KR20180110180A - 인간 배아 줄기 세포의 분화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 만능 줄기 세포의 인슐린 생성 세포로의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단의 생성 방법을 제공하며, 여기서, 집단 내의 50% 초과의 세포가 PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현한다.
Description
관련 출원과의 상호 참조
본 출원은 모든 목적을 위하여 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 가특허 출원 제61/333,831호(출원일: 2010년 5월 12일)의 이익을 주장한다.
본 발명은 인슐린 생성 세포로의 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단의 생성 방법을 제공하며, 여기서, 집단 내의 50% 초과의 세포가 PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현한다.
제I형 진성 당뇨병 및 이식가능한 랑게르한스섬의 부족에 대한 세포-대체 치료법에서의 진전에서는 생착(engraftment)에 적절한 인슐린-생성 세포, 또는 β 세포의 공급원을 개발하는 데 관심이 집중되었다. 한 가지 접근법은 예를 들어 배아 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포로부터의 기능성 β 세포의 생성이다.
척추동물 배아 발생에서, 만능 세포는 낭배형성(gastrulation)으로 알려진 과정에서 삼배엽층(외배엽, 중배엽, 및 내배엽)을 포함하는 세포군을 생성한다. 예를 들어, 갑상선, 흉선, 췌장, 소화관, 및 간과 같은 조직은 중간 단계를 통해 내배엽으로부터 발생할 것이다. 이 과정에서 중간 단계는 완성 내배엽(definitive endoderm)의 형성이다. 완성 내배엽 세포는 다수의 마커, 예컨대 HNF3 베타, GATA4, MIXL1, CXCR4 및 SOX 17을 발현한다.
췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, PDX1을 발현한다. PDX1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, PDX1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.
췌도 세포의 특징을 지닌 세포가 마우스의 배아 세포로부터 유도된 것으로 보고되었다. 예를 들어, 루멜스키(Lumelsky) 등(문헌[Science 292:1389, 2001])은 마우스 배아 줄기 세포가 췌도와 유사한 인슐린 분비 구조로 분화한 것을 보고하였다. 소리아(Soria) 등(문헌[Diabetes 49:157, 2000])은 마우스 배아 줄기 세포로부터 유도된 인슐린-분비 세포가 스트렙토조토신-유도 당뇨 마우스에서 혈당을 정상화시킴을 보고하였다.
일 예에서, 호리(Hori) 등(문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 마우스 배아 줄기 세포를 포스포이노시티드 3-키나제의 억제제(LY294002)로 처리하여, β 세포와 유사한 세포가 생성되었음을 개시하였다.
다른 예에서는, 블리츠주크(Blyszczuk) 등(문헌[PNAS 100:998, 2003])은 Pax4를 구성적으로 발현하는 마우스 배아 줄기 세포로부터 인슐린-생성 세포를 생성하는 것을 보고하였다.
미칼레프(Micallef) 등은 PDX1 양성 췌장 내배엽이 형성되게 하는 배아 줄기 세포의 계통 결정(commitment)을 레틴산이 조절할 수 있음을 보고하였다. 레틴산은 배아에서 낭배형성의 마지막에 해당하는 기간 동안 배아 줄기 세포 분화의 4일째에 배양물에 첨가될 때 Pdx1 발현을 유도하는 데 가장 효과적이다(문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
미야자키(Miyazaki) 등은 Pdx1을 과다 발현하는 마우스 배아 줄기 세포주를 보고하였다. 그들의 결과는 외인성 Pdx1 발현이 생성된 분화된 세포에서 인슐린, 소마토스타틴, 글루코키나제, 뉴로제닌3, p48, Pax6, 및 Hnf6 유전자의 발현을 명확히 향상시켰음을 보여준다(문헌[Diabetes 53: 1030, 2004]).
스쿠디(Skoudy) 등은 액티빈(activin) A(TGF-β 슈퍼패밀리의 구성원)가 마우스 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자(p48 및 아밀라아제) 및 내분비 유전자(Pdx1, 인슐린, 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고하였다. 최대 효과는 1nM 액티빈 A를 사용하여 관찰되었다. 그들은 또한 인슐린 및 Pdx1 mRNA의 발현 수준이 레틴산에 의해 영향을 받지 않지만; 3 nM FGF7 처리가 Pdx1의 전사체의 수준을 증가시킴을 관찰하였다(문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키(Shiraki) 등은 배아 줄기 세포의 PDX1 양성 세포로의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자들의 효과를 연구하였다. 이들은 TGF-β2가 재현가능하게 더 높은 비율의 PDX1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다(문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16]).
고든(Gordon) 등은 Wnt 신호전달 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에 그리고 혈청의 부재 하에, 마우스 배아 줄기 세포로부터 브라키어리(brachyury) [양성]/HNF3 베타 [양성] 내배엽 세포의 유도를 보여주었다(미국 특허 출원 공개 제2006/0003446A1호).
고든 등(문헌[PNAS, Vol 103, page 16806, 2006])은 "Wnt 및 TGF-베타/노달(nodal)/액티빈 신호전달은 전방 원시선(anterior primitive streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술하였다.
그러나, 배아 줄기 세포 발생의 마우스 모델은 예를 들어, 인간과 같은 고등 포유류에서의 발생 프로그램을 정확하게 모방하지 않을 수 있다.
톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다(문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 배(hEG) 세포주를 유도하였다(문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(LIF)와 함께 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 마우스 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건 하에서 유지되어야 한다(미국 특허 제6,200,806호; 국제 특허 공개 제WO 99/20741호; 제WO 01/06855호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다(문헌[Nature Biotechnology 2005]). 마우스의 신장 피막하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로의 분화가 야기되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 PDX1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다(미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호).
드'아무르 등(문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기(hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 방법을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내(in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다"고 밝혔다.
또 다른 예에서, 프리스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌장 도세포를 생성하는 시스템을 보고하였다(미국 출원 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에, 분화 경로를 세 단계로 나누었다. 인간 배아 줄기 세포를 먼저 부티르산나트륨 및 액티빈 A의 조합을 사용하여 내배엽으로 분화시켰다. 그 다음, 세포를 EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 TGF-β 길항제, 예컨대 노긴(Noggin)과 함께 배양하여, PDX1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
일 예에서, 벤베니스트리(Benvenistry) 등은 "우리는 PDX1의 과발현이 췌장 풍부 유전자의 발현을 향상시켰고, 인슐린 발현의 유도는 단지 생체 내에서 존재하는 추가의 신호를 필요로 할 수 있는 것으로 결론짓는다"고 언급하였다(문헌[Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930]).
다른 예에서, 그래핀-보튼(Grapin-Botton) 등은 "Ngn3의 조기 활성화는 췌장 전구 세포의 푸울(pool)을 고갈시키면서 글루카곤+ 세포를 거의 배타적으로 유도하였다. El 1.5에서와 같이, PDX-1 전구 세포는 인슐린 [양성] 및 PP [양성] 세포로의 분화에 대하여 적격성으로 되었다"라고 언급하였다(문헌[Johansson KA et al, Developmental Cell 12, 457 - 465, March 2007]).
예를 들어, 디에즈(Diez) 등은 "9 및 10주에, 대부분의 글루카곤 양성 세포는 인슐린을 공동-발현하였지만, 별개의 오직-인슐린 발현 세포가 이들 단계에서 명백하게 검출가능하였다. 인슐린 및 글루카곤을 공동-발현하는 세포를 전체 연구 기간(9 내지 21주) 동안 관찰하였으나, 이들은 단지 적은 분획의 전체 인슐린 및 글루카곤 발현 세포만을 나타내었다"라고 언급하였다(문헌[J Histochem Cytochem. 2009 Sep;57(9):811-24. 2009 Apr 13]).
일 예에서, 첸(Chen) 등은 "(-) -인돌락탐 V [(ILV)]가 단백질 키나제 C 신호전달을 활성화하며, 이미 내배엽 계통으로 수임된 hESC의 췌장 지정을 지시한다...ILV 및 레틴산은 관련 메카니즘을 통해 기능한다...ILV는 레틴산보다 더 강한 PDX-1 발현 세포(PDX-1을 발현하는 세포의 백분율)의 유도를 보여준다"고 진술하였다(문헌[Nature Chemical Biology 5, 195-196 (April 2009) doi:10.1038/nchembio0409-195]).
라이틀(Lyttle) 등은 "NKX6-1은 인슐린 세포와 함께 공동-국소화되며, NKX6-1은 인간 베타 세포 발생에 배타적으로 수반되는 것을 나타낸다"(문헌[Diabetologia 2008 Jul: 51(7):1169-80, 2008])고 진술하였다.
따라서, β 세포와 더욱 밀접하게 유사한 작용성 인슐린 발현 세포를 생성하기 위한 시험관 내 방법을 개발하는 것이 여전히 상당히 필요하다. 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성함으로써, 인간 배아 줄기 세포를 인슐린 발현 세포를 향해 분화시키는 효율을 향상시키는 대안적인 접근법을 취하며, 여기서, 집단 중의 50% 초과의 세포는 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 집단 중의 50% 초과의 세포가 PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현한다.
일 실시형태에서, 본 발명은 만능 줄기 세포의 집단을 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 방법을 제공하며, 이는 하기의 단계를 포함한다:
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계, 및
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 단백질 키나제 C 활성화제가 보충된 배지로 처리함으로써, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단 중의 50% 초과의 세포는 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다.
<도 1a 및 1b>
도 1a 및 1b는 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 4, 4일의 PDX1, NKX6.1 및 ISL-1의 발현을 보여준다. 도 1a는 PDX1 및 NKX6.1의 발현을 보여준다. 도 1b는 NKX6.1 및 ISL-1의 발현을 보여준다.
<도 2a 및 2b>
도 2a 및 2b는 아이엔 셀 어널라이저 1000(IN Cell Analyzer 1000)을 통해 분석되는 PDX1, NKX6.1 및 CDX2를 발현하는 세포의 백분율에서의 PKC 활성화제 처리의 효과(도 2a) 및 아이엔 셀 어널라이저를 통한 PDX1 및 NKX6.1을 발현하는 세포의 백분율에서의 그들의 효과 및 다양한 PKC 활성화제의 비교(도 2b)를 보여준다.
<도 3a, 3b 및 3c>
도 3a, 3b 및 3c는 피하 이식된 테라사이트(Theracyte) 장치(도 3b) 내에, 신장 피막(도 3a) 하에 본 발명의 세포가 제공되는 SCID-베이지 마우스에서의 순환하는 C-펩티드를 보여준다. C-펩티드 수준은 지정된 시점에서 검출되었다. 도 3c는 이식 12주 후에 테라사이트 장치에서 피하로 세포를 제공한 그룹과 신장 피막 하에서 세포를 제공한 그룹 사이에 관찰되는 C-펩티드 수준의 비교를 보여준다.
<도 4a, 4b, 4c 및 4d>
도 4a, 4b, 4c 및 4d는 실시예 3에 기재된 방법에 따라 처리된 세포에서의 PDX1, NKX6.1, NGN3 및 PTF1 알파 발현 상의 PKC 활성화제 처리의 효과를 보여준다.
<도 5a, 5b, 5c 및 5d>
도 5a, 5b, 5c 및 5d는 실시예 4에 기재된 방법에 따라 처리된 세포에서의 NKX6.1, PDX1, PTF1 알파 및 CDX2의 발현 상의 FGF7의 효과를 보여준다.
도 1a 및 1b는 실시예 1에 약술된 분화 프로토콜의 단계 4, 4일의 PDX1, NKX6.1 및 ISL-1의 발현을 보여준다. 도 1a는 PDX1 및 NKX6.1의 발현을 보여준다. 도 1b는 NKX6.1 및 ISL-1의 발현을 보여준다.
<도 2a 및 2b>
도 2a 및 2b는 아이엔 셀 어널라이저 1000(IN Cell Analyzer 1000)을 통해 분석되는 PDX1, NKX6.1 및 CDX2를 발현하는 세포의 백분율에서의 PKC 활성화제 처리의 효과(도 2a) 및 아이엔 셀 어널라이저를 통한 PDX1 및 NKX6.1을 발현하는 세포의 백분율에서의 그들의 효과 및 다양한 PKC 활성화제의 비교(도 2b)를 보여준다.
<도 3a, 3b 및 3c>
도 3a, 3b 및 3c는 피하 이식된 테라사이트(Theracyte) 장치(도 3b) 내에, 신장 피막(도 3a) 하에 본 발명의 세포가 제공되는 SCID-베이지 마우스에서의 순환하는 C-펩티드를 보여준다. C-펩티드 수준은 지정된 시점에서 검출되었다. 도 3c는 이식 12주 후에 테라사이트 장치에서 피하로 세포를 제공한 그룹과 신장 피막 하에서 세포를 제공한 그룹 사이에 관찰되는 C-펩티드 수준의 비교를 보여준다.
<도 4a, 4b, 4c 및 4d>
도 4a, 4b, 4c 및 4d는 실시예 3에 기재된 방법에 따라 처리된 세포에서의 PDX1, NKX6.1, NGN3 및 PTF1 알파 발현 상의 PKC 활성화제 처리의 효과를 보여준다.
<도 5a, 5b, 5c 및 5d>
도 5a, 5b, 5c 및 5d는 실시예 4에 기재된 방법에 따라 처리된 세포에서의 NKX6.1, PDX1, PTF1 알파 및 CDX2의 발현 상의 FGF7의 효과를 보여준다.
개시내용을 분명하게 하고 제한되지 않기 위해, 본 발명의 상세한 설명은 본 발명의 특정 특징, 실시형태 또는 출원을 기술 또는 예시하는 하기 부문으로 구분된다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 수준에서 자가 재생하고 분화하여 자가 재생 전구 세포, 비재생 전구 세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cell)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서 분화하는 그들의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직을 발생시키며, 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그들의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 능력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배자외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위집단이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위집단이 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 전구세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능 줄기 세포보다 더 제한된 하위집단의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 통상적인 환경하에서 특정 세포형 또는 세포형의 하위집단으로 계속 분화할 것이며, 통상적인 환경하에서 다른 세포형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화(De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통 특이적 마커는 대상 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결된 세포가 대상 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포", 또는 "1기 세포" 또는 "1기"는 하기 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질(Mix-like homeobox protein), FGF4 CD48, 에오메소더민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포를 말한다: PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 또는 PROX1. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포, 원시 장관(primitive gut tube) 세포, 및 후방 전장(posterior foregut) 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "완성 내배엽"은 낭배형성 동안 외배반(epiblast)으로부터 발생된 세포의 특징을 갖고 위장관로 및 그의 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: HNF 3 베타, GATA4, SOX 17, 세르베루스(Cerberus), OTX2, 구스코이드(goosecoid), C-Kit, CD99 및 MIXL 1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "마커"는 대상 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 대상 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 대상 세포가 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 확인되어 구별될 수 있게 한다.
본 명세서에서 사용되는 "췌장 내분비 세포", 또는 "췌장 호르몬 발현 세포", 또는 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기의 호르몬 중 하나 이상을 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
만능
줄기 세포의
분리, 증식 및 배양
만능
줄기 세포의
특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다(문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra1-60, 및 Tra1-81 발현(존재하는 경우)의 소실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼리성 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사(미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드를 이용하여 발색시킴으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 RT-PCR에 의해 검출할 때, OCT4 및 TERT를 발현한다.
증식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 마우스 내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배양체(embryoid body)를 형성하고, 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정될 수 있다.
증식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능
줄기 세포의
공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 임신 후 형성된 조직으로부터 유도되는 구축된 만능 세포주를 포함하고, 이러한 조직에는 전-배아 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 전형적으로 본질적으로는 대략 10 내지 12주의 임신 전이 아닌 임신 동안의 임의의 때에 취해진 태아 조직이 포함된다. 비제한적인 예로는 수립된 인간 배아 줄기 세포주 또는 인간 배아 생식 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9(WiCell)가 있다. 이러한 세포의 초기 수립 또는 안정화 시에 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능 세포일 것이다. 피더 세포(feeder cell)의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포도 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BGOlv(미국 조지아주 아텐스 소재의 브레사젠(BresaGen))도 또한 적합하다.
일 실시형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨 등(미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998]; 문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995])에 개시된 바와 같이 제조된다.
만능
줄기 세포의
배양
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 피더 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 피더 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 피더 세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형과 함께 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 피더 세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Reubinoff et al (Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000))]에 기재된 방법에 따라 마우스 배아 섬유아세포 피더 세포층 상에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Thompson et al (Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147)]에 개시된 방법에 따라 마우스 배아 섬유아세포 피더 세포층 상에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003)]에 개시된 피더 세포층 중 임의의 것 상에서 배양할 수 있다.
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Wang et al (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005)]에 개시된 방법에 따라 인간 피더 세포층 상에서 배양할 수 있다. 대안적인 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Stojkovic et al (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005)]에 개시된 인간 피더 세포층 상에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Miyamoto et al (Stem Cells 22: 433-440, 2004)]에 개시된 인간 피더 세포층 상에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Amit et al (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003)]에 개시된 인간 피더 세포층 상에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Inzunza et al (Stem Cells 23: 544-549, 2005)]에 개시된 인간 피더 세포층 상에서 배양할 수 있다.
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제US20020072117호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 제US6642048호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제 특허 공개 제W02005014799호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Xu et al (Stem Cells 22: 972-980, 2004)]에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제US20070010011호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제US20050233446호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 제US6800480호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제 특허 공개 제W02005065354호에 개시된 방법에 따라 유래된 배양 배지에서 배양할 수 있다.
일 실시형태에서, 만능 줄기 세포는 문헌[Cheon et al (BioReprod DOI: 10.1095/biolreprod. 105.046870, October 19, 2005)]에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 문헌[Levenstein et al (Stem Cells 24: 568-574, 2006)]에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제US20050148070호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 미국 특허 공개 제US20050244962호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 국제 특허 공개 제W02005086845호에 개시된 방법에 따라 배양할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막으로부터 유래된 것들, 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시형태에서, 적절한 배양 기재는 매트리겔(Matrigel)(등록상표) (벡턴 디킨슨(Becton Dickenson))이다. 매트리겔(등록상표)은 실온에서 겔화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 증식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재 하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특징은 씨딩 분포에 세심한 주의를 기울여 이익을 얻으며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기의 성분, 예컨대 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), 집코(Gibco) 번호 11965-092; 낙아웃 둘베코 변형 이글 배지(KO DMEM), 집코 번호 10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 집코 번호 15039-027; 비필수 아미노산 용액, 집코 11140-050; β-머캅토에탄올, 시그마(Sigma) 번호 M7522; 인간 재조합 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 집코 번호 13256- 029로부터 제조할 수 있다.
만능
줄기 세포로부터의
췌장 내배엽 계통의 특징적인
마커를
발현하는 세포의 형성
일 실시형태에서, 본 발명은 만능 줄기 세포로부터 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공하며, 이는
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계, 및
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 단백질 키나제 C 활성화제가 보충된 배지로 처리함으로써, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 태양에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 50% 초과의 집단은 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다. 대안적인 실시형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 60% 초과의 집단은 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다. 대안적인 실시형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 70% 초과의 집단은 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다. 대안적인 실시형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 80% 초과의 집단은 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다. 대안적인 실시형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 90% 초과의 집단은 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 추가로 처리되어 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 형성할 수 있다.
분화 효율은 원하는 세포 유형의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시킴으로써 결정할 수 있다.
배양되거나 분리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계에서의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 노던 블롯, 인 시츄(in situ) 혼성화(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역검정법, 예를 들어, 단면 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅 및 온전한 세포에서 접근가능한 마커의 경우 유세포분석(FACS)(예를 들어 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
만능 줄기 세포의 특징은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 만능 줄기 세포의 추가의 특징은 계속 확인되고 있다. 만능 줄기 세포 마커는 예를 들어, ABCG2, CRIPTO, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTFI, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81 중 하나 이상의 발현을 포함한다.
만능 줄기 세포를 본 발명의 방법으로 처리한 후, 분화된 세포는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포에 의해 발현된 CXCR4와 같은 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 처리 세포 집단을 노출시켜 정제할 수 있다.
본 발명에 사용하기에 적절한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9(NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1(NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7(NIH 코드: WA07) 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002(스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 또한, 만능 세포의 특징적인 하기의 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적절하다: ABCG2, CRIPTO, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTFI, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 및 Tra 1-81.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질, FGF4, CD48, 에오메소더민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다.
대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 대안적인 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN3, NEUROD, NKX2.2, PDX1, NKX6.1, PAX4 및 PAX6으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 하나 이상을 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커 중 하나 이상을 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 PDX1 및 하기 전사 인자 중 하나 이상을 발현한다: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 베타, MAFA, PAX4 및 PAX6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
완성 내배엽 계통의 특징적인
마커를
발현하는 세포로의 만능
줄기 세포의
분화
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성은 특정 프로토콜을 이행하기 전후에 마커의 존재에 대해 시험함으로써 결정될 수 있다. 만능 줄기 세포는 전형적으로 그러한 마커를 발현하지 않는다. 따라서, 만능 세포의 분화는 세포가 그들을 발현하기 시작할 때 검출된다.
만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662(2004)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25 , 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,889호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,900호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제 61/076,908호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 미국 특허 출원 제61/076,915호에 개시된 방법에 따라 만능 줄기 세포를 처리함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인
마커를
발현하는 세포의 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화
일 실시형태에서, 본 발명은 만능 줄기 세포로부터 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성하는 방법을 제공하며, 이는
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계, 및
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 단백질 키나제 C 활성화제가 보충된 배지로 처리함으로써, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 태양에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 50% 초과의 집단은 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다. 대안적인 실시형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 60% 초과의 집단은 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다. 대안적인 실시형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 70% 초과의 집단은 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다. 대안적인 실시형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 80% 초과의 집단은 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다. 대안적인 실시형태에서, 본 발명은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 제공하며, 여기서, 90% 초과의 집단은 PDX-1 및 NKX6.1을 공동-발현한다.
일 실시형태에서, 단백질 키나제 C 활성화제는 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노)벤졸락탐, 인돌락탐 V(ILV), 포르볼(phorbol)-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA) 및 포르볼-12,13-다이부티레이트(PDBu)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시형태에서, 단백질 키나제 C 활성화제는 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노)벤졸락탐이다. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노)벤졸락탐은 약 20nM 내지 약 500nM의 농도로 사용될 수 있다. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노)벤졸락탐은 본 명세서에서 "TPB"로 지칭된다.
일 실시형태에서, 단백질 키나제 C 활성화제가 보충된 배지에는 BMP를 억제할 수 있는 인자, TGFβ 수용체 신호전달 억제제 및 섬유아세포 성장 인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인자가 추가로 보충된다.
일 실시형태에서, BMP를 억제할 수 있는 인자는 노긴이다. 노긴은 약 50ng/㎖ 내지 약 500 ng/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 노긴은 100 ng/㎖의 농도로 사용된다.
일 실시형태에서, TGFβ 수용체 신호전달 억제제는 ALK5의 억제제이다. 일 실시형태에서, ALK5의 억제제는 ALK5 억제제 II이다. ALK5 억제제 II는 약 0.1 μΜ 내지 약 10 μΜ의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, ALK5 억제제 II는 1 μΜ의 농도로 사용된다.
일 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 FGF7이다. 대안적 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 FGF10이다.
일 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 약 50pg/㎖ 내지 약 50㎍/㎖의 농도로 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 섬유아세포 성장 인자는 50ng/㎖의 농도로 사용된다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인
마커를
발현하는 세포의 췌장 내분비 계통의 마커를 발현하는 세포로의 분화
일 실시형태에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 당업계의 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/736,908호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제11/779,311호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제60/953,178호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제60/990,529호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단은 미국 특허 출원 제61/289,671호에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 처리함으로써 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 추가로 분화될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예
실시예
1
본 발명의 세포 집단의 형성
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔(등록상표)(1:30 희석)(비디 바이오사이언스즈(BD Biosciences); 카달로그 번호 356231)-코팅된 접시에서 RPMI 배지(인비트로겐(Invitrogen); 카달로그 번호: 22400) + 0.2% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A(페프로테크(PeproTech); 카달로그 번호 120-14) + 20 ng/㎖ WNT-3a(알앤디 시스템즈(R&D Systems); 카달로그 번호 1324-WN/CF)를 사용하여 1일 동안 배양하고, 이어서, 추가 2일 동안 0.5% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A가 보충된 RPMI 배지(단계 1)에 이어서,
a. 3일 동안 DMEM/F12 + 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7(단계 2)에 이어서,
b. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27+ 0.25 μΜ 사이클로파민- KAAD + 2 μΜ 레틴산(RA) + 100 ng/㎖의 노긴(단계 3)에 이어서,
c. 처리 1: 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27(단계 4-기본 배지-BM), 또는
d. 처리 2: 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μΜ ALK5 억제제 II(단계 4), 또는
e. 처리 3: 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μΜ ALK5 억제제 II + 20nM 포르볼-12,13-다이부티레이트(PDBu)(칼바이오켐(Calbiochem), 카달로그 번호 524390)(단계 4) 중 어느 하나로 처리하였다.
배양물을 단계 4, 4일에 2벌로 샘플링하고, 이미지화를 아이엔 셀 어널라이저 1000(지이 헬쓰케어(GE Healthcare))을 사용하여 수행하였다. 웰 당 100개 필드의 이미지를 수득하여, 생물검정 및 후속의 염색 과정 동안의 임의의 세포 소실에 대해 보상하였다. 총 세포 개수, 전체 PDX1 발현 세포, 전체 NKX6.1 발현 세포 및 전체 CDX-2 발현 세포에 대한 측정치를 아이엔 셀 디벨로퍼 툴박스(IN Cell Developer Toolbox) 1.7(지이 헬스케어) 소프트웨어를 사용하여 각 웰로부터 수득하였다. 각각의 복제 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 PDX 1, NKX6.1 및 CDX-2 발현 세포를 전체 세포 집단의 백분율로 기록하였다.
도 2a에 나타낸 바와 같이, 단계 4, 4일의 마지막에 모든 실험 집단에서, 집단 내의 대략 92% ± 4%의 세포가 PDX 1을 발현하였다. 그러나, PDBu(단백질 키나제 C 활성화제)로의 처리가 기본 배지(처리 1) 또는 ALK5 억제제 II + 노긴(처리 2) 중 어느 하나로 처리한 세포의 집단에 비하여, PDX1 발현 집단(도 2a)에서 NKX6.1 발현 세포의 백분율의 유의미한 증가를 야기하였다. PDBu 처리 그룹에서, 전체 집단의 88% ± 4.2%가 NKX6.1을 발현한 한편, 처리 2를 제공한 세포의 62% ± 8%가 NKX6.1을 발현하였으며, 처리 1을 제공한 세포의 46.7 ± 0.2%가 NKX6.1을 발현하였다. 단계 4에서 대부분의 NKX6.1-발현 세포는 PDX1도 또한 발현하였다. 이들 관찰은 주어진 세포 집단으로부터 수득된 PDX1 발현 및 NKX6.1 발현의 이미지를 중첩시킴으로써 확인하였다(도 1a). 이들 데이터는 세포의 단백질 키나제 C 활성화제가 보충된 배지로의 처리가 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단에서 PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하는 세포의 백분율을 증가시키는 것을 나타내었다.
처리 1을 제공한 세포 집단에서, 10%의 세포가 CDX2(장의 마커)를 발현하였다(도 2a). 처리 2 또는 3 중 어느 하나를 제공한 세포의 집단에서 5% 미만의 세포가 CDX2를 발현하였다. 임의의 경우에, 대부분의 CDX2 발현 세포는 PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하지 않았다.
또한, 단계 3 세포의 병행 집단을 상기 처리 3에서 PDBu에 대하여 치환된 하기의 단백질 키나제 C 활성화제 - 20 nM의 농도의 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트(PMA)(칼바이오켐 번호 524400)로, 또는 50 nM의 농도의 [(2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에노일아미노)벤졸락탐](TPB)(칼바이오켐 번호 565740)로 처리하였다. 단계 4, 4일의 마지막에,
PMA로 처리한 세포 집단의 91% 및 TPB로 처리한 세포 집단의 90%는 NKX6.1을 발현하였다. 전체 PDX1 발현 세포에서 모든 처리 중에 유의미한 차이가 관찰되지 않았다. 도 2b를 참조한다.
본 실시예는 단백질 키나제 C 활성화제를 상대적으로 낮은 농도로 사용하여, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단 내에서 NKX6.1 발현의 상향 조절을 용이하게 하며, PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하는 세포의 백분율을 증가시킬 수 있음을 나타내었다.
실시예 2
중증 복합형 면역결핍증(
SCID
) 베이지(
Bg
) 마우스 내로의 본 발명의 세포의 이식
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 1일 동안 RPMI 배지 + 0.2% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A + 20 ng/㎖ WNT-3a가 있는 매트리겔(등록상표)(1:30의 희석) 코팅된 접시 상에서 배양하고, 이어서, 추가 2일간 RPMI 배지 + 0.5% FBS + 100 ng/㎖의 액티빈 A(단계 1)에 이어서,
a. 3일 동안 DMEM/F12+ 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7(단계 2)에 이어서,
b. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27+ 0.25 μΜ 사이클로파민- KAAD + 2 μΜ 레틴산(RA) + 100 ng/㎖의 노긴(단계 3)에 이어서,
c. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μΜ ALK5 억제제 II + 50nM TPB(단계 4)로 처리하였다.
5 내지 6주령 수컷 scid-베이지 마우스(C.B-Igh-Ib/GbimTzc-Prkdcscid-Lystbg N7)를 타코닉 팜즈(Taconic Farms)로부터 구입하였다. 마우스는 마이크로단리(microisolator) 케이지에 가두고 멸균된 먹이와 물을 마음대로 먹게 하였다. 수술 준비에서, 마우스를 귀 태깅에 의해 식별하고, 그의 체중을 측정하고, 그의 혈당을 휴대용 혈당측정기(원터치(One Touch), 라이프스캔)로 측정하였다.
아이솔플루란 및 산소의 혼합물을 사용해 마우스를 마취시키고 수술 부위를 작은 동물 클리퍼를 사용해 면도하였다. 수술 전에 마우스에 0.1 ㎎.㎏ 부프레넥스(Buprenex)를 피하 투여하였다. 70% 아이소프로필 알코올 및 10% 포비돈-요오다이드의 연속 세척에 의해 수술 부위를 준비하였다.
4 단계의 마지막의 세포를 1 ㎖ 유리 피펫을 사용하여 기계적으로 스코어링하고, 후속적으로 하룻밤 배양을 위하여 비-부착성 플레이트로 옮겼다. 마우스의 수술전 준비 동안에, 세포는 1.5 ㎖ 마이크로퓨즈 튜브에서 원심분리하고, 대부분의 상청액을 제거하여, 세포의 펠렛을 수집하기에 겨우 충분한 것을 남겨 두었다. 세포는 라이닌 포스-D(Rainin Pos-D) 용적형 피펫(positive displacement pipette) 내로 수집하고, 피펫은 세포가 중력에 의해 침강되도록 거꾸로 하였다. 여분의 배지를 디스펜스하여(dispensed) 이식용의 패킹된(packed) 세포 제제가 남게 하였다.
이식을 위하여, 24G x 1.9 ㎝(3/4") 정맥내 카테터를 사용하여 신장 피막을 침투시키고, 니들(needle)을 제거하였다. 다음, 카테터를 신장 피막 밑에서 신장의 원위부 극(distal pole)으로 두었다. 포스-D 피펫 팁을 카테터의 허브에 단단하게 놔두었고, 500만개의 세포를 신장 피막 아래에서 카테터를 통하여 피펫으로부터 디스펜스하여 신장의 원위부 극에 전달하였다. 신장 피막을 저온 소작에 의해 밀봉하고, 신장을 그의 원래의 해부학적 위치에 되돌려 놓았다. 이와 병행하여, 500만개의 세포를 포함하는 세포 응집체를 포스트-D 피펫 팁을 이용하여 50 ㎕ 장치 내로 로딩하였다. 50 ㎕ 장치를 테라사이트, 인코포레이티드(TheraCyte, Inc)(미국 캘리포니아주 어바인)로부터 구매하였다. 상기 장치는 로딩 후 의료용 접착제 실리콘 타입 A(다우 코닝(Dow Corning), 카탈로그 번호 129109)로 밀봉하고, SICD/Bg 마우스(동물 3번 및 4번) 내로 피하 이식하였다. 근육을 5-0 바이크릴을 사용하여 연속 봉합사로 닫고, 피부를 창상용 클립을 사용하여 닫았다. 수술 후에 1.0 ㎎.㎏ 메타캄을 마우스에 피하 투여하였다. 마우스에서 마취를 없애고, 마우스를 완전히 회복시켰다.
이식 후, 마우스를 1주 당 1회 칭량하고, 혈당을 1주에 2회 측정하였다. 이식 후 다양한 간격에서 3g/㎏ 글루코스를 마우스에 복강내 투약하고, 소량의 헤파린이 든 마이크로퓨즈 튜브에 후안구동을 통해 글루코스를 주사한 지 60분째에 혈액을 빼내었다. 혈액을 원심분리하고, 혈장을 제2 마이크로퓨즈 튜브 내에 넣고, 드라이아이스에서 냉동시키고, 이어서 인간 c-펩티드 분석을 수행할 때까지 -80℃에서 보관하였다. 제조업자의 지시에 따라 메르코디아/알프코 다이아그노스틱스(Mercodia/ALPCO Diagnotics) 초민감 C-펩티드 ELISA(카탈로그 번호 80-CPTHU-E01, 알프코 다이아그노스틱스(Alpco Diagnostics), 미국 뉴햄프셔주)를 사용하여 인간 c-펩티드 수준을 결정하였다.
신장 피막 그룹 및 이식 후에 테라사이트 장치를 제공한 그룹 둘 모두에서 4 내지 6주 만큼 조기에 동물 혈청에서 인간 C-펩티드가 검출되었으며, 시간이 지남에 따라 증가하였다(도 3a 및 3b). 3개월의 마지막에, 본 발명자들은 신장 피막 및 테라사이트 장치를 이식한 그룹 둘 모두에서, 100% 동물 내의 글루코스 투여에 대한 반응으로 상당한 양의 순환하는 인간 C-펩티드를 검출할 수 있었다. 신장 피막 그룹에서 인간 C-펩티드의 글루코스 자극된 혈청 수준은 3개월 후에 1.7± 0.5 ng/㎖이었으며(n=4), 테라사이트 장치 이식을 제공한 마우스에서 인간 C-펩티드는 1± 0.5 ng/㎖(n=2)(도 3c)이었다.
본 실시예는 단백질 키나제 C 활성화제에 의해 생성되는 PDX1 및 NKX6.1 공동-발현 세포 집단이 생체 내에서 인슐린-분비 세포로 추가로 분화되는 능력을 갖는 것을 나타내었다. 인슐린-분비 세포로의 추가의 분화능은 국소 환경에 의해 좌우되지 않는다. 본 발명자들은 PDX1 및 NKX6.1 공동-발현 세포가 신장 피막 및 피하 부위의 면역보호 장치 내에서 인슐린-분비 세포로 추가로 분화될 수 있음을 증명하였다.
실시예 3
본 발명의 세포 집단의 형성을 위한 대안적인 방법
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 1일 동안 매트리겔(등록상표)
(1:30 희석)(비디 바이오사이언스즈; 카달로그 번호 356231)-코딩된 접시에서 RPMI 배지(인비트로겐; 카달로그 번호: 22400) + 0.2% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A(페프로테크(PeproTech); 카달로그 번호 120-14) + 20 ng/㎖ WNT-3a(알앤디 시스템즈; 카달로그 번호 1324-WN/CF)를 사용하여 배양하고, 이어서, 추가 2일 동안 0.5% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A가 보충된 RPMI 배지(단계 1)에 이어서,
a. 3일 동안 DMEM/F12 + 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7(단계 2)에 이어서,
b. 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27+ 0.25 μΜ 사이클로파민- KAAD + 2 μΜ 레틴산(RA) + 100 ng/㎖의 노긴(단계 3)에 이어서,
c. 처리 4: 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 20nM PDBu + 100 ng/㎖ 노긴(단계 4), 또는
d. 처리 5: 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μΜ ALK5 억제제 II + 20nM PDBu(단계 4), 또는
e. 처리 6: 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 50 ng/㎖ FGF10 + 20nM PDBu(단계 4)로 처리하였다.
PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하는 세포의 백분율에서의 단백질 키나제 C 활성화제-매개의 증가에 대한 추가의 인자의 효과를 조사하였다. 배양물을 단계 4, 4일에 2벌로 샘플링하고, 이미지화 분석을 상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 수행하였다. 또한, ISL1 및 NEUROD 1의 발현을 기록하였다.
본 연구에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단의 대부분은 PDX1의 발현에 대하여 양성이었다. 또한, 대부분의 PDX1 발현 세포는 NKX6.1에 대하여 공동-양성이었다. 표 1에 나타낸 바와 같이, 단독의 PKC 활성화제의 첨가는 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단에서 NKX6.1 발현 세포의 형성을 조장하였다(처리 4). 단계 4의 4일까지, 전체 집단의 93%가 NKX6.1 양성이었으며, NKX6.1 발현 세포의 거의 모두는 PDX1의 발현에 대하여 양성이었다.
ALK5 억제제 II의 단백질 키나제 C 활성화제가 보충된 배지로의 첨가(처리 5)는 관찰된 NKX6.1 발현의 증가에서 효과를 갖지 않았다. 집단 내의 57.1%의 세포가 NEUROD1을 발현하였으며, 집단 내의 52.4%의 세포가 ISL1을 발현하였으며, 이는 이러한 처리 후에 집단에서의 내분비 전구 세포의 백분율의 증가를 시사한다. 표 1을 참조한다.
이러한 실시예로부터 수득한 샘플에서의 PCR 분석에 의해, 처리 5를 제공한 세포에 비하여 처리 4를 제공한 세포의 집단에서 PDX 1, NKX6.1 및 PTF1 알파의 발현이 증가함이 드러났다. 도 4a 내지 4d를 참고한다.
반면, NGN3의 발현의 유의미한 증가가 ALK5 억제제 2 및 PDBu를 제공한 세포에서 관찰되었다(처리 5). 도 4a 내지 4d를 참고한다.
또한, FGF10의 단백질 키나제 C 활성화제가 보충된 배지로의 첨가(처리 6)의 효과를 조사하였다. PDBu와 조합된 50ng/㎖의 농도의 FGF10의 첨가(처리 6)에 의해, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단이 생성되었으며, 여기서, 집단 내의 세포의 90%가 NKX6.1을 발현하였으나, 많은 NKX6.1 발현 세포는 또한 CDX2 양성이었다. 표 1을 참조한다. PDX1, NKX6.1 및 PTF1 알파에 대한 mRNA의 수준은 PDBu 및 노긴으로 처리한 세포에서 관찰된 것을 초과하여 증가되지 않았다. 도 4a 내지 4d를 참고한다.
본 실시예는 BMP 억제제와 조합된 상대적으로 낮은 농도(대략 20nM)에서의 단백질 키나제 C 활성화제를 사용하여, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 생성할 수 있음을 증명하였으며, 여기서, 90% 초과의 세포가 PDX1 및 NKX6.1을 공동-발현하였다.
실시예 4
본 발명의 세포의 집단의 형성을 위한 대안적인 방법
인간 배아 줄기 세포주 H1의 세포를 매트리겔(등록상표)(1:30 희석)(비디 바이오사이언스즈; 카달로그 번호 356231)-코팅된 접시에서, 1일 동안 RPMI 배지(인비트로겐; 카달로그 번호: 22400) + 0.2% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A(페프로테크; 카달로그 번호 120-14) + 20 ng/㎖ WNT-3a(알앤디 시스템즈; 카달로그 번호 1324-WN/CF)를 사용하여 배양하고, 이어서, 추가 2일 동안 0.5% FBS + 100 ng/㎖ 액티빈 A가 보충된 RPMI 배지(단계 1)에 이어서,
a. 3일 동안 DMEM/F12 + 2% FBS + 50 ng/㎖ FGF7(단계 2)에 이어서,
b. 처리 7(T7): 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27+ 0.25 μΜ 사이클로파민-KAAD + 2 μΜ 레틴산(RA) + 100 ng/㎖의 노긴(단계 3), 또는
c. 처리 8(T8): 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27+ 0.25 μΜ 사이클로파민- KAAD + 2 μΜ 레틴산(RA) + 100 ng/㎖의 노긴 + FGF7 50ng/㎖(단계 3)에 이어서,
d. 처리 9(T9): 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 100 ng/㎖ 노긴 + 1 μΜ ALK5 억제제 II + 20nM PDBu(단계 4), 또는
e. 처리 10(T10): 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 50 ng/㎖ FGF10 + 20nM PDBu(단계 4), 또는
f. 처리 11(T11): 4일 동안 DMEM-고 글루코스 + 1% B27 + 20nM PDBu +100 ng/㎖ 노긴(단계 4)으로 처리하였다.
배양물을 단계 4, 4일에 2벌로 샘플링하고, 이미지화를 아이엔 셀 어널라이저 1000(지이 헬쓰케어)을 사용하여 수행하였다. 웰 당 100개 필드의 이미지를 수득하여, 생물검정 및 후속의 염색 과정 동안의 임의의 세포 소실에 대해 보상하였다. 총 세포 개수, 전체 PDX1 발현 세포, 전체 NKX6.1 발현 세포 및 전체 CDX2 발현 세포에 대한 측정치를 아이엔 셀 디벨로퍼 툴박스 1.7(지이 헬스케어) 소프트웨어를 사용하여 각 웰로부터 수득하였다. 각각의 2벌의 데이터 세트에 대하여 평균 및 표준 편차를 계산하였다. 전체 PDX 1, NKX6.1 및 CDX-2 발현 세포를 전체 세포 집단의 백분율로 기록하였다.
T7에 이어서 T9 배지로 처리한 세포의 집단에서, 집단 내의 대략 80%의 세포가 NKX6.1을 발현하였다. 표 2를 참고한다. T7에 이어서 T10 배지로 처리한 세포의 집단에서, 90%의 세포가 NKX6.1을 발현하였으나, 더 많은 CDX2 발현 세포가 이러한 처리에서 관찰되었다. 표 2를 참고한다. 세포의 집단의 T7에 이어서 T11 배지로의 처리에 의해, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단이 생성되었으며, 여기서, 집단 내의 93%의 세포가 NKX6.1을 발현하였다. 집단 내의 대부분의 NKX6.1 발현 세포는 PDX1도 또한 발현하였다.
T8에 이어서 T9 배지로 처리한 배양에 의해, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단이 생성되었으며, 집단 내의 56.7%의 세포가 NKX6.1을 발현하였다. 표 2를 참고한다. T8에 이어서 T10 배지로 처리한 배양에 의해, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단이 생성되었으며, 여기서, 집단 내의 63.5%의 세포가 NKX6.1을 발현하였으며, 본 발명자들은 이러한 처리 후에 더 많은 CDX2 발현 세포를 관찰하였다. 표 2를 참고한다. T8에 이어서 T11 배지로 처리한 배양에 의해, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단이 생성되었으며, 집단 내의 74%의 세포가 NKX6.1을 발현하였다. 표 2를 참고한다. 또한, 대부분의 NKX6.1 발현 세포는 PDX 1을 발현하였다.
또한, PCR 분석에 의해, 단계 3에서의 레틴산, 사이클로파민 및 노긴으로의 처리에 이은 단계 4에서의 PKC 활성화제의 첨가가 단계 4, 4일에 NKX6.1 및 PTF1 알파의 mRNA 수준의 증가를 야기하였음이 뒷받침되었다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양은 실시예 및 바람직한 실시형태를 참조로 하여 상기 예시되었음에도, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 본 특허 법칙의 원칙 하에 적절하게 의도되는 하기 특허청구범위에 의해 정의되는 것으로 생각될 것이다.
Claims (24)
- 하기의 단계를 포함하는, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단의 생성 방법:
a. 만능 줄기 세포의 집단을 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포의 집단을 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계,
c. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 단백질 키나제 C 활성화제, 및 적어도 BMP를 억제할 수 있는 인자, TGFβ 수용체 신호전달 억제제 또는 둘 다가 보충된 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계, 및
d. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계로서,
여기서 상기 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커가 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질(Mix-like homeobox protein), FGF4, CD48, 에오메소더민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커가 PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커가 NGN3, NEUROD, NKX2.2, PDX1, NKX6.1, PAX4 및 PAX6로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임. - 하기의 단계를 포함하는, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단의 생성 방법:
a. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 단백질 키나제 C 활성화제, 및 적어도 BMP를 억제할 수 있는 인자, TGFβ 수용체 신호전달 억제제 또는 둘 다가 보충된 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계, 및
b. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단을 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 집단으로 분화시키는 단계로서,
여기서 상기 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커가 SOX17, GATA4, HNF3 베타, GSC, CER1, 노달, FGF8, 브라키어리, 믹스-유사 호메오박스 단백질(Mix-like homeobox protein), FGF4, CD48, 에오메소더민(eomesodermin, EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택되고,
상기 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커가 PDX1, NKX6.1, HNF1 베타, PTF1 알파, HNF6, HNF4 알파, SOX9, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택되며,
상기 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커가 NGN3, NEUROD, NKX2.2, PDX1, NKX6.1, PAX4 및 PAX6로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단이 췌장 내배엽 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 완성 내배엽 세포인 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 췌장 내분비 세포인 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴 및 췌장 폴리펩티드 중 하나 이상을 발현할 수 있는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 췌장 내분비 세포인 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질 키나제 C 활성화제가 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노)벤졸락탐, 인돌락탐 V, 포르볼-12-미리스테이트-13-아세테이트 및 포르볼-12,13-다이부티레이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 단백질 키나제 C 활성화제가 (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노)벤졸락탐인 것인 방법.
- 제8항에 있어서, (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(트라이플루오로메틸)페닐)-2,4-펜타다이에모일아미노)벤졸락탐이 20 nM 내지 500 nM의 농도로 사용되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 배지가 섬유아세포 성장 인자로 추가로 보충되는 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 섬유아세포 성장 인자가 FGF7인 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 섬유아세포 성장 인자가 FGF10인 것인 방법.
- 제11항에 있어서, 섬유아세포 성장 인자가 50 pg/ml 내지 50 ㎍/㎖의 농도로 사용되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, BMP를 억제할 수 있는 인자가 노긴(Noggin)인 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 노긴이 50 ng/㎖ 내지 500 ㎍/㎖의 농도로 사용되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 노긴이 100 ng/㎖의 농도로 사용되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, TGFβ 수용체 신호전달 억제제가 ALK5의 억제제인 것인 방법.
- 제18항에 있어서, ALK5의 억제제가 ALK5 억제제 II인 것인 방법.
- 제19항에 있어서, ALK5 억제제 II가 0.1 μΜ 내지 10 μΜ의 농도로 사용되는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, ALK5 억제제 II가 1 μΜ의 농도로 사용되는 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 배지가 DMEM-고 글루코스인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 배지가 단백질 키나제 C 활성화제 및 적어도 BMP를 억제할 수 있는 인자로 보충된 것인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 배지가 단백질 키나제 C 활성화제 및 적어도 TGFβ 수용체 신호전달 억제제로 보충된 것인 방법.
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