CN113684088B - 一种微生物油脂提取方法及其所得微生物油脂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物油脂提取技术领域，具体涉及一种微生物油脂提取方法及其所得微生物油脂。所述微生物油脂提取方法包括：对菌体采用干法破壁，并以极性Et(30)≥38的极性溶剂进行提取；其中所述菌体的含水率为3％‑10％。本发明所述方法不仅能够显著提高难破壁的微生物的破壁率及油脂提取率，同时所得油脂产品的过氧化值和茴香胺值均相对较低，具有良好的品质；此外，该方法工艺简单，能耗低，更有利于实现工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物油脂提取技术领域，具体涉及一种微生物油脂提取方法及其所得微生物油脂。
背景技术
微生物油脂的传统提取工艺是从发酵液中分离出菌体，将菌体干燥处理后利用烷烃类溶剂(即非极性溶剂)提取细胞内脂质。该方法萃取率高，但是需要使用大量的挥发性且可燃的烷烃类溶剂，不仅操作条件危险需要使用昂贵的防爆设备，还需要执行溶剂回收工艺，增大成本的同时还增加了工艺的复杂度；而且，由于菌体干燥会使微生物受热，如操作不恰当会使油脂品质下降；此外，所得油脂产品中仍然会残留部分烷烃类溶剂，对产品品质影响较大。
为了避免上述问题的发生，技术人员尝试采用极性溶剂替换非极性溶剂来提取微生物中的油脂，但须先对发酵液进行破壁处理，如CN1416469A、CN107523417A、CN105960235A等。
然而常规破壁手段对一些细胞壁厚或细胞壁组成复杂的菌体(如高山被孢霉、双鞭甲藻、吾肯氏壶藻等)来讲，常规破壁手段破壁效果较差；导致后续提油率非常低，而采用极端破壁手段(如在极端化学条件下破壁)又严重破坏油脂品质。
因此，针对难破壁的微生物，如何既能提高其破壁率及提油率，实现产业化提取，又能保证油脂品质，成为本行业的亟需解决的技术问题之一。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种新的微生物油脂提取方法。所述方法不仅能够显著提高难破壁的微生物的破壁率及油脂提取率，同时所得油脂产品的过氧化值和茴香胺值均相对较低，具有良好的品质；此外，该方法工艺简单，能耗低，更有利于实现工业化生产。
本发明所述的微生物油脂提取方法，包括：对菌体采用干法破壁，并以极性Et(30)≥38的极性溶剂进行提取；其中所述菌体的含水率为3％-10％。
现有技术采用烷烃类溶剂(即非极性溶剂)对干燥处理后的菌体进行提取，虽提取率高，但油脂品质较差，且有溶剂残留；极性溶剂提取技术可以避免非极性溶剂的部分缺陷，但须先对发酵液进行湿法破壁处理；然而对一些细胞壁厚或细胞壁组成复杂的菌体(如高山被孢霉、双鞭甲藻、吾肯氏壶藻等)，破壁效果较差，甚至无法破壁，导致后续提油率非常低；而采用极端破壁手段(如在极端化学条件下破壁)又严重破坏油脂品质。
干法破壁具有破壁率高、无溶剂残留等优点，常用于中药制备领域中；本发明技术人员试图将其用于细胞壁厚或细胞壁组成复杂的菌体的破壁处理，以解决其难破壁的问题；试验表明，虽然采用了干法破壁可显著提高破壁率，但也正因为其破壁能力强，在破壁过程中菌体容易因温度过高发生细胞碳化或糊化的情况，部分油脂还发生美拉德反应，导致油脂颜色较深，给后续油脂精炼增加困难，不仅无法获得较高的提油率，而且还会降低油脂品质。
为此，本发明技术人员又进一步研究发现，当菌体含水率在3％-10％之间，菌体具有合适的脆性，此时采用干法破壁，既能实现较高的破壁率，又可缩短破壁时间，避免菌体长时间高温下发生细胞碳化或糊化的情况，从而显著提高提油率且保证油脂品质；真正实现极性溶剂对此类难破壁微生物(如高山被孢霉、双鞭甲藻、吾肯氏壶藻、裂殖壶菌或破囊壶菌等)油脂提取的目的。
优选地，所述菌体的含水率控制在3％-5％之间。
根据本发明的一些实施例，所述菌体的含水率是通过将微生物发酵液过滤或离心得到的湿菌体(含水率60-70％)于低于60℃温度下干燥而得到的。
本发明中，所述干燥的具体工艺可根据需要进行选择。作为较为优选的具体实施方式之一，所述菌体的含水率可采用下述方法获得：先将微生物发酵液过滤或离心得到的湿菌体(含水率60-70％)采用挤压等手段控水至水含量在40％以下；再将湿菌体于50-60℃条件下真空干燥至目标含水率。研究表明，通过分阶段控制菌体中含水率，既能保证最终得到的菌体具有良好的脆性，提高破壁率及提油率，同时又能避免其脂质结构发生变化，影响油脂产品品质。所述干燥方式可为冷冻干燥、沸腾干燥、真空干燥等常规方式。
根据本发明的一些实施例，所述菌体的颗粒度需控制在10目以下。研究表明，合理控制菌体颗粒度不仅有利于降低破壁难度，提高破壁率，缩短破壁时间，更有助于保护脂质结构的稳定，同时还缩短整体提取时间。
根据本发明的一些实施例，所述干法破壁优选超微粉碎破壁；采用此技术处理后的物料颗粒度不大于20μm，有助于提高后续提油率；而且破壁效率高，大大缩短破壁时间，可避免油脂过氧化值和茴香胺值过高，更有利于提高油脂品质。
此外，为了获得更好的破壁效果，优选所述超微粉碎破壁在真空或充氮环境、温度＜45℃的条件下进行；研究表明，在惰性气体的氛围下或者真空等条件的保护下，温度保持在较低的温度下对仪器更友好，破壁效果也会更进一步提升。
进一步地，所述超微粉碎破壁优选研磨式超微粉碎破壁；研磨式超微粉碎破壁的压力条件为0.1-1MPa，可根据菌体的具体种类调整合适的压力条件；例如对于双鞭甲藻、裂殖壶菌、破囊壶菌、酵母等细胞壁较厚和/或球形菌体，需要在较高的压力如0.5-1MPa条件下破壁；而高山被孢霉等霉菌类不规则丝状真菌，其压力选择范围更宽，压力0.1-1MPa范围内皆可。
作为具体实施方式之一，所述研磨式超微粉碎的条件为：压力0.1-1MPa，转速10-60r/min，滚筒间隙小于1mm。
根据本发明的一些实施例，所述极性溶剂分为Et(30)值范围为38≤Et(30)值≤52的极性溶剂和Et(30)>52的极性溶剂两大类。
ET(30)是目前最为完善及常用的表示极性的经验参数，它是由Reichardt和Dimroth等提出的，采用吡啶鎓-N-苯氧内盐染料(Reichardt’s dye)在溶剂中的紫外可见光谱(UV-Vis)的吸收谱带的电子跃迁能来表征的。由于该分子具有分子内电荷迁移(CT)特性的π-π*吸收谱带，应用范围广。采用吡啶鎓-N-苯氧内盐染料法已经测量了300多种纯溶剂的ET(30)值，由此确定的溶剂极性已被本领域研究工作者认同。
根据本发明的一些实施例，所述极性溶剂的Et(30)值在38≤Et(30)值≤52时，极性溶剂可以直接通过萃取破壁后物料提取到油脂；萃取条件为：温度20-50℃，提取时间为10-60min，萃取次数1-2次；所述极性溶剂的体积量为所述菌体的5-10倍。
所述Et(30)值在38≤Et(30)值≤52的极性溶剂优选Ethyl acetate(乙酸乙酯)、i-propanol(异丙醇)、Chloroform(氯仿)、Acetone(丙酮)、Acetic acid(乙酸)或Acetonitrile(乙腈)中的一种或多种；进一步优选异丙醇和/或乙酸乙酯。
根据本发明的一些实施例，所述Et(30)>52以上的极性溶剂，提取步骤为：通过先将破壁后的物料配制乳状液，再破乳、分离提取油脂。优选地，所述Et(30)>52以上的极性溶剂为水和/或乙醇时，控制物料的质量浓度在10-20％之间，合适的流动性更有利于提高提油率。
根据本发明的一些实施例，在所述破乳的过程中，控制体系pH在7-10之间，并将乳状液先升温至50-60℃保持4-12h，可辅以搅拌操作，再升温至90-100℃保持5～10min；研究表明，通过合理分阶段控制温度更有利于提高破乳效果，同时避免长时间高温造成油脂品质下降。
为了获得更好的破乳效果，所述破乳还包括：加入碱性蛋白酶进行酶解反应；所述碱性蛋白酶可破坏物料中蛋白质，从而使乳化液破乳，两相分离。
优选地，所述酶解反应的条件为：控制体系pH至7-10，温度50-60℃，时间5-7h；研究表明，在此条件下酶解效果更优，更有助于提高提油率。
优选地，所述碱性蛋白酶的加入量为所述干菌体质量的0.5％-1％。
根据本发明的一些实施例，所述破乳还包括：向体系中加入辅助酶；所述辅助酶为果胶酶、β-葡聚糖酶或磷脂酶中的一种或多种；优选果胶酶和β-葡聚糖酶。
其中，所述果胶酶的加入量为所述干菌体质量的0.1％-0.5％；所述β-葡聚糖酶的加入量为所述干菌体质量的0.1％-0.5％；所述磷脂酶的加入量为所述干菌体质量的0.1％-0.5％。研究表明，上述酶的加入可在提高油脂提油率的同时，更显著降低油脂产物的过氧化值和茴香胺值，显著提高产品品质。
所述辅助酶的加入的方式分为两种：一种是所述辅助酶待所述碱性蛋白酶的酶解反应结束后加入，控制体系的pH至6-8酶解反应4-6h；另一种是所述辅助酶与所述碱性蛋白酶同时加入，并控制体系的pH至7-9；优选地，与碱性蛋白酶同时加入。
根据本发明的一些实施例，所述提取的过程包括：将所述酶解反应后得到的反应液离心，分离后油相降温至35℃以下，得到微生物油脂产物。其中所述离心的转速为6000-8000r；离心的时间为3-5min。
此外，为了进一步提高提油率，所述提取方法还包括在所述乳状液破乳前对其进行湿法物理破壁；所述湿法物理破壁包括搅拌、高速剪切、胶体磨剪切、湿法研磨、高压均质等。
根据本发明的一些实施例，所述提取油脂还包括：将破乳后两相体系离心，分离，油相降温至35℃以下，得到微生物油脂产物。其中所述离心的转速为6000-8000r；离心的时间为3-5min。
此外，在一些实施方式中，还可以通过例如倾析、撇除、真空处理、泵送、吸取、抽取、虹吸，或以其他方式从分离的组合物表面回收微生物油脂。
本发明所述的提取方法适用于大多数微生物，尤其适用于双鞭甲藻、吾肯氏壶藻、裂殖壶菌、破囊壶菌、酵母等细胞壁较厚和/或球形菌体，和高山被孢霉等霉菌类不规则丝状真菌，可显著提高此类微生物的提油率。
本发明还提供上述方法得到的微生物油脂，其包含不少于70％的多不饱和脂肪酸；所述多不饱和脂肪酸选自ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸或十八碳四烯酸中的一种或多种；
优选地，所述微生物油脂是针对粗制的毛油而言的。
优选地，所述微生物油脂中，甘油三酯含量达到90％以上，油脂的茴香胺值≤5，过氧化值≤3。
进一步优选地，所述微生物油脂中，甘油三酯含量达到90％以上，油脂的茴香胺值≤4，过氧化值≤3。
优选地，所述微生物油脂包含花生四烯酸(ARA)，以甘油三酯计，花生四烯酸含量不少于37％，茴香胺值(AnV)≤4，过氧化值(POV)≤3。
优选地，所述微生物油脂包含二十二碳六烯酸(DHA)，以甘油三酯计，二十二碳六烯酸不少于35％，茴香胺(AnV)≤5，过氧化值(POV)≤3。
本发明的有益效果如下：
本发明首次提出采用干法破壁(尤其是超微粉碎破壁)-极性溶剂提取相结合的油脂提取方式。该方法可显著提高细胞壁厚、组成复杂类微生物的破壁率(达到98％以上)及提油率；而且，所得毛油指标较好，减轻了后续精炼工艺的压力。
附图说明
图1为实施例1所述方法获得的微生物油脂产品及乳液镜检图。
图2为现有技术酸法破壁获得的产物的油脂产品及乳液镜检图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)超微粉碎破壁：
先将5000g高山被孢霉发酵液过滤或离心，得到含水量65％湿菌体，于60℃真空干燥，得到900g干菌体；所得菌体中水分为4.8％；
将所得菌体于0.4MPa，30r/min超微粉碎10min；镜检破壁率为98％；
(2)提取：
以水作为极性溶剂进行提取；向破壁所得物料加水稀释至含有细胞碎片质量浓度15％，得到乳状液；
破乳：将乳状液pH调至8，55℃搅拌6小时，再于95℃煮沸5min；
分离：将步骤(2)所得两相体系离心，分离；离心转速8000r，离心时间3min；将分离后的油相通过换热方式降温到35℃以下，得到微生物油脂，甘油三酯含量为93％，其镜检图如图1所示。
图1为实施例1所述方法获得的微生物油脂产品及乳液镜检图。
图2为现有技术酸法破壁获得的产物的油脂产品及乳液镜检图。
实施例2
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)超微粉碎破壁：
先将5000g高山被孢霉发酵液过滤或离心，得到含水量65％湿菌体，于60℃真空干燥，得到900g干菌体；所得菌体中水分为8％；
将所得菌体于0.3MPa，30r/min超微粉碎20min；镜检破壁率为98％；
(2)与实施例1相同。
实施例3
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)与实施例1相同；
(2)提取：
以水作为极性溶剂进行提取；
向破壁所得物料加水稀释至含有细胞碎片质量浓度20％，得到乳化液；
破乳：向乳状液中添加9g碱性蛋白酶，pH调至9，55℃搅拌6小时，再于90℃保温5min。
提取：离心转速6000r/min。
实施例4
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)与实施例1相同；
(2)提取：
以水作为极性溶剂进行提取：向破壁所得物料加水稀释至含有细胞碎片质量浓度20％，得到乳化液；
破乳：向乳状液中添加9g碱性蛋白酶，pH调至9，55℃搅拌6小时；再添加0.9g果胶酶、0.9gβ-葡聚糖酶，调pH＝6，反应6小时；最后于95℃煮沸5min。
提取：离心转速6000r/min。
实施例5
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)与实施例1相同；
(2)提取：
以水作为极性溶剂进行提取：向破壁所得物料加水稀释至含有细胞碎片质量浓度20％，得到乳化液；
破乳：向乳状液中同时添加9g碱性蛋白酶，0.9g果胶酶、0.9gβ-葡聚糖酶，氮气搅拌反应6小时，pH调至8，55℃反应6小时。最后于95℃煮沸5min。
提取：离心转速6000r/min。
实施例6
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)与实施例1相同；
(2)提取：
以水作为极性溶剂进行提取；向破壁所得物料加水稀释至含有细胞碎片质量浓度15％，先用剪切机20000r，混30min，使用砂磨机循环10次，得到乳状液。
破乳：与实施例4相同
分离：转速8000r/min。
实施例7
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)与实施例1相同；
(2)提取：
以异丙醇作为溶剂进行萃取；其中单次萃取异丙醇使用体积量为菌体的5倍，温度为50℃，搅拌30min，萃取2次。
实施例8
本实施例提供一种双鞭甲藻油脂的提取方法，包括：
(1)超微粉碎破壁
先将5000g双鞭甲藻发酵液过滤或离心，得到含水量65％湿菌体，于60℃真空干燥，得到1500g干菌体；所得菌体中水分为5％；
将所得菌体于0.8MPa，30r/min超微粉碎10min；镜检破壁率为98％；
(2)提取：
以水作为极性溶剂进行提取；向破壁所得物料加水稀释至含有细胞碎片质量浓度15％，得到乳状液；
破乳：将乳状液pH调至9，55℃搅拌6小时，再于95℃煮沸5min；
分离：将步骤(2)所得两相体系离心，分离；离心转速8000r，离心时间3min；将分离后的油相通过换热方式降温到35℃以下，得到微生物油脂，其甘油三酯含量为95％。
实施例9
本实施例提供一种双鞭甲藻油脂的提取方法，包括：
(1)超微粉碎破壁
先将5000g双鞭甲藻发酵液过滤或离心，得到含水量65％湿菌体，于60℃真空干燥，得到1500g干菌体；所得菌体中水分为5％；
将所得菌体于0.8MPa，30r/min超微粉碎10min；镜检破壁率为98％；
(2)提取：
以异丙醇作为溶剂进行萃取；其中单次萃取异丙醇使用体积量为菌体的5倍，温度为50℃，搅拌30min，萃取2次。
实施例10
本实施例提供一种双鞭甲藻油脂的提取方法，包括：
(1)超微粉碎破壁：
先将5000g双鞭甲藻发酵液过滤或离心，得到含水量65％湿菌体，于60℃真空干燥，得到1500g干菌体；所得菌体中水分为5％；
将所得菌体于0.3MPa，30r/min超微粉碎20min；镜检破壁率为93％；
(2)提取：
同实施例9。
实施例11
本实施例提供一种双鞭甲藻油脂的提取方法，包括：
(1)超微粉碎破壁
先将5000g双鞭甲藻发酵液过滤或离心，得到含水量65％湿菌体，于60℃真空干燥，得到1500g干菌体；所得菌体中水分为5％；
将所得菌体于0.8MPa，30r/min超微粉碎10min；镜检破壁率为98％；
(2)提取：
以乙酸乙酯作为溶剂进行萃取；其中单次萃取乙酸乙酯使用体积量为菌体的7倍，温度为50℃，搅拌30min，萃取2次。
实施例12
本实施例提供一种对高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)干法破壁：将干菌体采用球磨机进行破壁，时间为240min，破壁率达到86％；
(2)提取：
以异丙醇作为极性溶剂进行萃取；其中单次萃取异丙醇使用体积量为干菌体的5倍，温度为50℃，搅拌30min，萃取2次。
实施例13
本实施例提供一种对高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)干法破壁：将干菌体进行高速剪切粉碎机破壁，时间为240min，破壁率达到78％；
(2)提取：
以异丙醇作为极性溶剂进行萃取；其中单次萃取异丙醇使用体积量为干菌体的5倍，温度为50℃，搅拌30min，萃取2次。
对比例1
本对比例提供一种对高山被孢霉油脂的常规酸法无溶剂提取方法
(1)酸法破壁：先将1000g高山被孢霉发酵液，测得固形物浓度为12％，将发酵液使用盐酸调PH＝0.7，再用剪切机混合均匀，再在90℃搅拌反应28小时。
(2)升温破乳：pH调至8，将反应后的溶液加热到95℃，保温5min。
(3)离心分离：将升温后的溶液，进行保温离心5min，转速为8000r.
(4)取层油脂层，并快速降温到35℃以下。
对比例2
本对比例提供一种对高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)湿法破壁：将900g干菌体加水稀释20％，高压均质机循环3次，压力50MPa；
(2)提取：
破乳：向破壁后的物料中添加9g碱性蛋白酶，pH调至9，55℃搅拌6小时，再于95℃煮沸5min；
分离：转速8000r离心3min，分离油脂。
对比例3
本对比例提供一种对高山被孢霉油脂的提取方法，包括：将未破壁的干菌体直接用异丙醇萃取，其中单次萃取异丙醇使用体积量为干菌体的5倍，温度为50℃，搅拌30min，萃取2次。
对比例4
本对比例提供一种对高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)干法破壁：将干菌体加水稀释至20％后进行胶体磨破壁160min，物料颗粒大小至20μm；
(2)提取：
以异丙醇作为极性溶剂进行萃取；其中单次萃取异丙醇使用体积量为干菌体的5倍，温度为50℃，搅拌30min，萃取2次。
对比例5
本对比例提供一种高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)超微粉碎破壁：
先将5000g高山被孢霉发酵液过滤或离心，得到含水量65％湿菌体，于60℃真空干燥，得到900g干菌体；所得菌体中水分为2％；
将所得菌体于0.3MPa，30r/min超微粉碎10min；镜检破壁率为98％；
(2)与实施例1相同
对比例6
本对比例提供一种高山被孢霉油脂的提取方法，包括：
(1)超微粉碎破壁：
先将5000g高山被孢霉发酵液过滤或离心，得到含水量65％湿菌体，于60℃真空干燥，得到900g干菌体；所得菌体中水分为17％；
将所得菌体于0.3MPa，30r/min超微粉碎30min；镜检破壁率为60％；
(2)与实施例1相同。
对比例7
本实施例提供一种双鞭甲藻油脂的提取方法，包括：将未破壁的干菌体直接用异丙醇萃取，其中单次萃取异丙醇使用体积量为干菌体的5倍，温度为50℃，搅拌30min，萃取2次。
效果验证
将上述实施例1-13及对比例1-7所述方法得到的产品进行检测，结果如表1、表2所示。
表1
表2
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种微生物油脂提取方法，其特征在于，包括：对菌体采用超微粉碎破壁，并以极性Et（30）＞52的极性溶剂进行提取，所述Et（30）＞52的极性溶剂为水；所述菌体的含水率为3%-10%；
所述提取包括向破壁后的物料中加水配制成乳状液，再破乳、分离提取油脂；所述乳状液中物料的质量浓度在10-20%之间；所述破乳包括向体系中加入碱性蛋白酶进行酶解；所述酶解反应的条件为：体系pH至7-10，温度为50-60℃，时间为5-7h；所述破乳还包括向体系中加入辅助酶，所述辅助酶选自果胶酶和β-葡聚糖酶；所述酶解结束后，将体系升温至90-100℃保持5~10min；所述碱性蛋白酶的加入量为干菌体质量的0.5%-1%，所述果胶酶的加入量为干菌体质量的0.1%-0.5%，所述β-葡聚糖酶的加入量为干菌体质量的0.1%-0.5%。
2.根据权利要求1所述的微生物油脂提取方法，其特征在于，所述菌体的含水率为3%-5%；
和/或，所述菌体是由微生物发酵液过滤或离心得到的湿菌体于<60℃温度下干燥而得到的；
和/或，所述菌体的颗粒度在10目以下。
3.根据权利要求1所述的微生物油脂提取方法，其特征在于，所述超微粉碎破壁为研磨式超微粉碎破壁，其操作条件为：压力0.1-1MPa，转速10-60r/min，滚筒间隙小于1mm。
4.根据权利要求1所述的微生物油脂提取方法，其特征在于，所述果胶酶和β-葡聚糖酶的加入方式分为两种：一种是，所述果胶酶和β-葡聚糖酶待所述碱性蛋白酶的酶解反应结束后加入，控制体系的pH至6-8，酶解反应4-6h；
另一种是，所述果胶酶和β-葡聚糖酶与所述碱性蛋白酶同时加入，并控制体系的pH至7-9。
5.根据权利要求4所述的微生物油脂提取方法，其特征在于，所述果胶酶和β-葡聚糖酶与所述碱性蛋白酶同时加入。
6.根据权利要求1-5任一所述的微生物油脂提取方法，其特征在于，所述菌体选自双鞭甲藻、吾肯氏壶藻、裂殖壶菌、破囊壶菌、酵母、高山被孢霉中的一种或多种。
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| CN113684088A (zh) | 2021-11-23 |
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