KR20160100382A - 미생물 세포로부터의 미생물 오일의 수득 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은, 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하고 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 수득함으로써, 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUFA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로, 본원에 기술된 하나 이상의 방법에 의해 미생물 세포로부터 회수되는 하나 이상의 PUMA를 포함하는 미생물 오일에 관한 것이다.
Description
본원은, 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하고 그다음 상기 용해된 세포 조성물로부터 오일을 회수함으로써 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUFA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법을 개시한다. 추가로, 본원에는, 본원에 기술된 하나 이상의 방법에 의해 미생물 세포로부터 회수된 하나 이상의 PUFA를 포함하는 미생물 오일이 개시되어 있다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은, 개시내용이 본원에서 참고문헌으로 인용되는 것으로서, 2013년 12월 20일자로 출원된 미국 가특허출원 제 61/919,000 호의 출원일의 이점을 주장한다.
하나 이상의 PUFA를 함유하는 미생물 오일은, 미생물, 예를 들어 조류 및 균류에 의해 제조된다
미생물 세포로부터 PUFA 함유 오일을 수득하기 위한 전형적인 방법은, 발효기, 폰드(pond) 또는 생물반응장치에서 목적하는 오일을 제조할 수 있는 미생물을 키워서 미생물 세포 바이오매스를 제조하는 단계; 상기 바이오매스가 성장한 발효 배지로부터 상기 바이오매스를 분리하는 단계; 미생물 세포 바이오매스를 건조하는 단계; 수-불혼화성 유기 용매(예를 들어, 헥산)를 사용하여 건조된 세포로부터 상기 오일을 추출하는 단계; 및 상기 오일로부터 유기 용매(예를 들어, 헥산)를 제거하는 단계를 포함한다. 이 방법은 추가로, 상기 세포 바이오매스를 함유하는 발효 배지를 물로 희석하고, 그다음 원심분리시켜, 희석된 발효 배지로부터 상기 바이오매스를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.
미생물 세포로부터 PUFA-함유 오일을 수득하기 위한 또다른 방법은, 발효기, 폰드 또는 생물반응장치에서 목적하는 오일을 제조할 수 있는 미생물을 키워서 미생물 세포 바이오매스를 제조하는 단계; 세포 벽을 교란하기 위해서 기계력(예를 들어, 균질화), 효소 처리 또는 화학 처리를 사용함으로써, 상기 PUFA-함유 오일을, 세포를 키운 발효 배지로 방출하는, 단계; 및 PUFA-함유 오일, 세포 잔해 및 액체를 함유하는 결과물인 조성물로부터, 수-혼화성 유기 용매, 예를 들어 이소프로필 알콜을 사용하여 오일을 회수하는 단계를 포함한다. 상기 오일은 기계적으로 상기 조성물로부터 분리될 수 있고, 상기 알콜은 오일 및 수성 바이오매스 폐수로부터 제거되어야만 한다.
미생물 세포로부터 PUFA-함유 오일을 수득하기 위한 앞의 방법의 산업적 규모의 사용은, 다량의 휘발성 물질 및 인화성 유기 용매의 사용을 요구하고, 이는 위험한 작업 조건을 형성하며, 값비싼 방폭형 설비의 사용을 요구한다. 추가적으로, 유기 용매의 사용은 유기 용매 폐수를 발생시키며, 이는 휘발성 유기 화합물(VOC) 방출에 대한 엄격한 환경적 제한을 다루기 위해서 값비싼 용매 회수 공정의 이행을 요구하며, 다시 이것은 보다 많은 맨파워(manpower) 및 고가의 장치의 필요성을 발생시킨다.
추가로, 세포를 건조하고/건조하거나 회수된 오일로부터 용매를 회수하기 위한 앞의 방법에서의 열의 사용은 PUFA-함유 오일을 열화시키고 에너지 사용을 증가시켜, 추가로 가공 비용을 증가시킬 수 있다. PUFA 함유 오일이, 미생물 세포 벽의 일체성이 교란되고/교란되거나 미세물 세포가 열에 노출되는 경우와 같이, 산소에 노출될 때, 열화가 발생한다.
미생물 세포로부터 PUFA-함유 오일을 수득하기 위한 용매-부재 방법은, 발효기, 폰드 또는 생물반응장치에서 목적하는 오일을 제조할 수 있는 미생물을 키워 미생물 세포 바이오매스를 제조하는 단계; 세포 벽을 교란하기 위해서 기계력(예를 들어, 균질화), 효소 처리 또는 화학 처리를 사용함으로써, 상기 PUFA-함유 오일을, 세포를 키운 발효 배지로 방출하는, 단계; 및 pH를 올리고/올리거나, 염을 첨가하고/첨가하거나, 가열하고/가열하거나, 생성된 조성물을 진탕함으로써, PUFA-함유 오일, 세포 잔해 및 액체를 함유하는 결과물인 조성물로부터 천연 오일(crude oil)을 회수하는 단계를 포함한다. 그러나, 세포로부터 PUFA 함유 오일을 수득하기 위한 이 용매-부재 방법은, 긴 오일 회수 시간, 다량의 염, 및/또는 많은 단계들을 요구할 수 있고, 이는 모두 가공 비용을 증가시킬 수 있다.
결과적으로, 휘발성 유기 용매를 사용하지 않고, 용이하게 입수가능한 장치를 사용하여 수행될 수 있고, 최소 갯수의 단계들을 요구하고, 보다 짧은 오일 회수 시간을 갖고, 다량의 PUFA-함유 오일을 높은 수율로 제공할 수 있는, 미생물 세포로부터 다량의 PUFA-함유 오일을 수득하는 방법의 필요성이 존재한다.
본원에서는, 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUFA)을 함유하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서, (a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (b) 하나 이상의 효소를 첨가함을 동반하여 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시켜, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 상기 오일을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 개시되어 있다.
본원에는, 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUFA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서, (a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (b) 하나 이상의 효소 및 염기를 첨가함을 동반하여 용해된 세포 조성물을 해유화시켜, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 개시되어 있다.
본원에는, 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUFA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서, (a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (b) 하나 이상의 효소를 첨가함을 동반하여 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시켜, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 오일을 회수하는 단계를 포함하되, 여기서 (a) 단계 또는 (b) 단계 중 하나 이상이 상기 조성물을 60℃ 이상의 온도로 가열함을 추가로 포함하는, 방법이 개시되어 있다.
본원에는, 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUMA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서, (a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해하여 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (b) 하나 이상의 효소 및 염기를 첨가함을 동반하여 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시켜, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 오일을 회수하는 단계를 포함하되, 여기서 (a) 단계 또는 (b) 단계 중 하나 이상이 상기 조성물을 60℃ 이상의 온도로 가열함을 추가로 포함하는, 방법이 개시되어 있다.
본원에는, 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUMA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서, (a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해하여 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (b) 하나 이상의 효소를 첨가하고 용해된 세포 조성물의 pH를 8 이상으로 올림을 동반하여 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시켜, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 개시되어 있다.
본원에는, 하나 이상의 미생물로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUMA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서, (a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (b) 하나 이상의 베타-글루카나제를 첨가함을 동반하여 용해된 세포 조성물을 해유화시켜, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 개시되어 있다.
본원에는, 하나 이상의 미생물로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUMA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서, (a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (b) 하나 이상의 베타-글루카나제 효소를 첨가함을 동반하여 상기 해유화된 세포 조성물을 해유화시켜, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 오일을 회수하는 단계를 포함하되, 여기서 (a) 단계 또는 (b) 단계 중 하나 이상이, 상기 조성물을 60℃ 이상의 온도로 가열함을 추가로 포함하는, 방법이 개시되어 있다.
본원에는, 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUFA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서, (a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (b) 하나 이상의 베타-글루카나제 효소를 첨가하고 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 약 8 이상으로 올림을 동반하여 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시켜, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 오일을 회수하는 단계를 포함하는, 방법이 개시되어 있다.
본원에는, 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUFA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서, (a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해시켜, 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (b) 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시켜, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; (c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리하는 단계; 및 (d) 상기 오일을 회수하는 단계를 포함하되, 여기서 (a) 단계 및 (b) 단계를 서로 조합하여, 하나 이상의 베타-효소를 첨가함을 포함하는 1단계 용해 및 해유화 단계를 형성하는, 방법이 개시되어 있다.
본원에는, 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산(PUFA)을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서, (a) 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하기에 적합한 하나 이상의 효소로 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해시키는 단계; (b) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 오일을 회수하는 단계를 포함하되, 여기서 상기 해유화된 용해된 세포 조성물이 용해 도중에 수득되는, 방법이 개시되어 있다.
본원에는, 본원에서 기술한 임의의 방법에 의해 수득되는 미생물 오일이 개시되어 있다.
본 발명의 특징부 및 장점은, 당업계의 숙련자들이 하기 상세한 설명을 읽으면, 보다 용이하게 이해될 수도 있다. 명확하게 하기 위해서 개별적인 실시양태의 문맥에서 앞에서 및 이후에 설명되는 본 발명의 특정 특징부는, 또한 조합되어서 그의 하부 조합들을 형성할 수도 있음이 인식되어야 한다.
본원에서 예로서 확인된 실시양태는 설명하기 위한 것이지 제한하기 위한 것이 아니다.
"약"이라는 용어는, 언급된 숫자와 실질적으로 동일한 결과를 달성할 수도 있는 언급된 숫자의 앞과 뒤의 편차를 담아내고자 한다.
지방산은, 탄소쇄의 길이 및 포화 특징부에 기초하여 분류된다. 미생물 오일에 존재하는 지방산은 4 내지 28개의 탄소 원자를 가질 수 있고, 쇄에 존재하는 탄소의 갯수에 기초하여, 단쇄, 중간쇄 또는 장쇄 지방산으로 지칭한다. 지방산은, 탄소 원자들 사이에 어떠한 이중 결합도 존재하지 않으면, 포화 지방산으로 지칭하고, 이중 결합이 존재하면, 불포화 지방산으로 지칭한다. 불포화 장쇄 지방산의 경우, 단지 하나의 이중 결합이 존재하면, 단일불포화된 것이고, 하나 초과의 이중 결합이 존재하면, 다중불포화된 것이다.
본원에 기술된 미생물 오일은, 미생물 세포로부터 수득되고 하나 이상의 PUFA를 포함하는 오일을 지칭한다.
다중불포화 지방산(PUFA)은, 지방산의 메틸 말단으로부터 첫번째 이중 결합의 위치에 기초하여 분류하며; 오메가-3 (n-3) 지방산은 3번째 탄소에 첫번째 이중 결합을 함유하는 반면, 오메가-6 (n-6) 지방산은 6번째 탄소에 첫번째 이중 결합을 함유한다. 예를 들어, 도코사헥사엔산(DHA)은 22개의 탄소의 쇄 길이 및 6개의 이중 결합을 갖는, 오메가-3 장쇄 다중불포화 지방산(LC PUFA)으로서, 종종 "22:6n-3"으로 표시된다. 하나의 실시양태에서, PUFA는 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산, 및 이들의 혼합물 중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, PUFA는 LC-PUFA 중에서 선택된다. 여전히 추가의 실시양태에서, PUFA는 도코사헥사엔산 (DHA), 에이코사펜타엔산 (EPA), 도코사펜타엔산 (DPA), 아르아키돈산 (ARA), 감마-리놀렌산 (GLA), 다이호모-감마-리놀렌산 (DGLA), 스테아리돈산 (SDA), 및 이들의 혼합물 중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, PUFA는 DHA, ARA, 및 이들의 혼합물 중에서 선택된다. 추가의 실시양태에서, PUFA는 DHA이다. 여전히 추가의 실시양태에서, PUFA는 ARA이다.
LC-PUFA는 3개 이상의 이중 결합을 함유하는 지방산이고 18개 이상의 탄소 또는 20개 이상의 탄소의 길이의 쇄를 갖는다. 오메가-6 시리즈의 LC-PUFA는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 다이-호모-감마리놀레산 (C20:3n-6), 아르아키돈산 (C20:4n-6) ("ARA"), 도코사테트라엔산 또는 아드렌산 (C22:4n-6), 및 도코사펜타엔산 (C22:5n-6) ("DPA n-6")을 포함한다. 오메가-3 시리즈의 LC-PUFA는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 에이코사트라이엔산 (C20:3n-3), 에이코사테트라엔산 (C20:4n-3), 에이코사펜타엔산 (C20:5n-3) ("EPA"), 도코사펜타엔산 (C22:5n-3), 및 도코사헥사엔산 (C22:6n-3)을 포함한다. LC-PUFA는, 또한 이로서 한정하는 것은 아니지만, C24:6(n-3) 및 C28:8(n-3)을 비롯한, 22개 초과의 탄소 및 4개 이상의 이중결합을 갖는 지방산을 포함한다.
PUFA는, 유리 지방산, 염, 지방산 에스터(예를 들어, 메틸 또는 에틸 에스터), 모노아실글리세롤 (MAG), 다이아실글리세롤 (DAG), 트라이아실글리세롤 (TAG), 및/또는 인지질(PL)의 형태일 수 있다.
고도로 불포화된 지방산(HUFA)이 4 이상의 불포화 탄소-탄소 결합을 함유하는 오메가-3 및/또는 오메가-6 다중불포화 지방산이다.
본원에 사용될 때, "세포"란, 유질 미생물로부터 유도된 생체적합물질과 같은 오일-함유 생체적합물질을 지칭한다. 미생물 세포로부터 수득되거나 미생물에 의해 제조되는 오일을 "미생물 오일"로 지칭한다. 조류 및/또는 균류에 의해 제조된 오일은 또한 조류 및/또는 균류 오일로 각각 지칭한다.
본원에 사용될 때, "미생물 세포" 또는 "미생물"은 조류, 박테리아, 균류, 원생생물, 효모, 및 이들의 조합, 예를 들어 단세포 생물과 같은 유기체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 미생물 세포는 진핵 세포이다. 미생물 세포는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 황조류(예를 들어, 색조류계의 미생물); 녹조류; 규조류;와편모조류(예를 들어 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium cohnii) 또는 씨. 코니(C. cohnii)와 같은 크립테코디늄 속의 구성원을 비롯한 와편모조강목의 미생물); 트라우스토키트리알(Thraustochytriales) 목의 미세조류; 효모(자낭균류 또는 담자균류); 및 뮤코(Mucor), 또는 모르티에렐라(Mortierella) 속(이로서 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) 및 모르티에렐라 섹트. 슈뮤케리(Mortierella sect. schmuckeri), 및 피티움(Pythium) 속(이로서 한정하는 것은 아니지만, 피티움 인시디오숨(Pythium insidiosum))의 균류를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 미생물 세포는, 모르티에렐라 속, 크립테코디늄 속, 또는 트라우스토키트리알 목으로부터인 것이다. 여전히 추가의 실시양태에서, 미생물 세포는 크립테코디늄 코니로부터인 것이다. 여전의 추가의 실시양태에서, 미생물 세포는 크립테코디늄 코니, 모르티에렐라 알피나, 트라우스토키트리움 속, 스키조키트리움 속, 및 그의 혼합물 중에서 선택된다.
여전히 추가의 실시양태에서, 미생물 세포는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 모르티에렐라 속, 코니디오볼루스(Conidiobolus) 속, 피티움(Pythium) 속, 피토프토라(Phytophthora) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 클라도스포리움(Cladosporium) 속, 무코(Mucor) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 아스페르질루스(Aspergillus) 속, 로도토룰라(Rhodotorula ) 속, 엔토모프토라(Entomophthora ) 속, 에키노스포란지움(Echinosporangium) 속, 및 사프롤레그니아(Saprolegnia) 속으로부터인 미생물 중에서 선택된다. 추가의 실시양태에서, ARA는, 모르티에렐라 에롱가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 모르티에렐라 히그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS529.72, CBS608.70과 CBS754.68, 및 이들의 돌연변이체로부터인 미생물로부터 수득된다.
심지어 추가로, 미생물 세포는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속(종은 아루디멘탈(arudimentale), 아우리움(aureum), 벤티콜라(benthicola), 글로보숨(globosum), 키니(kinnei), 모티븀(motivum), 물티루디멘탈(multirudimentale), 파치데르뮴(pachydermum), 프로리페룸(proliferum), 로시움(roseum), 스트리아툼(striatum)을 포함함); 스키조키트리움(Schizochytrium) 속(종은 아그레타튬(aggregatum), 림나세움(limnaceum), 망그로비(mangrovei), 미누툼(minutum), 옥토스포룸(octosporum)을 포함함); 울케니아(Ulkenia) 속(종은 아모에보이디아(amoeboidea), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 미누타(minuta), 프로펀다(profunda), 라디에이트(radiate), 사일렌스(sailens), 사르카리아나(sarkariana), 쉬조키트롭스(schizochytrops), 비수르젠시스(visurgensis), 요르켄시스(yorkensis)); 우란티아코치트리움(Aurantiacochytrium) 속; 오브롱기트리움(Oblongichytrium) 속; 시사이오이도키트리움(Sicyoidochytium) 속; 파리엔티키트리움(Parientichytrium) 속; 보트리오키트리움(Botryochytrium) 속 및 이들의 조합을 포함하는, 트라우스토키트리알 목의 미세조류로부터인 것이다. 울케니아에서 기술된 종은, 스키조키트리움 속의 구성원으로 고려될 것이다. 또다른 실시양태에서, 미생물 세포는 트라우스토키트리알 목으로부터인 것이다. 심지어 또다른 실시양태에서, 미생물 세포는 트라우스토키트리움으로부터인 것이다. 여전히 추가의 실시양태에서, 미생물 세포는 스키조키트리움으로부터인 것이다. 여전히 추가의 실시양태에서, 미생물 세포는, 트라우스토키트리움 속, 스키조키트리움 속, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된다.
하나의 실시양태에서, 상기 방법은 미생물 오일을 포함하는 미생물 세포를 용해하여, 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계를 포함한다. "용해" 및 "용해하는"이라는 용어는, 미생물 세포의 벽 및/또는 막이 파열되는 공정을 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 미생물 세포는, 기계적, 화학적, 효소, 물리적 및 이들의 조합 중에서 선택된 하나 이상의 처리에 적용됨으로써 용해된다. 또다른 실시양태에서, 상기 공정은, 미생물 오일을 포함하는 미생물 세포를 용해시켜, 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계를 포함하되, 여기서 용해는, 기계적, 화학적, 효소, 물리적 및 이들의 조합 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 세포를 용해시키기 이전에, 세포는 세척 및/또는 저온살균될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 세척하는 것은, 임의의 세포밖의 수용성 또는 수-분산성 화합물을 제거하기 위해서, 물과 같은 수용액을 사용함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는, 1회, 2회, 3회 또는 그 이상으로 세척될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 저온살균하는 것은, 세포를 가열하여 임의의 원치않는 효소, 예를 들어 오일을 열화시키거나 PUFA의 수율을 줄이는 임의의 효소를 불활성화함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해 전에 세포는 세척되고 그다음 저온살균된다. 일부 실시양태에서, 용해된 세포는, 발효액에 함유된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 미생물 오일을 포함하는 미세척된 미생물 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 미생물 오일을 포함하는 미생물 세포를 포함하는 발효액은, 먼저, 예를 들어, 물로 세척되고, 그다음 상기 세포는 용해되어 용해된-세포 조성물을 형성한다. 또다른 실시양태에서, 상기 방법은 발효 배지에 미세척된 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계를 포함한다.
기계적 처리는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 균질화, 초음파, 냉압, 밀링, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 균질화에 의해 세포를 용해함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 균질화기에 의해 세포를 용해함을 포함한다.
균질화는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 프렌치 세포 프레스, 소니케이터, 균일화기, 미세유동화기, 볼 밀, 막대 밀, 페블 밀, 비드 밀, 고압 연식 롤, 수직형 쇄프트 인팩터, 산업용 블렌더, 고 전단 혼합기, 패들 혼합기, 폴리트론 균질화기, 산업용 균질화기(예를 들어, 니로 소아비 VHP 균질화기(Niro Soavi VHP Homogenizer) 및 APV 라니(APV Rannie)와 APV 가울린 균질화기(APV Gaulin homogenizers)), 산업용 고전단 유체 프로세서(예를 들어, 마이크로플루이드 고전단 유체 프로세서(Microfluidics high shear fluid processor)), 세포 용해/비드 밀 균질화기(예를 들어, 다이노-밀(Dyno-Mill) 및 뷰흘러(Buhler)), 및 이들의 조합을 사용하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는, 선택적으로 가열되는 균질하기를 통해 여과한다. 일부 실시양태에서, 적합한 균질화는, 높은 및/또는 낮은 압력에서 균질화기를 통해 1회 내지 3회 통과할 수 있다.
일부 실시양태에서, 균질화 동안의 압력은, 150 바 내지 1,400 바; 150 바 내지 1,200 바; 150 바 내지 900 바; 150 바 내지 300 바; 300 바 내지 1,400 바; 300 바 내지 1,200 바; 300 바 내지 900 바; 400 바 내지 800 바; 500 바 내지 700 바; 또는 600 바이다. 일부 실시양태에서, 균질화 동안의 압력은, 2,000 psi 내지 20,000 psi; 2,000 psi 내지 18,000 psi; 2,000 psi 내지 16,000 psi; 2,000 psi 내지 14,000 psi; 2,000 psi 내지 12,000 psi; 2,000 psi 내지 10,000 psi; 2,000 psi 내지 8,000 psi; 2,000 psi 내지 6,000 psi; 2,000 psi 내지 4,000 psi; 4,000 psi 내지 20,000 psi; 4,000 psi 내지 18,000 psi; 4,000 psi 내지 16,000 psi; 4,000 psi 내지 14,000 psi; 4,000 psi 내지 12,000 psi; 4,000 psi 내지 10,000 psi; 4,000 psi 내지 8,000 psi; 4,000 psi 내지 6,000 psi; 6,000 psi 내지 20,000 psi; 6,000 psi 내지 18,000 psi; 6,000 psi 내지 16,000 psi; 6,000 psi 내지 14,000 psi; 6,000 psi 내지 12,000 psi; 6,000 psi 내지 10,000 psi; 6,000 psi 내지 8,000 psi; 8,000 psi 내지 20,000 psi; 8,000 psi 내지 18,000 psi; 8,000 psi 내지 16,000 psi; 8,000 psi 내지 14,000 psi; 8,000 psi 내지 12,000 psi; 8,000 psi 내지 10,000 psi; 10,000 psi 내지 20,000 psi; 10,000 psi 내지 18,000 psi; 10,000 psi 내지 16,000 psi; 10,000 psi 내지 14,000 psi; 10,000 psi 내지 12,000 psi; 12,000 psi 내지 20,000 psi; 12,000 psi 내지 18,000 psi; 12,000 psi 내지 16,000 psi; 12,000 psi 내지 14,000 psi; 14,000 psi 내지 20,000 psi; 14,000 psi 내지 18,000 psi; 14,000 psi 내지 16,000 psi; 16,000 psi 내지 20,000 psi; 16,000 psi 내지 18,000 psi; 또는 18,000 psi 내지 20,000 psi이다.
일부 실시양태에서, 미생물 세포는 균질화되기 이전에 고 전단 혼합기에서 혼합된다. 일부 실시양태에서, 고 전단 혼합기는, 5,000 rpm 이상; 7,500 rpm 이상; 10,000 rpm 이상; 12,500 rpm 이상; 15,000 rpm 이상; 5,000 rpm 내지 15,000 rpm; 5,000 rpm 내지 12,500 rpm; 5,000 rpm 내지 10,000 rpm; 5,000 rpm 내지 7,500 rpm; 7,500 rpm 내지 15,000 rpm; 7,500 rpm 내지 12,500 rpm; 7,500 rpm 내지 10,000 rpm; 10,000 rpm 내지 15,000 rpm; 10,000 rpm 내지 12,500 rpm; 또는 12,500 rpm 내지 15,000 rpm의 범위에서 작동한다.
물리적 처리는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 가열, 예를 들어 이로서 한정하는 것은 아니지만, 저항성, 대류, 증기, 유체욕, 태양 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 벽 내부에 및/또는 위에 벽저항성 코일을 갖는 탱크에서 가열된다. 일부 실시양태에서, 세포는, 이를 통과하는 튜브를 보유한 액체욕에서 가열된다.
화학적 처리는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 세포의 pH를 높이는 것; 세포의 pH를 낮추는 것; 세포와 화학물질의 접촉; 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는, 세포의 pH를 높임으로서, 용해된다. 일부 실시양태에서, 염기를 첨가함으로써 pH가 높아진다. 염기는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 수산화물(예를 들어, LiOH, NaOH, KOH, 및 Ca(OH)2, 및 이들의 조합); 카보네이트(예를 들어, Na2CO3, K2CO3, MgCO3, 및 이들의 조합); 바이카보네이트(예를 들어, LiHCO3, NaHCO3, KHCO3, 및 이들의 조합); 및 이들의 조합을 포함한다. 염기는, 고체(예를 들어, 결정, 과립 및 펠렛); 액체(예를 들어, 수용액); 및 이들의 조합의 형태일 수 있다.
일부 실시양태에서, 염기의 pKb는 1 내지 12, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 3 내지 10, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 6, 5 내지 10, 또는 5 내지 8이다. 본원에 사용될 때, "pKb"란, 염기의 염기 결합 상수, Kb의 -log를 지칭한다. Kb는 물에서의 염기의 이온화에 대한 평형 상수를 지칭하되, 여기서
일부 실시양태에서, pH는, 약 8 이상; 약 9 이상; 약 10 이상; 약 11 이상; 및 약 12 이상 중에서 선택된다. 다른 실시양태에서, pH는 7 내지 13; 7 내지 12; 7 내지 11; 7 내지 10; 7 내지 9; 8 내지 13; 8 내지 12; 8 내지 11; 8 내지 10; 8 내지 9; 9 내지 12; 9 내지 11; 9 내지 10; 10 내지 12; 및 10 내지 11 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 세포의 pH는 클로르알칼리 방법에 의해 상승될 수 있다. 일부 실시양태에서, 염화나트륨 및 세포를 함유하는 발효액을 전기분해에 적용하자, 결과적으로 수산화나트륨이 형성되고, 이는 세포의 pH를 높인다. 일부 실시양태에서, 상기 발효액은 염화나트륨 대신에, 또는 염화나트륨 이외에 염화칼슘 또는 염화칼륨을 포함하고, 전기분해는 결과적으로 수산화칼슘 또는 수산화칼륨을 각각 형성하고, 이로써 세포의 pH가 높아진다.
일부 실시양태에서, 세포의 pH를 낮춤으로써 세포가 용해된다. 일부 실시양태에서, pH는 산을 첨가함으로써 낮아진다. 산은, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 황산; 인산; 염화수소산; 브롬화수소산; 요오드화수소산; 차아염소산; 아염소산; 염소산; 과염소산; 플루오로황산; 질산; 플루오로안티몬산; 플루오로붕산; 헥사플루오로인산; 크롬산; 붕산; 아세트산; 시트르산; 폼산; 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, pH는, 약 7 이하; 약 6.5 이하; 약 6 이하; 약 5.5 이하; 약 5 이하; 약 4.5 이하; 약 4 이하; 약 3.5 이하; 약 3 이하; 약 2.5 이하; 약 2 이하; 약 1.5 이하; 약 1 이하; 및 약 0.5 이하 중에서 선택된다. 다른 실시양태에서, pH는 약 0.5 내지 약 7; 약 0.5 내지 약 6.5; 약 0.5 내지 약 6; 약 0.5 내지 약 5.5; 약 0.5 내지 약 5; 약 0.5 내지 약 4.5; 약 0.5 내지 약 4; 약 0.5 내지 약 3.5; 약 0.5 내지 약 3; 약 0.5 내지 약 2.5; 약 0.5 내지 약 2; 약 0.5 내지 약 1.5; 약 0.5 내지 약 1; 약 1 내지 약 7; 약 1 내지 약 6.5; 약 1 내지 약 6; 약 1 내지 약 5.5; 약 1 내지 약 5; 약 1 내지 약 4.5; 약 1 내지 약 4; 약 1 내지 약 3.5; 약 1 내지 약 3; 약 1 내지 약 2.5; 약 1 내지 약 2; 약 1 내지 약 1.5; 약 1.5 내지 약 7; 약 1.5 내지 약 6.5; 약 1.5 내지 약 6; 약 1.5 내지 약 5.5; 약 1.5 내지 약 5; 약 1.5 내지 약 4.5; 약 1.5 내지 약 4; 약 1.5 내지 약 3.5; 약 1.5 내지 약 3; 약 1.5 내지 약 2.5; 약 1.5 내지 약 2; 약 2 내지 약 7; 약 2 내지 약 6.5; 약 2 내지 약 6; 약 2 내지 약 5.5; 약 2 내지 약 5; 약 2 내지 약 4.5; 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 3.5; 약 2 내지 약 3; 약 2 내지 약 2.5; 약 2.5 내지 약 7; 약 2.5 내지 약 6.5; 약 2.5 내지 약 6; 약 2.5 내지 약 5.5; 약 2.5 내지 약 5; 약 2.5 내지 약 4.5; 약 2.5 내지 약 4; 약 2.5 내지 약 3.5; 약 2.5 내지 약 3; 약 3 내지 약 7; 약 3 내지 약 6.5; 약 3 내지 약 6; 약 3 내지 약 5.5; 약 3 내지 약 5; 약 3 내지 약 4.5; 약 3 내지 약 4; 약 3 내지 약 3.5; 약 3.5 내지 약 7; 약 3.5 내지 약 6.5; 약 3.5 내지 약 6; 약 3.5 내지 약 5.5; 약 3.5 내지 약 5; 약 3.5 내지 약 4.5; 약 3.5 내지 약 4; 약 4 내지 약 7; 약 4 내지 약 6.5; 약 4 내지 약 6; 약 4 내지 약 5.5; 약 4 내지 약 5; 약 4 내지 약 4.5; 약 4.5 내지 약 7; 약 4.5 내지 약 6.5; 약 4.5 내지 약 6; 약 4.5 내지 약 5.5; 약 4.5 내지 약 5; 약 5 내지 약 7; 약 5 내지 약 6.5; 약 5 내지 약 6; 약 5 내지 약 5.5; 약 5.5 내지 약 7; 약 5.5 내지 약 6.5; 약 5.5 내지 약 6; 약 6 내지 약 7; 약 6 내지 약 6.5; 및 약 6.5 내지 약 7 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 산은, pH를 낮추기 위해서, 세포 브로쓰의 중량(또는 체적) 기준으로, 약 2% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 9%, 약 2% 내지 약 8%, 약 2% 내지 약 7%, 약 2% 내지 약 6%, 약 3% 내지 약 6%, 약 4% 내지 약 6%, 약 5% 내지 약 6%, 약 2% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 4%, 약 2% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 4%, 또는 약 4% 내지 약 5%의 양으로 첨가된다.
효소 처리는, 하나 이상의 효소와 세포를 접촉시킴으로써 세포를 용해함을 지칭한다. 효소는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 프로테아제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 키티나제, 펙티나제, 및 이들의 조합을 포함한다. 프로테아제의 비-제한적인 예는, 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파르테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 알라카제, 및 이들의 조합을 포함한다. 셀룰라제의 비-제한적인 예는, 수크라제, 말타제, 락타제, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 아밀라제, 라이소자임, 뉴라미니다제, 갈락토시다제, 알파-만노시다제, 글루쿠로니다제, 하이알루로니다제, 풀루라나아제, 글루코세레브로시다제, 갈락토실세라미다제, 아세틸갈락토사미니다제, 푸코시다제, 헥소사미니다제, 이두로니다제, 말타스-글루코아밀라제, 및 이들의 조합을 포함한다. 키티나제의 비-제한적인 예는 키토트리오시다제를 포함한다. 펙티나제의 비-제한적인 예는, 펙톨리아제, 펙토자임, 폴리갈락투로나제, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 일부 효소는 가열에 의해 활성화된다. 일부 실시양태에서, 세포의 용해는, 효소의 사용을 동반하지 않는다.
본원에 사용될 때, "용해된 세포 조성물"이라는 용어는, 세포 잔해 및 세포의 기타 내용물을 비롯한 하나 이상의 용해된 세포를, 미생물 오일(용해된 세포로부터) 및 선택적으로, 액체(예를 들어, 물), 영양소 및 미생물 세포를 함유하는 배양액과 함께, 포함하는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 미생물 세포는 발효액 또는 물을 포함하는 배지에 함유된다. 일부 실시양태에서, 용해된 세포 조성물은, 하나 이상의 용해된 세포, 세포 잔해, 미생물 오일, 세포의 천연 내용물, 및 발효액으로부터의 수성 성분을 포함하는 조성물을 지칭한다. 하나의 실시양태에서, 용해된 세포 조성물은 액체, 세포 잔해, 및 미생물 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해된 세포 조성물은, 연속적인 수성상 및 분산된 오일상의 혼합물을 포함하는 수중유 유화액의 형태이다. 일부 실시양태에서, 분산된 오일상은, 유화된 용해된 세포 조성물의 중량(또는 체적) 기준으로, 약 1% 내지 약 60%; 약 1% 내지 약 50%; 약 1% 내지 약 40%; 약 1% 내지 약 30%; 약 1% 내지 약 20%; 약 5% 내지 약 60%; 약 5% 내지 약 50%; 약 5% 내지 약 40%; 약 5% 내지 약 30%; 약 5% 내지 약 20%; 약 10% 내지 약 60%; 약 10% 내지 약 50%; 약 10% 내지 약 40%; 약 20% 내지 약 60%; 20% 내지 50%, 20% 내지 약 40%; 약 30% 내지 약 60%; 약 30% 내지 약 50%; 또는 약 40% 내지 약 60%의 농도로 존재한다.
일부 실시양태에서, 미생물 세포를 용해하면, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 단백질, 인지질, 탄수화물, 및 이들의 조합을 포함하는, 세포 또는 세포 바이오매스 내 내생 물질로부터 유화액이 형성된다. 임의의 구체적인 이론으로 제한하는 것은 아니지만, 본 발명의 방법은 유화된 용해된 세포 조성물을 깨거나 해유화시켜, 용해된 세포 조성물로부터 미생물 오일을 분리하도록 하는 것으로 여겨진다. "유화" 및 "유화된"이란 용어는, 하나의 상 또는 층이 또다른 상 또는 층에 분산되어 있는 2종 이상의 불혼화성 상 또는 층의 혼합물을 지칭한다. "파괴하다" "깨다", "해유화시키다", "해유화", "해유화시키는" 및 "깨는"은, 유화액의 불혼화성 상 또는 층을 분리하는 공정을 지칭한다. 예를 들어, 해유화된 용해된 세포 조성물을 해유화 또는 깨는 것은, 해유화된 용해된 세포 조성물이 하나 이상의 상 또는 층을 갖는 유화액으로부터 2종 이상의 상 또는 층을 갖는 조성물로 변하는 공정을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 유화된 용해된 세포 조성물을 단일상으로부터 2종 이상의 상으로 깬다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 상은 오일상 및 수성상을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 공정은 유화된 용해된 세포 조성물을 3개 이상의 상으로 깬다. 일부 실시양태에서, 3개의 상은, 오일상, 수성상, 및 고체상 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 상들은 오일상, 유화액 상, 수성상, 및 고체상 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 해유화 동안 형성된 오일 액적의 평균 입경은, 5 ㎛ 내지 50 ㎛; 5 ㎛ 내지 45 ㎛; 5 ㎛ 내지 40 ㎛; 5 ㎛ 내지 35 ㎛; 5 ㎛ 내지 30 ㎛; 5 ㎛ 내지 25 ㎛; 5 ㎛ 내지 20 ㎛; 5 ㎛ 내지 15 ㎛; 10 ㎛ 내지 50 ㎛; 10 ㎛ 내지 45 ㎛; 10 ㎛ 내지 40 ㎛; 10 ㎛ 내지 35 ㎛; 10 ㎛ 내지 30 ㎛; 10 ㎛ 내지 25 ㎛; 10 ㎛ 내지 20 ㎛; 10 ㎛ 내지 15 ㎛; 15 ㎛ 내지 50 ㎛; 15 ㎛ 내지 45 ㎛; 15 ㎛ 내지 40 ㎛; 15 ㎛ 내지 35 ㎛; 15 ㎛ 내지 30 ㎛; 15 ㎛ 내지 25 ㎛; 15 ㎛ 내지 20 ㎛; 20 ㎛ 내지 50 ㎛; 20 ㎛ 내지 45 ㎛; 20 ㎛ 내지 40 ㎛; 20 ㎛ 내지 35 ㎛; 20 ㎛ 내지 30 ㎛; 20 ㎛ 내지 25 ㎛; 25 ㎛ 내지 50 ㎛; 25 ㎛ 내지 45 ㎛; 25 ㎛ 내지 40 ㎛; 25 ㎛ 내지 35 ㎛; 25 ㎛ 내지 30 ㎛; 30 ㎛ 내지 50 ㎛; 30 ㎛ 내지 45 ㎛; 30 ㎛ 내지 40 ㎛; 30 ㎛ 내지 35 ㎛; 35 ㎛ 내지 50 ㎛; 35 ㎛ 내지 45 ㎛; 35 ㎛ 내지 40 ㎛; 40 ㎛ 내지 50 ㎛; 40 ㎛ 내지 45 ㎛; 및 45 ㎛ 내지 50 ㎛ 중에서 선택된다. 추가의 실시양태에서, 해유화 동안 형성된 오일 액적의 평균 입경은, 10 ㎛ 이상, 15 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상, 25 ㎛ 이상, 30 ㎛ 이상, 35 ㎛ 이상, 및 40 ㎛ 이상 중에서 선택된다. 추가의 실시양태에서, 해유화 도중 형성된 오일 액적의 평균 입경은, 10 ㎛ 이상, 15 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상, 및 25 ㎛ 이상 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 평균 입경은, 예를 들어 베크만 카울터(Beckman Coulter) LS 13 320 입경 분석기(베크만 카울터, 미국 캘리포니아주 브리아 소재)를 사용하여 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 평균 입경은, 예를 들어 말번(Malvern) MS2000 입경 분석기(말번 인스트루먼트 리미티드(Malvern Instruments Ltd.), 영국 워세터샤이어 소재)를 사용하여 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 해유화된 용해된 세포 조성물은 하나 이상의 효소를 첨가함으로써 형성된다. 일부 실시양태에서, 해유화된 용해된 세포 조성물은, 하나 이상의 효소 칵테일을 첨가함으로써 형성된다. 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하기에 적합한 효소는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 베타-글루카나제(예를 들어, 비노플로우 맥스(Vinoflow Max)(노보자임 코포레이션(Novozymes Corp.)) 및 브로우자임(Brewzyme) LP(다이아딕 인터내셔널(Dyadic Int.))); 자일라나제(예를 들어, 자일라나제 플러스(Xylanase Plus)(다이아딕 인터내셔널) 및 펜토판(Pentopan)(노보자임 코포레이션)); 셀룰라제(예를 들어, 셀루스타(Cellustar) CL (다이아딕 인터내셔널), 피브레자임(Fibrezyme) G2000 (다이아딕 인터내셔널), 셀루클라스트 (노보자임 코포레이션), 펑가밀 (노보자임 코포레이션), 및 비스코자임 L (노보자임 코포레이션))); 펙티나제 (예를 들어, 펙티넥스(노보자임 코포레이션)); 만나나제; 아밀라제 (예를 들어, 알파스타 플러스(Alphastar Plus)(다이아딕 인터내셔널) 및 테르마밀(노보자임 코포레이션)); 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 해유화된 용해된 세포 조성물은, 베타-글루카나제, 자일라나제, 셀룰라제, 펙티나제, 만나나제, 아밀라제, 및 이들의 조합 중에서 선택된 하나 이상의 효소를 첨가함으로써 형성된다. 다른 실시양태에서, 해유화된 용해된 세포 조성물은, 하나 이상의 베타-글루카나제 효소를 첨가함으로써 형성된다.
일부 실시양태에서, 해유화된 용해된 세포 조성물은, 효소(예를 들어, 분말 형태 또는 용액으로)를, 조성물의 중량(또는 체적) 기준으로, 약 0.05% 내지 약 10%, 약 0.05% 내지 약 9%, 약 0.05% 내지 약 8%, 약 0.05% 내지 약 7%, 약 0.05% 내지 약 6%, 약 0.05% 내지 약 5%, 약 0.05% 내지 약 4%, 약 0.05% 내지 약 3%, 약 0.05% 내지 약 2%, 약 0.05% 내지 약 1%, 약 0.05% 내지 약 0.5%, 약 0.05% 내지 약 0.1%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.1% 내지 약 9%, 약 0.1% 내지 약 8%, 약 0.1% 내지 약 7%, 약 0.1% 내지 약 6% , 약 0.1% 내지 약 5%, 약 0.1% 내지 약 4%, 약 0.1% 내지 약 3%, 약 0.1% 내지 약 2%, 약 0.1% 내지 약 1%, 약 0.1% 내지 약 0.5%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 9%, 약 0.5% 내지 약 8%, 약 0.5% 내지 약 7%, 약 0.5% 내지 약 6% , 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 3%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 9%, 약 1% 내지 약 8%, 약 1% 내지 약 7%, 약 1% 내지 약 6%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 4%, 약 1% 내지 약 3%, 및 약 1% 내지 약 2%의 양으로 첨가함으로써 형성된다. 추가의 실시양태에서, 해유화된 용해된 세포 조성물은, 효소를, 상기 조성물의 중량(또는 체적) 기준으로, 약 10% 미만, 약 9% 미만, 약 8% 미만, 약 7% 미만, 약 6% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만, 약 1% 미만, 및 약 0.5% 미만으로 첨가함으로써 형성된다.
일부 실시양태에서, 해유화된 용해된 세포 조성물의 형성 방법은 추가로 유화제를 첨가함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 유화제는 내생 물질에 의해 형성된 유화액을 대체하는데, 그 이유는 PUFA가 내생 물질(예를 들어, 단백질, 인지질, 및 탄수화물)보다 유화제에 대해 보다 강한 친화성을 갖기 때문이다. 일부 실시양태에서, 유화제에 의해 형성된 유화액은, 내생 물질에 의해 형성된 유화액보다 안정하다. 일부 실시양태에서, 유화제에 의해 형성된 유화액은, 내생 물질에 의해 형성된 유화액보다, 본원에서 기술된 방법을 사용하여 보다 용이하게 해유화된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 용해된 세포 조성물의 pH를 낮춤으로써 용해된 세포 조성물을 해유화시킴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 산을 첨가함으로써, pH가 낮아진다. 산은, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 황산; 인산; 염화수소산; 브롬화수소산; 요오드화수소산; 차아염소산; 아염소산; 염소산; 과염소산; 플루오로황산; 질산; 플루오로안티몬산; 플루오로붕산; 헥사플루오로인산; 크롬산; 붕산; 아세트산; 시트르산; 폼산; 및 이들의 혼합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, pH는, 7 이하; 약 6.5 이하; 약 6 이하; 약 5.5 이하; 약 5 이하; 약 4.5 이하; 약 4 이하; 약 3.5 이하; 약 3 이하; 약 2.5 이하; 약 2 이하; 약 1.5 이하; 약 1 이하; 및 약 0.5 이하 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 용해된 세포 조성물의 pH를 약 6 이하로 낮춤을 포함한다. 다른 실시양태에서, pH는 약 0.5 내지 약 7; 약 0.5 내지 약 6.5; 약 0.5 내지 약 6; 약 0.5 내지 약 5.5; 약 0.5 내지 약 5; 약 0.5 내지 약 4.5; 약 0.5 내지 약 4; 약 0.5 내지 약 3.5; 약 0.5 내지 약 3; 약 0.5 내지 약 2.5; 약 0.5 내지 약 2; 약 0.5 내지 약 1.5; 약 0.5 내지 약 1; 약 1 내지 약 7; 약 1 내지 약 6.5; 약 1 내지 약 6; 약 1 내지 약 5.5; 약 1 내지 약 5; 약 1 내지 약 4.5; 약 1 내지 약 4; 약 1 내지 약 3.5; 약 1 내지 약 3; 약 1 내지 약 2.5; 약 1 내지 약 2; 약 1 내지 약 1.5; 약 1.5 내지 약 7; 약 1.5 내지 약 6.5; 약 1.5 내지 약 6; 약 1.5 내지 약 5.5; 약 1.5 내지 약 5; 약 1.5 내지 약 4.5; 약 1.5 내지 약 4; 약 1.5 내지 약 3.5; 약 1.5 내지 약 3; 약 1.5 내지 약 2.5; 약 1.5 내지 약 2; 약 2 내지 약 7; 약 2 내지 약 6.5; 약 2 내지 약 6; 약 2 내지 약 5.5; 약 2 내지 약 5; 약 2 내지 약 4.5; 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 3.5; 약 2 내지 약 3; 약 2 내지 약 2.5; 약 2.5 내지 약 7; 약 2.5 내지 약 6.5; 약 2.5 내지 약 6; 약 2.5 내지 약 5.5; 약 2.5 내지 약 5; 약 2.5 내지 약 4.5; 약 2.5 내지 약 4; 약 2.5 내지 약 3.5; 약 2.5 내지 약 3; 약 3 내지 약 7; 약 3 내지 약 6.5; 약 3 내지 약 6; 약 3 내지 약 5.5; 약 3 내지 약 5; 약 3 내지 약 4.5; 약 3 내지 약 4; 약 3 내지 약 3.5; 약 3.5 내지 약 7; 약 3.5 내지 약 6.5; 약 3.5 내지 약 6; 약 3.5 내지 약 5.5; 약 3.5 내지 약 5; 약 3.5 내지 약 4.5; 약 3.5 내지 약 4; 약 4 내지 약 7; 약 4 내지 약 6.5; 약 4 내지 약 6; 약 4 내지 약 5.5; 약 4 내지 약 5; 약 4 내지 약 4.5; 약 4.5 내지 약 7; 약 4.5 내지 약 6.5; 약 4.5 내지 약 6; 약 4.5 내지 약 5.5; 약 4.5 내지 약 5; 약 5 내지 약 7; 약 5 내지 약 6.5; 약 5 내지 약 6; 약 5 내지 약 5.5; 약 5.5 내지 약 7; 약 5.5 내지 약 6.5; 약 5.5 내지 약 6; 약 6 내지 약 7; 약 6 내지 약 6.5; 및 약 6.5 내지 약 7 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 용해된 세포 조성물의 pH를 약 0.5 내지 약 6으로 낮춤을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 산을, 세포 브로쓰 또는 용해된 세포 조성물의 중량(또는 체적) 기준으로, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 15%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 9%, 약 0.5% 내지 약 8%, 약 0.5% 내지 약 7%, 약 0.5% 내지 약 6%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 3%, 약 0.5% 내지 약 2%, 및 약 0.5% 내지 약 1%의 양으로 첨가함으로써, 용해된 세포 조성물을 해유화시키는 단계를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 방법은, 용해된 세포 조성물의 중량 기준으로, 약 0.5중량% 내지 약 20중량%의 양으로 산을 첨가함으로써, 용해된 세포 조성물을 해유화시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 용해 및 해유화 단계를 서로 조합하여 1단계 용해 및 해유화 단계를 형성함을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 용해 및 해유화 단계를 서로 조합하여, 이미 앞에서 기술한 하나 이상의 효소를, 해유화된 용해된 세포 조성물을 수득하기 위해서 첨가함을 포함하는, 1단계 용해 및 해유화 단계를 형성함을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포는, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하기에 적합한 하나 이상의 효소로 용해된다. 일부 실시양태에서, 적합한 효소는, 해유화된 용해된 세포 조성물을 수득하기 위해서 앞에서 이미 기술된 효소이다.
일부 실시양태에서, 유화제는 세제이다. 일부 실시양태에서, 유화제는 계면활성제이다. 일부 실시양태에서, 유화제는, 용해 이전에, 용해 동안, 또는 용해 이후에 첨가된다. 하나의 실시양태에서, 유화제는 용해 이후에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 유화제는 용해된 세포 조성물에 첨가된다. 본원에 사용될 때, "유화제"란, 유화액을 안정화시키는 물질을 지칭한다. 유화제는, 이온성 유화제, 비이온성 유화제, 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 유화제는 이온성 유화제이다.
일부 실시양태에서, 이온성 유화제는, 음이온성 유화제, 양이온성 유화제, 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 음이온성 유화제는, 음이온성 설페이트 유화제, 예를 들어, 알킬 설페이트 (예를 들어, 암모늄 라우릴 설페이트, 나트륨라우릴 설페이트 (SLS)/나트륨 도데실 설페이트 (SDS), 및 이들의 조합), 알킬 에터 설페이트 (예를 들어, 나트륨 라우레쓰 설페이트/나트륨 라우릴 에터 설페이트, 나트륨 미레쓰 설페이트, 및 이들의 조합), 및 이들의 조합; 음이온성 설포네이트 유화제, 예를 들어, 도큐세이트 (예를 들어, 다이옥틸 나트륨 설포숙시네이트, 설포네이트 플루오로계면활성제 (예를 들어, 퍼플루오로옥탄설포네이트 및 퍼플루오로부탄설포네이트), 알킬 벤젠 설포네이트, 및 이들의 조합); 음이온성 포스페이트 유화제 (예를 들어, 알킬 아릴 에터 포스페이트, 알킬 에터 포스페이트, 및 이들의 조합); 음이온성 카복실레이트 유화제 (예를 들어, 알킬 카복실레이트, (예를 들어, 나트륨 스테아레이트, 나트륨 라우로일 사르코시네이트, 카복실레이트 플루오로계면활성제 (예를 들어, 퍼플루오로노나노에이트, 퍼플루오로옥타노에이트, 및 이들의 조합), 및 이들의 조합); 및 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 유화제는 음이온성 유화제이다. 하나의 실시양태에서, 음이온성 유화제는 음이온성 설페이트 유화제, 음이온성 설포네이트 유화제, 음이온성 포스페이트 유화제, 음이온성 카복실레이트 유화제, 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 또다른 실시양태에서, 음이온성 유화제는 음이온성 설페이트 유화제이다. 여전히 추가의 실시양태에서, 음이온성 설페이트 유화제는 암모늄 라우릴 설페이트, 나트륨 도데실 설페이트, 나트륨 라우레쓰 설페이트, 나트륨 라우릴 에터 설페이트, 나트륨 미레쓰 설페이트, 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 심지어 추가의 실시양태에서, 음이온성 설페이트 유화제는 나트륨 도데실 설페이트이다.
일부 실시양태에서, 양이온성 유화제는 pH-의존형 1차 아민; pH-의존형 2차 아민; pH-의존형 3차 아민; 옥테니딘 다이하이드로클로라이드; 영구적으로 하전된 4차 암모늄 양이온(예를 들어, 알킬트라이메틸암모늄 염 (예를 들어, 세틸 트라이메틸암모늄 브로마이드 (CTAB)/헥사데실 트라이메틸 암모늄 브로마이드, 세틸 트라이메틸암모늄 클로라이드 (CTAC), 및 이들의 조합), 세틸피리디늄 클로라이드 (CPC), 벤즈알코늄 클로라이드 (BAC), 벤즈에토늄 클로라이드 (BZT), 5-브로모-5-니트로-1,3-다이옥산, 다이메틸다이옥타데실암모늄 클로라이드, 다이옥타데실다이메틸암모늄 브로마이드 (DODAB), 및 이들의 조합); 및 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시양태에서, 유화제의 분자량은, 500 g/몰 이하, 450 g/몰 이하, 400 g/몰 이하, 350 g/몰 이하, 및 300 g/몰 이하 중에서 선택된다. 추가의 실시양태에서, 유화제의 분자량은 250 g/몰 내지 500 g/몰, 250 g/몰 내지 450 g/몰, 250 g/몰 내지 400 g/몰, 250 g/몰 내지 350 g/몰, 250 g/몰 내지 300 g/몰, 300 g/몰 내지 500 g/몰, 300 g/몰 내지 450 g/몰, 300 g/몰 내지 400 g/몰, 300 g/몰 내지 350 g/몰, 350 g/몰 내지 500 g/몰, 350 g/몰 내지 450 g/몰, 350 g/몰 내지 400 g/몰, 400 g/몰 내지 500 g/몰, 400 g/몰 내지 450 g/몰, 및 450 g/몰 내지 500 g/몰 중에서 선택된다. 예를 들어, SDS의 분자량은 288 g/몰이고, CTAB의 분자량은 364 g/몰이다. 심지어 추가의 실시양태에서, 유화제의 분자량은 250 g/몰 내지 450 g/몰, 250 g/몰 내지 400 g/몰, 250 g/몰 내지 350 g/몰, 및 250 g/몰 내지 300 g/몰 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 유화제는 분말로서 첨가된다. 일부 실시양태에서, 유화제는, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 10% 내지 50%, 10% 내지 45%, 10% 내지 40%, 10% 내지 35%, 10% 내지 30%, 15% 내지 50%, 15% 내지 45%, 15% 내지 40%, 15% 내지 35%, 15% 내지 30%, 20% 내지 50%, 20% 내지 45%, 20% 내지 40%, 20% 내지 35%, 20% 내지 30%, 25% 내지 50%, 25% 내지 45%, 25% 내지 40%, 25% 내지 35%, 25% 내지 30%, 30% 내지 50%, 30% 내지 45%, 30% 내지 40%, 및 30% 내지 35%의 양으로 유화제의 농도를 갖는 용액에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 유화제(예를 들어, 분말 형태 또는 용액 형태)는, 발효액 또는 용해된 세포 조성물의 중량(또는 체적) 기준으로, 0.2% 내지 10%, 0.2% 내지 9.5%, 0.2% 내지 9%, 0.2% 내지 8.5%, 0.2% 내지 8%, 0.2% 내지 7.5%, 0.2% 내지 7%, 0.2% 내지 6.5%, 0.2% 내지 6%, 0.2% 내지 5.5%, 0.2% 내지 5%, 0.2% 내지 4.5%, 0.2% 내지 4%, 0.2% 내지 3.5%, 0.2% 내지 3%, 0.2% 내지 2.5%, 0.2% 내지 2%, 0.2% 내지 1.5%, 0.2% 내지 1%, 0.2% 내지 0.5%, 0.5% 내지 10%, 0.5% 내지 9.5%, 0.5% 내지 9%, 0.5% 내지 8.5%, 0.5% 내지 8%, 0.5% 내지 7.5%, 0.5% 내지 7%, 0.5% 내지 6.5%, 0.5% 내지 6%, 0.5% 내지 5.5%, 0.5% 내지 5%, 0.5% 내지 4.5%, 0.5% 내지 4%, 0.5% 내지 3.5%, 0.5% 내지 3%, 0.5% 내지 2.5%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 1.5%, 0.5% 내지 1%, 1% 내지 10%, 1% 내지 9.5%, 1% 내지 9%, 1% 내지 8.5%, 1% 내지 8%, 1% 내지 7.5%, 1% 내지 7%, 1% 내지 6.5%, 1% 내지 6%, 1% 내지 5.5%, 1% 내지 5%, 1% 내지 4.5%, 1% 내지 4%, 1% 내지 3.5%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.5%, 1% 내지 2%, 1% 내지 1.5%, 1.5% 내지 10%, 1.5% 내지 9.5%, 1.5% 내지 9%, 1.5% 내지 8.5%, 1.5% 내지 8%, 1.5% 내지 7.5%, 1.5% 내지 7%, 1.5% 내지 6.5%, 1.5% 내지 6%, 1.5% 내지 5.5%, 1.5% 내지 5%, 1.5% 내지 4.5%, 1.5% 내지 4%, 1.5% 내지 3.5%, 1.5% 내지 3%, 1.5% 내지 2.5%, 1.5% 내지 2%, 2% 내지 10%, 2% 내지 9.5%, 2% 내지 9%, 2% 내지 8.5%, 2% 내지 8%, 2% 내지 7.5%, 2% 내지 7%, 2% 내지 6.5%, 2% 내지 6%, 2% 내지 5.5%, 2% 내지 5%, 2% 내지 4.5%, 2% 내지 4%, 2% 내지 3.5%, 2% 내지 3%, 2% 내지 2.5%, 2.5% 내지 10%, 2.5% 내지 9.5%, 2.5% 내지 9%, 2.5% 내지 8.5%, 2.5% 내지 8%, 2.5% 내지 7.5%, 2.5% 내지 7%, 2.5% 내지 6.5%, 2.5% 내지 6%, 2.5% 내지 5.5%, 2.5% 내지 5%, 2.5% 내지 4.5%, 2.5% 내지 4%, 2.5% 내지 3.5%, 2.5% 내지 3%, 3% 내지 10%, 3% 내지 9.5%, 3% 내지 9%, 3% 내지 8.5%, 3% 내지 8%, 3% 내지 7.5%, 3% 내지 7%, 3% 내지 6.5%, 3% 내지 6%, 3% 내지 5.5%, 3% 내지 5%, 3% 내지 4.5%, 3% 내지 4%, 및 3% 내지 3.5% 중에서 선택된 양으로 첨가된다. 또다른 실시양태에서, 유화제(예를 들어, 분말 형태 또는 용액 형태로)는, 발효액 또는 용해된 세포 조성물의 중량(또는 체적) 기준으로 0.2% 내지 5%, 0.5% 내지 5%, 1% 내지 5%, 1.5% 내지 5%, 2% 내지 5%, 2.5% 내지 5%, 및 3% 내지 5% 중에서 선택되는 양으로 첨가된다. 심지어 추가의 실시양태에서, 유화제는 용해된 세포 조성물의 중량 기준으로 0.2중량% 내지 10중량%의 양으로 첨가된다.
일부 실시양태에서, 유화제는 발효액 또는 용해된 세포 조성물의 계면 장력(즉, 표면 장력)을 감소시킨다. 본원에 사용될 때, "계면 장력" 또는 "표면 장력"이란, 2개의 상들 사이의 계면에서 길이 측면에서 1미터인 가상의 선 위에 작용하는 힘을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 유화제에 의해 형성된 유화액의 계면 장력은, 내생 물질에 의해 형성된 유화액보다 낮다. 일부 실시양태에서, 계면 장력은 다인/cm로 측정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 유화제는 발효액 또는 용해된 세포 조성물의 제타 포테셜의 절대값을 증가시킨다(즉, 양의 제타 포테셜을 증가시키거나 음의 제타 포테셜을 감소시킨다). 일부 실시양태에서, 음이온성 유화제의 첨가는, 결과적으로 발효액 또는 용해된 세포 조성물의 제타 포테셜을 하향 이동시킬 수 있다(예를 들어, 양의 제타 포텐셜을 감소시키거나 음의 제타 포텐셜을 증가시킨다). 일부 실시양태에서, 양이온성 유화제를 첨가하면, 결과적으로 발효액 또는 용해된 세포 조성물의 제타 포텐셜을 상향 이동시킬 수 있다(예를 들어, 양의 제타 포텐셜을 증가시키거나 음의 제타 포텐셜을 증가시킨다). 본원에 사용될 때, "제타 포텐셜"이란 용어는, 유화액 내 입자들 사이의 동전위를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 제타 포텐셜은 mV 단위로 측정될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유화제에 의해 형성된 유화액의 제타 포텐셜의 절대값이 내생 물질에 의해 형성된 유화액보다 높다.
일부 실시양태에서, 이온성 유화제를 첨가하면, 수중유 유화액이 형성된다. 일부 실시양태에서, 수중유 유화액은, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 오일, 물, 및 이온성 유화제를 포함한다.
일부 실시양태에서, 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계는, 용해된 세포 조성물의 pH를 올림을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, pH는, 상기 용해된 세포 조성물에 염기를 첨가함으로써 올라간다. 용해된 세포 조성물을 해유화시키기 위해서 사용될 수 있는 염기는, 전술한 것과 동일하다. 일부 실시양태에서, pH는 약 7.5 이상, 약 8 이상; 약 9 이상; 약 10 이상; 약 11 이상; 및 약 12 이상 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, pH는 7 내지 13; 7 내지 12; 7 내지 11; 7 내지 10; 7 내지 9; 7 내지 8; 8 내지 13; 8 내지 12; 8 내지 11; 8 내지 10; 8 내지 9; 9 내지 13; 9 내지 12; 9 내지 11; 9 내지 10; 10 내지 13; 10 내지 12; 및 10 내지 11 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, pH는 9 내지 11 중에서 선택된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 용해된 세포 조성물에 염을 첨가함을 추가로 포함한다. "염"이라는 용어는, 산의 수소 이온이 금속(예를 들어, 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 및 전이 금속) 또는 양으로 하전된 화합물(예를 들어, NH4 +)로 치환됨으로써 형성된 이온성 화합물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 염은, 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염, 설페이트 염 또는 이들의 조합일 수 있다. 염에 존재하는 음으로 하전된 이온성 종은, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 할라이드, 설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 포스페이트, 하이드로젠 포스페이트, 다이하이드로젠 포스페이트, 카보네이트, 바이카보네이트, 및 이들의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 염은 염화나트륨, 나트륨 설페이트, 나트륨 카보네이트, 칼슘 클로라이드, 칼륨 설페이트, 마그네슘 설페이트, 모노나트륨 글루타메이트, 암모늄 설페이트, 칼륨 클로라이드, 철 클로라이드, 철 설페이트, 알루미늄 설페이트, 암모늄 아세테이트 및 이들의 조합 중에서 선택된다. 일부 실시양태에서, 염은 NaOH를 포함하지 않는다. 염은 고체(예를 들어, 결정형, 무정형, 펠렛화된 형태, 및/또는 과립형)으로, 및/또는 예를 들어 물을 함유하는 용액(예를 들어, 희석액, 포화 용액, 또는 과포화된 용액)으로서 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 염은, 5 g/l 내지 25 g/l, 5 g/l 내지 10 g/l, 10 g/l 내지 15 g/l, 15 g/l 내지 20 g/l, 20 g/l 내지 25 g/l, 또는 10 g/l 내지 20 g/l의 양으로 첨가된다.
다른 실시양태에서, 염은, 용해된 세포 조성물에, 용해된 세포 조성물의 중량(또는 체적) 기준으로, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 7.5% 이하, 5% 이하, 또는 2% 이하의 양으로 첨가된다. 일부 실시양태에서, 염은, 용해된 세포 조성물에, 용해된 세포 조성물(예를 들어, 총 브로쓰 중량(또는 체적))의 중량(또는 체적) 기준으로, 약 0.05% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 15%, 약 0.1% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 15%, 약 0.5% 내지 약 10%, 약 0.5% 내지 약 5%, 약 0.5% 내지 약 4%, 약 0.5% 내지 약 3%, 약 0.5% 내지 약 2.5%, 약 0.5% 내지 약 2%, 약 0.5% 내지 약 1.5%, 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 1% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 4%, 1% 내지 약 3%, 약 1% 내지 약 2.5%, 약 1% 내지 약 2%, 약 1% 내지 약 1.5%, 약 1.5% 내지 약 5%, 약 1.5% 내지 약 4%, 약 1.5% 내지 약 3%, 약 1.5% 내지 약 2.5%, 약 1.5% 내지 약 2%, 약 2% 내지 20%, 약 2% 내지 약 15%, 약 2% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 4%, 약 2% 내지 약 3%, 약 2% 내지 약 2.5%, 약 2.5% 내지 약 5%, 약 2.5% 내지 약 4%, 약 2.5% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 4%, 약 4% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 15%, 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 15%, 또는 약 15% 내지 약 20%의 양으로 첨가된다. 예를 들어, 용해된 세포 조성물의 중량이 1,000 kg인 경우, 중량(또는 체적) 기준으로, 0.5% 내지 20%의 양으로 첨가되는 염은, 용해된 세포 조성물에 5 kg 내지 200 kg의 염을 첨가함을 요구한다. 일부 실시양태에서, 염은, 용해된 세포 조성물의 중량(또는 체적) 기준으로, 약 0.05% 내지 약 20%, 약 0.1% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 15%, 또는 약 2% 내지 약 10%의 양으로, 용해된 세포 조성물에 첨가된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포를 용해하기 전에, 용해하는 동안, 또는 용해한 이후에 가열함을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 유화제를 첨가하기 전에, 유화제를 첨가하는 동안, 유화제를 첨가한 이후에, 염을 첨가하기 전에, 염을 첨가하는 동안, 염을 첨가한 이후에, 또는 이들의 조합에 가열한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 용해된 세포 조성물 및/또는 세포를, 10 ℃ 이상, 20 ℃ 이상, 25 ℃ 이상, 30 ℃ 이상, 35 ℃ 이상, 40 ℃ 이상, 45 ℃ 이상, 50 ℃ 이상, 55 ℃ 이상, 60 ℃ 이상, 65 ℃ 이상, 70 ℃ 이상, 75 ℃ 이상, 80 ℃ 이상, 85 ℃ 이상, 90 ℃ 이상, 95 ℃ 이상, 또는 100 ℃ 이상으로 가열함을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은, 용해된 세포 조성물 및/또는 세포를 약 10 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 10 ℃ 내지 약 90 ℃, 약 10 ℃ 내지 약 80 ℃, 약 10 ℃ 내지 약 70 ℃, 약 20 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 20 ℃ 내지 약 90 ℃, 약 20 ℃ 내지 약 80 ℃, 약 20 ℃ 내지 약 70 ℃, 약 30 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 30 ℃ 내지 약 90 ℃, 약 30 ℃ 내지 약 80 ℃, 약 30 ℃ 내지 약 70 ℃, 약 40 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 40 ℃ 내지 약 90 ℃, 약 40 ℃ 내지 약 80 ℃, 약 50 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 50 ℃ 내지 약 90 ℃, 약 50 ℃ 내지 약 80 ℃, 약 50 ℃ 내지 약 70 ℃, 약 60 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 60 ℃ 내지 약 90 ℃, 약 60 ℃ 내지 약 80 ℃, 약 70 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 70 ℃ 내지 약 90 ℃, 약 80 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 80 ℃ 내지 약 90 ℃, 또는 약 90 ℃ 내지 약 100 ℃로 가열함을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 상기 방법은, 용해된 세포 조성물을 약 60 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 70 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 70 ℃ 내지 약 90 ℃, 약 80 ℃ 내지 약 100 ℃, 약 80 ℃ 내지 약 90 ℃, 또는 약 90 ℃ 내지 약 100 ℃로 가열함을 포함한다. 다른 추가의 실시양태에서, 상기 방법은, 용해된 세포 조성물을, 60 ℃ 이상, 70 ℃ 이상, 75 ℃ 이상, 80 ℃ 이상, 85 ℃ 이상, 90 ℃ 이상, 95 ℃ 이상, 또는 100 ℃ 이상으로 가열함을 포함한다.
일부 실시양태에서, 용해된 세포 조성물은, 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시키기에 충분한 시간 동안 가열한다.
일부 실시양태에서, 세포 및/또는 용해된 세포 조성물은 밀폐된 시스템에서 또는 증발기-동반 시스템에서 가열될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 및/또는 용해된 세포 조성물은 증발기-동반 시스템에서 가열될 수 있어서, 세포 및/또는 용해된 세포 조성물 내에 존재하는 물의 일부분이 증발에 의해 제거된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 증발기-동반 시스템에서 세포 및/또는 용해된 세포 조성물을 가열하여, 세포 및/또는 용해된 세포 조성물 내에 존재하는 물을, 중량(또는 체적) 기준으로, 1%까지, 5%까지, 10%까지, 15%까지, 20%까지, 25%까지, 30%까지, 35%까지, 40%까지, 45%까지 또는 50%까지 제거함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 증발기-동반 시스템에서 세포 및/또는 용해된 세포 조성물을 가열하여, 물의 중량(또는 체적) 기준으로, 1% 내지 50%, 1% 내지 45%, 1% 내지 40%, 1% 내지 35%, 1% 내지 30%, 1% 내지 25%, 1% 내지 20%, 1% 내지 15%, 1% 내지 10%, 1% 내지 5%, 5% 내지 50%, 5% 내지 45%, 5% 내지 40%, 5% 내지 35%, 5% 내지 30%, 5% 내지 25%, 5% 내지 20%, 5% 내지 15%, 5% 내지 10%, 10% 내지 50%, 10% 내지 45%, 10% 내지 40%, 10% 내지 35%, 10% 내지 30%, 10% 내지 25%, 10% 내지 20%, 10% 내지 15%, 15% 내지 50%, 15% 내지 45%, 15% 내지 40%, 15% 내지 35%, 15% 내지 30%, 15% 내지 25%, 15% 내지 20%, 20% 내지 50%, 20% 내지 45%, 20% 내지 40%, 20% 내지 35%, 20% 내지 30%, 20% 내지 25%, 25% 내지 50%, 25% 내지 45%, 25% 내지 40%, 25% 내지 35%, 25% 내지 30%, 30% 내지 50%, 30% 내지 45%, 30% 내지 40%, 30% 내지 35%, 35% 내지 50%, 35% 내지 45%, 35% 내지 40%, 40% 내지 50%, 40% 내지 45%, 또는 45% 내지 50% 제거함을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, (i) 세포를 용해시키기 이전에, 용해시키는 동안, 또는 용해시키는 이후에, (i) 용해된 세포 조성물을 해유화시키기 이전에, 해유화시키는 동안, 또는 해유화시키는 이후에, 또는 이들의 조합에서 진탕함을 추가로 포함한다. "진탕하는" 및 "진탕"이라는 용어는, 힘의 적용을 통해 세포 및/또는 용해된 세포 조성물에서의 운동에 영향을 미치는 공정을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 교반, 혼합, 블렌딩, 흔들기, 진동 또는 이들의 조합에 의해 세포 및/또는 용해된 세포 조성물을 진탕함을 포함한다.
일부 실시양태에서, 진탕기는 세포 및/또는 용해된 세포 조성물에 염기 및/또는 염을 분산하는 분산 스타일 진탕기이다. 일부 실시양태에서, 진탕기는 가열 플레이트를 갖는다. 일부 실시양태에서, 진탕기는 교반을 위한 맨틀을 갖는다. 일부 실시양태에서, 진탕기는 하나 이상의 임펠러를 갖는다. 본원에 사용될 때, "임펠러"란, 회전될 때, 세포 또는 용해된 세포 조성물에 움직임을 부여하기 위해 배열된 장치를 지칭한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 임펠러는, 균일두께 날개(straight blade) 임펠러, 러쉬톤 블레이드 임펠러, 축류 임펠러, 방사류 임펠러, 오목한 날 디스크 임펠러, 고효율 임펠러, 프로펠러, 패들, 터빈, 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 조성물의 0.1 hp/1,000 갤론 내지 10 hp/1,000 갤론, 0.5 hp/1,000 갤론 내지 8 hp/1,000 갤론, 1 hp/1,000 갤론 내지 6 hp/1,000 갤론, 또는 2 hp/1,000 갤론 내지 5 hp/1,000 갤론으로, 세포 및/또는 용해된 세포 조성물을 진탕시킴을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 각각, 세포 또는 조성물의 0.1 hp/1,000 갤론 내지 10 hp/1,000 갤론으로 세포 및/또는 용해된 세포 조성물을 진탕함을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 10 rpm 이하, 20 rpm 이하, 50 rpm 이하, 100 rpm 이하, 150 rpm 이하, 200 rpm 이하, 250 rpm 이하, 300 rpm 이하, 350 rpm 이하, 400 rpm 이하, 10 rpm 내지 400 rpm, 10 rpm 내지 350 rpm, 10 rpm 내지 300 rpm, 10 rpm 내지 250 rpm, 10 rpm 내지 200 rpm, 10 rpm 내지 150 rpm, 10 rpm 내지 100 rpm, 10 rpm 내지 50 rpm, 10 rpm 내지 20 rpm, 20 rpm 내지 400 rpm, 20 rpm 내지 350 rpm, 20 rpm 내지 300 rpm, 20 rpm 내지 250 rpm, 20 rpm 내지 200 rpm, 20 rpm 내지 150 rpm, 20 rpm 내지 100 rpm, 20 rpm 내지 50 rpm, 50 rpm 내지 400 rpm, 50 rpm 내지 350 rpm, 50 rpm 내지 300 rpm, 50 rpm 내지 250 rpm, 50 rpm 내지 200 rpm, 50 rpm 내지 150 rpm, 50 rpm 내지 100 rpm, 100 rpm 내지 400 rpm, 100 rpm 내지 350 rpm, 100 rpm 내지 300 rpm, 100 rpm 내지 250 rpm, 100 rpm 내지 200 rpm, 100 rpm 내지 150 rpm, 150 rpm 내지 400 rpm, 150 rpm 내지 350 rpm, 150 rpm 내지 300 rpm, 150 rpm 내지 250 rpm, 150 rpm 내지 200 rpm, 200 rpm 내지 400 rpm, 200 rpm 내지 350 rpm, 200 rpm 내지 300 rpm, 200 rpm 내지 250 rpm, 250 rpm 내지 400 rpm, 250 rpm 내지 350 rpm, 250 rpm 내지 300 rpm, 300 rpm 내지 400 rpm, 300 rpm 내지 350 rpm, 또는 350 rpm 내지 400 rpm로 진탕함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 350 rpm 이하의 속도로 진탕한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 90 피트/분 내지 1,200 피트/분, 200 피트/분 내지 1,000 피트/분, 300 피트/분 내지 800 피트/분, 400 피트/분 내지 700 피트/분, 또는 500 피트/분 내지 600 피트/분의 임펠러 선단 속도를 갖는 진탕기를 사용하여 세포 및/또는 용해된 세포 조성물을 진탕함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 200 피트/분 내지 1000 피트/분의 임펠러 선단 속도를 갖는 진탕기로 진탕함을 포함한다.
일부 실시양태에서, 방법은, 5 cm/초 내지 900 cm/초, 5 cm/초 내지 750 cm/초, 5 cm/초 내지 500 cm/초, 5 cm/초 내지 350 cm/초, 5 cm/초 내지 300 cm/초, 5 cm/초 내지 250 cm/초, 5 cm/초 내지 200 cm/초, 5 cm/초 내지 150 cm/초, 5 cm/초 내지 100 cm/초, 5 cm/초 내지 50 cm/초, 5 cm/초 내지 25 cm/초, 25 cm/초 내지 900 cm/초, 25 cm/초 내지 750 cm/초, 25 cm/초 내지 500 cm/초, 25 cm/초 내지 350 cm/초, 25 cm/초 내지 300 cm/초, 25 cm/초 내지 250 cm/초, 25 cm/초 내지 200 cm/초, 25 cm/초 내지 150 cm/초, 25 cm/초 내지 100 cm/초, 25 cm/초 내지 50 cm/초, 50 cm/초 내지 900 cm/초, 50 cm/초 내지 750 cm/초, 50 cm/초 내지 500 cm/초, 50 cm/초 내지 350 cm/초, 50 cm/초 내지 300 cm/초, 50 cm/초 내지 250 cm/초, 50 cm/초 내지 200 cm/초, 50 cm/초 내지 150 cm/초, 50 cm/초 내지 100 cm/초, 100 cm/초 내지 900 cm/초, 100 cm/초 내지 750 cm/초, 100 cm/초 내지 500 cm/초, 100 cm/초 내지 350 cm/초, 100 cm/초 내지 300 cm/초, 100 cm/초 내지 250 cm/초, 100 cm/초 내지 200 cm/초, 100 cm/초 내지 150 cm/초, 150 cm/초 내지 900 cm/초, 150 cm/초 내지 750 cm/초, 150 cm/초 내지 500 cm/초, 150 cm/초 내지 350 cm/초, 150 cm/초 내지 300 cm/초, 150 cm/초 내지 250 cm/초, 150 cm/초 내지 200 cm/초, 200 cm/초 내지 900 cm/초, 200 cm/초 내지 750 cm/초, 200 cm/초 내지 500 cm/초, 200 cm/초 내지 350 cm/초, 200 cm/초 내지 300 cm/초, 200 cm/초 내지 250 cm/초, 250 cm/초 내지 900 cm/초, 250 cm/초 내지 750 cm/초, 250 cm/초 내지 500 cm/초, 250 cm/초 내지 350 cm/초, 250 cm/초 내지 300 cm/초, 300 cm/초 내지 900 cm/초, 300 cm/초 내지 750 cm/초, 300 cm/초 내지 500 cm/초, 300 cm/초 내지 350 cm/초, 350 cm/초 내지 900 cm/초, 350 cm/초 내지 850 cm/초, 350 cm/초 내지 800 cm/초, 350 cm/초 내지 750 cm/초, 350 cm/초 내지 700 cm/초, 350 cm/초 내지 650 cm/초, 350 cm/초 내지 600 cm/초, 350 cm/초 내지 550 cm/초, 350 cm/초 내지 500 cm/초, 350 cm/초 내지 450 cm/초, 350 cm/초 내지 400 cm/초, 400 cm/초 내지 900 cm/초, 400 cm/초 내지 850 cm/초, 400 cm/초 내지 800 cm/초, 400 cm/초 내지 750 cm/초, 400 cm/초 내지 700 cm/초, 400 cm/초 내지 650 cm/초, 400 cm/초 내지 600 cm/초, 400 cm/초 내지 550 cm/초, 400 cm/초 내지 500 cm/초, 400 cm/초 내지 450 cm/초, 450 cm/초 내지 900 cm/초, 450 cm/초 내지 850 cm/초, 450 cm/초 내지 800 cm/초, 450 cm/초 내지 750 cm/초, 450 cm/초 내지 700 cm/초, 450 cm/초 내지 650 cm/초, 450 cm/초 내지 600 cm/초, 450 cm/초 내지 550 cm/초, 450 cm/초 내지 500 cm/초, 500 cm/초 내지 900 cm/초, 500 cm/초 내지 850 cm/초, 500 cm/초 내지 800 cm/초, 500 cm/초 내지 750 cm/초, 500 cm/초 내지 700 cm/초, 500 cm/초 내지 650 cm/초, 500 cm/초 내지 600 cm/초, 500 cm/초 내지 550 cm/초, 550 cm/초 내지 900 cm/초, 550 cm/초 내지 850 cm/초, 550 cm/초 내지 800 cm/초, 550 cm/초 내지 750 cm/초, 550 cm/초 내지 700 cm/초, 550 cm/초 내지 650 cm/초, 550 cm/초 내지 600 cm/초, 600 cm/초 내지 900 cm/초, 600 cm/초 내지 850 cm/초, 600 cm/초 내지 800 cm/초, 600 cm/초 내지 750 cm/초, 600 cm/초 내지 700 cm/초, 600 cm/초 내지 650 cm/초, 650 cm/초 내지 900 cm/초, 650 cm/초 내지 850 cm/초, 650 cm/초 내지 800 cm/초, 650 cm/초 내지 750 cm/초, 650 cm/초 내지 700 cm/초, 700 cm/초 내지 900 cm/초, 700 cm/초 내지 850 cm/초, 700 cm/초 내지 800 cm/초, 700 cm/초 내지 750 cm/초, 750 cm/초 내지 900 cm/초, 750 cm/초 내지 850 cm/초, 750 cm/초 내지 800 cm/초, 800 cm/초 내지 900 cm/초, 800 cm/초 내지 850 cm/초, 또는 850 cm/초 내지 900 cm/초의 임펠러 선단 속도를 갖는 진탕기를 사용하여 세포 및/또는 용해된 세포 조성물을 진탕함을 포함한다. "임펠러 선단 속도"라는 용어는, 그의 중심 축 주변으로 돌 때, 임펠러의 최외각의 속도를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 진탕(및 본원에서 기술한 바와 같은 선택적인 추가 단계)는, 임펠러를 포함하는 용기에서 수행되며, 여기서 임펠러 직경 대 용기 체적의 비는, 0.1 내지 0.5, 0.1 내지 0.4, 0.2 내지 0.5, 0.2 내지 0.4, 0.3 내지 0.5, 또는 0.3 내지 0.4이다.
일부 실시양태에서, 진탕(및 본원에서 기술한 바와 같은 선택적인 추가 단계)은, 임펠러를 포함하는 용기에서 수행되며, 여기서 임펠러 직경 대 용기의 내경의 비는, 0.25 이상, 0.34 이상, 0.65 이상, 0.25 내지 0.65, 0.25 내지 0.33, 0.3 내지 0.6, 0.3 내지 0.5, 0.3 내지 0.4, 0.34 내지 0.65, 0.34 내지 0.6, 0.34 내지 0.55, 0.37 내지 0.55, 0.4 내지 0.65, 0.4 내지 0.6, 0.4 내지 0.5, 또는 0.42 내지 0.55이다.
일부 실시양태에서, 진탕은, 세포 및/또는 용해된 세포 조성물이 10 내지 10,000, 1,000 내지 10,000, 1,500 내지 10,000, 또는 2,000 내지 10,000의 레이놀드 수로서 기술되는 유동 조건 하에 놓이도록, 세포 및/또는 용해된 세포 조성물을 혼합함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 진탕 도중의 용해된 세포 유화액의 레이놀드 수는 2,000 이상, 3,000 이상, 5,000 이상, 2,000 내지 10,000, 3,000 내지 10,000, 또는 5,000 내지 10,000이다.
일부 실시양태에서, 진탕 용기는 2개의 임펠러를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 임펠러는 러쉬톤 블레이드 임펠러이다. 일부 실시양태에서, 임펠러는, 적어도 최소의 임펠러의 직경과 동일한 거리만큼 서로 분리되어 있다. 일부 실시양태에서, 임펠러는 선단으로부터 선단까지 30 인치 내지 40 인치, 33 인치 내지 37 인치, 33 인치, 34 인치, 35 인치, 36 인치 또는 37 인치이다. 일부 실시양태에서, 진탕 용기의 체적은, 10,000 리터 이상, 20,000 리터 이상, 30,000 리터 이상, 40,000 리터 이상, 또는 50,000 리터 이상이다. 일부 실시양태에서, 진탕 용기의 내경은, 90 인치 내지 110 인치, 95 인치 내지 105 인치, 98 인치, 99 인치, 100 인치, 101 인치, 또는 102 인치이다. 일부 실시양태에서, 제 1 임펠러는, 진탕 용기의 바닥으로부터 15 인치 내지 20 인치, 16 인치 내지 19 인치, 또는 17 인치 내지 18 인치에 위치하고, 제 2 임펠러는 제 1 임펠러 위의 60 인치 내지 80 인치, 65 인치 내지 75 인치, 68 인치, 69 인치, 70 인치, 71 인치, 72 인치, 73 인치, 74 인치, 또는 75 인치에 위치한다. 일부 실시양태에서, 용해된 세포 조성물은 50 rpm 이상, 60 rpm 이상, 또는 70 rpm 이상이다. 일부 실시양태에서, 용해된 세포 조성물은 50 rpm 내지 70 rpm, 50 rpm 내지 60 rpm, 또는 60 rpm 내지 70 rpm으로 진탕한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 용해된 세포 조성물을 진탕함을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 용해된 세포 조성물을 진탕하는 방법은 용해된 세포 조성물을 해유화시킨다.
일부 실시양태에서, 용해된 세포 조성물은, 유화제, 염기, 염, 열 및 진탕 중 하나 이상에 적용되어 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 미생물 오일을 포함하는 미세척된 용해된 세포를 해유화시켜 미세척된 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계, 및 그 다음 상기 오일을 미세척된 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 분리하는 단계를 포함한다. 미세척된 해유화된 용해된 세포 조성물은, 용해된 세포 조성물이, 예를 들어 물 또는 완충액으로 세척되지 않는 방법을 지칭하되, 여기서 상기 물 또는 완충액은 예를 들어 원심분리에 의해 제거된다. 용해된 세포 조성물을 세척하면, 세포로부터 수득된 오일의 총 수율이 떨어질 수 있다.
대안의 실시양태에서, 용해된 세포 조성물을 세척하는 횟수는, 1회로, 2회로, 3회 이상으로 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 세척은 1회 이하, 2회 이하, 또는 3회 이하이다.
일부 실시양태에서, 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계, 상기 용해된 세포 조성물에 유화제를 첨가하는 단계, 용해된 세포 조성물을 염기와 접촉하거나, 용해된 세포 조성물의 pH를 올리는 단계, 용해된 세포 조성물을 염과 접촉시키는 단계, 용해된 세포 조성물을 가열하는 단계, 및 용해된 세포 조성물을 진탕하는 단계의 다양한 조합이 단일 용기에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포를 형성하는 단계, 세포를 염기와 접촉하거나 세포의 pH를 올리는 단계, 유화제를 용해된 세포 조성물에 첨가하는 단계, 세포를 염과 접촉하는 단계, 세포를 가열하는 단계, 및 세포를 진탕하는 단계의 다양한 조합이 단일 용기에서 발생할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 용기는 발효 용기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 발효 용기는, 20,000 리터 이상, 50,000 리터 이상, 100,000 리터 이상, 120,000 리터 이상, 150,000 리터 이상, 200,000 리터 이상, 또는 220,000 리터 이상의 체적을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 발효 용기는, 20,000 리터 내지 220,000 리터, 20,000 리터 내지 100,000 리터, 20,000 리터 내지 50,000 리터, 50,000 리터 내지 220,000 리터, 50,000 리터 내지 150,000 리터, 50,000 리터 내지 100,000 리터, 100,000 리터 내지 220,000 리터, 100,000 리터 내지 150,000 리터, 100,000 리터 내지 120,000 리터, 150,000 리터 내지 220,000 리터, 150,000 리터 내지 200,000 리터, 또는 200,000 리터 내지 220,000 리터의 체적을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 용기에 형성된 용해된 세포 또는 세포의 일정량은, 하나 이상의 진탕 용기로 옮길 수 있다. 일부 실시양태에서, 진탕 용기는, 20,000 리터 이상, 30,000 리터 이상, 40,000 리터 이상 또는 50,000 리터 이상의 체적을 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 진탕 용기는 20,000 리터 내지 50,000 리터, 20,000 리터 내지 40,000 리터, 20,000 리터 내지 30,000 리터, 30,000 리터 내지 50,000 리터, 30,000 리터 내지 40,000 리터, 또는 40,000 리터 내지 50,000 리터의 체적을 가질 수 있다.
일반적으로, 본원에 기술된 방법은, 미생물 세포로부터 미생물 오일을 수득하기 위해서, 분리하기 위해서, 또는 다르게 제거하기 위해서 유기 용매를 사용하지 않는다. 일부 실시양태에서, 임의의 유기 용매도, 미생물 세포로부터 미생물 오일을 수득하는데 사용되지 않는다. 또다른 실시양태에서, 유기 용매는, 세포에 첨가되지 않고/않거나 용해된 세포 조성물에 첨가되지 않고/않거나, 미생물 오일을 수득하기에 충분한 양 또는 농도로 본원에서 개시된 방법 동안 오일에 첨가되지 않는다. 유기 용매는, 극성 용매, 비-극성 용매, 수-혼화성 용매, 수-불혼화성 용매, 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리함을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 해유화된 용해된 세포 조성물을 원심분리함으로써 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 해유화된 용해된 세포 조성물을 정치시킴으로써 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일이 분리되되, 여기서 상기 오일은 중력에 의해 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 (예를 들어, 개별적인 층으로서) 분리된다. 일부 실시양태에서, 분리는 친유성 막에 의해 달성된다. 일부 실시양태에서, 분리는, 10℃ 내지 100℃의 온도에서의 원심분리를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은, 먼저 (예를 들어, 본원에서 앞에서 설명된 염기를 첨가함으로써) pH를 올리고 그다음 해유화된 용해된 세포 조성물을 원심분리하여 오일을 수득함으로써 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일이 분리된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 10℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상, 30℃ 이상, 35℃ 이상, 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상, 80℃ 이상, 85℃ 이상, 90℃ 이상, 95℃ 이상, 또는 100℃ 이상의 온도에서 해유화된 용해된 세포 조성물을 원심분리함으로써 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 10℃ 내지 100℃, 10℃ 내지 90℃, 10℃ 내지 80℃, 20℃ 내지 100℃, 20℃ 내지 90℃, 20℃ 내지 80℃, 25℃ 내지 100℃, 25℃ 내지 90℃, 25℃ 내지 80℃, 25℃ 내지 75℃, 30℃ 내지 100℃, 30℃ 내지 90℃, 30℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 100℃, 40℃ 내지 90℃, 40℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 100℃, 50℃ 내지 90℃, 50℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 100℃, 60℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 70℃, 70℃ 내지 100℃, 70℃ 내지 90℃, 70℃ 내지 80℃, 80℃ 내지 100℃, 80℃ 내지 90℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 해유화된 용해된 세포 조성물을 원심분리함으로써 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 오일을 분리함을 포함한다.
일부 실시양태에서, 원심분리는, 1 킬로그램/분(kg/분) 내지 500 kg/분, 1 kg/분 내지 400 kg/분, 1 kg/분 내지 300 kg/분, 1 kg/분 내지 200 kg/분, 1 kg/분 내지 100 kg/분, 1 kg/분 내지 75 kg/분, 1 kg/분 내지 50 kg/분, 1 kg/분 내지 40 kg/분, 1 kg/분 내지 30 kg/분, 1 kg/분 내지 25 kg/분, 1 kg/분 내지 10 kg/분, 10 kg/분 내지 500 kg/분, 10 kg/분 내지 400 kg/분, 10 kg/분 내지 300 kg/분, 10 kg/분 내지 200 kg/분, 10 kg/분 내지 100 kg/분, 10 kg/분 내지 75 kg/분, 10 kg/분 내지 50 kg/분, 10 kg/분 내지 40 kg/분, 10 kg/분 내지 30 kg/분, 20 kg/분 내지 500 kg/분, 20 kg/분 내지 400 kg/분, 20 kg/분 내지 300 kg/분, 20 kg/분 내지 200 kg/분, 20 kg/분 내지 100 kg/분, 20 kg/분 내지 75 kg/분, 20 kg/분 내지 50 kg/분, 20 kg/분 내지 40 kg/분, 25 kg/분 내지 500 kg/분, 25 kg/분 내지 400 kg/분, 25 kg/분 내지 300 kg/분, 25 kg/분 내지 200 kg/분, 25 kg/분 내지 100 kg/분, 25 kg/분 내지 75 kg/분, 25 kg/분 내지 50 kg/분, 30 kg/분 내지 60 kg/분, 30 kg/분 내지 50 kg/분, 30 kg/분 내지 40 kg/분, 50 kg/분 내지 500 kg/분, 100 kg/분 내지 500 kg/분, 또는 200 kg/분 내지 500 kg/분의 (원심분리로의 해유화된 용해된 세포 조성물의) 공급 속도로 수행된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 1,000 g 내지 25,000 g, 1,000 g 내지 20,000 g, 1,000 g 내지 10,000 g, 2,000 g 내지 25,000 g, 2,000 g 내지 20,000 g, 2,000 g 내지 15,000 g, 3,000 g 내지 25,000 g, 3,000 g 내지 20,000 g, 5,000 g 내지 25,000 g, 5,000 g 내지 20,000 g, 5,000 g 내지 15,000 g, 5,000 g 내지 10,000 g, 5,000 g 내지 8,000 g, 10,000 g 내지 25,000 g, 15,000 g 내지 25,000 g, 또는 1,000 g 이상, 2,000 g 이상, 4,000 g 이상, 5,000 g 이상, 7,000 g 이상, 8,000 g 이상, 10,000 g 이상, 15,000 g 이상, 20,000 g 이상, 또는 25,000 g 이상의 원심분리력으로 해유화된 용해된 세포 조성물을 원심분리함을 포함한다. 본원에 사용될 때, "g"는 표준 중력 또는 약 9.8 m/s2를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은, 4,000 rpm 내지 14,000 rpm, 4,000 rpm 내지 10,000 rpm, 6,000 rpm 내지 14,000 rpm, 6,000 rpm 내지 12,000 rpm, 8,000 내지 14,000 rpm, 8,000 rpm 내지 12,000 rpm, 또는 8,000 rpm 내지 10,000 rpm에서 해유화된 용해된 세포 조성물을 원심분리함을 포함한다.
일부 실시양태에서, 예를 들어, 기울어 따르기, 떠냄, 진공, 펌핑, 흡인, 드로잉 오프(drawing off), 사이포닝, 또는 다르게는 분리된 조성물의 표면으로부터 미생물 오일을 회수함으로써, 오일이 회수될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은, 오일로부터 물을 제거하기 위해서 회수된 오일을 건조함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일의 건조는, 이로서 한정하는 것은 아니지만 물을 증발하기 위해서 오일을 가열함을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 건조 후에, 오일은, 3% 미만, 2.5% 미만, 2% 미만, 1.5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1 미만%, 또는 0 미만%인, 오일의 중량(또는 체적) 기준의 물 함량을 갖는다. 일부 실시양태에서, 건조 이후에, 오일의 물 함량은, 오일의 중량(또는 체적) 기준으로, 0% 내지 3%, 0% 내지 2.5%, 0% 내지 2%, 0% 내지 1.5%, 0% 내지 1%, 0% 내지 0.5%, 0.1% 내지 3%, 0.1% 내지 2.5%, 0.1% 내지 2%, 0.1% 내지 1.5%, 0.1% 내지 1%, 0.1% 내지 0.5%, 0.5% 내지 3%, 0.5% 내지 2.5%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 1.5%, 0.5% 내지 1%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.5%, 1% 내지 2%, 1% 내지 1.5%, 1.5% 내지 3%, 1.5% 내지 2.5%, 1.5% 내지 2%, 2% 내지 3%, 2% 내지 2.5%, 또는 2.5% 내지 3%이다.
본원에는, 본원에 개시된 임의의 방법에 의해 미생물 세포에 의해 수득될 수 있는 미생물 오일이 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, 상기 오일은 30중량(체적)% 이상의 아르아키돈산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 오일은, 30중량(체적)% 이상의 도코사헥사엔산을 포함한다.
아니시딘 값(Anisidine value;AV)은, AOCS 공정방법 Cd 18-90을 따라 측정된다. 하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 오일의 AV는, 약 50 미만; 약 40 미만; 약 30 미만; 약 20 미만; 약 15 미만; 또는 약 10 미만이다. 일부 실시양태에서, 오일의 AV는 약 50 미만이다. 아니시딘 값이라는 용어는, 오일의 산화 동안 발생하는 알데하이드 및 케톤과 같은 2차 반응 생성물의 척도를 지칭한다.
과산화물가(PV)는, AOCS 공정방법 Cd 8-53에 따라 측정된다. 하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 오일의 PV는 약 20 meq/kg 미만; 약 10 meq/kg 미만; 또는 약 5 meq/kg 미만이다. 일부 실시양태에서, 오일의 PV는 약 5 meq/kg 미만이다. 과산화물가는, 오일의 산화 동안 발생하는, 과산화물 및 히드로과산화물과 같은 1차 반응 생성물의 측정치를 지칭한다. 본원에 사용될 때, 과산화물가는 meq/kg로 측정된다.
일부 실시양태에서, 오일의 인 함량은 100 ppm 이하, 95 ppm 이하, 90 ppm 이하, 85 ppm 이하, 80 ppm 이하, 75 ppm 이하, 70 ppm 이하, 65 ppm 이하, 60 ppm 이하, 55 ppm 이하, 50 ppm 이하, 45 ppm 이하, 40 ppm 이하, 35 ppm 이하, 30 ppm 이하, 25 ppm 이하, 20 ppm 이하, 15 ppm 이하, 10 ppm 이하, 9 ppm 이하, 8 ppm 이하, 7 ppm 이하, 6 ppm 이하, 5 ppm 이하, 4 ppm 이하, 3 ppm 이하, 2 ppm 이하, 또는 1 ppm 이하이다. 일부 실시양태에서, 오일의 인 함량은 약 8 ppm 이하이다.
일부 실시양태에서, 오일은 하나 이상의 PUFA를 갖는다. 일부 실시양태에서, 오일은, (PUMA 중량 기준으로) 10중량% 이상, 15중량% 이상, 20중량% 이상, 25중량% 이상, 30중량% 이상, 35중량% 이상, 40중량% 이상, 45중량% 이상, 50중량% 이상, 60중량% 이상, 70중량% 이상, 또는 80중량% 이상의 PUFA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은, (DHA 중량 기준으로) 10중량% 이상, 15중량% 이상, 20중량% 이상, 25중량% 이상, 30중량% 이상, 35중량% 이상, 40중량% 이상, 45중량% 이상, 50중량% 이상, 60중량% 이상, 70% 이상 또는 80% 이상의 DHA, 및/또는 (DPA n-6의 중량 기준으로) 10중량% 이상, 15중량% 이상, 또는 20중량% 이상의 DPA n-6, 및/또는 (EPA의 중량 기준으로) 10중량% 이상, 15중량% 이상, 또는 20중량%의 EPA, 및/또는 (ARA 중량 기준으로) 10중량% 이상, 15중량% 이상, 20중량% 이상, 25중량% 이상, 30중량% 이상, 35중량% 이상, 40중량% 이상, 45중량% 이상, 50중량% 이상, 55중량% 이상, 60중량% 이상, 65중량% 이상, 70중량% 이상, 75중량% 이상, 또는 80중량% 이상의 ARA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은, (EPA의 중량 기준으로) 50중량% 미만, 40중량% 미만, 30중량% 미만, 20중량% 미만, 15중량% 미만, 10중량% 미만, 또는 5중량% 미만의 EPA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 (DHA의 중량 기준으로) 50중량% 미만, 40중량% 미만, 30중량% 미만, 20중량% 미만, 15중량% 미만, 10중량% 미만, 또는 5중량% 미만의 DHA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일은 중량(또는 체적) 기준으로, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 또는 0.5% 미만의 스테롤을 포함한다.
일부 실시양태에서, 오일은, 중량(또는 체적) 기준으로, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 또는 50% 내지 95%, 50% 내지 90%, 50% 내지 85%, 50% 내지 80%, 50% 내지 75%, 60% 내지 95%, 60% 내지 90%, 60% 내지 85%, 70% 내지 95%, 70% 내지 90%, 70% 내지 85%, 75% 내지 95%, 75% 내지 90%, 또는 75% 내지 85%의 트리글리세라이드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 트리글리세라이드는, 중량(또는 체적) 기준으로, 10 % 이상, 20 % 이상, 30 % 이상, 35 % 이상, 40% 이상, 50 % 이상, 60 % 이상, 70 % 이상 또는 80 % 이상의 DHA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트리글리세라이드는, 중량(또는 체적) 기준으로 10 % 이상, 20 % 이상, 30 % 이상, 35 % 이상, 40 % 이상, 45 % 이상, 50 % 이상, 55 % 이상, 60 % 이상, 65 % 이상, 70 % 이상, 75 % 이상, 또는 80 % 이상의 ARA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 트리글리세라이드는 중량(또는 체적) 기준으로, 50 % 이상, 40 % 이상, 30 % 이상, 20 % 이상, 15 % 이상, 10 % 이상, 또는 5% 이상의 EPA를 포함한다.
하나의 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 방법에 의해 수득되고/수득되거나 회수된 미생물 오일은 천연 오일이다. 또다른 실시양태에서, 본원에 기술된 오일은 정제유이다. "천연 오일"은 추가의 가공 없이 미생물 세포로부터 수득된 오일이다. "정제유"는, 정제, 표백 및/또는 이취제거의 표준 가공으로 천연 오일을 처리함으로써 수득된 오일이다. 예를 들어, 미국특허 제 5,130,242 호를 참고한다. 일부 실시양태에서, 정제는, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 가성 정제, 탈검, 산 처리, 알칼리 처리, 냉각, 가열, 표백, 이취제거, 탈산, 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 미생물 세포를 포함하는 발효액을 농축함을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 용해된 세포 조성물을 농축함을 포함한다. 본원에 사용될 때 "농축하는"이란 조성물로부터 물을 제거함을 지칭한다. 농축이란, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 증발, 화학적 건조, 원심분리 등 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 조성물 또는 용해된 세포 조성물은, 조성물의 중량(체적) 기준으로 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상의 오일 농도를 제공하도록, 농축된다. 일부 실시양태에서, 세포 조성물 또는 용해된 세포 조성물은, 조성물의 중량(체적) 기준으로 4% 내지 40%, 4% 내지 30%, 4% 내지 20%, 4% 내지 15%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 15% 내지 40%, 15% 내지 30%, 20% 내지 40%, 20% 내지 30%, 25% 내지 40%, 또는 30% 내지 40%의 오일 농도를 제공하도록, 농축된다.
본 발명에 따른 용도를 위한 미생물 세포의 효율적인 배양 조건은, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 효과적인 배지, 생물반응 장치, 온도, pH, 및 오일 생산을 허용하는 산소 조건을 포함한다. 효과적인 배지는, 미생물 세포, 예를 들어 트라우스토키트리알 미생물 세포가 전형적으로 배양되는 임의의 배지를 지칭한다. 이러한 배지는, 전형적으로 동화가능한 탄소, 질소 및 인 공급원, 뿐만 아니라 적절한 염, 미네랄, 금속 및 기타 영양소, 예를 들어 비타민을 갖는 수성 배지를 포함한다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 미생물 세포는, 통상적인 발효 생물반응 장치, 세이크 플라스크, 테스트 튜브, 미량정량접시, 및 페트리판에서 배양될 수 있다.
일부 실시양태에서, 미생물 세포는, 30중량(체적)% 이상의 오일, 35중량(체적)% 이상의 오일, 40중량(체적)% 이상의 오일, 50중량(체적)% 이상의 오일, 60중량(체적)% 이상의 오일, 70중량(체적)% 이상의 오일, 또는 80중량(체적)% 이상의 오일을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 발명과 함께 사용하기 위한 미생물 세포는, 0.1 그램/리터/시간(g/L/h) 이상의 DHA, 0.2 g/L/h 이상의 DHA, 0.3 g/L/h 이상의 DHA, 또는 0.4 g/L/h 이상의 DHA를 생산할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명과 함께 사용하기 위한 미생물 세포는, 0.01 그램/리터/시간(g/L/h) 이상의 ARA, 0.05 g/L/h 이상의 ARA, 0.1 g/L/h 이상의 ARA, 0.2 g/L/h 이상의 ARA, 0.3 g/L/h 이상의 ARA, 또는 0.4 g/L/h 이상의 ARA를 생산할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 임의의 방법에 따라 수득된 오일, 이미 쓴 바이오매스, 또는 이들의 조합은, 식품 또는 식품 성분으로서, 예를 들어 아기 식품, 유아용 포물러, 음료, 소스, 낙농계 식품(예를 들어, 우유, 요거트, 치즈 및 아이스크림), 오일(예를 들어, 조리용 오일 또는 샐러드 드레싱), 구운 제품; 영양 보충제(예를 들어, 캡슐형 또는 정제형); 인간 이외의 임의의 동물(예를 들어, 그의 제품들(예를 들어, 육류, 우유 또는 달걀)이 인간에 의해 소비되는 동물들)을 위한 사료 또는 사료 보충제; 식품 보충제; 및 약품(직접적인 또는 아쥬반트 치료용 투여에서)에 사용될 수 있다. "동물"이란, 동물 왕국에 속하는 임의의 유기체를 지칭하고 임의의 인간 동물, 및 제품(예를 들어, 우유, 계란, 가금육, 쇠고기, 돼지고기 또는 양고기)이 유도되는 인간 이외의 동물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 오일 및/또는 바이오매스가 해산물에 사용될 수 있다. 해산물은, 제한하는 것은 아니지만, 어류, 새우 및 조개류로부터 유도된다. "제품"이란, 이로서 한정하는 것은 아니지만, 육류, 계란, 우유 또는 기타 제품을 비롯한, 이러한 동물로부터 유도되는 임의의 제품을 포함한다. 오일 및/또는 바이오매스가 이러한 동물에 먹히는 경우, 다중불포화 오일이 이러한 동물의 고기, 우유, 계란 또는 기타 제품에 도입되어서 이러한 오일의 함량을 증가시킬 수 있다.
실시예
실시예 1
미생물 세포(크립테코디늄 코니)를 함유하는 세척된 세포 브로쓰(250g)를 1시간 동안 60 ℃에서 저온살균하였다. 12,000psi에서 기계적 균질화기(미세유동화기 M110)를 통해 상기 브로쓰를 2회 통과시킴으로써, 세척된 세포를 용해하였다. 용해된 세포 조성물을 플라스크에 넣고, 50% NaOH를 사용하여 pH를 7.5로 조정하였다. 용해된 세포 조성물의 중량 기준으로 0.1중량%의 비노플로우(Vinoflow, 등록상표) 맥스 A(노보자임(Novozymes, 덴마크 소재))를 첨가하고, 상기 조성물을 65 ℃로 가열하고, 상기 조성물을 250 rpm의 속도로 진탕하면서, 6시간 동안 유지함으로써, 해유화된 용해된 세포 조성물이 형성되었다. 미생물 오일을 80 ℃로 가열하고 상기 조성물을 5분 동안 8000g에서 원심분리함으로써(써모 소발 ST 40R(Thermo Sorvall ST 40R), 미생물 오일을 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 분리하여 천연 오일을 제공하되, 이는 64% DHA (DHA 중량 기준)(FAME 분석에 기초함) 및, 아니시딘 값(AV)이 6.2이고 과산화물가(perdcn)가 0.42meg인, 천연 오일을 제공하였다.
실시예 2
미생물 세포(크립테코디늄 코니)를 함유하는 세척된 세포 브로쓰(250g)를 1시간 동안 60 ℃에서 저온살균하였다. 12,000psi에서 기계적 균질화기(미세유동화기 M110)를 통해 상기 브로쓰를 2회 통과시킴으로써, 세척된 세포를 용해하였다. 용해된 세포 조성물을 플라스크에 넣고, (i) 50% NaOH 용액을 첨가하여 pH를 7.5로 조정하고, 조성물 중량 기준으로 0.1중량%의 비노플로우(등록상표) 맥스 A(노보자임(덴마크 소재))를 첨가하고; 65 ℃로 가열하고; 250 rpm의 속도로 진탕하면서, 6시간 동안 유지함으로써, 그리고, 그다음, 계속 진탕하면서, (ii) 50% NaOH 용액을 첨가하여 pH를 10.5로 조정하고, pH가 8.2로 떨어질 때까지, 250rpm의 속도로 진탕하면서 80 ℃로 가열함으로써, 해유화된 용해된 세포 조성물이 형성되었다. 상기 조성물을 5분 동안 8000g에서 원심분리함으로써(써모 소발 ST 40R), 미생물 오일을 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 분리하여 천연 오일을 제공하되, 이는 78% DHA (DHA 중량 기준)(FAME 분석에 기초함) 및, AV가 6.4이고 PV가 0.42meg인, 천연 오일을 제공하였다.
실시예 3
미생물 세포(크립테코디늄 코니)를 함유하는 미세척된 세포 브로쓰(550kg)를 1시간 동안 60 ℃에서 저온살균하였다. 상기 세포 브로쓰를 90 ℃로 가열하고 12,000psi에서 기계적 균질화기(미세유동화기 M210)를 통해 상기 브로쓰를 2회 통과시킴으로써, 미세척된 세포를 용해하였다. 용해된 세포 조성물을 탱크에 넣고, 50% NaOH 용액을, 조성물 중량 기준으로 1.85% 가성으로 첨가하고, 상기 조성물을 90℃까지 가열하고, 6.2의 pH가 달성될 때까지, 유지하고, 브로자임(Brewzyme) LP(다이아딕스 인터내셔널 인포코레이티드(Dyadic International, Inc.), 미국 플로이다주, 쥬피터 소재)을 첨가하고 18시간 동안 반응하도록 함으로써, 상기 해유화된 세포 조성물을 해유화하였다. 상기 조성물을 75℃로 가열하고 상기 조성물을 5분 동안 8000g에서 원심분리함으로써(써모 소발 ST 40R), 미생물 오일을 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 분리하여 천연 오일을 제공하되, 이는 80% DHA (DHA 중량 기준)(천연 오일 중량 기준) 및, AV가 0.5 미만이고 PV가 0.14meg인, 천연 오일을 제공하였다.
실시예 4
미생물 세포(모르티에렐라)-함유 미세척된 세포 브로쓰(250 mL)를 1시간 동안 70 ℃에서 저온살균하였다. 상기 세포 브로쓰를 12,000psi에서 기계적 균질화기(미세유동화기 M110)를 통해 2회 통과시킴으로써, 상기 세포를 용해하였다. 50% NaOH를 첨가하여 pH를 7.5로 조정하고; 250 RPM에서 진탕하고; 65 ℃로 가열하고; 조성물의 중량 기준으로 피브레자임 및 셀루스타 효소를 첨가하는 단계; 및 상기 조성물을 24시간 동안 반응하게 함으로써, 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시켰다. 상기 조성물을 70℃로 가열하고 상기 조성물을 5분 동안 8000g에서 원심분리함으로써(써모 소발 ST 40R), 미생물 오일을 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 분리하여 천연 오일을 제공하되, 이는 54% ARA (ARA 중량 기준)(FAME 분석에 기초함)을 제공하였다.
실시예 5
미생물 세포(모르티에렐라)-함유 미세척된 세포 브로쓰(250 mL)를 1시간 동안 70 ℃에서 저온살균하였다. 상기 브로쓰를 12,000psi에서 기계적 균질화기(미세유동화기 M110)를 통해 2회 통과시킴으로써, 세포를 용해하였다. 50% NaOH를 첨가하여 pH를 7.5로 조정하고; 250 RPM에서 진탕하고; 65 ℃로 가열하고; 조성물의 중량 기준으로 피브레자임 및 셀루스타 효소를 첨가하고; 상기 조성물을 24시간 동안 반응하게 함으로써, 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시켰다. 상기 조성물을 70℃로 가열하고 상기 조성물을 5분 동안 8000g에서 원심분리함으로써(써모 소발 ST 40R), 미생물 오일을 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 분리하여 천연 오일을 제공하되, 이는 58% ARA (ARA 중량 기준)(FAME 분석에 기초함)을 제공하였다.
실시예 6
미생물 세포(모르티에렐라)-함유 미세척된 세포 브로쓰(250 mL)를 1시간 동안 70 ℃에서 저온살균하였다. 상기 브로쓰를 12,000psi에서 기계적 균질화기(미세유동화기 M110)를 통해 2회 통과시킴으로써, 상기 세포를 용해하였다. (i) 50% NaOH를 첨가하여 pH를 7.5로 조정하고; 250 RPM에서 진탕하고; 65 ℃로 가열하고; 조성물의 중량 기준으로 피브레자임 및 셀루스타 효소를 첨가하고; 상기 조성물을 24시간 동안 반응하게 하고, 그다음 (ii) 50% NaOH를 첨가하여 pH를 10으로 조정하고; 조성물의 중량 기준으로 고체 NaCl를 1% 첨가하고; 90 ℃로 가열하고; pH가 9.3으로 떨어질 때까지, 유지함으로써, 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시켰다. 상기 조성물을 70 내지 80℃로 냉각하고 상기 조성물을 5분 동안 8000g에서 원심분리함으로써(써모 소발 ST 40R), 미생물 오일을 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 분리하여 천연 오일을 제공하되, 이는 74% ARA (ARA 중량 기준)(FAME 분석에 기초함)을 제공하였다.
비교예 1
미생물 세포(크립테코디늄 코니)-함유 세척된 세포 브로쓰(750g)를 1시간 동안 60 ℃에서 저온살균 하였다. 상기 세포 브로쓰를 12,000psi에서 기계적 균질화기를 통해 2회 통과시킴으로써, 세척된 세포를 용해하였다. 상기 용해된 세포 조성물을 플라스크에 넣고, 50% NaOH 용액을, 조성물의 중량 기준으로 0.73%로 첨가함으로써 상기 조성물을 해유화시켰다. pH가 8.0으로 떨어질 때까지, 상기 조성물을 250rpm으로 진탕하면서, 상기 조성물을 90℃로 가열하고 상기 조성물을 5분 동안 8000g에서 원심분리함으로써(써모 소발 ST 40R), 미생물 오일을 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 분리하여 천연 오일을 제공하되, 이는 42% DHA (DHA 중량 기준)(FAME 분석에 기초함) 및 AV가 8.8이고 PV가 0.66meq인 천연 오일을 제공하였다.
Claims (44)
- 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서,
(a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해(lysing)시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계;
(b) 상기 용해된 세포 조성물을 해유화(demulsifying)시켜 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계;
(c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 상기 오일을 분리하는 단계; 및
(d) 상기 오일을 회수하는 단계
를 포함하되, 여기서 (b) 단계가 하나 이상의 효소를 첨가함을 포함하는, 방법. - 제 1 항에 있어서,
(a) 단계 또는 (b) 단계 중 하나 이상이, 상기 세포 또는 조성물을 60℃ 이상으로 가열함을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
(a) 단계 또는 (b) 단계 중 하나 이상이, 상기 세포 또는 조성물을 약 60℃ 내지 약 100℃로 가열함을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 단계가, 상기 용해된 세포 조성물에 염기를 첨가함을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 단계가, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 약 8 이상으로 올림을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 단계가, 상기 용해된 세포 조성물의 중량 기준으로 약 0.05중량% 내지 약 20중량%의 양으로 염을 첨가함을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 단계가 상기 용해된 세포 조성물을 진탕(agitating)시킴을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 단계가 상기 세포를 진탕시킴을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 단계가, 상기 용해된 세포 조성물에 유화제를 첨가함을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 단계의 세포가 미세척된 것인, 방법. - 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 단계의 세포가 발효액에 함유되어 있는, 방법. - 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
(c) 단계가 상기 해유화된 용해된 세포 조성물을 원심분리함을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다중불포화 지방산이, 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산, 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는, 방법. - 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 다중불포화 지방산이, 도코사헥사엔산 (DHA), 에이코사펜타엔산 (EPA), 도코사펜타엔산 (DPA), 아르아키돈산 (ARA), 감마-리놀렌산 (GLA), 다이호모-감마-리놀렌산 (DGLA), 스테아리돈산 (SDA), 및 이들의 혼합물 중에서 선택되는, 방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 다중불포화 지방산이 도코사헥사엔산 (DHA)인, 방법. - 제 14 항에 있어서,
상기 다중불포화 지방산이 아르아키돈산 (ARA)인, 방법. - 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물 세포가 조류(algae), 효모, 균류(fungi), 원생생물(protist), 또는 박테리아 세포인, 방법. - 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미생물 세포가 모르티에렐라(Mortierella) 속, 크립테코디늄(Crypthecodinium) 속, 또는 트라우스토키트리알(Thraustochytriales) 목으로부터 유래된 것인, 방법. - 제 17 항에 있어서,
상기 미생물 세포가 트라우스토키트리알 목으로부터 유래된 것인, 방법. - 제 18 항에 있어서,
상기 미생물 세포가 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속, 스키조키트리움(Schizochytrium) 속, 또는 이들의 혼합물로부터 유래된 것인, 방법. - 제 17 항에 있어서,
상기 미생물 세포가 모르티에렐라 알피나(Mortierella Alpina)로부터 유래된 것인, 방법. - 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 용해된 세포 조성물이, 액체, 세포 잔해, 및 미생물 오일을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포로부터 상기 오일을 수득하는 데 유기 용매가 사용되지 않는, 방법. - 제 1 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 해유화된 용해된 세포 조성물의 평균 입경이 10 ㎛ 이상인, 방법. - 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 효소가, 베타-글루카나제, 자일라나제, 셀룰라제, 펙티나제, 만나나제, 아밀라제, 및 이들의 조합 중에서 선택되는, 방법. - 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 효소가 베타-글루카나제인, 방법. - 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 효소가, 상기 용해된 세포 조성물의 중량 기준으로 약 0.05중량% 내지 약 10중량%의 양으로 첨가되는, 방법. - 제 9 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 유화제가 이온성 유화제인, 방법. - 제 6 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 염이 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염, 설페이트 염, 및 이들의 조합으로 구성된 군 중에서 선택되는, 방법. - 제 1 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서,
(d) 단계의 오일이 천연 오일(crude oil)인, 방법. - 제 30 항에 있어서,
(d) 단계가, 천연 오일을 정제하여 정제유를 수득함을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오일이 30중량% 이상의 아르아키돈산을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오일이 30중량% 이상의 도코사헥사엔산을 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오일의 아니시딘 값(anisidine value)이 약 50 미만인, 방법. - 제 1 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오일의 인 함량이 약 8 ppm 이하인, 방법. - 제 1 항 내지 제 35 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 오일이 약 5 meq/kg 미만의 과산화물가(peroxide value)를 갖는, 방법. - 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 오일.
- 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 6 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 단계가 pH를 약 6 이하로 낮춤을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 6 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 단계가, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 약 0.5 내지 약 6으로 낮춤을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 3 항 및 제 6 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항에 있어서,
(b) 단계가, 상기 용해된 세포 조성물의 중량 기준으로 약 0.5중량% 내지 약 20중량%의 양으로 산을 첨가함을 추가로 포함하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 단계 및 (b) 단계가 함께 조합되어 1단계 용해 및 해유화 단계를 형성하는, 방법. - 제 1 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서,
(c) 단계가, 상기 해유화된 용해된 세포 조성물의 pH를 올림을 추가로 포함하는, 방법. - 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서,
(a) 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계;
(b) 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시켜 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계;
(c) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 상기 오일을 분리하는 단계; 및
(d) 상기 오일을 회수하는 단계
를 포함하되, 여기서 (a) 및 (b) 단계가 서로 조합되어, 하나 이상의 효소를 첨가함을 포함하는 1단계 용해 및 해유화 단계를 형성하는, 방법. - 하나 이상의 미생물 세포로부터 하나 이상의 다중불포화 지방산을 포함하는 미생물 오일을 수득하는 방법으로서,
(a) 해유화된 용해된 세포 조성물을 형성하기에 적합한 하나 이상의 효소로, 미생물 오일을 포함하는 세포를 용해하는 단계;
(b) 상기 해유화된 용해된 세포 조성물로부터 상기 오일을 분리하는 단계; 및
(c) 상기 오일을 회수하는 단계
를 포함하되, 여기서 상기 해유화된 용해된 세포 조성물이 용해 도중에 수득되는, 방법.
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