KR20170066450A - 조직-접착 다공성 지혈 제품 - Google Patents

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요하네스 카스파 마티아스 엘리자베스 벤더
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가트 테크놀로지스 비.브이.
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Abstract

본 발명은 다공성 고체 기재를 제공하는 단계; 상기 기재를 친전자성으로 활성적인 폴리옥사졸린(EL-POX) 및 용매를 포함하는 코팅액으로 코팅하여 코팅된 기재를 생성하는 단계로서, 상기 EL-POX는 적어도 2개의 반응성 친전자성 기를 함유하는 코팅된 기재를 생성하는 단계; 코팅된 기재로부터 용매를 제거하는 단계를 포함하는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 기재의 공극 구조를 대체로 손상시키지 않고 EL-POX 코팅의 적용을 가능하게 하여 다공성 기재가 혈액과 같은 체액을 흡수하는 능력이 본질적으로 영향을 받지 않게 한다. 본 발명의 방법에 의해 수득된 EL-POX 코팅된 지혈 제품은 예를 들어, 공유 결합의 형성하에 조직 내에 자연적으로 존재하는 아민기와 반응할 수 있는 친전자성 반응기의 존재로 인해 우수한 접착 특성을 갖는다. 본 발명은 또한 코팅된 메시, 코팅된 발포체 및 코팅된 분말로부터 선택된 접착성 지혈 제품으로서, 상기 지혈 제품은 적어도 5부피%의 다공성을 가지며 반응성 친핵성 기를 함유하는 친핵성 폴리머를 포함하는 외부 표면을 포함하는 다공성 고체 기재; 고체 기재의 적어도 일부를 피복하는 접착성 코팅으로서, 상기 코팅은 친전자성으로 활성화된 폴리옥사졸린(EL-POX)을 포함하며, 상기 EL-POX는 평균적으로 적어도 1개의 반응성 친전자성 기를 함유하는, 접착성 코팅을 포함하는, 접착성 지혈 제품을 제공한다.

Description

조직-접착 다공성 지혈 제품{TISSUE-ADHESIVE POROUS HAEMOSTATIC PRODUCT}
본 발명은 다공성 고체 기재 및 친전자성으로 활성화된 폴리옥사졸린(EL-POX)을 함유하는 코팅을 포함하는 조직-접착 지혈 제품에 관한 것이다. 이 새로운 지혈 제품은 우수한 생분해성, 접착성 및 지혈 특성을 나타낸다. 본 발명에 포함되는 지혈 제품의 예는 지혈 메쉬(haemostatic mesh), 지혈 발포체 및 지혈 분말을 포함한다.
또한, 다공성 고체 기재에 친전자성으로 활성화된 폴리옥사졸린(EL-POX)을 코팅하는 것을 포함하는 조직-접착 지혈 제품을 제조하는 방법이 제공된다.
상처 드레싱은 세계적인 상처 치료 시장의 중요한 부분을 형성한다. 이 제품들은 상처, 출혈, 손상된 조직 및 출혈 조직과 같은 상해 치료에 널리 사용된다. 이상적인 드레싱은 과도한 출혈을 예방하고 환자에게 불편함을 최소로 하면서 합리적인 비용으로 신속한 치유를 촉진해야 한다.
상처 드레싱의 지혈 특성은 재료의 질감과 다공성에 의해 결정된다. 다공성과 관련하여, 드레싱의 공극들은 일반적으로 너무 작아서 평상적인 검사를 통해서는 사람의 눈으로 보이지 않는다. 그러나, 충분한 크기는 피부 수분과 상처 증기의 충분한 증산작용(transpiration)을 허용할 뿐만 아니라 혈액이 응고되면 드레싱이 조직에 단단히 고정되도록 혈액의 흡수를 허용한다.
상처 드레싱은 상처 주변의 촉촉한 환경, 세포 및 조직의 재생을 돕는 효과적인 산소 순환 및 낮은 박테리아 부하를 유지할 수 있어야 한다. 수술 중에 사용되며 신체에 남아있는 상처 드레싱은 생분해성이어야 하며 완전히 재흡수가능해야한다.
통상적인 조직-접착 상처 드레싱은 피브린 실란트(fibrin sealants), 시아노 아크릴레이트계 실란트 및 다른 합성 실란트 및 중합가능한 모노머들을 포함한다. 이러한 조직-접착제는 독성 분해 산물의 방출, 고비용, 냉장 보관의 필요성, 느린 경화, 제한된 기계적 강도 및 감염 위험을 포함하는 여러 가지 단점 때문에 특정 용도에만 적합하다. 따라서 하이드로겔 조직 접착제는 반응성 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 전구체를 기반으로 개발되었다. 그러나, 이러한 하이드로겔 조직 접착제는 팽창되거나 너무 빨리 용해되거나, 또는 충분한 응집력이 부족하여 외과용 접착제로서의 효과가 감소한다. 또한, 이러한 PEG-베이즈드 물질의 특성은 쉽게 조절될 수 없다.
지혈 분말은 널리 사용되는 지혈 제품의 또 다른 예이다. 스팁틱 분말(styptic powders)로도 알려진, 상업적으로 이용 가능한 지혈 분말의 예는 흡착성 지혈 젤라틴 분말(Spongostan® powder) 및 QuikClot®이라고도 알려진 제올라이트의 칼슘-로딩된 형태가 있다. 이러한 지혈 분말은 심한 출혈을 막는데 사용할 수 있다.
미국 특허 제 5,614,587호에는 조직의 부착에 유용한 콜라겐-베이즈드 조성물, 또는 합성 이식 물질에 대한 조직의 부착이 기재되어 있다. 상기 조성물은 원 섬유(fibrillar) 콜라겐, 섬유 분해제 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 다작용성으로 활성화된 합성 친수성 폴리머를 포함하며, 여기서 콜라겐 및 합성 폴리머는 공유 결합하여 콜라겐-합성 폴리머 접합체를 형성한다.
WO 2004/028404에는 건조 상태로 제공되는 합성 콜라겐 또는 합성 젤라틴 및 친전자성 가교제로 구성된 조직 실란트가 기재되어 있다. 이 국제공보에서, 가교제는 친전자성으로 활성화된(EA) 폴리 (에틸렌 글리콜)(PEG), 또는 PEG-숙신이미딜 에스테르, 특히 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트, PEG-숙신이미딜 부타노에이트, 또는 PEG-숙신이미딜 글루타레이트와 같은 EA PEG 유도체를 포함한다. 적절한 pH에서 이 조성물의 습윤시, 상기 2 성분들 사이의 반응이 일어나고 밀봉 특성을 갖는 겔이 형성된다.
US 2011/0251574에는 생체 재료의 매트릭스와 반응성기를 포함하는 친수성 중합 성분을 포함하는 지혈 다공성 복합 스펀지가 기재되어 있으며, 여기서 상기 중합 성분은 상기 생체 재료의 매트릭스의 표면 상에 코팅되거나, 또는 상기 매트릭스는 상기 중합 재료로 함침되거나, 그렇지 않으면 상기 중합 성분은 상기 생체 재료의 매트릭스의 표면 상에 코팅되고 상기 매트릭스는 상기 중합 재료로 함침된다. 바람직한 구현으로, 폴리머는 폴리알킬렌 옥사이드 폴리머, 특히 다중 친전자 성 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 매트릭스 물질은 콜라겐, 젤라틴, 피브린, 폴리사카라이드(키토산과 같은), 합성 생분해성 생체 재료(폴리락트산 또는 폴리글리콜산과 같은) 및 이의 유도체로부터 선택될 수 있다.
US 2010/069579에는 말단 활성화된 폴리옥사졸린(POZ) 화합물이 개시되어 있으며, 상기 POZ 화합물은 이의 말단에 하나의 활성 작용기를 갖는 POZ 폴리머를 포함하며, 상기 작용기는 표적 분자 상의 기와 반응하여 표적 분자-POZ 접합체를 생성할 수 있으며, 여리거 표적 분자와 POZ 화합물 사이의 모든 결합은 가수분해적으로 안정한 결합이다.
WO 2012/057628에는 천연 조직에 존재하는 친핵체-함유 화학적 엔티티와 반응할 수 있는 친전자성 기의 존재로 인한 조직-접착 특성을 갖는 가교 결합된 폴리옥사졸린 폴리머가 기재되어 있다.
본 발명의 목적은 개선된 특성을 갖는 조직-접착 지혈 제품을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 개선된 특성을 갖는 조직-접착 지혈 제품이 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있음을 발견하였다:
ㆍ 다공성 고체 기재를 제공하는 단계;
ㆍ 상기 기재를 친전자성으로 활성적인 폴리옥사졸린(EL-POX) 및 용매를 포함하는 코팅액으로 코팅하여 코팅된 기재를 생성하는 단계로서, 상기 EL-POX는 적어도 2개의 반응성 친전자성 기를 함유하는 코팅된 기재를 생성하는 단계;
ㆍ 코팅된 기재로부터 용매를 제거하는 단계.
본 발명자들은 놀랍게도 EL-POX가 기재의 다공성 구조에 악영향을 미치지 않으면서 본 발명의 방법에 의해 다공성 고체 기재 상에 적용될 수 있음을 발견하였다. 본 발명의 방법은 다공성 기질의 혈액과 같은 체액을 흡수하는 능력이 본질적으로 영향을 받지 않고 유지되도록 기재의 공극 구조가 대체로 본래 상태를 유지하는 EL-POX 코팅의 적용을 가능하게 한다. 본 발명의 방법에 의해 얻어지는 EL-POX 코팅된 지혈 제품은 예를 들어, 공유 결합의 형성하에 조직 내에 자연적으로 존재하는 아민기와 반응할 수 있는 친전자성 반응기의 존재로 인해 우수한 접착 특성을 갖는다.
본 발명은 또한 코팅된 메쉬, 코팅된 발포체 및 코팅된 분말로부터 선택된 조직-접착 지혈 제품을 제공하며, 상기 지혈 제품은
ㆍ 적어도 5부피%의 다공성을 가지며, 반응성 친전자성 기를 함유하는 친전자성 폴리머를 포함하는 외부 표면을 포함하는 다공성 고체 기질;
ㆍ 고체 기질의 적어도 일부를 피복하는 접착제 코팅으로서, 상기 코팅은 친전자성으로 활성화된 폴리옥사졸린(EL-POX)를 포함하며, 상기 EL-POX는 평균 적어도 1개의 반응성 친전자성 기를 함유하는, 접착제 코팅
을 포함한다.
지혈 제품의 코팅에 함유된 EL-POX 폴리머는 EL-POX 폴리머가 각각 하나 이상의 이러한 반응성 기를 운반할 수 있는 다수의 펜던트기를 함유할 수 있기 때문에 다수의 친전자성 반응기를 운반할 수 있다는 이점을 제공한다. 따라서, 지혈 제품의 접착 특성은 친전자성 기의 최적 밀도를 갖는 EL-POX를 선택함으로써 특정 적용에 대해 최적화될 수 있다. 또한, 친수성/소수성 균형 및 보다 낮은 임계 용액 온도와 같은 EL-POX의 다른 특성은 농도 및/또는 펜던트기의 특성을 변경함으로써 적절하게 최적화될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 견지는 조직-접착 지혈 제품을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은
ㆍ 다공성 고체 기재를 제공하는 단계;
ㆍ 상기 기재를 친전자성으로 활성적인 폴리옥사졸린(EL-POX) 및 용매를 포함하는 코팅액으로 코팅하여 코팅된 기재를 생성하는 단계로서, 상기 EL-POX는 적어도 2개의 반응성 친전자성 기를 함유하는 코팅된 기재를 생성하는 단계;
ㆍ 코팅된 기재로부터 용매를 제거하는 단계.
를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어 "조직-접착(tissue-adhesive)"은 상기 제품과 조직 사이의 공유 결합의 형성으로 인해 조직에 달라붙을 수 있는 지혈 제품의 능력을 의미한다. 본 발명의 조직 접착 지혈 제품의 경우, 조직에 대한 접착은 물의 존재를 필요로 할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "다공성(porous)"은 달리 표기되지 않는 한, 지혈 제품이 제품 내로의 액체의 유입을 허용하는 공극 및/또는 틈을 포함하는 것을 의미한다.
용어 "다공성(porosity)"은 기질 또는 지혈 제품 중 보이드(즉, "빈(empty)") 공간의 정도를 의미하며, 전체 체적에 대한 보이드의 백분율이다. 본 발명의 지혈 제품의 다공성은 가스 흡착 분석과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 적절히 검출될 수 있다. 가스 흡착 분석은 다양한 조건에서 기체 또는 증기에 고체 다공성 물질을 노출시키고, 중량 흡수 또는 샘플 체적 변화를 평가하는 것을 포함한다. 이러한 데이터의 분석은 골격 밀도, 다공성 및 전체 공극 체적을 포함하는 고체의 물리적 특성에 관한 정보를 제공한다. 골격 밀도는 전형적으로 헬륨 열분해 실험에 의해 평가되며 폐쇄된 다공성이 없는 경우에 물질의 진정한 고체 밀도를 나타낸다. 기질이 하나 이상의 아이템을 포함하여 구성되는 경우, 다공성은 개별 아이템의 평균 다공성을 가리키는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 기질이 다공성 분말인 경우, 다공성은 공극이 차지하는 다공성 입자의 부피의 백분율과 동일하다.
본 명세서에 사용된 용어 "평균 공극 크기(mean pore size)"는 주사형 전자 현미경(SEM)에 의해 측정된 평균 공극 직경을 가리킨다. 적절한 방법은 문헌, Faraj et al., Tissue Engineering, 2007, 13, 10, 2387-2394에 기재되어있다.
본 명세서에 사용된 용어 "수분 흡수능(water absorption capacity)"은 다공성 고체 기재가 물을 흡수하는 능력의 정도이다. 건조 다공성 기재의 샘플의 중량을 측정한 후(중량=Wd) 다공성 기재를 증류수(37℃)에 45분 동안 침지시켜 다공성 고체 기재의 수분 흡수능을 측정한다. 다음으로, 샘플을 물에서 꺼내어 기재 바깥쪽에 달라붙은 물을 제거한 다음, 샘플의 중량을 다시 측정한다(중량=Ww). 수분 흡수능 = 100% × (Ww-Wd)/Wd. 수분 흡수능은 기재의 다공성뿐만 아니라 물의 존재 하에서 팽창하는 능력을 나타낸다.
본 명세서에 사용된 용어 "폴리옥사졸린(polyoxazoline)"은 폴리(N-아실알킬 렌이민) 또는 폴리(아로일알킬렌이민)을 가리키며, 또한 POX로서 지칭된다. POX의 예는 폴리(2-에틸-2-옥사졸린)이다. 용어 "폴리옥사졸린"은 또한 POX 코폴리머를 포함한다.
용어 "친전자성 기(electrophilic group)"는 친핵성 기로부터 친핵성 공격을 받기 쉽고, 공유 결합의 형성하에 이러한 친핵성 기와 반응할 수 있는 작용기를 가리킨다. 친전자성 기들은 전형적으로 양전하로 하전되며 그리고/또는 전자/결핍성이다.
용어 "친핵성 기(nucleophilic group)"는 친전자성 기로부터 친전자성 공격을 받기 쉽고 공유 결합의 형성하에 친전자성 기와 반응할 수 있는 작용기를 가리킨다. 친핵성 기는 전형적으로 전자가 풍부하며, 반응성 부위로서 작용하는 비공유 전자쌍을 갖는다.
용어 "활성화된(activated)"이란 용어는, 달리 명시하지 않는 한, 새로운 반응성 작용기가 공유 결합을 형성하기 위해 다른 작용기와 반응할 수 있는 새로운 반응성 작용기를 생성하거나 또는 도입하기 위한 폴리머의 변형을 의미한다.
본 명세서에 사용된 용어 "가교 결합된(cross-linked)"은 공유 결합에 의해 분자간에 바인딩되는 폴리머와 같은 성분을 가리킨다. 2개의 가교 결합성 성분 사이의 공유 결합은 직접적이거나 연결기를 통해 간접적일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "버퍼링 시스템(buffering system)"은 용액을 특정 버퍼링 pH로 유도하기 위해 수성 시스템에 사용될 수 있는 물질 또는 물질들의 조합을 가리키며, 버퍼링 시스템은 버퍼링 pH의 변화를 방지하는 용량을 갖는다.
본 명세서에 사용된 액체의 "버퍼링 pH(buffering pH)"는 액체가 증류수로 10 배 희석된 후 측정된 20℃에서의 pH 값을 가리킨다.
본 명세서에 사용된 "버퍼 용량(buffer capacity)"은 pH의 변화에 저항하는 액체의 용량을 의미한다. 액체(코팅액 또는 버퍼액)의 버퍼 용량 β는 증류수로 10배 희석한 후 20℃에서 측정하고, mmol.l-1.pH-1로 표시한다. 버퍼 용량은 다음과 같이 정의된다:
Figure pct00001
여기서 dn은 첨가된 염기의 극소량이며 d(p[H+])는 수소 이온 농도의 대수 (cologarithm)에서 결과로 나타나는 극소의 변화이다.
본 발명에 따라 사용되는 EL-POX는 바람직하게는 이의 반복 단위가 하기 화학식 (I)으로 표시되는 폴리옥사졸린으로부터 유도된다:
(CHR1)mNCOR2
R2, 및 각각의 R1은 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-22 알킬, 임의로 치환된 시클로알킬, 임의로 치환된 아랄킬, 임의로 치환된 아릴로부터 선택되며; 그리고 m은 2 또는 3이다.
바람직한 구현에 따르면, 폴리옥사졸린은 폴리머이며, 더욱 바람직하게는 2-알킬-2-옥사졸린의 호모폴리머이며, 상기 2-알킬-2-옥사졸린은 2-메틸-2-옥사졸린, 2-에틸-2-옥사졸린, 2-프로필-2-옥사졸린, 2-부틸-2-옥사졸린 및 이의 조합으로부터 선택된다. 바람직하게, 폴리옥사졸린은 2-프로필-2-옥사졸린의 호모폴리머이며,보다 바람직하게는 2-에틸-옥사졸린의 호모폴리머이다.
EL-POX는 이의 측쇄 내에 친전자성 기(펜던드 친전자성 기라고도 함)를, 이의 말단, 또는 양쪽 모두에 친전자성기를 운반할 수 있다. 터미널, 말단 캡핑된 EL-POX의 예는 CH3O-POX-O2C-CH2-C(CH2CO2-NHS)3와 같은 숙신이미딜 숙시네이트 에스테르이다. 측쇄 활성화된 EL-POX의 예는 알킬 측쇄에 NHS기를 함유하는 POX이다. EL-POX의 또 다른 예는 NHS-에스테르로 말단 작용화된 별 모양의 POX-폴리머이다.
EL-POX에 존재하는 친전자성 기는 바람직하게 카르복실산 에스테르, 설포네이트 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, p-니트로티오페닐에스테르, 산 할라이드기, 무수물, 케톤, 알데히드, 이소시아네이토, 티오이소시아네이토(이소티오시아네이토), 이소시아노, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 올레핀, 글리시딜 에테르, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 숙신이미딜 카보네이트, 숙신이미딜카바메이트, 설포숙신이미딜 에스테르, 설포숙신이미딜 카보네이트, 말레이미도(말레이미딜), 에텐설포닐, 이미도 에스테르, 아세토 아세테이트, 할로 아세탈, 오르토피리딜 디설피드, 디히드록시-페닐 유도체, 비닐, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 요오드아세트아미드 및 이의 조합으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, EL-POX에 존재하는 친전자성 기는 카르복실산 에스테르, 산 염화물기, 무수물, 케톤, 알데히드, 이소시아네이토, 티오이소시아네이토, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 올레핀, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 숙신이미딜 카보네이트, 설포숙신이미딜 에스테르, 설포숙신이미딜 카보네이트, 말레이미도, 에텐설포닐 및 이의 조합으로부터 선택된다. 보다 더 바람직하게, EL-POX에 존재하는 친전자성 기는 알데히드, 이소시아네이토, 티오이소시아네이토, 숙신이미딜 에스테르, 설포숙신이미딜 에스테르, 말레이미도 및 이의 조합으로부터 선택된다. 가장 바람직하게, EL-POX에 존재하는 친전자성 기는 이소시아네이토, 티오이소시아네이토, 숙신이미딜 에스테르, 설포숙신이미딜 에스테르, 말레이미도 및 이의 조합으로부터 선택된다.
친전자성 기로서 사용될 수 있는 설포네이트 에스테르의 예는 메실레이트, 토실레이트, 노실레이트, 트리플레이트 및 이의 조합을 포함한다. 사용될 수 있는 올레핀의 예는 아크릴레이트, 메타크릴레이트, 에틸아크릴레이트 및 이의 조합을 포함한다. 활성화된 히드록실기의 예는 p-니트로페닐 클로로카보네이트, 카보닐디이미다졸(예, 1,1-카보닐디이미다졸) 및 설포닐 클로라이드로부터 선택된 활성화 제로 활성화된 히드록실기를 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 EL-POX는 바람직하게 적어도 10개의 반응성 친전자성 기를 함유한다. 더욱 바람직하게, EL-POX는 적어도 25개, 보다 바람직하게 적어도 35개, 그리고 가장 바람직하게 적어도 50개의 반응성 친전자성 기를 함유한다.
본 발명의 EL-POX는 유리하게 하나 이상의 펜던트 친전자성 기를 함유한다. 전형적으로, EL-POX는 100 모노머 당 3 내지 50 펜던트 친전자성 기, 보다 바람직하게 100 모노머 당 4 내지 35 펜던트 친전자성 기, 보다 바람직하게는 100 모노머 당 5 내지 25 펜던트 친전자성 기를 함유한다.
본 발명에 따라 사용되는 EL-POX는 전형적으로 1,000 내지 100,000 g/mol, 보다 바람직하게 5,000 내지 50,000 g/mol, 가장 바람직하게 10,000 내지 30,000 g/mol 범위의 평균 분자량을 갖는다.
본 발명의 일 구현으로, 다공성 고체 기재는 덱스트란, 알기네이트, 산화 셀룰로오스, 산화 재생 셀룰로오스(ORC), 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히알루론산; 및 이의 조합으로부터 선택된 폴리사카라이드를 적어도 50중량%, 가장 바람직하게 적어도 80중량%를 함유한다. 특히 바람직한 구현으로, 다공성 고체 기재는 적어도 50중량%, 가장 바람직하게 적어도 80중량%의 ORC를 함유한다.
셀룰로오스는 β-글루코시드 결합을 통해 중합된 글루코피라노오스의 호모폴리사카라이드이다. 산화되기 전에 셀룰로오스는 조직화되지 않은 섬유로 재생되지 않은 채 남아 있거나, 또는 재생되어 조직화된 섬유를 형성할 수 있다. 셀룰로오스 섬유가 디니트로겐 테트록시드로 처리될 경우에, 히드록실기는 카르복실산기로 산화되어 폴리우론산을 생성한다. 폴리우론산은 산화된 셀룰로오스의 주요 성분이지만, 비산화된 히드록실기는 섬유성 성분으로 유지된다.
본 발명의 다른 구현으로, 다공성 고체 기재는 반응성 친핵성 기를 함유하는 친핵성 폴리머를 포함하는 외부 표면을 포함한다. 바람직하게는, 다공성 고체 기재는 적어도 5중량%, 보다 바람직하게 적어도 10중량% 그리고 보다 바람직하게 적어도 50중량%의 친핵성 폴리머를 함유한다. 가장 바람직하게, 상기 기질은 상기 친핵성 폴리머로 구성된다.
친핵성 폴리머는 전형적으로 적어도 2개의 친핵성 기, 보다 바람직하게 적어도 10개의 친핵성 기, 가장 바람직하게 적어도 20개의 친핵성 기를 함유한다.
친핵성 폴리머의 친핵성 기는 바람직하게 아민기, 티올기, 포스핀기 및 이의 조합으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 이들 친핵성 기는 아민기이다. 이들 아민기는 바람직하게 1차 아민기, 2차 아민기 및 이의 조합으로부터 선택된다.
다공성 고체 기재의 외부 표면의 친핵성 폴리머는 바람직하게 적어도 1중량%, 보다 바람직하게 5 내지 10중량%, 그리고 가장 바람직하게 15 내지 25중량%의 질소 함량을 갖는 질소 농후 폴리머이다.
친핵성 폴리머는 바람직하게는 아민, 티올, 포스핀 및 이의 조합으로부터 선택된 반응성 친핵성 기를 함유하는 단백질, 키토산 및 합성 또는 탄수화물 폴리머로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 친핵성 폴리머는 콜라겐, 키토산 및 이의 조합으로부터 선택된다.
본 명세서에 사용된 용어 콜라겐은 가공된 유도체를 포함하는 모든 형태의 콜라겐을 가리킨다. 바람직한 콜라겐은 텔로펩타이드 영역("아텔로펩타이드 콜라겐(atelopeptide collagen)")을 함유하지 않고 용해성이며, 원섬유 또는 비-섬유 형태일 수 있다. 콜라겐은 마이크로피브릴 콜라겐, 타입 I 콜라겐, 타입 III 콜라겐 또는 타입 I 콜라겐과 타입 III 콜라겐의 조합과 같은 합성 인간 콜라겐의 그룹으로부터 선택될 수 있다. 열, 방사선 또는 글루타르알데히드와 같은 화학적 제제를 사용하여 가교 결합된 콜라겐은 특히 경질 가교 결합된 조성물을 형성하는데 사용될 수 있다. 건조하고 다공성인 동결 건조된 콜라겐 스펀지가 특히 바람직하다.
키토산은 천연 발생 물질인 키틴(폴리-[134]-N-아세틸-D-글루코사민)의 생분해성, 무독성 복합 탄수화물 유도체이다. 키토산은 키틴의 탈아세틸화된 형태이다. 일반적으로 탈아세틸화의 정도가 70% 이상일 때 일반적인 용어인 키토산이 적용되고, 탈아세틸화의 정도가 현저하지 않거나 20% 미만인 경우에 일반적인 용어인 키틴이 사용된다. 탈아세틸화가 100% 미만인 키토산 폴리사카라이드는 N-아세틸-D-글루코사민 및 D-글루코사민 모노머 단위를 모두 함유하는 선형 블록 코폴리머이다.
일 바람직한 구현에 따르면, 다공성 고체 기재의 표면에 존재하는 친핵성 폴리머의 친핵성 기는 아민기이고, EL-POX에 포함된 친전자성 기는 카르복실산 에스테르, 설포네이트 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, p-니트로티오페닐 에스테르, 산 할라이드기, 무수물, 케톤, 알데히드, 이소시아네이토, 티오이소시아네이토, 이소시아노, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 글리시딜 에테르, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 숙신이미딜 카보네이트, 숙신이미딜 카바메이트, 설포숙신이미딜 에스테르, 설포숙신이미딜 카보네이트, 이미도 에스테르, 디히드록시-페닐 유도체, 및 이의 조합으로부터 선택된다.
사용될 수 있는 숙신이미딜 유도체의 예는 숙신이미딜 글루타레이트, 숙신이미딜 프로피오네이트, 숙신이미딜 숙신아미드, 숙신이미딜 카보네이트, 디숙신이미딜 서버레이트, 비스(설포숙신이미딜) 서버레이트, 디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트), 비스(2-숙신이미도옥시카보닐옥시) 에틸 설폰 및 3,3'-디티오비스(설포숙신이미딜-프로피오네이트)를 포함한다. 사용될 수 있는 설포숙신이미딜 유도체의 예는 설포숙신이미딜(4-요오도아세틸)아미노벤조에이트, 비스(설포숙신이미딜) 서버레이트, 설포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-1-카르복실레이트, 디티오비스-설포숙신이미딜 프로피오네이트, 디설포-숙신이미딜 타르타레이트; 비스[2-(설포-숙신이미딜옥시카보닐옥시설폰)], 에틸렌 글리콜 비스(설포숙신이미클릴숙시네이트), 디티오비스-(숙신이미딜 프로피오네이트)를 포함한다. 디히드록시페닐 유도체의 예는 디히드록시페닐알라닌, 3,4-디히드록시페닐알라닌(DOPA), 도파민, 3,4-디히드록시히드로신남산(DOHA), 노르에피네프린, 에피네프린 및 카테콜을 포함한다.
다른 바람직한 구현에 따르면, 다공성 고체 기재의 외부 표면에서 친핵성 폴리머의 친핵성 기는 티올기이고, EL-POX에 함유된 친전자성 기는 할로 아세탈, 오르토피리딜 디설피드, 말레이미드, 비닐 설폰, 디히드록시페닐 유도체, 비닐, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 요오도아세트아미드, 숙신이미딜 에스테르, 숙신이미딜 카보네이트, 숙신이미딜 카바메이트, 술포숙신이미딜 에스테르, 술포숙신이미딜 카보네이트 및 이의 조합으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 친전자성 기는 숙신이미딜 에스테르, 할로 아세탈, 말레이미드 또는 디히드록시페닐 유도체 및 이의 조합으로부터 선택된다. 가장 바람직하게, 친전자성 기는 말레이미드 또는 디히드록시페닐 유도체 및 이의 조합으로부터 선택된다.
본 발명의 방법에 사용되는 다공성 고체 기재는 바람직하게는 적어도 5부피%의 다공성을 갖는다. 기재가 발포체 또는 메쉬인 경우, 기재는 바람직하게 적어도 50부피%, 보다 바람직하게 적어도 70부피%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 85부피%의 다공성을 갖는다. 기재가 다공성 분말인 경우, 다공성은 바람직하게 적어도 20부피%, 더욱 바람직하게 적어도 50부피%, 그리고 가장 바람직하게 적어도 75부피%이다.
본 발명의 방법에 사용되는 다공성 고체 기재는 바람직하게 적어도 2㎛의 평균 공극 크기를 갖는다. 기재가 발포체 또는 메시인 경우, 기재는 바람직하게 평균 공극 크기 5 내지 500㎛, 바람직하게는 10 내지 200㎛를 갖는다. 기재가 다공성 분말인 경우, 평균 공극 크기는 바람직하게 4 내지 50㎛, 보다 바람직하게 6 내지 25㎛이다.
다공성 고체 기재는 전형적으로 적어도 25%, 보다 바람직하게 적어도 100%, 보다 바람직하게 적어도 250% 그리고 가장 바람직하게 적어도 1000%의 수분 흡수능을 갖는다.
본 발명의 방법에 사용되는 다공성 고체 기재는 바람직하게는 메쉬 또는 발포체 형태의 대상물이며, 상기 대상물은 예를 들어, 시트와 같은 상처 드레싱(wound dressing)으로서 코팅된 기재의 적용을 용이하게 하는 형상을 갖는다. 전형적으로, 기재는 10mm 내지 200mm의 길이, 5mm 내지 200mm의 폭 및 0.5mm 내지 10mm의 두께를 갖는다.
본 발명의 일 구현으로, 다공성 고체 기재는 메쉬이다. 메쉬의 예는 직포 또는 부직포로 만들어진 시트 또는 거즈이다. 메쉬에 함유된 섬유는 바람직하게는 젤라틴, 콜라겐, ORC 또는 이의 조합과 같은 생체 적합성 및 생분해성 폴리머로 제조된다.
본 발명의 다른 구현으로, 다공성 고체 기재는 때때로 스펀지라고도 지칭되는 고체 발포체이다. 고체 발포체는 바람직하게 가교 결합된 젤라틴(겔폼(gelfoam))으로 제조된다.
본 발명의 다른 구현으로, 다공성 고체 기재는 분말이다. 다공성 분말은 바람직하게 젤라틴 또는 폴리사카라이드로 제조된다. 적합한 폴리사카라이드는 전분, 변형된 전분, 알기네이트, 키토산, 덱스트란 및 이의 조합이다. 가장 바람직하게, 사용된 폴리사카라이드는 변형된 전분이다.
바람직하게 다공성 분말은 자유 유동성 멸균 분말의 형태이다. 유리하게, 분말은 미세 다공성 분말이다.
다공성 분말은 전형적으로 10-200㎛, 보다 바람직하게는 25-100㎛, 가장 바람직하게는 50-75㎛ 범위의 질량 가중 평균 입자 크기(mass weighted average particle size)를 갖는다.
본 발명의 방법에서 사용되는 코팅액은 바람직하게 적어도 50중량%, 보다 바람직하게 적어도 60중량%, 가장 바람직하게 적어도 80중량%의 용매를 함유한다. 용매는 바람직하게 2-프로판올, 에틸 알코올, 메탄올, 디클로로메탄, 아세톤, 아니솔, 1-부탄올, 2-부탄올, 부틸 아세테이트, tert-부틸메틸 에테르, 큐멘, 디메틸 술폭시드, 에틸 아세테이트, 에틸 에테르, 에틸 포메이트, 헵탄, 이소부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 메틸 아세테이트, 3-메틸-1-부탄올, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 2-메틸-1-프로판올, 펜탄, 1-판탄올, 1-프로판올, 프로필 아세테이트 및 이의 조합으로부터 선택된다. 보다 바람직하게 용매는 2-프로판올, 에틸 알코올, 메탄올, 아세톤 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
코팅액은 약간의 물을 적절하게 함유할 수 있다. 전형적으로, 코팅액은 물 5중량% 미만, 더욱 바람직하게는 물 1중량% 미만을 함유한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 코팅액은 바람직하게 적어도 1중량%의 EL-POX를 함유한다. 보다 바람직하게 코팅액의 EL-POX 함량은 적어도 5중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 10중량%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 20중량%이다.
본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 기재 상에 코팅액을 스프레이함으로써 다공성 고체 기재가 코팅된다. 특히 바람직한 구현에 따르면, 코팅액은 초음파 노즐을 통해 기재 상에 스프레이된다. 본 발명자들은 초음파 노즐을 사용함으로써 상당한 양의 EL-POX를 함유하는 코팅액으로 기재를 균일하게 코팅할 수 있음을 발견하였다.
용매는 증발에 의해 코팅된 기재로부터 적절하게 제거될 수 있다. 증발은 바람직하게 예를 들어, 1mbar 미만의 압력에서와 같이 감압하에 수행된다.
대안적으로, 용매는 코팅된 기재를 액화 가스 또는 초임계 유체와 접촉시킴으로써 코팅된 기재로부터 제거될 수 있다. 바람직하게, 액화 가스 또는 초임계 유체는 적어도 30bar의 압력을 갖는다.
본 발명의 유리한 구현에 따르면, 다공성 고체 기재는 본 명세서에서 앞서 기재한 바와 같은 친핵성 폴리머를 포함하는 외부 표면을 포함하며, 그리고 코팅액으로 기재를 코팅한 후 및 용매를 제거하기 전 및/또는 제거하는 동안, 공유 결합 형성하에 EL-POX의 반응성 친전자성 기는 친핵성 폴리머의 반응성 친핵성 기와 반응한다. 바람직하게 상기 반응은 50℃ 미만의 온도, 보다 바람직하게는 15 내지 25℃ 범위의 온도(주위 조건)에서 발생한다. 본 발명의 방법의 이러한 구현은 반응성 친전자성 기와 반응성 친핵성기 사이의 반응이 버퍼링 시스템의 부재하에 발생할 수 있다는 이점을 제공한다.
본 발명의 방법에서, EL-POX 내의 반응성 친전자성 기는 다공성 고체 기질에 존재하는 반응성 친핵성 기와 반응할 수 있으며 그리고/또는 상기 방법에 사용되는 다른 성분들(예, 친핵성 가교제)에 존재하는 친핵성 기와 반응할 수 있다. 바람직하게는, 코팅된 기재로부터 용매를 제거한 후에, EL-POX는 여전히 평균적으로 적어도 하나, 보다 바람직하게는 적어도 5개, 가장 바람직하게는 적어도 40개의 반응성 친전자성 기를 함유한다. 이들 반응성 친전자성 기는 예를 들어, 조직에 자연적으로 존재하는 아민기와 공유 결합을 형성할 수 있어 코팅된 기재에 접착 특성을 제공한다.
본 발명의 방법에 사용되는 코팅액은 용해된 및/또는 분산된 형태로 EL-POX를 함유할 수 있다.
본 발명의 일 구현에 따르면, 코팅액은 완전히 용해된 형태로 EL-POX를 함유하고, 코팅액은 분산된 버퍼링 시스템을 추가로 함유한다. 바람직하게는, 코팅액은 7 내지 11 범위, 보다 바람직하게는 8 내지 10 범위로 버퍼링 pH를 갖는다. 코팅액의 버퍼 용량은 바람직하게 적어도 10mmol.l-1.pH-1이다. 보다 바람직하게, 버퍼 용량은 적어도 25mmol.l-1.pH-1이며, 가장 바람직하게 버퍼 용량은 적어도 50mmol.l-1.pH-1이다.
본 발명의 또 다른 구현으로, 코팅액은 완전히 용해된 형태의 EL-POX를 함유하고, 상기 방법은 기재가 EL-POX 함유 코팅액으로 코팅되기 전에 다공성 고체 기재를 버퍼액으로 피복하는 단계를 포함하며, 상기 버퍼액은 버퍼링 시스템을 포함한다. 바람직하게, 버퍼액은 7 내지 11 범위, 보다 바람직하게는 8 내지 10 범위의 버퍼링 pH를 갖는다. 버퍼액의 버퍼 용량은 바람직하게는 적어도 10mmol.l-1.pH-1이다. 보다 바람직하게, 버퍼 용량은 적어도 25mmol.l-1.pH-1이고, 가장 바람직하게 버퍼 용량은 적어도 50mmol.l-1.pH-1이다. 버퍼액이 수성인 경우, 기재는 바람직하게 코팅액으로 코팅하기 전에 버퍼액으로 피복한 후에 건조되는 것이 바람직하다. 따라서, EL-POX와 기재 사이의 원하지 않는 가교 결합 및 EL-POX의 분해가 최소화될 수 있다. 이 구현은 EL-POX가 다공성 고체 기재의 공극을 관통하여 이러한 공극 내부에 코팅을 형성할 수 있다는 이점을 제공한다. 이 구현 예에 따라 사용되는 버퍼액은 적절히 친핵성 가교 결합제를 함유할 수 있으며, 상기 친핵성 가교 결합제는 적어도 2개의 친핵성 기를 함유한다.
또 다른 구현으로, 코팅액에 존재하는 EL-POX의 적어도 80중량%는 코팅액이 다공성 고체 기재 상에 코팅될 경우에 용해되지 않는다. 유리하게는, 용해되지 않은 EL-POX 외에 코팅액은 용해되거나 용해되지 않은 버퍼링 시스템을 함유한다. 코팅액은 바람직하게 7 내지 11의 범위, 보다 바람직하게는 8 내지 10의 범위의 버퍼링 pH를 갖는다. 코팅액의 버퍼 용량은 바람직하게 적어도 10mmol.l-1.pH-1이다. 더욱 바람직하게, 버퍼 용량은 적어도 25mmol.l-1.pH-1이고, 보다 바람직하게, 버퍼 용량은 적어도 50mmol.l-1.pH-1이다. 바람직하게, 용해되지 않은 EL-POX를 함유한 코팅액으로 기재를 코팅한 후, 기재는 EL-POX가 용해가능한 액체 용매 조성물로 피복된다. 이 구현은 EL-POX가 공극에 들어가지 않고 EL-POX 코팅층이 다공성 기재의 표면 상에 집중된다는 이점을 제공한다. 특히 바람직한 구현에 따르면, 액체 용매 조성물은 친핵성 가교 결합제를 함유한다.
적합하게 사용될 수 있는 친핵성 가교 결합제의 예는 친핵성으로 활성화된 PEG, 친핵성으로 활성화된 POX, 트리리신(trilysine) 및 이의 조합을 포함한다.
친핵성 가교 결합제는 바람직하게 적어도 3개의 친핵성 기를 함유한다. 친 핵성 가교 결합제의 친핵성 기는 바람직하게 아민기, 티올기, 포스핀기 및 이의 조합으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 이들 친핵성 기는 아민기이다. 바람직한 구현에 따르면, 친핵성 가교 결합제에 존재하는 친핵성 기는 1급 아민기이다.
본 발명의 일 구현으로, 친핵성 가교 결합제는 1,000 g/mol 미만, 보다 바람직하게 700 g/mol 미만 및 가장 바람직하게는 400 g/mol 미만의 분자량을 갖는 저분자량 폴리아민이다. 보다 바람직하게, 친핵성 가교 결합제는 디리신(dilysine); 트리리신; 테트라리신; 펜타리신; 디시스테인; 트리시스테인; 테트라시스테인; 펜타시스테인; 리신, 오미틴(omithine), 시스테인, 아르기닌 및 이의 조합으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기 및 다른 아미노산 잔기를 포함하는 올리고펩타이드; 스퍼민(spermine); 트리스(아미노메틸)아민; 아르기닌 및 이의 조합의 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현에 따르면, 친핵성 가교 결합제는 적어도 2개의 아민기를 포함하는 친핵성 활성화 POX(NU-POX); 키토산; 키토산 유도체(예, WO 2009/028965에 기재된 디카르복시-유도체화 키토산 폴리머), 폴리에틸렌 이민; 폴리비닐아민; 폴리알릴 아민; 아민-작용화된 폴리(메트)아크릴레이트; 예를 들어 4,6-이치환된 데옥시스트렙타민(카나마이신 A, 아미카신, 토브라마이신, 디베카신, 겐타마이신, 시소미신, 네틸미신), 4,5-이치환된 데옥시스트렙타민(네오마이신 B, C 및 네오마이신 E(파로모마이신)) 및 예를 들어 스트렙토마이신과 같은 비-데옥시스트렙타민 아미노글리코사이드과 같은 아미노글리코사이드와 같은 아민-작용부를 함유하는 폴리사카라이드; 스티레닉스(styenics); 리신, 오미틴, 시스테인, 아르기닌 및 이의 조합으로부터 선택된 2개 이상의 아미노산 잔기 및 다른 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드; 및 이의 조합의 그룹으로부터 선택된 고분자량 폴리아민이다. 천연 공급원 또는 재조합체의 알부민은 폴리펩티드로서 적합하게 사용될 수있는 폴리펩타이드의 예이다. 아민-작용화된 폴리에틸렌 글리콜은 친핵성 가교 결합제로서 적합하게 사용될 수 있는 고분자량 폴리아민의 또 다른 예이다.
또 다른 바람직한 구현에 따르면, 친핵성 가교 결합제에 존재하는 친핵성 기는 티올(설포히드릴)기이다.
본 발명의 일 구현으로, 가교 결합된 폴리머에 사용되는 친핵성 가교 결합제는 1,000 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 700 g/mol 미만, 그리고 가장 바람직하게 400 g/mol 미만의 분자량을 갖는 2개 이상의 티올기를 포함하는 저분자량 폴리티올이다. 보다 바람직하게, 친핵성 가교 결합제는 트리메르캅토프로판, 에탄디티올, 프로판디티올, 2-메르캅토에틸 에테르, 2,2'-(에틸렌디옥시)디에탄티올, 테트라(에틸렌 글리콜) 디티올, 펜타(에틸렌 글리콜) 디티올, 헥사에틸렌 글리콜 디티올; 티올 변성 펜타에리스리톨, 디펜타에리트리톨, 트리메틸올프로판 또는 디트리메틸올 프로판; 적어도 2개의 시스테인 단위를 함유하는 올리고펩타이드의 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 구현에 따르면, 가교 결합된 폴리머에 사용되는 친핵성 가교 결합제는 적어도 2개의 티올기를 포함하는 NU-POX; 티올-작용화된 폴리(메트)아크릴레이트; 티올-작용부를 함유하는 폴리사카라이드; 스티레닉스; 2개 이상의 티올기를 포함하는 폴리펩타이드의 그룹으로부터 선택된 고분자량 폴리티올이다.
상술한 친핵성 가교 결합제는 EL-POX를 반응성 친전자성 기를 함유하는 폴리머를 포함하는 외부 표면으로 다공성 고체 기재에 공유 결합시키기 위해 코팅액 및/또는 버퍼액에 적합하게 사용될 수 있다. 친전자성 기를 갖는 적절한 폴리머는 폴리(락틱-코-글리콜산), 콘드로이틴 설페이트-NHS, 콘드로이틴 설페이트 숙신이미딜 숙시네이트, 알기네이트-NHS, 히알루론산-NHS, 메타크릴레이트 모노머를 함유하는 N-히드록시 숙신이미드 카보네이트를 포함하는 코폴리머(Cengiz et al., 2010, J. Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, vol. 48, issue 21, 4737-4746에 기재된 바와 같음), 2 이상의 카르복실기를 갖는 생물학적 저분자량 화합물의 적어도 하나의 카르복실기를 N-히드록시숙신이미드, N-히드록시설포숙신이미드 또는 이의 유도체(EP1548004에 기재된 바와 같음)로 변형시켜 얻어진 생물학적 저분자량 유도체이다. 바람직하게, 친핵성 가교 결합제가 코팅액에 사용된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현으로, EL-POX 및 친핵성 가교 결합제는 별도의 유체에 존재하지만 동시에 다공성 고체 기재 상에 코팅된다. 이는 2개의 초음파 스프레이 노즐을 사용함으로써 적절하게 달성될 수 있다. 따라서, 이 유리한 구현에 따른 방법은 하기 단계를 포함한다:
ㆍ 고체 다공성 기재를 제공하는 단계,
ㆍ EL-POX를 제 1 용매에 포함하는 코팅액을 제공하는 단계;
ㆍ 버퍼링 시스템 및/또는 친핵성 가교 결합제뿐만 아니라 제 2 용매를 포함하는 제 2 액체를 제공하는 단계;
ㆍ 코팅액을 제 1 초음파 노즐을 통해 통과시켜 제 1 스프레이 스트림을 생성시키는 단계;
ㆍ 제 2 액체를 제 2 초음파 노즐을 통해 통과시켜 제 2 스프레이 스트림을 생성하는 단계;
ㆍ 고체 다공성 고체 기재의 표면의 적어도 일부를 제 1 스프레이 스트림 및 제 2 스프레이 스트림 모두에 동시에 노출시켜 고체 다공성 기재의 상기 부분을 EL-POX뿐만 아니라 친핵성 가교 결합제 및/또는 버퍼링 시스템을 포함하는 코팅 혼합물로 피복하는 단계;
ㆍ 코팅 혼합물로부터 제 1 및 제 2 용매를 제거하여 EL-POX 및 친핵성 가교 결합제를 함유하는 건조 층으로 적어도 부분적으로 코팅된 다공성 고체 기재를 얻는 단계.
이 방법에서 EL-POX는 PVP-아크릴산-NHS 또는 (폴리-(N-비닐피롤리돈)50-코- (아크릴산)25-코-(아크릴산 N-히드록시숙신이미드 에스테르)25)로 적절히 대체될 수 있다.
상술한 이중 스프레이 방법에서 친핵성 가교제가 사용되는 경우, EL-POX 및 친핵성 가교제는 서로 반응하여 용매의 제거 전, 도중 또는 후에 가교 결합된 폴리머를 형성할 수 있다. 바람직한 구현으로, 건조 층에 포함되는 가교 결합된 폴리머는 미반응된 친전자성 기를 포함한다. 적합한 용매는 상기 본 명세서에서 정의된 바와 같다. 바람직한 구현으로, 제 1 및 제 2 용매는 혼화성이고, 보다 바람직한 구현으로 제 1 및 제 2 용매는 동일하다.
제 2 액체가 버퍼링 시스템을 함유하는 경우에, 제 2 액체는 바람직하게 7 내지 11의 범위, 보다 바람직하게는 8 내지 10의 범위의 버퍼링 pH를 갖는다. 제 2 액체의 버퍼 용량은 바람직하게 적어도 10mmol.1-1.pH-1. 보다 바람직하게, 버퍼 용량은 적어도 25mmol.l-1.pH-1이고, 가장 바람직하게 버퍼 용량은 적어도 50mmol.l-1.pH-1이다.
본 발명의 또 다른 견지는 코팅된 메시, 코팅된 발포체 또는 코팅된 분말로부터 선택된 접착성 지혈 제품에 관한 것으로, 상기 지혈 제품은
ㆍ 적어도 20 부피%의 다공성을 가지며 반응성 친핵성 기를 함유하는 친핵성 폴리머를 포함하는 외부 표면을 포함하는 다공성 고체 기재;
ㆍ 평균적으로 적어도 1개의 반응성 친전자성 기를 함유하는 EL-POX를 포함하는 고체 기재의 적어도 일부를 피복하는 접착성 코팅
을 포함한다.
이 접착성 지혈 제품은 앞서 본 명세서에 기재된 방법에 의해 적절하게 얻어질 수 있다.
상술한 바와 같이, 지혈 제품은 조직 내에 자연적으로 존재하는 친핵성 기와 반응할 수 있는 친전자성 반응기의 존재로 인해 탁월한 접착 특성을 갖는다. 또한, 이러한 지혈 제품은 혈액 또는 다른 수성 유체와의 접촉시, EL-POX 내의 반응성 친전자성 기가 공유 결합의 형성하에 친핵성 폴리머의 반응성 친핵성 기와 반응함에 따라, 접착성 코팅이 다공성 기재에 고정되는 이점을 제공한다.
접착 지혈 물질의 코팅에 존재하는 EL-POX는 다공성 고체 기재에 공유 결합될 수 있다. 또한, EL-POX는 가교 결합될 수 있다.
다공성 고체 기재, EL-POX 및 친핵성 폴리머의 바람직한 형태는 본 명세서에서 앞서 기재되어있다.
지혈 제품의 코팅에서 EL-POX는 바람직하게 5개의 반응성 친전자성 기, 보다 바람직하게는 25개의 반응성 친전자성 기 그리고 가장 바람직하게는 50개의 반응성 친전자성 기를 함유한다.
기재는 전형적으로 지혈 제품의 적어도 10중량%, 더욱 바람직하게는 적어도 50중량% 그리고 가장 바람직하게는 적어도 75중량%를 나타낸다.
EL-POX 함유 코팅은 전형적으로 지혈 제품의 5-75중량%를 나타낸다. 보다 바람직하게, 코팅은 지혈 제품의 10 내지 50중량%, 가장 바람직하게는 12 내지 25 중량%를 나타낸다.
코팅은 바람직하게 25-100중량%의 EL-POX를 함유한다. 보다 바람직하게, 코팅의 EL-POX 함량은 적어도 50중량%, 가장 바람직하게는 적어도 75중량%이다.
본 발명은 접착성 코팅이 다공성 고체 기재의 공극과 상호 연결된 공극을 함유하는 코팅된 지혈 제품의 제조를 가능하게 한다.
특히 바람직한 구현에 따르면, 접착 지혈제는 적어도 50%, 보다 바람직하게는 적어도 80%의 공극 밀도를 갖는다.
본 발명은 하기 비-제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1
25% NHS 에스테르(=EL-POX, 25% NHS) 단위를 함유하는 NHS-측쇄 활성화 폴리[2-(프로필/NHS-에스테르-에틸)-2-옥사졸린] 코폴리머를 다음과 같이 합성하였다:
75% 2-n-프로필-2-옥사졸린(nPropOx) 및 25% 2-메톡시카보닐-에틸-2-옥사졸린(MestOx)을 사용하고 양이온성 고리 오프닝 중합(CROP)을 이용하여 폴리[2-(프로필/메톡시-카보닐-에틸)-2-옥사졸린] 코폴리머(중합도=DP=약 100)를 합성하였다. 25% 2-메톡시카보닐-에틸기를 함유하는 통계학에 근거한 코폴리머(1H-NMR)를 수득하였다. 25% 2-메톡시카보닐-에틸기를 함유하는 폴리머를 소듐 히드록시드(1M)을 사용하여 가수분해하여 25% 2-카복시-에틸기를 갖는 코폴리머를 수득하였다(1H-NMR). 2-카복시-에틸기는 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 디이소프로필카보디이미드(DIC)에 의해 활성화되어 [2-(프로필/NHS-에스테르-에틸)-2-옥사졸린] 코폴리머(=EL-POX, 25% NHS)를 수득하였다. 폴리머는 1H-NMR 및 UV-분광법에 의하면 25% NHS-에스테르기를 함유하였다.
소의 콜라겐 스펀지는 Faraj et al., Tissue Engineering, 2007, 13, 10, 2387-2394에 기재된 절차에 따라 제조하였다. 콜라겐은 소의 힘줄에서 추출되었다. 이렇게 수득된 콜라겐 스펀지는 95 내지 98%의 다공성 및 80 내지 100㎛의 평균 공극 크기를 가졌다. 다공성은 콜라겐 필름(공극이 없는 공간)의 밀도와 콜라겐 스펀지의 밀도를 비교하여 계산되었다. 공극 크기는 Faraj et al., Tissue Engineering, 2007, 13, 10, 2387-2394에 기재된 방법에 따라 주사 전자 현미경을 사용하여 측정되었다.
EL-POX, 25% NHS는 아세톤(180mg/ml)에 용해되었다. 용액은 동결건조된 소 콜라겐 스펀지의 상부에 균일하게 적상 분배(distributed drop wise)되었다. 코팅 직후, 스펀지는 진공(1mbar)하에 실온에서 8시간 동안 건조되었다. EL-POX, 25% NHS 코팅(15mg/cm2)이 있는 접착성 콜라겐 스펀지를 얻었다.
EL-POX, 25% NHS 및 콜라겐 상에 존재하는 친핵성 아민기 사이의 가능한 가교 결합을 평가하기 위해, 코팅된 콜라겐 스펀지를 아세톤으로 린스하였다. 모든 EL-POX, 25% NHS는 아세톤 추출물에서 회수되었으며, 이는 EL-POX 내의 친전자성 기가 코팅 및/또는 건조 중에 콜라겐의 아민기와 반응하지 않았음을 나타낸다.
코팅된 콜라겐 스펀지의 지혈 특성은 다음과 같이 평가하였다:
ㆍ 콜라겐 스펀지의 EL-POX, 25% NHS 코팅면의 상부에 신선한 헤파린 처리된 전혈 100μL를 적가(added drop wise)하였다.
ㆍ 다른 EL-POX, 25% NHS 코팅 스펀지를 EL-POX 코팅면이 혈액을 향하게 하여 혈액 코팅 콜라겐 스펀지의 상부에 놓았다("샌드위치 방법").
ㆍ 거즈로 가벼운 압력을 10초 동안 가하였다. 다음에, 그 샌드위치를 물을 함유한 비이커에 넣고 그 물을 2분 동안 교반하였다. 이 두 가지 콜라겐 스펀지는 이러한 조건에서 접착된 채로 남아 있었고 스펀지에서 혈액이 새어 나오지 않았으며, 이는 지혈과 접착을 나타낸다.
코팅되지 않은 콜라겐 스펀지를 사용한 컨트롤 실험으로, 물속에서 20초 후에 스펀지가 분리되고 물이 빨갛게 변하였으며, 이는 지혈이 없음을 나타낸다.
실시예 2
15% NHS 에스테르기(=EL-POX, 15% NHS)를 함유하는 NHS-측쇄 활성화 폴리 2-(프로필/히드록시-에틸-아미드-에틸/NHS-에스테르-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸)-2-옥사졸린] 터폴리머를 다음과 같이 합성하였다:
70% 2-프로필-2-옥사졸린 및 30% 2-메톡시카보닐-에틸-2-옥사졸린을 사용하고 CROP을 이용하여 폴리[2-(프로필/메톡시-카보닐-에틸)-2-옥사졸린] 코폴리머(DP= +/-100)를 합성하였다. 30% 2-메톡시카보닐-에틸기를 함유하는 통계학에 근거한 코폴리머(1H-NMR)를 수득하였다. 둘째로, 30% 2-메톡시카보닐-에틸기를 함유하는 폴리머를 에탄올아민과 반응하여 30% 2-히드록시-에틸-아미드-에틸기를 갖는 코폴리머를 수득하였다(1H-NMR). 그 후, 2-히드록시-에틸-아미드-에틸기의 일부를 숙신산 무수물과 반응시켜 1H-NMR에 따르면 70% 2-프로필기, 15% 2-히드록시-에틸-아미드-에틸기 및 15% 2-카복시-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸기를 갖는 터폴리머를 수득하였다. 마지막으로, 2-카복시-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸기는 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 디이소프로필카보디이미드(DIC)에 의해 활성화되어 EL-POX, 15% NHS를 수득하였다. 폴리머는 1H-NMR에 의하면 15% NHS-에스테르기를 함유하였다.
EL-POX, 15% NHS(130mg) 및 무수 소듐 보레이트를 칭량하고, 이소프로판올/2-부타논의 용액(1.6mL, v/v, 1:1)을 첨가하였으며, 이는 무수 소듐 보레이트가 이소프로판올/2-부타논(v/v, 1:1)에 불용성이기 때문에 미세한 서스펜션을 형성하였다. 서스펜션은 동결건조된 소 콜라겐 스펀지의 상부에 균일하게 적상 분배되었다. 코팅 직후, 스펀지는 진공(1mbar)하에 실온에서 8시간 동안 건조되었다. EL-POX, 15% NHS 및 무수 소듐 보레이트 코팅(19mg/cm2)이 있는 접착성 콜라겐 스펀지를 얻었다.
코팅된 콜라겐 스펀지의 지혈 특성은 다음과 같이 평가하였다:
ㆍ 콜라겐 스펀지의 EL-POX, 15% NHS 및 무수 소듐 보레이트 코팅면의 상부에 신선한 헤파린 처리된 전혈 100μL를 적가하였다.
ㆍ 다른 EL-POX, 15% NHS 및 무수 소듐 보레이트 코팅 스펀지를 EL-POX 코팅면이 혈액을 향하게 하여 혈액 코팅 콜라겐 스펀지의 상부에 놓았다("샌드위치 방법").
ㆍ 거즈로 가벼운 압력을 10초 동안 가하였다. 다음에, 그 샌드위치를 물을 함유한 비이커에 넣고 그 물을 3분 동안 교반하였다.
이 두 가지 콜라겐 스펀지는 이러한 조건에서 접착된 채로 남아 있었고 스펀지에서 혈액이 새어 나오지 않았으며, 이는 지혈과 접착을 나타낸다.
실시예 3
본 실시예에서, 몇몇 폴리머들을 전단 강도에 대해 시험하였고, 샘플의 개요를 표 1에 제공하였다. 폴리머(DP = +/-100)를 2-n-프로필-2-옥사졸린, 2-에틸-2-옥사졸린 및 2-메톡시-에틸-2-옥사졸린의 CROP로 합성하였다. 샘플 1-3으로 사용 된 EL-POX는 실시예 1에 기재된 경로를 통해 후 변형되었다. 샘플 4-6으로 사용된 EL-POX는 실시예 2에 기재된 경로를 통해 합성되었다. 모든 활성화된 폴리머를 NHS 함량에 대한 1H-NMR 및 UV 분광법을 통해 분석하였다. PEG 4-arm NHS(펜타에리스리톨 폴리(에틸렌글리콜)에테르 테트라숙신이미딜 글루타레이트, 샘플 7)는 NOF America corporation에서 입수하였다. 소의 콜라겐 스펀지(5 × 7 × 1cm(b × l × h))를 컨트롤(샘플 8)로서 시험하였다. 모든 코팅된 스펀지는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다.
제조 과정
ㆍ 다공성 콜라겐 스펀지를 칭량하였다(n=7).
ㆍ EL-POX 용액은 유기 용매(디클로로메탄(DCM)/이소프로필알코올(IPA)(v/v, 1:1))에 정의된 양의 폴리머를 최종 농도 300mg/mL로 용해시켜 제조하였다.
ㆍ EL-POX 용액을 다공성 콜라겐 스펀지(14cm2)의 일부에 적가 방식으로 코팅하여 15mg/cm2의 목표 코팅 밀도를 얻었다. 코팅된 다공성 콜라겐 스펀지를 실온에서 진공 오븐(5mbar)에서 밤새 건조시켰다.
ㆍ 코팅된 다공성 콜라겐 스펀지를 다시 칭량하고 코팅 밀도를 측정하였다. 사용된 폴리머 및 코팅 밀도에 대한 개요를 표 1에 제공하였다.
시험 절차
이들 폴리머는 하기 방식으로 전단 강도를 시험하였다:
ㆍ 구조물을 5 x 1cm(bxl)의 동일한 조각으로 절단하였다.
ㆍ 코팅된 면을 헤파린 처리된 인간 혈액 200μL를 사용하여 접착 면이 마주 보도록 함께 놓았다. 중량(10g)을 표준화된 압력에 대해 10초 동안 적용하였다.
ㆍ 구조물을 정의된 시간, 1분(t1) 또는 15분(t15) 동안 가교 결합이 이루어지도록 하였다.
ㆍ 정의된 시간 지점에서 구조물을 전단 시험기(Zwicky Roell, 20N 로드 셀)에 배치하고 파단될 때까지 전단 강도를 측정하였다.
ㆍ 결과: 측정된 힘(N)은 구조물의 겹쳐진 영역(cm2)으로 나누어졌으며, 이는 전단 강도(kPa)를 형성하였다. 그 결과를 표 1에 열거하였다.
전단 강도 시험 결과
코팅 밀도 ( mg / cm2 )
n =7 		전단 강도( kPa )
n=6 t1 및 t15
샘플 EL - POX 평균 t1 t15
1 P(PropOx-EtOx-NHS) (50-40-10) 14.5 ± 0.8 2.10 ± 1.64 5.29 ± 1.44
2 P(PropOx-EtOx-NHS) (40-35-25) 14.0 ± 0.9 3.20 ± 1.53 8.29 ± 1.11
3 P(PropOx-EtOx-NHS) (40-50-10) 14.5 ± 0.4 1.91 ± 0.85 4.62 ± 0.60
4 P(PropOx-OH-NHS) (70-20-10) 14.2 ± 2.9 3.45 ± 0.43 5.27 ± 1.26
5 P(PropOx-OH-NHS) (70-5-25) 15.1 ± 1.3 2.98 ± 0.43 8.20 ± 2.16
6 P(PropOx-OH-NHS) (50-40-10) 14.6 ± 0.8 1.29 ± 0.60 4.79 ± 1.74
비교예
7 PEG 4-arm NHS 13.0 ±1.5 3.18 ± 0.32 6.78 ± 1.42
8 코팅없는 콜라겐 - 0.79 ± 0.48 1.47 ± 0.46
이 결과로부터 다음과 같은 결론을 내릴 수 있다:
ㆍ EL-POX 폴리머(1-6)는 가교 결합 시간이 증가함에 따라 더 높은 전단 강도를 나타낸다.
ㆍ EL-POX 폴리머(2 및 5)는 t15에서 폴리머 PEG 4-arm NHS(7)보다 높은 전단 강도 값을 나타낸다.
ㆍ 컨트롤 샘플(8)은 전단 강도가 없는 것으로 제한되었으며, 이는 가교 결합이 NHS-에스테르기에 의해 발생되는 것을 나타낸다.
본 실시예는 콜라겐에 코팅된 EL-POX가 콜라겐에 코팅된 PEG 4-arm NHS와 동일한 농도보다 높은 전단 강도를 생성하는 혈액의 존재 하에서 가교 결합할 수 있음을 보여준다.
실시예 4
20% NHS 에스테르기(=EL-POX, 20% NHS)를 함유하는 NHS-측쇄 활성화 폴리 2-(프로필/히드록시-에틸-아미드-에틸/NHS-에스테르-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸)-2-옥사졸린] 터폴리머를 다음과 같이 합성하였다:
70% 2-프로필-2-옥사졸린 및 30% 2-메톡시카보닐-에틸-2-옥사졸린을 사용하고 CROP을 이용하여 폴리[2-(프로필/메톡시-카보닐-에틸)-2-옥사졸린] 코폴리머(DP= +/-100)를 합성하였다. 30% 2-메톡시카보닐-에틸기를 함유하는 통계학에 근거한 코폴리머(1H-NMR)를 수득하였다. 둘째로, 30% 2-메톡시카보닐-에틸기를 함유하는 폴리머를 에탄올아민과 반응하여 30% 2-히드록시-에틸-아미드-에틸기를 갖는 코폴리머를 수득하였다(1H-NMR). 그 후, 2-히드록시-에틸-아미드-에틸기의 일부를 숙신산 무수물과 반응시켜 1H-NMR에 따르면 70% 2-프로필기, 10% 2-히드록시-에틸-아미드-에틸기 및 20% 2-카복시-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸기를 갖는 터폴리머를 수득하였다. 마지막으로, 2-카복시-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸기는 N-히드록시숙신이미드(NHS) 및 디이소프로필카보디이미드(DIC)에 의해 활성화되어 EL-POX, 20% NHS를 수득하였다. 폴리머는 1H-NMR에 의하면 20% NHS-에스테르기를 함유하였다.
알킬 측쇄에 프로필 및 아민기를 함유하는 아민 작용화된 NU-POX는 nPropOx 및 MestOx의 CROP에 의해 합성되고, 그리고 후속적으로 에틸렌 디아민을 이용한 메틸 에스테르 측쇄의 아미드화가 이루어져 폴리(2-프로필/아미노에틸아미도에틸-2-옥사졸린) 코폴리머(NU-POX)를 수득하였다. 폴리머는 1H-NMR에 의하면 20% NH2를 함유하였다.
소 콜라겐 스펀지(7 × 5 × 1cm)가 사용되었으며, 이는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되었다. 이들 실험을 위해, 가열 플래이트가 장착된 ExactaCoat SC 초음파 스프레이 장치(Sono-Tek)가 사용되어 콜라겐 스펀지를 코팅하였다.
시험 4A: 용액 내 EL - POX
IPA/2-부타논(v/v, 1:1)(90mg/mL) 중의 EL-POX(EL-POX, 20% NHS)의 용액을 표 2에 나타낸 설정에 따라 초음파 스프레이에 의해 콜라겐 상에 균질하게 분포시켰으며, 이는 코팅 밀도 5mg/cm2를 형성하였다. SEM-이미지는 콜라겐의 다공성 구조가 유지된다는 것을 보여주었다.
구조물을 조각(2cm2)으로 절단하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 t15에서 전단 강도 시험을 사용하여 시험하였다. 결과는 10.9+/-3.3kPa(n=4)이었으며, 이는 양호한 접착 및 지혈을 나타낸다.
파라미터 초음파 스프레이
노즐 48 Accumist
기재 설명 소 콜라겐 타입 1
코팅 영역(cm) 5x7cm
노즐 파워/완속 파워 시험 4A에서 6|
시험 4B-4D에서 3|
분배율(ml/min) 1ml/min
압력(mbar) 40mbar
트랜스 속도(mm/sec) 예 5A, 5B, 5C(NU-POX 코팅)에 대해 20mm/s|
예 5C(EL-POX 코팅) 및 5D에 대해 40mm/s|
기재 상부에서의 높이(mm) 30mm
간격(mm) 5mm
코팅 사이클 시험 4A에 대해 2 코팅 사이클|
시험 4B에 대해 3 코팅 사이클|
시험 4C 및 4D에 대해 1 코팅 사이클|
시험 4B: 서스펜딩된 버퍼를 갖는 EL - POX
서스펜딩된 HEPES-버퍼(1.7g)와 함께 IPA/2-부타논 중의 EL-POX 용액(v/v, 1:1)(10mg/mL)을 표 2에 나타낸 설정에 따라 초음파 스프레이에 의해 콜라겐 상에 균질하게 분포시켰으며, 이는 코팅 밀도 5mg/cm2를 형성하였다. SEM-이미지는 콜라겐의 다공성 구조가 유지된다는 것을 보여주었다. 구조물을 조각(2cm2)으로 절단하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 t15에서 전단 강도 시험을 사용하여 시험하였다. 측정된 평균 전단 강도는 2.6+/-0.8kPa(n=3)이었으며, 이는 양호한 접착 및 지혈을 나타낸다.
시험 4C: (1) NU - POX 및 버퍼의 용액 + (2) EL - POX 의 용액
HEPES(1.7g)를 함유한 물 중의 NU-POX의 용액(10mg/mL)을 표 2에 나타낸 설정에 따라 초음파 스프레이에 의해 콜라겐 상에 균질하게 분배시켰다. 용매를 30분 동안 증발시켰다. 그 후, IPA/2-부타논 중의 EL-POX의 용액(v/v, 1:1)(15mg/mL)을 코팅된 콜라겐의 상부에 표 2에 나타낸 설정에 따라 초음파 스프레이에 의해 균질하게 분배시켰다. 코팅 후, 5mg/cm2(±40중량% NU-POX 및 ±60중량% EL-POX)의 코팅 밀도가 얻어졌다. SEM-이미지는 콜라겐의 다공성 구조가 유지되었음을 보여주었다. 구조물을 조각들(2cm2)로 절단하고 실시예 3에 기재된 바와 같이 t15에서 전단 강도 시험을 사용하여 시험하였다. 측정된 평균 전단 강도는 3.9+/-2.9kPa(n=2)이었으며, 이는 양호한 접착 및 지혈을 나타낸다.
시험 4D: 버퍼 용액( EL - POX 현탁액)
IPA/디에틸에테르/트리에틸아민(v/v/v, 50:50:1) 중의 현탁액 EL-POX를 표 2에 나타낸 설정에 따라 초음파 스프레이에 의해 콜라겐 상에 균질하게 분배시켰다. 코팅 후, 4mg/cm2의 코팅 밀도가 얻어졌다. SEM-이미지는 콜라겐의 다공성 구조가 유지되었음을 보여주었다. 구조물을 조각들(2cm2)로 절단하고 실시예 3에 기재된 전단 강도 시험을 사용하여 시험하였다. 측정된 평균 전단 강도는 4.2+/-3.5kPa(n=3)이었으며, 이는 양호한 접착 및 지혈을 나타낸다.
또한, 초음파로 코팅된 콜라겐 스펀지 4A-4D의 지혈 특성을 다음과 같이 평가하였다:
ㆍ 콜라겐 스펀지의 EL-POX 코팅면의 상부에 신선한 헤파린 처리된 전혈 100μL를 적가하였다.
ㆍ 다른 EL-POX 코팅된 스펀지를 EL-POX 코팅면이 혈액을 향하게 하여 혈액 코팅된 콜라겐 스펀지의 상부에 놓는다('샌드위치 방법(sandwich method)').
ㆍ 거즈로 가벼운 압력을 10초 동안 가하였다. 다음에, 그 샌드위치를 물을 함유한 비이커에 넣고 그 물을 2분 동안 교반하였다.
두 콜라겐 스펀지 4A-4D는 모두 이러한 조건하에서 접착된 상태로 남아 있었고 스펀지로부터 혈액이 새어 나오지 않았으며, 이는 지혈 및 접착을 나타낸다.
실시예 5
NHS-측쇄 활성화된 폴리 2-(프로필/히드록시-에틸-아미드-에틸/NHS-에스테르-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸)-2-옥사졸린 터폴리머(=EL-POX, 20% NHS)를 실시예 2에 기술된 바와 같이 합성하였다.
EL-POX, 20% NHS를 메탄올(180mg/ml)에 용해하였다. 용액을 산화 재생 셀룰로오스 패치(ORC, Gelita-Cel)의 상부에 균일하게 적가하였다. 코팅 직후, 패치를 4시간 동안 공기 흐름하에 실온에서 건조시켰다. EL-POX, 20% NHS 코팅(12mg/cm2)을 갖는 ORC를 얻었다.
코팅된 ORC의 지혈 특성은 다음과 같이 평가하였다:
ㆍ ORC(1x1cm)의 EL-POX, 20% NHS 코팅면의 상부에 신선한 헤파린 처리된 전혈 100μL를 적가하였다.
ㆍ 다른 EL-POX, 20% NHS 코팅된 ORC를 EL-POX 코팅면이 혈액을 향하게 하여 혈액 코팅된 ORC의 상부에 놓는다('샌드위치 방법').
ㆍ 거즈로 가벼운 압력을 10초 동안 가하였다. 다음에, 그 샌드위치를 물을 함유한 비이커에 넣고 그 물을 5분 동안 교반하였다. 두 개의 ORC 조각은 5분 동안 이러한 조건하에서 부착된 채로 유지되었으며, 매체는 빨갛게 변하지 않았다.
코팅되지 않은 ORC를 사용한 컨트롤 실험에서, 교반 중 물속에서 1분 이내에 ORC가 분리되고, 물이 빨갛게 변하였으며, 이는 지혈이 없음을 나타낸다.
실시예 6
NHS-측쇄 활성화된 폴리 2-(프로필/히드록시-에틸-아미드-에틸/NHS-에스테르-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸)-2-옥사졸린 터폴리머(=EL-POX, 20% NHS)를 실시예 2에 기술된 바와 같이 합성하였다. 키토산 분말은 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. (탈아세틸화도 75-85%, Mn 10,000). 전분 분말(HaemoCer®)은 독일의 BioCer에서 구입하였다.
분말을 EL-POX, 20% NHS(EL-POX)로 다음과 같은 방식으로 별도로 코팅하였다.
ㆍ 분말(키토산 또는 전분)을 칭량하고 DCM 중의 EL-POX(15mg/mL) 용액으로 코팅하였다.
ㆍ 현탁액을 감압하에 건조시켰다.
ㆍ 그 후, 건조된 코팅된 분말을 분쇄하여 균일하게 미세한 분말을 형성하였다. 코팅된 키토산 분말은 약 25중량% EL-POX를 함유한다. 코팅된 전분 분말은 약 10중량% EL-POX를 함유한다.
컨트롤로서, 분쇄된 코팅되지 않은 키토산 분말, 분쇄된 코팅되지 않은 전분 분말 및 분쇄된 EL-POX가 시험되었다.
EL-POX 코팅된 분말 및 컨트롤 샘플을 (1)카보네이트 버퍼(0.1M, pH 9) 또는 (2)헤파린 처리된 인간 혈액(pH 7.4)과 혼합하여 지혈 특성을 평가하였다. 이것은 다음과 같은 방법으로 시험되었다: 분말을 에펜도르프 튜브에서 칭량하고 250μL의 버퍼 (1) 또는 혈액 (2)와 혼합하였다. 겔이 형성될 때까지 튜브를 상하로 인버팅하여 겔화 시간을 측정하였다.
사용된 물질의 양과 가교 결합 시험의 결과를 표 3에 나타내었다.
가교 결합 시험의 결과
샘플 키토산* ( mg ) 전분* ( mg ) EL - POX * ( mg ) (1) 버퍼 pH 9 (μL) (2) 혈액
(μL) 		겔화 시간
1 16.5 5.7 250 2 min
2 17.2 5.8 250 1 min
3 19.8 250 겔화되지 않음
4 18.0 250 겔화되지 않음
5 20.1 250 45 sec
6 24 250 겔화되지 않음
7 18.1 2.0 250 겔화되지 않음
8 20 250 겔화되지 않음
9 21 250 겔화되지 않음
10 17.8 2.0 250 2 min
*코팅된 분말 중의 중량% EL-POX로부터 산출됨
이러한 결과는 키토산이 EL-POX로 가교 결합할 수 있고(샘플 2) 전분이 EL-POX와 가교 결합할 수 없음(샘플 7)을 보여준다. EL-POX로 코팅된 키토산과 녹말은 모두 혈액으로 가교 결합할 수 있었지만(샘플 1 및 10), 코팅되지 않은 키토산과 전분 분말은 버퍼 및/또는 혈액의 존재하에 겔을 형성하지 못하였다(샘플 3, 4, 8 및 9). EL-POX 분말은 혈액 중의 아민과 반응하여 겔을 형성할 수 있었지만(샘플 5), EL-POX 분말을 버퍼와 혼합한 경우에는 겔 형성이 관찰되지 않았다(샘플 6).
EL-POX를 함유한 겔은 물에서 안정한 것으로 나타났다. 대조적으로, 혈액 250μL에 전분 또는 키토산 200mg을 첨가하여 제조한 혈액 겔은 물에서 안정하지 못하였다.
실시예 7
NHS-측쇄 활성화된 폴리 2-(프로필/히드록시-에틸-아미드-에틸/NHS-에스테르-에틸-에스테르-에틸-아미드-에틸)-2-옥사졸린 터폴리머(=EL-POX, 20% NHS)를 실시예 3에 기술된 바와 같이 합성하였다. PEG-arm NHS(펜타에리트리톨 폴리(에틸렌글리콜)에테르테트라숙신이미딜 글루타레이트, EL-PEG)는 NOF America corporation으로부터 입수하였다. 소 콜라겐 스펀지(7 x 5 x 1cm)를 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조하였다.
두 가지 적용 방법, 즉 (I) 용융 방법과 (II) 코팅액 방법을 비교하였다.
(I) 용융 방법( 비교예 )
공지된 양의 폴리머 분말, EL-POX, 20% NHS 및 EL-PEG를 표 4에 나타낸 코팅 밀도를 얻기 위해 콜라겐 스펀지의 상부에 균질하게 분포시켰다. EL-POX, 20% NHS 및 EL-PEG는 예비가열된 오븐에서 5분 동안 표 4에 나타낸 온도로 가열하여 폴리머 분말을 용융시켰다. 이 시간 프레임 및 온도 설정 내에서, EL-POX 및 EL-PEG는 안정한 상태를 유지하였다.
제조된 구조물의 SEM-이미지는 형성된 폴리머 필름이 콜라겐 상부층의 다공성 구조물을 밀봉하는 것을 보여주었다.
설정 (I) 용융 방법
폴리머 오븐 온도(℃) 코팅 밀도( mg / cm 2 )
EL-POX, 20% NHS 140 12
EL-PEG 60 11
( II ) 코팅액 방법
EL-POX, 20% NHS 분말을 IPA/DCM(v/v, 1:1)(15mg/mL)에 용해시키고, 용액을 점적 코팅(drip coating)에 의해 콜라겐 스펀지의 상부에 고르게 분포시켜 12mg/cm2의 코팅 밀도를 수득하였다. 스펀지를 2시간 동안 진공 오븐에서 건조시켰다. SEM-이미지는 콜라겐의 다공성 구조가 유지되었음을 보여 주었다.
코팅된 콜라겐 스펀지의 지혈 특성은 다음과 같이 평가하였다:
ㆍ 콜라겐 스펀지의 EL-POX, 20% NHS 또는 EL-PEG 코팅면의 상부에 100μL의 신선한 헤파린 처리된 전혈을 적가하였다.
ㆍ 다른 코팅된 스펀지를 코팅면이 혈액을 향하게 하여 혈액 코팅된 콜라겐 스펀지의 상부에 놓는다('샌드위치 방법').
ㆍ 거즈로 가벼운 압력을 10초 동안 가하였다. 다음에, 그 샌드위치를 물을 함유한 비이커에 넣고 그 물을 1분 동안 교반하였다.
용융에 의해 제조된 콜라겐 스펀지(EL-POX 및 EL-PEG 모두)는 1분 이내에 분리되었으며, 이는 지혈 및 접착이 없음을 나타낸다. 드립 코팅에 의해 제조된 콜라겐 스펀지(EL-POX)는 1분 동안 접착된 채로 유지되었으며, 이는 지혈 및 접착을 나타낸다.
본 실시예는 적용 방법이 콜라겐에서의 공극의 접근성에 영향을 미침을 보여주며, 용융에 의해 수득된 스펀지와 액 코팅에 의해 수득된 스펀지 사이의 지혈 및 접착의 차이를 설명한다.
실시예 8
외상성 간 및 비장 파열의 치료는 외과의사에게 중요한 과제이다. 비장에는 우수한 혈액 공급이 있고 비장의 파열은 다량 복부 출혈과 종종 연관되어 있기 때문이다.
마취된 돼지 1마리 (국내산 돼지, 수컷, 체중 범위: 40kg, 다 자란 돼지)에서 표준화된 합침 관통 비장 파열이 발생하였다. 비장에 접근하기 위해 정중선 개복술을 시행하였다. 메스(scalpel)를 사용하여 n=3(S1...S3)의 피막 표준화된 병변(subcapsular standardized lesions)(10mm x 10mm)을 만들었다.
3가지 유형의 지혈 제품을 시험하였으며, 개요를 표 5에 나타내었다.
시험된 제품의 설명
샘플 제품 제품의 설명
S1 EL-POX 실시예 4에서와 같이 제조된 EL-POX, 25% NHS(5mg/cm2)로 코팅된 콜라겐 스펀지
비교예
S2 코팅 없음 실시예 1에서 제조딘 소 콜라겐 스펀지
S3 레퍼런스 2x2cm HemopatchTM(Baxter Healthcare로부터 구입함)
지혈 제품은 가벼운 압력으로 가해졌다. 제품을 적용한 후 지혈까지의 시간을 평가하였다. 참조 표 6.
결과 동물 모델
샘플 적용된 제품 결과
S1 EL-POX TTH: 1분, n=1
비교예
S2 코팅 없음 TTH: 3 내지 4분, n=2
S3 레퍼런스 TTH: 1분, n=1
TTH = 지혈까지의 시간; n = 지혈에 이르는데 필요한 제품의 수
본 실시예는 EL-POX 코팅된 스펀지의 돼지 비장에 대한 지혈 효능을 보여준다. 표 6의 종료점을 기반으로, EL-POX 코팅된 스펀지는 지혈을 얻는데 있어서 이 모델에서 레퍼런스 제품(HemopatchTM)과 동등하게 잘 수행하였으며, 컨트롤보다 우수하였다. 또한, EL-POX 코팅된 스펀지의 혈액 흡수능이 레퍼런스 제품보다 우수한 것으로 관찰되었다. 따라서, EL-POX 코팅된 스펀지로 달성된 지혈은 혈액 응고의 빠른 개시에 의해 도움받았다.

Claims (15)

  1. ㆍ 다공성 고체 기재를 제공하는 단계;
    ㆍ 상기 기재를 친전자성으로 활성적인 폴리옥사졸린(EL-POX) 및 용매를 포함하는 코팅액으로 코팅하여 코팅된 기재를 생성하는 단계로서, 상기 EL-POX는 적어도 2개의 반응성 친전자성 기를 함유하는 코팅된 기재를 생성하는 단계;
    ㆍ 코팅된 기재로부터 용매를 제거하는 단계
    를 포함하는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 기재는 적어도 20부피%, 바람직하게 적어도 50부피%, 그리고 보다 바람직하게 적어도 85부피%의 다공성을 갖는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 기재는 반응성 친핵성 기를 함유하는 친핵성 폴리머를 포함하는 외부 표면을 포함하는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고체 기재는 10mm 내지 200mm의 길이, 5mm 내지 200mm의 폭 및 0.5mm 내지 10mm의 두께를 갖는 시트 형태의 메쉬 또는 발포체인, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 고체 기재는 분말이며, 상기 분말은 10-200μm 범위의 질량 가중 평균 입자 크기(mass weighted average particle size)를 갖는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기재는 상기 기재 상의 초음파 노즐을 통해 상기 코팅액을 스프레이하여 코팅되는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 EL-POX는 카르복실산 에스테르, 설포네이트 에스테르, 포스포네이트 에스테르, 펜타플루오로페닐 에스테르, p-니트로페닐 에스테르, p-니트로티오페닐에스테르, 산 할라이드기, 무수물, 케톤, 알데히드, 이소시아네이토, 티오이소시아네이토, 이소시아노, 에폭시드, 활성화된 히드록실기, 올레핀, 글리시딜 에테르, 카르복실, 숙신이미딜 에스테르, 숙신이미딜 카보네이트, 숙신이미딜카바메이트, 설포숙신이미딜 에스테르, 설포숙신이미딜 카보네이트, 말레이미도(말레이미딜), 에텐설포닐, 이미도 에스테르, 아세토 아세테이트, 할로 아세탈, 오르토피리딜 디설피드, 디히드록시-페닐 유도체, 비닐, 아크릴레이트, 아크릴아미드, 요오드아세트아미드 및 이의 조합으로부터 선택된 적어도 2개의 반응성 친전자성 기를 함유하는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  8. 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친핵성 폴리머는 단백질, 키토산 및 합성 또는 탄수화물 폴리머로부터 선택되며, 그리고 여기서 상기 반응성 친핵성 기는 아민, 티올, 포스핀 및 이의 조합으로부터 선택될 수 있는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코팅액은 2-프로판올, 에틸 알코올, 메탄올, 디클로로메탄, 아세톤, 아니솔, 1-부탄올, 2-부탄올, 부틸 아세테이트, tert-부틸메틸 에테르, 큐멘, 디메틸 술폭시드, 에틸 아세테이트, 에틸 에테르, 에틸 포메이트, 헵탄, 이소부틸 아세테이트, 이소프로필 아세테이트, 메틸 아세테이트, 3-메틸-1-부탄올, 메틸에틸케톤, 메틸이소부틸케톤, 2-메틸-1-프로판올, 펜탄, 1-펜탄올, 1-프로판올, 프로필 아세테이트 및 이의 조합으로부터 선택된 용매를 적어도 50중량% 함유하는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코팅액으로 상기 기재를 코팅한 후 및 용매를 제거하기 전 및/또는 제거하는 동안, EL-POX의 반응성 친전자성 기는 공유 결합 형성하에 상기 기재의 표면에 존재하는 친핵성 폴리머의 반응성 친핵성 기와 반응하는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 EL-POX는 상기 코팅액에 용해되고, 그리고 여기서 상기 코팅액은 분산된, 용해되지 않은 버퍼링 시스템을 함유하며, 상기 코팅액은 7 내지 11 범위의 버퍼링 pH 및 적어도 10mmol.l-1.pH-1의 버퍼 용량을 갖는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 EL-POX는 상기 코팅액에 용해되고, 그리고 여기서 상기 방법은 상기 기재를 상기 EL-POX 함유 코팅액으로 코팅하기 전에 상기 기재를 버퍼액으로 피복하는 것을 포함하며, 상기 버퍼액은 7 내지 11 범위의 버퍼링 pH 및 적어도 10mmol.l-1.pH-1의 버퍼 용량을 갖는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 코팅액이 상기 기재 상에 코팅되는 경우에 상기 코팅액에 존재하는 EL-POX의 적어도 80중량%가 용해되지 않으며, 그리고 여기서 상기 코팅액은 용해되거나 또는 용해되지 않은 버퍼링 시스템을 함유하며, 상기 코팅액은 7 내지 11 범위의 버퍼링 pH 및 적어도 10mmol.l-1.pH-1의 버퍼 용량을 갖는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용매의 제거 후에 상기 EL-POX는 평균적으로 적어도 하나의 반응성 친전자성 기를 함유하는, 접착 지혈 제품을 제조하는 방법.
  15. 코팅된 메시, 코팅된 발포체 또는 코팅된 분말로부터 선택된 접착성 지혈 제품으로서, 상기 지혈 제품은
    ㆍ 적어도 5부피%의 다공성을 가지며 반응성 친핵성 기를 함유하는 친핵성 폴리머를 포함하는 외부 표면을 포함하는 다공성 고체 기재;
    ㆍ 상기 고체 기재의 적어도 일부를 피복하는 접착성 코팅으로서, 상기 코팅은 친전자성으로 활성화된 폴리옥사졸린(EL-POX)을 포함하며, 상기 EL-POX는 평균적으로 적어도 1개의 반응성 친전자성 기를 함유하는, 접착성 코팅
    을 포함하는, 접착성 지혈 제품.
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