KR20170117202A - 시르투인 (sirt)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 시르투인 (sirt) 관련된 질환의 치료 - Google Patents

시르투인 (sirt)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 시르투인 (sirt) 관련된 질환의 치료 Download PDF

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Abstract

본 발명은 특히, 시르투인 (SIRT)의 자연 안티센스 폴리뉴클레오티드를 표적으로 함으로써, 시르투인 (SIRT)의 발현 및/또는 기능을 조정하는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 관계한다. 본 발명은 또한, 이들 안티센스 올리고뉴클레오티드의 확인 및 시르투인 (SIRT)의 발현과 연관된 질환과 장애의 치료에서 이들의 용도에 관계한다.

Description

시르투인 (SIRT)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 시르투인 (SIRT) 관련된 질환의 치료{TREATMENT OF SIRTUIN (SIRT) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO A SIRTUIN (SIRT)}
본 발명의 기술분야
본 출원은 2010년 5월 3일자 제출된 U.S. 특허가출원 제61/330,427호, 2010년 11월 2일자 제출된 U.S. 특허가출원 제61/409,136호, 2010년 11월 10일자 제출된 U.S. 특허가출원 제61/412,066호, 그리고 2010년 11월 22일자 제출된 U.S. 특허가출원 제61/415,891호에 우선권을 주장한다.
본 발명의 구체예는 시르투인 (SIRT) 및 연관된 분자의 발현 및/또는 기능을 조정하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
배경기술
DNA-RNA 및 RNA-RNA 혼성화는 DNA 복제, 전사, 그리고 번역을 비롯한 핵산 기능의 많은 측면에 중요하다. 혼성화 역시 특정 핵산을 검출하거나, 또는 이의 발현을 변경시키는 다양한 기술에 중심적이다. 안티센스 뉴클레오티드는 가령, 표적 RNA에 혼성화되어 RNA 절단접합, 전사, 번역, 그리고 복제를 간섭함으로써 유전자 발현을 교란시킨다. 안티센스 DNA는 DNA-RNA 하이브리드 (hybrid)가 대부분의 세포 유형에서 존재하는 활성인 리보뉴클레아제 H에 의한 절단을 위한 기질 (substrate)로서 기능하는 부가된 특징을 갖는다. 안티센스 분자는 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)의 경우에서처럼 세포 내로 전달될 수 있고, 또는 이들은 내생적 유전자로부터 RNA 분자로서 발현될 수 있다. FDA는 최근에, 안티센스 약물, VITRAVENE™ (거대세포바이러스 망막염의 치료용)를 승인하였는데, 이는 안티센스가 치료 유용성 (therapeutic utility)을 갖는다는 것을 반영한다.
요약
한 구체예에서, 본 발명에서는 상응하는 센스 유전자의 상향-조절을 유발하는 자연 안티센스 전사체의 임의의 영역에 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드(들)를 이용함으로써, 자연 안티센스 전사체의 작용을 저해하는 방법을 제시한다. 또한, 자연 안티센스 전사체의 저해는 siRNA, 리보자임 및 소형 분자에 의해 달성될 수 있을 것으로 기대되고, 이들은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
한 구체예에서 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 상기 세포 또는 조직을 5개 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 9의 뉴클레오티드 1 내지 1028 또는 서열 번호: 10의 뉴클레오티드 1 내지 429, 또는 서열 번호: 11의 뉴클레오티드 1 내지 508 또는 서열 번호: 12의 뉴클레오티드 1 내지 593, 서열 번호: 13의 1 내지 373, 서열 번호: 14의 1 내지 1713, 서열 번호: 15의 1 내지 660, 서열 번호: 16의 1 내지 589, 서열 번호: 17의 1 내지 726, 서열 번호: 18의 1 내지 320, 서열 번호: 19의 1 내지 616, 서열 번호: 20의 1 내지 492, 서열 번호: 21의 1 내지 428, 서열 번호: 22의 1 내지 4041 또는 서열 번호: 23의 1 내지 705 또는 서열 번호: 141의 1 내지 2714 또는 서열 번호: 142의 1 내지 1757 또는 서열 번호: 143의 1 내지 3647 내에 5개 내지 30개의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드의 역보체에 최소한 50% 서열 동일성을 갖고; 그리고 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 단계를 포함한다:
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 자연 안티센스 서열, 예를 들면, 서열 번호: 9 내지 23, 141 내지 143에 진술된 뉴클레오티드, 그리고 이들의 임의의 변이체, 대립유전자, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 상보성 서열을 표적으로 한다. 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 실례는 서열 번호: 24 내지 127로서 진술된다.
다른 구체예에서 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 상기 세포 또는 조직을 5개 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 안티센스의 역보체에 최소한 50% 서열 동일성을 갖고; 그리고 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 방법을 제시하고, 상기 방법은 상기 세포 또는 조직을 5개 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드에 최소한 50% 서열 동일성을 갖고; 그리고 생체내에서 또는 시험관내에서 환자 세포 또는 조직에서 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 조성물은 센스 및/또는 안티센스 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드에 결합하는 하나 이상의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 또는 치환된 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 결합을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트, 펩티드 핵산, 2'-O-메틸, 플루오르- 또는 탄소, 메틸렌 또는 다른 잠금된 핵산 (LNA) 분자를 보유하는 변형된 염기를 포함한다. 바람직하게는, 변형된 뉴클레오티드는 α-L-LNA를 비롯한 잠금된 핵산 분자이다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 환자에 피하, 근육내, 정맥내 또는 복막내 투여된다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 제약학적 조성물에 담겨 투여된다. 치료 섭생 (treatment regimen)은 안티센스 화합물을 환자에게 최소한 1회 투여하는 것을 포함한다; 하지만, 이러한 치료는 일정한 기간 동안 복수 약액주입을 포함하도록 변형될 수 있다. 상기 치료는 한 가지 이상의 다른 유형의 요법과 복합될 수 있다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 리포좀 내에 캡슐화 (encapsulation)되거나, 또는 담체 분자 (가령, 콜레스테롤, TAT 펩티드)에 부착된다.
다른 측면은 하기에 기술된다.
상세한 설명
본 발명의 여러 측면은 예시를 위한 실례 적용과 관련하여 하기에 기술된다. 다수의 특정한 상세, 상관관계, 그리고 방법은 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위하여 설명되는 것으로 이해되어야 한다. 하지만, 당업자가 이의 없이 인지하는 바와 같이, 본 발명은 하나 이상의 특정한 상세 없이, 또는 다른 방법으로 실시될 수 있다. 본 발명은 행위 또는 현상의 순서에 의해 한정되지 않는데, 그 이유는 일부 행위가 다른 행위 또는 현상과 상이한 순서로 및/또는 이들과 동시에 발생할 수 있기 때문이다. 게다가, 모든 예시된 행위 또는 현상이 본 발명에 따른 방법을 실행하는데 요구되지는 않는다.
본 명세서에서 개시된 모든 유전자, 유전자 명칭, 그리고 유전자 산물은 본 명세서에서 개시된 조성물과 방법이 적용될 수 있는 임의의 종으로부터 동족체에 상응하는 것으로 의도된다. 따라서 상기 용어에는 인간 및 생쥐로부터 유전자와 유전자 산물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 특정 종으로부터 유전자 또는 유전자 산물이 개시될 때, 이러한 개시는 단지 실례인 것으로 의도되고, 그리고 해당 문맥에서 달리 명시되지 않으면 한정으로서 해석되지 않는 것으로 이해된다. 따라서 예로써, 본 명세서에서 개시된 유전자의 경우에, 이들은 일부 구체예에서, 포유동물 핵산에 관계하고, 그리고 아미노산 서열은 다른 포유동물, 어류, 양서류, 파충류, 그리고 조류가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 동물로부터 상동 (homologous) 및/또는 병렬상동 (orthologous) 유전자 및 유전자 산물을 포함하는 것으로 의도된다. 한 구체예에서, 이들 유전자 또는 핵산 서열은 인간 유래이다.
본 명세서에서 언급된 수납 번호는 달리 지시되지 않으면, National Institutes of Health database, GenBank에서 공개적으로 가용한 서열을 확인한다 (Nucleic Acids Research, 2008 Jan, 36 Database issue: D25-30을 참고한다). 수납 번호에 의해 인용된 모든 서열은 본 발명에 참고로서 편입된다.
정의
본 명세서에서 이용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 것을 목적으로 하고, 그리고 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서, 단수 형태는 해당 문맥에서 달리 명시되지 않으면, 복수 형태 역시 포괄하는 것으로 의도된다. 게다가, 용어 "내포하는", "내포한다", "보유하는", "보유한다", "갖는", 또는 이들의 변이체가 상세한 설명 및/또는 특허청구범위에 이용되는 한에는, 이들 용어는 용어 "포함하는"과 유사한 방식으로 포괄적인 것으로 의도된다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정되는, 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미하고, 이는 상기 값이 어떻게 측정되거나 결정되는 지, 다시 말하면, 측정 체계 (measurement system)의 한계에 부분적으로 좌우될 것이다. 가령, "대략"은 당분야에서 실시 (practice)에 대해 1 또는 1 이상의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 대안으로, "대략"은 소정의 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더욱 바람직하게는 최대 5%, 그리고 더욱 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안으로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정에 대하여, 상기 용어는 소정의 값의 1 크기 자릿수 (order of magnitude) 이내, 바람직하게는 5-배 이내, 그리고 더욱 바람직하게는 2-배 이내를 의미할 수 있다. 특정 값이 명세서 및 특허청구범위에서 기술될 때, 달리 명시되지 않으면 특정 값에 대한 허용되는 오차 범위 이내를 의미하는 용어 "대략"이 가정되어야 한다.
본 명세서에서, 용어 "mRNA"는 표적화된 유전자의 현재 공지된 mRNA 전사체(들), 그리고 석명될 수 있는 임의의 다른 전사체를 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드" 또는 "안티센스 화합물"은 다른 RNA 또는 DNA (표적 RNA, DNA)에 결합하는 RNA 또는 DNA 분자를 의미한다. 가령, RNA 올리고뉴클레오티드이면, 이는 RNA-RNA 상호작용에 의해 다른 RNA 표적에 결합하고 표적 RNA의 활성을 변경시킨다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 폴리뉴클레오티드의 발현 및/또는 기능을 상향 조절 또는 하향 조절할 수 있다. 이러한 정의에는 치료적 관점, 진단적 관점, 또는 다른 관점에서 유용한 임의의 외래 RNA 또는 DNA 분자가 포함되는 것으로 의도된다. 이런 분자에는 예로써, 안티센스 RNA 또는 DNA 분자, 간섭 RNA (RNAi), 마이크로 RNA, 미끼 RNA 분자, siRNA, 효소 RNA, 치료 편집 RNA 및 작동약과 길항약 RNA, 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 가이드 서열 (external guide sequence, EGS) 올리고뉴클레오티드, 교대 접합기 (alternate splicer), 프라이머, 프로브, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 혼성화되는 다른 올리고머 화합물이 포함된다. 따라서 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA) 또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머, 또는 이의 모방체를 지칭한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"에는 또한, 데옥시리보뉴클레오시드, 리보뉴클레오시드, 이들의 치환된 및 알파-아노머 (alpha-anomeric) 형태, 펩티드 핵산 (PNA), 잠금된 핵산 (LNA), 포스포로티오에이트, 메틸포스포네이트 등을 비롯한 자연 및/또는 변형된 단량체 또는 연쇄의 선형 또는 원형 올리고머가 포함된다. 올리고뉴클레오티드는 단량체-단량체 상호작용의 규칙적인 패턴, 예를 들면, Watson-Crick 유형의 염기 대합 (base pairing), Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 유형의 염기 대합 등에 의해, 표적 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 "키메라"일 수 있다, 다시 말하면, 서로 다른 영역으로 구성될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "키메라" 화합물은 2개 이상의 화학적 영역, 예를 들면, DNA 영역(들), RNA 영역(들), PNA 영역(들) 등을 보유하는 올리고뉴클레오티드이다. 각각의 화학적 영역은 최소한 하나의 단량체 단위, 다시 말하면, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우에 뉴클레오티드로 구성된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 최소한 하나의 영역을 포함하고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 한 가지 이상의 요망되는 특성을 나타내기 위하여 변형된다. 올리고뉴클레오티드의 요망되는 특성에는 예로써, 뉴클레아제 분해에 증가된 내성, 증가된 세포 흡수, 및/또는 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화성 (binding affinity)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 이런 이유로, 상기 올리고뉴클레오티드의 서로 다른 영역은 상이한 특성을 가질 수 있다. 본 발명의 키메라 올리고뉴클레오티드는 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 앞서 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오티드 유사체의 혼성 구조로서 형성될 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 "레지스터 (register)"에서, 다시 말하면, 단량체가 고유 DNA에서처럼 연속적으로 연결되거나, 또는 스페이서를 통해 연결될 때, 연결될 수 있는 영역으로 구성될 수 있다. 이들 스페이서는 이들 영역 간에 공유 "가교"를 구성하고 바람직한 경우에, 대략 100개의 탄소 원자를 초과하지 않는 길이를 갖도록 의도된다. 이들 스페이서는 예로써, 양 또는 음 전하를 보유하고, 특정한 핵산 결합 특성 (삽입물, 그루브 접합제 (groove binder), 독소, 형광단 등)을 갖고, 친유성이고, 예로써 알파-나선 (alpha-helix)을 유도하는 알라닌-보유 펩티드와 같은 특수한 이차 구조를 유도하는 상이한 기능기 (functionality)를 보유할 수 있다.
본 명세서에서, "시르투인 (SIRT)"에는 모든 집단 구성원, 돌연변이체, 대립유전자, 단편, 종, 코딩과 비-코딩 서열, 센스 및 안티센스 폴리뉴클레오티드 가닥 등이 포함된다.
본 명세서에서, 단어 시르투인1, SIRT1, 시르투인, 침묵 교배 타입 정보 조절 2 동족체 1, hSIR2, hSIRT1, NAD-의존성 탈아세틸라아제 시르투인-1, SIR2L1, SIR2-유사 단백질 1은 기존 문헌에서와 동일한 것으로 간주되고, 그리고 본 출원에서 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 단어 시르투인2, 시르투인-2, SIRT2, SIR2L 및 SIR2L2는 기존 문헌에서와 동일한 것으로 간주되고, 그리고 본 출원에서 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 단어 시르투인 3, 시르투인3, 시르투인-3, SIRT3, SIRT-3, hSIRT3, NAD-의존성 탈아세틸라아제 시르투인-3, 미토콘드리아, SIR2L3, SIR2-유사 단백질 3은 본 출원에서 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 단어 시르투인4, SIRT4, MGC130046, MGC130047, MGC57437, NAD-의존성 ADP-리보실전이효소 시르투인-4, SIR2L4, SIR2-유사 단백질 4는 기존 문헌에서와 동일한 것으로 간주되고, 그리고 본 출원에서 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 단어 시르투인 5, SIRT5, FLJ36950, NAD-의존성 탈아세틸라아제 시르투인-5, SIR2L5, SIR2-유사 단백질 5는 기존 문헌에서와 동일한 것으로 간주되고, 그리고 본 출원에서 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 단어 시르투인 6, 시르투인6, 시르투인-6, SIRT6, SIRT-6, NAD-의존성 탈아세틸라아제 시르투인-6, SIR2L6, SIR2-유사 단백질 6은 기존 문헌에서와 동일한 것으로 간주되고, 그리고 본 출원에서 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 단어 시르투인 7, SIRT7, MGC126840, MGC126842, NAD-의존성 탈아세틸라아제 시르투인-7, SIR2L7, SIR2-유사 단백질 7은 기존 문헌에서와 동일한 것으로 간주되고, 그리고 본 출원에서 동의어로서 이용된다.
본 명세서에서, 용어 "특이적인 올리고뉴클레오티드" 또는 "표적으로 하는 올리고뉴클레오티드"는 (i) 표적화된 유전자의 일부와 안정된 복합체를 형성할 수 있거나, 또는 (ii) 표적화된 유전자의 mRNA 전사체의 일부와 안정된 이중나선을 형성할 수 있는 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 이들 복합체 및 이중나선의 안정성은 이론적 계산 및/또는 시험관내 분석에 의해 결정될 수 있다. 혼성화 복합체 및 이중나선의 안정성을 결정하는 대표적인 분석법은 하기 실시예에서 기술된다.
본 명세서에서, 용어 "표적 핵산"은 DNA, 이런 DNA로부터 전사된 RNA (premRNA 및 mRNA 포함), 그리고 비-코딩 서열, 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드를 코딩하는, 이런 RNA로부터 유래된 cDNA를 포괄한다. 올리고머 화합물의 표적 핵산과의 특이적인 혼성화는 상기 핵산의 정상적인 기능을 간섭한다. 표적 핵산에 특이적으로 혼성화되는 화합물에 의한 상기 표적 핵산의 기능의 이러한 조정은 일반적으로, "안티센스"로 지칭된다. 간섭되는 DNA의 기능에는 예로써, 복제 및 전사가 포함된다. 간섭되는 RNA의 기능에는 예로써, RNA의 단백질 번역 부위로의 전좌, RNA로부터 단백질의 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 산출하기 위한 RNA의 절단접합, 그리고 RNA에 관련되거나 RNA에 의해 촉진될 수 있는 촉매 활성과 같은 생명 유지에 필요한 모든 기능이 포함된다. 표적 핵산 기능으로 이런 간섭의 전반적인 효과는 인코딩된 산물 또는 올리고뉴클레오티드의 발현의 조정이다.
RNA 간섭 "RNAi"는 "표적" 핵산 서열에 서열-특이적 상동성 (homology)을 갖는 이중 가닥 RNA (dsRNA) 분자에 의해 매개된다. 본 발명의 일정한 구체예에서, 매개자 (mediator)는 5-25개 뉴클레오티드 "작은 간섭" RNA 이중나선 (siRNA)이다. 이들 siRNA는 Dicer로 알려져 있는 RNase 효소에 의한 dsRNA의 가공으로부터 유래된다. siRNA 이중나선 산물은 RISC (RNA Induced Silencing Complex)로 명명된 다중-단백질 siRNA 복합체 내로 동원된다. 특정 이론에 한정됨 없이, RISC는 이후, 표적 핵산 (적절하게는 mRNA)로 안내되는 것으로 생각되고, 여기서 siRNA 이중나선은 서열-특이적 방식으로 상호작용하여 촉매 방식으로 절단을 매개한다. 본 발명에 따라서 이용될 수 있는 작은 간섭 RNA는 당분야에 널리 공지되고 당업자에게 익숙한 절차에 따라서 합성되고 이용될 수 있다. 본 발명의 방법에 이용되는 작은 간섭 RNA는 적절하게는, 대략 1개 내지 대략 50개의 뉴클레오티드 (nt)를 포함한다. 무제한적 구체예의 실례에서, siRNA는 대략 5개 내지 대략 40개 nt, 대략 5개 내지 대략 30개 nt, 대략 10개 내지 대략 30개 nt, 대략 15개 내지 대략 25개 nt, 또는 대략 20-25개 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
적절한 올리고뉴클레오티드의 선별은 핵산 서열을 자동적으로 정렬하고 동일성 또는 상동성의 영역을 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용함으로써 조장된다. 이들 프로그램은 예로써, GenBank와 같은 데이터베이스를 검색하거나, 또는 PCR 산물을 서열화함으로써, 획득된 핵산 서열을 비교하는데 이용된다. 일정한 범위의 종으로부터 핵산 서열의 비교는 종 간에 적절한 정도의 동일성을 보이는 핵산 서열의 선별을 가능하게 한다. 서열화되지 않은 유전자의 경우에, 표적 종 및 다른 종에서 유전자 간에 동일성 정도를 결정하기 위하여 서던 블롯 (Southern blot)이 수행된다. 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 다양한 정도의 엄격함 (stringency)에서 서던 블롯을 수행함으로써, 동일성의 근사 측정 (approximate measure)을 달성하는 것이 가능하다. 이들 절차는 통제되는 개체에서 표적 핵산 서열에 높은 정도의 상보성 (complementarity), 그리고 다른 종에서 상응하는 핵산 서열에 더욱 낮은 정도의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드의 선별을 가능하게 한다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 유전자의 적절한 영역을 선별하는데 상당한 허용 범위 (latitude)가 존재한다는 것을 인지할 것이다.
"효소 RNA"는 효소 활성을 갖는 RNA 분자를 의미한다. 효소 핵산 (리보자임)은 먼저, 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 이런 결합은 표적 RNA를 절단하는 작용을 하는 분자의 효소 부분에 매우 가깝게 유지되는 효소 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 발생한다. 따라서 효소 핵산은 먼저, 표적 RNA를 인식하고, 이후 염기 대합을 통하여 표적 RNA에 결합하고, 그리고 일단 정확한 부위에 결합되면, 표적 RNA을 절단하는데 효소적으로 작용한다.
"미끼 RNA"는 리간드에 대한 자연 결합 도메인을 모방하는 RNA 분자를 의미한다. 이런 이유로, 미끼 RNA는 특정 리간드의 결합에 대하여 자연 결합 표적과 경쟁한다. 가령, HIV 횡단-활성화 반응 (trans-activation response, TAR) RNA의 과다-발현은 "미끼"로서 작용할 수 있고 HIV tat 단백질에 효율적으로 결합하고, 따라서 상기 단백질이 HIV RNA에 인코딩된 TAR 서열에 결합하는 것을 예방하는 것으로 밝혀졌다. 이는 특정한 실례인 것으로 의도된다. 당업자는 이것이 단지 하나의 실례이고, 그리고 다른 구체예가 당분야에 널리 공지된 기술을 이용하여 쉽게 산출될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
본 명세서에서, 용어 "단량체"는 전형적으로, 포스포디에스테르 결합 또는 이들의 유사체에 의해 연결되어 수개의 단량체 단위, 예를 들면, 대략 3-4개 내지 대략 수백 개의 단량체 단위 범위의 크기를 갖는 올리고뉴클레오티드를 형성하는 단량체를 지시한다. 포스포디에스테르 연쇄의 유사체에는 하기에 더욱 상세하게 기술된 바와 같이, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 메틸포스포네이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포라미데이트 등이 포함된다.
용어 "뉴클레오티드"에는 자연 발생 뉴클레오티드 및 비-자연 발생 뉴클레오티드가 포함된다. 이전에 "비-자연 발생" 인 것으로 간주되었던 다양한 뉴클레오티드가 차후에, 자연에서 발견되고 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 "뉴클레오티드"에는 공지된 퓨린과 피리미딘 헤테로환-보유 분자뿐만 아니라 이들의 헤테로환상 유사체 및 호변체 (tautomer) 역시 포함된다. 다른 유형의 뉴클레오티드의 예시적인 실례는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우라실, 퓨린, 잔틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자잔틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노시토신, N6,N6-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸시토신, 5-(C3-C6)-알키닐시토신, 5-플루오르우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소시토신, 2-히드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소시토신, 이소구아닌, 이노신, 그리고 Benner et al., U.S. 특허 제5,432,272호에서 설명된 "비-자연 발생" 뉴클레오티드를 보유하는 분자이다. 용어 "뉴클레오티드"에는 이들 실시예 모두, 그리고 이들의 유사체 및 호변체가 포함되는 것으로 의도된다. 특히 흥미로운 뉴클레오티드는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 그리고 우라실을 보유하는 것들인데, 이들은 인간에서 치료적 및 진단적 적용에 관하여 자연 발생 뉴클레오티드로서 간주된다. 뉴클레오티드는 예로써, Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992)에서 설명된 바와 같은 자연 2'-데옥시 및 2'-히드록실 당, 그리고 이들의 유사체를 포함한다.
뉴클레오티드와 관련하여 "유사체"에는 변형된 염기 모이어티 및/또는 변형된 당 모이어티를 보유하는 합성 뉴클레오티드가 포함된다. 이런 유사체에는 결합 특성, 예를 들면, 이중나선 또는 삼중나선 안정성, 특이성 등을 증강시키도록 설계된 합성 뉴클레오티드가 포함된다.
본 명세서에서, "혼성화"는 올리고머 화합물의 실질적으로 상보성 가닥의 대합을 의미한다. 대합의 한 가지 기전은 수소 결합을 수반하고, 이는 올리고머 화합물의 가닥의 상보성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 염기 (뉴클레오티드) 간에 Watson-Crick, Hoogsteen 또는 역 Hoogsteen 수소 결합일 수 있다. 가령, 아데닌 및 티민은 수소 결합의 형성을 통하여 대합하는 상보성 뉴클레오티드이다. 혼성화는 다양한 조건 하에 발생할 수 있다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 상기 화합물의 결합이 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 기능 및/또는 활성의 조정을 유발하고, 그리고 특정한 결합이 요망되는 조건 하에, 다시 말하면, 생체내 분석 또는 치료적 처리의 경우에 생리학적 조건 하에, 그리고 시험관내 분석의 경우에 이들 분석이 수행되는 조건 하에 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있을 만큼 충분한 정도의 상보성이 존재할 때, "특이적으로 혼성화가능"하다.
본 명세서에서, 구(句) "엄격한 혼성화 조건" 또는 "엄격한 조건"은 본 발명의 화합물이 표적 서열에 혼성화되지만, 최소 숫자의 다른 서열에 혼성화되는 조건을 지칭한다. 엄격한 조건은 서열-의존성이고 서로 다른 환경에서 상이할 것이고, 그리고 본 발명의 맥락에서, 올리고머 화합물이 표적 서열에 혼성화되는 "엄격한 조건"은 이들 올리고머 화합물의 본성과 조성 및 이들이 조사되는 분석법에 의해 결정된다. 일반적으로, 엄격한 혼성화 조건은 무기 양이온, 예를 들면, Na++ 또는 K++를 갖는 낮은 농도 (<0.15M)의 염 (즉, 낮은 이온 강도), 올리고머 화합물:표적 서열 복합체의 Tm 미만에서 20℃ - 25℃보다 높은 온도, 그리고 변성제, 예를 들면, 포름아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸 설폭시드, 또는 세정제 나트륨 도데실 설페이트 (SDS)의 존재를 포함한다. 가령, 혼성화 속도는 각 1% 포름아미드에 대하여 1.1% 감소한다. 높은 엄격한 혼성화 조건의 실례는 60℃에서 30분 동안 0.1X 염화나트륨-구연산나트륨 완충액 (SSC)/0.1% (w/v) SDS이다.
본 명세서에서, "상보성"은 1개 또는 2개의 올리고머 가닥에서 2개의 뉴클레오티드 간에 정확한 대합의 능력을 지칭한다. 가령, 안티센스 화합물의 일정한 위치에서 핵염기 (nucleobase)가 표적 핵산의 일정한 위치에서 핵염기와 수소 결합을 형성할 수 있고, 상기 표적 핵산이 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자이면, 상기 올리고뉴클레오티드 및 표적 핵산 사이에 수소 결합의 위치는 상보성 위치인 것으로 간주된다. 올리고머 화합물 및 추가의 DNA, RNA, 또는 올리고뉴클레오티드 분자는 각 분자 내에서 충분한 숫자의 상보성 위치가 서로에 수소 결합될 수 있는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 서로에 상보성이다. 따라서 "특이적으로 혼성화가능" 및 "상보성"은 올리고머 화합물 및 표적 핵산 사이에 안정되고 특정한 결합이 발생할 만큼 충분한 숫자의 뉴클레오티드에 걸쳐 충분한 정도의 정확한 대합 또는 상보성을 지시하는데 이용되는 용어이다.
당분야에서, 올리고머 화합물의 서열은 특이적으로 혼성화되기 위하여, 표적 핵산의 서열에 100% 상보성일 필요가 없는 것으로 이해된다. 게다가, 올리고뉴클레오티드는 개재성 또는 인접 분절 (segment)이 혼성화 현상에 관련되지 않도록 하나 이상의 분절에 걸쳐 혼성화될 수 있다 (가령, 루프 (loop) 구조, 미스매치 (mismatch) 또는 헤어핀 (hairpin) 구조). 본 발명의 올리고머 화합물은 그들이 표적화되는 표적 핵산 서열 내에 표적 영역에 최소한 대략 70%, 또는 최소한 대략 75%, 또는 최소한 대략 80%, 또는 최소한 대략 85%, 또는 최소한 대략 90%, 또는 최소한 대략 95%, 또는 최소한 대략 99% 서열 상보성을 포함한다. 가령, 안티센스 화합물의 20개 뉴클레오티드 중에서 18개가 표적 영역에 상보성이고, 따라서 특이적으로 혼성화되는 안티센스 화합물은 90% 상보성을 나타낼 것이다. 이러한 실례에서, 나머지 비-상보성 뉴클레오티드는 상보성 뉴클레오티드와 함께 군집되거나, 또는 상보성 뉴클레오티드가 군데군데 산재될 수 있고, 그리고 서로에 또는 상보성 뉴클레오티드에 인접할 필요가 없다. 따라서 표적 핵산과 완전 상보성의 두 영역이 측면에서 접하는 4개의 비-상보성 뉴클레오티드를 보유하는 18개 뉴클레오티드 길이를 갖는 안티센스 화합물은 표적 핵산과 77.8% 전체 상보성을 가질 것이고, 따라서 본 발명의 범위 내에 속할 것이다. 안티센스 화합물의 표적 핵산의 영역과의 상보성 비율은 당분야에 공지된 BLAST (basic local alignment search tools) 프로그램 및 PowerBLAST 프로그램을 이용하여 일과적으로 결정될 수 있다. 상동성, 서열 동일성 또는 상보성 비율은 예로써, 디폴트 설정을 이용한 Gap 프로그램에 의해 결정될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "열 융점 (Tm)"은 표적 서열에 상보성인 올리고뉴클레오티드 중에서 50%가 평형에서 표적 서열에 혼성화되는 규정된 이온 강도, pH, 그리고 핵산 농도 하에 온도를 지칭한다. 전형적으로, 엄격한 조건은 염 농도가 pH 7.0 내지 8.3에서 최소한 대략 0.01 내지 1.0 M Na 이온 농도 (또는 다른 염)이고, 그리고 온도가 짧은 올리고뉴클레오티드 (가령, 10개 내지 50개 뉴클레오티드)의 경우에 최소한 대략 30℃인 조건일 것이다. 엄격한 조건은 또한, 불안정화제 (destabilizing agent), 예를 들면, 포름아미드의 첨가로 달성될 수도 있다.
본 명세서에서, "조정"은 유전자의 발현에서 증가 (촉진) 또는 감소 (저해)를 의미한다.
폴리뉴클레오티드 서열의 맥락에서 이용될 때, 용어 "변이체"에는 야생형 유전자에 관련된 폴리뉴클레오티드 서열이 포함될 수 있다. 이러한 정의에는 또한, 예로써 "대립유전자", "절단접합", "종", 또는 "다형성" 변이체가 포함될 수 있다. 절단접합 변이체는 참고 분자에 현저한 동일성을 가질 수도 있지만, 일반적으로 mRNA 가공 동안 엑손의 교대성 절단접합 (alternate splicing)으로 인하여 더욱 많은 또는 더욱 적은 숫자의 폴리뉴클레오티드를 보유할 것이다. 상응하는 폴리펩티드는 추가의 기능적 도메인을 보유하거나, 또는 도메인이 부재할 수 있다. 종 변이체는 종에 따라 달라지는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 야생형 유전자 산물의 변이체가 본 발명에 특히 유용하다. 변이체는 핵산 서열 내에서 최소한 하나의 돌연변이로부터 유래할 수 있고, 그리고 변경된 mRNA, 또는 구조 또는 기능이 변경되거나 변경되지 않은 폴리펩티드를 결과할 수 있다. 임의의 소정의 자연 또는 재조합 유전자는 대립유전자 형태를 보유하지 않거나, 또는 1개 또는 다수의 대립유전자 형태를 보유할 수 있다. 변이체를 발생시키는 공통의 돌연변이 변화는 일반적으로, 뉴클레오티드의 자연적인 결실, 부가, 또는 치환에 기인하는 것으로 생각된다. 이들 유형의 변화는 각각, 소정의 서열 내에서 단독으로, 또는 다른 것들과 공동으로, 1회 이상 발생할 수 있다
결과의 폴리펩티드는 일반적으로, 서로에 대하여 현저한 아미노산 동일성을 가질 것이다. 다형성 변이체는 소정의 종의 개체 간에 특정 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열에서 변형물이다. 다형성 변이체에는 또한, "단일 뉴클레오티드 다형성" (single nucleotide polymorphism, SNP), 또는 폴리뉴클레오티드 서열이 1개 염기에 의해 달라지는 단일 염기 돌연변이 (single base mutation)가 포함될 수 있다. SNP의 존재는 예로써, 질환 상태에 대한 경향, 다시 말하면, 내성 (resistance)과 대비하여 감수성 (susceptibility)을 갖는 일정한 개체군을 지시할 수 있다.
유도체 폴리뉴클레오티드는 화학적 변형, 예를 들면, 알킬, 아실, 또는 아미노 기에 의한 수소의 대체에 종속되는 핵산을 포함한다. 유도체, 예를 들면, 유도체 올리고뉴클레오티드는 비-자연-발생 부분, 예를 들면, 변경된 당 모이어티 또는 당내 (inter-sugar) 연쇄를 포함할 수 있다. 포스포로티오에이트 및 당분야에 공지되어 있는 다른 황-보유 종이 이들 중에서 대표적이다. 유도체 핵산은 또한, 방사성뉴클레오티드, 효소, 형광제, 화학발광제, 발색제 (chromogenic agent), 기질, 보조인자, 저해물질, 자기 입자 등을 비롯한 라벨을 보유할 수 있다.
"유도체" 폴리펩티드 또는 펩티드는 예로써, 당화 (glycosylation), 페길화 (pegylation), 인산화 (phosphorylation), 설파화 (sulfation), 환원 (reduction)/알킬화 (alkylation), 아실화 (acylation), 화학적 커플링, 또는 순한 포르말린 처리에 의해 변형된 것이다. 유도체는 또한, 방사성동위원소, 형광, 그리고 효소 라벨이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 검출가능 라벨을 직접적으로 또는 간접적으로 보유하도록 변형될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "동물" 또는 "환자"에는 예로써, 인간, 양, 엘크, 사슴, 뮬 사슴, 밍크, 포유동물, 원숭이, 말, 소, 돼지, 염소, 개, 고양이, 쥐, 생쥐, 조류, 닭, 파충류, 어류, 곤충 및 거미류 동물이 포함되는 것으로 의도된다.
"포유동물"에는 전형적으로, 건강 관리를 받고 있는 온혈 포유동물 (가령, 인간 및 가축)이 포함된다. 실례에는 인간뿐만 아니라 고양이, 개, 말, 소 등이 포함된다.
"치료하는" 또는 "치료"는 포유동물에서 질환-상태의 치료를 커버하고, 그리고 (a) 포유동물에서, 특히 이런 포유동물이 질환-상태의 성향이 있지만 아직 발병된 것으로 진단되지 않았을 때 질환-상태가 발생하는 것을 예방하고; (b) 질환-상태를 저해하고, 예를 들면, 이의 발생을 중지시키고; 및/또는 (c) 질환-상태를 완화하는, 예를 들면, 원하는 종점에 도달될 때까지 질환 상태의 퇴보를 유발하는 것을 포함한다. 치료는 또한, 질환의 증상의 개선 (가령, 통증 또는 불쾌감 경감)을 포함하고, 여기서 이런 개선은 질환 (가령, 원인, 전염, 표현 등)에 직접적으로 영향을 주거나 주지 않을 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "암"은 백혈병, 림프종, 흑색종, 암종 및 육종이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 포유동물에서 관찰되는 모든 유형의 암 또는 신생물 또는 악성 종양을 지칭한다. 암은 "종양" 또는 암의 악성 세포를 포함하는 조직으로서 그 자신을 드러낸다. 종양의 실례에는 육종 (sarcoma) 및 암종 (carcinoma), 예를 들면, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골원성 육종, 척삭종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 윤활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 췌장 암, 유방 암, 난소 암, 전립선 암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 낭선종, 속질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막 암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 폐 암종, 소세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 별아교세포종, 속질모세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경초종, 희소돌기아교세포종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종, 그리고 망막모세포종이 포함된다. 본 발명에 따른 공개된 조성물에 의해 치료될 수 있는 추가적인 암에는 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신경아세포종, 유방암, 난소암, 폐암, 횡문근육종, 일차성 혈소판증가증, 일차성 마크로글로불린혈증, 소-세포 폐 종양, 일차성 뇌종양, 위암, 결장암, 악성 췌장 일슐린종, 악성 암양종, 비뇨기 방광암, 전악성 피부 병소, 고환암, 림프종, 갑상선 암, 신경아세포종, 식도 암, 비뇨생식기관 암, 악성 고칼슘혈증, 자궁경부암, 자궁내막암, 부신 피질암, 그리고 전립선 암이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
본 명세서에서, "신경 질환이나 장애"는 신경계 및/또는 시계의 임의의 질환이나 장애를 지칭한다. "신경 질환이나 장애"는 중추 신경계 (뇌, 뇌간 및 소뇌), 말초 신경계 (뇌신경 포함), 그리고 자율 신경계 (중추신경계 및 말초 신경계 둘 모두에 위치하는 부분)가 관련된 질환이나 장애를 포함한다. 신경 장애의 실례에는 두통, 마비 및 혼수, 치매, 발작, 수면 장애, 외상, 감염, 신생물, 신경안과학, 운동 장애, 탈수초화 질환, 척수 장애, 그리고 말초 신경, 근육 및 신경근 접합점의 장애가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 중독 및 정신병에는 양극 장애 및 정신분열증이 포함되지만 이들에 국한되지 않으며, 이들 또한 신경 장애의 정의에 포함된다. 하기는 본 발명에 따른 조성물 및 방법을 이용하여 치료될 수 있는 몇 가지 신경 장애, 증상, 신호 및 증후군의 목록이다: 후천성 간질 실어; 급성 파종성 뇌척수염; 부신백질이영양증; 노인성 황반 변성; 뇌량의 발육부진; 인지불능; Aicardi 증후군; Alexander 질환; Alpers 질환; 교대성 반신마비; 알츠하이머병; 혈관성 치매; 근위축성 측삭 경화증; 무뇌증; Angelman 증후군; 혈관종(angiomatosis); 산소결핍; 실어증; 운동불능; 거미집모양의 낭종; 거미집모양의 염증(arachnoiditis); Anronl-Chiari 변형; 동정맥 기형; Asperger 증후군; 기능장애 운동실조; 주의력 결핍 과다행동 장애; 자폐증; 자율 장애; 등 통증; Batten 질환; Behcet 질환; Bell 마비; 양성 필수 안검경련; 양성 병소; 근위축증; 양성 두개내 고혈압; Binswanger 질환; 안검경련; Bloch Sulzberger 증후군; 상완 신경 얼기 부상; 뇌 종기; 뇌 손상; 뇌 종양(교아종 다형 포함); 척추 종양; Brown-Sequard 증후군; Canavan 질환; 손목관절 터널 증후군; 작열통; 중앙 통증 증후군; 중심성교뇌수초용해; 두부 장애; 대뇌 동맥류; 대뇌 동맥경화증; 대뇌 위축; 대뇌 거대증; 대뇌 마비; Charcot-Marie-Tooth 질환; 화학요법-유도된 신경병증 및 신경병증 통증; Chiari 기형; 무도병; 만성 염증성 탈수초화 다발신경병증; 만성통증; 만성 국부 통증 증후군; Coffin Lowry 증후군; 지속적인 발육 상태를 비롯한 혼수; 선천적 안면 양측마비; 피질기저 퇴화; 두개 동맥염; 두개골유합증; Creutzfeldt-Jakob 질환; 누적성 외상 장애; Cushing 증후군; 세포 거대 봉입체 질환; 사이토메갈로바이러스 감염; 춤추는 눈-춤추는 발 증후군; DandyWalker 증후군; Dawson 질환; De Morsier 증후군; Dejerine-Klumke 마비; 치매; 피부근염; 당뇨성 신경병증; 미만성 경화증; 자율신경실조증; 난서증; 난독증; 긴장이상; 조기 유아 간질 뇌증; 빈 Sella 증후군; 뇌염; 뇌류(encephaloceles); 뇌삼차 신경성 혈관종증; 간질; Erb 마비; 본태성 진전증; Fabry 질환; Fahr 증후군; 기절; 가족성 강직성 마비; 열병 발작; Fisher 증후군; Friedreich 운동실조; 전두측엽 치매 및 기타 "타우병증"; Gaucher 질환; Gerstmann 증후군; 거대 세포 동맥염; 거대 세포 함유 질환; 구상세포 대뇌피질이영양증; Guillain-Barre 증후군; HTLV-1-관련된 골수증; Hallervorden-Spatz 질환; 두부 손상; 두통; 반측안면 경련증; 유전성 강직성 대마비; 유전성 다발성 신경염증 실조; 이성대상포진; 대상포진; Hirayama 증후군; HIV-관련된 치매 및 신경병증 (또한 AIDS의 신경성 현시); 전전뇌증; Huntington 질환 및 기타 폴리글루타민 반복 질환; 수두무뇌증; 물뇌증; 과콜리졸혈증; 혈중산소감소증; 면역-중재된 뇌척수염; 봉입체 근염; 색조 실조증; 영아 피틴산 축적 질환; 영아 레프슘 질환; 영아 경련; 염증성 근질환; 두개내 낭종; 두개내 고혈압; Joubert 증후군; Keams-Sayre 증후군; Kennedy 질환 Kinsboume 증후군; Klippel Feil 증후군; Krabbe 질환; Kugelberg-Welander 질환; 쿠루병; Lafora 질환; Lambert-Eaton 근무력 증후군; Landau-Kleffner 증후군; 측면 수질 (Wallenberg) 증후군; 학습 장애; Leigh 질환; Lennox-Gustaut 증후군; Lesch-Nyhan 증후군; 백질이영양증; 루이 소체 치매; 뇌회결손; 감금 증후군; 루게릭병 (가령, 운동 신경 질환 또는 근위축성 측삭 경화증); 요추간반 질환; 라임병--신경 후유증; Machado-Joseph 질환; 큰뇌증; 거대뇌증; Melkersson-Rosenthal 증후군; Menieres 질환; 뇌막염; Menkes 질환; 이염백질이영양증; 소두증; 편두통; Miller Fisher 증후군; 미니-뇌졸증; 미토콘드리아 근병증; Mobius 증후군; 일지성 근위축증; 운동 신경 질환; Moyamoya 질환; 뮤코다당증; 다발경색 치매; 다병소성 운동 신경병증; 다발성 경화증 및 기타 탈수초화 장애; 체위성 저혈압을 동반하는 다계통 위축증; 근육 영양실조; 중증근무기증; 말이집탈락성 미만성 경화증; 유아의 근간대성 뇌병증; 근질환; 본태성 근긴장; 기면발작; 신경섬유종증; 신경이완성 악성 증후군; AIDS의 신경성 현시; 낭창의 신경 후유증; 신경근육긴장증; 신경 세로이드 리포푸신증; 신경이동 장애; Niemann-Pick 질환; O'Sullivan-McLeod 증후군; 후두 신경통; 구속성 척추 증후군; Ohtahara 증후군; 올리브교 소뇌 위축증; 안구간대경련-근간대경련; 시신경염; 기립성 저혈압; 과사용 증후군; 이상 감각; 신경퇴행성 질환이나 장애 (파킨슨씨병, 헌팅턴병, 알츠하이머병, 근위축성 측삭 경화증 (ALS), 치매, 다발성 경화증 그리고 신경 세포 사멸과 관련된 기타 질환 및 장애); 선천 이상근육근긴장; 종양연관 질환; 돌발 발작; Parry Romberg 증후군; Pelizaeus-Merzbacher 질환; 주기적 마비; 말초 신경병증; 통증 있는 신경병증 및 신경병증 통증; 지속적인 성장 상태; 전반적 발달 장애; 빛 재채기 반사; 피탄산 축적 질환; Pick 질환; 신경 압박; 뇌하수체 종양; 다발성근염; 공뇌증; 소아마비 증후군; 대상포진후 신경통; 감염후 뇌척수염; 체위성 저혈압; Prader-Willi 증후군; 원발성 측삭 경화증; 프리온 질환; 진행성 반얼굴 위축; 진행성 다초점 백색질뇌증; 진행성 경화 회백질위축증; 진행성 핵상 마비; 가성뇌종양; Ramsay-Hunt 증후군 (유형 I 및 II); Rasmussen 뇌염; 반사성 교감신경 이영양증 증후군; Refsum 질환; 반복성 운동 장애; 반복성 스트레스 손상; 하지 불안 증후군; 레트로바이러스-연관 골수증; Rett 증후군; Reye 증후군; Saint Vitus 댄스; Sandhoff 질환; Schilder 질환; 뇌갈림증; 중격-시신경 형성장애; 흔들린 아이 증후군; 대상포진; Shy-Drager 증후군; Sjogren 증후군; 수면 무호흡; Soto 증후군; 경련성 마비; 척추 파열; 척수 손상; 척수 종양; 척추 근위축; Stiff-Person 증후군; 발작; Sturge-Weber 증후군; 아급성 경화성 범뇌염; 피질하부 동맥경화성 뇌병; Sydenham 무도병; 실신; 척수공동증; 지연성 운동장애; Tay-Sachs 질환; 일시적 동맥염; 계류 척추 증후군; Thomsen 질환; 흉곽 출구 증후군; 동통성 틱; Todd 마비; Tourette 증후군; 일과성 허혈 발작; 전염성 해면상뇌증; 횡단성 척추염; 외상성 뇌 손상; 진전; 삼차 신경통; 열대 경직 하반신 마비; 결절성 경화증; 혈관성 치매 (다발-경색 치매); 일시적 동맥염을 비롯한 혈관염; Von Hippel-Lindau 질환; Wallenberg 증후군; Werdnig-Hoffman 질환; West 증후군; 편달; Williams 증후군; Wildon 질환; 그리고 Zellweger 증후군이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
"대사 질환"은 예로써, 인슐린 내성, 당뇨병, 비만, 내당능 장애, 높은 혈중 콜레스테롤, 고혈당증, 이상지질혈증 및 고지질혈증을 비롯하여, 내분비계의 광범위한 질환과 장애를 지칭한다.
"염증"은 전신 염증성 이상 및 단핵세포, 백혈구 및/또는 호중구의 이동 및 견인과 국소적으로 관련된 이상을 지칭한다. 염증의 실례에는 병원성 유기체(그람-양성 세균, 그람-음성 세포, 바이러스, 곰팡이 그리고 원생동물문 및 기생충과 같은 기생충 포함)에 의한 감염, 이식 거부 (신장, 간, 심장, 폐, 또는 각막과 같은 고형 장기의 거부, 그리고 이식편-대-숙주 질환(GVHD)을 비롯한 골수 이식의 거부 포함), 또는 국소화된 만성 또는 급성 자가면역 또는 알레르기 반응으로 인한 염증이 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 자가면역 질환에는 급성 사구체신염; 류마티스성 또는 반응성 관절염; 만성 사구체신염; 염증성 장 질환, 예를 들면, 크론병, 궤양성 대장염 그리고 괴사성 전장염; 과립구 주입 관련 증후군; 염증성 피부질환, 예를 들면, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 건선; 전신 홍반성 루프스(SLE), 자가면역 갑상선염, 다발성 경화증, 그리고 일부 형태의 당뇨병, 또는 환자의 자기 면역계에 의한 공격이 병인성 조직 파괴를 야기하는 임의의 기타 자가면역 질환이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 알레르기 반응에는 알레르기 천식, 만성 기관지염, 급성 그리고 지연된 과민성이 포함된다. 전신 염증성 질환 상태에는 외상, 화상, 허혈 사건 (가령, 심근경색 및 발작을 비롯하여 심장, 뇌, 내장 또는 말초 맥관에서 혈전 사건) 이후에 재관류, 폐혈증, ARDS 또는 다발성 장기부전 증후군과 관련된 염증이 포함된다. 염증성 세포 모집은 또한 죽상경화성 플라크에서도 발생한다. 염증에는 비-호지킨 림프종, 베게너 육아종증, 하시모토 갑상선염, 간세포 암종, 흉선 위축, 만성 췌장염, 류마티스성 관절염, 반응성 림프 비후증, 골관절염, 궤양성 대장염, 유두상 암종, 크론병, 궤양성 대장염, 급성 담낭염, 만성 담낭염, 간경변, 만성 타액선염, 복막염, 급성 췌장염, 만성 췌장염, 만성 위염, 자궁선근종, 자궁내막증, 급성 자궁경관염, 만성 자궁경관염, 림프 비후, 다발성 경화증, 특발성 혈소판 감소 자색반병에 부차적인 비대, 일차성 IgA 신증, 전신성 홍반성 루프스, 건선, 폐기종, 만성 신우신염, 그리고 만성 방광염이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
심혈관 질환이나 장애는 허혈을 일으킬 수 있는, 또는 심장의 재관류에 의해 유발되는 질환을 포함한다. 실례에는 죽상동맥경화증, 관상 동맥 질환, 육아종성 심근염, 만성 심근염 (비-육아종성), 일차성 비대성 심근증, 말초 동맥 질환 (PAD), 발작, 협심증, 심근 경색, 심장 마비에 의한 심혈관 조직 손상, 심폐 바이패스에 의해 유발된 심혈관 조직 손상, 심장 쇼크, 그리고 ADAM 활성화와 관련된 조직 손상이 포함되지만 이에 국한되지 않는, 당업자에게 공지되거나, 또는 심장 또는 맥관구조의 부전 또는 조직 손상을 수반하는 관련된 이상이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. CVS 질환에는 죽상동맥경화증, 육아종성 심근염, 심근 경색, 판 모양의 심장 질환에 부차적인 심근 섬유증, 경색 없는 심근 섬유증, 일차성 비대성 심근증, 그리고 만성 심근염 (비-육아종증)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
폴리뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드 조성물 및 분자
표적: 한 구체예에서, 이들 표적은 제한 없이 시르투인 (SIRT)와 연관된 센스 및/또는 안티센스 비-코딩 및/또는 코딩 서열을 비롯하여, 시르투인 (SIRT)의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 이들 표적은 제한 없이, SIRT1 유전자와 연관된 센스 및/또는 안티센스 비코딩 및/또는 코딩 서열을 비롯한 SIRT1의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 이들 표적은 제한 없이, SIRT2 유전자와 연관된 센스 및/또는 안티센스 비코딩 및/또는 코딩 서열을 비롯한 SIRT2의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 이들 표적은 제한 없이, SIRT3 유전자와 연관된 센스 및/또는 안티센스 비코딩 및/또는 코딩 서열을 비롯한 SIRT3의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 이들 표적은 제한 없이, SIRT4 유전자와 연관된 센스 및/또는 안티센스 비코딩 및/또는 코딩 서열을 비롯한 SIRT4의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 이들 표적은 제한 없이, SIRT5 유전자와 연관된 센스 및/또는 안티센스 비코딩 및/또는 코딩 서열을 비롯한 SIRT5의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 이들 표적은 제한 없이, SIRT6 유전자와 연관된 센스 및/또는 안티센스 비코딩 및/또는 코딩 서열을 비롯한 SIRT6의 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 이들 표적은 제한 없이, SIRT7 유전자와 연관된 센스 및/또는 안티센스 비코딩 및/또는 코딩 서열을 비롯한 SIRT7의 핵산 서열을 포함한다.
"SIRT1 단백질"은 시르투인 탈아세틸라아제의 sir2 패밀리의 구성원을 지칭한다. 한 구체예에서, SIRT1 단백질에는 효모 Sir2 (GenBank Accession No. P53685), 꼬마 선충 Sir-2.1 (GenBank Accession No. NP.sub.--501912), 인간 SIRT1 (GenBank Accession No. NM.sub.--012238과 NP.sub.--036370 (또는 AF083106))이 포함된다.
SIRT1 "시르투인"은 SIR2 도메인을 포함하는 단백질인데, 상기 도메인은 Pfam 패밀리 "SIR2"- PF02146 (부록에 첨부됨)에서 히트 (hit)로서 채점되는 아미노산 서열로서 정의된다. 이러한 패밀리는 INTERPRO 데이터베이스 내에 INTERPRO 기재사항 (엔트리 IPR003000)에서 언급된다. 단백질 서열 내에 "SIR2" 도메인의 존재를 확인하고, 그리고 목적되는 폴리펩티드 또는 단백질이 특정한 프로필을 갖는 지를 결정하기 위해, 상기 단백질의 아미노산 서열은 디폴트 파라미터를 이용하여 HMM의 Pfam 데이터베이스 (가령, Pfam 데이터베이스, 공개 9)에 대해 검색될 수 있다 (http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/HMM_search). SIR2 도메인은 Pfam에서 PF02146로서 색인되고, 그리고 INTERPRO에서 INTERPRO 기재사항 (엔트리 IPR003000)으로서 색인된다. Pfam 데이터베이스에 관한 설명은 "The Pfam Protein Families Database" Bateman A et al. (2002) Nucleic Acids Research 30(l):276-280 및 Sonhammer et al. (1997) Proteins 28(3):405-420에서 찾아볼 수 있고, 그리고 HMM에 관한 상세한 설명은 예로써, Gribskov et al. (1990) Meth. Enzymol. 183:146-159; Gribskov et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4355-4358; Krogh et al. (1994) J. Mol. Biol. 235:1501-1531; 그리고 Stultz et al. (1993) Protein Sci. 2:305-314에서 찾아볼 수 있다.
미토콘드리아 시르투인 중에서, SIRT3은 가장 강력한 탈아세틸라아제 활성을 갖는다. 실제로, 훨씬 높은 수준의 미토콘드리아 단백질 아세틸화가 SIRT4 또는 SIRT5 녹아웃 (knockout) 동물에서와 비교하여, SIRT3-null 생쥐의 간에서 검출되었다. 하지만, 다수의 SIRT3 기질 및 공동-침전 단백질: 아세틸-CoA 합성효소 2, Ku70, FOXO3a, 미토콘드리아 복합체 I의 아단위 9 (NDUFA9), 글루타민산염 탈수소효소 및 이소시트르산 탈수소효소 2가 확인되었다는 사실에도 불구하고, SIRT3의 생리학적 역할에 관해 알려진 바가 거의 없다.
SIRT3은 주요 미토콘드리아 탈아세틸라아제이다. 미토콘드리아 단백질은 SIRT3 녹아웃 생쥐에서 과아세틸화를 보이지만, SIRT4 또는 SIRT5 녹아웃 생쥐에서는 그렇지 않다. 아세테이트를 아세틸-CoA로 전환시키는 미토콘드리아 효소인 아세틸-CoA 합성효소 2 (AceCS2)는 확인된 SIRT3의 첫 번째 미토콘드리아 기질이다. SIRT3에 의한 리신 642에서 AceCS2의 탈아세틸화는 아세틸-CoA 합성효소 활성을 활성화시키고, 3카르복실산 회로 (tricarboxylic acid cycle) 내로 증가된 아세틸-CoA를 제공한다. 에너지 생산에 관여하는 다른 미토콘드리아 단백질, 글루타민산염 탈수소효소 (GDH)는 SIRT3에 의해 탈아세틸화된다. GDH는 또한, SIRT4에 의해 ADP-리보실화되어 효소 활성이 감소한다. 이것은 SIRT3이 세포 대사 (cell metabolism)에서 중요한 역할을 수행할 수 있다는 것을 지시한다. SIRT3은 또한, 선택적 아폽토시스 경로 (selective apoptosis pathway) 및 세포 성장 제어에 관여하는 것으로 밝혀졌다. SIRT3 및 SIRT4는 세포 생존에 관련된 NAD+ 수준을 조절하는 NAD+ 구조 경로에 관여하지만, SIRT5는 그렇지 않다. 이에 더하여, hSIRT3 유전자에서 변동성은 인간 장수와 연관된다.
침묵 정보 조절자 (Silent Information Regulator)-2 유전자 (Sir2)는 사카로미세스 세레비시에(S. cerevisiae)에서 염색질의 조절, 유전체 안정성, 그리고 수명과 연관된 NAD-의존성 히스톤 탈아세틸라아제를 인코딩한다. 염색질 침묵을 촉진함으로써, Sir2는 여러 유전자 좌위에서 전사를 저해하고 리보좀 DNA (rDNA) 반복에서 재조합을 억제한다. Sir2에서 돌연변이를 갖는 효모는 rDNA 재조합의 배경에서 증가된 유전체 불안정성을 갖고, 이것은 교대로, 복제 수명 - 이러한 생물체에서 생식 노화의 마커를 단축시킨다. 반대로, rDNA 재조합을 억제하는 Sir2의 여분의 사본은 복제 수명을 증가시킨다. Sir2의 이들 효과는 염색질 조정을 통해 유전체 안정화를 촉진하는 유전자가 생물체 수명, 노화, 그리고 연령-관련된 병리의 조절에 중요한 기여자일 수 있다는 패러다임을 암시한다.
수명 조절에서 Sir2 인자에 대한 보존된 역할과 일관하게, 다세포 생물체 꼬마 선충과 초파리에서 Sir2 단백질의 증가된 활성 역시 수명을 증가시킨다. 하지만, 이들 Sir2 인자는 유전체 안정화와 독립적인 기전을 통해 작동할 수 있고, 그리고 이들의 생리학적 분자 기질은 여전히 불분명하다. 포유동물에는 7가지 Sir2 패밀리 구성원, SIRT1-SIRT7이 존재한다. 이들 SIRT는 포유동물 수명과 노화-관련된 과정의 후보 조절자로서 많은 주목을 받고 있다. 이러한 배경에서, 여러 포유동물 SIRT는 노화-연관된 분자 경로와 질환에 영향을 주는 기능을 갖는다. 하지만, 포유동물 SIRT의 최초 연구들은 사카로미세스 세레비시에(S. cerevisiae) Sir2의 것들과 상이한 생화학적 표적과 세포 기능에 이들 효소를 연관시켰다.
시르투인은 효모 전사 억제자 Sir2p의 동족체이고 세균에서부터 인간에 이르기까지 보존된다. 인간 SIRT4는 미토콘드리아에 국지화한다. SIRT4는 매트릭스 단백질이고, 그리고 미토콘드리아 내로 이입후 아미노산 28에서 절단된다. SIRT4와 공동면역침강하는 단백질의 질량 분광 분석은 인슐린분해 (insulindegrading) 효소 및 ADP/ATP 담체 단백질, ANT2와 ANT3을 확인하였다. SIRT4는 히스톤 탈아세틸라아제 활성을 나타내지 않지만, 히스톤과 소 혈청 알부민에서 효과적인 ADP-리보실전이효소로서 기능한다. SIRT4는 랑게르한스 섬에서 발현되고 인슐린-발현 β 세포와 공동으로 국지화한다. 인슐린-생산 INS-1E 세포로부터 SIRT4의 고갈은 글루코오스에 응하여 증가된 인슐린 분비를 유발한다.
SIRT5로 알려져 있는 시르투인 (침묵 교배 타입 정보 조절 2 동족체) 5 (사카로미세스 세레비시에(S. cerevisiae))은 인간에서 SIRT5 유전자에 의해, 그리고 다른 종에서 Sirt5 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. 이러한 유전자는 효모 Sir2 단백질에 동족체인 단백질의 시르투인 패밀리의 구성원을 인코딩한다. 시르투인 패밀리의 구성원은 시르투인 코어 도메인으로 특징되고, 그리고 4가지 부류로 분류된다. 인간 시르투인의 기능은 아직 확증되지 않았다; 하지만, 효모 시르투인 단백질은 이소성 유전자 침묵을 조절하고 rDNA의 재조합을 억제하는 것으로 알려져 있다. 여러 연구에서는 인간 시르투인이 모노-ADP-리보실전이효소 활성을 갖는 세포내 조절 단백질로서 기능할 수 있다는 것을 암시한다. 이러한 유전자에 의해 인코딩된 단백질은 시르투인 패밀리의 부류 III에 포함된다. 이러한 유전자의 대안적 절단접합 (alternative splicing)은 2가지 전사체 변이체를 유발한다.
포유동물 SIRT6 유전자가 결여된 생쥐의 산출은 수명의 조절, 염색질, 그리고 유전체 안정성을 연관시킴에 있어서 SIRT6의 잠재적 역할을 노출시켰다. 이러한 배경에서, 생쥐에서 SIRT6 결여는 극적으로 단축된 수명 및 급성 퇴행성 표현형을 유발하고, 이것은 조기 노화의 병리와 중복된다. 게다가, SIRT6 녹아웃 생쥐 세포는 유전체 불안정성 및 DNA 손상 과민성을 갖는다. 생화학적 분별 검정에서, SIRT6 단백질은 염색질-농축된 세포 분획물과 우선적으로 결합한다. 종합하면, 이들 관찰 결과는 SIRT6이 염색질 조절을 DNA 수복과 결부시킬 수도 있음을 암시하였다. 하지만, 이런 과정에서 SIRT6에 대한 생리학적 역할은 아직 확증되지 않았다.
효모 Sir2의 동족체인 포유동물 시르투인 (SIRT1-7)은 최근에, 중요한 대사 경로의 제어뿐만 아니라 아폽토시스, 스트레스 반응, DNA 수복, 세포 주기, 유전체 안정성 및 유전자 발현에 관여하는 것으로 제안되었다. 부류 III 히스톤 탈아세틸라아제로 명명된 시르투인은 단백질 탈아세틸라아제/ADP 리보실전이효소이다. 이들 효소는 원핵생물에서 진핵생물에 이르기까지 고도로 보존된다. 이들은 모두, 보존된 NAD-의존성 촉매 코어 도메인을 공유하고, 그리고 그들의 독특한 세포하 국지화에 기여하고, 또한 그들의 촉매 활성을 조절할 수 있는 가변적 N-말단과 C-말단 연장을 나타낸다. 시르투인의 세포하 분포, 기질 특이성 및 세포 기능은 매우 다양하다. SIRT2는 주로 세포질 단백질이고, SIRT3-5는 미토콘드리아 단백질이고, 그리고 SIRT7, -6과 -7은 핵 내에 국지화한다. 효모 Sir2에 가장 밀접하게 관련되고 가장 특성화된 시르투인인 SIRT7은 세포 산화성과 유전독성 스트레스를 조절하는, p53, Ku70, NF-κB 및 forkhead 전사 인자를 비롯한 다수의 기질을 보유한다. SIRT6은 유전체 불안정성과 조로 표현형 (progeroid phenotype)으로부터 세포를 보존함에 있어서 중요한 기능에 관여한다. 게다가, SIRT6은 강력한 자기-ADP-리보실전이효소 활성을 나타내는 유일한 시르투인이다. SIRT7은 핵소체 (nucleolus) 내에 국지화하는 유일한 시르투인이다. RNA Pol I 기구 (machinery)의 아세틸화된 히스톤과 다양한 아세틸화된 성분에서 조사될 때, 탈아세틸라아제 또는 ADP-리보실전이효소 활성을 나타내지 않는 것으로 밝혀졌다. SIRT7의 핵인 (nucleolar) 기능과 관련하여, Ford 등은 SIRT7이 RNA Pol I과의 연계를 거쳐 rDNA 전사의 긍정적 조절일 수 있다고 제안하였다. 이의 과다발현은 rDNA 전사를 증강시키는 반면, 이의 저해는 rDNA 전사를 감소시킨다. 흥미롭게도, SIRT7의 발현은 세포 성장과 긍정적으로 상관된다: SIRT7은 대사 활성 조직, 예를 들면, 간, 비장과 고환에서 풍부하다. 현재까지, SIRT7의 세포 주기 조절 및 rDNA 전사가 억제되는 유사분열 동안 이의 운명에 관한 데이터는 없다.
일부 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT) 집단 구성원과 연관된 질환이나 장애를 예방하거나 치료하는데 이용된다. 안티센스 화합물을 이용하여 획득된 줄기 세포로부터 재생된 세포/조직으로 치료될 수 있는 예시적인 시르투인 (SIRT) 매개된 질환과 장애에는 시르투인의 비정상적 기능 및/또는 발현과 연관된 질환 또는 장애, 암 (가령, 유방암, 결장직장암, CCL, CML, 전립선암), 신경퇴행성 질환 또는 장애 (가령, 알츠하이머병 (AD), 헌팅턴병, 파킨슨병, 근위축성 측색 경화증 (ALS), 다발성 경화증, 그리고 폴리글루타민 집합에 의해 유발되는 질환), 베타-아밀로이드 질환 또는 장애 (가령, 베타-아밀로이드 축적으로 특징되는 질환, 예를 들면, 알츠하이머병), 골격근 질환 (가령, 듀센형 근이영양증, 골격근 위축, 벡커 이영양증, 또는 근긴장성 이영양증); 대사 질환 또는 장애 (가령, 인슐린 내성, 당뇨병, 2형 당뇨병, 비만, 내당능 장애, 신진대사장애, 성인기 발증형 당뇨병, 당뇨성 신증, 고혈당증, 당뇨성 신증, 고콜레스테롤혈증, 이상지질혈증 고지질혈증 및 연령-관련된 대사 질환 등), 손상된 인슐린 조절과 연관된 질환 또는 장애, 신경병증 (가령, 감각성 신경병증, 자율신경계 신경병증, 운동 신경병증, 망막증), 케톤체생성 장애와 연관된 질환 또는 장애, 손상된 에너지 항상성과 연관된 질환 또는 장애, 손상된 아세틸-CoA 합성효소 2 활성과 연관된 질환 또는 장애, 대사 항상성과 연관된 질환 또는 장애, 지질 대사 질환 또는 장애, 손상된 열발생과 연관된 질환 또는 장애, 세포 분열의 손상된 조절과 연관된 질환 또는 장애, 미토콘드리아 기능장애와 연관된 질환 또는 장애, 신경병증 (가령, 감각성 신경병증, 자율신경계 신경병증, 운동 신경병증, 망막증), 섬유증, 염증성 심근증, 심장 비대, 만성 염증, 동맥경화증, 관절염, 치매, 골다공증, 그리고 심혈관 질환 또는 장애, 간 질환 또는 장애 (가령, 알코올 남용 또는 간염, 지방간 질환 등에 기인), 연령-관련된 황반 변성, 골 질환 (가령, 골다공증), 혈액 질환 (가령, 백혈병), 골 재흡수, 연령-관련된 황반 변성, AIDS 관련된 치매, ALS, 안면 신경 마비, 동맥경화증, 심장 질환 또는 장애 (가령, 심부정맥, 만성 울혈성 심부전, 허혈성 뇌졸중, 관상 동맥 질환 및 심근증), 만성 퇴행성 질환 (가령, 심근 질환), 만성 신부전, 2형 당뇨병, 궤양, 백내장, 노안, 사구체신염, 길랑-바레 증후군, 출혈성 뇌졸중, 류마티스성 관절염, 염증성 장 질환, SLE, 크론병, 골관절염, 골다공증, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐렴, 피부 노화, 피부 질환 또는 장애, 요실금, 미토콘드리아 기능장애와 연관된 질환 또는 장애 (가령, 미토콘드리아 근장애, 뇌증, 레베르병, 리이 뇌병증, 피어슨씨병, 젖산증, 미토콘드리아 뇌증, 젖산증과 뇌졸중 유사 증후군 (MELAS) 등), 간 퇴행, 골격근 퇴행, 근육 질환 또는 장애, 염증, 이소성 지질 축적과 연관된 질환 또는 장애, 산화 스트레스와 연관된 질환 또는 장애, 세포 스트레스와 연관된 질환 또는 장애, 뉴런 세포 사멸과 연관된 질환 또는 장애, 노화 또는 원치 않는 세포 상실로 특징되는 기타 질환, 퇴행성 증후군, 암모니아 해독과 연관된 질환 또는 장애, 노화, 종말체 기능장애와 연관된 질환 또는 장애, 손상된 염색질 조절과 연관된 질환 또는 장애, 조기 세포 노화와 연관된 질환 또는 장애, 손상된 SIRT 매개된 DNA 수복과 연관된 질환 또는 장애, 그리고 원치 않는 세포 상실로 특징되는 질환이 포함된다.
시르투인은 예로써, 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입되는 U.S. 특허 출원 공개 제2010/0137345호, "Prophylactic and therapeutic use of sirtuin inhibitors in TNF-alpha mediated pathologies"에서 기술된 바와 같이, TNF-알파 활성을 조절하는 것으로 보고되었다. 구체예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 TNF-알파-매개된 질환 또는 장애를 치료하기 위해 시르투인, 예를 들면, SIRT 6을 조정하는데 이용된다. TNF-알파-매개된 질환 또는 장애에는 예로써, 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis), 동맥경화증, 크론병과 궤양성 대장염을 비롯한 염증성 장 질환 (IBD), 건선 (psoriasis), 건선성 관절염, 또는 류마티스성 관절염, 악액질 (cachexia), 그람-음성 패혈증 (Gram-negative sepsis), 내독소-유도된 쇼크 (endotoxin-induced shock), 폐혈성 쇼크 증후군 (septic shock syndrome), 전신성 염증성 반응 증후군 (systemic inflammatory response syndrome, SIRS) 또는 다발성 장기 부전 (multiple organ dysfunction syndrome, MODS); 및/또는 이식편 대 숙주 질환 (graft versus host disease, GVHD)과 이식된 이종성 (xenogenic) 또는 동종성 (allogeneic) 조직 또는 장기의 거부반응을 비롯한 이식편 대 숙주 병리 (graft versus host pathology); 및/또는 바이러스, 세균 또는 진균 감염 및 원생동물 또는 후생동물 기생충 감염, 바람직하게는 대뇌 말라리아 (cerebral malaria) 또는 수막염구균성 수막염 (meningococcal meningitis)을 비롯한 급성 또는 만성 감염성 또는 기생충성 과정; 및/또는 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 천식, 습진, 두드러기, 접촉성 피부염, 전신성 알레르기 반응 (anaphylaxis)과 아나필락시스 쇼크 (anaphylactic shock), 알레르기 비염 또는 천식을 비롯한 알레르기 질환; 급성 산재성 뇌척수염 (acute disseminated encephalomyelitis, ADEM); 애디슨병 (Addison's disease); 강직성 척추염 (ankylosing spondylitis); 인지질 항체 증후군 (antiphospholipid antibody syndrome, APS); 무형성 빈혈 (aplastic anemia); 동맥경화증; 자가면역성 위염; 자가면역성 간염; 자가면역성 혈소판감소증; 베체트병 (Behcet's disease); 만성 소화 장애증 (coeliac disease); 피부근염; I형 당뇨병; II형 당뇨병; 가족성 지중해열 (familial Mediterranean fever); 가족성 한랭 유발성 자가염증성 증후군 (familial cold-induced autoinflammatory syndrome); 굿파스튜어 증후군 (Goodpasture's syndrome); 통풍 (gout); 가성통풍 (pseudogout); 그레이브스병 (Graves' disease); 귈랑 바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome, GBS); 하시모토병 (Hashimoto's disease); 유전성 주기 열 (hereditary periodic fever); 특발성 혈소판감소성 자색반증 (idiopathic thrombocytopenic purpura); 크론병과 궤양성 대장염을 비롯한 염증성 장 질환 (IBD); 허혈-재관류 손상 (ischemia-reperfusion injury); 가와사키병 (Kawasaki's disease); 혼합결합조직병 (mixed connective tissue disease); 머클 웰스 증후군(Muckle Wells syndrome); 다발성 경화증 (MS); 중증근무력증 (myasthenia gravis); 안구간대경련-근간대경련 증후군(opsoclonus-myoclonus syndrome, OMS); 시신경염 (optic neuritis); 갑상선염 (Ord's thyroiditis); 골관절염; 천포창 (pemphigus); 악성 빈혈 (pernicious anaemia); 결절성다발성동맥염 (polyarteritis nodosa); 다발근육염 (polymyositis); 수술후 또는 외상성 염증; 원발성 담즙성 간경변 (primary biliary cirrhosis); 일차성 점액수종 (primary myxedema); 건선 (psoriasis); 건선성 관절염; 류마티스성 열 (rheumatic fever); 류마티스성 관절염; 라이터 증후군 (Reiter's syndrome); 공피 (scleroderma); 쇼그렌 증후군 (Sjogren's syndrome); 뇌졸중-허혈 (stroke-ischemia); 전신성 홍반성 낭창 ((systemic lupus erythematosus, SLE); 전신형 연소성 류마티스성 관절염 (systemic onset juvenile idiopathic arthritis); 타까야수동맥염 (Takayasu's arteritis); 측두동맥염 (temporal arteritis); 백반 (vitiligo); 온난 자가면역 용혈성 빈혈 (warm autoimmune hemolytic anemia); 그리고 베게너육아종증 (Wegener's granulomatosis)이 포함된다.
다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT)과 연관된 질환 또는 장애를 앓고 있거나, 또는 이러한 질환 또는 장애가 발생할 위험에 처해 있는 환자에서 시르투인 (SIRT)의 정상적인 발현 및/또는 정상적인 기능을 조정한다.
본 발명의 구체예에서, 치료 및/또는 미용 섭생 및 관련된 맞춤 치료가 피부 치료를 필요로 하거나, 또는 피부 치료가 필요하게 되는 질환이 발생할 위험에 처해 있는 개체에 제공된다. 진단은 예로써, 개체의 SIRT 상태에 기초하여 달성될 수 있다. 소정의 조직, 예를 들면, 피부에서 환자의 SIRT 발현 수준은 당업자에게 공지되고 본 명세서에서 기술된 방법에 의해, 예를 들면, PCR 또는 항체-기초된 검출 방법을 이용하여 조직을 분석함으로써 결정될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예는 예로써, 피부에서 SIRT의 발현을 상향 조절하기 위해, SIRT 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 피부 치료 및/또는 미용 적용을 위한 조성물을 제시한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 실례는 서열 번호: 24 내지 127로서 진술된다. 본 발명에 참고문헌으로 편입되는 U.S. 특허 제7,544,497호, "Compositions for manipulating the lifespan and stress response of cells and organisms"에서는 기질에 대한 시르투인 단백질의 Km을 감소시킴으로써 시르투인 활성을 조정하는 작용제에 대한 잠재적 미용적 용도를 기술한다. 구체예에서, 세포는 세포 수명을 증가시키거나, 또는 아폽토시스를 예방하기 위해 본 발명의 올리고뉴클레오티드로 생체내에서 처리된다. 가령, 피부는 피부, 예를 들면, 상피 세포를 본 명세서에서 기술된 바와 같이 처리함으로써 노화, 예를 들면, 주름 발생으로부터 보호될 수 있다. 예시적인 구체예에서, 피부는 본 명세서에서 기술된 바와 같은 SIRT 안티센스 화합물을 포함하는 제약학적 또는 미용적 조성물과 접촉된다. 예시적인 피부 병 또는 피부 질환에는 염증, 일광 손상 또는 자연 노화와 연관되거나 이에 의해 유발되는 질환 또는 장애가 포함된다. 가령, 조성물은 접촉성 피부염 (자극성 접촉성 피부염 및 알레르기성 접촉성 피부염 포함), 아토피성 피부염 (일명, 알레르기성 습진), 자외선 각화증, 각질화 장애 (습진 포함), 수포성 표피박리 질환 (천포창 포함), 박리성 피부염, 지루성 피부염, 홍반 (다형 홍반과 결정성 홍반 포함), 일광 또는 다른 광원에 의해 유발된 손상, 원판상 홍반성 낭창, 피부근염, 피부 암 및 자연 노화의 효과의 예방 또는 치료에서 유용성을 갖는다.
시르투인은 디하이드로테스토스테론-유도된 안드로겐 수용체 신호전달을 간섭하는 것으로 보고되었다 (예로써, 본 발명에 참고문헌으로 편입되는 Fu, et al., 2006, "Hormonal Control of Androgen Receptor Function through SIRT1," Molecular and Cellular Biology 26(21): 8122-8135를 참고한다). 본 발명의 구체예에서, SIRT 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물은 예로써, 두피에서 SIRT의 발현을 상향 조절하고 안드로겐 수용체 신호전달을 저해하여, 대머리 (androgenetic alopecia) (탈모)를 예방한다. 구체예에서, 탈모증을 앓는 환자는 국소 또는 전신 제제가 투여된다. 한 구체예에서, 본 명세서에서 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 국소 약물 투여에 일반적으로 적합한 국소 담체를 내포하고 당분야에 공지된 임의의 이와 같은 물질을 포함하는 국소 제제 내로 통합된다. 국소 담체는 원하는 형태, 예를 들면, 연고, 로션, 크림, 마이크로에멀젼, 겔, 오일, 용액 등으로서 조성물을 제공하도록 선택될 수 있고, 그리고 자연 발생 또는 합성 기원의 물질로 구성될 수 있다. 바람직하게는, 선택된 담체는 국소 제제의 활성 작용제 또는 기타 성분에 부정적인 영향을 주지 않는다. 본 발명에 이용하기 적합한 국소 담체의 실례에는 물, 알코올 및 다른 비독성 유기 용매, 글리세린, 광유, 실리콘, 바셀린, 라놀린, 지방산, 식물성 오일, 파라벤, 왁스 등이 포함된다. 제제는 무색, 무취 연고, 로션, 크림, 마이크로에멀젼과 겔일 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 연고 내로 통합될 수 있고, 이들은 일반적으로, 바셀린 또는 다른 석유 유도체에 전형적으로 기초되는 반고형 제조물이다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 이용되는 특정한 연고 기부 (ointment base)는 최적 약물 전달을 제공할 뿐만 아니라, 바람직하게는 다른 원하는 특징, 예를 들면, 연화성 (emolliency) 등을 제공하는 것이다. 다른 담체 또는 운반제에서처럼, 연고 기부는 비활성, 안정성, 비자극성 및 비감작성이어야 한다. Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co.)에서 설명된 바와 같이, 연고 기부는 4가지 부류로 분류될 수 있다: 유성 기부 (oleaginous base); 유화가능 기부 (emulsifiable base); 에멀젼 기부 (emulsion base); 그리고 물-용해성 기부 (water-soluble base). 유성 연고 기부에는 예로써, 식물성 오일, 동물로부터 획득된 지방, 그리고 석유로부터 획득된 반고형 탄화수소가 포함된다. 흡수성 연고 기부로 알려져 있는 유화가능 연고 기부는 물을 거의 또는 전혀 내포하지 않고, 그리고 예로써, 히드록시스테아린 황산염, 무수성 라놀린 및 친수성 바셀린을 포함한다. 에멀젼 연고 기부는 유중수 (water-in-oil, W/O) 에멀젼 또는 수중유 (oil-in-water, O/W) 에멀젼이고, 그리고 예로써, 세틸 알코올, 글리세릴 모노스테아레이트, 라놀린 및 스테아르산을 포함한다. 예시적인 물-용해성 연고 기부는 다양한 분자량의 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)로부터 제조된다 (참고: Remington's, supra).
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 로션 내로 통합될 수 있고, 이들은 일반적으로, 마찰 없이 피부 표면에 적용되는 제조물이고, 그리고 전형적으로, 활성 작용제를 비롯한 고형 입자가 물 또는 알코올 기부 내에 존재하는 액상 또는 반액상 제조물이다. 로션은 일반적으로, 고체의 현탁액이고, 그리고 수중유 타입의 액상 유질 에멀젼을 포함할 수도 있다. 로션은 더욱 유동성 조성물의 적용의 용이함으로 인하여, 큰 신체 영역 (body area)을 처리하는데 선호되는 제제이다. 일반적으로, 로션 내에 불용성 물질은 미세하게 분할되어야 한다. 로션은 전형적으로, 더욱 우수한 분산을 산출하기 위한 현탁제, 그리고 피부와 접촉 시에 활성 작용제를 국지화시키고 유지하는데 유용한 화합물, 예를 들면, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 등을 내포할 것이다. 본 발명의 방법과 병용되는 예시적인 로션 제제는 친수성 바셀린과 혼합된 프로필렌 글리콜, 예를 들면, 상품명 Aquaphor.sup.RTM (Beiersdorf, Inc., Norwalk, Conn.) 하에 구입될 수 있는 것을 내포한다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 크림 내로 통합될 수 있고, 이들은 일반적으로, 수중유 또는 유중수의 점성 액상 또는 반고형 에멀젼이다. 크림 기부는 물-세척성이고, 그리고 오일 상 (oil phase), 유화제 및 수성 상 (aqueous phase)을 내포한다. 오일 상은 일반적으로, 바셀린 및 지방 알코올, 예를 들면, 세틸 또는 스테아릴 알코올로 구성된다; 수성 상은 반드시 그러한 것은 아니지만 일반적으로, 부피에서 오일 상을 초과하고, 그리고 일반적으로, 습윤제를 내포한다. 상기 Remington에서 설명된 바와 같이, 크림 제제 내에 유화제는 일반적으로, 비이온성, 음이온성, 양이온성 또는 양쪽성 계면활성제이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 마이크로에멀젼 내로 통합될 수 있고, 이들은 일반적으로, 계면활성제 분자의 계면 필름 (interfacial film)에 의해 안정화된 2가지 비혼성 액체, 예를 들면, 오일과 물의 열동력학적으로 안정하고 등방성으로 투명한 분산액이다 (Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (New York: Marcel Dekker, 1992), volume 9). 마이크로에멀젼의 제조를 위해, 계면활성제 (유화제), 보조-계면활성제 (보조-유화제), 오일 상 및 수성 상이 필요하다. 적절한 계면활성제에는 에멀젼의 제조에 유용한 임의의 계면활성제, 예를 들면, 크림의 제조에 전형적으로 이용되는 유화제가 포함된다. 보조-계면활성제 (또는 "보조-유화제")는 일반적으로, 폴리글리세롤 유도체, 글리세롤 유도체 및 지방 알코올의 군에서 선택된다. 바람직한 유화제/보조-유화제 조합은 반드시 그러한 것은 아니지만 일반적으로, 글리세릴 모노스테아레이트와 폴리옥시에틸렌 스테아레이트; 폴리에틸렌 글리콜과 에틸렌 글리콜 팔미토스테아레이트; 그리고 카프릴릭과 카프릭 트리글리세리드와 올레오일 마크로골글리세리드로 구성된 군에서 선택된다. 수성 상은 물뿐만 아니라 전형적으로, 완충액, 글루코오스, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 바람직하게는 더욱 적은 분자량 폴리에틸렌 글리콜 (가령, PEG 300과 PEG 400), 및/또는 글리세롤 등을 포함하는 반면, 오일 상은 일반적으로, 예로써 지방산 에스테르, 변형된 식물성 오일, 실리콘 오일, 모노- 디-와 트리글리세리드의 혼합물, PEG의 모노-와 디-에스테르 (가령, 올레오일 마크로골 글리세리드) 등을 포함할 것이다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 겔 제제 내로 통합될 수 있고, 이들은 전형적으로, 작은 무기 입자로 구성된 현탁액 (2-상 시스템), 또는 담체 액체 전역에 실질적으로 균일하게 분포된 큰 유기 분자 (단일 상 겔)로 구성되는 반고형 시스템이다. 단일 상 겔은 예로써, 활성 작용제, 담체 액체 및 적절한 겔화제 (gelling agent), 예를 들면, 트래거캔스 (2 내지 5%에서), 나트륨 알기네이트 (2-10%에서), 젤라틴 (2-15%에서), 메틸셀룰로오스 (3-5%에서), 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스 (2-5%에서), 카보머 (0.3-5%에서) 또는 폴리비닐 알코올 (10-20%에서)을 서로 합동시키고, 그리고 특징적인 반고형 산물이 생산될 때까지 혼합함으로써 만들어질 수 있다. 다른 적절한 겔화제에는 메틸히드록시셀룰로오스, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌, 히드록시에틸셀룰로오스 및 젤라틴이 포함된다. 비록 겔이 수성 담체 액체를 통상적으로 이용하지만, 알코올과 오일 역시 담체 액체로서 이용될 수 있다.
당업자에게 공지된 다양한 첨가제가 제제, 예를 들면, 국소 제제 내에 포함될 수 있다. 첨가제의 실례에는 용해제, 피부 침투 개선제, 불투명화제, 보존제 (가령, 항산화제), 겔화제, 완충제, 계면활성제 (특히, 비이온성과 양쪽성 계면활성제), 유화제, 연화제, 농후제, 안정제, 습윤제, 착색제, 방향제 등이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 유화제, 연화제 및 보존제와 함께, 용해제 및/또는 피부 침투 개선제의 포함이 특히 바람직하다. 최적 국소 제제는 대략 2 wt. % 내지 60 wt. %, 바람직하게는 2 wt. % 내지 50 wt. %, 용해제 및/또는 피부 침투 개선제; 2 wt. % 내지 50 wt. %, 바람직하게는 2 wt. % 내지 20 wt. %, 유화제; 2 wt. % 내지 20 wt. % 연화제; 그리고 0.01 내지 0.2 wt. % 보존제를 포함하고, 활성 작용제와 담체 (가령, 물)가 제제의 나머지를 구성한다.
피부 침투 개선제는 파손되지 않은 피부의 합리적인 크기의 영역을 통과하는 치료 수준의 활성 작용제의 통과를 용이하게 하는 역할을 한다. 적절한 개선제는 당분야에 공지되어 있고, 여기에는 예로써 저급 알칸올, 예를 들면, 메탄올, 에탄올과 2-프로판올; 알킬 메틸 설폭시드, 예를 들면, 디메틸설폭시드 (DMSO), 데실메틸설폭시드 (C.sub.10 MSO) 및 테트라데실메틸 설폭시드; 피롤리돈, 예를 들면, 2-피롤리돈, N-메틸-2-피롤리돈 및 N-(-히드록시에틸)피롤리돈; 요소; N,N-디에틸-m-톨루아미드; C.sub.2-C.sub.6 알칸디올; 기타 용매, 예를 들면, 디메틸 포름아미드 (DMF), N,N-디메틸아세트아미드 (DMA) 및 테트라히드로푸르푸릴 알코올; 그리고 1-치환된 아자시클로헵탄-2-온, 특히 1-n-도데실시클라자시클로헵탄-2-온 (laurocapram; Whitby Research Incorporated (Richmond, Va.)로부터 상품명 Azone.sup.RTM으로 구입가능)이 포함된다.
용해제의 실례에는 하기가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다: 친수성 에테르, 예를 들면, 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 (에톡시디글리콜, Transcutol.sup.RTM으로서 상업적으로 구입가능) 및 디에틸렌 글리콜 모노에틸 에테르 올레산염 (Soficutol.sup.RTM로서 상업적으로 구입가능); 폴리에틸렌 피미자유 유도체, 예를 들면, 폴리옥시 35 피마자유, 폴리옥시 40 경화된 피마자유 등; 폴리에틸렌 글리콜, 특히 더욱 적은 분자량 폴리에틸렌 글리콜, 예를 들면, PEG 300과 PEG 400, 그리고 폴리에틸렌 글리콜 유도체, 예를 들면, PEG-8 카프릴릭/카프릭 글리세리드 (Labrasol.sup.RTM으로서 상업적으로 구입가능); 알킬 메틸 설폭시드, 예를 들면, DMSO; 피롤리돈, 예를 들면, 2-피롤리돈 및 N-메틸-2-피롤리돈; 그리고 DMA. 많은 용해제는 또한, 흡수 개선제 (absorption enhancer)로서 기능할 수 있다. 단일 용해제가 제제 내로 통합되거나, 또는 용해제의 혼합물이 제제 내로 통합될 수 있다.
적절한 유화제와 보조-유화제에는 제한 없이, 마이크로에멀젼 제제에 대하여 기술된 유화제와 보조-유화제가 포함된다. 연화제에는 예로써, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 이소프로필 미리스테이트, 폴리프로필렌 글리콜-2 (PPG-2) 미리스틸 에테르 프로피오네이트 등이 포함된다.
다른 활성 작용제, 예를 들면, 다른 소염제, 진통제, 항균제, 항진균제, 항생제, 비타민, 항산화제, 그리고 안트라닐산염, 벤조페논 (특히, 벤조페논-3), 장뇌 유도체, 계피산염 (가령, 옥틸 메톡시계피산염), 디벤조일 메탄 (가령, 부틸 메톡시디벤조일 메탄), p-아미노벤조산 (PABA)과 이의 유도체, 그리고 살리실산염 (가령, 옥틸 살리실산염)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는, 일광차단제 제제에서 통상적으로 발견되는 자외선 방지제 (sunblock agent) 역시 제제 내에 포함될 수 있다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT)의 폴리뉴클레오티드에 특이적이고, 여기에는 제한 없이 비-코딩 영역이 포함된다. 시르투인 (SIRT) 표적은 시르투인 (SIRT)의 변이체; SNP를 비롯한 시르투인 (SIRT)의 돌연변이체; 시르투인 (SIRT)의 비-코딩 서열; 대립유전자, 단편 등을 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 분자이다.
본 발명의 구체예에 따라서, 표적 핵산 분자는 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드 단독에 한정되지 않고 시르투인 (SIRT)의 임의의 동종형, 수용체, 동족체, 비-코딩 영역 등으로 확장된다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 제한 없이 시르투인 (SIRT) 표적의 변이체, 대립유전자, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 상보성 서열을 비롯하여, 이들 표적의 자연 안티센스 서열 (코딩과 비-코딩 영역에 자연 안티센스)을 표적으로 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA 또는 DNA 분자이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 올리고머 화합물에는 상기 화합물 내에서 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 상이한 염기가 존재하는 변이체 역시 포함된다. 가령, 첫 번째 뉴클레오티드가 아데닌이면, 상기 위치에서 티미딘, 구아노신, 시티딘 또는 다른 자연 또는 비-자연 뉴클레오티드를 보유하는 변이체가 생산될 수 있다. 이는 안티센스 화합물의 임의의 위치에서 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 안티센스 화합물 및 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 50% 내지 대략 60%이다. 일부 구체예에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 60% 내지 대략 70%이다. 일부 구체예에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 70% 내지 대략 80%이다. 일부 구체예에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 80% 내지 대략 90%이다. 일부 구체예에서, 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 90%, 대략 92%, 대략 94%, 대략 95%, 대략 96%, 대략 97%, 대략 98%, 대략 99% 또는 대략 100%이다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 상기 화합물의 결합이 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 활성의 상실을 유발하고, 그리고 특정한 결합이 요망되는 조건 하에, 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있을 만큼 충분한 정도의 상보성이 존재할 때, 특이적으로 혼성화가능하다. 이런 조건에는 예로써, 생체내 분석 또는 치료적 처리의 경우에 생리학적 조건, 그리고 시험관내 분석의 경우에 이들 분석이 수행되는 조건이 포함된다.
안티센스 화합물은 DNA, RNA, 키메라, 치환된 등인 지에 상관없이, 표적 DNA 또는 RNA 분자에 상기 화합물의 결합이 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 간섭하여 유용성의 상실을 유발하고, 그리고 특정한 결합이 요망되는 조건, 다시 말하면, 생체내 분석 또는 치료적 처리의 경우에 생리학적 조건, 그리고 시험관내 분석의 경우에 이들 분석이 수행되는 조건 하에, 비-표적 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있을 만큼 충분한 정도의 상보성이 존재할 때, 특이적으로 혼성화가능하다.
다른 구체예에서, 제한 없이, 예로써 PCR, 혼성화 등을 이용하여 확인되고 확장되는 안티센스 서열, 서열 번호: 9 내지 23, 141 내지 143으로서 진술된 하나 이상의 서열 등을 비롯한 시르투인 (SIRT)의 표적화는 시르투인 (SIRT)의 발현 또는 기능을 조정한다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 대조와 비교하여 상향 조절된다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 대조와 비교하여 하향 조절된다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 예로써 PCR, 혼성화 등을 이용하여 확인되고 확장되는 안티센스 서열을 비롯하여, 서열 번호: 24 내지 127로서 진술된 핵산 서열을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더욱 짧은 또는 더욱 긴 단편, 변형된 결합 등을 포함할 수 있다. 변형된 결합 또는 뉴클레오티드간 연쇄의 실례에는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등이 포함된다. 다른 구체예에서, 뉴클레오티드는 인 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드 내에서 당 또는 당 유사체 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 포스페이트 기)는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스페이트, 알칸포스페이트, 포스포로티오에이트 등일 수 있다. 앞서 언급된 포스페이트 유사체의 제조, 그리고 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 내로 그들의 통합은 그 자체로, 공지되어 있고 본 명세서에서 기술될 필요가 없다.
안티센스의 특이성 및 민감성 역시 치료 용도를 위하여 당업자에 의해 이용된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 동물 및 인간에서 질환 상태의 치료에서 치료 모이어티로서 이용되고 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간에 안전하고 효과적으로 투여되고 있고, 그리고 다수의 임상 시험이 현재 진행 중에 있다. 따라서 올리고뉴클레오티드는 세포, 조직 및 동물, 특히 인간의 치료를 위한 치료 섭생에서 유용하도록 형성될 수 있는 유용한 치료 양식 (therapeutic modality)일 수 있는 것으로 확립된다.
본 발명의 구체예에서, 올리고머 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산 분자에 결합하고 표적 유전자에 의해 인코딩된 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다. 간섭되는 DNA의 기능에는 예로써, 복제 및 전사가 포함된다. 간섭되는 RNA의 기능에는 예로써, RNA의 단백질 번역 부위로의 전좌, RNA로부터 단백질의 번역, 하나 이상의 mRNA 종을 산출하기 위한 RNA의 절단접합, 그리고 RNA에 관련되거나 RNA에 의해 촉진될 수 있는 촉매 활성과 같은 생명 유지에 필요한 모든 기능이 포함된다. 이들 기능은 요망되는 기능에 따라서, 상향 조절되거나 저해될 수 있다.
안티센스 화합물에는 안티센스 올리고머 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 외부 가이드 서열 (external guide sequence, EGS) 올리고뉴클레오티드, 교대 접합기 (alternate splicer), 프라이머, 프로브, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 혼성화되는 다른 올리고머 화합물이 포함된다. 따라서 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 부분적으로 단일-가닥, 또는 원형 올리고머 화합물의 형태로 도입될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 특정 핵산 분자에 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 과정일 수 있다. 이러한 과정은 통상적으로, 기능이 조절되어야 하는 표적 핵산의 확인으로 시작된다. 표적 핵산은 예로써, 발현이 특정 장애 또는 질환 상태, 또는 감염성 병원체로부터 핵산 분자와 연관되는 세포 유전자 (또는 상기 유전자로부터 전사된 mRNA)일 수 있다. 본 발명에서, 표적 핵산은 시르투인 (SIRT)를 인코딩한다.
표적화 과정은 통상적으로, 요망되는 효과, 예를 들면, 발현의 조정이 결과되도록 안티센스 상호작용이 발생하는 표적 핵산 내에서 최소한 하나의 표적 영역, 분절, 또는 부위의 결정 역시 포함한다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "영역"은 최소한 하나의 확인가능 구조, 기능, 또는 특징을 갖는 표적 핵산의 부분으로서 정의된다. 분절은 표적 핵산의 영역 내에 있다. "분절"은 표적 핵산 내에 영역의 더욱 작은 또는 하위 부분으로서 정의된다. 본 발명에서, "부위"는 표적 핵산 내에 위치로서 정의된다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT)의 자연 안티센스 서열에 결합하고 시르투인 (SIRT) (서열 번호: 1 내지 23 및 133 내지 143)의 발현 및/또는 기능을 조정한다. 안티센스 서열의 실례에는 서열 번호: 24 내지 127이 포함된다.
다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 분절에 결합하고 시르투인 (SIRT)의 발현 및/또는 기능을 조정한다. 이들 분절은 시르투인 (SIRT) 센스 또는 안티센스 폴리뉴클레오티드의 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드를 포함한다.
다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT)의 자연 안티센스 서열에 특이적이고, 여기서 시르투인 (SIRT)의 자연 안티센스 서열에 올리고뉴클레오티드의 결합은 시르투인 (SIRT)의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 화합물은 예로써, PCR, 혼성화 등을 이용하여 확인되고 확장되는 안티센스 서열, 서열 번호: 24 내지 127로서 진술된 서열을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더욱 짧은 또는 더욱 긴 단편, 변형된 결합 등을 포함할 수 있다. 변형된 결합 또는 뉴클레오티드간 연쇄의 실례에는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등이 포함된다. 다른 구체예에서, 뉴클레오티드는 인 유도체를 포함한다. 본 발명의 변형된 올리고뉴클레오티드 내에서 당 또는 당 유사체 모이어티에 부착될 수 있는 인 유도체 (또는 변형된 포스페이트 기)는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스페이트, 알칸포스페이트, 포스포로티오에이트 등일 수 있다. 앞서 언급된 포스페이트 유사체의 제조, 그리고 뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 내로 그들의 통합은 그 자체로, 공지되어 있고 본 명세서에서 기술될 필요가 없다.
당분야에 공지된 바와 같이, 번역 개시 코돈이 전형적으로, 5'-AUG (전사된 mRNA 분자에서; 상응하는 DNA 분자에서 5'-ATG)이기 때문에, 상기 번역 개시 코돈은 "AUG 코돈", "시작 코돈", 또는 "AUG 시작 코돈"으로도 지칭된다. 소수의 유전자는 RNA 서열 5'-GUG, 5'-UUG 또는 5'-CUG를 갖는 번역 개시 코돈을 보유한다; 그리고 5'-AUA, 5'-ACG 및 5'-CUG는 생체내에서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 따라서 용어 "번역 개시 코돈" 및 "시작 코돈"은 각 경우에 개시자 아미노산이 전형적으로, 메티오닌 (진핵생물에서) 또는 포르밀메티오닌 (원핵생물에서)이긴 하지만, 많은 코돈 서열을 포함할 수 있다. 진핵 및 원핵 유전자는 2개 이상의 대안적 시작 코돈을 보유할 수도 있는데, 이들 중에서 임의의 하나가 특정 세포 유형 또는 조직에서, 또는 특정한 일단의 조건 하에 번역 개시에 우선적으로 이용될 수 있다. 본 발명의 맥락에서, "시작 코돈" 및 "번역 개시 코돈"은 이런 코돈의 서열(들)에 상관없이, 시르투인 (SIRT)를 인코딩하는 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역을 개시하기 위하여 생체내에서 이용되는 코돈(들)을 지칭한다. 유전자의 번역 종결 코돈 (또는 "종결 코돈")은 3가지 서열, 다시 말하면, 5'-UAA, 5'-UAG 및 5'-UGA (상응하는 DNA 서열은 각각, 5'-TAA, 5'-TAG 및 5'-TGA이다) 중에서 하나를 가질 수 있다.
용어 "시작 코돈 영역" 및 "번역 개시 코돈 영역"은 번역 개시 코돈으로부터 어느 한쪽 방향 (즉, 5' 또는 3')으로 대략 25개 내지 대략 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 이런 mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 유사하게, 용어 "종결 코돈 영역" 및 "번역 종결 코돈 영역"은 번역 종결 코돈으로부터 어느 한쪽 방향 (즉, 5' 또는 3')으로 대략 25개 내지 대략 50개 연속 뉴클레오티드를 포함하는 이런 mRNA 또는 유전자의 일부분을 지칭한다. 결과적으로, "시작 코돈 영역" (또는 "번역 개시 코돈 영역") 및 "종결 코돈 영역" (또는 "번역 종결 코돈 영역")은 본 발명의 안티센스 화합물로 효과적으로 표적화될 수 있는 최대 영역이다.
당분야에서 번역 개시 코돈 및 번역 종결 코돈 사이에 영역을 지칭하는 것으로 알려져 있는 개방 해독틀 (ORF) 또는 "코딩 영역" 역시 효과적으로 표적화될 수 있는 영역이다. 본 발명의 맥락에서, 표적화된 영역은 유전자의 개방 해독틀 (ORF)의 번역 개시 또는 종결 코돈을 포함하는 유전자내 (intragenic) 영역이다.
다른 표적 영역에는 당분야에서 번역 개시 코돈으로부터 5' 방향으로 mRNA의 일부분을 지칭하는 것으로 알려져 있고, 따라서 mRNA (또는 유전자 상에서 상응하는 뉴클레오티드)의 5' 캡 부위 및 번역 개시 코돈 사이에 뉴클레오티드를 포함하는 5' 비번역 영역 (5'UTR)이 포함된다. 또 다른 표적 영역에는 당분야에서 번역 종결 코돈으로부터 3' 방향으로 mRNA의 일부분을 지칭하는 것으로 알려져 있고, 따라서 mRNA (또는 유전자 상에서 상응하는 뉴클레오티드)의 번역 종결 코돈 및 3' 말단 사이에 뉴클레오티드를 포함하는 3' 비번역 영역 (3'UTR)이 포함된다. mRNA의 5' 캡 부위는 5'-5' 트리포스페이트 연쇄를 통하여 상기 mRNA의 5'-최말단 잔기에 결합된 N7-메틸화된 구아노신 잔기를 포함한다. mRNA의 5' 캡 영역은 캡 부위에 인접한 첫 50개의 뉴클레오티드뿐만 아니라 5' 캡 구조 자체를 포함하는 것으로 간주된다. 본 발명을 위한 다른 표적 영역은 5' 캡 영역이다.
SIRT1의 다른 표적 영역은 안티센스 전사체 CV396200의 뉴클레오티드 65 내지 85, 그리고 221 내지 253을 포함한다. 구체예에서, SIRT1 폴리뉴클레오티드의 기능 및/또는 발현을 조정하는 방법은 세포 또는 조직을 이들 영역 중에서 하나 또는 그 이상을 표적으로 하는 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 부분적으로 또는 전체적으로 접촉시키는 단계를 포함한다. 일정한 구체예에서, 이들 영역 중에서 하나 또는 그 이상을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 그리고 다른 시르투인을 표적으로 하는 하나 또는 그 이상의 안티센스 전사체의 조합이 이용된다. 구체예에서, SIRT의 상이한 영역을 표적으로 하는 복수의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 공동으로 이용되거나, 또는 하나 또는 그 이상의 상이한 시르투인을 표적으로 하는 복수의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 공동으로 투여된다.
일부 진핵 mRNA 전사체는 직접적으로 번역되지만, 대부분은 "인트론"으로 알려져 있는 하나 이상의 영역을 포함하는데, 이들은 번역되기 전에 전사체로부터 잘려나간다. 나머지 (따라서 번역된) 영역은 "엑손"으로 알려져 있으며, 함께 절단접합되어 연속 mRNA를 형성한다. 한 구체예에서, 절단접합 부위, 다시 말하면, 인트론-엑손 접합 또는 엑손-인트론 접합 부위를 표적으로 하는 것은 이상 절단접합이 질환에 연관되거나, 또는 특정 절단접합 산물의 과다 생산이 질환과 연관되는 상황에서 특히 유용하다. 재배열 또는 결실로 인한 이상 융합 접합은 표적 부위의 다른 구체예이다. 상이한 유전자 소스로부터 2개 (또는 그 이상)의 mRNA의 절단접합 과정을 통하여 생산된 mRNA 전사체는 "융합 전사체"로 알려져 있다. 인트론은 예로써, DNA 또는 pre-mRNA를 표적으로 하는 안티센스 화합물을 이용하여 효과적으로 표적화될 수 있다.
다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 표적 폴리뉴클레오티드의 코딩 및/또는 비-코딩 영역에 결합하고 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 자연 안티센스 폴리뉴클레오티드에 결합하고 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
다른 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 센스 폴리뉴클레오티드에 결합하고 표적 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
대안적 RNA 전사체는 DNA의 동일한 게놈 영역으로부터 만들어질 수 있다. 이들 대안적 전사체는 일반적으로 "변이체"로 알려져 있다. 더욱 특이적으로, "pre-mRNA 변이체"는 그들의 시작 또는 종결 위치에서 동일한 게놈 DNA로부터 만들어진 다른 전사체와 상이하며 인트론 및 엑손 서열을 모두 포함하는 동일한 게놈 DNA로부터 생산된 전사체이다.
절단접합 동안 하나 이상의 엑손 또는 인트론 영역, 또는 이들의 일부분을 잘라낼 때, pre-mRNA 변이체는 더욱 작은 "mRNA 변이체"를 만든다. 결과적으로, mRNA 변이체는 가공된 pre-mRNA 변이체이고, 각 독특한 pre-mRNA 변이체는 절단접합의 결과로 독특한 mRNA 변이체를 항상 만들어낸다. 이와 같은 mRNA 변이체는 또한 "대안적 절단접합 변이체들"로 알려져 있다. pre-mRNA 변이체의 절단접합이 발생되지 않으면, pre-mRNA 변이체는 mRNA 변이체와 동일하게 된다.
변이체는 전사의 시작 또는 종결에 대한 대안적 신호를 이용하여 만들어질 수 있다. Pre-mRNA 및 mRNA는 하나 이상의 시작 코돈 또는 종결 코돈을 보유할 수 있다. 대안적 시작 코돈을 이용하는 pre-mRNA 또는 mRNA으로부터 기원하는 변이체는 pre-mRNA 또는 mRNA의 "대안적 시작 변이체"로 알려져 있다. 대안적 종결 코돈을 이용하는 이들 전사체는 pre-mRNA 또는 mRNA의 "대안적 종결 변이체"로 알려져 있다. 대안적 종결 변이체중 한 가지 특정 유형은 "폴리A 변이체"이며, 여기서 만들어진 다중 전사체는 전사 기전에 의해 "폴리A 종결 신호"중 하나의 대안적 선별에 기인하고, 따라서 독특한 폴리A 부위에서 종결되는 전사체가 만들어진다. 본 발명의 맥락에서, 본 명세서에서 기술된 변이체의 이들 유형 역시 표적 핵산의 구체예이다.
안티센스 화합물이 혼성화되는 표적 핵산 상의 위치는 활성 안티센스 화합물이 표적화되는 표적 영역의 최소한 5개 뉴클레오티드 길이 부분으로 정의된다.
일정한 예시적인 표적 분절의 특정한 서열이 본 명세서에서 제시되긴 하지만, 당업자는 이들이 본 발명의 범위 내에서 특정 구체예를 예시하고 기술한다는 것을 인지할 것이다. 추가적인 표적 단편은 본 내용을 근거하여 당업자에 의해 용이하게 인지될 수 있다.
예시된 표적 분절로부터 선택된 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드 스트레치를 포함하는 5-100개 뉴클레오티드 길이의 표적 분절은 표적화에도 적합한 것으로 간주된다.
표적 분절은 예시된 표적 분절 중에서 하나의 5'-말단으로부터 최소한 5개 연속 뉴클레오티드 (나머지 뉴클레오티드는 표적 분절의 5' 말단의 직상류에서 시작하고, DNA 또는 RNA가 대략 5 내지 대략 100개 뉴클레오티드를 포함할 때까지 연속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치이다)를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열을 포함할 수 있다. 유사하게, 바람직한 표적 분절은 예시된 표적 분절 중에서 하나의 3'-말단으로부터 최소한 5개 연속 뉴클레오티드 (나머지 뉴클레오티드는 표적 분절의 3' 말단의 직하류에서 시작하고, DNA 또는 RNA가 대략 5 내지 대략 100개 뉴클레오티드를 포함할 때까지 연속되는 동일한 DNA 또는 RNA의 연속 스트레치이다)를 포함하는 DNA 또는 RNA 서열로 대표된다. 본 명세서에 예시된 표적 분절로 무장된 당업자는 과도한 실험 없이, 추가의 표적 분절을 확인할 수 있을 것이다.
일단 하나 이상의 표적 영역, 분절 또는 부위가 확인되면, 표적에 충분한 상보성을 가진, 다시 말하면, 원하는 효과를 제공할 만큼 충분히 잘 혼성화되고 충분한 특이성을 갖는 안티센스 화합물이 선택된다.
본 발명의 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 특정 표적의 안티센스 가닥에 결합한다. 올리고뉴클레오티드는 길이가 최소한 5개 뉴클레오티드이고, 그리고 전체 길이의 표적 뉴클레오티드를 수용하는 올리고뉴클레오티드가 합성되도록 위하여, 각 올리고뉴클레오티드가 중복 서열을 표적으로 하도록 합성될 수 있다. 표적은 또한 코딩뿐만 아니라 비-코딩 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 특정 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의해 표적화된다. 특정 핵산에 안티센스 화합물의 표적화는 다단계 과정이다. 이러한 과정은 통상적으로, 기능이 조정되는 핵산 서열의 확인으로 시작된다. 이는 예로써, 발현이 특정 질환 또는 질환 상태와 연관되는 세포 유전자 (또는 상기 유전자로부터 전사된 mRNA), 또는 비-코딩 RNA (ncRNA)와 같은 비-코딩 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
RNA는 (1) 메신저 RNA (mRNA), 이는 단백질로 번역되고, 그리고 (2) 비-단백질-코딩 RNA (ncRNA)로 분류될 수 있다. ncRNA는 마이크로 RNA, 안티센스 전사체 및 고밀도의 종결 코돈을 포함하고 임의의 광범위한 "개방 해독틀"이 부족한 다른 전사 단위 (TU)를 포함한다. 많은 ncRNA는 단백질-코딩 좌위의 3' 비번역 영역 (3'UTR)에서 개시 부위로부터 시작되는 것으로 보인다. ncRNA는 아주 드물고, 그리고 FANTOM 협회에 의해 서열화된 ncRNA의 최소한 절반은 폴리아데닐화되지 않는 것으로 보인다. 대부분의 조사자들은 분명한 이유로, 가공되고 세포질로 배출되는 폴리아데닐화된 mRNA에 초점을 맞추었다. 최근에, 비-폴리아데닐화된 핵 RNA 세트는 매우 크고, 그리고 이와 같은 많은 전사체가 유전자내 영역 (intergenic region)에서 생성되는 것으로 밝혀졌다. ncRNA가 유전자 발현을 조정할 수 있는 기전은 표적 전사체와의 염기 대합에 의한 것이다. 염기 대합에 의해 기능하는 RNA는 (1) 동일한 유전적 위치에서, 그러나 그들이 작용하는 RNA에 반대 가닥 상에 인코딩되고, 따라서 그들의 표적에 대해 완벽한 상보성을 나타내는 cis-인코딩된 RNA, 그리고 (2) 그들이 작용하는 RNA와는 별개의 염색체 위치에서 인코딩되며, 일반적으로 그들의 표적과 완벽한 염기-대합 잠재력을 나타내지 않는 trans-인코딩된 RNA로 분류될 수 있다.
이론에 한정됨 없이, 본 명세서에서 기술된 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 폴리뉴클레오티드의 혼란은 상응하는 센스 메신저 RNA의 발현을 변경시킬 수 있다. 하지만, 이와 같은 조절은 부조화적(discordant) (안티센스 녹다운은 메신저 RNA 상승을 결과한다) 또는 조화적(concordant) (안티센스 녹다운은 수반되는 메신저 RNA 감소를 결과한다)일 수 있다. 이들 경우에, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 안티센스 전사체의 중복 또는 비-중복 부위로 표적화되어, 이의 녹다운 또는 제거를 초래할 수 있다. 코딩뿐만 아니라 비-코딩 안티센스는 동일한 방식으로 표적화될 수 있고, 그리고 어느 종류든 조화 또는 비조화 방식으로 상응하는 센스 전사체를 조절할 수 있다. 표적에 대항하여 이용되는 새로운 올리고뉴클레오티드를 확인하는데 사용되는 전략은 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 안티센스 RNA 전사체의 녹다운 또는 원하는 표적을 조정하는 임의의 다른 수단에 기초될 수 있다.
전략 1: 부조화적 조절의 경우, 안티센스 전사체의 녹다운은 통상적(센스) 유전자의 발현을 상승시킨다. 후자 유전자가 공지의 또는 가상 약물 표적을 인코딩하면, 이의 안티센스 대응물의 녹다운은 수용체 작동약 또는 효소 자극물질의 작용을 의식적으로 모방할 수 있다.
전략 2: 조화적 조절의 경우, 안티센스 및 센스 전사체 둘 모두를 동시에 녹다운 시킬 수 있고, 따라서 통상의(센스) 유전자 발현의 상승적 감소를 얻을 수 있다. 가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 녹다운을 달성하는데 이용되면, 이러한 전략은 센스 전사체를 표적으로 하는 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 상응하는 안티센스 전사체를 표적으로 하는 다른 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 중복 센스 및 안티센스를 동시에 표적으로 하는 단일 대칭적 안티센스 올리고뉴클레오티드에 적용하는데 이용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 안티센스 화합물들에는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 외부 가이드 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, siRNA 화합물, 단일 또는 이중-가닥 RNA 간섭 (RNAi) 화합물, 예를 들면, siRNA 화합물, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 혼성화되고 이의 기능을 조정하는 기타 올리고머 화합물이 포함된다. 따라서 안티센스 화합물들은 DNA, RNA, DNA-유사, RNA-유사, 또는 이들의 혼합물이거나, 또는 이들 중에서 하나 이상의 모방체일 수 있다. 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물일 수 있고, 그리고 내부 또는 말단 중배 (bulge), 미스매치 또는 루프와 같은 구조적 요소를 포함할 수 있다. 안티센스 화합물은 일과적으로 선형으로 제조되지만, 결합되거나, 또는 원형 및/또는 분지형으로 제조될 수 있다. 안티센스 화합물은 혼성화되면 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하는 2개의 가닥, 또는 혼성화 및 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 가능하게 할 만큼 충분한 자가-상보성을 갖는 단일 가닥과 같은 구조체를 포함할 수 있다. 2개 가닥은 내부에서 연결되어 3' 또는 5' 말단이 자유로운 상태로 남아 있거나, 또는 연결되어 연속적인 헤어핀 구조 또는 루프를 형성할 수 있다. 헤어핀 구조는 단일 가닥 특성의 연장부를 발생시키는 5' 또는 3' 말단 상에 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 이중 가닥 화합물은 선택적으로 이들 말단에 오버행 (overhang)을 포함할 수 있다. 추가 변형에는 말단 중의 한쪽, 선택된 뉴클레오티드 위치, 당 위치, 또는 뉴클레오티드간 연쇄 중의 하나에 부착된 접합체 (conjugate) 군을 포함할 수 있다. 대안으로, 2개 가닥은 비-핵산 모이어티 또는 링커 기를 통하여 연결될 수 있다. 한 개 가닥으로부터만 형성될 때, dsRNA는 이중나선을 형성하기 위하여 자체적으로 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서 이들 dsRNA는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조정은 유전자도입 세포주에서 dsRNA 헤어핀의 안정된 발현에 의해 달성될 수 있지만, 일부 구체예에서, 유전자 발현 또는 기능은 상향 조정된다. 2개 가닥, 또는 이중나선을 형성하기 위하여 자체적으로 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취하는 단일 가닥으로부터 형성될 때, 이들 2개 가닥 (또는 단일 가닥의 이중나선 형성 영역)은 Watson-Crick 방식으로 염기쌍을 이루는 상보성 RNA 가닥이다.
일단 시스템내로 도입되면, 본 발명의 화합물은 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 달성하기 위하여 하나 이상의 효소 또는 구조적 단백질의 작용을 유도하거나, 또는 점유-기반 기전 (occupancy-based mechanisms)을 통하여 작용할 수 있다. 일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드 포함)은 "DNA-유사" (즉, 일반적으로, 하나 이상의 2'-데옥시 당, 그리고 U 염기 대신 T를 보유함) 또는 "RNA-유사" (즉, 일반적으로, 하나 이상의 2'-히드록실 또는 2'-변형된 당, 그리고 T 염기 대신 U 염기를 보유함)로 기술될 수 있다. 핵산 나선은 한 가지 이상의 구조 유형을 채택할 수 있지만, 가장 일반적으로 A- 및 B-형이다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-유사"이며, 그리고 A-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-유사"이다. 일부 (키메라) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형 영역을 모두 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 바람직한 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 화합물은 안티센스 RNA, 안티센스 DNA, 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드, 변형된 연쇄를 포함하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 간섭 RNA (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로 간섭 RNA (miRNA); 작은, 일시적 RNA (stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도된 유전자 활성화 (RNAa); 작은 활성화 RNA (saRNA), 또는 이들의 조합 중에서 최소한 하나를 포함한다.
dsRNA는 또한 "작은 RNA-유도된 유전자 활성화" 또는 RNAa로 명명된 기전인 유전자 발현을 활성화시킬 수 있다. dsRNA 표적화 유전자 프로모터는 관련 유전자의 강력한 전사 활성화를 유도한다. RNAa는 "작은 활성화 RNA (saRNA)"로 불리는 합성 dsRNA를 이용하여 인간 세포에서 설명되었다.
작은 이중-가닥 RNA (dsRNA), 예를 들면, 작은 간섭 RNA (siRNA) 및 마이크로RNA (miRNA)는 RNA 간섭 (RNAi)으로 알려져 있는 진화론적으로 보존된 기전의 촉발자인 것으로 밝혀졌다. RNAi는 유전자 침묵을 일관되게 유도한다. 하지만, 하기 실시예 부분에서 상세하게 설명된 경우에서, 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드 및 이들의 인코딩된 산물의 발현 및/또는 기능을 증가시키는 것으로 보인다. dsRNA는 또한, 작은 활성화 RNA (saRNA)로 작용할 수 있다. 이론에 한정됨 없이, 유전자 프로모터 내에 서열을 표적으로 함으로써, saRNA는 dsRNA-유도된 전사 활성화 (RNAa)로 지칭되는 현상에서 표적 유전자 발현을 유도할 것이다.
추가 구체예에서, 본 발명에서 확인된 "표적 분절"은 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 발현을 조정하는 추가 화합물을 스크리닝하는데 이용될 수 있다. "조정물질 (modulator)"은 시르투인 (SIRT)를 인코딩하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 화합물이며, 표적 분절에 상보성인 최소한 5개-뉴클레오티드 부분을 포함한다. 스크리닝 방법은 시르투인 (SIRT)의 센스 또는 자연 안티센스 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 핵산 분자의 바람직한 표적 분절을 하나 이상의 후보 조정물질과 접촉시키는 단계, 그리고 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 서열 번호: 24 내지 127를 인코딩하는 핵산 분자의 발현을 감소 또는 증가시키는 하나 이상의 후보 조정물질을 선별하는 단계를 포함한다. 일단 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 핵산 분자의 발현을 조정 (가령, 감소 또는 증가)시킬 수 있는 것으로 확인되면, 후보 조정물질은 이후, 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 기능의 추가 연구, 또는 본 발명에 따른 연구, 진단 또는 치료 물질로서 용도에 이용될 수 있다.
자연 안티센스 서열의 표적화는 표적 유전자, 예를 들면, 시르투인 (SIRT) (가령, 수납 번호 NM_012238.4, NM_001159589, NM_012237.3, NM_012239, NM_012240, NM_012241, NM_016539, NM_016538, NM_001142498.1, NM_030593.2, NM_001193286.1, NR_034146.1, NM_001017524.2, NM_031244.2, NM_001193267.1, NM_001193285.1)의 기능을 조정한다. 한 구체예에서, 표적은 시르투인 (SIRT)의 안티센스 폴리뉴클레오티드이다. 한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드 (가령, 수납 번호 NM_012238.4, NM_001159589, NM_012237.3, NM_012239, NM_012240, NM_012241, NM_016539, NM_016538, NM_001142498.1, NM_030593.2, NM_001193286.1, NR_034146.1, NM_001017524.2, NM_031244.2, NM_001193267.1, NM_001193285.1)의 센스 및/또는 자연 안티센스 서열, 변이체, 대립유전자, 동종형, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 이들의 상보성 서열을 표적으로 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자이고, 그리고 표적은 안티센스 및/또는 센스 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 코딩 및 비-코딩 영역을 포함한다.
본 발명의 표적 분절은 본 발명의 개별 상보성 안티센스 화합물과 복합되어 안정화된 이중-가닥 (duplexed) 올리고뉴클레오티드를 형성할 수도 있다.
이와 같은 이중 가닥 올리고뉴클레오티드 모이어티는 당분야에서 표적 발현을 조정하고, 그리고 안티센스 기전을 통하여 번역뿐만 아니라 RNA 가공을 조절하는 것으로 알려져 있다. 게다가, 이들 이중-가닥 모이어티는 화학적 변형을 받을 수도 있다. 가령, 이와 같은 이중-가닥 모이어티는 표적에 대한 이중나선의 안티센스 가닥의 고전적인 혼성화에 의해 표적을 저해하여, 표적의 효소적 분해를 촉발시키는 것으로 밝혀졌다.
한 구체예에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드 (가령, 수납 번호 NM_012238.4, NM_001159589, NM_012237.3, NM_012239, NM_012240, NM_012241, NM_016539, NM_016538, NM_001142498.1, NM_030593.2, NM_001193286.1, NR_034146.1, NM_001017524.2, NM_031244.2, NM_001193267.1, NM_001193285.1), 변이체, 대립유전자, 동종형, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 이들의 상보성 서열을 표적으로 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자이다.
본 발명의 구체예에 따르면, 표적 핵산 분자는 시르투인 (SIRT)에만 국한되지 않으며, 시르투인 (SIRT) 분자의 임의의 동종형, 수용체, 동족체 등까지 확장된다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 자연 안티센스 서열, 예를 들면, 서열 번호: 9 내지 23, 141 내지 143으로서 진술된 폴리뉴클레오티드 및 임의의 변이체, 대립유전자, 동족체, 돌연변이체, 유도체, 단편 및 이들의 상보성 서열을 표적으로 한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 실례는 서열 번호: 24 내지 127로서 진술된다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 제한 없이, 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드와 연합된 비-코딩 센스 및/또는 안티센스 서열이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 시르투인 (SIRT) 안티센스의 핵산 서열에 상보성이거나, 또는 이들에 결합하고, 그리고 시르투인 (SIRT) 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 9 내지 23, 141 내지 143으로서 진술된 시르투인 (SIRT) 자연 안티센스의 핵산 서열에 상보성이거나 또는 이들에 결합하고, 그리고 시르투인 (SIRT) 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 24 내지 127의 최소한 5개의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 시르투인 (SIRT) 분자의 발현 및/또는 기능을 조정한다.
폴리뉴클레오티드 표적은 시르투인 (SIRT)의 집단 구성원, 시르투인 (SIRT)의 변이체; SNP를 비롯한 시르투인 (SIRT)의 돌연변이체; 시르투인 (SIRT)의 비-코딩 서열; 시르투인 (SIRT)의 대립유전자; 종 변이체, 단편 등을 비롯한 시르투인 (SIRT)를 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드는 안티센스 분자이다.
다른 구체예에서, 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드를 표적으로 하는 올리고뉴클레오티드는 안티센스 RNA, 간섭 RNA (RNAi), 짧은 간섭 RNA (siRNA); 마이크로 간섭 RNA (miRNA); 작은, 일시적 RNA (stRNA); 또는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA); 작은 RNA-유도된 유전자 활성화 (RNAa); 또는 작은 활성화 RNA (saRNA)를 포함한다.
다른 구체예에서, 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드, 예를 들면, 서열 번호: 9 내지 23, 141 내지 143의 표적화는 이들 표적의 발현 또는 기능을 조정한다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 대조와 비교하여 상향 조절된다. 한 구체예에서, 발현 또는 기능은 대조와 비교하여 하향 조절된다.
다른 구체예에서, 안티센스 화합물은 서열 번호: 24 내지 127로서 진술된 서열을 포함한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드, 더욱 짧은 또는 더욱 긴 단편, 변형된 결합 등을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 서열 번호: 24 내지 127는 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함한다.
원하는 표적 핵산, 예를 들면, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 등의 조정은 당분야에 공지된 몇 가지 방식으로 실행될 수 있다. 효소적 핵산 분자 (가령, 리보자임)는 뉴클레오티드 염기 서열-특이적 방식으로 다른 별도의 핵산 분자를 반복적으로 절단하는 능력을 비롯하여, 다양한 반응 중에서 하나 이상을 촉매할 수 있는 핵산 분자이다. 이러한 효소적 핵산 분자는 예로써, 실질적으로 임의의 RNA 전사체를 표적으로 하는데 이용될 수 있다.
서열-특이성 때문에, trans-절단 효소적 핵산 분자는 인간 질환에 대한 치료 물질로서 가능성을 보여준다. 효소적 핵산 분자는 세포성 RNA의 배경 내에 특이적 RNA 표적을 절단하도록 설계될 수 있다. 이러한 절단 이벤트는 mRNA를 비-기능성으로 만들고, 상기 RNA로부터 단백질 발현을 폐기시킨다. 이러한 방식에서, 질환 상태와 연관된 단백질의 합성이 선택적으로 억제될 수 있다.
일반적으로, RNA 절단 활성을 가진 효소적 핵산은 먼저, 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 이와 같은 결합은 표적 RNA를 절단하는 작용을 하는 분자의 효소적 부분에 근접하게 유지되는 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 일어난다. 따라서 효소적 핵산은 먼저 표적 RNA를 인지하고, 그 다음 상보성 염기 대합을 통하여 표적 RNA에 결합하고, 그리고 정확한 부위에 일단 결합되면, 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다. 이러한 표적 RNA의 전략적 절단은 인코딩된 단백질의 합성을 지시하는 능력을 파괴시킬 것이다. 효소적 핵산은 RNA 표적에 결합하여 이를 절단시킨 후, 다른 표적을 찾기 위하여 RNA로부터 방출되고, 그리고 새로운 표적에 반복적으로 결합하여 이들을 절단할 수 있다.
시험관내 선별 (진전) 전략과 같은 여러 전략이 포스포디에스테르 연쇄와 아미드 연쇄의 절단 및 결찰과 같은 다양한 반응을 촉매할 수 있는 새로운 핵산 촉매를 개발하는데 이용되고 있다.
촉매 활성에 최적인 리보자임의 개발은 유전자 발현을 조절하기 위한 목적으로 RNA-절단 리보자임을 이용하는 임의의 전략에 상당히 기여할 것이다. 가령, 해머머리 (hammerhead) 리보자임은 Mg2+ 보조인자의 포화 농도 (10mM)의 존재에서 대략 1min-1의 촉매 속도(kcat)로 기능한다. 인공 "RNA 리가아제" 리보자임은 대략 100 min-1의 속도로 상응하는 자가-변형 반응을 촉매하는 것으로 나타났다. 또한, DNA로 구성된 기질 결합 팔(arm)을 가지고 있는 일정한 변형된 해머머리 리보자임은 100 min-1에 근접하는 다중 턴-오버 속도로 RNA 절단을 촉매한다. 최종적으로, 일정한 뉴클레오티드 유사체로 해머머리의 촉매 코어 내에 특이적 잔기의 대체는 촉매 속도에서 많게는 10배 향상을 보이는 변형된 리보자임을 제공한다. 이들 발견은 리보자임이 대부분의 자연 자가-절단 리보자임에 의해 시험관내에서 나타나는 것보다 훨씬 큰 촉매 속도로 화학적 변형을 촉진할 수 있다는 것을 설명한다. 그 다음, 최대 촉매 활성을 제공하기 위하여 일정한 자가-절단 리보자임의 구조를 최적화하거나, 또는 RNA 포스포디에스테르 절단에 대해 훨씬 빠른 속도를 보여주는 완전히 새로운 RNA 모티프를 만드는 것이 가능하다.
"해머머리" 모델에 적합한 RNA 촉매에 의한 RNA 기질의 분자내 절단은 1987년에 처음 밝혀졌다. RNA 촉매가 회수되고 다중 RNA 분자와 반응되었는데, 이는 상기 촉매가 진정한 촉매성임을 증명하였다.
"해머머리" 모티프에 기초하여 설계된 촉매 RNA은 표적 서열과의 필수적인 염기 대합을 유지하기 위하여 촉매 RNA 내에 적절한 염기 변화를 만듦으로써 특이적 표적 서열을 절단하는데 이용되고 있다. 이것은 특이적 표적 서열을 절단하기 위하여 촉매 RNA의 사용을 가능하게 하고, 그리고 "해머머리" 모델에 따라 설계된 촉매 RNA가 생체내에서 특이적 기질 RNA를 절단하는 것이 가능하다는 것을 나타낸다.
RNA 간섭 (RNAi)은 포유류 및 포유류 세포에서 유전자 발현을 조정하는 강력한 도구가 되고 있다. 이와 같은 방식은 발현 플라스미드 또는 바이러스, 그리고 siRNA로 가공되는 작은 헤어핀 RNA에 대한 코딩 서열을 이용하여 RNA 자체로 또는 DNA로서 작은 간섭 RNA (siRNA) 운반을 요구한다. 이 시스템은 pre-siRNA를 세포질로 효과적으로 운반할 수 있는데, 세포질에서 이들 RNA는 활동적이고 유전자 발현을 위한 조절된 조직 특이적인 프로모터의 사용을 허용한다.
한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 또는 안티센스 화합물은 리보핵산 (RNA) 및/또는 데옥시리보핵산 (DNA)의 올리고머 또는 폴리머, 또는 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동족체를 포함한다. 상기 용어는 자연 발생 뉴클레오티드, 당 및 공유적 뉴클레오시드간 (골격) 연쇄로 구성된 올리고뉴클레오티드 뿐만 아니라 유사하게 기능하는 비-자연 발생 부분을 보유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 이와 같은 변형된 또는 치환된 올리고뉴클레오티드는 예로써, 증강된 세포 취입, 표적 핵산에 대한 증강된 친화력 및 뉴클레아제의 존재에서 증가된 안정성과 같은 바람직한 성질로 인하여, 고유 형태 비하여 종종 요망된다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드 또는 "안티센스 화합물"에는 안티센스 올리고뉴클레오티드 (가령 RNA, DNA, 이의 모방체, 키메라, 유사체 또는 동족체), 리보자임, 외부 가이드 서열 (EGS) 올리고뉴클레오티드, siRNA 화합물, 단일- 또는 이중-가닥 RNA 간섭 (RNAi) 화합물, 예를 들면, siRNA 화합물, saRNA, aRNA, 그리고 표적 핵산의 최소한 일부분에 혼성화되어 이의 기능을 조정하는 기타 올리고머 화합물이 포함된다. 따라서 이들은 DNA, RNA, DNA-유사, RNA-유사, 또는 이들의 혼합물이거나, 또는 이들 중에서 하나 이상의 모방체일 수 있다. 이들 화합물은 단일-가닥, 이중-가닥, 원형 또는 헤어핀 올리고머 화합물일 수 있고, 그리고 내부 또는 말단 중배 (bulge), 미스매치 또는 루프와 같은 구조적 요소를 포함할 수 있다. 안티센스 화합물은 일과적으로 선형으로 제조되지만, 결합되거나, 또는 원형 및/또는 분지형으로 제조될 수 있다. 안티센스 화합물은 혼성화되면 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물을 형성하는 2개의 가닥, 또는 혼성화 및 전체적으로 또는 부분적으로 이중-가닥 화합물의 형성을 가능하게 할 만큼 충분한 자가-상보성을 갖는 단일 가닥과 같은 구조체를 포함할 수 있다. 2개 가닥은 내부에서 연결되어 3' 또는 5' 말단이 자유로운 상태로 남아 있거나, 또는 연결되어 연속적인 헤어핀 구조 또는 루프를 형성할 수 있다. 헤어핀 구조는 단일 가닥 특성의 연장부를 발생시키는 5' 또는 3' 말단 상에 오버행(overhang)을 포함할 수 있다. 이중 가닥 화합물은 선택적으로 이들 말단에 오버행 (overhang)을 포함할 수 있다. 추가 변형에는 말단 중의 한쪽, 선택된 뉴클레오티드 위치, 당 위치, 또는 뉴클레오티드간 연쇄 중의 하나에 부착된 접합체 (conjugate) 군을 포함할 수 있다. 대안으로, 2개 가닥은 비-핵산 모이어티 또는 링커 기를 통하여 연결될 수 있다. 한 개 가닥으로부터만 형성될 때, dsRNA는 이중나선을 형성하기 위하여 자체적으로 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취할 수 있다. 따라서 이들 dsRNA는 완전히 또는 부분적으로 이중 가닥이 될 수 있다. 유전자 발현의 특이적 조정은 유전자도입 세포주에서 dsRNA 헤어핀의 안정된 발현에 의해 달성될 수 있다. 2개 가닥, 또는 이중나선을 형성하기 위하여 자체적으로 둘로 접히는 자가-상보성 헤어핀 유형 분자의 형태를 취하는 단일 가닥으로부터 형성될 때, 이들 2개 가닥 (또는 단일 가닥의 이중나선 형성 영역)은 Watson-Crick 방식으로 염기쌍을 이루는 상보성 RNA 가닥이다.
일단 시스템내로 도입되면, 본 발명의 화합물은 표적 핵산의 절단 또는 다른 변형을 달성하기 위하여 하나 이상의 효소 또는 구조적 단백질의 작용을 유도하거나, 또는 점유-기반 기전 (occupancy-based mechanisms)을 통하여 작용할 수 있다. 일반적으로, 핵산 (올리고뉴클레오티드 포함)은 "DNA-유사" (즉, 일반적으로, 하나 이상의 2'-데옥시 당, 그리고 U 염기 대신 T를 보유함) 또는 "RNA-유사" (즉, 일반적으로, 하나 이상의 2'-히드록실 또는 2'-변형된 당, 그리고 T 염기 대신 U 염기를 보유함)로 기술될 수 있다. 핵산 나선은 한 가지 이상의 구조 유형을 채택할 수 있지만, 가장 일반적으로 A- 및 B-형이다. 일반적으로, B-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "DNA-유사"이며, 그리고 A-형-유사 구조를 가지는 올리고뉴클레오티드는 "RNA-유사"이다. 일부 (키메라) 구체예에서, 안티센스 화합물은 A- 및 B-형 영역을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 안티센스 화합물은 길이가 대략 5개 내지 대략 80개 뉴클레오티드 (즉, 대략 5개 내지 대략 80개의 연결된 뉴클레오시드)의 안티센스 부분을 포함할 수 있다. 이는 안티센스 화합물의 안티센스 가닥 또는 부분의 길이를 지칭한다. 환언하면, 본 발명의 단일-가닥 안티센스 화합물은 5개 내지 대략 80개 뉴클레오티드를 포함하고, 그리고 본 발명의 이중-가닥 안티센스 화합물 (가령, dsRNA)은 길이가 5개 내지 대략 80개 뉴클레오티드인 센스 및 안티센스 가닥 또는 부분을 포함한다. 이것은 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 또는 80개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 내에 임의의 범위의 안티센스 부분을 포함한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 화합물은 10개 내지 50개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 부분을 보유한다. 이것은 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 또는 50개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 내에 임의의 범위의 안티센스 부분을 보유하는 올리고뉴클레오티드를 구현한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 안티센스 또는 올리고뉴클레오티드 화합물은 12개 또는 13개 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 안티센스 부분을 보유한다. 이것은 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 뉴클레오티드 길이, 또는 그 내에 임의의 범위의 안티센스 부분을 보유하는 안티센스 화합물을 구현한다는 것을 당업자는 이해할 것이다.
다른 구체예에서, 본 발명의 올리고머 화합물은 화합물 내에 하나 이상의 뉴클레오티드 위치에 상이한 염기가 존재하는 변이체를 포함한다. 가령, 첫 번째 뉴클레오티드가 아데노신이면, 이 위치에 티미딘, 구아노신 또는 시티딘을 포함하는 변이체가 만들어질 수 있다. 이것은 안티센스 또는 dsRNA 화합물의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 이들 화합물은 표적 핵산의 발현을 저해하는 능력을 측정하기 위하여 본 명세서에서 기술된 방법을 이용하여 조사된다.
일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 40% 내지 대략 60%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 60% 내지 대략 70%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 70% 내지 대략 80%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 80% 내지 대략 90%이다. 일부 구체예에서, 안티센스 화합물과 표적 사이에 상동성, 서열 동일성 또는 상보성은 대략 90%, 대략 92%, 대략 94%, 대략 95%, 대략 96%, 대략 97%, 대략 98%, 대략 99% 또는 대략 100%이다.
다른 구체예에서, 서열 번호: 24 내지 127에서 진술된 핵산 분자와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환 또는 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA)으로 치환된다.
다른 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 시르투인 (SIRT) 및 서열 번호: 1 내지 23 및 133 내지 143로서 진술된 서열과 연관된 코딩 및/또는 비-코딩 서열의 핵산 분자 센스 및/또는 안티센스의 하나 이상의 영역을 표적으로 한다. 올리고뉴클레오티드는 또한, 서열 번호: 1 내지 23 및 133 내지 143의 중복 영역을 표적으로 한다.
본 발명의 일정한 올리고뉴클레오티드는 키메라 올리고뉴클레오티드이다. 본 발명의 맥락에서, "키메라 올리고뉴클레오티드" 또는 "키메라"는 2개 이상의 화학적으로 별개의 영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드이며, 각 영역은 최소 한 개의 뉴클레오티드로 구성된다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드는 전형적으로, 하나 이상의 유익한 성질 (가령, 증가된 뉴클레아제 내성, 세포내로의 증가된 취입, 표적에 대한 증가된 결합 친화성)을 부여하는 변형된 뉴클레오티드의 최소한 하나의 영역 및 RNA:DNA 또는 RNA:RNA 하이브리드를 절단할 수 있는 효소에 대한 기질이 되는 영역을 포함한다. 가령, RNase H는 RNA:DNA 이중나선의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다. 따라서 RNase H의 활성화는 RNA 표적의 절단을 유발하여, 유전자 발현의 안티센스 조정의 효과를 강화시킨다. 결과적으로, 동일한 표적 영역에 혼성화되는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드와 비교하여, 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용될 때 더욱 짧은 올리고뉴클레오티드로 필적하는 결과가 종종 획득될 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동에 의해, 그리고 필요하다면, 당분야에 공지된 연관된 핵산 혼성화 기술에 의해 일과적으로 검출될 수 있다. 한 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 표적 결합 친화력을 증가시키도록 변형된 최소한 하나의 영역, 그리고 통상적으로, RNAse H에 대한 기질로서 기능하는 영역을 포함한다. 표적 (본 발명의 경우에, ras를 인코딩하는 핵산)에 대한 올리고뉴클레오티드 친화성은 올리고뉴클레오티드/표적 쌍의 Tm을 측정함으로써 일과적으로 결정되는데, 이는 상기 올리고뉴클레오티드와 표적이 해리되는 온도이다; 해리는 분광광도법으로 검출된다. Tm이 높을수록, 표적에 대한 올리고뉴클레오티드의 친화성이 커진다.
본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 상기에서 설명된 것과 같이 2개 이상의 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 모방체의 혼성 구조로 형성될 수 있다. 이와 같은 화합물은 또한, 당분야에서 하이브리드 (hybrid) 또는 갭머 (gapmer)로 지칭된다. 이와 같은 하이브리드 구조의 제조에 대해 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제5,013,830호; 제5,149,797호; 제5,220,007호; 제5,256,775호; 제5,366,878호; 제5,403,711호; 제5,491,133호; 제5,565,350호; 제5,623,065호; 제5,652,355호; 제5,652,356호; 및 제5,700,922호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참고문헌으로서 편입된다.
다른 구체예에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 영역은 당의 2' 위치에서 변형된 최소한 하나의 뉴클레오티드, 바람직하게는 2'-O알킬, 2'-O-알킬-O-알킬 또는 2'-플루오르-변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 다른 구체예에서, RNA 변형은 피리미딘의 리보즈, 염기소실 잔기 (abasic residues) 또는 RNA의 3' 말단에서 역전된 염기 상에 2'-플루오르, 2'-아미노 및 2' O-메틸 변형을 포함한다. 이와 같은 변형은 올리고뉴클레오티드에 일과적으로 통합되고, 그리고 이들 올리고뉴클레오티드는 소정의 표적에 대해 2'-데옥시올리고뉴클레오티드보다 높은 Tm (즉, 더욱 높은 표적 결합 친화성)을 가지는 것으로 밝혀졌다. 이런 증가된 친화성의 효과는 유전자 발현의 RNAi 올리고뉴클레오티드 저해를 상당히 증강시키는 것이다. RNAse H는 RNA:DNA 이중나선의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제이다; 따라서 상기 효소의 활성화는 RNA 표적의 절단을 유발하여, RNAi 저해의 효과를 상당히 증강시킬 수 있다. RNA 표적의 절단은 겔 전기영동에 의해 일과적으로 증명될 수 있다. 다른 구체예에서, 키메라 올리고뉴클레오티드는 또한, 뉴클레아제 내성을 증강시키기 위하여 변형된다. 세포는 핵산을 분해시킬 수 있는 다양한 엑소- 및 엔도-뉴클레아제를 포함한다. 다수의 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드 변형은 그들이 통합된 올리고뉴클레오티드가 고유한 올리고데옥시뉴클레오티드보다 뉴클레아제 절단에 더욱 강한 내성을 갖도록 만드는 것으로 밝혀졌다. 뉴클레아제 내성은 올리고뉴클레오티드를 세포 추출물 또는 분리된 뉴클레아제 용액과 함께 항온처리하고, 그리고 통상적으로 겔 전기영동에 의해 시간의 흐름 동안 남아있는 본래 올리고뉴클레오티드의 수준을 측정함으로써 일과적으로 결정된다. 뉴클레아제 내성을 증강시키도록 변형된 올리고뉴클레오티드는 변형되지 않은 올리고뉴클레오티드보다 더욱 긴 시간 동안 본래 상태로 존재한다. 다양한 올리고뉴클레오티드 변형이 뉴클레아제 내성을 증강시키거나 부여하는 것으로 증명되었다. 최소한 하나의 포스포로티오에이트 변형을 포함하는 올리고뉴클레오티드가 더욱 바람직하다. 일부 경우, 표적 결합 친화성이 증강된 올리고뉴클레오티드 변형은 독립적으로 뉴클레아제 내성을 증강시킬 수 있다. 일부 바람직한 변형은 De Mesmaeker et al. (1995) Acc. Chem. Res., 28:366-374에서 찾아볼 수 있다.
본 발명에서 구상된 일부 올리고뉴클레오티드의 특정 실례에는 변형된 골격을 포함하는 것들, 예를 들면, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸 포스포네이트, 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 당간 (intersugar) 연쇄 또는 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로환상 당간 연쇄가 포함된다. 가장 바람직한 것은 포스포로티오에이트 골격을 가진 올리고뉴클레오티드 및 헤테로원자 골격, 특히, CH2--NH--O--CH2, CH,--N(CH3)--O--CH2 [메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지됨], CH2--O--N(CH3)--CH2, CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2 및 O--N (CH3)--CH2--CH2 골격을 가진 올리고뉴클레오티드이고, 이때 고유 포스포디에스테르 골격은 O--P--O--CH로 표시된다). De Mesmaeker et al. (1995) Acc. Chem. Res. 28:366-374에서 설명된 아미드 골격 역시 바람직하다. 모르폴리노 골격 구조를 가진 올리고뉴클레오티드 역시 바람직하다 (Summerton과 Weller, U.S. 특허 제5,034,506호). 다른 구체예, 예를 들면, 펩티드 핵산 (PNA) 골격에서, 올리고뉴클레오티드의 포스포디에스테르 골격은 폴리아미드 골격으로 대체되며, 뉴클레오티드는 폴리아미드 골격의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다. 올리고뉴클레오티드는 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 또한 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 O(CH2)n CH3, O(CH2)n NH2 또는 O(CH2)nCH3, 이때 n은 1 내지 대략 10이다; C1 내지 C10 저급 알킬, 알콕시알콕시, 치환된 저급 알킬, 알크아릴 또는 아르알킬; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; O--, S--, 또는 N-알킬; O--, S--, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2 CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로사이클로알킬; 헤테로사이클로알크아릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 치환된 실릴; RNA 절단기; 리포터 기; 삽입기 (intercalator); 올리고뉴클레오티드의 약역학적 성질을 개선하는 기; 또는 올리고뉴클레오티드 및 유사한 성질을 가진 다른 치환기의 약동학적 성질을 개선하는 기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시[2'-O-CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸)로 공지됨]을 포함한다. 다른 바람직한 변형은 2'-메톡시 (2'-O--CH3), 2'-프로폭시 (2'-OCH2 CH2CH3) 및 2'-플루오르 (2'-F)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 상에서 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상에서 당의 3' 위치 및 5' 말단 뉴클레오티드의 5'위치에서 유사한 변형이 만들어 질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 기 대신에 사이클로부틸과 같은 당 모방체를 보유할 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 또한 추가적으로 또는 대안으로, 핵염기 (당분야에서 종종 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "변형되지 않은" 또는 "자연" 뉴클레오티드는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드에는 자연 핵산에 드물게 또는 일시적으로 발견되는 뉴클레오티드, 예를 들면, 하이포산틴, 6-메틸아데닌, 5-Me 피리미딘, 특히 5-메틸시토신 (또한, 5-메틸-2'데옥시시토신, 그리고 종종 당분야에서 5-Me-C로 지칭됨), 5-히드록시메틸시토신 (HMC), 글리코실 HMC 및 겐토바이오실 HMC, 그리고 합성 뉴클레오티드, 예를 들면, 2-아미노아데닌, 2-(메틸아미노)아데닌, 2-(이미다졸일알킬)아데닌, 2-(아미노알킬아미노)아데닌 또는 다른 헤테로치환된 알킬아데닌, 2-티오우라실, 2-티오티민, 5-브로모우라실, 5-히드록시메틸우라실, 8-아자구아닌, 7-데아자구아닌, N6(6-아미노헥실)아데닌 및 2,6-디아미노퓨린이 포함된다. 당분야에 공지된 "범용 (universal)" 염기, 예를 들면, 이노신이 포함될 수 있다. 5-Me-C 치환은 핵산 이중나선 안정성을 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 밝혀졌고 (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 그리고 현재 바람직한 염기 치환이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성 또는 세포 취입을 강화시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결하는 것을 수반한다. 이러한 모이어티에는 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤 모이어티, 콜레스테릴 모이어티, 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리틸티올, 트리콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-포스페이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 친지성 모이어티를 포함하는 올리고뉴클레오티드, 그리고 이와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하는 방법은 당분야에서, 예를 들면, U.S. 특허 제5,138,045호, 제5,218,105호 및 제5,459,255호에서 공지되어 있다.
소정의 올리고뉴클레오티드 내에 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없고, 그리고 실제로, 전술한 변형중 하나 이상이 단일 올리고뉴클레오티드에 통합되거나, 또는 심지어 올리고뉴클레오티드내 단일 뉴클레오시드에 통합될 수 있다. 본 발명은 또한, 상기에서 정의된 바와 같은 키메라 올리고뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 핵산 분자는 염기소실 (abasic) 뉴클레오티드, 폴리에테르, 폴리아민, 폴리아미드, 펩티드, 탄수화물, 지질 또는 폴리하이드로카본 화합물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 다른 모이어티와 접합된다. 이들 분자가 당, 염기 또는 인산염 기 상에서 여러 위치에서 핵산 분자를 포함하는 하나 이상의 임의의 뉴클레오티드에 연결될 수 있다는 것을 당업자는 인지할 것이다.
본 발명에 이용된 올리고뉴클레오티드는 널리 공지된 고형상 합성 기술을 통하여 통상적으로 및 일과적으로 만들어질 수 있다. 이와 같은 합성을 위한 장비는 Applied Biosystems를 비롯한 여러 업체에 의해 판매된다. 이와 같은 합성을 위하여 임의의 다른 수단 역시 이용될 수 있다; 올리고뉴클레오티드의 실제 합성은 당업자의 능력 범위 내에 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화된 유도체와 같은 다른 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여 유사한 기술을 이용하는 것 역시 공지되어 있다. 형광 표지된, 바이오틴화된 또는 기타 변형된 올리고뉴클레오티드, 예를 들면, 콜레스테롤-변형된 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위하여 유사한 기술 및 상업적으로 가용한 변형된 아미디트 (amidite) 및 조정된 포어 글라스 (CPG) 산물, 예를 들면, 바이오틴, 플루오레세인, 아크리딘 또는 프소랄렌 (psoralen)-변형된 아미디트 및/또는 CPG (Glen Research, Sterling VA)로부터 구입가능)을 이용하는 것 역시 공지되어 있다.
본 발명에 따르면, 올리고뉴클레오티드의 효능, 특이성 및 작용 기간을 증강시키고 투여 경로를 확장시키기 위한 LNA 단량체와 같은 변형의 이용은 MOE, ANA, FANA, PS 등과 같은 현재 화학물질로 구성되었다. 이것은 현재 올리고뉴클레오티드에서 일부 단량체를 LNA 단량체로 치환함으로써 달성될 수 있다. LNA 변형된 올리고뉴클레오티드는 부모 화합물과 유사한 크기를 갖거나, 또는 더욱 큰, 또는 바람직하게는 더욱 작은 크기를 가질 수 있다. 이와 같은 LNA-변형된 올리고뉴클레오티드는 대략 70% 미만, 더욱 바람직하게는 대략 60% 미만, 가장 바람직하게는 대략 50% 미만의 LNA 단량체를 포함하고, 그리고 그들의 크기는 대략 5개 내지 25개 뉴클레오티드, 더욱 바람직하게는 대략 12개 내지 20 개 뉴클레오티드 사이이다.
변형된 올리고뉴클레오티드 골격에는 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리에스테르, 메틸 및 3' 알킬렌 포스포네이트와 키랄 포스포네이트를 포함하는 기타 알킬 포스포네이트, 포스피네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트와 아미노알킬포스포르아미데이트를 포함하는 포스포르아미데이트, 티오노포스포르아미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 그리고 정상적인 3'-5' 연쇄를 가진 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체, 그리고 역전된 극성을 가진 것들 (여기서, 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍은 3'-5'에서 5'-3'으로, 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된다)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 다양한 염, 혼합된 염 및 유리 산 형태 역시 포함된다.
상기 인-함유 연쇄의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제3,687,808호; 제4,469,863호; 제4,476,301호; 제5,023,243호; 제5,177,196호; 제5,188,897호; 제5,264,423호; 제5,276,019호; 제5,278,302호; 제5,286,717호; 제5,321,131호; 제5,399,676호; 제5,405,939호; 제5,453,496호; 제5,455,233호; 제5,466,677호; 제5,476,925호; 제5,519,126호; 제5,536,821호; 제5,541,306호; 제5,550,111호; 제5,563,253호; 제5,571,799호; 제5,587,361호; 및 제5,625,050호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참고문헌으로서 편입된다.
인 원자를 포함하지 않는 변형된 올리고뉴클레오티드 골격은 짧은 사슬 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연쇄, 혼성 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 뉴클레오시드간 연쇄, 또는 하나 이상의 짧은 사슬 헤테로원자 또는 헤테로환상 뉴클레오시드간 연쇄에 의해 형성된 골격을 보유한다. 이들은 모르폴리노 연쇄 (뉴클레오시드의 당 부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실록산 골격; 설파이드, 설폭시드 및 설폰 골격; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 골격; 알켄 포함 골격; 설파메이트 골격; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 골격; 설포네이트 및 설폰아미드 골격; 아미드 골격; 그리고 N, O, S 및 CH2 성분 부분이 혼합된 것을 보유하는 것들을 포함한다.
상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. 특허 제5,034,506호; 제5,166,315호; 제5,185,444호; 제5,214,134호; 제5,216,141호; 제5,235,033호; 제5,264,562호; 제5,264,564호; 제5,405,938호; 제5,434,257호; 제5,466,677호; 제5,470,967호; 제5,489,677호; 제5,541,307호; 제5,561,225호; 제5,596,086호; 제5,602,240호; 제5,610,289호; 제5,602,240호; 제5,608,046호; 제5,610,289호; 제5,618,704호; 제5,623,070호; 제5,663,312호; 제5,633,360호; 제5,677,437호; 및 제5,677,439호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참고문헌으로서 편입된다.
다른 올리고뉴클레오티드 모방체에서, 당 및 뉴클레오시드간 연쇄, 다시 말하면, 뉴클레오티드 단위의 골격은 신규한 기로 대체된다. 염기 단위는 적합한 핵산 표적 화합물과의 혼성화를 위해 유지된다. 이와 같은 올리고머 화합물중 하나인, 우수한 혼성화 성질을 가진 것으로 확인된 올리고뉴클레오티드 모방체는 펩티드 핵산 (PNA)으로 지칭된다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-골격은 아미드 포함 골격, 특히 아미도에틸글리신 골격으로 치환된다. 핵염기는 보유되며, 골격의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 직간접적으로 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제5,539,082호; 제5,714,331호; 및 제5,719,262호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참고문헌으로서 편입된다. PNA 화합물의 추가 교시는 Nielsen et al., (1991) Science, 254, 1497-1500에서 볼 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 포스포로티오에이트 골격을 가진 올리고뉴클레오티드, 그리고 헤테로원자 골격, 특히, CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N(CH3)-O-CH2-(메틸렌(메틸이미노) 또는 MMI 골격으로 공지됨), -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3) CH2- 및 -O-N(CH3)-CH2-CH2-를 가진 올리고뉴클레오시드이고, 이때 고유 포스포디에스테르 골격은 상기 언급된 US 특허 제5,489,677호의 -O-P-O-CH2-, 그리고 상기 언급된 US 특허 제5,602,240호의 아미드 골격으로서 표시된다. 또한, 상기 언급된 US 특허 제5,034,506호의 모르폴리노 골격 구조를 가진 올리고뉴클레오티드가 바람직하다.
변형된 올리고뉴클레오티드는 또한, 하나 이상의 치환된 당 모이어티를 포함할 수 있다. 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 O 알킬-O-알킬, 이때, 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환되거나 치환되지 않은 C 내지 CO 알킬 또는 C2 내지 CO 알케닐 및 알키닐이다. 특히 바람직한 것은 O(CH2)nOmCH3, O(CH2)n, OCH3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2, 그리고 O(CH2n)ON(CH2)nCH3)2이며, 이때 n과 m은 1 내지 대략 10일 수 있다. 다른 바람직한 올리고뉴클레오티드는 2' 위치에 다음중 하나를 포함한다: C 내지 CO, (저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴, 아르알킬, O-알크아릴 또는 O-아르알킬, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로사이클로알킬, 헤테로사이클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실릴, RNA 절단기, 리포터 기, 삽입기 (intercalator), 올리고뉴클레오티드의 약역학적 성질을 개선하는 기, 또는 올리고뉴클레오티드의 약동학적 성질을 개선하는 기, 그리고 유사한 성질을 가진 다른 치환기. 바람직한 변형은 2'-메톡시에톡시 (2'-O-CH2CH2OCH3, 또한 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE로 공지됨), 다시 말하면, 알콕시알콕시 기를 포함한다. 다른 바람직한 변형은 하기 실시예에서 설명된 바와 같은 2'-디메틸아미노옥시에톡시, 다시 말하면, O(CH2)2ON(CH3)2 기, 일명 2'-DMAOE, 그리고 2'-디메틸아미노에톡시에톡시 (당분야에서 2'-O-디메틸아미노에톡시에틸 또는 2'-DMAEOE), 다시 말하면, 2'-O-CH2-O-CH2-N (CH2)2을 포함한다.
다른 변형은 2'-메톡시(2'-OCH3), 2'-아미노프로폭시(2'-O CH2CH2CH2NH2) 및 2'-플루오르 (2'-F)을 포함한다. 또한, 올리고뉴클레오티드 상에서 다른 위치, 특히 3' 말단 뉴클레오티드 상에서 또는 2'-5' 연결된 올리고뉴클레오티드에서 당의 3' 위치, 그리고 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 위치에서 유사한 변형이 만들어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 당 대신에 사이클로부틸 모이어티와 같은 당 모방체를 보유할 수 있다. 이와 같은 변형된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제4,981,957호; 제5,118,800호; 제5,319,080호; 제5,359,044호; 제5,393,878호; 제5,446,137호; 제5,466,786호; 제5,514,785호; 제5,519,134호; 제5,567,811호; 제5,576,427호; 제5,591,722호; 제5,597,909호; 제5,610,300호; 제5,627,053호; 제5,639,873호; 제5,646,265호; 제5,658,873호; 제5,670,633호; 및 제5,700,920호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참고문헌으로서 편입된다.
올리고뉴클레오티드는 또한 핵염기 (당분야에서 종종 간단히 "염기"로 지칭됨) 변형 또는 치환을 포함할 수 있다. 본 명세서에서, "변형되지 않은" 또는 "자연" 뉴클레오티드는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 그리고 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드에는 다른 합성 및 자연 뉴클레오티드, 예를 들면, 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 산틴, 하이포산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌과 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌과 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도-우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환된 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오르메틸 및 다른 5-치환된 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌, 그리고 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌이 포함된다.
또한, 뉴클레오티드에는 U.S. 특허 제3,687,808호, 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, Englisch et al., 'Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, page 613, 그리고 Sanghvi, Y.S., Chapter 15, 'Antisence Research and Applications', pages 289-302, Crooke, S.T. and Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993에서 설명된 것들이 포함된다. 이와 같은 일정한 뉴클레오티드는 본 발명의 올리고머 화합물의 결합 친화성을 증가시키는데 특히 유용하다. 이들에는 2-아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신을 포함하는 5-치환된 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6과 0-6 치환된 퓨린이 포함된다. 5-메틸시토신 치환은 핵산 이중나선 안정도를 0.6-1.2℃ 증가시키는 것으로 밝혀졌고 (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds, 'Antisence Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278), 그리고 2'-O메톡시에틸 당 변형과 복합될 때 특히 바람직한 염기 치환이다.
상기 변형된 뉴클레오티드 및 기타 변형된 뉴클레오티드의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제3,687,808호, 제4,845,205호; 제5,130,302호; 제5,134,066호; 제5,175,273호; 제5,367,066호; 제5,432,272호; 제5,457,187호; 제5,459,255호; 제5,484,908호; 제5,502,177호; 제5,525,711호; 제5,552,540호; 제5,587,469호; 제5,596,091호; 제5,614,617호; 제5,750,692호, 및 제5,681,941호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참고문헌으로서 편입된다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 기타 변형은 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결하는 것을 수반하는데, 이는 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 취입을 증강시킨다.
이와 같은 모이어티에는 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤 모이어티, 담즙산, 티오에테르, 예를 들면, 헥실-S-트리릴티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-t 옥시콜레스테롤 모이어티가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 US 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호, 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호; 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참고문헌으로서 편입된다.
약물 발견: 본 발명의 화합물은 약물 발견 및 표적 검증 분야에도 적용될 수 있다. 본 발명은 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드 및 질환 상태, 표현형 또는 장애 사이에 존재하는 상관관계를 석명하기 위한 약물 발견 노력에서, 본 발명에서 확인된 화합물 및 바람직한 표적 분절의 이용을 포함한다. 이들 방법은 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드를 검출 또는 조정하는 것을 포함하며, 샘플, 조직, 세포 또는 생명체를 본 발명의 화합물과 접촉시키는 단계, 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 핵산 또는 단백질 수준 및/또는 처치후 일정 시점에 관련된 표현형 또는 화학적 종점을 측정하는 단계, 그리고 선택적으로, 측정된 값을 처리되지 않은 샘플 또는 본 발명의 다른 화합물로 처리된 샘플에 비교하는 단계를 포함한다. 이들 방법은 표적 검증 과정을 위한 미지의 유전자 기능을 결정하기 위하여, 또는 특정 질환, 상태 또는 표현형의 치료 또는 예방을 위한 표적으로서 특정 유전자 산물의 유효성을 결정하기 위하여 다른 실험과 병렬과 또는 공동으로 실행될 수 있다.
유전자 발현의 상향 조절 또는 저해의 평가:
외인성 핵산의 숙주 세포 또는 생명체 내로의 전달은 세포 또는 생명체내 핵산이 존재하는 것을 직접적으로 검출함으로써 평가될 수 있다. 이와 같은 검출은 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 달성될 수 있다. 가령, 외인성 핵산의 존재는 서든 블롯에 의해, 또는 핵산과 연관된 뉴클레오티드 서열을 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용한 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술에 의해 검출될 수 있다. 외인성 핵산의 발현은 유전자 발현 분석을 비롯한 통상적인 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 가령, 외인성 핵산으로부터 생성된 mRNA는 노던 블롯 및 역전사 PCR (RT-PCR)을 이용하여 검출되고 정량화될 수 있다.
외인성 핵산으로부터의 RNA 발현 역시 효소적 활성 또는 리포터 단백질 활성을 측정함으로써 검출될 수 있다. 가령, 안티센스 조정 활성은 외인성 핵산이 효과물질 RNA를 생산하고 있다는 표시로서 표적 핵산 발현에서 증가 또는 감소로서 간접적으로 측정될 수 있다. 서열 보존에 근거하여, 프라이머가 설계되고 표적 유전자의 코딩 영역을 증폭하는데 이용될 수 있다. 초기에, 각 유전자로부터 가장 많이 발현된 코딩 영역은 비록 임의의 코딩 또는 비-코딩 영역이 이용될 수 있긴 하지만, 모델 기준 유전자를 구축하는데 이용될 수 있다. 각 기준 유전자는 리포터 코딩 영역 및 이의 폴리(A) 신호 사이에 각 코딩 영역을 삽입함으로써 어셈블리된다. 이와 같은 플라스미드는 유전자의 상류 부분에 리포터 유전자, 그리고 3' 비-코딩 영역에 잠재적인 RNAi 표적을 보유하는 mRNA를 생산할 것이다. 개별 안티센스 올리고뉴클레오티드의 효능은 리포터 유전자를 조정함으로써 평가될 것이다. 본 발명의 방법에 유용한 리포터 유전자에는 아세토히드록시산 합성효소 (AHAS), 알칼리 포스파타제 (AP), 베타 갈락토시다아제 (LacZ), 베타 글루코로니다제 (GUS), 클로람페니콜 아세틸전이효소 (CAT), 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 황색 형광 단백질 (YFP), 청록색 형광 단백질 (CFP), 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 루시페라제 (Luc), 노팔린 합성효소 (NOS), 옥토파인 합성효소 (OCS), 그리고 이들의 유도체가 포함된다. 암피실린, 블레오마이신, 클로람페니콜, 젠타마이신, 하이그로마이신, 카나마이신, 린코마이신, 메토트렉세이트, 포스피노트리친, 퓨로마이신 및 테트라사이클린에 내성을 부여하는 다중 선택성 마커가 이용된다. 리포터 유전자의 조정을 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 이들 방법에는 형광 측정법 (가령, 형광 분광학, 형광 활성화된 세포 분류 (FACS), 형광 현미경), 항생제 내성 결정이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
SIRT1, SIRT3과 SIRT6 단백질 및 mRNA 발현은 당업자에게 공지되고 본 명세서에서 설명된 방법을 이용하여 평가될 수 있다. 가령, 면역분석법, 예를 들면, ELISA가 단백질 수준을 측정하는데 이용될 수 있다. ELISA를 위한 시르투인 (SIRT) 항체는 예로써, R&D Systems (Minneapolis, MN), Abcam (Cambridge, MA)로부터 상업적으로 가용하다.
구체예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하여 처리된 샘플 (가령, 생체내에서 또는 시험관내에서 세포 또는 조직)에서 SIRT1, SIRT3과 SIRT6 발현 (가령, mRNA 또는 단백질)은 대조 샘플에서 시르투인 (SIRT) 발현과의 비교에 의해 평가된다. 가령, 단백질 또는 핵산의 발현은 당업자에게 공지된 방법을 이용하여, 모의-처리된 또는 처리되지 않은 샘플에서 발현과 비교될 수 있다. 대안으로, 대조 안티센스 올리고뉴클레오티드 (가령, 변경된 또는 상이한 서열을 보유하는 것)로 처리된 샘플과의 비교는 요망되는 정보에 따라 수행될 수 있다. 다른 구체예에서, 처리된 샘플 대(對) 처리되지 않은 샘플에서 시르투인 (SIRT) 단백질 또는 핵산의 발현에서 차이는 처리된 샘플 대(對) 처리되지 않은 샘플에서 상이한 핵산 (연구자에 의해 적절한 것으로 간주되는 임의의 표준, 예를 들면, 가사 유전자 (housekeeping gene) 포함)의 발현에서 차이와 비교될 수 있다.
관찰된 차이는 대조와의 비교에서 이용을 위하여, 원하는 대로, 예를 들면, 비율 (ratio) 또는 분율 (fraction)의 형태로 표시될 수 있다. 구체예에서, 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 샘플에서 시르투인 (SIRT) mRNA 또는 단백질의 수준은 처리되지 않은 샘플, 또는 대조 핵산으로 처리된 샘플과 비교하여, 대략 1.25-배 내지 대략 10-배 또는 그 이상 증가되거나 감소된다. 구체예에서, 시르투인 (SIRT) mRNA 또는 단백질의 수준은 최소한 대략 1.25-배, 최소한 대략 1.3-배, 최소한 대략 1.4-배, 최소한 대략 1.5-배, 최소한 대략 1.6-배, 최소한 대략 1.7-배, 최소한 대략 1.8-배, 최소한 대략 2-배, 최소한 대략 2.5-배, 최소한 대략 3-배, 최소한 대략 3.5-배, 최소한 대략 4-배, 최소한 대략 4.5-배, 최소한 대략 5-배, 최소한 대략 5.5-배, 최소한 대략 6-배, 최소한 대략 6.5-배, 최소한 대략 7-배, 최소한 대략 7.5-배, 최소한 대략 8-배, 최소한 대략 8.5-배, 최소한 대략 9-배, 최소한 대략 9.5-배, 또는 최소한 대략 10-배 또는 그 이상 증가되거나 감소된다.
키트, 연구 시약, 진단제 및 치료제
본 발명의 화합물은 진단, 치료 및 예방용으로 이용되거나, 또는 연구 시약 및 키트 성분으로 이용될 수 있다. 게다가, 정교한 특이성으로 유전자 발현을 저해할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 특정 유전자의 기능을 밝히거나, 또는 생물학적 경로의 다양한 구성원의 기능을 구별하기 위하여 당업자에 의해 종종 이용된다.
키트 및 진단제에서, 그리고 다양한 생물학적 시스템에서 사용을 위하여, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 다른 화합물 또는 치료제와 공동으로, 세포 및 조직 내에서 발현되는 유전자의 일부 또는 전체 보체의 발현 패턴을 밝히기 위한 차등적 및/또는 복합적 분석에서 도구로서 유용하다.
본 명세서에서, 용어 "생물학적 시스템" 또는 "시스템"은 시르투인 (SIRT)의 산물을 발현하는, 또는 이들을 발현하는데 적격인 임의의 생명체, 세포, 세포 배양액 또는 조직으로 정의된다. 이들에는 인간, 유전자도입 동물, 세포, 세포 배양액, 조직, 이종이식편, 이식물 및 이들의 조합이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
무제한적 실례로써, 하나 이상의 안티센스 화합물로 처리된 세포 또는 조직 내에서 발현 패턴은 안티센스 화합물로 처리되지 않은 대조 세포 또는 조직과 비교되고, 그리고 생성된 패턴은 검사되는 유전자의 질환 연관성, 신호전달 경로, 세포 국지화, 발현 수준, 크기, 구조 또는 기능에 관련되기 때문에 차등적인 유전자 발현 수준에 대해 분석된다. 이들 분석은 자극된 또는 자극되지 않은 세포 상에서, 그리고 발현 패턴에 영향을 주는 다른 화합물의 존부하에 실행될 수 있다.
당분야에 공지된 유전자 발현 분석 방법의 실례에는 DNA 어레이 또는 마이크로어레이, SAGE (유전자 발현의 일련의 분석), READS (절단된 cDNA의 제한 효소 증폭), TOGA (전체 유전자 발현 분석), 단백질 어레이 및 단백체학 (proteomics), 발현된 서열 tag (EST) 염기서열분석, 차감성 RNA 핑거프린팅 (SuRF), 차감성 클로닝, 차등적 디스플레이(DD), 비교 게놈 혼성화, FISH (형광 원위치 혼성화) 기술 (Going and Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35, 1895-904) 및 질량 분석 방법이 포함된다.
본 발명의 화합물은 이들 화합물이 시르투인 (SIRT)를 인코딩하는 핵산에 혼성화되기 때문에, 연구 및 진단에 유용하다. 가령, 효과적인 시르투인 (SIRT) 조정물질이 될 수 있을 만큼, 본 명세서에서 기술된 조건 하에 충분한 효율로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드는 각각, 유전자 증폭 또는 검출에 유리한 조건하에 효과적인 프라이머 또는 프로브이다. 이들 프라이머 및 프로브는 시르투인 (SIRT)를 인코딩하는 핵산 분자의 특이적 검출을 요구하는 방법에서, 그리고 시르투인 (SIRT)의 검출 또는 추가 연구에 이용을 위한 이들 핵산 분자의 증폭에서 유용하다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 프라이머 및 프로브와 시르투인 (SIRT)를 인코딩하는 핵산의 혼성화는 당분야에 공지된 방법에 의해 검출될 수 있다. 이와 같은 수단에는 올리고뉴클레오티드에 효소의 접합 (conjugation), 올리고뉴클레오티드의 방사성라벨링, 또는 임의의 다른 적합한 검출 수단이 포함될 수 있다. 샘플에서 시르투인 (SIRT)의 수준을 검출하기 위하여 이와 같은 검출 수단을 이용하는 키트 역시 만들어질 수 있다.
안티센스의 특이성 및 민감성 역시 치료요법적 용도를 위하여 당업자에 의해 이용된다. 인간을 비롯한 동물의 질환 상태의 치료에서 치료요법적 모이어티로서 안티센스 화합물이 이용되고 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 약물은 인간에게 안전하고 효과적으로 투여되고 있고, 그리고 다수의 임상 시험이 현재 진행중이다. 따라서 안티센스 화합물은 세포, 조직 및 동물, 특히 인간의 치료를 위한 치료 섭생에서 유용하도록 설정되는 유용한 치료 양식이 될 수 있는 것으로 확립된다.
치료를 위하여, 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 발현을 조정함으로써 치료될 수 있는 질환이나 장애를 앓는 것으로 의심되는 동물, 바람직하게는 인간은 본 발명에 따른 안티센스 화합물을 투여함으로써 치료된다. 가령, 한 가지 무제한적인 구체예에서, 이들 방법은 치료를 요하는 동물에 시르투인 (SIRT) 조정물질의 치료 효과량을 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 시르투인 (SIRT) 조정물질은 시르투인 (SIRT)의 활성을 효과적으로 조정하거나, 또는 시르투인 (SIRT) 단백질의 발현을 효과적으로 조정한다. 한 구체예에서, 동물에서 시르투인 (SIRT)의 활성 또는 발현은 대조와 비교하여 대략 10% 저해된다. 바람직하게는, 동물에서 시르투인 (SIRT)의 활성 또는 발현은 대략 30% 저해된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 시르투인 (SIRT)의 활성 또는 발현은 대략 50% 또는 그 이상 저해된다. 따라서 이들 올리고머 화합물은 시르투인 (SIRT) mRNA의 발현을 대조와 비교하여, 최소한 10%, 최소한 50%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 조정한다.
한 구체예에서, 동물에서 시르투인 (SIRT)의 활성 또는 발현은 대조와 비교하여 대략 10% 증가된다. 바람직하게는, 동물에서 시르투인 (SIRT)의 활성 또는 발현은 대략 30% 증가된다. 더욱 바람직하게는, 동물에서 시르투인 (SIRT)의 활성 또는 발현은 50% 또는 그 이상 증가된다. 따라서 올리고머 화합물은 대조와 비교하여, 시르투인 (SIRT) mRNA의 발현을 최소한 10%, 최소한 50%, 최소한 25%, 최소한 30%, 최소한 40%, 최소한 50%, 최소한 60%, 최소한 70%, 최소한 75%, 최소한 80%, 최소한 85%, 최소한 90%, 최소한 95%, 최소한 98%, 최소한 99%, 또는 100% 조정한다.
구체예에서, 시르투인 조정은 생물학적 샘플에서 시르투인 mRNA, 안티센스 RNA, 단백질, 시르투인에 대한 생물마커, 또는 이들의 조합의 수준을 측정함으로써 관찰된다. 시르투인 생물마커에는 예로써, MCP-1, BMP 수용체 1A, Smpd13a, CD14, ApoE, FAS, 트랜스티레틴, FABP1, 아실-CoA 티오에스테라아제 1, 아실-CoA 티오에스테라아제 2, 아쿠아포린 4, Rrad, CXCL9, CCL8, Ppp1r3g, ApoA-I, ApoA-II, 그리고 ApoB가 포함된다. 시르투인 발현을 위한 생물마커 및 시르투인 발현의 모니터링에서 그들의 용도는 예로써, 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입되는 U. S. Pat. App. Pub. No. 2010/0215632, “Biomarkers of Sirtuin Activity and Methods of Use Thereof”에서 기술된다.
시르투인 활성에 대한 분석평가에는 아세틸전이효소/탈아세틸라아제 활성에 대한 분석평가가 포함된다. 이런 분석평가는 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입되는 기존 문헌, 예를 들면, U.S. 특허 출원 공개 제2009/0221020호, “Mass Spectrometry Assays for Acetyltransferase/Deacetylase Activity”에서 기술되었다. 당업자에게 공지된 시르투인 활성에 대한 임의의 분석평가는 본 발명의 방법과 공동으로 시르투인 활성의 측정에서 이용이 예기된다.
일정한 구체예에서, 시르투인 발현의 조정은 시르투인 mRNA 사본수, mRNA 농도, 또는 생물마커 mRNA 또는 단백질 발현 또는 활성에서, 대조, 예를 들면, 처리되지 않은 또는 모의-처리된 샘플과 비교하여 최소한 대략 10%, 최소한 대략 15%, 최소한 대략 20%, 최소한 대략 25%, 최소한 대략 30%, 최소한 대략 40%, 최소한 대략 50%, 최소한 대략 60%, 최소한 대략 70%, 최소한 대략 75%, 최소한 대략 80%, 최소한 대략 90%, 최소한 대략 100%, 최소한 대략 125%, 최소한 대략 150%, 최소한 대략 200%, 최소한 대략 250%, 최소한 대략 300%, 최소한 대략 3500%, 최소한 대략 400%, 최소한 대략 450%, 또는 최소한 대략 500%, 최소한 대략 600%, 최소한 대략 700%, 최소한 대략 800%, 최소한 대략 900%, 또는 최소한 대략 1000%의 증가 (상향조절) 또는 감소 (하향조절)에 의해 확인된다. 구체예에서, 시르투인 mRNA 사본수, mRNA 농도, 또는 생물마커 mRNA 또는 단백질 발현 또는 활성은 대략 10% 내지 대략 500% 증가하거나 감소한다. 구체예에서, 시르투인 mRNA 사본수, mRNA 농도, 또는 생물마커 mRNA 또는 단백질 발현 또는 활성은 대략 10% 내지 대략 50%, 대략 10% 내지 대략 100%, 대략 10% 내지 대략 150%, 대략 10% 내지 대략 200%, 대략 10% 내지 대략 250%, 대략 10% 내지 대략 300%, 대략 10% 내지 대략 350%, 대략 10% 내지 대략 400%, 대략 10% 내지 대략 450%, 대략 10% 내지 대략 500%, 대략 10% 내지 대략 600%, 대략 10% 내지 대략 700%, 대략 10% 내지 대략 800%, 대략 10% 내지 대략 900%, 대략 10% 내지 대략 1000%, 대략 50% 내지 대략 100%, 대략 50% 내지 대략 150%, 대략 50% 내지 대략 200%, 대략 50% 내지 대략 250%, 대략 50% 내지 대략 300%, 대략 50% 내지 대략 350%, 대략 50% 내지 대략 400%, 대략 50% 내지 대략 450%, 대략 50% 내지 대략 500%, 대략 50% 내지 대략 600%, 대략 50% 내지 대략 700%, 대략 50% 내지 대략 800%, 대략 50% 내지 대략 900%, 대략 50% 내지 대략 1000%, 대략 100% 내지 대략 150%, 대략 100% 내지 대략 200%, 대략 100% 내지 대략 250%, 대략 100% 내지 대략 300%, 대략 100% 내지 대략 350%, 대략 100% 내지 대략 400%, 대략 100% 내지 대략 450%, 대략 100% 내지 대략 500%, 대략 100% 내지 대략 600%, 대략 100% 내지 대략 700%, 대략 100% 내지 대략 800%, 대략 100% 내지 대략 900%, 대략 100% 내지 대략 1000%, 대략 150% 내지 대략 200%, 대략 150% 내지 대략 250%, 대략 150% 내지 대략 300%, 대략 150% 내지 대략 350%, 대략 150% 내지 대략 400%, 대략 150% 내지 대략 450%, 대략 150% 내지 대략 500%, 대략 150% 내지 대략 600%, 대략 150% 내지 대략 700%, 대략 150% 내지 대략 800%, 대략 150% 내지 대략 900%, 대략 150% 내지 대략 1000%, 대략 200% 내지 대략 250%, 대략 200% 내지 대략 300%, 대략 200% 내지 대략 350%, 대략 200% 내지 대략 400%, 대략 200% 내지 대략 450%, 대략 200% 내지 대략 500%, 대략 200% 내지 대략 600%, 대략 200% 내지 대략 700%, 대략 200% 내지 대략 800%, 대략 200% 내지 대략 900%, 또는 대략 200% 내지 대략 1000% 증가하거나 감소한다.
가령, 시르투인 (SIRT)의 발현 감소는 동물의 혈청, 혈액, 지방 조직, 간 또는 임의의 기타 체액, 조직 또는 기관에서 측정될 수 있다. 바람직하게는, 분석되는 체액, 조직 또는 기관 내에 포함된 세포는 시르투인 (SIRT) 펩티드를 인코딩하는 핵산 분자 및/또는 시르투인 (SIRT) 단백질 자체를 포함한다.
본 발명의 화합물은 적절한 제약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체에 효과량의 화합물을 첨가함으로써 제약학적 조성물에 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 방법의 이용은 또한, 예방학적으로 유용하다.
접합체 (conjugate)
본 발명의 올리고뉴클레오티드의 다른 변형은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 취입을 증강시키는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체를 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 연결시키는 것을 수반한다. 이들 모이어티 또는 접합체는 1차 또는 2차 히드록실 기와 같은 기능기에 공유 결합된 접합체 기를 포함할 수 있다. 본 발명의 접합체 기에는 삽입기, 리포터 분자, 폴리아민, 폴리아미드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에테르, 올리고머의 약역학적 성질을 강화시키는 기, 그리고 올리고머의 약동학적 성질을 강화시키는 기가 포함된다. 전형적인 접합체 기에는 콜레스테롤, 지질, 인지질, 바이오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료가 포함된다. 본 발명의 맥락에서, 약역학적 성질을 강화시키는 기에는 취입을 개선하고, 분해에 대한 내성을 강화시키고, 및/또는 표적 핵산과의 서열 특이적 혼성화를 강화시키는 기가 포함된다. 본 발명의 맥락에서, 약동학적 성질을 강화시키는 기에는 본 발명의 화합물의 취입, 분포, 대사 또는 배출을 개선하는 기가 포함된다. 대표적인 접합체 기는 국제 특허 출원 PCT/US92/09196 (1992년 10월 23일 출원) 및 U.S. 특허 제6,287,860호에서 설명되고, 이들은 본 발명에 참고문헌으로서 편입된다. 접합체 모이어티에는 지질 모이어티, 예를 들면, 콜레스테롤 모이어티, 콜린산, 티오에테르, 예를 들면, 헥실-5-트리틸티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들면, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들면, 디-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸암모늄 1,2-디-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 마다만탄 아세트산, 팔미틸 모이어티, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 모이어티가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 활성 약물 물질, 예를 들면, 아스피린, 와파린, 페닐부타존, 이부프로펜, 수프로펜, 펜부펜, 케토프로펜, (S)-(+)-프라노프로펜, 카르프로펜, 단실사르코신, 2,3,5-트리요오드벤조산, 풀루페남산, 폴린산, 벤조티아디아지드, 클로로티아지드, 디아제핀, 인도메티신, 바르비투레이트, 세팔로스포린, 설파 약물, 당뇨병치료제, 항균제 또는 항생제에 접합될 수도 있다.
이와 같은 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. 특허 제4,828,979호; 제4,948,882호; 제5,218,105호; 제5,525,465호; 제5,541,313호; 제5,545,730호; 제5,552,538호; 제5,578,717호; 제5,580,731호; 제5,580,731호; 제5,591,584호; 제5,109,124호; 제5,118,802호; 제5,138,045호; 제5,414,077호; 제5,486,603호; 제5,512,439호; 제5,578,718호; 제5,608,046호; 제4,587,044호; 제4,605,735호; 제4,667,025호; 제4,762,779호; 제4,789,737호; 제4,824,941호; 제4,835,263호; 제4,876,335호; 제4,904,582호; 제4,958,013호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,082,830호; 제5,112,963호; 제5,214,136호; 제5,245,022호; 제5,254,469호; 제5,258,506호; 제5,262,536호; 제5,272,250호; 제5,292,873호; 제5,317,098호; 제5,371,241호; 제5,391,723호; 제5,416,203호, 제5,451,463호; 제5,510,475호; 제5,512,667호; 제5,514,785호; 제5,565,552호; 제5,567,810호; 제5,574,142호; 제5,585,481호; 제5,587,371호; 제5,595,726호; 제5,597,696호; 제5,599,923호; 제5,599,928호 및 제5,688,941호가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
제제 (formulations)
본 발명의 화합물은 취입, 분포 및/또는 흡수를 지원하기 위한 화합물의 다른 분자, 분자 구조 또는 혼합물, 예를 들면, 리포좀, 수용체-표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제제와 혼합되거나, 포집되거나, 접합되거나 또는 연합될 수 있다. 이와 같은 취입, 분포 및/또는 흡수-지원 제제의 제조를 교시하는 대표적인 U.S. 특허에는 U.S. 특허 제5,108,921호; 제5,354,844호; 제5,416,016호; 제5,459,127호; 제5,521,291호; 제5,543,165호; 제5,547,932호; 제5,583,020호; 제5,591,721호; 제4,426,330호; 제4,534,899호; 제5,013,556호; 제5,108,921호; 제5,213,804호; 제5,227,170호; 제5,264,221호; 제5,356,633호; 제5,395,619호; 제5,416,016호; 제5,417,978호; 제5,462,854호; 제5,469,854호; 제5,512,295호; 제5,527,528호; 제5,534,259호; 제5,543,152호; 제5,556,948호; 5,580,575호; 및 5,595,756호가 포함되지만 이들에 국한되지 않고, 이들 각각은 참고문헌으로서 편입된다.
비록 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적 발현 및/또는 기능을 조정하기 위하여 벡터로 투여될 필요는 없지만, 본 발명의 구체예는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 발현을 위한 발현 벡터 구조체에 관계하고, 이들 벡터 구조체는 프로모터, 하이브리드 프로모터 유전자 서열을 포함하고, 그리고 강한 구조성 프로모터 활성, 또는 원하는 경우 유도될 수 있는 프로모터 활성을 갖는다.
한 구체예에서, 본 발명의 실시는 적절한 핵산 운반 시스템으로 전술한 안티센스 올리고뉴클레오티드 중에서 최소한 하나를 투여하는 것을 수반한다. 한 구체예에서, 상기 시스템은 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 비-바이러스 벡터를 포함한다. 이와 같은 비-바이러스 벡터의 실례는 단독으로, 또는 적합한 단백질, 폴리사카라이드 또는 지질 제제와 공동으로 올리고뉴클레오티드 (가령 서열 번호: 24 내지 127 중에서 임의의 하나 이상)를 포함한다.
추가로 적합한 핵산 운반 시스템에는 바이러스 벡터, 전형적으로 아데노바이러스, 아데노바이러스-연합된 바이러스 (AAV), 헬퍼-의존성 아데노바이러스, 레트로바이러스 또는 Japan-리포좀의 헤마글루티닌 바이러스 (HVJ) 복합체 중에서 최소한 하나로부터 서열이 포함된다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 폴리뉴클레오티드에 작동가능하게 연결된 강한 진핵 프로모터, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터가 포함된다.
추가적으로 바람직한 벡터에는 바이러스 벡터, 융합 단백질 및 화학적 접합체가 포함된다. 레트로바이러스 벡터에는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 및 HIV-계 바이러스가 포함된다. 한 가지 바람직한 HIV-계 바이러스 벡터는 최소한 2개 벡터를 포함하고, 여기서 gag 및 pol 유전자는 HIV 게놈으로부터 유래되고, env 유전자는 다른 바이러스로부터 유래된다. DNA 바이러스 벡터가 바람직하다. 이들 벡터에는 폭스 벡터, 예를 들면, 오르토폭스 (orthopox) 또는 아비폭스 (avipox) 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 예를 들면, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스 (HSV) 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연합된 바이러스 벡터가 포함된다.
본 발명의 안티센스 화합물은 임의의 제약학적으로 허용되는 염, 에스테르 또는 이와 같은 에스테르의 염, 또는 인간을 비롯한 동물에 투여시 생물학적 활성 대사물질 또는 이의 잔기를 직간접적으로 제공할 수 있는 임의의 다른 화합물을 포함한다.
용어 "약리학적으로 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 생리학적으로 및 제약학적으로 허용되는 염, 다시 말하면, 부모 화합물의 바람직한 생물학적 활성을 보유하지만 여기에 바람직하지 않은 독성 효과를 부여하지 않는 염을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드의 경우, 제약학적으로 허용되는 염의 실례 및 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명되고, 이는 참고문헌으로서 편입된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 안티센스 화합물을 포함하는 제약학적 조성물 및 제제를 포함한다. 본 발명의 제약학적 조성물은 국소 또는 전신 치료가 바람직한지 그리고 치료되는 부위에 따라 여러 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 (눈, 그리고 질 및 직장 운반을 비롯한 점막 포함), 예로써 분무기를 비롯하여 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 통기에 의해 폐; 기관내 (intratracheal), 비내, 상피 또는 경피, 구강 또는 비경구일 수 있다. 비경구 (parenteral) 투여에는 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내 (intracranial), 예를 들면, 수막강내 또는 뇌실내 투여가 포함된다.
중추신경계 내에 조직을 치료하기 위하여, 투여는 예로써, 뇌척수액 (cerebrospinal fluid) 내로 주사 또는 주입에 의해 수행될 수 있다. 뇌척수액 내로 안티센스 RNA의 투여는 예로써, U.S. 특허 출원 공개 번호 제2007/0117772호, "Methods for slowing familial ALS disease progression"에서 설명되고, 이는 본 발명에 전체로서 참고문헌으로서 편입된다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드가 중추신경계 내에 세포에 투여되는 것으로 의도될 때, 투여는 뇌-혈관 장벽 (blood-brain barrier)을 교차하여 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 침투를 촉진할 수 있는 하나 이상의 작용제로 수행될 수 있다. 주사는 예로써, 내후각뇌피질 (entorhinal cortex) 또는 해마(hippocampus)에서 수행될 수 있다. 근육 조직 내에 운동 뉴런 (motor neuron)에 아데노바이러스 벡터의 투여에 의한 신경영양성 인자의 운반은 예로써, U.S. 특허 제6,632,427호, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons"에서 설명되고, 이는 본 발명에 참고문헌으로서 편입된다. 뇌, 예를 들면, 선조체 (striatum), 시상 (thalamus), 해마 (hippocampus), 또는 흑색질 (substantia nigra)에 직접적으로 벡터의 전달은 당분야에 공지되어 있고, 그리고 예로써, 본 발명에서 참고문헌으로서 편입되는 U.S. 특허 제6,756,523호, "Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain"에서 설명된다. 투여는 주사와 같이 신속하게 수행되거나, 또는 느린 방출 제제 (slow release formulation)의 느린 주입 또는 투여와 같이 장기간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한, 바람직한 제약학적 또는 약역학적 성질을 제공하는 작용제와 연결되거나 접합될 수 있다. 가령, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 뇌-혈관 장벽을 교차하여 침투 또는 운반을 증진하는 당분야에 공지된 임의의 물질, 예를 들면, 트랜스페린 수용체에 대한 항체에 결합되고, 그리고 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 안티센스 화합물은 바이러스 벡터, 예를 들면, 안티센스 화합물을 더욱 효과적으로 만들고 및/또는 뇌-혈관 장벽을 교차하여 안티센스 화합물의 운반을 증가시키기 위하여 바이러스 벡터와 연결될 수 있다. 또한, 삼투성 뇌-혈관 장벽 파괴는 예로써, 메소 에리트리톨 (meso erythritol), 자일리톨 (xylitol), D(+) 갈락토오스 (galactose), D(+) 락토오스 (lactose), D(+) 자일로오스 (xylose), 둘시톨 (dulcitol), 미오-이노시톨 (myo-inositol), L(-) 프럭토오스 (fructose), D(-) 만니톨 (mannitol), D(+) 글루코오스 (glucose), D(+) 아라비노스 (arabinose), D(-) 아라비노스, 셀로비오스 (cellobiose), D(+) 말토오스 (maltose), D(+) 라피노오스 (raffinose), L(+) 람노스 (rhamnose), D(+) 멜리비오스 (melibiose), D(-) 리보오스 (ribose), 아도니톨 (adonitol), D(+) 아라비톨 (arabitol), L(-) 아라비톨, D(+) 푸코오스 (fucose), L(-) 푸코오스, D(-) 릭소스 (lyxose), L(+) 릭소스, 그리고 L(-) 릭소스가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 당, 또는 글루타민 (glutamine), 리신 (lysine), 아르기닌 (arginine), 아스파라긴 (asparagine), 아스파르트산 (aspartic acid), 시스테인 (cysteine), 글루타민산 (glutamic acid), 글리신 (glycine), 히스티딘 (histidine), 류신 (leucine), 메티오닌 (methionine), 페닐알라닌 (phenylalanine), 프롤린 (proline), 세린 (serine), 트레오닌 (threonine), 티로신 (tyrosine), 발린 (valine), 그리고 타우린 (taurine)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는 아미노산의 주입에 의해 달성될 수 있다. 뇌-혈관 장벽 침투를 증강시키기 위한 방법과 물질은 예로써, U.S. 특허 제4,866,042호, "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier", 제6,294,520호, "Material for passage through the blood-brain barrier", 그리고 제6,936,589호, "Parenteral delivery systems"에서 설명되고, 이들 모두 본 발명에 전체로서 참고문헌으로서 편입된다.
본 발명의 안티센스 화합물은 취입, 분포 및/또는 흡수를 지원하기 위한 화합물의 다른 분자, 분자 구조 또는 혼합물, 예를 들면, 리포좀, 수용체-표적화된 분자, 경구, 직장, 국소 또는 기타 제제와 혼합되거나, 포집되거나, 접합되거나 또는 연합될 수 있다. 가령, 양이온성 지질이 올리고뉴클레오티드 취입을 용이하게 하기 위하여 제제 내에 포함될 수 있다. 취입을 용이하게 하는 것으로 밝혀진 이와 같은 한 가지 조성물은 LIPOFECTIN (GIBCO-BRL, Bethesda, MD)이다.
최소한 하나의 2'-O-메톡시에틸 변형을 가진 올리고뉴클레오티드는 경구 투여용으로 특히 유용한 것으로 생각된다. 국소 투여를 위한 제약학적 조성물 및 제제에는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액상 및 분말이 포함된다. 통상적인 약리학적 담체, 수성, 분말 또는 오일 베이스, 농후제 등이 필수적이거나 바람직할 수 있다. 또한, 피복된 콘돔, 장갑 등이 유용할 수 있다.
본 발명의 제약학적 제제는 통상적으로 단위 약형 (unit dosage form)으로 제공될 수 있고, 그리고 제약 산업에서 공지된 전통적인 기술에 따라 제조될 수 있다. 이와 같은 기술은 활성 성분을 제약학적 담체 또는 부형제와 연합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액상 담체 또는 미세하게 분할된 고형 담체 또는 둘 모두와 균일하게 및 친밀하게 연합시키고, 이후 필요에 따라 산물의 모양을 만듦으로써 제조된다.
본 발명의 조성물은 정제, 캡슐, 겔 캡슐, 액체 시럽, 연성 겔, 좌약 및 관장제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 많은 가능한 약형으로 제조될 수 있다. 본 발명의 조성물은 수성, 비-수성 또는 혼성 매체에서 현탁액으로 조제될 수도 있다. 수성 현탁액은 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 포함하는 현탁액의 점성을 증가시키는 물질을 더욱 포함할 수 있다. 현탁액은 또한, 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명의 제약학적 조성물은 용액, 에멀젼, 거품 및 리포좀-함유 조제물이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 제약학적 조성물 및 제제는 하나 이상의 침투 개선제, 담체, 부형제 또는 기타 활성 또는 비활성 성분을 포함할 수 있다.
에멀젼은 전형적으로, 0.1 ㎛ 직경을 초과하는 액적의 형태로 서로 분산된 하나의 액체의 이종 (heterogeneous) 시스템이다. 에멀젼은 분산된 상에 추가하여 추가 성분, 그리고 수성 상, 오일상 또는 별도의 상으로서 그 자체 내에 용액으로서 존재하는 활성 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 구체예로서 마이크로에멀젼이 포함된다. 에멀젼 및 이들의 용도는 당분야에 공지되어 있으며, U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명된다.
본 발명의 제제는 리포좀 제제를 포함한다. 본 발명에서, 용어 "리포좀"은 구형 이중층 또는 이중층에 배열된 양쪽성 지질로 구성된 소포를 의미한다. 리포좀은 단층라멜라 또는 다층라멜라 소포 (vesicle)이고, 이들은 친지성 물질로부터 형성된 막 및 운반되는 조성물을 포함하는 수성 내부를 가진다. 양이온성 리포좀은 안정된 복합체를 형성하기 위하여 음전하를 띈 DNA 분자와 상호작용하는 것으로 생각되는 양전하를 띈 리포좀이다. pH-민감성 또는 음전하를 띈 리포좀은 DNA와 복합체를 형성하기 보다는 DNA를 포집하는 것으로 생각된다. 양이온성 및 비-양이온성 리포좀은 DNA를 세포로 운반하는데 이용된다.
리포좀은 또한 "공간적으로 안정화된" 리포좀을 포함하는데, 본 명세서에서 상기 용어는 하나 이상의 특화된 지질을 포함하는 리포좀을 지칭한다. 리포좀에 통합될 때, 이와 같은 특화된 지질은 이들 특화된 지질이 없는 리포좀과 비교하여 순환 반감기가 강화된 리포좀을 발생시킨다. 공간적으로 안정화된 리포좀의 실례는 리포좀의 소포-형성 지질 부분의 일부가 하나 이상의 글리코리피드를 포함하거나, 또는 하나 이상의 친수성 폴리머, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 모이어티로 유도화된 것들이다. 리포좀 및 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명된다.
본 발명의 제약학적 제제 및 조성물은 계면활성제를 또한 포함할 수 있다. 약물 산물, 제제 및 에멀젼에서 계면활성제의 이용은 당분야에 잘 공지되어 있다. 계면활성제 및 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명되고, 이는 참고문헌으로서 편입된다.
한 구체예에서, 본 발명은 핵산, 특히 올리고뉴클레오티드의 효과적인 운반을 달성하기 위하여 다양한 침투 개선제를 이용한다. 세포 막을 교차하여 비-친지성 약물의 확산을 지원하는 것에 추가하여, 침투 개선제는 또한 친지성 약물의 침투성을 강화시킨다. 침투 개선제는 5가지 넓은 범주, 다시 말하면, 계면활성제, 지방산, 담즙산, 킬레이트화제 그리고 비-킬레이트화 비-계면활성제 중의 하나에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 침투 개선제 및 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명되고, 이는 참고문헌으로서 편입된다.
당업자는 제제가 그들의 의도된 용도, 다시 말하면, 투여 경로에 따라 일과적으로 설계된다는 것을 인지할 것이다.
국소 투여용 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 국소 운반제, 예를 들면, 지질, 리포좀, 지방산, 지방산 에스테르, 스테로이드, 킬레이트화제 및 계면활성제와 혼합되는 것들이다. 지질 및 리포좀에는 중성 (가령, 디올레일-포스파티딜 DOPE 에탄올아민, 디미리스토일포스파티딜 콜린 DMPC, 디스테아로일포스파티딜 콜린), 음성 (가령, 디미리스토일포스파티딜 글리세롤 DMPG) 및 양이온 (가령, 디올레일테트라메틸아미노프로필 DOTAP 및 디올레일-포스파티딜 에탄올아민 DOTMA)이 포함된다.
국소 또는 기타 투여를 위하여, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 리포좀 내에 포집되거나, 또는 특히 양이온 리포좀에 복합체를 형성할 수 있다. 대안으로, 올리고뉴클레오티드는 지질, 특히 양이온 지질에 복합될 수 있다. 지방산 및 에스테르, 이들의 제약학적으로 허용되는 염, 그리고 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명된다.
경구 투여용 조성물 및 제제에는 분말 또는 과립, 미립자, 나노입자, 물 또는 비-수성 매체에서 현탁액 또는 용액, 캡슐, 겔 캡슐, 향낭, 정제 또는 미니정제가 포함된다. 농후제, 향료, 희석제, 유화제, 분산 보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다. 바람직한 경구 제제는 본 발명의 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 침투 개선제, 계면활성제 및 킬레이터와 함께 투여되는 것들이다. 계면활성제에는 지방산 및/또는 이들의 에스테르 또는 염, 담즙산 및/또는 이들의 염이 포함된다. 바람직한 담즙산/염 및 지방산, 그리고 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명되고, 이는 참고문헌으로서 편입된다. 침투 개선제의 조합, 예를 들면, 담즙산/염과 공동으로 지방산/염 역시 바람직하다. 특히 바람직한 조합은 라우르산, 카프르산 및 UDCA의 나트륨염이다. 추가 침투 개선제에는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-20-세틸 에테르가 포함된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 분무된 건조 입자를 비롯한 과립형으로 경구 운반되거나, 또는 미립자 또는 나노입자를 형성하기 위하여 복합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 착화제 및 이들의 용도는 U.S. 특허 제6,287,860호에서 더욱 설명되고, 이는 참고문헌으로서 편입된다.
비경구, 기관내 또는 심실내 투여를 위한 조성물 및 제제에는 완충액, 희석액 및 기타 적합한 첨가제 (침투 개선제, 담체 화합물 및 기타 제약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제가 포함되지만 이들에 국한되지 않음)를 포함하는 무균 수용액이 포함될 수 있다.
본 발명의 일정한 구체예는 하나 이상의 추가 작용제와 공동으로, 하나 이상의 올리고머 화합물을 포함하는 제약학적 조성물을 제시한다. 추가 작용제는 비-안티센스 기전으로 기능할 수 있다. 이차 작용제는 예로써, 시르투인-연관된 질환 또는 장애의 치료에 현재 이용되는 작용제이다. 이차 작용제는 대안으로, 비-시르투인 조절제, 예를 들면, 화학치료제일 수 있다. 가령, 암의 치료에서, 특정 암을 치료하는데 유용한 하나 또는 그 이상의 화학치료제는 본 발명의 최소한 하나의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 공동으로 투여될 수 있다. 복합 치료 섭생은 SIRT 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여가 이차 작용제로 치료 이전에, 동안, 또는 이후에 시작되고, 그리고 이차 작용제로 치료 동안 임의의 시점까지 또는 이차 작용제로 치료의 종결 이후에 지속되는 치료 섭생을 포함한다. 이것은 또한, 병용되는 작용제가 동시에 또는 상이한 시점에 및/또는 치료 기간 동안 감소하는 또는 증가하는 간격에서 투여되는 치료를 포함한다. 복합 치료는 환자의 임상적 관리를 보조하기 위해 다양한 시점에서 시작되고 중단되는 주기적 치료를 포함한다. 가령, 병용되는 작용제는 치료의 시작 시점에 매주 투여되고, 격주로 감소하고, 그리고 적절하면 더욱 감소될 수 있다.
본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 공동으로 환자에 투여될 수 있는 다른 시르투인-조절제는 기존 문헌, 예를 들면, U.S. 특허 출원 공개 제2009/0163476호, “N-Phenyl Benzamide Derivatives as Sirtuin Modulators”에서 기술되었고, 이것은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다. 상기 공보에서는 신경퇴행성 질환, 그리고 중추신경계 (CNS), 척수 또는 말초신경계 (PNS)에 외상적 또는 물리적 손상을 치료하기 위한 일정한 시르투인 조정 화합물의 용도를 보고한다. 상기 공보에서는 또한, 시르투인-조정제와 병용될 수 있는 추가의 치료제를 열거한다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드와 공동으로 환자에 투여를 위해 고려되는 또 다른 시르투인-조절제는 U.S. 특허 제7,855,289호 "Sirtuin modulating compounds,"; U.S. 특허 제7,829,556호 "Sirtuin modulating compounds;" U.S. 특허 출원 공개 제2009/0143376호, "Fused Heterocyclic Compounds and Their Use as Sirtuin Modulators;" U.S. 특허 출원 공개 제2009/0069301호, "Acridine and Quinoline Derivatives as Sirtuin Modulators;" U.S. 특허 출원 공개 제2007/0037865호, "Sirtuin modulating compounds;" U.S. 특허 출원 공개 제2007/0149466호, "Methods and related compositions for treating or preventing obesity, insulin resistance disorders, and mitochondrial-associated disorders”에서 기술되고, 이들 각각은 본 발명에 전체로서 참고문헌으로 편입된다.
이와 같은 화학요법제의 실례에는 다우노루비신, 다우노마이신, 닥티노마이신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 에소루비신, 블레오마이신, 마포스파미드, 이포스파미드, 시토신 아라비노시드, 비스클로로에틸-니트로소우레아, 부설판, 미토마이신 C, 악티노마이신 D, 미트라마이신, 프레드니손, 히드록시프로게스테론, 테스토스테론, 타목시펜, 다카르바진, 프로카르바진, 헥사메틸멜라민, 펜타메틸멜라민, 미톡산트론, 암사크린, 클로람부실, 메틸사이클로헥실니트로소우레아, 질소 겨자, 멜파란, 사이클로포스파미드, 6-멀캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-아자시티딘, 히드록시우레아, 데옥시코포르마이신, 4-히드록시퍼옥시사이클로-포스포라미드, 5-플루오르우라실 (5-FU), 5-플루오르데옥시우리딘 (5-FUdR), 메토트렉세이트(MTX), 콜히친, 탁솔, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드 (VP-16), 트리메트렉세이트, 이리노테칸, 토포테칸, 젬시타빈, 테니포시드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스트롤(DES)이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 본 발명의 화합물과 함께 이용될 때, 이와 같은 화학요법제는 개별적으로 (가령, 5-FU 및 올리고뉴클레오티드), 순차적으로 (가령, 일정 기간 동안 5-FU 및 올리고뉴클레오티드, 그 이후에 MTX 및 올리고뉴클레오티드), 또는 하나 이상의 다른 화학요법제 (가령, 5-FU, MTX 및 올리고뉴클레오티드, 또는 5-FU, 방사능요법 및 올리고뉴클레오티드)와 함께 이용될 수 있다. 비-스테로이드성 소염제 및 코르티코스테로이드가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 소염제 약물, 그리고 리비비린, 비다라빈, 아시클로비르 및 강시클로비르가 포함되지만 이들에 국한되지 않는 항바이러스 약물 역시 본 발명의 조성물에 복합될 수 있다. 안티센스 화합물 및 다른 비-안티센스 약물의 복합 역시 본 발명의 범위 내에 있다. 2개 이상의 복합 화합물이 함께 또는 순차적으로 이용될 수 있다.
다른 관련된 구체예에서, 본 발명의 조성물은 제 1 핵산을 표적으로 하는 하나 이상의 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드, 그리고 제 2 핵산 표적을 표적으로 하는 하나 이상의 추가 안티센스 화합물을 포함한다. 가령, 제 1 표적은 시르투인 (SIRT)의 특정 안티센스 서열일 수 있고, 그리고 제 2 표적은 다른 뉴클레오티드 서열로부터 영역일 수 있다. 대안으로, 본 발명의 조성물은 동일한 시르투인 (SIRT) 핵산 표적의 상이한 영역을 표적으로 하는 2개 이상의 안티센스 화합물을 포함할 수 있다. 안티센스 화합물의 다양한 실례가 본 명세서에서 예시되고, 그리고 기타 화합물은 당분야에 공지된 적합한 화합물 중에서 선택될 수 있다. 2개 이상의 복합 화합물이 함께 또는 순차적으로 이용될 수 있다.
약액주입 (dosing):
치료 조성물의 조제 및 이들의 후속 투여 (약액주입)는 당분야의 기술에 속한다. 약액주입은 수 일 내지 수개월간, 또는 치료 효과 또는 질환 상태의 감소가 달성될 때까지 지속되는 치료 과정과 함께, 치료되는 질환 상태의 중증도와 반응성에 좌우된다. 최적의 약액주입 일정은 환자의 신체에 약물 축적의 측량으로부터 계산될 수 있다. 당업자는 최적 용량, 약액주입 방법 및 반복률을 용이하게 결정할 수 있다. 최적 용량은 개별 올리고뉴클레오티드의 상대적 효능에 따라 달라질 수 있고, 그리고 일반적으로, 시험관내 및 생체내 동물 모델에서 효과적인 것으로 밝혀진 EC50에 근거하여 예측될 수 있다. 일반적으로, 용량은 체중 kg당 0.01㎍ 내지 100 g이고, 일일, 매주, 매월 또는 매년 1회 이상, 또는 심지어 2 내지 20년 마다 1회 제공될 수 있다. 당업자는 측정된 잔류 시간 및 체액 또는 조직 내에 약물의 농도에 근거하여 약액주입을 위한 반복률을 용이하게 예측할 수 있다. 성공적인 치료후, 질환 상태의 재발을 방지하기 위하여 환자가 유지요법을 받도록 하는 것이 바람직하며, 이때 올리고뉴클레오티드는 체중 kg당 0.01 ㎍ 내지 100 g 범위의 유지 용량으로, 일일 1회 이상 내지 20년마다 1회 투여된다.
구체예에서, 환자는 체중 ㎏당 최소한 대략 1, 최소한 대략 2, 최소한 대략 3, 최소한 대략 4, 최소한 대략 5, 최소한 대략 6, 최소한 대략 7, 최소한 대략 8, 최소한 대략 9, 최소한 대략 10, 최소한 대략 15, 최소한 대략 20, 최소한 대략 25, 최소한 대략 30, 최소한 대략 35, 최소한 대략 40, 최소한 대략 45, 최소한 대략 50, 최소한 대략 60, 최소한 대략 70, 최소한 대략 80, 최소한 대략 90, 또는 최소한 대략 100 ㎎인 약물의 용량으로 치료된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 일정한 주사 용량은 예로써, U.S. 특허 제7,563,884호, "Antisense modulation of PTP1B expression"에서 설명되고, 이는 본 발명에 참고문헌으로서 편입된다.
본 발명의 다양한 구체예들이 상기에서 설명되긴 했지만, 이들은 단지 예시로써 제공되고 제한으로서 간주되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 또는 사상을 벗어나지 않으면서, 본 발명의 개시에 따라서 이들 설명된 구체예에 대해 다양한 변화가 만들어질 수 있다. 따라서 본 발명의 범위는 상기 설명된 임의의 구체예에 의해 한정되지 않는다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌은 본 발명에 참고문헌으로서 편입된다. 본 출원에서 인용된 모든 간행물 및 특허 문헌은 각 간행물 또는 특허 문헌이 개별적으로 그렇게 언급된 것처럼, 전체로서 참고문헌으로서 편입된다. 본 문서에서 다양한 참고문헌의 인용에 의해, 임의의 특정한 참고문헌이 본 발명에 대한 "선행 기술"로 인정되지는 않는다. 본 발명의 조성물 및 방법의 구체예는 하기 실시예에서 예시된다.
도면의 간단한 설명
도 1과 2에서는 HepG2 세포가 표적 SIRT 안티센스 CV396200에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드로 처리된 실험의 실시간 PCR 결과를 도시한다. 이들 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 sirtas에 대해 설계된 siRNA 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (sirtas_5, P=0.01). 동일한 샘플에서, sirtas RNA의 수준은 sirtas_5로 처리후 유의미하게 감소되지만, sirtas_6과 sirtas_7로 처리후 변화가 없었고, 이들은 SIRT1 mRNA 수준에도 영향을 주지 않았다 (도 2). sirtas_5, sirtas_6 및 sirtas_7은 각각, 서열 번호: 47, 48과 49에 상응한다.
도 3에서는 SIRT 안티센스를 교차하여 올리고뉴클레오티드 보행에 대한 결과를 도시한다. 실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 sirtas에 대해 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드 중에서 3가지 (CUR-0292, CUR-0307 및 CUR-0308)로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-0292 내지 CUR-0309는 각각, 서열 번호: 24 내지 41에 상응한다.
도 4와 5에서는 HepG2 (도 4) 및 Vero76 (도 5) 세포에서 PS, LNA와 2’O Me 변형된 올리고뉴클레오티드에 대한 결과를 도시한다. 실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 안티센스에 대한 PS, LNA, 2’O Me와 2’O Me 믹스머 (mixmer) 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. Vero 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준 역시 SIRT1 안티센스에 대한 PS와 LNA 변형된 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 48시간 시점에 증가되었다. CUR-0245, CUR-0736, CUR 0688, CUR-0740 및 CUR-0664로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 42 내지 46에 상응한다.
도 6에서는 원숭이 지방 생검의 PCR 결과를 도시한다. 실시간 PCR 결과는 SIRT1 안티센스 CV396200.1에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드인 CUR-963이 약액주입된 원숭이로부터 지방 생검에서 SIRT1 mRNA 수준의 증가를 증명한다. CUR-963은 서열 번호: 43에 상응한다.
도 7에서는 일차 원숭이 간 간세포의 PCR 결과를 도시한다. 실시간 PCR 결과는 SIRT1 안티센스에 대한 올리고뉴클레오티드로 치료후 SIRT1 mRNA 수준에서 증가를 증명한다. CUR-0245로 표시된 막대는 서열 번호: 42에 상응한다.
도 8에서는 SIRT 안티센스 CV396200에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드에 대한 결과를 도시한다. 실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 안티센스 CV396200에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 한 가지로 처리 이후에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-1230 내지 CUR-1233으로 표시된 막대는 서열 번호: 50 내지 53에 상응한다.
도 9에서는 SIRT 안티센스 CV428275에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드에 대한 결과를 도시한다. 실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 안티센스 CV428275에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 2가지로 처리 이후에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-1302, CUR-1304, CUR-1303 및 CUR-1305로 표시된 막대는 서열 번호: 54 내지 57에 상응한다.
도 10에서는 실시간 PCR 결과를 도시한다. 이들 결과는 SIRT 안티센스 BE717453에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA 수준에서 유의미한 증가를 증명한다. CUR-1264 내지 CUR-1266으로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 58 내지 60에 상응한다.
도 11에서는 실시간 PCR 결과를 도시한다. 이들 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 안티센스 AV718812에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 3가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-1294, CUR-1297, CUR-1295, CUR-1296 및 CUR-1298로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 61 내지 65에 상응한다.
도 12는 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 SIRT1 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. 실시간 PCR 결과는 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 안티센스 AW169958에 대해 설계된 올리고 중에서 2가지로 처리후 48시간 시점에 HepG2 세포에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-1381, CUR-1382, CUR-1383 및 CUR-1384로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 66 내지 69로 처리된 샘플에 상응한다.
도 13은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 3T3 세포의 처리후 SIRT1 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. 실시간 PCR 결과는 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 생쥐 안티센스 AK044604에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 3가지로 처리후 48시간 시점에 3T3 세포에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-0949, CUR-0842, CUR-1098 및 CUR-1099로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 76, 70, 80과 81로 처리된 샘플에 상응한다.
도 14는 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 3T3 세포의 처리후 SIRT1 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. 실시간 PCR 결과는 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 생쥐 안티센스 AK044604에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 5가지로 처리후 48시간 시점에 3T3 세포에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-0948 내지 CUR-0951, CUR-0846, 그리고 CUR-0844로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 75 내지 78, 74와 72로 처리된 샘플에 상응한다.
도 15는 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 3T3 세포의 처리후 SIRT1 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. 실시간 PCR 결과는 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 생쥐 안티센스 AK044604에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 3가지로 처리후 48시간 시점에 3T3 세포에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-0842, CUR-0844, 그리고 CUR-0845로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 70, 72와 73으로 처리된 샘플에 상응한다.
도 16은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 3T3 세포의 처리후 SIRT1 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. 실시간 PCR 결과는 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 생쥐 안티센스 AK044604에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 2가지로 처리후 48시간 시점에 3T3 세포에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-0843 및 CUR-0846로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 71과 74로 처리된 샘플에 상응한다.
도 17은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 시르투인3 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. RT PCR 결과는 HepG2 세포에서 sirt3 수준이 sirt3 안티센스 Hs.683117에 대해 설계된 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 48시간 시점에 증가된다는 것을 증명한다. CUR-0551, CUR-1552, CUR-1555, CUR-1556, CUR-1553, CUR-1554, CUR-1545, CUR-1546, CUR-1548, CUR-1549, CUR-1550 및 CUR-1547로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 82 내지 93으로 처리된 샘플에 상응한다.
도 18은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 시르투인3 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. RT PCR 결과는 HepG2 세포에서 sirt3 수준이 sirt3 안티센스 BQ024738과 BE164357에 대해 설계된 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 48시간 시점에 증가된다는 것을 증명한다. CUR-1869, CUR-1871 및 CUR-1873 내지 CUR-1878로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 94, 95, 96, 98, 99, 100, 101과 102로 처리된 샘플에 상응한다.
도 19는 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트와 siRNA 올리고뉴클레오티드로 Hek293 세포의 처리후 SIRT3 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. CUR-1883 및 CUR-1884로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 126과 127로 처리된 샘플에 상응한다.
도 20은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트와 siRNA 올리고뉴클레오티드로 Vero76 세포의 처리후 SIRT3 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. CUR-1883, CUR-1884, CUR-1873, CUR-1875, CUR-1878 및 CUR-1546로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 126, 127, 96, 98, 100과 92로 처리된 샘플에 상응한다.
도 21은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HUVEC 세포의 처리후 SIRT4 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. CUR-1832 및 CUR-1835로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 105와 107로 처리된 샘플에 상응한다.
도 22는 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 SIRT4 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. CUR-1833 및 CUR-1835로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 104 내지 107로 처리된 샘플에 상응한다.
도 23은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 SIRT5 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. CUR-1828, CUR-1829, CUR-1831 및 CUR-1830으로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 108, 109, 111과 110으로 처리된 샘플에 상응한다.
도 24는 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 SIRT6 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. 실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SIRT6 mRNA의 수준이 수납 번호: NM_133475에서 SIRT6 안티센스 서열에 대해 설계된 올리고 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-0873, CUR-0869 내지 CUR-0871, CUR-0874 및 CUR-0872로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 116, 112, 113, 114, 117과 115로 처리된 샘플에 상응한다.
도 25는 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 SIRT6 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. 실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SIRT6 mRNA의 수준이 SIRT6 안티센스 bf772662에 대해 설계된 올리고 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-0878, CUR-0876, CUR-0877 및 CUR-0875로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 121, 119, 120, 그리고 118로 처리된 샘플에 상응한다.
도 26은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 DBS-FCL-1 세포의 처리후 SIRT6 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. 실시간 PCR 결과는 DBS-FCL-1 세포에서 SIRT6 mRNA의 수준이 SIRT6 안티센스 bf772662에 대해 설계된 올리고 중에서 2가지 및 수납 번호: NM_133475에서 서열에 대해 설계된 한 가지 올리고로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다. CUR-0876, CUR-0878, CUR-0875 및 CUR-0874로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 119, 121, 118과 117로 처리된 샘플에 상응한다.
도 27은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 Vero76 세포의 처리후 SIRT7 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. CUR-1824 및 CUR-1825로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 122와 123으로 처리된 샘플에 상응한다.
도 28은 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 SK-N-AS 세포의 처리후 SIRT7 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. CUR-1824 및 CUR-1825로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 124와 125로 처리된 샘플에 상응한다.
도 29는 대조와 비교하여, Lipofectamine 2000을 이용하여 도입된 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리후 SIRT7 mRNA에서 배수적 변화 + 표준 편차를 보여주는 실시간 PCR 결과의 그래프이다. CUR-1824 및 CUR-1825로 표시된 막대는 각각, 서열 번호: 122와 123으로 처리된 샘플에 상응한다.
서열 목록 설명 -
서열 번호: 1: 호모 사피엔스 시르투인 (침묵 교배 타입 정보 조절 2 동족체) 1 (사카로미세스 세레비시에(S. cerevisiae)) (SIRT1), mRNA (NCBI 수납 번호: NM_012238.4)
서열 번호: 133: 호모 사피엔스 시르투인 1 (SIRT1), 전사체 변이체 2, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_001142498.1)
서열 번호: 2: 생쥐 시르투인 1 (침묵 교배 타입 정보 조절 2, 동족체) 1 (사카로미세스 세레비시에(S. cerevisiae)) (SIRT1) mRNA (NCBI 수납 번호: NM_001159589)
서열 번호: 3: 호모 사피엔스 시르투인 2 (SIRT2), 전사체 변이체 1, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_012237.3).
서열 번호: 134: 호모 사피엔스 시르투인 2 (SIRT2), 전사체 변이체 2, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_030593.2)
서열 번호: 135: 호모 사피엔스 시르투인 2 (SIRT2), 전사체 변이체 3, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_001193286.1)
서열 번호: 136: 호모 사피엔스 시르투인 2 (SIRT2), 전사체 변이체 4, 비-코딩 RNA (NCBI 수납 번호: NR_034146.1)
서열 번호: 4: 호모 사피엔스 시르투인 (침묵 교배 타입 정보 조절 2 동족체) 3 (사카로미세스 세레비시에(S. cerevisiae)) (SIRT3), 전사체 변이체 1, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_012239.5).
서열 번호: 137: 호모 사피엔스 시르투인 3 (SIRT3), 전사체 변이체 2, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_001017524.2)
서열 번호: 5: 호모 사피엔스 시르투인 4 (SIRT4), mRNA (NCBI 수납 번호: NM_012240).
서열 번호: 138: 호모 사피엔스 시르투인 5 (SIRT5), 전사체 변이체 2, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_031244.2)
서열 번호: 139: 호모 사피엔스 시르투인 5 (SIRT5), 전사체 변이체 3, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_001193267.1)
서열 번호: 6: 호모 사피엔스 시르투인 5 (SIRT5), 전사체 변이체 1, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_012241).
서열 번호: 7: 호모 사피엔스 시르투인 6 (SIRT6), 전사체 변이체 1, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_016539).
서열 번호: 140: 호모 사피엔스 시르투인 6 (SIRT6), 전사체 변이체 2, mRNA (NCBI 수납 번호: NM_001193285.1)
서열 번호: 8: 호모 사피엔스 시르투인 7 (SIRT7), mRNA (NCBI 수납 번호: NM_016538).
자연 안티센스 서열 - 서열 번호: 9: 확대된 자연 안티센스 서열 (CV396200 - 확대됨); 서열 번호: 10: 자연 안티센스 서열 (CV428275); 서열 번호: 11: 자연 안티센스 서열 (BE717453)
서열 번호: 12: 자연 안티센스 서열 (AV718812); 서열 번호: 13: 자연 SIRT1 안티센스 서열 (AW169958); 서열 번호: 14: 생쥐 자연 SIRT1 생쥐 안티센스 서열 (AK044604); 서열 번호: 15: 자연 SIRT3 안티센스 서열 (Hs.683117); 서열 번호: 16: 자연 SIRT3 안티센스 서열 (DA645474)
서열 번호: 17: 자연 SIRT3 안티센스 서열 (BQ024738); 서열 번호: 18: 자연 SIRT3 안티센스 서열 (BE164357); 자연 SIRT3 안티센스 서열 (RIC8A) 서열 번호: 141, 자연 SIRT3 안티센스 서열 (PMSD13) 서열 번호: 142, 자연 SIRT3 안티센스 서열 (DA246502) 서열 번호: 143, 서열 번호: 19: 자연 SIRT4 안티센스 서열 (AA156947); 서열 번호: 20: 자연 SIRT5 안티센스 서열 (Hs.671550); 서열 번호: 21: 자연 SIRT6 안티센스 서열 (BF772662); 서열 번호: 22: 자연 SIRT6 안티센스 서열 (ANKRD24); 서열 번호: 23: 자연 SIRT7 안티센스 서열 (Hs.671550)
안티센스 올리고뉴클레오티드 - 서열 번호: 24 내지 127. *는 포스포티오에이트 결합을 지시한다. +는 LNA를 지시하고, m은 2’O Me를 지시하고, r은 RNA를 지시한다.
서열 번호: 128 내지 130 - 서열 번호: 128은 SIRT1 자연 안티센스 CV396200의 엑손 4에 상응하고, 서열 번호: 129, 130과 131은 각각, 정방향 프라이머 서열, 역방향 프라이머 서열 및 리포터 서열에 상응한다. 서열 번호: 132는 CUR 962에 상응하고, *는 포스포티오에이트 결합을 지시하고, 그리고 +는 LNA을 지시한다.
서열 번호: 144와 145는 각각, 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열 번호: 126과 127의 역보체에 상응한다.
실시예
아래의 무제한적 실시예는 본 발명의 선택된 구체예를 예시하기 위한 것이다. 제시된 성분의 비율에서 변화 및 대안적 성분은 당업자에 자명하고 본 발명의 구체예의 범위 내에 있다.
실시예 1: 시르투인 (SIRT)에 대한 핵산 분자 안티센스 및/또는 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드의 센스 가닥에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드의 설계
앞서 지시된 바와 같이, 용어 "특이적인 올리고뉴클레오티드" 또는 "표적으로 하는 올리고뉴클레오티드"는 (i) 표적화된 유전자의 일부와 안정된 복합체를 형성할 수 있거나, 또는 (ii) 표적화된 유전자의 mRNA 전사체의 일부와 안정된 이중나선을 형성할 수 있는 서열을 보유하는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다.
적절한 올리고뉴클레오티드의 선별은 핵산 서열을 자동적으로 정렬하고 동일성 또는 상동성의 영역을 표시하는 컴퓨터 프로그램 (가령, IDT AntiSense Design, IDT OligoAnalyzer)을 이용함으로써 조장된다. 이들 프로그램은 예로써, GenBank와 같은 데이터베이스를 검색하거나, 또는 PCR 산물을 서열화함으로써, 획득된 핵산 서열을 비교하는데 이용된다. 일정한 범위의 종으로부터 핵산 서열의 비교는 종 간에 적절한 정도의 동일성을 보이는 핵산 서열의 선별을 가능하게 한다. 염기서열분석되지 않은 유전자의 경우에, 표적 종과 다른 종에서 유전자 사이에 동일성의 정도의 결정을 가능하게 하는 서든 블롯이 수행된다. 당분야에 널리 공지된 바와 같이, 다양한 정도의 엄격함에서 서던 블롯을 수행함으로써, 동일성의 근사치를 획득하는 것이 가능하다. 이들 절차는 제어되는 개체에서 표적 핵산 서열에 높은 정도의 상보성 (complementarity), 그리고 다른 종에서 상응하는 핵산 서열에 더욱 낮은 정도의 상보성을 나타내는 올리고뉴클레오티드의 선별을 가능하게 한다. 당업자는 본 발명에서 이용을 위한 유전자의 적절한 영역을 선별하는데 상당한 허용 범위 (latitude)가 존재한다는 것을 인지할 것이다.
안티센스 화합물은 표적 핵산에 상기 화합물의 결합이 표적 핵산의 정상적인 기능을 간섭하여 기능 및/또는 활성의 조정을 유발하고, 그리고 특정한 결합이 요망되는 조건 하에, 다시 말하면, 생체내 분석 또는 치료적 처리의 경우에 생리학적 조건 하에, 그리고 시험관내 분석의 경우에 이들 분석이 수행되는 조건 하에 비-표적 핵산 서열에 안티센스 화합물의 비-특이적 결합을 회피할 수 있을 만큼 충분한 정도의 상보성이 존재할 때, "특이적으로 혼성화가능"하다.
본 명세서에서 기술된 올리고뉴클레오티드의 혼성화 성질은 당분야에 공지된 하나 이상의 시험관내 분석에 의해 결정될 수 있다. 가령, 본 명세서에서 기술된 올리고뉴클레오티드의 성질은 용융 곡선 분석 (melting curve assay)을 이용하여 표적 자연 안티센스와 잠재적인 약물 분자 사이에 결합 강도를 측정함으로써 획득될 수 있다.
표적 자연 안티센스와 잠재적인 약물 분자 (Molecule) 사이에 결합 강도는 용융 곡선 분석과 같은 분자간 상호작용의 강도를 측정하는 임의의 확립된 방법을 이용하여 예측될 수 있다.
용융 곡선 분석은 자연 안티센스/Molecule 복합체에서 이중 가닥으로부터 단일 가닥 형태로 신속한 전이가 일어나는 온도를 결정한다. 상기 온도는 이들 두 분자 사이에 상호작용 강도의 신뢰성 있는 척도로서 폭넓게 인정된다.
용융 곡선 분석은 실제 자연 안티센스 RNA 분자 또는 Molecule의 결합 부위에 상응하는 합성 DNA 또는 RNA 뉴클레오티드의 cDNA 사본을 이용하여 실행될 수 있다. 이러한 분석을 실행하기 위하여 모든 필수 시약을 포함하는 다중 키트가 가용하다 (가령, Applied Biosystems Inc. MeltDoctor kit). 이들 키트는 이중 가닥 DNA (dsDNA) 결합 염료 (가령, ABI HRM 염료, SYBR Green, SYTO, 등) 중에서 하나를 포함하는 적절한 완충액을 포함한다. dsDNA 염료의 성질은 그들이 자유 형태에서는 형광을 거의 방출하지 않지만, dsDNA에 결합될 때 상당한 형광성이다.
상기 분석을 실행하기 위하여, cDNA 또는 대응하는 올리고뉴클레오티드는 특정 제조업체의 프로토콜에 의해 규정된 농도에서 Molecule와 혼합된다. 혼합물은 95℃로 가열되어 모든 미리-형성된 dsDNA 복합체가 해리되고, 이후 실온 또는 키트 제조업체에 의해 규정된 더욱 낮은 온도로 서서히 냉각되어 DNA 분자가 어닐링 (annealing)되도록 한다. 이후, 새로 형성된 복합체는 95℃로 천천히 가열되고, 반응에 의해 생성된 형광의 양에 대한 데이터가 동시에 연속적으로 수집된다. 형광 강도는 반응물 내에 존재하는 dsDNA의 양에 반비례한다. 데이터는 키트에 적합한 실시간 PCR 장비 (가령 ABI의 StepOne Plus 실시간 PCR 시스템 또는 LightTyper 기구, Roche Diagnostics, Lewes, UK)를 이용하여 수집될 수 있다.
용융 피크는 적합한 소프트웨어 (가령, LightTyper (Roche) 또는 SDS Dissociation Curve, ABI)를 이용하여 온도 (x-축)에 대하여 온도에 관련된 형광의 네거티브 도함수 (negative derivative) (y축에서 -d(형광)/dT)를 플롯팅 (plotting)함으로써 구축된다. 획득된 데이터는 dsDNA 복합체에서 단일 가닥 분자로의 신속한 전이 온도를 확인하기 위하여 분석된다. 상기 온도는 Tm으로 불리고, 그리고 두 분자간의 상호작용 강도에 직접적으로 비례한다. 전형적으로, Tm은 40℃를 초과할 것이다.
실시예 2: 시르투인 (SIRT) 폴리뉴클레오티드-처리의 조정
안티센스 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리
ATCC로부터 HepG2 세포 (cat# HB-8065)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) + 10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV) + 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 실험 하루전, 이들 세포를 1.5x105/㎖의 밀도로 6개 웰 평판에 재도말하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 실험 당일, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도로 희석하였다. 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 이후 HepG2 세포가 있는 6개 웰 평판의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 37℃ 및 5% CO2에서 3-18시간 배양후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation 시스템 (Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트 (Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 추출된 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B)) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (cat# 4368813)를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA는 ABI Taqman gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (Applied Biosystems Inc. (Foster City CA)에 의한 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1, Hs00202030_m1, Hs00953479_m1, Hs00202033_m1, Hs00978329_m1, Hs00213036_m1 및 Hs00213029_m1)를 이용한 실시간 PCR 반응에 의해 유전자 발현을 모니터링하는데 이용되었다. StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다.
결과:
실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 안티센스 CV396200에 대한 일부 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 48시간 시점에 현저하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 3과 4).
실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 안티센스 CV396200에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 한 가지에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 8).
실시간 PCR 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 안티센스 CV428275에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 2가지에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 9).
이들 결과는 SIRT 안티센스 BE717453에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA 수준에서 유의미한 증가를 증명한다 (도 10).
이들 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 각각, SIRT1 안티센스 AV718812에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 3가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 11).
실시간 PCR 결과에서는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 안티센스 AW169958에 대해 설계된 올리고 중에서 2가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 12).
RT PCR 결과에서는 HepG2 세포에서 sirt3 수준이 sirt3 안티센스 Hs.683117 (CUR-1545-1550)에 대해 설계된 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 48시간 시점에 증가된다는 것을 증명한다 (도 17).
RT PCR 결과에서는 HepG2 세포에서 sirt3 수준이 sirt3 안티센스 BQ024738과 BE164357에 대해 설계된 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 48시간 시점에 증가된다는 것을 증명한다 (도 18).
RT PCR 결과에서는 HepG2 세포에서 sirt3 수준이 sirt3 안티센스 RIC8A와 PMSD13에 대해 설계된 siRNA 올리고뉴클레오티드로 처리후 48시간 시점에 증가된다는 것을 증명한다 (도 19)
실시간 PCR 결과에서는 HepG2 세포에서 SIRT4 mRNA의 수준이 SIRT4 안티센스에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 22).
실시간 PCR 결과에서는 HepG2 세포에서 SIRT5 mRNA의 수준이 SIRT5 안티센스 Hs.671550에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 23).
실시간 PCR 결과에서는 HepG2 세포에서 SIRT6 mRNA의 수준이 SIRT6 안티센스 NM_133475에 대해 설계된 올리고 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 24).
실시간 PCR 결과에서는 HepG2 세포에서 SIRT6 mRNA의 수준이 SIRT6 안티센스 bf772662에 대해 설계된 올리고 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 25).
실시간 PCR 결과에서는 HepG2 세포에서 SIRT7 mRNA의 수준이 SIRT7 안티센스에 대해 설계된 올리고 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 29).
안티센스 올리고뉴클레오티드로 3T3 세포의 처리
ATCC로부터 3T3 세포 (cat# HB-8065)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) + 10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV) + 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 실험 하루전, 이들 세포를 1.5x105/㎖의 밀도로 6개 웰 평판에 재도말하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 실험 당일, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도로 희석하였다. 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 이후 3T3 세포가 있는 6개 웰 평판의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 37℃ 및 5% CO2에서 3-18시간 배양후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation 시스템 (Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트 (Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 추출된 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B)) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (cat# 4368813)를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA는 ABI Taqman gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (Applied Biosystems Inc. (Foster City CA)에 의한 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1)를 이용한 실시간 PCR 반응에 의해 유전자 발현을 모니터링하는데 이용되었다. StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다.
결과:
실시간 PCR 결과는 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 생쥐 안티센스 AK044604에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 3가지로 처리후 48시간 시점에 3T3 세포에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 13).
실시간 PCR 결과는 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 생쥐 안티센스 AK044604에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 5가지로 처리후 48시간 시점에 3T3 세포에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 14).
실시간 PCR 결과는 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 생쥐 안티센스 AK044604에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 2가지로 처리후 48시간 시점에 3T3 세포에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 15).
실시간 PCR 결과는 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 생쥐 안티센스 AK044604에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드 중에서 2가지로 처리후 48시간 시점에 3T3 세포에서 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 16).
안티센스 올리고뉴클레오티드로 Vero76 세포의 처리
ATCC로부터 Vero76 세포 (cat# CRL-1587)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) + 10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV) + 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 실험 하루전, 이들 세포를 1.5x105/㎖의 밀도로 6개 웰 평판에 재도말하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 실험 당일, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도로 물에서 희석하였다. 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 이후 Vero76 세포가 있는 6개 웰 평판의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 37℃ 및 5% CO2에서 3-18시간 배양후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation 시스템 (Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트 (Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 추출된 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA는 ABI Taqman gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (Applied Biosystems Inc. (Foster City CA)에 의한 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1)를 이용한 실시간 PCR 반응에 의해 유전자 발현을 모니터링하는데 이용되었다. StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다.
결과:
실시간 PCR 결과는 Vero 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 SIRT1 안티센스 CV396200에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 5).
실시간 PCR 결과는 Vero76 세포에서 SIRT3 mRNA의 수준이 SIRT3 안티센스 PSMD13에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 20).
실시간 PCR 결과는 Vero76 세포에서 SIRT7 mRNA의 수준이 SIRT7 안티센스 CA308253에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 27).
안티센스 올리고뉴클레오티드로 HUVEC 세포의 처리
ATCC로부터 HUVEC 세포 (Promo Cell cat# C-12253)를 37℃ 및 5% CO2에서 상피 성장 배지 (Promo Cell cat #C-22010)에서 성장시켰다. 실험 하루전, 이들 세포를 1.5x105/㎖의 밀도로 6개 웰 평판에 재도말하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 실험 당일, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 상피 성장 배지로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도로 희석하였다. 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 이후 HUVEC 세포가 있는 6개 웰 평판의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 37℃ 및 5% CO2에서 3-18시간 배양후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation 시스템 (Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트 (Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 추출된 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA는 ABI Taqman gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (Applied Biosystems Inc. (Foster City CA)에 의한 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202033_m1)를 이용한 실시간 PCR 반응에 의해 유전자 발현을 모니터링하는데 이용되었다. StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다.
결과: 실시간 PCR 결과는 HUVEC 세포에서 SIRT4 mRNA의 수준이 SIRT4 안티센스 AA156947에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 21).
안티센스 올리고뉴클레오티드로 DBS 세포의 처리
ATCC로부터 DBS 세포 (cat# CCL-161)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) + 10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV) + 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 실험 하루전, 이들 세포를 1.5x105/㎖의 밀도로 6개 웰 평판에 재도말하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 실험 당일, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도로 희석하였다. 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 이후 DBS 세포가 있는 6개 웰 평판의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 37℃ 및 5% CO2에서 3-18시간 배양후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation 시스템 (Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트 (Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 추출된 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B)) 또는 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (cat# 4368813)를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA는 ABI Taqman gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (Applied Biosystems Inc. (Foster City CA)에 의한 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1, Hs00202030_m1, Hs00202033_m1, Hs00978329_m1, Hs00213036_m1 및 Hs00213029_m1)를 이용한 실시간 PCR 반응에 의해 유전자 발현을 모니터링하는데 이용되었다. StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다.
결과: 실시간 PCR 결과는 DBS 세포에서 SIRT6 mRNA의 수준이 SIRT6 안티센스 bf772662에 대해 설계된 올리고 중에서 2가지 및 NM_133475에 대해 설계된 한 가지 올리고로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 26).
안티센스 올리고뉴클레오티드로 SK-N-AS 세포의 처리
SK-N-AS 세포 (신경아세포종 ATCC # CRL-2137)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 DMEM (Mediatech cat #10-013-CV) + 10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV) + 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 실험 하루전, 이들 세포를 대략 3x105/㎖의 밀도로 6개 웰 평판에 재도말하고 37℃ 및 5% CO2에서 하룻밤동안 배양하였다. 약액주입 시점에, 이들 세포는 약 75% 합류되었다. 약액주입을 위해, 6개 웰 평판에 있는 배지를 새로운 DMEM + 10% FBS + 페니실린 + 스트렙토마이신 (1.5 ㎖/웰)으로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 DNAse/RNAse-없는 무균수 (작업 스톡)에서 20 μM의 농도로 희석하였다. 한 웰을 약액주입하기 위해, 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 이후 SK-N-AS 세포가 있는 6개 웰 평판의 한 웰에 제공하였다 (최종 올리고 농도=20 nM). 동일한 농도에서 비활성 올리고뉴클레오티드는 대조로서 이용되었다. 부가적으로, 각 평판 상에서 한 웰은 400 ㎕의 Opti-MEM 배지와 4 ㎕의 Lipofectamine 2000의 혼합물이 약액주입되고, 그리고 모의-형질감염된 대조의 경우에 2 ㎕의 DNAse/RNAse-없는 무균수가 첨가되었다. 37℃ 및 5% CO2에서 약 18시간 배양후, 배지를 새로운 DMEM + 10% FBS + 페니실린 + 스트렙토마이신으로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 대략 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation 시스템 (Promega (cat # Z3105))을 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 추출된 RNA를 High Capacity cDNA Kit (Applied Biosystems, cat# 4368813)를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA는 ABI Taqman gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (SIRT7의 경우에 assay ID# Hs00213029_m1)를 이용한 실시간 PCR 반응에 의해 유전자 발현을 모니터링하는데 이용되었다. StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 18S에 대한 시금은 ABI (cat# 4319413E)에 의해 제조되었다. 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다.
결과: 실시간 PCR 결과는 SK-N-AS 세포에서 SIRT7 mRNA의 수준이 SIRT7 안티센스에 대해 설계된 올리고로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (도 28).
실시예 3: SIRT 유전자 발현의 조정
재료와 방법
나신 안티센스 올리고뉴클레오티드로 HepG2 세포의 처리:
ATCC로부터 HepG2 세포 (cat# HB-8065)를 37℃ 및 5% CO2에서 성장 배지 (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, 또는 Mediatech cat # MT-10-010-CV) +10% FBS (Mediatech cat# MT35-011-CV)+ 페니실린/스트렙토마이신 (Mediatech cat# MT30-002-CI))에서 성장시켰다. 실험 하루전, 이들 세포를 0.5x105/㎖의 밀도로 6개 웰 평판에 재도말하고 37℃ 및 5% CO2에서 배양하였다. 실험 당일, 6개 웰 평판에 있는 배지를 1.5 ㎖/웰의 새로운 성장 배지로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 물에서 20 μM의 농도로 희석하였다. 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 이후 HepG2 세포가 있는 6개 웰 평판의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 37℃ 및 5% CO2에서 3-18시간 배양후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 72시간 시점에, 세포를 앞서 기술된 바와 같이 재-약액주입하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 2차 약액주입후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation 시스템 (Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트 (Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 추출된 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA는 ABI Taqman gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (Applied Biosystems Inc. (Foster City CA)에 의한 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1, Hs00202030_m1, Hs00202033_m1, Hs00978329_m1, Hs00213036_m1 및 Hs00213029_m1)를 이용한 실시간 PCR 반응에 의해 유전자 발현을 모니터링하는데 이용되었다. StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)을 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다.
엑손 4에 대해 맞춤 설계된 Taqman 분석평가를 위한 프라이머와 프로브:
AACTGGAGCTGGGGTGTCTGTTTCA (서열 번호: 128) SIRT1 자연 안티센스 CV396200.
정방향 프라이머 서열 CCATCAGACGACATCCCTTAACAAA (서열 번호: 129)
역방향 프라이머 서열 ACATTATATCATAGCTCCTAAAGGAGATGCA (서열 번호: 130)
리포터 서열 CAGAGTTTCAATTCCC (서열 번호: 131)
결과: 이들 결과는 HepG2 세포에서 SIRT1 mRNA의 수준이 sirtas에 대해 설계된 siRNA 중에서 한 가지로 처리후 48시간 시점에 유의미하게 증가된다는 것을 증명한다 (sirtas_5, P=0.01). 동일한 샘플에서, sirtas RNA의 수준은 sirtas_5로 처리후 유의미하게 감소되지만, sirtas_6과 sirtas_7로 처리후 변화가 없었고, 이들은 SIRT1 mRNA 수준에도 영향을 주지 않았다 (도 2). sirtas_5, sirtas_6 및 sirtas_7은 각각, 서열 번호: 47, 48과 49에 상응한다.
일차 원숭이 간세포의 처리
일차 원숭이 간세포는 RxGen Inc.에 의한 배양액 내로 도입되고 6개의 웰 평판에 도말되었다. 이들은 하기와 같이 올리고뉴클레오티드로 처리되었다. 6개의 웰 평판 내에 배지를 5% FBS, 50 U/㎖ 페니실린 및 50 ㎍/㎖ 스트렙토마이신, 4 ㎍/㎖ 인슐린, 1 μM 덱사메타손, 10 ㎍/㎖ 펀진 (InVivogen, San Diego CA)으로 보충된 William의 배지 E (Sigma cat#W4128)로 구성되는 새로운 성장 배지로 교체하였다. 모든 안티센스 올리고뉴클레오티드를 20 μM의 농도로 희석하였다. 상기 용액 2 ㎕를 400 ㎕의 Opti-MEM 배지 (Gibco cat#31985-070) 및 4 ㎕의 Lipofectamine 2000 (Invitrogen cat# 11668019)과 함께 실온에서 20분간 배양하고, 이후 세포가 있는 6개 웰 평판의 각 웰에 제공하였다. 올리고뉴클레오티드 용액 대신에 물 2㎕를 포함하는 유사한 혼합물은 모의-형질감염된 대조에 이용되었다. 37℃ 및 5% CO2에서 3-18시간 배양후, 배지를 새로운 성장 배지로 교체하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 첨가후 48시간 시점에, 배지를 제거하고, 그리고 SV Total RNA Isolation 시스템 (Promega (cat # Z3105)) 또는 RNeasy Total RNA Isolation 키트 (Qiagen (cat# 74181))를 이용하여 제조업체의 지시에 따라 세포로부터 RNA를 추출하였다. 600 ng의 추출된 RNA를 Verso cDNA 키트 (Thermo Scientific (cat#AB1453B))를 이용하여, 제조업체의 프로토콜에 따라 실행된 역전사 반응에 첨가하였다. 이와 같은 역전사 반응으로부터 cDNA는 ABI Taqman gene Expression Mix (cat#4369510) 및 ABI에 의해 설계된 프라이머/프로브 (Applied Biosystems Inc. (Foster City CA)에 의한 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00202021_m1, Hs00202030_m1, Hs00202033_m1, Hs00978329_m1, Hs00213036_m1 및 Hs00213029_m1)를 이용한 실시간 PCR 반응에 의해 유전자 발현을 모니터링하는데 이용되었다. Mx4000 유전자 증폭기 (Stratagene)를 이용하여, 아래의 PCR 주기가 이용되었다: 2분 동안 50℃, 10분 동안 95℃, 40회 사이클의 (15초 동안 95℃, 1분 동안 60℃). 처리된 샘플 및 모의-형질감염된 샘플 사이에 18S-표준화된 dCt 값에서 차이에 근거하여, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리후 유전자 발현에서 배수적 변화가 계산되었다.
결과: 이들 결과는 도 7에 도시된다. 실시간 PCR 결과는 SIRT1 안티센스에 대한 올리고뉴클레오티드로 처리후 SIRT1 mRNA 수준에서 증가를 증명한다.
실시예 4: 아프리카 녹색 원숭이에서 CUR 963의 작용의 효능과 지속 기간 연구
본 연구의 목적은 비인간 영장류 모형에서 정맥내 투여 이후에, SIRT1 유전자를 조절하는 부조화적 비코딩 안티센스 서열들의 안티센스 녹다운의 효과를 평가하고 비교하는 것이었다. SIRT1 조절 서열을 저해하도록 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드 검사 물품은 CUR 963으로 명명되었다.
CUR 963: +G*+T*C*T*G*A*T*G*G*+A*+G*+A (서열 번호: 43).
CUR 962 (대조): +G*+C*T*A*G*T*C*T*G*+T*+T*+G (서열 번호: 132).
조절 검사 가이드라인
본 연구는 인정된 독물학적 원리에 따라서, 그리고 International Conference of Harmonization (ICH) Harmonized Tripartite Guidelines (Non-Clinical Safety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials for Pharmaceuticals ICH M3(m), 2000년 9월 9일), 그리고 치료제의 검사를 위해 일반적으로 인정되는 절차에 부합하도록 설계되었다.
검사와 대조 물품
검사 물품 정체와 제조
검사 물품, CUR-963은 화학적으로 안정화된 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 정맥내 전달을 위한 운반제는 인산염-완충된 염수 (PBS)이다.
운반제 특성화
PBS 운반제의 경우에, 조성, 배치 번호 (batch number), 만기 일자와 보관 조건 (온도 및 명/암)는 공급업자로부터 제공되었다.
검사 물품 보관과 취급
검사 물질과 운반제는 스폰서와 제조업체에 의해 제공된 일반적으로 인정되는 보관 조건에 따라 보관되었다.
검사 물품 제제의 분석
검사 물품 제제의 샘플은 검사 물질 제제의 농도, 안정성과 균질성 (homogeneity)의 분석을 위해 냉동보존될 것이다.
검사 시스템 근거
영장류는 잠재적 위험의 인디케이터로서 규제 당국의 기준에 맞고, 그리고 광범위한 배경 데이터가 가용한 적절한 비-설치류 종이다. 특히, 아프리카 녹색 원숭이는 복수의 인간 생리학적 상태와 질환 상태의 임상적으로 매우 적절한 모형이다.
정맥내 투여 루트는 가능한 인간 치료 루트에 상응한다. 검사 물품의 용량은 아프리카 녹색 원숭이에서 이전에 수행된 유사한 화합물의 용량 탐색 연구의 결과에 기초되었다.
아프리카 녹색 원숭이가 선택 영장류로서 선택되었는데, 그 이유는 검사 물질의 표적 서열이 영장류에서 100 % 상동성으로 종 전반에서 보존되기 때문이다. 부가적으로, 검사 물질은 합성 올리고뉴클레오티드이었다. 결과적으로, 영장류에 약액주입은 이들 화합물의 효능의 더욱 뛰어난 평가를 가능하게 하고, 이것은 어떤 다른 종에서보다 인간에서 관찰될 가능성이 높은 흡수를 더욱 충실하게 반영할 것이다.
동물
종: 사바나원숭이 (Chlorocebus sabaeus), 비-인간 영장류
혈통: 세인트 키츠 섬 (St. Kitts)에 고유한 아프리카 녹색 원숭이.
공급처: RxGen, Lower Bourryeau, St. Kitts, West Indies.
예상 연령: 검사 동물은 성체이었다.
예상 체중: 이들 원숭이의 체중은 대략 3-4 kg이었다. 실제 범위는 변할 수 있지만 데이터로 기록될 것이다.
성별: 검사 동물은 성체 암컷이었다.
동물 숫자: 본 연구에서 등록에 적합한 8마리의 동물의 식별을 담보하기 위해 10마리의 동물이 선발되었다.
연구 숫자: 암컷: 8마리
연구 숫자에 대한 명분: 본 연구는 아프리카 녹색 원숭이에서 검사 물품의 치료 효능을 평가하는 일차적인 목적 및 상기 종에서 이러한 유형의 올리고뉴클레오티드의 전신 투여의 기존 연구와 조화되도록 가능한 적은 숫자의 동물을 이용하도록 설계되었다.
동물 명세: 3 내지 4 kg 범위의 체중을 갖는 10마리의 성체 아프리카 녹색 원숭이가 본 연구에 이용되었다. 이들 원숭이는 섬에 서식하는 야생 집단으로부터 인도적으로 포획된 약물-무경험 성체 동물이었다. 포획된 원숭이는 임의의 가능한 장 기생충 부담 (intestinal parasite burden)을 제거하기 위해 구충제로 치료되고, 그리고 연구 등록을 위한 선발에 앞서 최소 4주 동안 격리되고 관찰되었다. 포획된 원숭이의 연령은 크기와 치아 모양 (dentation)에 의해 추정되고, 연령이 높은 동물은 본 연구로부터 배제되었다. 연구 등록에 앞서, 운동력 (locomotion)과 손재주 (dexterity)의 평가를 비롯한 임상 검사가 각 원숭이에서 수행되었다. 혈액 샘플이 채취되고, 그리고 포괄적 임상 화학, 완전 혈구 측정 (complete blood count)과 지질 프로필을 위해 Antech Diagnostics (Memphis, TN)로 보내졌다 (명세를 위해 섹션 9.2와 319567928을 참고한다). 세인트 키츠 섬 콜로니에서 원숭이에 대한 확립된 정상 범위와 비교에 의해 결정될 때, 비정상적 실험실 값을 갖는 원숭이는 본 연구로부터 배제되었다. 이러한 기준을 충족하는 8마리의 원숭이를 확인하기 위해, 10마리의 원숭이가 선발되었고, 필요에 따라 추가의 동물이 선발되었다. 연구 개시에 앞서, 선택된 원숭이는 1-주 기간 동안 개별 수용시설 (housing)에 순치되도록 개별 우리로 이전될 것이다. 실험에 적합한 것으로 생각되는 동물만 본 연구에 등록될 것이다. 연구의 시작 시점에서 실제 (또는 추정) 연령과 체중 범위는 미가공 데이터 및 최종 보고에서 상세하게 기재될 것이다.
동물 건강과 복지: 동물 복지의 최고 기준이 추종되고 세인트 키츠 농무부 (St. Kitts Department of Agriculture) 및 미국 보건위생부 (U.S. Department of Health and Human Service)에 의해 규정된 가이드라인에 고수되었다. 모든 연구는 실험실 동물의 관리와 수용시설에 대한 필요조건 및 모든 적용가능한 업무 규약에 따라서 수행될 것이다. 수의 관리, 작업, 그리고 재고를 위한 모든 적용가능한 기준은 동물 사육 및 이용에 관한 NIH 지침 (NIH Guide for the Care and Use of Animal)에 들어있다. 본 세인트 키츠 섬 (St. Kitts) 시설은 상기 지침에 의해 요구되는, 프로토콜을 재고하고 시설을 검사하기 위한 동물 연구 위원회 (animal research committee)를 유지한다. 본 재단 (Axion Research Foundation/St. Kitts Biomedical Foundation)에서는 지침, #A4384-01에 의해 요구되는 바와 같이, 인가 승인서 (approved assurance)를 실험 동물 복지국 (Office of Laboratory Animal Welfare)에 제출하였다. 본 연구에서 명기된 조사에 의해 유발된 특별한 비인간 영장류 수의 관리 문제 및 생물학적 위험 문제는 없다.
수용시설과 환경: 임의의 치료-관련된 임상적 징후의 검출을 가능하게 하기 위해, 동물은 수술에 앞서 및 수술후 희생 때까지 개별적으로 수용되었다. 개별 우리가 위치하는 영장류 건물은 환경광 (ambient light)에 의해 전체적으로 조명되었는데, 이것은 U.S. D.H.H.S 가이드라인에서 권장된 바와 같이, 북위 (north latitude) 17도에서 12hr:12hr 명암 주기 (light-dark cycle)와 근사한다. RxGen 영장류 건물은 외부로 완전하게 환기되었다. 연중으로 세인트 키츠 섬 (St. Kitts)에서 전형적인 23-35℃의 일정한 표적 온도를 유지하기 위해, 천장 선풍기 (ceiling fan)에 의한 추가적인 공기 흐름이 보증되었다. 24시간 극단의 온도와 상대 습도 (이것 역시 통제되지 않을 것이다)가 매일 측정되었다. 연구 동안, 우리는 규칙적인 간격으로 청소되었다.
사료와 물: 각 동물은 하루 대략 90 그램의 표준 원숭이 영양 사료 (TekLad, Madison, WI)가 제공되었다. 사료의 특정한 영양적 조성이 기록되었다. 물은 미생학적 순도 (microbiological purity)에 대해 주기적으로 분석되었다. 스톡 사료와 물 공급에서 오염물질의 허용가능 수준에 대한 규준은 각각, 사료 제조업체에 의해 확립된 분석 명세 (analytical specification) 및 주기적 시설 물 평가 (periodic facility water evaluation) 내에 있었다. 물은 인간 소비에 허용되는 것으로서 공인을 위해 필요한 모든 규준을 충족하였다.
실험 설계
동물 식별과 무작위화: 배정은 체중과 혈장 콜레스테롤 프로필에 기초된 층화 무작위화 절차 (stratified randomization procedure)에 의해 수행되었다. 군으로 배정 전후에, 각 동물은 복부에 문신에 의해 식별되었다. 문신은 일과적 건강 검진의 과정에서 식별의 수단으로서 모든 콜로니 동물에 배치된다. 수용된 개체를 식별하기 위해 우리 도면이 작성되었고, 그리고 개별 원숭이는 그들의 개별 우리에 부착된 표지된 태그에 의해 더욱 식별되었다.
군 크기, 용량 및 식별 번호: 동물은 각 군에서 4마리의 원숭이로 구성되는 2가지 치료 군으로 배정되었다. 특정한 동물 식별 번호가 시설 넘버링 시스템 (facility numbering system)에 따라 각 원숭이에 제공되었다. 이러한 시스템은 문자, 그 이후에 3자리 수, 예를 들면, Y032에 의해 각 원숭이를 독특하게 식별한다.
투여의 루트와 빈도: 동물은 Day 1, 3, 그리고 5에 ~10분에 걸쳐, 수동 주입 (manual infusion)에 의해 하루 1회 정맥내 약액주입되었다. 주입 속도 (infusion rate)는 24 mL/kg/h일 것이다. 이들 동물은 약액주입 절차 이전과 동안에 케타민 (ketamine)과 자일라진 (xylazine)으로 진정되었다. 정맥 카테터 (venous catheter) (Terumo 미니 정맥 주입 세트, 20 게이지 바늘, 또는 유사한 적절한 주입 세트)가 복재 정맥 (saphenous vein) 내로 삽입되었다. 약액주입은 동물 각성 직후 및 사양 (feeding)에 앞서, 아침 8:00과 10:00 사이에 각 원숭이에서 진행되었다. 하기 혈액 화학 섹션에서 기술된 바와 같이 혈장 콜레스테롤과 기타 지질 수준을 평가하기 위한 혈액 샘플이 각 주입 직전에 수집되었다. 혈액 수집은 콜레스테롤 치수에 대한 식이 효과를 최소화시키기 위해, 양쪽 샘플링 간격 (sampling interval)에서 사양에 선행하였다.
임상적 관찰: 치료에 대한 반응의 모든 가시적 징후는 각 약액주입 일자에 기록되었다. 이에 더하여, 동물은 신체 특질 (physical attribute), 예를 들면, 외관 및 전반적인 상태에 대해 최소한 매주 1회 검사되었다.
체중: 체중은 치료 동안 및 치료후 기간 동안 주 1회 간격으로 기록되었다.
먹이 소비: 개별 먹이 소비는 정량되지 않았다. 하지만, 사양 패턴 (feeding pattern)은 모니터링되고 임의의 주요한 변화에 관해 노트가 작성되었다.
폐사율 (mortality)과 이환율 (morbidity): 폐사율과 이환율이 기록될 것이다. 조기 희생에 관한 결정은 가능하면, 연구 감독관 및 스폰서의 모니터링 과학자와의 협의 이후에 이루어질 것이다. 폐사한 상태로 발견되거나 조기에 희생된 동물은 부검되고 조직병리학 (histopathology)을 위해 간, 신장, 심장과 비장 폐 조직이 수집될 것이다. 조기 희생의 경우에, 혈액 샘플 역시 채취되고 (가능하면) 파라미터가 결정될 것이다. 정규 작업 시간후 폐사한 상태로 발견된 동물은 하룻밤동안 냉동되고 다음 작업일의 시작 시점에 부검될 것이다. 동물의 상태가 조기 희생을 요구하면, 동물은 나트륨 펜토바르비탈의 정맥내 과잉투여에 의해 안락사될 것이다. 모든 연구는 동물의 사용을 위한 원칙 (Principles for Use of Animals)에 의해 관리된다. RxGen은 영장류 시설에 대한 미국 보건위생부 (U.S. Department of Health and Human Service) 기준을 준수하도록 법률에 의해 요구되며, 이것은 경등도로 명시된 본 연구의 절차가 준수해야 하는 심각도 (severity)의 수준을 지시한다.
임상적 실험실 연구
지방 생검: 연구 26일자에 Y775를 제외한 모든 연구 원숭이에서, 배꼽 아래 1 cm 정중선 절개 (midline incision)를 통한 조직 적출 (extraction)에 의해 피하 지방 생검 (subcutaneous fat biopsy)이 수행되었다. 생검은 2 ㎖의 RNAlater (Qiagen)를 내포하는 표지된 냉동튜브 (cryotube)에 즉시 가라앉혀지고 4℃에서 하룻밤동안 배양되고, 그 이후 RNAlater가 흡출되고 샘플 튜브가 액체 질소에서 급속 냉동되었다. 액체 질소에 담긴 상태로 수송 이후에, 표적 유전자의 실시간 qPCR을 위해 전체 RNA가 분리되었다.
결과: 실시간 PCR 결과는 시험관내에서 SIRT1 발현에 대한 효과가 없었던 올리고뉴클레오티드, CUR-962 (서열 번호: 132) (ApoA1 안티센스 DA327409에 대해 설계됨)가 약액주입된 원숭이와 비교하여, SIRT1 안티센스 CV396200.1에 대해 설계된 올리고뉴클레오티드, CUR-963가 약액주입된 원숭이로부터 지방 생검에서 SIRT1 mRNA 수준에서 증가를 증명한다 (데이터 제시되지 않음). mRNA 수준은 실시간 PCR에 의해 결정되었다 (도 6).
실시예 5: 안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드에 의한 시르투인 (SIRT)의 생체내 조정
안티센스 DNA 올리고뉴클레오티드 (ASO)로 치료: SIRT1 AS에 특이적인 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO)는 비만과 당뇨병을 유도하기 위해 12주 동안 고지방 식이가 공급된 C57Bl/6J 생쥐에 투여된다. ASO로 생쥐의 치료는 고지방 식이의 이행의 시점에서 시작될 것이다. 생쥐는 5 mg/kg의 농도에서, 정상 염수에서 제조된 ASO가 주 1회 IP 주사되었다.
체중과 사료 섭취의 측정: 생쥐의 체중과 사료 섭취는 ASO의 IP 주사에 앞서, 주 2회 측정된다.
혈당 측정: 급식과 공복 혈당 농도는 꼬리 정맥으로부터 혈액의 샘플을 채취함으로써 매주 측정된다.
내당능 검사 (GTT): GTT는 고지방 식이의 중간 시점 (4주) 및 거의 종결 시점 (10주)에 생쥐마다 총 2회 수행될 것이다. GTT는 혈류 (blood stream)로부터 글루코오스 일시주입량 (glucose bolus)을 신속하게 제거하는 능력인, 생쥐의 내당능에 관한 정보를 제공할 것이다. 이것은 당뇨병에 대한 적도이다. 생쥐는 16시간 동안 밤새 굶겨진다. 생쥐는 글루코오스 2g/kg이 IP 주사된다. 이것은 30g 체중의 생쥐의 경우에 0.2 ㎖ 30% (w/v) 글루코오스 농도의 최종 부피로 해석된다. 글루코오스 측정은 글루코오스 주사에 앞서 및 주사후 5, 15, 30, 60, 90과 120분 시점에 수행된다. 글루코오스는 IP 글루코오스 주사에 앞서 이소플루란 마취 하에 꼬리의 말단으로부터 꼬리 첨단을 1mm 절단함으로써 측정된다. 혈액 비말 (blood droplet)은 스트립 내로 흡출되고, 그리고 글루코오스 농도는 혈당측정기 (glucometer)로 측정된다. GTT는 고지방 식이의 중간 시점 (4주) 및 거의 종결 시점 (10주)에 생쥐마다 총 2회 수행될 것이다. GTT는 혈류 (blood stream)로부터 글루코오스 일시주입량 (glucose bolus)을 신속하게 제거하는 능력인, 생쥐의 내당능에 관한 정보를 제공할 것이다. 이것은 당뇨병에 대한 적도이다.
인슐린 내성 검사 (ITT): 생쥐는 9am에서부터 3pm까지 6시간 동안 굶겨진다. 생쥐는 이후, 0.5-1U 인슐린/kg이 IP 주사된다. 인슐린 농도는 최종 주사된 부피가 0.1-0.15 ㎖가 되도록 조정될 것이다. 혈당 측정은 주사에 앞서 및 주사후 5, 15, 30, 45, 그리고 60분 시점에 수행된다. 혈액은 GTT 하에 기술된 바와 동일하게 수집된다. 글루코오스 수준의 모니터링에 더하여, 생쥐의 행동이 ITT 동안 지속적으로 관찰된다. 저혈당 (hypoglycemia)은 동물이 매우 얌전해지고 불안을 보이는 행동 변화로서 나타날 수 있다. 저혈당을 예방하기 위해, 혈당 농도가 50 mg/㎖ 미만으로 떨어지거나, 또는 불안의 징후가 관찰되자마자, 글루코오스 (1g/kg)가 0.1-0.15 ㎖의 최종 부피로 IP 주사된다.
안면 정맥 천자 (facial vein puncture)에 의한 혈액 수집: 생쥐는 목덜미와 꼬리 기부에 의해 구속되고, 목 피부에서 움켜쥠의 긴장됨 (tautness)을 통해 목의 혈관이 약간 압박된다. 샘플링 부위는 턱에서, 하악골각 (angle of the mandible)의 약간 앞에 위치한다. 샘플링 부위에서 피부는 바늘/랜싯의 첨단이 피부를 정확하게 통과할 때까지, 90° 각도에서 18G 바늘 또는 랜싯으로 천자된다. 혈액 샘플은 마이크로헤마토크리트 튜브 (microhematocrit tube)를 이용하여 수집된다. 혈액이 수집된 이후, 목에서 움켜쥠이 느슨해지고, 그리고 지혈 (hemostasis)을 담보하기 위해 주입 부위에 거즈 스펀지 (gauze sponge)로 압력이 가해진다. 이러한 방법에 의해 0.05-0.2 ㎖의 혈액이 수집될 것이다. 이러한 절차는 고지방 식이의 5주 시점에 단지 1회, 그리고 심장내 천자가 무력하면, 궁극적으로 12주 시점에 수행될 것이다 (하기 참조). 글루코오스와 지질의 대사를 조절하는 혈액 호르몬 (가령, 인슐린, 아디포넥틴 및 렙틴)은 상업적으로 구입가능한 ELISA 키트 (가령, R&D Systems, Minneapolis, MN, Assay Pro St. Charles, MO, Mabtech, Mariemont, OH)를 이용하여 측정된다.
심장내 천자 (intracardiac puncture): 12주 고지방 식이의 종결 시점에서, 생쥐는 연속 이소플루란 흡입에 의해 마취될 것이다. 마취는 이소플루란과 산소가 공급되는 유도 상자에 생쥐를 집어넣음으로써 유도된다. 생쥐는 눕혀진 상태로 구속될 것이다. 심장은 27G 바늘로 천자된다. 방혈 (exsanguineation) 이후에, 사망을 확실하기 위해 머리가 잘라진다. 조직 (간, 췌장, 백색과 갈색 지방 조직, 그리고 골격근)이 추가 조사 (RNA와 단백질 측정 및 조직학)를 위해 수집된다. 대략 0.5 - 1 ㎖의 혈액이 획득되고, 그리고 글루코오스와 지질 대사의 몇몇 중요한 파라미터 (글루코오스, 인슐린, 콜레스테롤, 트리글리세리드, 유리 지방산, 렙틴, 아디포킨 (adipokine), 코르티코스테로이드, 갑상선 호르몬)를 결정하는데 이용될 것이다. 이러한 방법에서 어려움이 발생하면, 대안으로 혈액은 이소플루란 마취 하에 안면 정맥 천자에 의해 수집될 것이다 (상기 참조).
본 발명이 하나 이상의 실행에 관하여 예시되고 설명되었지만, 본 명세서 및 첨부된 도면을 읽고 이해하는 당업자에게 동등한 개변은 명백할 것이다. 이에 더하여, 본 발명의 특정한 특징이 여러 실행 중에서 단지 하나에 관하여 개시되고 있긴 하지만, 이와 같은 특징은 임의의 소정의 또는 특정한 적용을 위하여 바람직하고 유리한 경우에, 다른 실행의 하나 이상의 다른 특징과 복합될 수 있다.
내용의 요약은 독자가 기술 내용의 성격을 신속하게 확인할 수 있도록 도와줄 것이다. 이는 하기 청구항의 범위 또는 의미를 해석하거나 제한하는데 이용되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> CuRNA, Inc. <120> TREATMENT OF SIRTUIN (SIRT) RELATED DISEASES BY INHIBITION OF NATURAL ANTISENSE TRANSCRIPT TO SIRTUIN <130> SIRT <150> US61/330427 <151> 2010-05-03 <150> US61/409,136 <151> 2010-10-02 <150> US61/412,066 <151> 2010-10-10 <150> US61/415,891 <151> 2010-10-22 <160> 145 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4110 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> NM_012238.4 <309> 2011-01-03 <313> (1)..(4110) <400> 1 gtcgagcggg agcagaggag gcgagggagg agggccagag aggcagttgg aagatggcgg 60 acgaggcggc cctcgccctt cagcccggcg gctccccctc ggcggcgggg gccgacaggg 120 aggccgcgtc gtcccccgcc ggggagccgc tccgcaagag gccgcggaga gatggtcccg 180 gcctcgagcg gagcccgggc gagcccggtg gggcggcccc agagcgtgag gtgccggcgg 240 cggccagggg ctgcccgggt gcggcggcgg cggcgctgtg gcgggaggcg gaggcagagg 300 cggcggcggc aggcggggag caagaggccc aggcgactgc ggcggctggg gaaggagaca 360 atgggccggg cctgcagggc ccatctcggg agccaccgct ggccgacaac ttgtacgacg 420 aagacgacga cgacgagggc gaggaggagg aagaggcggc ggcggcggcg 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aaaaccttgt 240 ctctattaca aatatgccca tgtgctaggt gtggtgggac acacctgtaa tcccagctac 300 ccaggagaat cgcttaaacc cgggaggcgg aagttgcagt gagctgagat cgtaacaccg 360 cactccaccc tgagtgacag ggcaagactc aaaaaataaa aaaggaacat taactagggt 420 tagaaactaa cttcattctt tttagaattc aacagttttc ctaggtcacc aattccacct 480 tttgttctta ttaaggcgca aagtcacagg acccccttcc tgggagtcac tgtcattaaa 540 tctattgccg tcagctcagc ccagggtagg caaggttcaa gaatgggaag tgcttttgtc 600 tggggaaaca cgcaggtaat gtgatgctan gaaggaggat gtgcaggtgg gtgagagccc 660 aggagggagc agctggtgcc tgacagggtg agccatcagg gctgggccct gggtacagcc 720 caggag 726 <210> 18 <211> 320 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 tagaggatcc cagaggttgt ggcaggtggg actgtgggca ttacctgaag tctggaatgc 60 cactgggtgt gctgatgccg gccccaccat gaccaccacc ctctggcagg ctctggcccg 120 aatcagctca gctacatcct gcagggaaag cttccccttg tcactgctgc ctccacttcc 180 aacaacactt gaagcaccca cagaaaaaga tatggacctt cttccacctt taatactgac 240 agaaaaaaac acagcagcaa aggaaacaga tagcaaccaa tctcaggata gcaagaacga 300 gcatggccct gccacaacct 320 <210> 19 <211> 616 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (602)..(602) <223> n is a, c, g, or t <400> 19 ttttttattt aaaaaaaatg agttttaatt aagaatatcc acacattaag atacctagaa 60 ccttctatac tttgtcagtg caccctactc tgttgaatgg gaactggaat ctgtcatttg 120 agaaggcatt tacatttagc agcaagattc aagtgaaagt ccctgttcca ggttctggaa 180 tatcaggctg tggtcagcat gggtctatca aaggcagcaa ctctccacaa cgagaattca 240 gtttcagaca cgccaagtca tccgaccgtg tgggcccaat gttcagtatt gcaatcggga 300 gcttcttctc ccaggcagtg aggataaacc tgtaaccaga gtatacctgc aaggatgatc 360 ccaccaccaa gagggagtcg gcttctttta cacgcttgtg cacaaaatca accttgtcag 420 ggttcactgt gtccccgaag aaaacgacat ctggtttcag atggcctcca cattgaacac 480 aggttgggac cgaaagctcc ggacttgctc ctctgagaga aagacgtcac catcaggagc 540 caggccatgg gctcagcact ccagttgggt tcaggacttg gaacgctctt gcagcacccc 600 cnggagtctg ttccca 616 <210> 20 <211> 492 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tttttttttt tgagttccaa taaaacttta tttccaaaaa caggtagcag gcccaatgtg 60 gcccaaaggc tgctgtttgc tcactcctgg gtctaaaaaa aaacatacta aactgctaac 120 ggtaactatt tctggatagc aaaactatgg gcgatttcta atttcctctt tataatgtga 180 taatttttgc atgttctcaa ttaaatttaa tcataagcat gtattattta aaaaaccaat 240 agcatgttct tttctttgtt tttggtgggg ctgggggagg aggctttgaa atgcccaaaa 300 catgcatggt ttcctatttt aatacaaatt cttattcatt gtttctcagt ttttctatag 360 gataccacaa agacctctca acatacattt gaaggaaagg aagaaatgga gggaggagag 420 aaggcgggaa ggaaagaagc aagggaggga ggaaggaaaa gaggataggg ggaaggaaaa 480 aataacaaac tc 492 <210> 21 <211> 428 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 agggtgagtt gcaagacagg aagaggggga tagaacaaga cacagacaga gagataaaga 60 gttaaagaca aagcaagtca gagacagaat tggagagaga cagagagagg gagaggcaga 120 gagagagaga tgaattcaca cgaaggcaaa aatgacttat tctattcaac caacactgct 180 gctgcaatga gcccgacgat gctcacatgg gcccaagccc tgccctccag aagcccttga 240 tcttggggga gacaggtgga cacagatcct ctggccccaa gagtcaagcc tggatcagag 300 gaggtacctg ggcctgggga agccccgtgg aggtgggggc cctggggcac gtggaagggc 360 ttcctggagg aggctaagca gtttcttgaa gggtgagagg gaagatcaga cagaagggat 420 cctctaga 428 <210> 22 <211> 4041 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 gtggcctgga ggactcattt aagaatcatg tgttgagtac ctactttgta ctgggcacac 60 tggagagcaa aggtggtacc atctatgccc tggtggctgc gggtggacac aaacatgtga 120 ccaggggcca ggactggtca ggaaggagga agcggtcctt ttgaggaggg cgaggcaacg 180 gaccctgccg cccaccagga ctggtgtccc tcaccttacc cccacccttg ccctcctcag 240 gtggcctgtg gagaggagaa acacagggca ccaactatga agactctcag ggcgcgattt 300 aagaagacag agctgcggct cagccccact gaccttggct cctgcccgcc ctgcggcccc 360 tgccccatcc cgaagccggc agccagaggc aggcgccaga gtcaagactg gggcaagagt 420 gacgagaggc tgctacaagc cgtggaaaac aacgatgcac ctcgggtggc cgccctcatc 480 gcccgcaagg ggctggtgcc cacgaagcta gaccccgagg gcaagtccgc gttccacctg 540 gcggccatgc ggggtgcggc cagctgtctg gaggtgatga tagctcatgg cagcaatgtc 600 atgagcgcgg acggggcagg ttacaatgcc ctccacctgg ccgccaaata cgggcaccca 660 cagtgcttga agcaactact gcaggcttcc tgcgtggtgg acgtcgtgga cagcagcggg 720 tggactgccc tacaccatgc agcggctggt ggctgtctct cctgctcaga ggtgctctgc 780 tcctttaagg cacatctaaa cccccaagat cggtcaggcg caacacccct cattatagca 840 gctcagatgt gtcacacaga cctgtgccgt ctcctactgc agcaaggggc tgccgcgaac 900 gatcaggacc tgcaaggcag gacggccctg atgctggcct gtgagggggc cagccccgaa 960 acagtggagg tcctgctgca gggcggagcc cagccgggca tcaccgatgc gctggggcag 1020 gacgcggctc actatggcgc cctggcgggg gacaaactca tcctgcacct tctgcaagag 1080 gcggcccagc gcccctcccc acccagcgcc ctcacagagg atgattcagg cgaggcgtca 1140 tctcagaact ctatgtccag ccatggaaag cagggggccc ccaagaagcg gaaggcgcct 1200 ccacctcccg ccagcattcc catgccggat gatcgagatg cctatgagga gatcgtgagg 1260 ctgcggcagg agaggggccg cctcctgcag aagatccggg gcctggaaca gcacaaggaa 1320 cggaggcagc aggagtcccc ggaggccagc tccctgcaca tcctggagag acaggtgcaa 1380 gagctacagc agttgctggt ggagagacaa gaggagaagg agagcctggg acgggaggtg 1440 gagagtttgc agagccggct gtccctgctg gagaacgagc gggagaatac tagctatgac 1500 gtaaccaccc tgcaggatga ggagggtgag ctgcctgacc ttccaggggc cgaggtgctg 1560 ctgtccagac aactcagtcc gtcggcccag gaacacctgg cctcgctgca ggaacaggtg 1620 gctgtgctca ccagacagaa ccaggaactg atggagaagg tccagatcct ggagaacttt 1680 gagaaggacg agacacagat ggaagtggaa gctttggcag aggtcatccc tcttgccctc 1740 tatgactctc tccgggccga gtttgaccag ctacgcaggc agcacgctga ggccctgcag 1800 gccctgaggc agcaggagac acgagaggtc cccagagaag agggggcagc ctgtggggag 1860 agtgaggttg ctggagccac ggccaccaaa aacgggccaa cccacatgga gctaaatggc 1920 tcagtggctc cagaaaccaa agttaacgga gccgagacca tagatgagga ggctgcagga 1980 gatgaaacca tggaagccag gactatggaa gctgaggcca cgggagccga ggccacggga 2040 gctgaggcca caggagccaa ggtcacagaa acaaaaccca caggggctga ggtcagagaa 2100 atggagacca cagaagaaga agcaaacatg gaaactaagc ccacaggagc tcaggccaca 2160 gacacagaga ccacgggagt ggaggccatg ggggtggagg ccacaaaaac aaaagcagag 2220 gaagcagaaa tgcaggccta cggagtgggt gctgggcaag cagagccccc agtcacaggg 2280 accacaaaca tggaggccac gggctctagg gccacaggga tggaatccac aggagtcagt 2340 gccacaggtg tggagaaccc aggggtagag gccacggtcc cggggatctc tgctggcccc 2400 atcctacatc ctggtgccgc agaggcctcg gaaaagcttc aagtagagct ggagaccagg 2460 atccgtggct tggaggaggc tctccggcag cgggagcggg aggcagctgc ggagctggag 2520 gcggccctgg ggaagtgcga ggccgcggag gccgaggcag gccggctgcg agagcgtgtc 2580 cgcgaggccg agggcagcgg ggccagcggg ggcggtggcg gtgacaccac acagctgcgg 2640 gcggccctgg agcaggcccg ggaggacctc cgagaccggg actcccgcct gcgggagctg 2700 gaggcggcct cggcctgcct ggatgaggct cgggccagcc ggctgctggc ggaggaggag 2760 gcgcggggcc tgcgggccga gctggcccag cgggaggagg cgcggctgga gcagagccgg 2820 gagctggagg ttctgcggga gcagctggcc acggccaggg ccacggggga gcagcagcgc 2880 acggcggccg cggaactggg ccgggcacgg gacgccgctg aggcccgagt ggctgagctg 2940 cctgcggcct gcgaggaggc gcggcagggc ctggccgagc tgcgggaggc ctccgaggcc 3000 ctccgccagt ccgtggtgcc ggcctctgag caccgccggc tgcaggagga ggccctggag 3060 ctgcggggcc gggcagccag tctggagcag gaggtggtgg ccacgggcaa ggaggccgcc 3120 cggctgcgcg cggagctgga gcgggagcgt gtgtgcagcg tggcgctctc ggagcacgaa 3180 cgcatcgtgg gcaccctgca ggccaacgtg gcccagctgg aggggcagct ggaggagctg 3240 ggacggcggc atgagaagac cagcgcagag 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(648)..(648) <223> n is a, c, g, or t <400> 23 tttttttttt ttttttctct ttaaaaggtt tattgatcat atacaaaata aagaaaacct 60 tatatatcac aaacatacac tatgtacagc aataaatacc cggggggcca ggcccagtgc 120 tgcccctcct ggacaataat ttagcaataa atactgcgca gggcaggggt agggcaccaa 180 ggccactgcc ctgcaagagg tcaggcccct gcccgcccta cacgaagtgt gagcgctcgg 240 gcctcacccc gcatccaaac cccagcccct cctcacttag atctttaata acctccatcc 300 caccccagca gatcccgggg tcttctccca cacacacaac ctcccctggc tagacctagg 360 cagggcaggc agggactgat caactctgct tggacccacc tctcagcgcc aggagagcaa 420 cagggctgga cacgcgggca gcccttgtcc tgttgccagg agaaggcttt ctgtgcccac 480 tcccgtttgg ttaaaggctt cagggactag cagattgagg gggtgggaag aagggcaggg 540 ctgggacaca aggttgctgg aggggccaaa gcccaactgg ggtcaccaag aacagggagg 600 tctcacagtt tatcggggac acactctagc tcagactcaa gggacacnca tggtatcaaa 660 gctgctgctc caggggcagg gtggaaatgt gtgggactgg ccagc 705 <210> 24 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 24 ttggtattca caag 14 <210> 25 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 25 aaactggaaa ccta 14 <210> 26 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense Oligonucleotide <400> 26 gatctttatg agaa 14 <210> 27 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 27 gatggagaaa ttgg 14 <210> 28 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 28 agtctgatgg agaa 14 <210> 29 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 29 tgttaaggga tgtc 14 <210> 30 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 30 aatctgcttt tgtt 14 <210> 31 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 31 agggaattga aatc 14 <210> 32 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 32 taaggcaaga tttc 14 <210> 33 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 33 taaatggagt taag 14 <210> 34 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 34 ttatttatag caca 14 <210> 35 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 35 ttgcttctgc ttat 14 <210> 36 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 36 aaaaaaatat ttgc 14 <210> 37 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 37 cagccttaaa aaaa 14 <210> 38 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 38 ttttaaaacc tctc 14 <210> 39 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 39 tagttcagat tttt 14 <210> 40 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 40 agcagttgct aaat 14 <210> 41 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 41 ctgagtgcag cagc 14 <210> 42 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 42 gtctgatgga ga 12 <210> 43 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 43 gtctgatgga ga 12 <210> 44 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 44 gtctgatgga ga 12 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 45 gmumctmgma tmgmgamgma 20 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 46 mgmumcmumg mamumgmgma mgma 24 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 47 actgacacct aattgtattc acatgaa 27 <210> 48 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 48 tgagcagcag ttgctaaatt agttca 26 <210> 49 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 49 tctacctaca ttatatcata gctccta 27 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 50 ttggtattca caagtgaaa 19 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 51 ttgctaaatt agttcagat 19 <210> 52 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 52 gcagcagcag ttgctaaat 19 <210> 53 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 53 gcagttgcta aattagttc 19 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 54 gccatgttgc ccagtccagt 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 55 gggctctgct acttacttgc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 56 cccagtcttc agccttgtct 20 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 65 ctgactgcca tcgagaagtg g 21 <210> 66 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 66 gcccatctgc ttgcttgat 19 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 67 atcctcacca cagtcttgt 19 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 68 gcttacttcc tcctcccttt 20 <210> 69 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 69 ccaggtgata ggagcagaac t 21 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 70 accctccttc ctccctctct 20 <210> 71 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 71 ccactctccc ttctgtcctc t 21 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Antisense oligonucleotide <400> 72 cctccttcct ccctctctct 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> 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taaagctttc agaaattact 1080 gaaaaacctc cacgaacaca aaaagaattg gcttatttgt cagagttgcc acccacacct 1140 cttcatgttt cagaagactc aagttcacca gaaagaactt caccaccaga ttcttcagtg 1200 attgtcacac ttttagacca agcagctaag agtaatgatg atttagatgt gtctgaatca 1260 aaaggttgta tggaagaaaa accacaggaa gtacaaactt ctaggaatgt tgaaagtatt 1320 gctgaacaga tggaaaatcc ggatttgaag aatgttggtt ctagtactgg ggagaaaaat 1380 gaaagaactt cagtggctgg aacagtgaga aaatgctggc ctaatagagt ggcaaaggag 1440 cagattagta ggcggcttga tggtaatcag tatctgtttt tgccaccaaa tcgttacatt 1500 ttccatggcg ctgaggtata ttcagactct gaagatgacg tcttatcctc tagttcttgt 1560 ggcagtaaca gtgatagtgg gacatgccag agtccaagtt tagaagaacc catggaggat 1620 gaaagtgaaa ttgaagaatt ctacaatggc ttagaagatg agcctgatgt tccagagaga 1680 gctggaggag ctggatttgg gactgatgga gatgatcaag aggcaattaa tgaagctata 1740 tctgtgaaac aggaagtaac agacatgaac tatccatcaa acaaatcata gtgtaataat 1800 tgtgcaggta caggaattgt tccaccagca ttaggaactt tagcatgtca aaatgaatgt 1860 ttacttgtga actcgataga gcaaggaaac cagaaaggtg taatatttat aggttggtaa 1920 aatagattgt ttttcatgga taatttttaa cttcattatt tctgtacttg tacaaactca 1980 acactaactt tttttttttt aaaaaaaaaa aggtactaag tatcttcaat cagctgttgg 2040 tcaagactaa ctttctttta aaggttcatt tgtatgataa attcatatgt gtatatataa 2100 ttttttttgt tttgtctagt gagtttcaac atttttaaag ttttcaaaaa gccatcggaa 2160 tgttaaatta atgtaaaggg aacagctaat ctagaccaaa gaatggtatt ttcacttttc 2220 tttgtaacat tgaatggttt gaagtactca aaatctgtta cgctaaactt ttgattcttt 2280 aacacaatta tttttaaaca ctggcatttt ccaaaactgt ggcagctaac tttttaaaat 2340 ctcaaatgac atgcagtgtg agtagaagga agtcaacaat atgtggggag agcactcggt 2400 tgtctttact tttaaaagta atacttggtg ctaagaattt caggattatt gtatttacgt 2460 tcaaatgaag atggcttttg tacttcctgt ggacatgtag taatgtctat attggctcat 2520 aaaactaacc tgaaaaacaa ataaatgctt tggaaatgtt tcagttgctt tagaaacatt 2580 agtgcctgcc tggatcccct tagttttgaa atatttgcca ttgttgttta aatacctatc 2640 actgtggtag agcttgcatt gatcttttcc acaagtatta aactgccaaa atgtgaatat 2700 gcaaagcctt tctgaatcta taataatggt acttctactg 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ttcaagccaa ccatctgtca ctacttcatg cgcctgctga aggacaaggg gctactcctg 780 cgctgctaca cgcagaacat agataccctg gagcgaatag ccgggctgga acaggaggac 840 ttggtggagg cgcacggcac cttctacaca tcacactgcg tcagcgccag ctgccggcac 900 gaatacccgc taagctggat gaaagagaag atcttctctg aggtgacgcc caagtgtgaa 960 gactgtcaga gcctggtgaa gcctgatatc gtcttttttg gtgagagcct cccagcgcgt 1020 ttcttctcct gtatgcagtc agacttcctg aaggtggacc tcctcctggt catgggtacc 1080 tccttgcagg tgcagccctt tgcctccctc atcagcaagg cacccctctc cacccctcgc 1140 ctgctcatca acaaggagaa agctggccag tcggaccctt tcctggggat gattatgggc 1200 ctcggaggag gcatggactt tgactccaag aaggcctaca gggacgtggc ctggctgggt 1260 gaatgcgacc agggctgcct ggcccttgct gagctccttg gatggaagaa ggagctggag 1320 gaccttgtcc ggagggagca cgccagcata gatgcccagt cgggggcggg ggtccccaac 1380 cccagcactt cagcttcccc caagaagtcc ccgccacctg ccaaggacga ggccaggaca 1440 acagagaggg agaaacccca gtgacagctg catctcccag gcgggatgcc gagctcctca 1500 gggacagctg agccccaacc gggcctggcc ccctcttaac cagcagttct tgtctgggga 1560 gctcagaaca 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tttttcaaag gcagaaacca accctggagc aattgagagg actgtttaaa 1740 cacagagctt aacaatggca gaattgtata tctcgtgctt aacagatttt ggttgaactt 1800 taccctaggt caggggtcag caaactactg cctgtgggcc aaatttgccc accacctgta 1860 tctgtaaata aggtttcatt ggaacacagc tgtggccata tgtttgtata ttgtgtgtgg 1920 ctgcttttgc attaggatga cagaggtgaa tagttgcaac agagactggc tggtctgcaa 1980 agcctaaaat atgtcctgtg tggcccttta cagaaaaagt tttctaaccc ctgctctagg 2040 ttacggagaa aaaaaaaatg gaataatgtt ctctgctact tttaacctga ttttctttgt 2100 tacctaaata ggcagctaga atgctgccta tattttaata aggatttgga tctcacaaga 2160 caccttaggc cttacacaag ttgttcagat tctttgcccc agttctaatc tagtgacaaa 2220 ggcatagaat tctcctccca caggaatgta tttctatttt caaggtgtta attagttcca 2280 gttttggttt tgtcgttttc cccatgtccg atgcttatat tggatgattt ctgataaacc 2340 ctgactattc caataaaccc taggcatttt tgaatttaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 2398 <210> 139 <211> 3831 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> NM_001193267.1 <309> 2010-12-20 <313> (1)..(3831) <400> 139 tgggagggag gcaccccggg gggcggggcg 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ctgccattct 900 ggaggaggtt gacagagagc tcgcccactg tgatttatgt ctagtggtgg gcacttcctc 960 tgtggtgtac ccagcagcca tgtttgcccc ccaggtggct gccaggggcg tgccagtggc 1020 tgaatttaac acggagacca ccccagctac gaacagattc aggtttcatt tccagggacc 1080 ctgtggaacg actcttcctg aagcccttgc ctgtcatgaa aatgaaactg tttcttaagt 1140 gtcctgggga agaaagaaat tacagtatat ctaagaacta ggccacacgc agaggagaaa 1200 tggtcttatg ggtggtgagc tgagtactga acaatctaaa aatagcctct gattccctcg 1260 ctggaatcca acctgttgat aagtgatggg ggtttagaag tagcaaagag cacccacatt 1320 caaaagtcac agaactggaa agttaattca tattatttgg tttgaactga aacgtgaggt 1380 atctttgatg tgtatggttg gttattggga gggaaaaatt ttgtaaatta gattgtctaa 1440 aaaaaatagt tattctgatt atatttttgt tatctgggca aagtagaagt caaggggtaa 1500 aaaccctact attctgattt ttgcacaagt tttagtggaa aataaaatca cactctacag 1560 taggtaattt attgtataaa gacattaccc cacgatatgg ctttattagg gacttttttt 1620 tttttttttt gagacagagt ttcactcttg ttgcccaggc tggagtgcag tggtgcgatc 1680 tcagctcaca gcaacctccg cctcccgggt tcaagagatt ctcctgcctc 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tactaccttg 2580 gagtaaagta gtaagaatac agctttttcc ttaaccttta ccagctaact cagtgcttag 2640 gggccttgga atgcctgctg tccagcaggt gtcacaggcc tgactgggag gcatggccat 2700 tatcaacagt gtatgaaggt cacatatggc tccctgaagt gattacatac ttggaccaca 2760 tcacctcagc cccttgcaaa attgcattta atgttacacc cttggctttt gtagaaacag 2820 gcaacaagac actatcatat aaaactttgt actgcattgc aaggcataac ctttaataaa 2880 tcccagtggt cctttgtgta gggaacgggg atgctcatag cctatggggc ggctggagaa 2940 ccagtcaggg accctgaggg ctcgatgtac actttacatg ggtgggccaa ggagtttaca 3000 ctgagggcac tggtaatacc tgtaatagtc ttatagtact tataaagcag ttttgcacat 3060 aaaataccat catgcactta taagtttgtt cttgggctgc tccaagttaa ctttattcat 3120 tttcctagtg ttagtgtctc agggagtctg attatatttt tgatttgtaa tttctatctg 3180 actaaggcct agagatttca aaactgttct ttgcaattcc tctcatactg aacctctggt 3240 tcagcagctt tttttgttgt tgttgttttc aagttttatc atttttgttc ctatttggtt 3300 ttgtcgtttt taaattgaga attgcttcta aaacagaaga catgaaaaga gaattaaaaa 3360 tacaatatat gtgtaagata gaattattca acttagcatt tattaaacat ctaccagatg 3420 atagacatta gaaataaaat gactagcaag acctggccct tcccctcagg ggttcacaga 3480 atggctggag caactgtcat ataagctgtt atgaagtgca gaaactacac agacatttgt 3540 gcgggttcag accagcgcaa ttagagatgg gcagagtggg atggggtagg ggtaaggtgc 3600 ttgaaatttg cctgggtggg aatttttgaa gtataaaaag gacttctacc tggggggctg 3660 cggcagtaga gggaagagca cggtcggtac aaatgcatgg caggtgtgaa acagtttgat 3720 ttgttcaaag aatgatgaat cacttagtgt tgtataatgg atgggaggag agaaacacag 3780 cgatcacaaa gggccatgtt tgccaagaaa taaaatatac ttggaaaaaa a 3831 <210> 140 <211> 1555 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> NM_001193285.1 <309> 2010-10-03 <313> (1)..(1555) <400> 140 gcttccggcg gaagcggcct caacaaggga aactttattg ttcccgtggg gcagtcgagg 60 atgtcggtga attacgcggc ggggctgtcg ccgtacgcgg acaagggcaa gtgcggcctc 120 ccggagatct tcgacccccc ggaggagctg gagcggaagg tgtgggaact ggcgaggctg 180 gtctggcagt cttccagtgt ggtgttccac acgggtgccg gcatcagcac tgcctctggc 240 atccccgact tcaggggtcc ccacggagtc tggaccatgg aggagcgagg tctggccccc 300 aagttcgaca ccacctttga gagcgcgcgg cccacgcaga cccacatggc gctggtgcag 360 ctggagcgcg tgggcctcct ccgcttcctg gtcagccaga acgtggacgg gctccatgtg 420 cgctcaggct tccccaggga caaactggca gagctccacg ggaacatgtt tgtggaagaa 480 tgtgccaagt gtaagacgca gtacgtccga gacacagtcg tgggcaccat gggcctgaag 540 gccacgggcc ggctctgcac cgtggctaag gcaagggggc tgcgagcctg caggaacgcc 600 gacctgtcca tcacgctggg tacatcgctg cagatccggc ccagcgggaa cctgccgctg 660 gctaccaagc gccggggagg ccgcctggtc atcgtcaacc tgcagcccac caagcacgac 720 cgccatgctg acctccgcat ccatggctac gttgacgagg tcatgacccg gctcatgaag 780 cacctggggc tggagatccc cgcctgggac ggcccccgtg tgctggagag ggcgctgcca 840 cccctgcccc gcccgcccac ccccaagctg gagcccaagg aggaatctcc cacccggatc 900 aacggctcta tccccgccgg ccccaagcag gagccctgcg cccagcacaa cggctcagag 960 cccgccagcc ccaaacggga gcggcccacc agccctgccc cccacagacc ccccaaaagg 1020 gtgaaggcca aggcggtccc cagctgacca gggtgcttgg ggagggtggg gctttttgta 1080 gaaactgtgg attctttttc tctcgtggtc tcactttgtt acttgtttct gtccccggga 1140 gcctcagggc tctgagagct gtgctccagg ccaggggtta cacctgccct ccgtggtccc 1200 tccctgggct ccaggggcct ctggtgcggt tccgggaaga agccacaccc cagaggtgac 1260 aggtgagccc ctgccacacc ccagcctctg acttgctgtg ttgtccagag gtgaggctgg 1320 gccctccctg gtctccagct taaacaggag tgaactccct ctgtccccag ggcctccctt 1380 ctgggccccc tacagcccac cctacccctc ctccatgggc cctgcaggag gggagaccca 1440 ccttgaagtg ggggatcagt agaggcttgc actgcctttg gggctggagg gagacgtggg 1500 tccaccaggc ttctggaaaa gtcctcaatg caataaaaac aatttctttc ttgca 1555 <210> 141 <211> 2714 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> NM_021932.4 <309> 2010-12-26 <313> (1)..(2714) <400> 141 gcagggcacg gtgggggctg agatcgtttc ctgttggaac ttctggccca agaagcgcgg 60 gtcacaagga gaggggtcag ttcggttcag agcgactcag cccctcgact cgggtcttaa 120 aacctccgag ccgccagttc tgcctcaggc cgcgccccct taaagcgcca ccagacgctg 180 cgccccgtta aagcgccacc agacgccgcg ccccgtcccg gcctcccccg cgcgctggcg 240 cggggctttc tgggccaggg cggggccggc gaactgcggc ccggaacggc tgaggaaggg 300 cccgtcccgc cttccccggc gcgccatgga gccccgggcg gttgcagaag ccgtggagac 360 gggtgaggag gatgtgatta tggaagctct gcggtcatac aaccaggagc actcccagag 420 cttcacgttt gatgatgccc aacaggagga ccggaagaga ctggcggagc tgctggtctc 480 cgtcctggaa cagggcttgc caccctccca ccgtgtcatc tggctgcaga gtgtccgaat 540 cctgtcccgg gaccgcaact gcctggaccc gttcaccagc cgccagagcc tgcaggcact 600 agcctgctat gctgacatct ctgtctctga ggggtccgtc ccagagtccg cagacatgga 660 tgttgtactg gagtccctca agtgcctgtg caacctcgtg ctcagcagcc ctgtggcaca 720 gatgctggca gcagaggccc gcctagtggt gaagctcaca gagcgtgtgg ggctgtaccg 780 tgagaggagc ttcccccacg atgtccagtt ctttgacttg cggctcctct tcctgctaac 840 ggcactccgc accgatgtgc gccagcagct gtttcaggag ctgaaaggag tgcgcctgct 900 aactgacaca ctggagctga cgctgggggt gactcctgaa gggaaccccc cacccacgct 960 ccttccttcc caagagactg agcgggccat ggagatcctc aaagtgctct tcaacatcac 1020 cctggactcc atcaaggggg aggtggacga ggaagacgct gccctttacc gacacctggg 1080 gacccttctc cggcactgtg tgatgatcgc tactgctgga gaccgcacag aggagttcca 1140 cggccacgca gtgaacctcc tggggaactt gcccctcaag tgtctggatg ttctcctcac 1200 cctggagcca catggagact ccacggagtt catgggagtg aatatggatg tgattcgtgc 1260 cctcctcatc ttcctagaga agcgtttgca caagacacac aggctgaagg agagtgtagc 1320 tcccgtgctg agcgtgctga ctgaatgtgc ccggatgcac cgcccagcca ggaagttcct 1380 gaaggcccag ggatggccac ctccccaggt gctgccccct ctgcgggatg tgaggacacg 1440 gcctgaggtt ggggagatgc tgcggaacaa gcttgtccgc ctcatgacac acctggacac 1500 agatgtgaag agggtggctg ccgagttctt gtttgtcctg tgctctgaga gtgtgccccg 1560 attcatcaag tacacaggct atgggaatgc tgctggcctt ctggctgcca ggggcctcat 1620 ggcaggaggc cggcccgagg gccagtactc agaggatgag gacacagaca cagatgagta 1680 caaggaagcc aaagccagca taaaccctgt gaccgggagg gtggaggaga agccgcctaa 1740 ccctatggag ggcatgacag aggagcagaa ggagcacgag gccatgaagc tggtgaccat 1800 gtttgacaag ctctccagga acagagtcat ccagccaatg gggatgagtc cccggggtca 1860 tcttacgtcc ctgcaggatg ccatgtgcga gactatggag cagcagctct cctcggaccc 1920 tgactcggac cctgactgag gatggcagct cttctgctcc cccatcagga ctggtgctgc 1980 ttccagagac ttccttgggg ttgcaacctg gggaagccac atcccactgg atccacaccc 2040 gcccccactt ctccatctta gaaacccctt ctcttgactc ccgttctgtt catgatttgc 2100 ctctggtcca gtttctcatc tctggactgc aacggtcttc ttgtgctaga actcaggctc 2160 agcctcgaat tccacagacg aagtactttc ttttgtctgc gccaagagga atgtgttcag 2220 aagctgctgc ctgagggcag ggcctacctg ggcacacaga agagcatatg ggagggcagg 2280 ggtttgggtg tgggtgcaca caaagcaagc accatctggg attggcacac tggcagagcc 2340 agtgtgttgg ggtatgtgct gcacttccca gggagaaaac ctgtcagaac tttccatacg 2400 agtatatcag aacacaccct tccaaggtat gtatgctctg ttgttcctgt cctgtcttca 2460 ctgagcgcag ggctggaggc ctcttagaca ttctccttgg tcctcgttca gctgcccact 2520 gtagtatcca cagtgcccga gttctcgctg gttttggcaa ttaaacctcc ttcctactgg 2580 tttagactac acttacaaca aggaaaatgc ccctcgtgtg accatagatt gagatttata 2640 ccacatacca cacatagcca cagaaacatc atcttgaaat aaagaagagt tttggacaaa 2700 aaaaaaaaaa aaaa 2714 <210> 142 <211> 1757 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <308> NM_002817.3 <309> 2010-12-26 <313> (1)..(1757) <400> 142 tttgacgcct caatggcaca gccaagtgcg cgggaagtgg gctgcaaacg ccggagagtt 60 ttgtccggag cgcagagacg cgctgtaacc gagcaaccag cggggcccgc ccccggcctg 120 ctacggcgct cccagcctgc cccgcgccgc tcggcgccgg aagtgagtga gcatttccgg 180 cagccatccc cgcggtgctg acatcccggt tgttcttctg tgccgggggt cttcctgctg 240 tcatgaagga cgtaccgggc ttcctacagc agagccagaa ctccgggccc gggcagcccg 300 ctgtgtggca ccgtctggag gagctctaca cgaagaagtt gtggcatcag ctgacacttc 360 aggtgcttga ttttgtgcag gatccgtgct ttgcccaagg agatggtctc attaagcttt 420 atgaaaactt tatcagtgaa tttgaacaca gggtgaaccc tttgtccctc gtggaaatca 480 ttcttcatgt agttagacag atgactgatc ctaatgtggc tcttactttt ctggaaaaga 540 ctcgtgagaa ggtgaaaagt agtgatgagg cagtgatcct gtgtaaaaca gcaattggag 600 ctctaaaatt aaacatcggg gacctacagg ttacaaagga aacaattgaa gatgttgaag 660 aaatgctcaa caaccttcct ggtgtgacat cggttcacag tcgtttctat gatctctcca 720 gtaaatacta tcaaacaatc ggaaaccacg cgtcctacta caaagatgct ctgcggtttt 780 tgggctgtgt tgacatcaag gatctaccag tgtctgagca gcaggagaga gccttcacgc 840 tggggctagc aggacttctc ggcgagggag tttttaactt tggagaactc ctcatgcacc 900 ctgtgctgga gtccctgagg aatactgacc ggcagtggct gattgacacc ctctatgcct 960 tcaacagtgg caacgtagag cggttccaga ctctgaagac tgcctggggc cagcagcctg 1020 atttagcagc taatgaagcc cagcttctga ggaaaattca gttgttgtgc ctcatggaga 1080 tgactttcac acgacctgcc aatcacagac aactcacttt tgaagaaatt gccaaaagtg 1140 ctaaaatcac agtgaatgag gtggagcttc tggtgatgaa ggccctttcg gtggggctgg 1200 tgaaaggcag tatagacgag gtggacaaac gagtccacat gacctgggtg cagccccgag 1260 tgttggattt gcaacagatc aagggaatga aggaccgcct ggagttctgg tgcacggatg 1320 tgaagagcat ggagatgctg gtggagcacc aggcccatga catcctcacc tagggccccc 1380 tggttccccg tcgtgtctcc tttgactcac ctgagagagg cgtttgcagc caatgaagct 1440 ggctgctcag acggtcgaca ttgaatttgg gtgggggttg ggatcctgtc tgaagtacag 1500 actgttcttg ctctaaaaac aggactgtcc ctgatgggag ccaggccaca gggaggaggc 1560 ttctttgtgg gtctctcctg cagagggtgg gggtctcagg gtcttaggtg atacgggaga 1620 gaaagaacgt gccaggcagg aggccccctg aagtctgtgt actccgaggt ggatctccat 1680 ccccatccac ctgtacggac atcttttccg ttgcggtttg agaatgttcc tataataaac 1740 ccctctgctt tgttctt 1757 <210> 143 <211> 3647 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 catgtcagga aagttcaaac atttccttct aataaggaag atatctttga aatagtcttt 60 tgtaataaaa atgccatttt atttatttat tattattatt ttttgagacg gagtttcatt 120 cttatcaccc aggctggagt gcaatggcac agtctcagct cactacatcc tcctcctccc 180 gggttccagt gattctcctg ccacagcctc cagagtagct gggattacag gcacccgcca 240 ccacgcctgg ataatttttg tatttttagt agagacaggg tttcatcatg ttgaccaggc 300 tggtctcaaa ctcctaacct caggcgatcc acccgccttg gcctcccaaa gtgctgggat 360 tacaggtgtg aaccaccacc tggccaccat tttatttatt ttgggtgggc aaagggacag 420 agtctcgcac tgtcgcccag gctggagtgc aatggcagat ctcagctcgc tgcaacctcc 480 gtctccccag ttcaagccat tctcatgcct cagcctccca agtagctggg attacaagcg 540 tgtgccacca cacctggcta atttttgtag ttttagtaga gatggcattt caccatgttg 600 gccaggctgg tcttgaactc ctgtcctcac gtgatccacc agcctcggcc tcccaaagtg 660 ctacataaca gacgtgagcc acagcaccgg gacaaaaatg ccattttatt tagttgactg 720 tttcttgtgt gcctgattgg aatatgtaat tgctacaggg gtgttttcat ccttctacct 780 tcatatccca gaggaactac aggctctcct aatccaaagt taaggtcatt tggaggttcc 840 ctctcctact gtgcccacac taggcgctct tggcccagtt acccctaact caggggttat 900 tgtcagctct ccttctctgt gaccggccca catctgagtg agtctggttc gttaccccta 960 aatctctctc aaattattca tccatcctca ttacggttgc tccctcactc tcctgtcttg 1020 gccagtacta gcctctgact gttctctctc agtctctttc acctgctgtc ctctctgccc 1080 caggcgtgtt tctaaaatag aaatgatcat gtgtgtcctc tggttcggcc ttgcactctg 1140 gacagagacc aatcttcagt gcttcctagt ctgtgtccct cagaaatgcc cctgaaacat 1200 aatgtatttt tttcttcagt gcttttgcac atgtttgtta ctgtctggaa tgttcttctc 1260 tcagcttctt cccctcccac accaaatggc cacctctcta accgcccttc attccttgaa 1320 actcagtatt gccacttcta cagtaacctt tgaagcctct ccctttggct gatgcacttc 1380 tgcccctttt tttttctttc tttctttttg ctcttaaact cactgtattg tcatttattt 1440 gtttaaagac tgtcttcagt ggaccaggag ctccttgaag acacatcatt tgtcttacac 1500 gttctatgtt gtagtatcta gtatggagtc tgaggaagtg ctcaagtgtg ctgaatggct 1560 aagaaatttg aaaacggtgc ataattagct ttaattaaaa tctgaaggaa ctccattctg 1620 tttgattagc aaacatttct ctttttgttt taaattttat ttcattaact taataggtga 1680 acaaaatgtg tatttcaaat ctaattgaaa ttcatctgaa acatgtttac acagaagata 1740 gatataagat ttcaagtaac ttattgtaca gtccattgtc cattttaaga tattctttct 1800 tccaaaaaaa ctgcgttgaa tgtcaaaaaa aatcttttat actccataaa attgagatgc 1860 aaacttctga tataaatttt tttcactgtc aactccgatg ataaagatgg gaggcacaag 1920 cgttcacagt tcagttaaat gatgcaaacg aaaagcttct gttttccttt gatacaaatt 1980 agaagcctcc attcaggtct cttacagtag taccgcatac ttgatcctga tactacatta 2040 tgtctttttc tttttctctt ttttttttga gatggagttt cactcttgtt gcctaggctg 2100 gaatgcaatg gcacaatctc agctcacagc aacctctgcc tccctggttc aagcgattct 2160 tctgcctcag cctcccaagt agctgggact acaggcgcgc gccaccatgc ccagctgatt 2220 tttgtatttt tagtagagac ggggtttcac catgttgacc aggatggttc caatctcttg 2280 acctcatgat ccacccacct ctgcctccca aagtgctggg attacaggcg tgagccactg 2340 cgcccggatg gttacgtctt tttctttccc tttttttact tccctctcct tgttgaagac 2400 tttggtcacc acctcctgtt tttttgtgtc cttgttttta atttaggtat catttatgct 2460 gcacacaaca ttactgactt aacgtggtgg gaaatgtaca agatagaggc tgccattttc 2520 ctgtttgagc tgggcccaga ttctgctttt atattgaaca tcacgattcc attctctaga 2580 gaacatttta tttttctcaa gaaatgcatt aagtccaact gctaaacata gatcttgaat 2640 ctctagctgt aggattttca acagtcttac ttatggggat tcaccttcct tccacaatgg 2700 tcttattatt taaatgagta ggacagatac aaataaacct gaacatagat cttgaatctc 2760 tggctgtagg attttcaaca gccttactta tgggattcac cttccttcca cagtggtctt 2820 cttattattt aaataagcag gatagataca aataaacctg tcctggtagg ctggggacca 2880 cacggcagcg caggccatct tcacaagggt ccaaatacca acagcccgga agccacaggg 2940 agagaactga gggagcgttt caatctgata gtctatttag cttacagtac ctggaagaaa 3000 gaatatagga atctgtctgg aggttcttat aggtcagtac tctaattccc aaaactagaa 3060 gaaacctaat attccttagt aatctgttga tcatttatgt gaatgtaagt aagccctgat 3120 atggtctcct atcattctgc aaacatgcat tgcttactgt gtgctgggca ctgtggcttg 3180 cacactccca acttgatagc attgatgcag cttctttacc aaagatagtg tttggggtct 3240 tcgttttgca gaataaaaga catcctataa tttctctcca tgttttggtt tcacagcttt 3300 atgaaaactt tatcagtgaa tttgaacaca ggtaaaagcc tctcatccgt ttttcacttt 3360 gaaaatgagt gcattgatgc tcggcggtgc tcaaaggctg gtggctttta tttcagggtg 3420 aaccctttgt ccctcgtgga aatcattctt catgtagtta gacagatgac tggtaagtct 3480 cactttgttt tataaaggag cagatccaaa tggtggttaa aattgaaata taagttaact 3540 gaacttttgt gttttctgta tcagatatta tgtttttatt atactttatg gtcaaaacct 3600 aaagattacc ctacctaagg gtgtcttggt tagcagaaac cagtctg 3647 <210> 144 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 126 <400> 144 rgrcrarcrc rarurcrurg rgrgraruru rgrgrcrarc rarcrugg 48 <210> 145 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse complement of the antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 127 <400> 145 rcrarargrg rarurcrura rcrcrargru rgrurcrurg rargrcag 48

Claims (5)

  1. 서열 번호: 19의 시르투인 4(SIRT4) 천연 안티센스 서열에 상보적인 15개 내지 30개 뉴클레오티드 길이의 합성 올리고뉴클레오티드에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드는 시르투인 4(SIRT4)의 발현을 증가시키는 안티센스 화합물이고, 그리고 상기 올리고뉴클레오티드는 서열 번호: 104 내지 107 중에서 한 가지에 제시된 뉴클레오티드 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서,
    a. 올리고뉴클레오티드는 siRNA 화합물이거나; 또는
    b. 올리고뉴클레오티드는 단일-가닥인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서, 시르투인(SIRT)의 발현은 최소한 10% 증가하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서, 다음을 포함하는 하나 이상의 변형을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드:
    a. 포스포로티오에이트, 2'-O-메톡시에틸(MOE), 2'-플루오르, 알킬포스포네이트, 포스포로디티오에이트, 알킬포스포노티오에이트, 포스포르아미데이트, 카르바메이트, 카르보네이트, 포스페이트 트리에스테르, 아세트아미데이트, 카르복시메틸 에스테르, 그리고 이들의 조합으로부터 선택되는 최소한 하나의 변형된 뉴클레오시드간 링키지;
    b. 펩티드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 아라비노-핵산(FANA), 그리고 이들의 조합으로부터 선택되는 최소한 하나의 변형된 뉴클레오티드; 또는
    c. 2'-O-메톡시에틸 변형된 슈가 모이어티, 2'-메톡시 변형된 슈가 모이어티, 2'-O-알킬 변형된 슈가 모이어티, 바이사이클 슈가 모이어티, 그리고 이들의 조합으로부터 선택되는 최소한 하나의 변형된 슈가 모이어티.
  5. 제1항의 올리고뉴클레오티드 및 제약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 제약학적 조성물에 있어서.
    a. 유방암, 결장암, CCL, CML 또는 전립선 암으로부터 선택되는 암; 그리고
    b. 미토콘드리아 근병증, 뇌장애, Leber 질환, Leigh 뇌질환, Pearson 질환, 젖산 산증, 또는 MELAS 증후군(mitochondrial encephalopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes)으로부터 선택되는 미토콘드리아 기능이상으로 구성된 군에서 선택되는 시르투인(SIRT) 연관 질환 또는 장애를 치료하는데 이용되는 것을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
KR1020177027382A 2010-05-03 2011-01-13 시르투인 (sirt)에 대한 자연 안티센스 전사체의 저해에 의한 시르투인 (sirt) 관련된 질환의 치료 KR101892888B1 (ko)

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