KR20160032041A - 단백질 약물의 불활성화를 위한 항체 로커 - Google Patents

단백질 약물의 불활성화를 위한 항체 로커 Download PDF

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Abstract

표적 세포 또는 조직의 질병을 치료하기 위해 표적 세포 또는 조직에서 선택적으로 활성화될 수 있는 힌지 항체가 본원에 기재되어 있다. 힌지 항체는 작용성 항체, 2개의 억제 도메인 및 4개의 절단가능한 링커를 포함한다. 작용성 항체는 활성화된 상태에서 질병을 치료할 수 있으며, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 갖는다. 각 억제 도메인은 면역글로불린의 힌지 도메인을 포함하며, 2개의 펩티드 암으로 구성된다. 각 절단가능한 링커는 표적 세포 또는 조직에서 특이적으로 또는 고도로 발현된 효소에 의해 절단가능한 펩티드 기질을 포함하며, 억제 도메인의 펩티드 암 중 하나를 작용성 항체의 경쇄 및 중쇄 중 하나의 N-말단에 연결시킨다. 또한, 본원에는 이러한 힌지 항체를 제조하고 이용하는 방법이 기재되어 있다.

Description

단백질 약물의 불활성화를 위한 항체 로커 {ANTIBODY LOCKER FOR THE INACTIVATION OF PROTEIN DRUG}
1. 본 발명의 분야
본 기재내용은 일반적으로, 다양한 질병을 치료하기 위한 치료제로서 유용한 항체-기반 분자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 기재된 발명은 표적 세포 또는 조직에서 선택적으로 활성화되어 표적 조직 또는 세포의 질병을 치료하기 위한 힌지 항체에 관한 것이다.
2. 관련된 기술의 설명
모노클로날 항체를 포함하는 항체-기반 치료제는 다양한 질병의 치료에서 유효한 주요 부류의 약물중 하나로서 제시되고 있다. 2012년 세계 판매 상위 10개 약물중 5개가 HUMIRA™, REMICADE™, RITUXAN™, HERCEPTIN™, 및 AVASTIN™를 포함하는 치료학적 항체이다. 상기 5개 약물은 전세계에서 약 450억 달러의 수익을 올렸으며, 이는 그 해의 전 세계 항체-기반 치료제 시장의 약 60%이다. 현존하는 제품들은 이들의 승인된 용도가 확장되고 새로운 시판물들이 시장에 론칭됨에 따라 세계 시장은 계속해서 성장할 것으로 예측된다.
본 분야가 계속 발전됨에도 불구하고, 더욱 효과적이고 적당한 항체-기반 후보자를 시장에 공급하기 위해서는 많은 도전이 여전히 남아 있다. 현 항체-기반 치료제와 관련된 한 문제점은 작용 부위의 불량한 선택성이다. 모노클로날 항체 및 가용성 융합 단백질은 이들의 의도된 표적 분자 (예컨대, 항원 및 세포 표면 수용체)에 결합하여 중화시키는데 특이적이다. 그러나, 대부분의 표적 분자는 질병 부위에 특이적이지 않다; 그보다는, 이들은 질병 부위 이외의 세포 또는 조직에 존재할 수 있다. 따라서, 치료제는 이들 무-질환의 정상 세포 또는 조직에 작용할 수 있다. 이러한 표적을 벗어난 작용은 원하지 않는 부작용을 초래할 수 있다. 결론적으로, 고도로 표적화된 항체-기반 치료제의 개발이 바람직하다.
표적을 벗어난 작용을 피하고 선택성을 증가시키기 위한 한 가능한 방법은 표적 부위에서 활성화가능한 프로-항체를 제공하는 것이다. 예를 들어, 미국 특허 번호 8,399,219 및 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0189651에는 펩티드 마스크 또는 차폐 모이어티에 의해 변형되는 프로테아제 활성화가능한 항체가 기술되어 있다. 이들 문헌에는, 파아지 디스플레이 기법을 이용하여 작용성 항체의 이의 결합 표적으로의 결합을 억제/감소시킬 수 있는 펩티드 또는 모이어티를 스크리닝하였다. 그러나, 이러한 방법에 의해 획득된 차폐 모이어티는 이들이 특정 표적에 대한 이들의 억제력을 기반으로 하여 확인되기 때문에 모든 항체에 보편적으로 적용될 수 없다. 따라서, 이들의 접근법에는 각 항체-기반 치료제에 대한 차폐 모이어티를 개발하는 것이 필요하며, 이는 시간 소모적이며, 고가이며 복잡하다. 추가로, 차폐 모이어티의 도입은 대상체에 불필요한 면역 반응을 유발할 위험성을 제공한다.
유사한 접근법이 미국 특허 출원 공개 번호 2010/0189727에 기술되어 있으며, 이는 항체를 불활성화시키도록 항체의 항원 결합 부위에 비공유적으로 결합된 차폐 리간드를 제안하였다. 특히, 차폐 리간드는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 에피토프의 2개의 복사체 및 에피토프의 각 복사체에 연합된 절단가능한 폴리펩티드 절단가능한 링커를 포함한다. 상기 기술된 파아지 디스플레이 기법과 유사하게, 차폐 리간드에는 또한 각 항체에 관련하여 특정하게 설계될 필요가 있으며, 따라서 이러한 불활성화된 항체의 개발은 또한 시간 소모적이고 고비용이 든다. 추가로, 차폐 리간드는 치료학적 항체에 대한 높은 친화성을 갖기 때문에, 절단가능한 폴리펩티드 절단가능한 링커의 절단 후 항체에 부착된 특정 차폐 리간드가 존재할 수 있다. 이러한 잔여 차폐 리간드는 항체의 치료학적 작용을 저해시킬 수 있다.
상기 관점에서, 향상된 효능 뿐만 아니라 작용 부위의 증가된 선택성과 같은 특성을 지니도록 주의 깊게 설계되고 공학 처리된 차세대 치료제를 제공할 필요가 본 기술분야에 존재한다. 추가로, 이러한 설계 및 공학 처리 개념은 광범위한 항체-기반 치료제에 적용가능해야 하며, 원하지 않는 면역 반응을 발생시키지 않을 것이다.
요약
하기는 독자에게 기본적인 이해를 제공하기 위해 본 기재내용의 간략한 요약을 제시한다. 이러한 요약은 본 기재내용의 광범위한 개관이 아니며, 이는 본 발명의 주요한/중대한 요소를 확인하거나 본 발명의 범위를 설명한 것이 아니다. 이의 유일한 목적은 후에 제시된 더욱 상세한 설명에 대한 서두로서 간략한 형태로 본원에 기재된 일부 개념을 제시하는 것이다.
일 양태에서, 본 기재 내용은 힌지 항체에 관한 것이다. 이러한 항체-기반 치료제는 표적 세포 또는 조직에서 질환을 치료하기 위해 표적 세포 또는 조직에서 선택적으로 활성화될 수 있다.
본 기재내용의 다양한 구체예에 따르면, 힌지 항체는 작용성 항체, 2개의 억제 도메인 및 4개의 절단가능한 링커를 포함한다. 작용성 항체는 활성화된 상태에서 질병을 치료할 수 있으며, 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함한다. 2개의 억제 도메인 각각은 디설피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 펩티드 암으로 구성된다. 각 억제 도메인은 디설피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 펩티드 암으로 구성된다. 4개의 절단가능한 링커 각각은 표적 세포 또는 조직에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 효소에 의해 절단가능한 펩티드 기질을 포함한다. 각각의 절단가능한 링커는 2개의 억제 도메인의 2개의 펩티드 암 중 하나를 작용성 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄 중 하나의 N-말단에 연결시킨다.
본 기재내용의 특정 구체예에 따르면, 2개의 억제 도메인 각각은 면역글로불린 A (IgA), 면역글로불린 D 또는 면역글로불린 G (IgG)의 힌지 도메인, 또는 이러한 힌지 도메인의 단편이다. 예를 들어, 억제 도메인은 하기 서열 IgG의 SEQ ID No. 10, 11, 12 및 13, IgA의 SEQ ID No. 14 및 15, 및 IgD의 SEQ ID No. 54 및 55 중 임의의 서열을 포함할 수 있다.
선택적 구체예에서, 작용성 항체는 항-TNF-α 항체, 항-RANKL 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-HER2 항체, 항-EGFR 항체, 항-VEGF 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-IL6R 항체, 항-IL12/23 항체, 항-CD3 항체, 항-CD11a 항체, 항-CD20 항체, 항-CD25 항체, 항-CD30 항체, 항-CD33 항체 또는 항-CD52 항체이다. 예를 들어, 작용성 항체의 경쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9의 아미노산 서열 중 임의의 서열이며; 작용성 항체의 중쇄의 아미노산 서열은 SEQ ID No. 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 및 66의 아미노산 서열 중 임의의 서열이다.
특정 구체예에서, 펩티드 기질은 하기 효소 중 임의의 효소에 의해 절단가능하다: 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 카텝신 (CTS), 카스파제 (CASP), 또는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 (ADAM). 예를 들어, 일부 구체예에 따르면, 효소는 MMP-2 또는 MMP-9이며, 각각의 절단가능한 링커는 SEQ ID No. 16의 아미노산 서열을 포함한다.
본 기재내용의 일부 구체예에 따르면, 작용성 항체는 항-TNF-α 항체이며, 이는 SEQ ID No. 1의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 및 SEQ ID No. 58의 아미노산 서열을 갖는 중쇄를 지니며, 절단가능한 링커 각각은 SEQ ID No. 16의 아미노산 서열을 포함하며; 억제 도메인 각각은 SEQ ID No. 10의 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 기재내용은 본 기재내용의 상기 양태/구체예에 따른 힌지 항체를 생성하기위한 발현 시스템에 관한 것이다.
본 기재내용의 다양한 구체예에 따르면, 생성을 위한 발현 시스템은 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열을 포함한다. 제 1 핵산 서열은 5'에서 3'으로 제 1 억제 도메인-엔코딩 영역, 제 1 절단가능한 링커-엔코딩 영역 및 경쇄-엔코딩 영역을 포함한다. 제 1 억제 도메인-엔코딩 영역은 상기 기술된 임의의 힌지 항체의 억제 도메인의 제 1 펩티드 암을 엔코딩한다. 제 1 절단가능한 링커-엔코딩 영역은 상기 언급된 힌지 항체의 절단가능한 링커를 엔코딩하며, 절단가능한 링커는 표적 세포 또는 조직에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 효소에 의해 절단가능한 펩티드 기질이다. 경쇄-엔코딩 영역은 상기 언급된 힌지 항체의 작용성 항체의 경쇄를 엔코딩하며, 여기에서 작용성 항체는 활성화된 상태에서 질병을 치료할 수 있다. 제 2 핵산 서열은 5'에서 3'으로 제 2 억제 도메인-엔코딩 영역, 제 2 절단가능한 링커-엔코딩 영역 및 중쇄-엔코딩 영역을 포함한다. 제 2 억제 도메인-엔코딩 영역은 힌지 항체의 억제 도메인의 제 2 펩티드 암을 엔코딩한다. 제 2 절단가능한 링커-엔코딩 영역은 힌지 항체의 절단가능한 링커를 엔코딩한다. 중쇄-엔코딩 영역은 힌지 항체의 작용성 항체의 중쇄를 엔코딩한다.
본 기재내용의 일부 선택적 구체예에서, 제 1 및 제 2 핵산 서열은 단일 발현 벡터에서 작제될 수 있다. 예를 들어, 발현 시스템은 제 1 핵산 서열과 제 2 핵산 서열을 연결하는 연결 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 연결 핵산 서열의 비제한적 예는 퓨린-2A 폴리펩티드 또는 내부 리보솜 유입점 (IRES) 서열을 엔코딩하는 서열을 포함한다.
제 1 및 제 2 핵산 서열이 단일 발현 벡터에서 작제되는 경우, 발현 시스템은 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 추가로 선택적으로 포함할 수 있어 숙주 세포에서 제 1 핵산 서열, 제 2 핵산 서열 및 선택적으로 연결 핵산 서열의 번역을 조절한다. 대안적으로, 발현 시스템은 각각 제 1 및 제 2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 적어도 2개의 별개의 조절 서열을 포함할 수 있어 제 1 및 제 2 핵산 서열 발현의 개별적 조절을 허용한다.
일부 기타 구체예에서, 제 1 및 제 2 핵산 서열은 2개의 별도의 발현 벡터에서 작제될 수 있다. 예를 들어, 작동가능하게 연결된 제 1 조절 서열과 함께 제 1 핵산 서열은 제 1 발현 벡터에서 작제되는 반면, 작동가능하게 연결된 제 2 조절 서열과 함께 제 2 핵산 서열은 제 2 발현 벡터에서 작제된다. 이어서, 제 1 및 제 2 발현 벡터는 동일한 숙주 세포 또는 상이한 숙주 세포 내로 전달되고 발현될 수 있다.
본 기재내용의 특정 구체예에 따르면, 억제 도메인은 면역글로불린 A (IgA), 면역글로불린 D 또는 면역글로불린 G (IgG)의 힌지 도메인, 또는 이러한 힌지 도메인의 단편이다.
본 기재내용의 다양한 구체예에 따르면, 발현 시스템은 상기 언급된 힌지 항체 중 임의의 항체를 엔코딩한다. 예를 들어, 발현 시스템이 단일 작제물에 의해 구현되는 경우, 작제물의 핵산 서열은 SEQ ID No. 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 및 50의 임의의 서열일 수 있다. 발현 시스템이 2-벡터 (또는 2-플라스미드) 시스템으로서 구현되는 경우, 제 1 핵산 서열은 SEQ ID No. 67, 69, 71, 73, 75, 및 77 중 임의의 서열인 반면; 제 2 핵산 서열은 SEQ ID No. 68, 70, 72, 74, 76 및 78 중 임의의 서열이다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 기재내용은 본 기재내용의 상기 양태/구체예에 따른 힌지 항체의 제작에 사용하기에 적합한 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 기재내용의 특정 구체예에 따르면, 재조합 벡터는 본 기재내용의 상기 언급된 양태/구체예에 따른 합성 핵산 분자, 및 합성 핵산 분자에 작동적으로 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함하여, 벡터는 적절한 조건하에 적합한 숙주 세포에서 본 기재내용의 상기 언급된 양태/구체예에 따른 힌지 항체를 발현할 수 있다.
추가의 또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체; 특히, 암 또는 자가면역 질환에 걸린 대상체를 치료하기 위한 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일부 구체예에 따르면, 본 방법은 본 기재내용의 상기 양태/구체예에 따른 치료학적 유효량의 힌지 항체를 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 힌지 항체는 경구, 피하, 정맥내, 경막내 또는 근내로 대상체에 투여될 수 있다.
본 기재내용의 수반되는 많은 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 고려된 하기 상세 설명을 참조로 더욱 잘 이해될 것이다.
본 설명은 첨부된 도면의 견지에서 숙지된 하기 상세한 설명으로부터 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1은 본 기재내용의 특정 구체예에 따른 힌지 항체 구조를 묘사한 개략도이다.
도 2는 본 기재내용의 구체예에 따른 힌지 항체의 설계 구성을 묘사한 개략도이다.
도 3은 본 기재내용의 특정 구체예에 따른 힌지 항체를 엔코딩하는 핵산 분자를 묘사한 개략도이다.
도 4는 본 기재내용의 일 구체예에 따른 힌지 항체의 전반적 구조를 묘사한 개략도이다.
도 5는 본 기재내용의 일 실시예에 따른 SDS PAGE 겔의 사진이다.
도 6은 본 기재내용의 일 실시예에 따른 2개의 SDS PAGE 겔의 사진이다.
도 7은 본 기재내용의 일 실시예에 따른 다양한 항체의 결합능을 나타낸 막대 그래프이다.
도 8은 본 기재내용의 일 실시예에 따른 TNF-α 시그널을 묘사한 막대 그래프이다.
도 9는 본 기재내용의 또 다른 실시예에 따른 다양한 항체의 결합능을 묘사한 막대 그래프이다.
도 10은 본 기재내용의 또 다른 추가의 실시예에 따른 다양한 항체의 결합능을 묘사한 막대 그래프이다.
도 11은 본 기재내용의 일 실시예에 따른, 마우스의 종양 부위에서 힌지-αEGFR 항체의 생체내 국소화 및 활성화를 묘사한 사진을 제공한다.
도 12는 콜라겐-유발된 관절염에 대한 힌지-TNFα 항체의 생체내 항-염증 효과를 나타낸 선 그래프이다.
일반적 실시에 따르면, 다양하게 기술된 특징/요소는 그 규모대로 그린 것이 아니라 대신에 본 발명과 관련된 특정한 특징/요소를 가장 잘 묘사하도록 그렸다. 또한, 다양한 도면에서 동일한 참조 번호 및 명칭은 동일한 요소/부분을 나타내기 위해 사용된다.
첨부된 도면과 관련하여 하기 제공된 상세한 설명은 본 실시예의 설명으로서 의도된 것이며, 본 실시예가 구성되고 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내고자 하는 것은 아니다. 설명은 실시예의 기능 및 실시예를 구성하고 작업하는 단계의 순서를 제시한다. 그러나, 동일하거나 동등한 기능 및 순서가 상이한 실시예에 의해 달성될 수 있다
편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어를 여기에 모았다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 기재내용에 사용된 과학적 및 기술적 전문용어는 당업자에 의해 통상적으로 이해되고 사용되는 의미를 가질 것이다. 문맥상 다르게 요구되지 않는 한, 단수 용어는 동일한 대상의 복수 형태를 포함할 것이며, 복수 용어는 단수형을 포함할 것임이 이해될 것이다. 특히, 본원 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 분명히 다르게 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 또한, 본원 및 청구범위에 사용된 바와 같이, 용어 "적어도 하나" 및 "하나 이상"은 동일한 의미를 가지며, 1, 2, 3 또는 그 이상을 포함한다.
본 발명의 광범위한 범주를 제시하는 수치 범위 및 변수는 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치 값은 가능한 정확하게 기록한 것이다. 그러나, 임의의 수치 값은 본질적으로 각 평가 측정에서 밝혀진 표준 편차로부터 어쩔수 없이 초래되는 특정 오차를 함유한다. 또한, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 일반적으로 주어진 값 또는 범위의 10%, 5%, 1%, 또는 0.5% 이내를 의미한다. 대안적으로, 용어 "약"은 당업자에 의해 고려되는 경우 평균의 허용가능한 표준 오차 이내를 의미한다.
용어 "항체-기반 치료제"는 내인성 인간 단백질 또는 병원체의 약물학적 작용을 억제하는 치료제를 의미하는 것이다. 치료학적 유효량으로 제공되는 경우 상기 "치료제"는 대상체에서 요망되는 치료 효과를 유도한다. 본 기재내용의 목적에 있어서, 항체-기반 치료제는 이들의 의도된 표적 분자에 결합하여 중화시키기에 고도로 특이적인 항체 및 융합 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체"는 전장 항체 및 이의 임의의 항원 결합 단편 또는 단일 사슬을 포함한다. 각 항체의 기본 작용성 단위체는 디설피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄로 구성된 Y-형 분자인 면역글로불린 모노머이다. "작용성 항체"는 전장 항체 또는 이들의 특이적 결합력을 보유한 항체의 하나 이상을 단편을 포함한다; 이러한 작용성 단편의 예는 Fab (항원-결합 단편), Fv (가변 단편), 및 F(ab')2, Fab', scFv (단일쇄 가변 단편), 및 기타 등등을 포함한다. 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있으며, 인간 및 인간외 기원 또는 키메라 단백질일 수 있다.
여기에서 "절단가능한 링커"는 효소에 의해 절단가능한 펩티드 기질이다. 작동적으로, 절단가능한 링커는 효소에 의해 절단시 본 힌지 항체의 활성화를 허용한다. 바람직하게는, 절단가능한 링커는 활성화가 표적 세포 (예를 들어, 암종 세포) 또는 조직 또는 이 근처의 부위일 수 있는 요망되는 작용 부위에서 발생하도록 선택된다. 예를 들어, 절단가능한 링커는, 표적 부위에서 절단가능한 링커의 절단 비율이 표적 부위 이외의 부위에서의 절단 비율보다 크도록 작용 부위에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 효소에 대해 특이적인 펩티드 기질이다.
용어 "리간드"는 수용체, 기질, 항원 결정인자 또는 표적 세포 또는 조직 상의 기타 결합 부위에 특이적으로 결합하거나 이들과 반응적으로 회합되거나 착화되는 임의의 분자를 의미한다. 리간드의 예는 항체 및 이의 단편 (예를 들어, 모노클로날 항체 또는 이의 단편), 효소 (예를 들어, 섬유소 분해 효소), 생체 반응 조절인자 (예를 들어, 인터류킨, 인터페론, 에리트로페오이틴, 또는 콜로니 자극 인자), 펩티드 호르몬 및 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산"은 단일- 또는 이중-가닥 RNA, mRNA, 및 cDNA 및 게놈 DNA를 포함하는 DNA를 지칭한다. 달리 언급되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 또한, 이의 보존적으로 개질된 변이체 (예를 들어, 변질된 코돈 치환) 및 상보적 서열은 물론 정확하게 나타낸 서열을 또한, 내재하여 포함한다. 또한, 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열의 왼쪽 말단은 5' 말단이며; 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 왼쪽 방향은 달리 명시하지 않는 한 5' 방향으로서 지칭된다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 폴리머를 나타내는 것으로서 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이들 용어는 또한 용어 "항체"를 포함한다. 용어 "아미노산"은 자연 발생 및 합성 아미노산은 물론, 자연 발생 아미노산과 유사한 방식으로 작용하는 아미노산 유사체 및 아미노산 모방체를 나타낸다. 본원에 사용된 폴리펩티드 기호에서, 표준 용법 및 관례에 따라 왼쪽 방향은 아미노 (N)-말단 방향이며, 오른쪽 방향은 카르복실 (C)-말단 방향이다.
본 기재내용 전반에 걸쳐, 용어 "합성" 핵산 또는 아미노산은 천연에서 발견되지 않는 핵산 또는 아미노산 서열을 의미한다. 본 방법에 의해 설계된 합성 서열은 본 발명에서 임의의 형태 예를 들어, 종이 또는 컴퓨터 해독가능한 형태로 포함되며, 물리적으로 생성된 핵산 또는 폴리펩티드로 포함됨이 의도된다. 설계된 서열로부터 직접 또는 이러한 서열의 복사체 (예를 들어, PCR, 플라스미드 복제, 화학 합성 및 기타 등등에 의해 제조됨)로부터 유래되는지의 여부에 상관없이, 본 발명의 물리적으로 생성된 핵산 및 폴리펩티드는 본 발명의 일부이다. 용어 "합성 핵산"은 예를 들어, 전체 인공 아미노산 서열로부터 유래되거나 설계된 핵산 서열, 또는 천연 발생 서열과 비교하여 단일 또는 다중 뉴클레오티드가 변화된 핵산 서열을 포함할 수 있으며, 이들은 임의 돌연변이유발 또는 특이적 돌연변이유발, 화학 합성, DNA 셔플링 방법, DNA 재조립 방법, 또는 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의해 발생된다. 이러한 변형은 핵산 서열에 의해 엔코딩된 아미노산 서열을 변화시키지 않으면서 수행될 수 있거나, 비변형되거나 향상된 엔코딩된 단백질의 요망되는 기능은 유지하도록 아미노산 서열을 변형시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 유전자 물질을 숙주 세포 내로 전달하는데 사용된 물질 (예를 들어, 파아지, 플라스미드, 바이러스 벡터는 물론 인공 크로모좀, 예컨대, 박테리아 또는 효모 인공 크로모좀)의 조성물을 지칭한다. 벡터는 DNA 또는 RNA로 구성될 수 있다. 벡터는 당해기술분야에 널리 공지된 다양한 기법에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터의 조절 서열은 여기에 작동가능하게 연결된 표적 유전자 생성물의 발현에 요구되는 핵산 서열이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된"은 관심 핵산의 발현이 조절 핵산에 의해 좌우되도록 즉, 조절 핵산 서열이 발현될 상기 핵산 서열에 작용적으로 연결되도록 상기 조절 핵산과 상기 관심 핵산이 연결됨을 의미한다. 따라서, 조절 핵산 서열 및 발현될 핵산 서열은 예를 들어, 발현될 핵산 서열의 5' 말단에 조절 핵산 서열을 삽입함으로써 서로 물리적으로 연결될 수 있다. 대안적으로, 조절 핵산 서열과 발현될 핵산은 단지 물리적으로 근접하게 위치할 수 있어 조절 핵산 서열이 적어도 하나의 관심 핵산 서열의 발현을 좌우할 수 있다. 조절 핵산 서열과 발현될 핵산은 바람직하게는, 500 bp, 300 bp, 100 bp, 80 bp, 60 bp, 40 bp, 20 bp, 10 bp 또는 5 bp 이하로 분리된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "치료하는"는 특정 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 특징을 부분적으로 또는 완전하게 완화하고/거나 개선하고/거나 경감시키고/거나 발병 지연시키고/거나 진행 억제시키고/거나 중증도 감소시키고/거나 발병률을 저하시키기 위해, 질병, 질병의 증상, 질병에 대한 이차 질환 또는 장애, 또는 질병에 대한 소인을 갖는 대상체에 본 힌지 항체를 적용하거나 투여하는 것을 나타낸다. 일반적으로, "치료"는 질병 증상의 개선 또는 질병 표지 감소를 포함할 뿐만 아니라 치료제의 부재하에 예상될 증상의 악화 또는 진행의 중단 또는 감속을 포함한다. 이롭거나 요망되는 임상 결과는 비제한적으로, 검출되거나 검출되지 않든지 하나 이상의 증상(들)의 완화, 질병 정도의 축소, 질병의 안정화된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질병 진행의 지연 또는 감속, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 차도 (부분적이든 전체적이든)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 요망되는 치료학적 반응을 수득하기에 충분한 구성요소의 정량을 지칭한다. 치료학적 유효량은 또한, 치료학적으로 이로운 효과가 화합물 또는 조성물의 임의의 독성 또는 해로운 효과보다 큰 양이다. 특정 유효량 또는 충분량은 치료될 특정 질병, 환자의 신체 상태 (예를 들어, 환자의 몸무게, 연령 또는 성별), 치료될 포유동물 또는 동물의 유형, 치료 기간, 현 치료법 (존재하는 경우)의 특성 및 사용된 특정 제형 및 화합물 또는 이의 유도체의 구조와 같은 요인에 따라 변화될 것이다. 유효량은 예를 들어, 체중 킬로그램 당 그램, 밀리그램 또는 마이크로그램 또는 밀리그램 (mg/kg)으로 표현될 수 있다.
용어 "대상체"는 본 발명의 힌지 항체 및/또는 방법으로 치료가능한 인간 종을 포함하는 포유동물을 나타낸다. 용어 "대상체"는 하나의 성별이 특정하게 나타내지 않는 한 수컷 및 암컷 성별 둘 모두를 나타내는 것으로 의도된다.
본 발명은 표적 세포 또는 조직에서 선택적으로 활성화가능한 힌지 항체에 관한 것이다. 본 힌지 항체를 제조하기 위한 방법 및 물질 (예를 들어, 핵산 서열 및 벡터)의 조성물, 힌지 항체를 포함하는 약제 조성물은 물론 이를 사용하는 치료 방법이 또한 본 발명의 범주내에 속한다.
도 1은 본 발명의 특정 구체예에 따른 힌지 항체 (100)의 일반적 구조를 묘사한 개략도이며, 도 2는 힌지 항체 (100)의 설계 구성 및 작용 메카니즘을 묘사한 개략도이다. 도 1에 묘사된 바와 같이, 힌지 항체 (100)는 작용성 항체 (110), 2개의 억제 도메인 (120), 및 억제 도메인 (120)을 작용성 항체 (110)로 연결하는 4개의 절단가능한 링커 (130)를 포함한다. 도 2를 참조하여, 원래의 비절단된 형태에서 상기 힌지 항체 (100)의 이의 표적 리간드 (L)로의 결합력은 실질적으로 억제된다 (비활성화된다). 힌지 항체 (100)가 대상체에 투여되고 표적 부위에 도달하면, 표적 부위에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 효소 (E)가 절단가능한 링커 (130)에서 힌지 항체 (100)를 절단할 것이다. 힌지 항체 (100)의 이러한 효소 절단은 힌지 항체 (100)로부터 억제 도메인 (120)을 제거하며 리간드 (L)로의 결합 친화성을 갖는 작용성 항체 (110)를 유도한다. 따라서, 작용성 항체 (110)의 치료학적 효과가 질병 부위에서 복구될 수 있다.
도 1을 다시 참조로 하여, 작용성 항체 (110)는 전장 항체이거나 활성화된 상태에서 질병을 치료하기 위한 항체의 하나 이상의 작용성 단편을 포함한다. 구조에서, 작용성 항체 (110)는 디설피드 결합에 의해 연결된 2개 경쇄 (112) 및 2개 중쇄 (114)를 포함한다. 특히, 2개 중쇄 (114)는 힌지 영역에서 하나 이상의 디설피드 결합 (116)에 의해 연결된다.
바람직하게는, 작용성 항체 (110)는 대상체에서 하나 이상의 질병을 치료하기 위한 치료학적 항체이다. 작용성 항체 (110)는 전장의 치료학적 항체 또는 이의 작용성 단편일 수 있다. 작용성 항체 (110)의 비제한적 예는 하기를 포함한다: 항-종양 괴사 인자-알파 (항-TNF-α) 항체 (예를 들어, 인플릭시맙, 아달리무맙, 세르톨리주맙 페골 및 골리무맙), NFκb 리간드의 항-수용체 활성인자 (항-RANKL) 항체 (예를 들어, 데노수맙), 항-세포독성 T 림프구-회합된 항원-4 (항-CTLA-4) 항체 (예를 들어, 트레멜리무맙 및 이필리무맙), 항-인간 표피 성장 인자 수용체 (항-HER2) 항체 (예를 들어, 페르투주맙, 트라스투주맙 및 트라스투주맙 엠탄신), 항-표피 성장 인자 수용체 (항-EGFR) 항체 (예를 들어, 파니투무맙, 세툭시맙, 잘루투무맙 및 네시투무맙), 항-맥관 내피 세포 성장 인자 (항-VEGF) 항체 (예를 들어, 베바시주맙 및 라니비주맙), 항-맥관 내피 세포 성장 인자 수용체 2 (항-VEGFR2) 항체 (예를 들어, 라무시루맙), 항-인터류킨 6 수용체 (항-IL6R) 항체 (예를 들어, 레게네론 및 토실리주맙), 항-인터류킨 12/23 (항-IL12/23) 항체 (예를 들어, 우스테키누맙 및 브리아키누맙), 항-분화무리 3 (항-CD3) 항체 (예를 들어, 오텔릭시주맙, 테플리주맙 및 무로모납-CD3), 항-CD11a 항체 (예를 들어, 에팔리주맙), 항-CD20 항체 (예를 들어, 오비누투주맙, 오파투무맙, 토시투모맙-i131, 아이브리투모맙 티욱세탄 및 리툭시맙), 항-CD25 (또한, 항-IL2R로서 공지됨) 항체 (예를 들어, 바실릭시맙 및 다클리주맙), 항-CD30 항체 (예를 들어, 브렌툭시맙 베도틴), 항-CD33 항체 (예를 들어, 겜투주맙 오조가미신) 및 항-CD52 항체 (예를 들어, 알렘투주맙). 이는 본원에 기술된 작용성 항체 (110)로서 사용하기에 적합한 치료학적 항체의 완전한 목록이 아님을 주지해야 한다; 그보다는, 상기 기술된 구조를 갖는 기타 항체가 본 발명에 동일하게 적용가능하다.
상기 언급된 치료학적 항체 중 하나 이상에 의해 치료가능한 질환 또는 질병은 비제한적으로, 진행성 흑색종 (예를 들어, 이필리무맙), 골 소실 (예를 들어, 데노수맙), 유방암 (예를 들어, 트라스투주맙, 트라스투주맙 엠탄신, 페르투주맙 또는 라무시루맙), 만성 림프성 백혈병 (예를 들어, 오비누투주맙 또는 오파투무맙), 직장결장암 (예를 들어, 파니투무맙, 세툭시맙 또는 베바시주맙), 크론병 (예를 들어, 인플릭시맙 또는 세르톨리주맙 페골), 위 또는 위식도 접합부 샘암종 (예를 들어, 라무시루맙), 두경부암 (예를 들어, 잘루투무맙), 간세포암종 (예를 들어, 라무시루맙), 호지킨 림프종 (예를 들어, 브렌툭시맙 베도틴), 황반변성 (예를 들어, 라니비주맙), 전이성 흑색종 (예를 들어, 트레멜리무맙), 골수성 백혈병 (예를 들어, 겜투주맙 오조가미신 또는 알렘투주맙), 비호지킨 림프종 (예를 들어, 오시투모맙-i131, 아이브리투모맙 티욱세탄 또는 리툭시맙), 비소세포 폐 암 (예를 들어, 네시투무맙), 건선 (예를 들어, 에팔리주맙), 판상형 건선 (예를 들어, 우스테키누맙 또는 브리아키누맙), 신장 이식 거부의 반전 또는 예방 (예를 들어, 무로모납-cd3, 바실릭시맙 또는 다클리주맙), 류마티스 관절염 (예를 들어, 토실리주맙, 골리무맙 또는 아달리무맙) 및 타입 1 진성 당뇨병 (예를 들어, 오텔릭시주맙 또는 테플리주맙).
특정 구체예에서, 작용성 항체 (110)는 SEQ ID No. 1의 아미노산 서열 (즉, 인플릭시맙 경쇄) 및 SEQ ID No. 58의 아미노산 서열 (즉, 인플릭시맙 중쇄)를 갖는 항-TNF-α 항체, SEQ ID No. 2의 아미노산 서열 (즉, 파니투무맙 경쇄) 및 SEQ ID No. 59의 아미노산 서열 (즉, 파니투무맙 중쇄)를 갖는 항-EGFR 항체, SEQ ID No. 3의 아미노산 서열 (즉, 트라스투주맙 경쇄) 및 SEQ ID No. 60의 아미노산 서열 (즉, 트라스투주맙 중쇄)을 갖는 항-HER2 항체, SEQ ID No. 4의 아미노산 서열 (즉, 아달리무맙 경쇄) 및 SEQ ID No. 61의 아미노산 서열 (즉, 아달리무맙 중쇄)을 갖는 항-TNF-α 항체, SEQ ID No. 5의 아미노산 서열 (즉, 데노수맙 경쇄) 및 SEQ ID No. 62의 아미노산 서열 (즉, 데노수맙 중쇄)을 갖는 항-RANKL 항체, SEQ ID No. 6의 아미노산 서열 (즉, 이필리무맙 경쇄) 및 SEQ ID No. 63의 아미노산 서열 (즉, 이필리무맙 중쇄)을 갖는 항-CTLA-4 항체, SEQ ID No. 7의 아미노산 서열 (즉, 트레멜리무맙 (a.k.a., 티실리무맙) 경쇄) 및 SEQ ID No. 트레멜리무맙의 아미노산 서열 (즉, 트레멜리무맙 중쇄)을 갖는 항-CTLA-4 항체, SEQ ID No. 8 (즉, 에팔리주맙 경쇄) 및 SEQ ID No. 65의 아미노산 서열 (즉, 에팔리주맙 중쇄)의 항-CD11a 항체, 또는 SEQ ID No. 9 (즉, 우스테키누맙 경쇄) 및 SEQ ID No. 66의 아미노산 서열 (즉, 우스테키누맙 중쇄)의 항-IL12/23 항체이다.
도 1에 묘사된 바와 같이, 각 억제 도메인 (120)은 2개의 펩티드 암 (122)으로 구성된다. 묘사된 예에서, 2개의 펩티드 암 (122)은 디설피드 결합 (124)에 의해 상호연결된다; 그러나, 본 발명은 이로 제한되지 않는다. 본 기재내용의 특정 구체예에 따르면, 억제 도메인 (120)은 면역글로불린의 힌지 도메인이거나 이의 일부를 포함한다: 예컨대, 면역글로불린 A (IgA), 면역글로불린 D (IgD), 또는 면역글로불린 G (IgG). 본 기재내용의 다양한 구체예에 따르면, IgA는 IgA1 (SEQ ID No. 14) 또는 IgA2 (SEQ ID No. 15)이며, IgG는 IgG1 (SEQ ID No. 10), IgG2 (SEQ ID No. 11), IgG3 (SEQ ID No. 12) 또는 IgG4 (SEQ ID No. 13)인 반면; IgD는 IgD1 (SEQ ID No. 54) 또는 IgD2 (SEQ ID No. 55)이다.
작용성 항체 (110)에 부착될 때 억제 도메인 (120)의 힌지 구조는 작용성 항체 (110)의 리간드-결합 부위를 입체적으로 차폐시킨다. 따라서, 절단되지 않은 상태의 힌지 항체 (100)는 의도된 리간드와의 상호작용을 나타낸다 하더라도 거의 나타내지 않는다. 본원에 제공된 작업 실시예에 따르면, 절단되지 않은 상태에서 작용성 항체 (110)의 이의 리간드로의 결합력은 적어도 약 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 심지어 100 감소된다.
본 기재내용의 다양한 구체예에 따르면, 작용성 항체 (110)가 이의 의도된 리간드의 존재하에 억제 도메인 (120)에 커플링되는 경우, 작용성 항체 (110)의 이의 리간드로의 결합은 전혀 없거나 실질적으로 없거나, 억제 도메인 (120)으로 커플링되지 않은 작용성 항체 (110)의 결합과 비교하여 작용성 항체 (110)의 이의 리간드로의 0.001%, 0.02%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 또는 30% 이하의 결합이다.
본 억제 도메인 (120)의 또 다른 이점은 이의 다용도의 적용가능성에 있다. 이해할 수 있는 바와 같이, 억제 도메인 (120)은 작용성 항체 (110) 및/또는 작용성 항체 (110)의 의도된 리간드와의 이의 특이적 상호작용을 기반으로 설계되지 않으며, 따라서, 억제 활성은 작용성 항체 (110)에 의존적이지 않다. 또한, 대부분의 치료학적 항체는 공통의 유사한 백본을 공유하여, 여기로의 억제 도메인 (120)의 부착을 촉진한다.
바람직한 억제 활성 및 다용도의 적용가능성 이외에, 본 억제 도메인 (120)은 면역글로불린의 힌지 영역으로부터 유래한다는 점에 있어서 또한 이롭다. 따라서, 종래의 외인성 차폐 리간드와 달리, 본 억제 도메인 (120)은 대상체에서 원하지 않은 면역 반응을 유도하지 않을 것이다.
억제 도메인 (120)은 절단가능한 링커 (130)를 통해 작용성 항체에 부착된다. 특히, 4개의 절단가능한 링커 (130) 각각은 2개의 억제 도메인 (120)의 2개의 펩티드 암 (122) 중 하나를 작용성 항체 (110)의 2개의 경쇄 (112) 및 2개의 중쇄 (114) 중 하나의 N-말단에 연결시킨다. 절단가능한 링커 (130)는 힌지 항체 (100)가 표적 세포 또는 조직에서 활성화가능하도록 표적 세포 또는 조직 (예컨대, 대상체의 병소 부위)에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 효소에 의해 절단가능한 펩티드 기질을 포함한다.
상기 논의된 바와 같이, 억제 도메인 (120)의 작용성 항체 (110)와의 부착은 작용성 항체 (110)의 이의 의도된 리간드로의 결합 억제를 유발시킨다. 그러나, 일단 효소가 절단가능한 링커 (130)를 분해하면, 억제 도메인 (120)은 힌지 항체 (100)로부터 분리되어 작용성 항체 (110)의 결합력을 복구시킨다.
특정 구체예에서, 펩티드 기질은 하기 효소 중 임의의 효소에 의해 절단가능하다: 매트릭스 메탈로프로테이나제 (예를 들어, MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MMP-13 및 MMP-14), 카텝신 (예를 들어, CTS A, CTS B, CTS D, CTS E 및 CTS K), 카스파제 (예를 들어, CASP-1, CASP-2, CASP-3, CASP-4, CASP-5, CASP-6, CASP-7, CASP-7, CASP-9, CASP-10, CASP-11, CASP-12, CASP-13 및 CASP-14), 또는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 (예를 들어, ADAM-10, ADAM-12, ADAM-17, ADAM-TS 및 ADAM-TS5).
매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)는 매트릭스 단백질을 분해하는 아연-의존성 엔도펩티다제의 패밀리이다. MMP는 콜라게나제, 젤라티나제, 마트릴리신, 에나멜리신, 메탈로엘라스타제, 스트로멜리신 및 기타 구조 단백질 및 수용체 리신을 포함한다. MMP는 배아 발생 및 생식과 같은 정상적인 생리학적 과정은 물론 관절염 및 전이와 같은 질병 과정에서 세포외 매트릭스의 파괴에 관련된다.
예를 들어, MMP-2 (또한, 젤라티나제 A 또는 72 kDa IV 형 콜라게나제로서 공지됨) 및 MMP-9 (또한, 젤라티나제 B 또는 92 kDa IV 형 콜라게나제로서 공지됨) 둘 모두는 염증 반응에서 역할을 수행한다. 따라서, 이들 단백질은 대상체의 기타 세포/조직에서보다 염증 부위에서 고도로 발현된다. 또한, MMP-2 또는 MMP-9의 증가된 발현은 또한, 침윤, 전이, 성장 및 혈관형성을 포함하는 종양 진행과 분명히 관련된다. 따라서, 이들 단백질에 대한 펩티드 기질은 힌지 항체 (100)가 염증 부위 또는 암성 부위에서 활성화가능하도록 절단가능한 링커 (130)로서 사용하기에 적합하다. 추가로, 병소 부위 이외에 세포/조직에서 MMP-2/MMP-9의 발현 수준은 비교적 낮기 때문에, 이들 세포/조직에서 본 힌지 항체 (100)의 활성화는 병소 부위에서의 것과 비교하여 극히 적다. 따라서, 본 힌지 항체 (100)는 작용 부위의 향상된 선택성을 이용하여 질환을 치료하는데 작동가능하다.
일부 구체예에 따르면, 각 절단가능한 링커 (130)는 MMP-2 또는 MMP-9에 대한 펩티드 기질인 Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg의 아미노산 서열 (GPLGVR; SEQ ID No. 16)을 포함한다. MMP-2/MMP-9에 대한 펩티드 기질의 비제한적 예는 하기를 포함한다: Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg (PLGMWSR; SEQ ID No. 51), Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-(d)-Arg (PLGLWA-(d)-R; SEQ ID No. 52), 및 Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-(d)-Arg (PQGIAGQ-(d)-R; SEQ ID No. 53).
활성화가능하다는 것은 힌지 항체 (100)가 절단되지 않은 또는 비-활성화된 상태에서는 관심 리간드에 대한 제 1의 결합 친화성을 나타내며, 절단된 또는 활성화된 상태에서는 동일한 리간드에 대해 제 2의 결합 친화성을 나타냄을 의미하며, 여기에서 제 2 결합 친화성은 제 1 결합 친화성보다 크다. 예를 들어, 활성화된 작용성 항체 (110)의 이의 의도된 리간드에 대한 결합 친화력은 동일한 리간드에 대한 절단되지 않은 힌지 항체 (100)의 결합 친화성보다 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900 또는 심지어 1,000 배 클 수 있다.
절단가능한 링커 (130)는 표적 부위에서 고도로 발현되는 효소에 대한 이의 특이성을 기반으로 선택되기 때문에, 힌지 항체 (100)의 활성화는 주로 표적 부위에서 발생할 것임이 자명하다. 절단되지 않은 상태의 탁월한 억제 활성과 함께 작용 부위에서의 이러한 높은 선택성은 작용성 항체 (110)의 표적을 벗어난 활성을 실질적으로 방지한다.
본 기재내용은 분리된 억제 도메인 (120)이 활성화된 작용성 항체 (110)와 작용성 항체 (110)의 의도된 리간드 간의 결합을 방해하지 않는다는 점에서 추가로 이롭다. 따라서, 작용성 항체 (110)의 결합 친화성은 일단 힌지 항체 (100)가 절단가능한 링커 (130)의 절단을 통해 활성화되면 실질적으로 복구된다. 예를 들어, 힌지 항체 (100)가 지정된 시간 동안 표적 부위에서 고도로 발현되는 효소 (예를 들어, MMP-2)와 접촉된 후, 이의 의도된 리간드에 대한 활성화된 작용성 항체 (110)의 결합은 억제 도메인 (120)에 커플링되지 않은 작용성 항체 (110)의 결합과 비교하여 적어도 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
본 기재내용의 특정 구체예에서, 작용성 항체 (110)는 항-TNF-α 항체이며, SEQ ID No. 1의 아미노산 서열을 포함하며, 절단가능한 링커 (130) 각각은 SEQ ID No. 14의 아미노산 서열을 포함하며; 억제 도메인 (120) 각각은 SEQ ID No. 8의 아미노산 서열을 포함한다.
본 기재내용의 구체예에 따른 힌지 항체는 합성적으로 발생될 수 있거나 재조합적으로 발현되고 정제될 수 있다.
예를 들어, 힌지 항체는 알파-아미노 기의 t-BOC 또는 FMOC 보호와 같은 통상적으로 사용된 방법에 의해 합성될 수 있다. 두 방법 모두는 단계식 합성을 포함하며, 이에 의해 단일 아미노산이 펩티드의 C 말단으로부터 출발하여 각 단계에 부가된다. 본 발명의 힌지 항체는 또한 널리 공지된 고형상 펩티드 합성법에 의해 합성될 수 있다.
힌지 항체의 재조합 생성을 위해, 본 힌지 항체를 엔코딩하는 벡터 작제물 또는 핵산 분자가 제공된다. 원핵세포 또는 진핵세포에서 발현될 수 있는 다양한 벡터 작제물은 당해분야에 공지되어 있다. 발현 벡터 작제물은 이들이 사용될 숙주 세포와 양립가능하도록 일반적으로 선택된다. 특정 구체예에서, 벡터는 작용성 항체의 경쇄 및 중쇄, 억제 도메인 및 절단가능한 링커를 엔코딩한다.
도 3은 본 기재내용의 특정 구체예에 따른 예시적 핵산 분자 (200)의 도면이다. 적합한 조건하에서, 핵산 분자 (200)가 번역될 수 있으며, 이어서 발현된 폴리뉴클레오티드(들)는 변형되고/거나 본 힌지 항체 예를 들어, 상기 묘사된 힌지 항체 (100) 내로 어셈블링된다. 도 3은 본 기재내용의 특정 구체예에 따른 힌지 항체; 예를 들어, 상기 묘사된 힌지 항체 (100)를 엔코딩하는 핵산 분자를 묘사한 개략도이다.
특정 구체예에서, 합성 핵산 분자 (200)는 제 1 핵산 서열 (210), 제 2 핵산 서열 (220) 및 연결 핵산 서열 (230)을 포함한다. 제 1 핵산 서열 (210)은 5'에서 3'으로 제 1 억제 도메인-엔코딩 영역 (212), 제 1 절단가능한 링커-엔코딩 영역 (214) 및 경쇄-엔코딩 영역 (216)을 포함한다. 제 1 억제 도메인-엔코딩 영역 (212)은 본 힌지 항체의 억제 도메인 (예컨대, 도 1의 억제 도메인 (120))의 제 1 펩티드 암 (예컨대, 도 1에 묘사된 하나의 펩티드 암 (122))을 엔코딩한다. 특정 구체예에서, 억제 도메인은 IgA, IgD, 또는 IgG의 힌지 도메인, 또는 이러한 힌지 도메인의 단편일 수 있다. 제 1 절단가능한 링커-엔코딩 영역 (214)은 표적 세포 또는 조직에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 효소에 의해 절단가능한 펩티드 기질 (예를 들어, 도 1의 절단가능한 링커 (130))을 엔코딩한다. 경쇄-엔코딩 영역 (216)은 활성화된 상태에서 질병을 치료할 수 있는 작용성 항체의 경쇄 (예를 들어, 도 1의 경쇄 (102))를 엔코딩한다. 제 2 핵산 서열 (220)은 5'에서 3'로 제 2 억제 도메인-엔코딩 영역 (222), 제 2 절단가능한 링커-엔코딩 영역 (224) 및 중쇄-엔코딩 영역 (226)을 포함한다. 제 2 억제 도메인-엔코딩 영역 (222)은 억제 도메인 (예를 들어, 도 1의 억제 도메인 (120))의 펩티드 제 2 암 (예컨대, 도 1의 또 다른 펩티드 암 (122))을 엔코딩한다. 제 2 절단가능한 링커-엔코딩 영역 (224)은 동일한 펩티드 기질 (예를 들어, 도 1에 묘사된 절단가능한 링커 (130))을 엔코딩한다. 중쇄-엔코딩 영역 (226)은 작용성 항체의 중쇄 (예컨대, 중쇄 (104))를 엔코딩한다.
연결 핵산 서열 (230)은 제 1 핵산 서열 (210)과 제 2 핵산 서열 (220)을 연결시켜 단일 핵산 분자 (200)를 형성시키는데 사용된다.
선택적 구체예에서, 제 1 핵산 서열 (210) 및 제 2 핵산 서열 (220)은 단일의 개방해독틀에서 조합되고, 분비시 번역된 생성물은 변형되어 어셈블링된 힌지 항체를 생성시킨다. 예를 들어, 도 3에 묘사된 바와 같이, 퓨린-2A-엔코딩 서열 (230)은 제 1 핵산과 제 2 핵산 (210 및 220) 사이에 제공된다. 대안적으로, IRES 서열 (미도시됨)은 제 1 핵산 서열 (210)과 제 2 핵산 서열 (220)이 2개의 폴리펩티드로 각각 번역되도록 이들 두 핵산 서열을 연합시키는데 사용될 수 있다.
본 기재내용의 다양한 구체예에 따르면, 합성 핵산 분자 (200)는 임의의 상기 언급된 힌지 항체 및 이의 등가물을 엔코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들어, 합성 핵산 분자는 SEQ ID No. 17-50의 임의의 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 본 기재내용의 다른 구체예에 따르면, 제 1 및 제 2 핵산 서열은 2개의 별도의 벡터에서 작제되며, 여기에서 제 1 핵산 서열은 SEQ ID No. 67, 69, 71, 73, 75, 및 77 중 임의의 서열인 반면, 제 2 핵산 서열은 SEQ ID No. 68, 70, 72, 74, 76 및 78 중 임의의 서열이다.
또한, SEQ ID NO. 56은 SEQ ID No. 54의 서열을 갖는 IgD1 힌지 도메인을 엔코딩하는 핵산 분자의 예시적인 서열인 반면; SEQ ID No.57은 SEQ ID No. 55의 서열을 갖는 IgD2 힌지 도메인을 엔코딩하는 핵산 분자의 예시적인 서열이다.
상기 합성 핵산 분자 (200)를 발현하기 위한 벡터는 합성 핵산 분자 (200)의 전사 및/또는 번역이 조절 서열(들)의 조정하에 있도록 일반적으로 합성 핵산 분자 (200)를 하나 이상의 조절 서열과 연합시킴으로써 작제된다. 조절 서열의 비제한적 예는 촉진자, 증강인자, 종료자, 작동유전자, 억제인자 및 유도인자를 포함한다.
발현 벡터 작제는 일반적으로, 필요에 따라 또는 요구에 따라 유발성 또는 구성적일 수 있는 전사 및 번역 개시 영역 (코딩 영역은 전사 개시 영역의 전사 조정하에 작동가능하게 연결됨), 및 전사 및 번역 종결 영역을 제공한다. 이들 조정 영역은 핵산이 수득되는 종에 대해 천연일 수 있거나 외인성 공급원으로부터 유래될 수 있다. 발현 벡터 작제물은 또한, 숙주에서 작동적인 선택가능한 마커를 포함하여 예를 들어, 관심 작제물을 함유하는 숙주 세포의 성장을 촉진할 수 있다. 이러한 선택가능한 마커 유전자는 변형된 숙주 세포 선택을 위한 표현형 특질 예컨대, 디하이드로폴레이트 환원효소 또는 진핵세포 배양을 위한 네오마이신 내성을 제공할 수 있다.
인지될 수 있는 바와 같이, 제 1 핵산 서열 (210) 및 제 2 핵산 서열 (220)이 단일 해독 틀로 작제되는 경우, 발현 벡터는 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 하나의 조절 서열을 포함할 수 있다. 다른 한편으로는, 제 1 핵산 서열 (210) 및 제 2 핵산 서열 (220)이 상이한 해독 틀로 정렬되는 경우, 발현 벡터는 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열에 작동가능하게 각각 연결된 적어도 2개의 조절 서열을 가질 수 있다.
기타 구체예에서, 제 1 핵산 및 제 2 핵산은 단일 벡터로 작제되지 않는다; 그보다는 이들은 고유의 전사 및 번역 개시 영역, 선택가능한 마커 및/또는 조절 서열을 갖는 각각 2개의 별도의 벡터에 제공된다.
본 발명의 힌지 항체는 힌지 항체의 작용성 항체에 의해 치료가능한 질환(들) 또는 질병(들)의 치료에 유용하다. 항체-기반 요법에 의해 치료가능한 질환 또는 질병은 주로 암 또는 자가면역 질환이다.
이러한 질환으로부터 고통받는 대상체를 치료하기 위해, 본 힌지 항체 또는 이를 포함하는 약제 조성물은 치료학적 유효량으로 대상체에 투여된다. 따라서, 약제 조성물 및 치료 방법 또한 본 발명의 범주내에 속한다.
힌지 항체 이외에, 상기 약제 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은 문구 "약제학적으로 허용되는 담체"는 신체의 한 기관 또는 부분으로부터 신체의 또 다른 기관 또는 부분으로 활성제 (예를 들어, 힌지 항체)를 수송하거나 전달하는데 관련된 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클 예컨대, 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 담체는 제형의 기타 성분들과 양립가능하다는 점에서 "허용가능"해야 하며, 활성제의 어떠한 분해도 최소화하고 대상체에서 어떠한 해로운 부작용도 최소화하도록 선택된다. 약제 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 첨가제로서, 결합제, 향미제, 완충화제, 증점제, 착색제, 항-산화제, 희석제, 안정화제, 완충제, 에멀젼화제, 분산제, 현탁제, 소독제 및 기타 등등을 포함하는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 힌지 항체 펩티드와 함께 사용될 약제학적으로 허용되는 담체의 선택은 기본적으로 조성물이 투여되는 방식에 의해 결정된다. 본 발명의 약제 조성물은 피하, 정맥내, 경막내 또는 근내 주입으로 투여될 수 있다.
투여에 주입가능한 것은 멸균 수용액 또는 불수용액, 현탁액 및 에멀젼에서 제조될 수 있다. 비수성 용매의 예로는 비제한적으로, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일 예컨대, 올리브유, 및 주입가능한 유기 에스테르 예컨대, 에틸 올레에이트를 포함한다. 수성 담체의 예시적인 예는 물, 알콜/수용액, 에멀젼 또는 현탁액을 포함하며, 염수 및 완충된 매질을 포함한다. 통상의 비경구 비히클은 소듐 클로라이드 용액, 링거 덱스트로스, 덱스트로스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화된 링커, 또는 고정유를 포함하며; 반면 정맥내 비히클은 종종 유체 및 영양분 보충제 (replenisher), 전해질 보충제 (예컨대, 링커 덱스트로스를 기반으로 하는 것들), 및 기타 등등을 포함한다.
인지될 수 있는 바와 같이, 본 힌지 항체는 병소 부위에서 절단되어 활성화되고, 신체의 다른 부위에서는 절단되지 않은 채 유지되어 비활성화되기 때문에, 본 치료 방법은 표적을 벗어난 작용으로부터 초래된 전신 부작용 위험을 감소시키거나 심지어 제거한다는데 있어서 이롭다. 또한, 본 치료 방법은 존재하는 치료학적 항체의 효능을 향상시킨다.
하기 실시예는 본 발명의 특정 양태를 설명하고 본 발명을 실시하는데 있어서 당업자를 돕기 위해 제공된다. 이들 실시예는 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 추가의 고민 없이, 당업자는 본원의 설명을 기반으로 본 발명을 이의 가능한 넓은 범위로 이용할 수 있음이 이해된다. 본원에 언급된 모든 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 인용된다.
실시예 1
재료 및 방법
1.1 세포주 및 세포 배양
SV40 T 항원을 발현하는 인간 배아 신장 세포주 (293T), 인간 유방암 세포주 (SKBr3), 인간 직장결장 암종 세포주 (SW480), Huh 7를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에서 구입하였다. 세포를 10% 코스믹 송아지 혈청 (Cosmic calf serum) (CCS; Sigma-Aldrich), 1% (10,000 μ/ml) 페니실린, 및 1% (10,000 μ/ml) 스트렙토마이신 (Invitrogen)이 보충된 둘베코 변형 이글 배지에서 5% CO2의 습화된 대기하에 37℃에서 배양하였다. 피닉스 양영양성 레트로바이러스 패키징 세포 (공급원)를 10% 소태 혈청 (FBS; Sigma-Aldrich), 1% (10,000 μ/ml) 페니실린, 및 1% (10,000 μ/ml) 스트렙토마이신이 보충된 DMEM/뉴트리언트 F-12 Ham (DMEM/F12) 배지에서 5% CO2의 습화된 대기하에서 37℃에서 배양하였다. 계대 목적을 위해, 293T 세포 및 피닉스 세포를 3 내지 5분 동안 1X 베르센 (Versene) (EDTA) 용액으로 처리한 반면, SKBr3, SW480 및 Huh7 세포는 3 내지 5분 동안 트립신으로 처리하였다. 이어서, 세포를 필요한 실험에 의해 요구되는 바에 따라 다양한 농도로 계대배양하였다.
1.2 생화학 시약
TransIT®-LT1 형질감염 시약을 Mirus Bio LLC로부터 구입하였다. Opti-MEM 및 EDTA는 Invitrogen로부터 구입하였다. 소혈청 알부민 (BSA) 및 타입 IV MMP2 (젤라티나제 A)는 Sigma-Aldrich로부터 구입하였다. HRP-염소-α 인간-IgG Fcγ 항체 및 FITC-염소-α 인간-IgGAM Fcγ는 Jackson으로부터 구입하였다.
1.3 플라스미드 작제물
항-TNF-α 항체 즉, 인플릭시맙을 엔코딩하는 핵산 작제물을 작제하기 위해, 퓨린-2A 펩티드-엔코딩 핵산 작제물을 사용하여 경쇄-엔코딩 서열과 중쇄-엔코딩 서열을 단일 플라스미드에서 연합시켰다. 이어서, 중합효소 연쇄 반응 (PCR)을 수행하여 NheI, HindIII 및 SfiI를 경쇄의 N-말단에, XhoI를 경쇄의 C-말단에, BglII을 중쇄의 N-말단에 그리고, ClaI 및 AscI을 중쇄의 C-말단에 도입하였다. 이어서, IgG1 힌지-엔코딩 및 MMP2 기질-엔코딩 서열을 경쇄 및 중쇄-엔코딩 서열의 상류에 도입하여 IgG1 힌지/MMP2/인플릭시맙을 엔코딩하는 핵산 작제물 (SEQ ID No. 43)을 생성하였다. 동일한 프로토콜을 기타 항체 또는 힌지/MMP2/항체 예컨대, IgG1 힌지/MMP2/이필리무맙 (SEQ ID No. 17), IgG2 힌지/MMP2/이필리무맙 (SEQ ID No. 18), IgG3 힌지/MMP2/이필리무맙 (SEQ ID No. 19), IgG4 힌지/MMP2/이필리무맙 (SEQ ID No. 20), IgA1 힌지/MMP2/이필리무맙 (SEQ ID No. 21), IgA2 힌지/MMP2/이필리무맙 (SEQ ID No. 22), IgG1 힌지/MMP2/트레멜리무맙 (SEQ ID No. 23), IgG2 힌지/MMP2/트레멜리무맙 (SEQ ID No. 24), IgG3 힌지/MMP2/트레멜리무맙 (SEQ ID No. 25), IgG4 힌지/MMP2/트레멜리무맙 (SEQ ID No. 26), IgA1 힌지/MMP2/트레멜리무맙 (SEQ ID No. 27), IgA2 힌지/MMP2/트레멜리무맙 (SEQ ID No. 28), IgG1 힌지/MMP2/아달리무맙 (SEQ ID No. 29), IgG2 힌지/MMP2/아달리무맙 (SEQ ID No. 30), IgG3 힌지/MMP2/아달리무맙 (SEQ ID No. 31), IgG4 힌지/MMP2/아달리무맙 (SEQ ID No. 32), IgA1 힌지/MMP2/아달리무맙 (SEQ ID No. 33), IgA2 힌지/MMP2/아달리무맙 (SEQ ID No. 34), IgG1 힌지/MMP2/파니투무맙 (SEQ ID No. 35), IgG1 힌지/MMP2/데노수맙 (SEQ ID No. 36), IgG2 힌지/MMP2/데노수맙 (SEQ ID No. 37), IgG3 힌지/MMP2/데노수맙 (SEQ ID No. 38), IgG4 힌지/MMP2/데노수맙 (SEQ ID No. 39), IgA1 힌지/MMP2/데노수맙 (SEQ ID No. 40), IgA2 힌지/MMP2/데노수맙 (SEQ ID No. 41), IgG1 힌지/MMP2/에팔리주맙 (SEQ ID No. 42), IgG2 힌지/MMP2/인플릭시맙 (SEQ ID No. 44), IgG3 힌지/MMP2/인플릭시맙 (SEQ ID No. 45), IgG4 힌지/MMP2/인플릭시맙 (SEQ ID No. 46), IgA1 힌지/MMP2/인플릭시맙 (SEQ ID No. 47), IgA2 힌지/MMP2/인플릭시맙 (SEQ ID No. 48), IgG1 힌지/MMP2/우스테키누맙 (SEQ ID No. 49), 및 IgG1 힌지/MMP2/트라스투주맙 (SEQ ID No. 50)을 엔코딩하는 핵산 작제물의 작제에 적용하였다.
이어서, 인플릭시맙 및 힌지/MMP2/인플릭시맙을 엔코딩하는 작제물을 각각 신장된 바이러스 패키징 시그널(Ψ+), 퓨로마이신-내성 유전자 (Puror) 및 암피실린-내성 유전자 (Ampr)를 함유하는 pLKO AS3w.퓨로 플라스미드에 도입하여 발현 벡터 (인플릭시맙-pLKO 플라스미드 및 힌지/MMP2/인플릭시맙-pLKO 플라스미드)를 생성하였다. 기타 핵산 작제물을 발현시키기 위한 플라스미드를 동일한 프로토콜로 제조하였다.
1.4 렌티바이러스 형질감염
피닉스 세포를 베르센으로 처리하고, 분리된 세포 (1.5x106 세포/웰)를 6-웰 셀바인드 (CellBind) 플레이트에 시딩하였다. 37℃에서 24시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이션시킨 후, 원래의 세포 배양액을 제거하고, 10% FBS 배양액이 보충된 절반 부피의 DMEM을 재공급하였다.
1.25 ㎍ 힌지/MMP2/인플릭시맙-pLKO 플라스미드 (125 μL Opti-MEM와 1.125 ㎍ pCMV-ΔR8.91 플라스미드 및 0.125 ㎍ pMD.G 플라스미드)를 125 μL Opti-MEM에서 7.5 ㎕ TransIT® 시약을 함유하는 반응 용액에 서서히 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 방치하고 이어서 6-웰 플레이트에 서서히 첨가하고 37℃에서 16시간 동안 인큐베이터에서 진탕시킨 후, 절반 부피의 새로운 배지 (DMEM/F12 + 10%FBS + 1% BSA +1x p/s)를 첨가하였다. 그 다음 3일에 걸쳐, 2 ml의 상청액을 24시간 마다 수집하고 2 ml의 새로운 배지를 보충하였다. 수집된 상청액을 1250 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 4℃에서 냉장고에서 보관하였다.
바이러스 응결을 위해, 냉장된 상청액을 실온으로 재가온시키고, 단백질 원심분리 필터 튜브로 여과한 후, 부피가 1.5 ml로 감소될 때 까지 4℃에서 3500 rpm으로 원심분리하였다. 응축물을 분취하고 사용할 때 까지 -80℃에서 저장하였다.
293T 세포를 형질감염시키기 위해, 293T 세포를 4x104/웰로 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 다음 날, 10-20% 컨플루언스에서 세포를 형질감염시켰다. 원래의 배지를 먼저 제거하고, 감염 배지 (1ml의 성장 배지 (DMEM + 10% CCS + 1% P/S) +150 ㎕ 바이러스 액체 + 8 ㎍/ml 폴리브렌)를 벽을 따라 첨가하였다. 24시간 동안 진탕시킨 후, 배지를 제거하고, 새로운 성장 배지로 재보충하고, 형질감염된 293T 세포를 퓨로마이센 (puromycene) (3-5 ㎍/ml)으로 스크리닝하였다. 퓨로마이센 스크리닝하면서 2주 동안 2일마다 성장 배지를 새롭게 하였다. 이어서, 세포를 수확하고 웨스턴 블롯으로 처리하여 세포가 힌지/MMP2/인플릭시맙을 안정하게 발현하는지의 여부를 검출하였다. 인플릭시맙을 안정하게 발현하는 293T 세포를 동일한 프로토콜로 제조하였다.
1.5 항체 정제
형질감염된 293T 세포를 배양 플레이트 (15 cm)에 시딩하고, 약 80-90% 컨플루언스까지 10% CCS 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM으로 배양하였다. 원래 성장 배지를 제거하고, 플레이트를 10 ml PBS로 세척하여 혈청을 제거하였다. 이어서, 세포를 2일 동안 15ml 혈청-비함유 DMEM 배지로 배양하고, 상청액을 수집하고 10분 동안 4℃에서 3500 rpm으로 원심분리하였다. 이어서, 상청액을 수집하고 사용시까지 -80℃에서 저장하였다.
정제를 위해, 135 ml의 냉동된 상청액을 37℃ 수조를 사용하여 재가온하였다. 이어서, 상청액을 단백질 원심분리 필터 튜브를 사용하여 30배로 응축시켰다. 항체를 단백질 A 세파로스 정제 시스템을 이용하여 정제하고, 결합된 항체를 0.1 M 글리신 용리 완충제 (pH 3.0)으로 용리시켰다. 용리물의 pH 값을 1M Tris-염기 (pH 8.0) 및 6N HCL을 사용하여 7.4로 조절하였다. 이어서, 샘플을 투석 막 (재생된 셀룰로스 관형 막 T4, MWCO :12000-14000, CelluSep)으로 수집하고, 1 내지 2시간 동안 1X PBS (pH 7.4)로 2회 투석하였다. 생성물을 10% SDS-PAGE 분리에 의해 확인한 후 10분 동안 코마시에 브릴리언트 블루 (Comassie Brilliant Blue)로 염색하였다.
1.6 MMP2 기질 절단
힌지/MMP2/인플릭시맙 (36 ㎕의 PBS 중 5 ㎍)을 얼음 상에서 0, 1, 5, 10, 30, 또는 60 분 동안 MMP2 (4 ㎕의 DMEM 중 0.8 ㎍, 최종 농도 20 ㎍/ml)와 반응시켰다. 항-TNF-α 항체 (인플릭시맙)를 대조군으로서 사용하였다. 이어서, 반응 혼합물을 환원 염료에 첨가하고, 10분 동안 100℃에서 비등시켜 MMP2의 활성을 종결시켰다. MMP2 기질의 절단을 10 % SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 확인하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 환원 염료를 6:1 (v/v) 비의 수집된 세포 및 상청액에 첨가하고 10분 동안 100℃에서 비등시켰다. 이어서, 단백질을 10% SDS-PAGE에 의해 분리하고, 4℃에서 밤새 5% 탈지유로 차단시킨 니트로셀룰로스 페이퍼로 옮겼다. HRP-염소 항-인간 IgG Fcγ 항체 (5% 탈지유 중 0.4 ㎍/ml)를 사용하여 항체를 확인하였다.
1.7 효소-결합 면역흡착 검정
힌지/MMP2/항체의 활성을 항원-기반 ELISA 또는 세포-기반 ELIA에 의해 측정하였다.
(A) 플레이트 코팅
힌지/MMP2/인플릭시맙 또는 힌지/MMP2/아달리무맙의 활성을 측정하기 위해, TNF-α (0.3 ㎍/ml)를 코팅 완충제 (100mM Na2CO3, Ph 8.0)에 희석시키고, 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 ELISA (Nunc-Maxisorp) 상에 코팅시켰다. 힌지/MMP2/데노수맙에 있어서, 96 웰 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 코팅 완충제 (100 mM Na2CO3, pH 8.0) 중의 RANKL (0.3 ㎍/ml) 50 ㎕/웰로 코팅하였다. 힌지/MMP2/이필리무맙 또는 힌지/MMP2/트레멜리무맙의 활성을 측정하기 위해, 96 웰 플레이트를 37℃에서 2시간 동안 코팅 완충제 (100 mM Na2CO3, pH 8.0) 중의 CTLA4 (0.3 ㎍/ml) 50 ㎕/웰로 코팅하였다.
차단을 위해, 200 ㎕의 5% 탈지유를 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고, 밤새 4℃ 냉장고에서 저장하였다.
힌지/MMP2/항-EGFR 항체 및 힌지/MMP2/항-HER2 항체의 활성을 세포-기반 ELISA에 의해 측정하였다. 간단하게는, EGFR-양성 SW480 세포 또는 HER2-양성 SKBr3 세포를 200 ㎕의 성장 배지 (DMEM + 10 % CCS + 1 % P/S)를 사용하여 105 세포/웰로 96-웰 플레이트에 시딩하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
(B) MMP2 처리
20 ㎕의 얼음같이 찬 MMP2 효소 (혈청 비함유 DMEM 중의 200 ㎍/ml)를 10-배 희석하고, 얼음 상에서 0, 1, 10, 30, 60 또는 90 분 동안 180 ㎕의 형질감염된 293T 세포 상청액과 반응시킨 후 반응을 20 ㎕의 CCS 첨가에 의해 종결시켰다.
(C) 항체 활성
다음 날, 차단된 96-웰 플레이트로부터 원래의 배양액을 제거한 후, 플레이트를 0.05% PBST (200 ㎕/웰)로 한번 및 PBS (200 ㎕/웰로 한번)로 세척하고 (또는 세포-기반 ELIA의 경우 DMEM (200 ㎕/웰)으로 한번 세척함), 웰 중의 액체를 제거하였다. 이어서, MMP2-처리된 힌지/MMP2/항체 (50 ㎕/웰)를 이중으로 (또는 세포-기반 ELIA의 경우 삼중으로) 첨가하고, 2시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응 후, 샘플을 웰로부터 피페팅시키고, 플레이트를 0.05% PBST (200 ㎕/웰)로 순간적으로 그리고, PBS (200 ㎕/웰)로 한번 세척하여 (또는 세포-기반 ELIA의 경우 DMEM (200 ㎕/웰)로 순간적으로 세척하여) 자유 항체를 제거하였다. 이어서, PBS (또는 세포-기반 ELIA의 경우 DMEM + 2 % CCS) 중의 2 % 탈지유 중 1 ㎍/ml의 HRP-염소 항-인간 IgG Fcγ 항체를 50 ㎕/웰로 96-웰 플레이트에 분포시키고, 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 웰로부터 HRP-염소 항-인간 IgG Fcγ 항체를 피페팅한 후, 플레이트를 0.05% PBST (또는 세포-기반 ELIA의 경우 DMEM) (200 ㎕/웰)로 순간적으로 그리고, PBS (200 ㎕/웰)로 한번 세척하였다.
MMP2-처리된 힌지/MMP2/항체의 활성을 기질로서 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤즈티아졸린-6-설폰산) (ABTS)의 산화에 의해 측정하였다. ABTS 및 30% H2O2 (ABTS: H2O2=3000:1)를 함유하는 반응 혼합물을 150 ㎕/웰로 플레이트에 첨가하였다. ABTS의 산화에 이어 405 nm에서 흡광도를 증가시켰다. 효소 활성은 흡광도 세기에 의해 평가하였다. 기타 항체의 활성은 동일한 프로토콜로 평가하였다.
1.8 힌지 / MMP2 / 인플릭시맙에 의한 TNF -α 시그널의 중화
Huh 7 세포를 트립신 (0.05%)으로 처리하고, 분리된 세포 (7x104 세포/웰)를 24-웰 셀바인드 플레이트에 시딩하였다. 24 시간 동안 37℃에서 인큐베이터에서 인큐베이션시킨 후, 원래의 세포 배양액을 제거하고, 10% FBS 배양액이 보충된 DMEM으로 재보충하였다.
0.5 ㎍ NF - kB -Luc 리포터 플라스미드를 30 ㎕ 혈청-비함유 DMEM 중의 1.5 ㎕ TransIT®-LT1 형질감염 시약을 함유하는 반응 용액에 첨가하였다. 혼합물을 24-웰 플레이트에 서서히 첨가하고 24시간 동안 37℃에서 인큐베이터에서 진탕시켰다.
형질감염 후 24시간째에, 세포를 하기 하나로 처리하였다: (1) 배지 (음성 대조군으로서); (2) 20 ng TNF-α (양성 대조군으로서); (3) 20 ng TNF-α 및 100 mg/ml 인플릭시맙; (4) 20 ng TNF-α, 100 mg/ml 인플릭시맙 및 20 mg/ml MMP2; (5) 20 ng TNF-α 및 100 mg/ml IgG1 힌지/MMP2/인플릭시맙; 및 (6) 20 ng TNF-α, 100 mg/ml IgG1 힌지/MMP2/인플릭시맙 및 20 mg/ml MMP2. 처리 후 24시간째에, 스테디-글로 (Steady-Glo) 및 PBS를 96 웰에 첨가하고, 루시퍼라제 해독기를 사용하여 루시퍼라제 활성을 검출하였다.
1.9 동물 실험
본 기재내용의 작업 실시예에 사용된 모든 동물을 온도 제어 (24-25℃) 및 12:12 명-암 사이클 하에 동물 우리에 하우징시켰다. 표준 실험실 음식 및 수돗물은 임의로 이용가능하게 하였다. 실험 절차는 가오슝 메디칼 유니버시티 리뷰 보드 (Kaohsiung Medical University Review Board) (Kaohsiung City, Taiwan, R.O.C.)에 의해 승인되었으며, 네셔널 애니멀 웰페어 규정 (national animal welfare regulation)에 따라 수행하였다.
실시예 2
힌지 / MMP2 / 인플릭시맙의 정제
힌지/MMP2/인플릭시맙의 3-차원 구조를 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 생성시켰다. 도 4를 참조로 하여, IgG1 힌지 도메인은 디설피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 펩티드로 구성되며, 인플릭시맙의 경쇄 및 중쇄의 상보성 결정 부위 (CDR)를 IgG1 힌지 도메인으로부터 유래된 스윙 억제 도메인에 의해 차단하였다.
정제를 상기 실시예 1.5에 기술된 바와 같이 수행하고, 정제된 생성물은 SDS PAGE에 의해 확인하였다 (도 5). 정제된 생성물은 55 kDa IgG1 힌지/MMP2/인플릭시맙 중쇄 (왼쪽)인 것으로 확인되었으며, 이의 크기는 인플릭시맙 (중간)과 유사하였다. 레인 4로부터의 생성물 순도는 약 85%이었다.
실시예 3
MMP2 처리를 통해 힌지 / MMP2 / 인플릭시맙으로부터 억제 도메인 제거
IgG1 힌지/MMP2/인플릭시맙 또는 인플릭시맙 (항-TNF-α 항체)을 실시예 1.6에 기술된 바와 같이 MMP2 (20 ㎍/ml)로 처리하였다. 도 6에 제공된 바와 같은 웨스턴 블롯 분석 결과는 인플릭시맙의 분자량 (약 53.5 kDa)이 MMP2 처리 전 및 후에 일정함을 입증하였다. 다른 한편으로는, MMP2 처리 전, IgG1 힌지/MMP2/인플릭시맙의 분자량은 약 55 kDa인 반면, MMP2 처리 후 55 kDa 생성물의 밴드의 세기는 점차적으로 감소되나, 약 53.5 kDa의 밴드의 세기는 시간에 따라 증가한다. 이러한 결과는 본 힌지 항체의 억제 도메인이 MMP2 처리에 의해 작용성 항체 도메인으로부터 제거될 수 있음을 나타낸다.
실시예 4
힌지 / MMP2 /항- TNF -α 항체의 항원-결합 활성의 억제 및 복구
MMP2 처리 전 및 후의 정제된 힌지/MMP2/인플릭시맙의 항원-결합 활성 (실시예 1.6)을 ELISA에 의해 측정하고, 결과는 도 7에 요약하였다. 이러한 분석에서, 항-TNF-α 항체의 TNF-α의 결합능은 100%로 설정되었으며, 힌지/MMP2/인플릭시맙의 상대적 퍼센트를 이에 따라 계산하였다.
ELISA 결과는 TNF-α에 대한 힌지/MMP2/인플릭시맙의 결합능은 MMP2로 처리 전에 약 0.5%임을 나타내며, 이는 억제 도메인의 부착이 작용성 항-TNF-α 도메인의 결합능을 99.5% 만큼 실질적으로 억제시킴을 확인시켜 준다. 데이타는 또한, 1시간의 MMP2 처리가 힌지/MMP2/인플릭시맙을 활성화시키기에 충분함을 보여주는데, 힌지/MMP2/인플릭시맙의 결합능이 약 110%로 회복되기 때문이다. MMP2 처리 후 2시간 째에, 활성화된 힌지/MMP2/인플릭시맙의 결합능은 인플릭시맙과 비교하여 약 120%로 추가로 상승되었다.
실시예 5
힌지 / MMP2 / 인플릭시맙에 의한 TNF -α 시그널의 중화
실시예 1.8을 수행하여 IgG1 힌지/MMP2/인플릭시맙이 MMP2 처리 후 TNF-α 시그널을 여전히 중화시킬 수 있는 지의 여부를 확인하였다. 도 8에 요약된 바와 같이 결과는, MMP2 처리 (군 4) 또는 비처리 (군 3) 여부에 상관없이 통상적인 인플릭시맙은 양성 대조군 (군 2)과 비교하여 TNF-α 시그널을 효과적으로 차단할 수 있음을 나타낸다. 이에 반해, MMP2 비처리된 IgG1 힌지/MMP2/인플릭시맙 (군 5)은 실질적으로 TNF-α 시그널을 중화시킬 수 없는 반면, MMP2-처리된 IgG1 힌지/MMP2/인플릭시맙 (군 6)은 효과적으로 TNF-α 시그널을 중화시킨다. 이들 결과는 본 발명에 의해 제안된 억제 도메인이 작용성 항체 도메인과 작용성 항체의 의도된 리간드 간의 결합을 차단하는데 효과적임을 입증한다. 게다가, 이러한 실험은 또한, 본 힌지 항체의 작용성 도메인의 작용성이 MMP2 처리에 의해 복구될 수 있음을 확립하였다.
실시예 6
다양한 힌지 / MMP2 /항체의 항원-결합 활성의 억제 및 복구
MMP2 처리 전 및 후 다양한 힌지/MMP2/항-HER2 항체의 항원-결합능은 도 9, 도 10 및 표 1에 요약하였다.
항체 (INN) 힌지 도메인 억제율 ( % )
항-TNF -α ( 인플릭시맙 ) IgG1 99.5
IgG2 94
IgG3 99
IgG4 68.5
IgA1 97.5
IgA2 76.5
항-EGFR(파니투무맙) IgG1 89
항-HER2(트라스투주맙) IgG1 73
항- TNF -α ( 아달리무맙 )




IgG1 90
IgG2 90
IgG3 90
IgG4 90
IgA1 90
IgA2 90
항-RANK-L ( 데노수맙 )




IgG1 98
IgG2 98
IgG3 98
IgG4 98
IgA1 98
IgA2 98
항-CTLA -4 ( 이필리무맙 ) IgG1 95
항-CTLA -4 ( 트레멜리무맙 ) IgG1 87
항-IL 1β ( 카나키누맙 ) IgG1 97
INN, 국제 일반명.
도 9 및 표 1 둘 모두를 참조하여, MMP2 처리 전, 불활성화된 IgG1 힌지/MMP2/트라스투주맙의 항원-결합 활성은 약 27%이며, 이는 작용성 항-HER2 도메인의 결합능의 약 73%가 부착된 억제 도메인에 의해 억제됨을 나타낸다. MMP2 처리 후 약 1.5 시간에, IgG1 힌지/MMP2/트라스투주맙 항체는 실질적으로 활성화되며, 결합능은 약 97%로 복구된다.
MMP2 처리 전 불활성화된 IgG1 힌지/MMP2/파니투무맙의 항원-결합 활성은 약 11%이며, 이는 작용성 항-EGFR 도메인의 결합능의 약 89%가 부착된 억제 도메인에 의해 억제됨을 나타낸다. IgG1 힌지/MMP2/파니투무맙의 실질적 활성화는 MMP2 처리 후 대략 2 시간에 달성되며, 이는 약 90%의 항원 결합능에 의해 입증된다.
요약하면, 다양한 IgG1 힌지/MMP2/항체는 힌지 항체와 이들의 각 리간드 간의 결합에 대한 약 73% 내지 99.5% 억제를 나타내며, 결합 친화력은 MMP2 처리 후 약 100%로 복구될 수 있다.
힌지 항체의 억제 효과에 대한 힌지 도메인의 효과를 이해하기 위해, 다양한 면역글로불린 (예를 들어, IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, IgA1 및 IgA2)으로부터의 힌지 도메인을 상기 기술된 바와 같은 작용성 항체에 부착시켰다. 힌지 도메인 모두는 힌지 항체가 활성화되지 않은 경우 이의 의도된 리간드로의 힌지 항체의 결합을 실질적으로 억제시킬 수 있다. 특히, MMP2 처리 전 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 힌지/MMP2/항-TNF-α 항체의 항원-결합능은 각각 0.5%, 6%, 1%, 31.5%, 2.5% 및 23.5%이다 (도 10). 또한, MMP2로의 활성화 후, 이들 활성화된 항체의 결합능은 100% 복구된다 (도 10).
이들 결과는 본 발명에 의해 제안된 억제 도메인이 작용성 항체 도메인의 결합 친화성을 약 73 내지 99.5% 차단할 수 있으며, 힌지 항체의 결합 친화성은 MMP2 처리에 의해 약 90 내지 100%로 복구될 수 있음을 나타내며, 이는 본 힌지 항체의 설계 구성은 임의의 임상적으로 이용가능한 항체에 적용될 수 있음을 시사한다.
실시예 7
동물 모델에서 힌지 - αEGFR 항체의 국소화 및 활성화
파니투무맙 (항-αEGFR 항체)은 EGFR-발현 직장결장암의 치료에 사용되었다. 본 실시예에서, 힌지/MMP2/파니투무맙 (이후, 힌지-αEGFR 항체)을 제조하고, 생체내 국소화 및 활성화를 결장 종양-함유 마우스를 사용하여 시험하였다.
항-αEGFR 항체 (파니투무맙) 및 힌지-αEGFR 항체를 상기 실시예 1에 제시된 프로토콜에 따라 제조하였다. 이어서, 항-αEGFR 항체 및 힌지-αEGFR 항체를 통상적으로 이용가능한 시아닌 염료 IR820 (Sigma 543365로부터 구입)로 컨쥬게이션하였다.
20 그램의 평균 체중의 누드 마우스에 인간 결장 암 세포 HCT116 (EGFR+/MMP+)를 이식하였다. HCT116 (EGFR+/MMP+) 결장 종양-함유 마우스에 5 mg/kg의 IR820-항-αEGFR 항체 또는 IR820-힌지-αEGFR 항체를 PBS 또는 MMP 억제제 (Sigma로부터 구입한 5 mg/kg의 1.10-펜안트롤린 모노히드레이트)와 i.v. 주입하였다. 각각 710 및 820 nm의 여기 및 방사 파장에서 IVIS 스펙트럼/CT 이미지화 시스템 (Caliper Life Sciences, PE)을 사용하여 마우스를 이미지화시킴으로써 광학 이미지화를 주입 후 48시간에 수행하였다. 이미지화 절차 동안, 마우스를 37℃에서 가스 마취 (5% 이소플루란) 하에 유지하였다. 대표적인 이미지는 도 11에 제공되어 있다.
광학 이미지화는 비침습적으로 살아있는 대상체에 투여된 형광-시그널의 3-차원 분포의 정량적 측정을 제공하다. 이론적으로, 힌지-αEGFR 항체는 일단 종양 부위에 도달하면, MMP2 프로테아제의 작용하에 활성화될 것이며, 이어서 활성화된 작용성 항체는 EGFR-양성 종양 세포와 결합할 수 있다.
도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 항-αEGFR 항체 (왼쪽에서 첫 번째 이미지)와 같은 활성화된 힌지-αEGFR 항체 (왼쪽에서 세 번째 이미지)는 종양 부위로 선택적으로 국소화되었다. 추가로, 이미지에 기록된 색상으로 판단하면, 종양 부위에서 활성화된 힌지-αEGFR 항체의 축적 수준은 종양 부위에서의 항-αEGFR 항체의 것과 동등하였다.
게다가, 도 11에서의 항-αEGFR 항체 및 힌지-αEGFR 항체로 각각 처리된 2개 세트의 이미지와 비교할 경우, MMP 억제제의 존재하에 힌지-αEGFR 항체는 덜 활성화되며 EGFR-양성 종양 세포에 덜 결합함이 주지된다. 이들 데이타는 힌지-αEGFR 항체의 활성화가 MMP 억제제에 의해 억제됨을 나타내었다. 또한, 이들 결과는, 본 기재내용의 구체예에 따른 힌지/MMP2 항체의 활성화가 절단 효소 (예컨대, MMP2)의 작용에 의해 달성됨을 확인시켜주었다.
실시예 8
동물 모델에서 힌지 - TNFα항체의 항-염증 효과
항-TNFα 항체 예컨대, 아달리무맙은 면역 반응의 억제가 요구되는 여러 질병을 치료하는데 사용되었다. 본 실시예에서, 콜라겐-유발된 관절염 (CIA)을 치료하기 위한 IgG1 힌지/MMP2/아달리무맙 (이 후, 힌지-TNFα 항체)의 효능을 조사하였다. CIA는 인간 류마티스 관절염의 만성 자가면역 모델이며, 류마티스 관절염의 분자 및 세포 매개인자를 분석하는데 널리 이용된다.
항-TNFα 항체 (아달리무맙) 및 힌지-TNFα 항체를 상기 실시예 1에 제시된 프로토콜에 따라 제조하였다.
콜라겐-유발된 관절염의 동물 모델을 하기와 같이 확립하였다. 수컷 DBA/1 마우스 (8 내지 10 주령)를 동일 용적의 프로인드 완전 보조제 (Chondrex, Inc., Redmond, WA, USA)로 에멀젼화된 100 ㎍의 타입 II 소 콜라겐 (Chondrex, Inc., Redmond, WA, USA)을 꼬리 아래에 피내 주사하여 면역화시켰다. 처음 면역화 후 3주에 절차를 반복하였다. 마우스를 2일 내지 3일마다 검사하고, 하나 이상의 다리에 홍반 및/또는 발 부기를 나타내는 각 마우스를 치료 연구에 할당하였다. 관절염 발병시, 마우스에 PBS, 항-TNFα 항체 또는 힌지-TNFα 항체 (100 ㎍/마우스)를 i.p. 주사하였다. 4개 발의 염증은 하기와 같이 0 내지 4로 등급화시켰다: 0 = 부기 없음 및 국소 발적; 1 = 손가락 관절의 약간의 부기; 2 = 발목 또는 손목 관절의 약간의 부기; 3 = 전체 발의 심각한 염증; 및 4 = 기형 또는 관절유착증. 각 발을 등급화시키고, 4개 스코어를 합쳐서 마우스 당 최대 가능한 염증 스코어는 16이었다. 결과는 도 12에 요약되어 있다.
도 12의 데이타는, 항-TNFα 항체 (아달리무맙) 및 힌지-TNFα 항체로 처리된 마우스의 염증 스코어가 PBS로 처리된 마우스보다 현저하게 저하되었음을 나타내었다. 게다가, 본 힌지-TNFα 항체로 처리된 마우스의 염증 스코어는 통상적으로 입수가능한 항-TNFα 항체로 처리된 것의 스코어보다 더 낮았다. 따라서, 이들 데이타는 본 힌지-TNFα 항체가 류마티스 관절염을 치료하는데 사용될 수 있음을 입증해준다.
상기 구체예 및 작업 실시예의 힌지 항체가 모노클로날 항체로부터 유래됨에도 불구하고, 본 기재내용은 이에 제한되지 않음을 주지해야 한다. 그보다는, 본 출원에 의해 제공된 설계 구성은 기타 항체-기반 치료제에 적용가능하다. 예를 들어, 본 기재내용에 제안된 억제 도메인은 본원에 논의된 것과 유사한 방식으로 이중특이성 항체 (예를 들어, 카투막소맙)의 N-말단에 부착될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 기타 항체-기반 치료제는 비제한적으로, 이중특이성 이항체, 삼중특이성 Fab3 항체, 이가 미니바디, 트리아바디, 테트라바디, scFv 단편, Fab 단편, 및 Bis-scFv 단편을 포함한다.
구체예의 상기 설명은 단지 예로서 제공되며, 다양한 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이타는 본 발명의 예시적 구체예의 구조 및 사용에 대한 충분한 설명을 제공한다. 하나 이상의 개별 구체예를 참조하여 또는 특정 정도의 특수성을 갖는 본 발명의 다양한 구체예가 상기 기술되어 있지만, 당업자는 본 발명의 사상 또는 범주를 벗어나지 않으면서 기재된 구체예에 대한 많은 대안을 제시할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> DCB-USA LLC Kaohsiung Medical University <120> ANTIBODY LOCKER FOR THE INACTIVATION OF PROTEIN DRUG <130> P2757-1-PCT <150> PCT/US61/827,763 <151> 2013-05-28 <160> 78 <170> BiSSAP 1.3 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> infliximab light chain <400> 1 Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Phe Val Gly Ser Ser 20 25 30 Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Thr Val Glu Ser 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser His Ser Trp Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val 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<223> IgG1 Hinge+ Ipilimumab heavy chain <400> 68 gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca tgcccaccgt gcccaggcgg ccgcggcggc 60 ggcggcagcg gtcccctggg tgtgagaaga tctcaggtgc agctggtgga gtctggggga 120 ggcgtggtcc agcctgggag gtccctgaga ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttc 180 agtagctata ctatgcactg ggtccgccag gctccaggca aggggctgga gtgggtgaca 240 tttatatcat atgatggaaa caataaatac tacgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc 300 atctccagag acaattccaa gaacacgctg tatctgcaaa tgaacagcct gagagctgag 360 gacacggcta tatattactg tgcgaggacc ggctggctgg ggccctttga ctactggggc 420 cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagcc tccaccaagg gaccatcggt cttccccctg 480 gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac 540 tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac 600 accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 660 ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac 720 accaaggtcg acaagaaagt tgagcccaaa tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg 780 tgcccagcac ccgaactcct ggggggaccg tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 840 gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 900 gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 960 acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 1020 ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc 1080 ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa gccaaggggc agccccgaga accacaggtg 1140 tacaccctgc ccccatcccg ggatgagctg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1200 gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1260 aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1320 aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1380 catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaataa 1440 <210> 69 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG2 Hinge+ Ipilimumab light chain <400> 69 gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccagtta acggcggcgg cggcagcggt 60 cccctgggtg tgagagcggc ccagccggcc gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc 120 ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttggc 180 agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat 240 ggtgcattca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca 300 gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag 360 cagtatggta gctcaccgtg gacgttcggc caagggacca aggtggaaat caaacggact 420 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 480 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 540 gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 600 gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 660 aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 720 aacaggggag agtgc 735 <210> 70 <211> 1431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG2 Hinge+ Ipilimumab heavy chain <400> 70 gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccaggcg gccgcggcgg cggcggcagc 60 ggtcccctgg gtgtgagaag atctcaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcgtggtc 120 cagcctggga ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt cagtagctat 180 actatgcact gggtccgcca ggctccaggc aaggggctgg agtgggtgac atttatatca 240 tatgatggaa acaataaata ctacgcagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga 300 gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa atgaacagcc tgagagctga ggacacggct 360 atatattact gtgcgaggac cggctggctg gggccctttg actactgggg ccagggaacc 420 ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggaccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 480 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 540 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 600 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 660 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtc 720 gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780 cccgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 840 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 900 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 960 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1020 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1080 atcgagaaaa ccatctccaa agccaagggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1140 cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1200 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1260 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1320 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1380 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaata a 1431 <210> 71 <211> 885 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG3 Hinge+ Ipilimumab light chain <400> 71 gagctcaaaa ccccacttgg tgacacaact cacacatgcc cacggtgccc agagcccaaa 60 tcttgtgaca cacctccccc gtgcccacgg tgcccagagc ccaaatcttg tgacacacct 120 cccccatgcc cacggtgccc agagcccaaa tcttgtgaca cacctccccc gtgcccaagg 180 tgcccagtta acggcggcgg cggcagcggt cccctgggtg tgagagcggc ccagccggcc 240 gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 300 ctctcctgca gggccagtca gagtgttggc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 360 cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcattca gcagggccac tggcatccca 420 gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 480 cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcaccgtg gacgttcggc 540 caagggacca aggtggaaat caaacggact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 600 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 660 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 720 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 780 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag 840 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgc 885 <210> 72 <211> 1581 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG3 Hinge+ Ipilimumab heavy chain <400> 72 gagctcaaaa ccccacttgg tgacacaact cacacatgcc cacggtgccc agagcccaaa 60 tcttgtgaca cacctccccc gtgcccacgg tgcccagagc ccaaatcttg tgacacacct 120 cccccatgcc cacggtgccc agagcccaaa tcttgtgaca cacctccccc gtgcccaagg 180 tgcccaggcg gccgcggcgg cggcggcagc ggtcccctgg gtgtgagaag atctcaggtg 240 cagctggtgg agtctggggg aggcgtggtc cagcctggga ggtccctgag actctcctgt 300 gcagcctctg gattcacctt cagtagctat actatgcact gggtccgcca ggctccaggc 360 aaggggctgg agtgggtgac atttatatca tatgatggaa acaataaata ctacgcagac 420 tccgtgaagg gccgattcac catctccaga gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa 480 atgaacagcc tgagagctga ggacacggct atatattact gtgcgaggac cggctggctg 540 gggccctttg actactgggg ccagggaacc ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag 600 ggaccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 660 ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 720 gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 780 ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 840 gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtc gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac 900 aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cccgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 960 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 1020 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 1080 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 1140 gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 1200 aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaagggg 1260 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac 1320 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1380 gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1440 ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1500 gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1560 tccctgtctc cgggtaaata a 1581 <210> 73 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 Hinge+ Ipilimumab light chain <400> 73 gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagtta acggcggcgg cggcagcggt 60 cccctgggtg tgagagcggc ccagccggcc gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc 120 ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc ctctcctgca gggccagtca gagtgttggc 180 agcagctact tagcctggta ccagcagaaa cctggccagg ctcccaggct cctcatctat 240 ggtgcattca gcagggccac tggcatccca gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca 300 gacttcactc tcaccatcag cagactggag cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag 360 cagtatggta gctcaccgtg gacgttcggc caagggacca aggtggaaat caaacggact 420 gtggctgcac catctgtctt catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact 480 gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag 540 gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag 600 gacagcacct acagcctcag cagcaccctg acgctgagca aagcagacta cgagaaacac 660 aaactctacg cctgcgaagt cacccatcag ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc 720 aacaggggag agtgc 735 <210> 74 <211> 1431 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG4 Hinge+ Ipilimumab heavy chain <400> 74 gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccaggcg gccgcggcgg cggcggcagc 60 ggtcccctgg gtgtgagaag atctcaggtg cagctggtgg agtctggggg aggcgtggtc 120 cagcctggga ggtccctgag actctcctgt gcagcctctg gattcacctt cagtagctat 180 actatgcact gggtccgcca ggctccaggc aaggggctgg agtgggtgac atttatatca 240 tatgatggaa acaataaata ctacgcagac tccgtgaagg gccgattcac catctccaga 300 gacaattcca agaacacgct gtatctgcaa atgaacagcc tgagagctga ggacacggct 360 atatattact gtgcgaggac cggctggctg gggccctttg actactgggg ccagggaacc 420 ctggtcaccg tctcctcagc ctccaccaag ggaccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 480 tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 540 gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 600 gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 660 agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtc 720 gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 780 cccgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 840 atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 900 gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 960 cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 1020 gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1080 atcgagaaaa ccatctccaa agccaagggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1140 cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc 1200 ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1260 aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1320 gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1380 ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaata a 1431 <210> 75 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA1 Hinge+ Ipilimumab light chain <400> 75 ccagttccct caactccacc taccccatct ccctcaactc cacctacccc atctccctca 60 tgctgccacg ttaacggcgg cggcggcagc ggtcccctgg gtgtgagagc ggcccagccg 120 gccgaaattg tgttgacgca gtctccaggc accctgtctt tgtctccagg ggaaagagcc 180 accctctcct gcagggccag tcagagtgtt ggcagcagct acttagcctg gtaccagcag 240 aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc tatggtgcat tcagcagggc cactggcatc 300 ccagacaggt tcagtggcag tgggtctggg acagacttca ctctcaccat cagcagactg 360 gagcctgaag attttgcagt gtattactgt cagcagtatg gtagctcacc gtggacgttc 420 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 480 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 540 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 600 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 660 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaactct acgcctgcga agtcacccat 720 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgc 768 <210> 76 <211> 768 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA1 Hinge+ Ipilimumab heavy chain <400> 76 ccagttccct caactccacc taccccatct ccctcaactc cacctacccc atctccctca 60 tgctgccacg ttaacggcgg cggcggcagc ggtcccctgg gtgtgagagc ggcccagccg 120 gccgaaattg tgttgacgca gtctccaggc accctgtctt tgtctccagg ggaaagagcc 180 accctctcct gcagggccag tcagagtgtt ggcagcagct acttagcctg gtaccagcag 240 aaacctggcc aggctcccag gctcctcatc tatggtgcat tcagcagggc cactggcatc 300 ccagacaggt tcagtggcag tgggtctggg acagacttca ctctcaccat cagcagactg 360 gagcctgaag attttgcagt gtattactgt cagcagtatg gtagctcacc gtggacgttc 420 ggccaaggga ccaaggtgga aatcaaacgg actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 480 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 540 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 600 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 660 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaactct acgcctgcga agtcacccat 720 cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgc 768 <210> 77 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA2 Hinge+ Ipilimumab light chain <400> 77 ccagttcccc cacctccccc atgctgccac gttaacggcg gcggcggcag cggtcccctg 60 ggtgtgagag cggcccagcc ggccgaaatt gtgttgacgc agtctccagg caccctgtct 120 ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc tgcagggcca gtcagagtgt tggcagcagc 180 tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc caggctccca ggctcctcat ctatggtgca 240 ttcagcaggg ccactggcat cccagacagg ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc 300 actctcacca tcagcagact ggagcctgaa gattttgcag tgtattactg tcagcagtat 360 ggtagctcac cgtggacgtt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaacg gactgtggct 420 gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 480 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 540 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 600 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaactc 660 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 720 ggagagtgc 729 <210> 78 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgA2 Hinge+ Ipilimumab heavy chain <400> 78 ccagttcccc cacctccccc atgctgccac gttaacggcg gcggcggcag cggtcccctg 60 ggtgtgagag cggcccagcc ggccgaaatt gtgttgacgc agtctccagg caccctgtct 120 ttgtctccag gggaaagagc caccctctcc tgcagggcca gtcagagtgt tggcagcagc 180 tacttagcct ggtaccagca gaaacctggc caggctccca ggctcctcat ctatggtgca 240 ttcagcaggg ccactggcat cccagacagg ttcagtggca gtgggtctgg gacagacttc 300 actctcacca tcagcagact ggagcctgaa gattttgcag tgtattactg tcagcagtat 360 ggtagctcac cgtggacgtt cggccaaggg accaaggtgg aaatcaaacg gactgtggct 420 gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 480 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat 540 aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag caaggacagc 600 acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa acacaaactc 660 tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg 720 ggagagtgc 729

Claims (24)

  1. 표적 세포 또는 조직의 질환을 치료하기 위한 표적 세포 또는 조직에서 선택적으로 활성화될 수 있는 힌지 항체로서,
    2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함하며 활성화된 상태에서 질환을 치료할 수 있는 작용성 항체; 2개의 억제 도메인; 및 4개의 절단가능한 링커를 포함하며;
    상기 각각의 억제 도메인은 디설피드 결합에 의해 상호연결된 2개의 펩티드 암으로 구성되고; 상기 각각의 절단가능한 링커는 표적 세포 또는 조직에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 효소에 의해 절단가능한 펩티드 기질을 포함하며, 2개의 억제 도메인의 2개의 펩티드 암 중 하나를 작용성 항체의 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄 중 하나의 N-말단에 연결시키는, 힌지 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 작용성 항체가 항-TNF-α 항체, 항-RANKL 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-HER2 항체, 항-EGFR 항체, 항-VEGF 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-IL6R 항체, 항-IL12/23 항체, 항-CD3 항체, 항-CD11a 항체, 항-CD20 항체, 항-CD25 항체, 항-CD30 항체, 항-CD33 항체 및 항-CD52 항체로 구성된 군으로부터 선택된 힌지 항체.
  3. 제 1항에 있어서, 작용성 항체의 경쇄가 SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 가지며, 작용성 항체의 중쇄는 SEQ ID No. 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 및 66의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 갖는 힌지 항체.
  4. 제 1항에 있어서, 2개의 억제 도메인 각각이 면역글로불린 A (IgA), 면역글로불린 D (IgD) 또는 면역글로불린 G (IgG)의 힌지 도메인, 또는 이러한 힌지 도메인의 단편인 힌지 항체.
  5. 제 4항에 있어서, IgA가 IgA1 또는 IgA2인 힌지 항체.
  6. 제 4항에 있어서, IgG가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 힌지 항체.
  7. 제 4항에 있어서, 억제 도메인 각각이 SEQ ID No. 10, 11, 12, 13, 14, 15, 54 또는 55의 아미노산 서열 중 임의의 서열을 포함하는 힌지 항체.
  8. 제 1항에 있어서, 펩티드 기질이 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 카텝신 (CTS), 카스파제 (CASP), 또는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 (ADAM) 중 임의의 효소에 의해 절단가능한 힌지 항체:.
  9. 제 8항에 있어서, 효소가 MMP-2 또는 MMP-9이고, 각 절단가능한 링커는 SEQ ID No. 16의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 항체.
  10. 제 1항에 있어서, 작용성 항체가 항-TNF-α 항체이며, 이의 경쇄는 SEQ ID No. 1의 아미노산 서열을 포함하며, 이의 중쇄는 SEQ ID No. 58의 아미노산 서열을 포함하며;
    절단가능한 링커 각각은 EQ ID No. 16의 아미노산 서열을 포함하며;
    억제 도메인 각각은 SEQ ID No. 10의 아미노산 서열을 포함하는 힌지 항체.
  11. 표적 세포 또는 조직의 질환을 치료하기 위한 표적 세포 또는 조직에서 선택적으로 활성화될 수 있는 힌지 항체를 생산하는 발현 시스템으로서,
    5'에서 3'으로
    힌지 항체의 억제 도메인의 제 1 펩티드 암을 엔코딩하는 제 1 억제 도메인-엔코딩 영역으로서, 억제 도메인이 면역글로불린의 힌지 도메인, 또는 이러한 힌지 도메인의 단편을 포함하는, 제 1 억제 도메인-엔코딩 영역,
    힌지 항체의 절단가능한 링커를 엔코딩하는 제 1 절단가능한 링커-엔코딩 영역으로서, 절단가능한 링커는 표적 세포 또는 조직에서 특이적으로 또는 고도로 발현되는 효소에 의해 절단가능한 펩티드 기질인, 제 1 절단가능한 링커-엔코딩 영역, 및
    힌지 항체의 작용성 항체의 경쇄를 엔코딩하는 경쇄-엔코딩 영역으로서, 작용성 항체는 활성화된 상태에서 질환을 치료할 수 있는, 경쇄-엔코딩 영역을 포함하는 제 1 핵산 서열, 및
    5'에서 3'으로
    힌지 항체의 억제 도메인의 제 2 펩티드 암을 엔코딩하는 제 2 억제 도메인-엔코딩 영역,
    힌지 항체의 절단가능한 링커를 엔코딩하는 제 2 절단가능한 링커-엔코딩 영역, 및
    힌지 항체의 작용성 항체의 중쇄를 엔코딩하는 중쇄-엔코딩 영역을 포함하는 제 2 핵산 서열을 포함하는 발현 시스템.
  12. 제 11항에 있어서, 제 1 핵산 서열과 제 2 핵산 서열을 연결하는 연결 핵산 서열을 추가로 포함하며, 이러한 연결 핵산 서열은 퓨린(Furin)-2A-엔코딩 서열 또는 내부 리보솜 유입점 (IRES) 서열인 발현 시스템.
  13. 제 12항에 있어서, 제 1 핵산 서열, 제 2 핵산 서열 및 연결 핵산 서열을 발현시키기 위해 제 1 핵산 서열 및 제 2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 추가로 포함하는 발현 시스템.
  14. 제 11항에 있어서, 제 1 핵산 서열을 발현시키기 위해 제 1 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제 1 조절 서열; 및
    제 2 핵산 서열을 발현시키기 위해 제 2 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 제 2 조절 서열을 추가로 포함하는 발현 시스템.
  15. 제 14항에 있어서, 제 1 핵산 서열 및 제 1 조절 서열이 제 1 발현 벡터에서 작제된 것이며,
    제 2 핵산 서열 및 제 2 조절 서열은 제 2 발현 벡터에서 작제된 것인 발현 시스템.
  16. 제 14항에 있어서, 제 1 핵산 서열, 제 1 조절 서열, 제 2 핵산 서열, 및 제 2 조절 서열이 단일 발현 벡터에서 작제된 것인 발현 시스템.
  17. 제 11항에 있어서, 작용성 항체가 항-TNF-α 항체, 항-RANKL 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-HER2 항체, 항-EGFR 항체, 항-VEGF 항체, 항-VEGFR2 항체, 항-IL6R 항체, 항-IL12/23 항체, 항-CD3 항체, 항-CD11a 항체, 항-CD20 항체, 항-CD25 항체, 항-CD30 항체, 항-CD33 항체 및 항-CD52 항체로 구성된 군으로부터 선택된 발현 시스템.
  18. 제 11항에 있어서, 면역글로불린이 면역글로불린 A (IgA), 면역글로불린 D (IgD), 또는 면역글로불린 G (IgG)인 발현 시스템.
  19. 제 18항에 있어서, IgA가 IgA1 또는 IgA2인 합성 핵산 분자.
  20. 제 18항에 있어서, IgG가 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4인 합성 핵산 분자.
  21. 제 11항에 있어서, 펩티드 기질이 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP), 카텝신 (CTS), 카스파제 (CASP), 또는 디스인테그린 및 메탈로프로테이나제 (ADAM) 중 임의의 효소에 의해 절단가능한 합성 핵산 분자.
  22. 제 11항에 있어서, 합성 핵산 분자가 SEQ ID No. 17 내지 50 중 임의의 뉴클레오티드 서열을 갖는 합성 핵산 분자.
  23. 치료학적 유효량의 제 1항 내지 제 10항 중의 어느 한 항의 힌지 항체를 대상체에 투여하는 것을 포함하여, 대상체의 암 또는 자가면역 질환을 치료하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 힌지 항체가 피하, 경구, 정맥내, 경막내 또는 근내로 투여되는 방법.
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