 중 하나 이상으로 치환되고, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되며,
    R3, R4, R5, R6, R7 및 R8은 독립적으로 H, C1-6 알킬, C3-20 헤테로사이클릴, C5-20 아릴, C1-6 알콕시, 하이드록시(OH), 아미노(NH2), 일치환 아미노(NRXH), 이치환 아미노(NRx 1Rx 2), 니트로(NO2), 할로겐, CF3, CN, CONH2, S02Me, CONHMe, 환형 C1-5 알킬아미노, 이미다졸일, C1-6 알킬피페라진일, 몰폴리노, 티올(SH), 티오에테르(S-Rx), 테트라졸, 카복시(COOH), 카복실레이트(COORx), 설폭시(S(=0)20H), 설포네이트(S(=0)2ORx), 설포닐(S(=0)2Rx), 설픽시(S(=0)OH), 설피네이트(S(=0)ORx), 설핀일(S(=0)Rx), 포스포노옥시(OP(=0)(OH)2) 및 포스페이트(OP(=0)(ORx)2)를 표시하며, Rx, Rx 1 및 Rx 2는 C1-6 알킬 기, C3-20 헤테로사이클릴 기 또는 C5-20 아릴 기로부터 선택되고, 치환체 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중 둘 이상은 선택적으로 서로 연결되어 하나 이상의 지방족 또는 방향족 환형 구조를 형성한다.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 LM 링커 분자가 아래의 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC:
    (1) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
    (2) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
    (3) p-암모신남일옥시카보닐;
    (4) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐;
    (5) p-아미노-벤질옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
    (6) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
    (7) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐;
    (8) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐;
    (9) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p아미노벤질옥시카보닐;
    (10) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐;
    (11) p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
    (12) p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
    (13) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
    (14) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
    (15) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)-카보닐;
    (16) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노신남일옥시카보닐(메틸아미노)에틸(메틸아미노)카보닐;
    (17) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질;
    (18) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노벤질;
    (19) p-아미노신남일;
    (20) p-아미노신남일옥시카보닐-p-아미노벤질;
    (21) p-아미노벤질옥시카보닐-p-아미노신남일;
    (22) p-아미노-신남일옥시카보닐-p-아미노신남일;
    (23) p-아미노페닐펜타디엔일;
    (24) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노신남일;
    (25) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노벤질; 또는
    (26) p-아미노페닐펜타디엔일옥시카보닐-p-아미노페닐펜타디엔일.
  18. 제 13 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LM 링커 분자는 Ab의 폴리펩타이드 사슬의 아미노산의 측쇄에 콘쥬게이트되고 상기 Ab와 상기 세포독성 약물 부분 D의 분자를 결합시키는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포독성 약물 부분 D는 사이토톡신, 방사성동위원소, 면역조정제, 사이토카인, 림포카인, 케모카인, 성장인자, 종양괴사인자, 호르몬, 호르몬 길항제, 효소, 올리고뉴클레오타이드, DNA, RNA, siRNA, RNAi, 마이크로RNA, 광활성 치료제, 항신생혈관제, 친-세포자살제, 펩타이드, 지질, 탄수화물, 킬레이트화제, 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 세포독성 약물 부분 D는 사이토톡신을 포함하고, 튜불리신, 아우리스타틴, 메이탄시노이드, 칼리키아미신, 피롤로벤조디아제핀, 및 듀오카르마이신로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 세포독성 약물 부분 D는 튜불리신 사이토톡신을 포함하고, 튜불리신 A, 튜불리신 B, 튜불리신 C, 및 튜불리신 D로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  22. 제 19 항에 있어서, 상기 세포독성 약물 부분 D는 아우리스타틴 사이토톡신을 포함하고, MMAE(N-메틸발린-발린-돌라이소로이신-돌라프로인-노르에페드린) 및 MMAF(N-메틸발린-발린-돌라이소로이신-돌라프로인-페닐알라닌)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  23. 제 19 항에 있어서, 상기 세포독성 약물 부분 D는 메이탄시노이드 사이토톡신을 포함하고, 마이탄신, DM1 및 DM4로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  24. 제 19 항에 있어서, 상기 세포독성 약물 부분 D는 칼리키아미신 사이토톡신을 포함하고, 칼리키아미신 γ1, 칼리키아미신 β1Br, 칼리키아미신 γ1Br, 칼리키아미신 α2I, 칼리키아미신 α3I, 칼리키아미신 β1I, 칼리키아미신 γ1I, 및 칼리키아미신 Δ1I로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  25. 제 19 항에 있어서, 상기 세포독성 약물 부분 D는 피롤로벤조디아제핀 사이토톡신을 포함하고, 바다스툭시맙 탈리린, SJG-136, SG2000, SG2285 및 SG2274로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  26. 제 19 항에 있어서, 상기 세포독성 약물 부분 D는 듀오카르마이신 사이토톡신을 포함하고, 듀오카르마이신 A, 듀오카르마이신 B1, 듀오카르마이신 B2, 듀오카르마이신 C1, 듀오카르마이신 C2, 듀오카르마이신 D, 듀오카르마이신 SA, CC-1065, 아도젤레신, 비젤레신, 카젤레신(U-80244) 및 스피로-듀오카르마이신(DUBA)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LM 링커 분자는 환원된 사슬간 이황화물을 통해서 상기 Ab에 공유 결합되는 것을 특징으로 하는 B7-H3-ADC.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 B7-H3-ADC의 유효량 및 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 제약학적 조성물.
  29. B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에서 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항의 B7-H3-ADC 또는 제 28 항의 제약학적 조성물의 사용.
  30. 제 29 항에 있어서, B7-H3의 발현과 관련되거나 그것을 특징으로 하는 상기 질환 또는 상태는 암인 것을 특징으로 하는 사용.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 암은 부신 종양, AIDS-관련 암, 포상 연부 육종, 성상세포 종양, 부신암, 방광암, 골암, 뇌척수암, 전이성 뇌종양, B-세포 암, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골 육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 대장암, 피부 양성 섬유성 조직구종, 결체조직 작은 원형 세포 종양, 상의세포종, 유잉 종양, 골외 점액성 연골 육종, 골성 불완전 섬유원증, 섬유성 골 이형성증, 담낭암 또는 담관암, 위암, 임신성 융모성 질환, 생식세포종, 두경부암, 교모세포종, 악성 혈액암, 간세포 암종, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암, 백혈병(예를 들어, 급성 골수성 백혈병), 지방육종/악성 지방종성 종양, 간암, 림프종, 폐암(예를 들어, 비소세포 폐암(NSCLC)), 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 중피종 인두암, 다발성 내분비종양증, 다발성 골수종, 골수 이형성 증후군, 신경아세포종, 신경 내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경집 종양, 크롬 친화성 세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 전이성 신장암, 간상소체 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 소아의 소 원형 청색 세포 종양(신경아세포종 및 횡문근육종 포함), 연부 조직 육종, 편평세포암(예를 들어, 두경부의 편평세포암(SCCHN), 위암, 활막육종, 고환암, 흉선암, 흉선종, 갑상선암(예를 들어, 전이성 갑상선암) 및 자궁암의 세포로 구성되는 군으로부터 선택된 암세포의 존재를 특징으로 하는 것임을 특징으로 하는 사용.
  32. 제 30 항에 있어서, 상기 암은 암의 존재를 특징으로 하며, 상기 암은 부신암, 방광암, 유방암, 대장암, 위암, 교모세포종, 신장암, 비소세포 폐암(NSCLC), 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 모양 세포 백혈병, 버킷 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 변연부 림프종, 중피종 인두암, 비-호지킨 림프종, 소 림프구성 림프종, 다발성 골수종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 신장 세포 암종, 소아의 소 원형 청색 세포 종양(신경아세포종 및 횡문근육종 포함), 편평세포암(예를 들어, 두경부의 편평세포암(SCCHN), 고환암, 갑상선암(예를 들어, 전이성 갑상선암) 및 자궁암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 사용.
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