CN113684087B - 一种微生物油脂无溶剂提取方法及所得微生物油脂 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物油脂提取技术领域，具体涉及一种微生物油脂无溶剂提取方法及所得微生物油脂。所述微生物油脂无溶剂提取方法包括：对菌体采用干法物理破壁，且所述菌体的含水率≤10％。本发明首次提出在无溶剂提取工艺中采用干菌体为原料，通过控制菌体的脆性在合适的范围内，结合干法物理破壁技术，不仅能实现对细胞壁厚、组成复杂的微生物的完全破壁，提高提油率，而且还可避免因破壁条件极端化(温度过高)导致油脂被氧化，影响最终油脂产品的品质的情况发生，解决了现有无溶剂提取工艺难以兼顾的技术问题。
Description
技术领域
本发明属于微生物油脂提取技术领域，具体涉及一种微生物油脂无溶剂提取方法及所得微生物油脂。
背景技术
微生物油脂提取工艺可分为溶剂萃取和无溶剂提取。溶剂萃取是指将菌体进行干燥后采用烷烃溶剂进行萃取；该方法虽然萃取率高，但是需要使用大量的挥发性且可燃的有机溶剂，操作条件危险且需要使用昂贵的防爆设备，以及需要执行昂贵的溶剂回收工艺；此外，所得油脂产品中有溶剂残留，对产品品质影响较大。
无溶剂提取是指在发酵液中进行细胞裂解破壁，形成乳液后同时或分布进行破乳，分离得到油脂；其中所述裂解破壁的方法包括化学破壁(酸法、碱法)、酶解破壁、机械剪切破壁等，例如CN1416469A、CN107523417A、CN105960235A等。所得油脂产品中无溶剂残留，产品更健康，更受人们关注。
然而，在实际提取研究中发现，无溶剂方法具有一定的局限性，对于一些细胞壁较厚、细胞壁组成复杂的微生物，采用常规的破壁方法提取效果并不理想；例如高山被孢霉属于丝状真菌，具有较厚的细胞壁，由长长的菌丝和孢子组成，根据CN107523417A中实施例6所述，其提油率为32.5％。
当然，现有技术也有采用极端的化学方法使细胞破壁，但对油脂品质破坏严重，并且这种方法需要付出相当高的能耗及时间来执行此步骤；虽然有案例将裂解和破乳同时进行来节约工时、或者蒸发发酵液中的水分来帮助破乳，但这必然会影响到整体的提取效果，使得最后收获难以达到令人满意的收率，并且高强度的条件也影响所得油脂的品质，
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种新的微生物油脂无溶剂提取方法。所述方法显著提高提油率，同时保证油脂具有良好的品质。
本发明所述的微生物油脂无溶剂提取方法，包括：对菌体采用干法物理破壁，并控制所述菌体的含水率控≤10％。
本发明技术人员在研究中发现，常规的无溶剂提取方法对某些细胞壁较厚，细胞壁组成复杂的微生物的提取效果并不理想，其中原因之一就是破壁效果难以达到预期，甚至无法破壁，油滴难以全部浸出，导致后续无溶剂提取失去意义。虽然技术人员也尝试将多种常规破壁方法组合，不断调整组合方式，优化调整操作条件，提高了破壁率及提油率，但由于破壁工艺所使用的极端条件，油脂品质难以保证；即高品质油脂和高效提油率是目前无溶剂提取工艺难以兼顾的。
在经过大量努力不断改进后，本申请技术人员发现将微生物发酵液先除水至一定程度，控制干菌体的脆性在合适的范围内，结合干法物理破壁技术，不仅能实现对细胞壁厚、组成复杂的微生物的完全破壁，提高提油率，而且还可避免因破壁条件极端化(温度过高)导致油脂被氧化，影响最终油脂产品的品质的情况发生，解决了现有无溶剂提取工艺难以兼顾的技术问题。
优选地，所述菌体的含水率控制在≤5％，且所述菌体的颗粒度控制在10目以下。研究表明，在此条件下所得菌体的脆性结合干法物理破壁后提取综合效果更佳。
根据本发明的一些实施例，所述菌体是通过下述方法制得：将微生物发酵液过滤或离心得到湿菌体(含水率60-70％)；再将湿菌体于＜60℃条件下干燥至目标含水率；所述干燥包括冷冻干燥、沸腾干燥、真空干燥等。研究表明，通过分阶段合理控制菌体中水分，既能保证最终得到的干菌体具有良好的脆性，又能避免其中油脂被氧化，保证产品的品质。
本发明中，所述干法物理破壁的具体方式可采用本领域的常用方法，如研磨和/或剪切、超微粉碎等；常用的干法破壁的设备主要有球磨机、高速剪切机、超微粉碎机等。
根据本发明的一些实施例，所述干法物理破壁所得物料的粒径≤30μm，破壁率达到95％以上，以确保后续提取效果。
作为本发明的具体实施方式之一，当所述干法物理破壁采用研磨和/或剪切破壁时，控制干法物理破壁的温度≤45℃；进一步优选地，所述干法物理破壁是在真空或充氮保护下进行的，如此既可通过延长破碎时间进一步提升破壁率，又避免油脂在长时间破壁处理过程中被氧化，降低油脂品质。
作为本发明的又一具体实施方式，当所述干法物理破壁采用超微粉碎破壁时，如研磨式超微粉碎，控制所述菌体的含水率在3-10％之间，优选含水率在3-5％之间，且控制所述干法物理破壁的压力在0.1-1MPa之间，如此即可用较短的时间将物料颗粒粉碎至20μm以下，优选10μm以下，且破壁率达到98％以上。
根据本发明的一些实施例，所述微生物油脂无溶剂提取方法还包括将所述干法物理破壁所得物料制成乳状液、破乳；
优选地，所述乳状液中细胞碎片的质量浓度为10-20％；研究表明，在此浓度条件下可以确保乳状液具有适合的流动性，更有利于后续破乳及油脂提取效果的提高。
优选地，在所述破乳前对所述乳状液进行湿法物理破壁；所述湿法物理破壁包括搅拌、高速剪切、湿法研磨、高压均质等，进一步优选采用湿法研磨。
根据本发明的一些实施例，所述破乳的过程中，控制体系的pH为7-10，温度为50-60℃，破乳时间为4-12小时，还可辅以搅拌等措施；在一些更为优选的实施例中，所述破乳结束后，将体系继续升温至90-100℃保持5～10min；研究表明，在此条件下，水达到汽化，更有助于提高油水分离程度，可进一步提高油脂收率。
根据本发明的一些实施例，所述破乳还包括：向体系中加入碱性蛋白酶进行酶解反应；优选地，所述碱性蛋白酶的加入量为所述干菌体质量的0.5％-1％。
作为具体的实施方式之一，采用所述碱性蛋白酶进行酶解时，控制体系pH至7-10，温度50-60℃，时间5-7h；研究表明，在此条件下酶解效果更优，更有助于提高提油率。
根据本发明的一些实施例，所述破乳还包括向体系中加入辅助酶；所述辅助酶选自果胶酶、β-葡聚糖酶或磷脂酶中的一种或多种；优选果胶酶和β-葡聚糖酶。
其中，所述果胶酶的加入量为所述干菌体质量的0.1％-0.5％；所述β-葡聚糖酶的加入量为所述干菌体质量的0.1％-0.5％；所述磷脂酶的加入量为所述干菌体质量的0.1％-0.5％。研究表明，上述辅助酶的加入可在提高油脂提油率的同时，更显著降低油脂产物的过氧化值和茴香胺值，显著提高产品品质。
所述辅助酶的加入方式为：待所述碱性蛋白酶的酶解反应结束后加入所述辅助酶，同时控制体系的pH至6-8酶解反应4-6h；或者，所述辅助酶与所述碱性蛋白酶同时加入，并控制体系的pH至7-9；优选所述辅助酶与碱性蛋白酶同时加入。
根据本发明的一些实施例，所述提取的过程包括：将所述酶解反应后得到的反应液离心，分离后油相降温至35℃以下，得到微生物油脂产物。其中所述离心的转速为6000-8000r；离心的时间为3-5min。
本发明所述的无溶剂提取方法适用于大多数微生物，如双鞭甲藻、吾肯氏壶藻、裂殖壶菌、破囊壶菌、酵母、高山被孢霉，特别适用于高山被孢霉、双鞭甲藻、酵母等这类细胞壁厚、组成复杂的微生物，可显著提高此类微生物的提油率。
本发明还提供上述方法得到的微生物油脂。优选的，该微生物油脂是针对粗制的油而言。
所述微生物油脂中含有多不饱和脂肪酸；所述多不饱和脂肪酸为ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、花生四烯酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸或十八碳四烯酸中的一种或多种。
优选地，所述微生物油脂中甘油三酯含量达到90％以上，所述微生物油脂的茴香胺值≤5，过氧化值≤3。
进一步优选地，所述微生物油脂中甘油三酯含量达到90％以上，所述微生物油脂的茴香胺值≤4，过氧化值≤3。
优选地，微生物油脂包含花生四烯酸(ARA)，以甘油三酯计，ARA含量不少于37％，茴香胺值(AnV)≤4，过氧化值(POV)≤3。
优选地，所述微生物油脂包含二十二碳六烯酸(DHA)，以甘油三酯计，DHA不少于35％，茴香胺(AnV)≤5，过氧化值(POV)≤3。
本发明的有益效果如下：
本发明提供一种新的微生物油脂无溶剂提取方法。首次提出在无溶剂提取工艺中采用干菌体为原料，通过干法物理破壁促使细胞壁破碎，充分获得油脂；同时对破乳及提取工艺进行优化改进，显著提高提油率的同时，保证了油脂良好的品质。
附图说明
图1为实施例2所述干法物理破壁获得的高山被孢霉ARA油脂及乳液镜检图。
图2为对比例1所述酸法破壁获得的高山被孢霉ARA乳液镜检图。
图3为对比例2所述酸法破壁获得的高山被孢霉ARA油脂图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的无溶剂提取方法，包括：
(1)干法物理破壁：先将1000g高山被孢霉发酵液过滤，得到含水量65％湿菌体，于45℃真空干燥，得到120g干菌体；所得干菌体中水分含量控制在5％；
通过超微粉碎方法破壁使物料颗粒物粒径达到20μm，破壁率达到98％以上结束；
将破壁所得物料加水稀释至含有细胞碎片质量浓度15％的乳状液；
(2)破乳：将乳状液pH调至9，55℃搅拌6小时；
(3)分离提取油脂：将破乳所得混合液于95℃保持5min，离心转速8000r/min，离心3min；将分离后的油相降温到35℃以下，得到花生四烯酸油脂，甘油三酯含量为92％。
实施例2
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的无溶剂提取方法，与实施例1的区别在于：
步骤(1)：乳状液中含有细胞碎片质量浓度20％；
步骤(2)：向乳状液中添加0.6g碱性蛋白酶，pH调至9，55℃搅拌6小时；
步骤(3)：将破乳所得混合液于90℃保温5min。
图1为实施例2所述干法物理破壁获得的高山被孢霉ARA油脂及乳液镜检图。
实施例3
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的无溶剂提取方法，与实施例1的区别在于：
步骤(1)：乳状液中含有细胞碎片质量浓度20％；
步骤(2)：向乳状液中添加0.6g碱性蛋白酶，pH调至9，55℃搅拌6小时；再添加0.12g果胶酶、0.12gβ-葡聚糖酶，调pH＝6.5，反应4小时。
步骤(3)：离心速度6000r/min。
实施例4
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的无溶剂提取方法，与实施例1的区别在于：
步骤(2)：向乳状液中同时添加0.6g碱性蛋白酶，0.12g果胶酶、0.12gβ-葡聚糖酶，氮气搅拌反应6小时，pH调至8，55℃反应6小时；
步骤(3)：离心的转速8000r。
实施例5
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的无溶剂提取方法，与实施例1的区别在于：
步骤(1)：乳状液中含有细胞碎片质量浓度20％；
步骤(2)：向乳状液中添加0.6g碱性蛋白酶，pH调至9，55℃搅拌6小时；再添加0.12g果胶酶、0.12gβ-葡聚糖酶，0.12g磷脂酶，调pH＝6.5，反应4小时。
步骤(3)：离心速度6000r/min。
实施例6
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的无溶剂提取方法，与实施例1的区别在于：
步骤(1)：乳状液中含有细胞碎片质量浓度20％；
步骤(2)先以20000r/min的剪切速度混合30min，继续采用砂磨机循环研磨10次,再加入0.6g的碱性蛋白酶，调PH＝9，55℃搅拌6小时。
步骤(3)：离心的转速6000r。
实施例7
本实施例提供一种高山被孢霉油脂的无溶剂提取方法，与实施例1的区别在于：
步骤(1)：乳状液中含有细胞碎片质量浓度20％；
步骤(2)先以20000r/min的剪切速度混合30min，继续采用高压均质循环5次,加0.6g的碱性蛋白酶，调PH＝9，55℃搅拌6小时。
步骤(3)：离心的转速6000r。
实施例8
本实施例提供一种双鞭甲藻的无溶剂提取方法：
(1)干法物理破壁：先将1000g双鞭甲藻发酵液离心，得到含水量60％湿菌体，于45℃真空干燥，得到120g双鞭甲藻干菌体；所得干菌体中水分含量控制在5％；
所得干菌体在充氮条件下利用研磨方法破壁，物料颗粒物达到20μm，破壁率达到95％；
将破壁所得物料加水稀释至含有细胞碎片质量浓度20％的乳状液；
(2)破乳：向乳状液中添加0.6g碱性蛋白酶，pH调至9，55℃搅拌6小时；再添加0.12g果胶酶、0.12gβ-葡聚糖酶，调pH＝6.5，反应4小时。；
(3)分离提取油脂：将破乳所得混合液于95℃保持5min，离心转速8000r/min，离心3min；将分离后的油相通过换热方式降温到35℃以下，得到DHA油脂，甘油三酯含量为93％。
对比例1
本对比例提供一种高山被孢霉油脂的酸法无溶剂提取，具体步骤如下：
(1)酸法破壁：先将1000g高山被孢霉发酵液，测得固形物浓度为12％；再将发酵液使用盐酸调pH＝2，用剪切机混合均匀，再在80℃搅拌反应12小时。
(2)升温破乳：pH调至8，加入碱性蛋白酶0.6g，与60℃下搅拌4h，将反应后的溶液加热到95℃，保温5min。
(3)离心分离：将升温后的溶液，进行保温离心5min，转速为8000r.
(4)取层油脂层，并快速降温到35℃以下。
图2为对比例1所述酸法破壁获得的高山被孢霉ARA乳液镜检图。
对比例2
本对比例提供一种高山被孢霉油脂的酸法无溶剂提取，具体步骤如下：
(1)酸法破壁：先将1000g高山被孢霉发酵液，测得固形物浓度为12％，将发酵液使用盐酸调PH＝0.7，再用剪切机混合均匀，再在90℃搅拌反应28小时。
(2)升温破乳：pH调至7，加入碱性蛋白酶0.6g，与60℃下保持4h，再将反应后的溶液加热到95℃，保温5min。
(3)离心分离：将升温后的溶液，进行保温离心5min，转速为8000r。
(4)取层油脂层，并快速降温到35℃以下。
图3为对比例2所述酸法破壁获得的高山被孢霉ARA油脂图。
对比例3
本对比例提供一种高山被孢霉油脂的无溶剂提取，与实施例1的区别在于：
(1)干菌体未进行干法物理破壁，直接加水稀释至菌浓为20％的混合液；
(2)向所得混合液中添加0.6g碱性蛋白酶，pH调至9，55℃搅拌6小时；再添加0.12g果胶酶、0.12gβ-葡聚糖酶，调pH＝6，反应6小时。
对比例4
本对比例提供一种高山被孢霉油脂的无溶剂提取，与实施例1的区别在于：
(1)干菌体未进行干法物理破壁，直接加水稀释至菌浓为20％的混合液；将混合液进行湿法破壁，高压均质机循环3次，压力50MPa；
(2)向所得混合液中添加0.6g碱性蛋白酶，pH调至9，55℃搅拌6小时；
(3)离心转速为8000r。
对比例5
本对比例提供一种高山被孢霉油脂的无溶剂提取，与实施例1的区别仅在于，得到的菌体含水量为15％。其他步骤均不变。
效果验证
将上述实施例1-8及对比例1-4所述方法所得产品进行检测，结果如表1、表2所示。
| 对比例1 | 对比例2 | 对比例3 | 对比例4 | 对比例5 | |
| 破壁工艺 | 酸法破壁 | 酸法破壁 | 酶法破壁 | 湿法破壁 | 干法破壁 |
| 提油率 | 26.3％ | 88.6％ | 10.7％ | 25.6％ | 32％ |
| 过氧化值(POV)≤2 | 25.6 | 37.5 | 1.5 | 1.8 | 1.8 |
| 茴香胺 | 22 | 32.5 | 2.0 | 2.5 | 2.3 |
| ARA或DHA含量 | 45.4％ | 42.5％ | 43.8％ | 46.8％ | 46.0％ |
表2
由表1可知：
(1)对比例1采用较为温和的酸法破壁，提油率较低，且过氧化值和茴香胺值过高，提取效果最差；对比例2采用条件剧烈的酸法破壁，提油率虽然尚可，但是油脂颜色较深，茴香胺值、过氧化值相对较高，油脂气味呈酸臭味，油品较差；对比例3直接采用酶法破壁，对比例4采用高压均质湿法破壁，两者所得油脂的过氧化值和茴香胺值较低，油品较好，但提油率相对较低，不能产业化生产；
(2)相比对比例1-4的破壁方法，实施例1-7采用对干菌体进行干法物理破壁，其提油率较高，同时过氧化值和茴香胺值较低，综合提取效果较佳。
(3)实施例2-7的提油率均高于实施例1，说明采用碱性蛋白酶与干法物理破壁相结合的处理方式可产生协同作用，使提油率显著提高。
(4)相比实施例2，实施例3、实施例5所得油脂的过氧化值较低，提油率较高，说明再碱性蛋白酶破乳后加入复合酶(果胶酶、β-葡聚糖酶)不仅使提油率得到进一步提升，而且有效降低油脂产物的过氧化值。
(5)相比实施例3和实施例5，实施例4的提油率较高，过氧化值和茴香胺值较低，说明在氮气保护下，同时加入碱性蛋白酶和复合酶(果胶酶、β-葡聚糖酶)并调节体系pH＝8，控制反应时间在6小时的优化控制条件下，可使提油率进一步提高(达到95.6％)，且显著降低过氧化值和茴香胺值，显著提升产品的品质。
(6)相比实施例2，实施例6提油率更高，说明在干法物理破壁基础上配合湿法研磨破壁处理，可以进一步提高破壁效果，进而提高提油率，实施例7虽然同样进行了湿法破壁但高压均值处理后破乳难度较大，导致提取率较低，不适用于无溶剂提取。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，包括：对菌体采用干法物理破壁，所述干法物理破壁为超微粉碎破壁，所述菌体的含水率控制在3-5%，且控制所述干法物理破壁的压力在0.1-1MPa；经所述干法物理破壁处理得到的物料的粒径≤30μm，破壁率达到95%以上；所述微生物油脂无溶剂提取方法还包括将所述干法物理破壁处理得到的物料制成乳状液及破乳；所述破乳包括：向体系中加入碱性蛋白酶进行酶解；所述碱性蛋白酶的加入量为所述菌体质量的0.5%-1%；在所述酶解过程中，控制体系的pH为7-10，温度为50-60℃，酶解时间为5-7h；所述破乳还包括：向体系中加入辅助酶；所述辅助酶选自果胶酶和β-葡聚糖酶；所述破乳结束后，将体系继续升温至90-100℃保持5~10min。
2.根据权利要求1所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，所述菌体的颗粒度在10目以下。
3.根据权利要求1所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，在所述破乳前，对所述乳状液进行湿法物理破壁；所述湿法物理破壁为湿法研磨。
4.根据权利要求1所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，所述辅助酶的加入方式是所述辅助酶于所述碱性蛋白酶的酶解反应结束后加入，同时控制体系的pH至6-8，酶解反应4-6h。
5.根据权利要求1所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，所述辅助酶的加入方式是所述辅助酶与所述碱性蛋白酶同时加入，同时控制体系的pH至7-9。
6.根据权利要求1-5任一所述的微生物油脂无溶剂提取方法，其特征在于，所述菌体为双鞭甲藻、吾肯氏壶藻、裂殖壶菌、破囊壶菌、酵母或高山被孢霉。
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