TW201520230A - 一種可屏蔽抗體活性的閉鎖器 - Google Patents
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Abstract
本發明揭露一鉸鏈抗體,可選擇性地活化於一目標細胞或組織中,來治療其中之病徵。該鉸鏈抗體包括一功能性抗體、兩個抑制區、及四個可切割之多胜肽鏈連接體。該功能性抗體於活化狀態時可治療該病徵,且包含兩個輕鏈及兩個重鏈。各個抑制區包括一免疫球蛋白之鉸鏈區,且由兩個胜肽臂所組成。各個可切割之多胜肽鏈連接體包括一受質,其受質可被一專一地或高度地表現於目標細胞或組織之酵素切割,且可切割之多胜肽鏈連接體連結該抑制區之其中一個胜肽臂於該功能性抗體之其中一個輕鏈及重鏈之N端。此外,本發明亦揭露一製備及使用該鉸鏈抗體之方法。
Description
本發明係關於一種可用於當作治療法之抗體分子,用以治療各種病況。特別是本發明係關於一鉸鏈抗體,可選擇性地活化於目標細胞或組織中,以治療其中之病況。
抗體治療藥劑包括單株抗體,逐漸在治療各種疾病之主要藥品類型中出現。2012年,在全球前十大銷售量藥品中,有五個即是抗體藥物,包括HUMIRATM、REMICADETM、RITUXANTM、HERCEPTINTM、及AVASTINTM。在2012年,這五種單株抗體藥物在全世界獲得約450億新台幣毛利,佔了全世界單株抗體毛利的60%。未來可望在現有的單株抗體藥物發展出更多被認可的用途,以及新的抗體藥劑進入市場。
雖然此領域持續成長,但仍然存在許多挑戰以發展出更有效及負擔得起的抗體藥劑進入市場。在現有的抗體藥劑中有一個很大的問題是對疾病區域選擇性不足。單株抗體和溶性融合蛋白這兩者係用來結合並中和它們的目標分子(例如抗原及細胞表面受器)。然而,大部分的目標分子對疾病部位並沒有專一性;它們可能會在疾病部位以外的細胞或組織中出現。因此,該治療藥劑可能作用在這些非疾病的正常細胞或組織上。這種脫靶作用可能導致不想要的副作用。於是,便產生了發展高度專一的
抗體治療藥劑的需求。
一種用於避免脫靶作用且用於提升選擇性的可能方案為提供一可在目標部位被活化的前驅抗體。例如於美國專利號8,399,219及美國專利公開號2010/0189651所揭露的可被蛋白酶活化之抗體,其係被胜肽遮罩或遮罩官能基所修飾。在這些文獻中,係使用噬菌體顯示(Phage display)技術來篩選胜肽或官能基,其胜肽或官能基可用來抑制/降低功能性抗體與功能性抗體的目標結合部位之結合。然而,利用此類方法所獲得的遮罩官能基無法普遍地被應用於各種抗體,因為它們是根據它們對於一特定目標的抑制作用來被辨認。因此,在他們的方法中,必須替各個抗體治療藥劑開發一遮罩官能基,而這是費時、昂貴且複雜的。此外,遮罩官能基的引進,在投藥對象身上會有引起不必要的免疫反應的風險。
一種相似的方法敘述於美國專利申請公開號2010/0189727中,其提出一遮蔽配位子,以非共價鍵連結於一抗體之抗原結合位,以使抗體失去活性。尤其是該遮蔽配位子包含兩個複製的抗原之抗原決定位,抗體專一地連接於該抗原決定位,及包含一以可切割之多胜肽鏈連接體連結於各個抗原決定位之複製。類似前述的噬菌體顯示法,該遮蔽配位子亦須針對其對應的各個抗體做特殊設計,因此,此類非活化抗體的發展亦費時且極耗成本。此外,由於該遮蔽配位子對於抗體治療藥劑具有高度親和力,因此可能會有一些遮蔽配位子在切斷可切割之多胜肽鏈連接體之後會附著於該抗體。這些殘餘的遮蔽配位子可能阻礙抗體之治療作用。
鑒於上述,在此領域中需要提供下一代治療法,其需要仔細地設計及製造,使之具有如改善作用部位之選擇性及加強功效之特色。此
外,此類的設計和製造方法應可被應用於各種抗體治療藥劑,且不會產生多餘的免疫反應。
以下敘述介紹本發明之簡單概要,目的在於提供讀者基本的認識。此概要並非為本發明之廣泛的概觀,且並非用於辨別本發明之關鍵/重要元件或描述本發明之範圍。此概要的目的係以簡單的形式呈現文中所揭露之概念,用以作為其後之發明內容的序幕。
在一態樣中,本發明係關於一鉸鏈抗體。該抗體治療藥劑可選擇性地活化於一目標細胞或組織中,來治療其中一文中之病徵。
根據本發明之眾多實施例,該鉸鍊抗體包含一個功能性抗體、兩個抑制區、及四個可切割之多胜肽鏈連接體。該功能性抗體於活性狀態下可用於治療病徵,且該功能性抗體包含兩個輕鏈及兩個重鏈。各個抑制區係由兩個以雙硫鍵相互連接的胜肽臂所組成。各個可切割之多胜肽鏈連接體包含一可被酵素切斷之受質胜肽,該酵素專一地或高度地表現於目標細胞或組織中。各個可切割之多胜肽鏈連接體連結兩個抑制區的兩個胜肽臂之一於該功能性抗體的兩個輕鏈及兩個重鏈之其中一個的N端。
根據本發明之特定實施例,各該兩個抑制區之一係一免疫球蛋白A、免疫球蛋白D、或免疫球蛋白G之鉸鏈區,或係該鉸鏈區的片段。例如,該抑制區可能包含下列序列的任一個:免疫球蛋白G序列SEQ IDNo.10、11、12、及13;免疫球蛋白A之序列SEQ IDNo.14及15;免疫球蛋白D之序列SEQ IDNo.54及55。
在任選的實施例中,該功能性抗體係一抗-TNF-α抗體、抗-RANKL抗體、抗-CTLA-4抗體、抗-HER2抗體、抗-EGFR抗體、抗-VEGF抗體、抗-VEGFR2抗體、抗-IL6R抗體、抗-IL12/23抗體、抗-CD3抗體、抗-CD11a抗體、抗-CD20抗體、抗-CD25抗體、抗-CD30抗體、抗-CD33抗體、或抗-CD52抗體。例如,該功能性抗體之輕鏈的胺基酸序列係SEQ ID Nos.1、2、3、4、5、6、7、8及9之任何一個;而該功能性抗體之重鏈的胺基酸序列係SEQ ID Nos.58、59、60、61、62、63、64、65及66之任何一個。
在特定實施例中,受質胜肽可由下列任何的酵素來切斷:基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMP)、細胞自溶酶(cathepsin,CTS)、半胱天冬酶(caspase,CASP)或是解整合素與金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)。例如,根據一些實施例,該酵素為基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)或基質金屬蛋白酶-9(MMP-9),且各個可切割之多胜肽鏈連接體包含胺基酸序列SEQ ID No.16。
根據本發明的一些實施例,該功能性抗體係一抗-TNF-α抗體,其有一具有胺基酸序列SEQ ID No.1之輕鏈,及一具有胺基酸序列SEQ ID No.58之重鏈,各個可切割之多胜肽鏈連接體包含胺基酸序列SEQ ID No.16;且各個抑制區包含胺基酸序列SEQ ID No.10。
在另一方面,本發明係關於一表現系統,其用以製造本發明根據上述態樣/實施例之鉸鏈抗體。
根據本發明中各種實施例,該用來製造的表現系統包含一第一核酸序列及一第二核酸序列。該第一核酸序列包含(從5’端到3’端)一
第一抑制區編碼區域、一第一可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域、及一輕鏈編碼區域。該第一抑制區編碼區域將上述任一個鉸鏈抗體之抑制區的第一胜肽臂進行編碼。該第一可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域將上述任一個鉸鏈抗體之可切割之多胜肽鏈連接體進行編碼,且該可切割之多胜肽鏈連接體係一可被酵素切割的受質胜肽,該酵素專一地或高度地在目標細胞或組織中表現。該輕鏈編碼區域將上述提及的鉸鏈抗體之功能性抗體的輕鏈進行編碼,而該功能性抗體可於活化狀態時用於治療病徵。該第二核酸序列包含(從5’端到3’端)一第二抑制區編碼區域、一第二可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域、及一重鏈編碼區域。該第二抑制區編碼區域將鉸鏈抗體的抑制區之第二胜肽臂進行編碼。該第二可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域將該鉸鏈抗體之可切割之多胜肽鏈連接體進行編碼。該重鏈編碼區域將該絞鏈抗體之功能性抗體的重鏈進行編碼。
在本發明一些任選的實施例中,該第一及第二核酸序列可以在單一個表現載體中構成。例如,該表現系統可進一步包含一連接核酸序列,用以連接該第一核酸序列及該第二核酸序列。連接核酸序列的非限定例子包括弗林蛋白酶(Furin-2A)多胜肽或內部核醣體進入位置(internal ribosome entry site,IRES)之編碼序列。
在第一及第二核酸序列構成於單一表現載體的情況下時,該表現系統進一步選擇性地包含一調控序列,其可操作地連接至該第一核酸序列及第二核酸序列,其係為了在宿主細胞內調控第一核酸序列、第二核酸序列,或(選擇性)連接核酸序列的轉譯。或者該表現系統可包含至少
兩個分離的調控序列,其可操作地連接至第一及第二核酸序列,可允許個別地調控第一及第二核酸序列的表現。
在一些其他實施例中,該第一及第二核酸序列可構成於兩個分離的表現載體。例如,該第一核酸序列,與可操作連結之第一調控序列一起構成於第一表現載體,而該第二核酸序列,與可操作連結之第二調控序列一起構成於第二表現載體。接著該第一及第二表現載體被送入並表現於同樣的宿主細胞或不同的宿主細胞內。
根據一些本發明之特定實施例,該抑制區為一免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白D或免疫球蛋白G(IgG)之鉸鏈區,或是該鉸鏈區的一個片段。
根據本發明之各種實施例,該表現系統將各種以上提及的鉸鏈抗體進行編碼。例如當該表現系統具體化於單一構建中時,該構件的核酸序列可以是任一個SEQ ID Nos.17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49及50。在該表現系統具體化於一雙載體(或雙質體)系統的情況時,該第一核酸序列可以是SEQ ID Nos.67、69、71、73、75、及77的任一個;而該第二核酸序列可以是SEQ ID Nos.68、70、72、74、76、及78的任一個。
在另一個態樣中,本發明係關於一基因重組載體,適用於製造根據本發明上述提及之鉸鏈抗體。
根據本發明之特定實施例,該基因重組載體包含本發明上述提及之態樣/實施例的合成核酸分子,及一個或多個調控序列,操作地連結
至該合成核酸分子,因此該載體在適當的情況下及在適合的宿主細胞內時,可以表現本發明上述提及之態樣/實施例之鉸鏈抗體。
在另一個態樣中,本發明係關於治療一對象之方法,特別是有癌症或自體免疫疾病之對象。
根據本發明一些實施例,該方法包含投以一本發明上述之態樣/實施例之有療效量的鉸鏈抗體於該對象。例如,該鉸鏈抗體可透過口服、皮下、靜脈注射、鞘內注射或是肌肉注射投予該對象。
許多本發明伴隨的特色和優勢將透過以下詳細敘述及相關的附帶圖示而更好理解。
100‧‧‧鉸鏈抗體
110‧‧‧功能性抗體
112‧‧‧輕鏈
114‧‧‧重鏈
116‧‧‧雙硫鍵
120‧‧‧抑制區
122‧‧‧胜肽臂
124‧‧‧雙硫鍵
130‧‧‧可切割之多胜肽鏈連接體
200‧‧‧鉸鏈抗體之核酸序列(未顯示於圖中)
210‧‧‧第一核酸序列
212‧‧‧第一抑制區編碼區域
214‧‧‧第一可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域
216‧‧‧輕鏈編碼區域
220‧‧‧第二核酸序列
222‧‧‧第二抑制區編碼區域
224‧‧‧第二可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域
226‧‧‧重鏈編碼區域
230‧‧‧連接核酸序列
本發明可從以下詳細敘述而更好理解,按照其相關圖示,其中:圖1為一示意圖,說明根據本發明特定實施例之鉸鏈抗體的結構;圖2為一示意圖,說明本發明特定實施利之鉸鏈抗體的設計圖解;圖3一示意圖,說明本發明特定實施例之鉸鏈抗體編碼核酸分子;圖4為一示意圖,說明本發明一實施例之鉸鏈抗體的整體結構;圖5為本發明的一工作示例之SDS-PAGE膠圖;圖6為本發明的一工作示例之兩個SDS-PAGE膠圖;圖7為一條形圖,說明本發明的一工作示例之各種抗體結合能力;
圖8為一條形圖,說明本發明的一工作示例之TNF-α訊號;圖9為一條形圖,說明本發明的另一個工作示例之各種抗體結合能力;圖10為一條形圖,說明本發明的更另一個工作示例之抗體結合能力;圖11提供數個圖,說明根據本發明的一示例之in vivo鉸鏈-αEGFR抗體在小鼠腫瘤位置的定位及活化;及圖12為一線圖,指示in vivo鉸鏈-TNFα抗體對膠原誘導關節炎小鼠模式之抗發炎效果。
根據一般通常實施,所述之各種特色/構件並非依照比例所繪製,而是用以最佳地描繪關於本發明之特定的特色/構件。同樣地,如圖示中的各種元件符號及命名係用來指出例如元件/構件。
以下的詳細說明及其關聯的附加圖示係意圖用來描述目前示例且不意圖代表目前示例的構成或應用之唯一形式。該說明列舉了示例的功能及示例的構建及操作步驟順序。然而,其相同或相等的功能和順序可透過不同的示例來達成。
為了方便起見,說明書、示例及申請專利範圍中使用的特定的術語彙集於此。除非另有定義,否則所有在此使用的技術上及科學上的術語之意義與所本發明屬技術領域之一般通常知識者所認知的一樣。
除非於此另外定義,否則所有在此使用的技術上及科學上的術語之意義與所本發明屬技術領域之一般通常知識者所認知的一樣。除非
文中另外需要,否則文中的單數形包括相同物件的複數形,且複數形包括其單數形。特別是文中及申請專利範圍所使用的「一」包含複數相關意義,除非文中有另外清楚地定義。同樣的,如文中及申請專利範圍所使用的「至少一個」及「一個或多個」具有相同意義,且包括一個、兩個、三個、或更多。
儘管列舉的本發明之廣闊範圍的數值範圍和參數係相似的,然而於特定示例所列舉的數值仍盡可能準確地記述。然而任何數值固有包含來自個別的測試量測標準差之特定錯誤。同樣的,如文中所使用之術語「約」通常代表給予的數值或範圍介於10%、5%、1%、或0.5%之內。或者該術語「約」代表給予的數值或範圍介於一般通常知識者可接受之樣本平均標準差之內。
該術語「抗體治療藥劑」係意圖代表一抑制內生性人類蛋白(endogenous human proteins)或病原體的藥理作用之治療藥劑。當所謂的「治療藥劑」有具療效的量時,其會於投藥對象上產生所需的治療效果。為了本發明的目的,抗體治療藥劑包含具有專一性之抗體及融合蛋白,用以結合及中和預期目標分子。
於文中所使用之該術語「抗體」包括全長的抗體及任何抗原結合片段或其單鏈。各個抗體的基本功能單元係一由兩個重鏈及兩個輕鏈所組成的Y型免疫球蛋白單體,該重鏈及輕鏈係透過雙硫鍵互相連接。「功能性抗體」函括一全長抗體或一個或多個維持其結合專一性的抗體片段;功能性抗體片段的範例包括Fab(抗原結合片段)、Fv(變異區片段)及F(ab')2、Fab'、scFv(單鏈變異區片段)及其他相似物。抗體可以是單株
抗體或多株抗體且可以是人類的抗體或源自非人類的抗體或是一嵌合蛋白。
在這裡,「可切割之多胜肽鏈連接體」係一可被酵素切割之受質胜肽。在操作上,該可切割之多胜肽鏈連接體被酵素切割之後,可活化當前的鉸鏈抗體。較佳的是該可切割之多胜肽鏈連接體是挑選過的,因此使活化作用可發生在期望的作用點,而此地方可以是在目標細胞或組織內或是靠近目標細胞或組織(例如:癌細胞)。例如,該可切割之多胜肽鏈連接體係一對酵素有專一性的受質胜肽,該酵素可專一地或高度地表現於作用點,如此一來在目標部位的可切割之多胜肽鏈連接體之切割速率會大於其他非目標部位的切割速率。
術語「配位子」表示任何與受體、基質、抗原決定位或其他目標細胞或組織之結合部位專一結合或反應性地關聯或合成的分子。配位子的範例包括抗體及其片段(例如單株抗體或其片段)、酵素(例如纖維蛋白分解酶)、生物反應修飾劑(例如介白素、干擾素、紅血球生成素(erythropeoitin)或群落刺激因子(colony stimulating factor))、肽類激素、及其抗原結合片段。
如文中所使用之術語「核酸」標定為單股或雙股RNA、mRNA及DNA包括cDNA及基因體DNA。除非另外指示,否則特定的核酸序列亦隱含包括其保守性修飾變異性(例如變性密碼子替換(degenerate codon substitution))及互補序列,以及有明確指出的序列。同樣的,除非另有定義,否則單股多核苷酸序列之左手端係為5’端;該雙股多核苷酸的左手端方向指的是5’端。
於本文中所使用的可互換之術語「多胜肽」、「胜肽」及「蛋白」指的是一胺基酸殘碁之單體。這些術語亦可包含該術語「抗體」。該術語「胺基酸」指的是自然產生的或是合成的胺基酸,以及運作方式類似自然產生的胺基酸之胺基酸類似物或模擬物。於文中所使用之多胜肽標記,根據一般通常的使用及慣例,左手方向為胺基N端方向,而右手方向為C端方向。
遍布全文之術語「合成」核酸或胺基酸代表一並非發現於自然界中之核酸或胺基酸序列。合成序列係利用本發明中的各種形式之方法而設計,例如:文獻或電腦可讀取、及自然規律產生的核酸或多胜肽。自然規律產生的核酸或多胜肽發明係為本發明的一部分,無論是直接源自於設計好的序列或是其序列的複製(例如透過PCR、質體複製、化學合成、及其相似的方法而製成)。該術語「合成核酸」可包括例如源自於或從全人造核酸序列核酸序列設計的核酸序列,或是跟自然產生的序列比起來係具有一個或多個核苷酸變異的核酸序列,那些透過隨機或直接突變、化學合成、DNA重新排列(DNA shuffling)方法、DNA重組(DNA reassembly)方法、或透過任何為所屬技術領域者所知的方法而產生的核酸序列。這類的變更可在不改變由核酸序列編碼的胺基酸序列之下而達成,或這類的變更可修飾該胺基酸序列,使得在不改變或加強編碼蛋白之下而留下所需的功能。
如文中所使用之術語「載體」係指物質(例如:嗜菌體、質體、病毒載體、以及人造染色體,諸如細菌或酵母菌人造染色體)的組合物,用來傳送基因物質進入一宿主細胞。載體可由DNA或RNA所組成。該
載體可能透過各種此領域已知的技術被引入一宿主細胞內。該載體的調控序列係一核酸序列,其為一可操作地連結的目標基因產物所需。於本文中所使用之術語「操作地連結」代表該調控核酸與興趣核酸係連結在一起,因此所謂的興趣核酸的表現可以透過所謂的調控核酸來支配,也就是該調控核酸序列將會功能性地結合於所謂的欲表現的核酸序列。因此,該調控核酸序列及該欲表現的核酸序列可能自然規律地與彼此結合,例如透過插入該調控核酸序列於欲表現的核酸序列的5’端。或者該調控核酸序列及欲表現的核酸序列可能僅僅在物理上臨近彼此,因此該調控核酸序列便可以支配至少一個興趣核酸序列的表現。該調控核酸序列及欲表現的核酸序列較佳的是分開的,且不超過500bp、300bp、100bp、80bp、60bp、40bp、20bp、10bp、或5bp。
於本文中所使用之該術語「治療」係指本發明之鉸鏈抗體應用於或投予一具有病況、病徵、疾病或病況的續發性失調或傾向具有該病況之對象,其目的為部分地或完全地減輕、改善、舒緩、延後該特定疾病、失調、及/或病況的發生、抑制該特定疾病、失調、及/或病況發展、減少該特定疾病、失調、及/或病況的嚴重性、及/或減少一個或多個該特定疾病、失調、及/或病況之症狀或病徵的影響。通常來說,「治療」不僅包括改善疾病的症狀或降低疾病的特徵,也包括中斷或放慢病程或延緩在沒有治療的情況下,自然的病徵惡化。有益的或所需的臨床結果包括但不限於減輕一個或多個病徵、減少疾病的範圍、穩定(例如:不惡化)疾病的狀態、延緩或放慢疾病病程、舒緩或緩和疾病狀態、及緩解(無論是部分或全部)可偵測到的或不可偵測到的疾病狀態。
於文中所使用之術語「有效量」係指一成分的量足以產生所需的治療反應。一有效治療量亦可為該成分或組合物的治療有益效果大於其毒性或有害的效果。該特定的有效量或足夠的量隨著特定的治療病況、病患的身體狀況(例如:該病患的身體質量、年齡、或性別)、哺乳類的類型或是被治療的動物類型、治療期間的長短、合併治療的類型(如果有),及使用的特定配方及成分的結構或其衍生物而有不一樣的量。有效量可以例如克、毫克、或微克、或毫克/每公斤體重(mg/kg)來表示。
該術語「對象」係指哺乳類包括人類這類可被鉸鏈抗體及/或本發明之方法所治療的種類。該術語「對象」意圖係指男性及女性,除非特定指出某性別。
本發明係關於鉸鏈抗體選擇性地活化於一目標細胞或組織。用來製備目前的鉸鏈抗體之方法及物質(例如核酸序列及載體)的組合物、包含該鉸鏈抗體的藥學組合物、及使用其之治療方法亦落在本發明之範圍內。
圖1為一示意圖,說明根據本發明特定實施例之鉸鏈抗體100的結構,及圖2為一示意圖,說明該鉸鏈抗體100的設計策略與作用機制。如說明於圖1中,該鉸鏈抗體100包含一功能性抗體110、兩個抑制區120、及四個可切割之多胜肽鏈連接體130,用以連結該抑制區120及及功能性抗體110。參考圖2,在原始、未被切割的型態下,該鉸鏈抗體100對它的目標配位子(L)的結合力實質上為被抑制的(不活化)。一旦投以該鉸鏈抗體100於一對象上且到達該目標部位,一專一地或高度地表現於該目標部位的酵素(E)便會於該可切割部位130來切割該鉸鏈抗體100。被該酵素
切割後的鉸鏈抗體100自該鉸鏈抗體100移除該抑制區120,並產生一對該配位子(L)具有結合親合力的功能性抗體110。因此,該功能性抗體110的療效便可累積在疾病區。
參照回圖1,該功能性抗體110係一全長的抗體或包含一個或多個抗體的功能性片段,在活化態時用以治療一病況。在結構上,該功能性抗體110包含由雙硫鍵連結的兩個輕鏈112及兩個重鏈114。特別的是該兩個重鏈114係由一個或多個雙硫鍵(116)連結於一鉸鏈區。
較佳的是,該功能性抗體110係一治療抗體,用以治療一個或多個病況於一對象。該功能性抗體110可以是全長治療抗體,或是其功能性片段。該功能性抗體110之非限制的範例包括:抗-腫瘤壞死因子-α(anti-TNF-α)抗體(例如:infliximab、adalimumab、ceitolizumab pegol及golimumab)、抗-細胞核因子κb活化因子受體配位子(anti-RANKL)抗體(例如:denosumab)、抗-細胞毒殺性T淋巴球相關抗原-4(anti-CTLA-4)抗體(例如:tremelimumab及ipilimumab)、抗-人類表皮生長因子受體(anti-HER2)抗體(例如:pertuzumab、trastuzumab及trastuzumab emtansine)、抗-表皮生長因子受體(anti-EGFR)抗體(例如:panitumumab、cetuximab、zalutumumab及necitumumab)、抗-血管內皮細胞生長因子(anti-VEGF)抗體(例如:bevacizumab及ranibizumab)、抗-血管內皮細胞生長因子受體-2(anti-VEGFR2)抗體(例如:ramucirumab)、抗-介白素-6受體(anti-IL6R)抗體(例如:Regeneron及Tocilizumab)、抗-介白素-12/23(anti-IL12/23)抗體(例如:ustekinumab及briakinumab)、抗分化群3(anti-CD3)抗體(例如:otelixizumab、teplizumab及muromonab-CD3)、
抗-CD11a抗體(例如:efalizumab)、抗-CD20抗體(例如:obinutuzumab、ofatumumab、tositumomab-i131、ibritumomab tiuxetan及rituximab)、抗-CD25(亦為anti-IL2R)抗體(例如:basiliximab及daclizumab)、抗-CD30抗體(例如:brentuximab vedotin)、抗-CD33抗體(例如:gemtuzumab ozogamicin)、抗-CD52抗體(例如:alemtuzumab)。應當注意的是,此並非為完整的適用於當作於文中所述的功能性抗體100之治療抗體清單;而其他具有上述結構的抗體同樣地可應用於本發明中。
可被一個或多個以上所提及的治療抗體來治療的疾病或病況包括但不限於:惡性色素瘤(例如透過ipilimumab)、骨質疏鬆(例如透過denosumab)、乳癌(例如透過trastuzumab、trastuzumab emtansine、pertuzumab或ramucirumab)、慢性淋巴球性白血病(例如透過obinutuzumab或ofatumumab)、大腸直腸癌(例如透過panitumumab、cetuximab或bevacizumab)、克隆氏症(例如透過infliximab或certolizumab pegol)、胃或胃食道交接處腺癌(例如透過ramucirumab)、頭頸癌(例如透過zalutumumab)、肝細胞癌(例如透過ramucirumab)、何杰金氏淋巴瘤(例如透過:brentuximab vedotin)、黃斑部病變(例如透過ranibizumab)、轉移性黑色素瘤(例如透過tremelimumab)、骨髓性白血病(例如透過gemtuzumab ozogamicin或alemtuzumab)、非何杰金氏淋巴瘤(例如透過ositumomab-i131、ibritumomab tiuxetan或rituximab)、非小細胞肺癌(例如透過necitumumab)、乾癬(例如透過efalizumab)、斑塊性乾癬(例如透過ustekinumab或briakinumab)、逆轉或預防腎臟移植排斥(例如透過muromonab-cd3、basiliximab或daclizumab)、風濕性關節炎(例如透過
tocilizumab、golimumab或adalimumab)及第一型糖尿病(例如透過otelixizumab或teplizumab)。
在特定實施例中,該功能性抗體110係一抗-TNF-α抗體,具有胺基酸序列SEQ ID No.1(也就是infliximab輕鏈)及胺基酸序列SEQ ID No.58(也就是infliximab重鏈);一抗-EGFR抗體,具有胺基酸序列SEQ ID No.2(也就是panitumumab輕鏈)及胺基酸序列SEQ ID No.59(也就是panitumumab重鏈);一抗-HER2抗體,具有胺基酸序列SEQ ID No.3(也就是trastuzumab輕鏈)及胺基酸序列SEQ ID No.60(也就是trastuzumab重鏈);一抗-TNF-α抗體,具有胺基酸序列SEQ ID No.4(也就是adalimumab輕鏈)及胺基酸序列SEQ ID No.61(也就是adalimumab重鏈);一抗-RANKL抗體,具有胺基酸序列SEQ ID No.5(也就是denosumab輕鏈)及胺基酸序列SEQ ID No.62(也就是denosumab重鏈);一抗-CTLA-4抗體,具有胺基酸序列SEQ ID No.6(也就是ipilimumab輕鏈)及胺基酸序列SEQ ID No.63(也就是ipilimumab重鏈);一抗-CTLA-4抗體,具有胺基酸序列SEQ ID No.7(也就是tremelimumab(a.k.a.,ticilimumab)輕鏈)及胺基酸序列SEQ ID No.64(也就是tremelimumab重鏈);一抗-CD11a抗體,具有胺基酸序列SEQ ID No.8(也就是efalizumab輕鏈)及胺基酸序列SEQ ID No.65(也就是efalizumab重鏈);或一抗-IL12/23抗體,具有胺基酸序列SEQ ID No.9(也就是ustekinumab輕鏈)及胺基酸序列SEQ ID No.66(也就是ustekinumab重鏈)。
如說明於圖1中,各個抑制區120由兩個胜肽臂122所組成。在說明的示例中,該兩個胜肽臂122透過雙硫鍵124而交互連結;然而本發
明並非對其作出限制。根據本發明之特定實施例,該抑制區120係(或者包含一部分之)一免疫球蛋白之鉸鏈區;諸如免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白D(IgD)或是免疫球蛋白G(IgG)。根據本發明各種實施例,該IgA係IgA1(SEQ ID No.14)或IgA2(SEQ ID No.15),該IgG係IgG1(SEQ ID No.10)、IgG2(SEQ ID No.11)、IgG3(SEQ ID No.11)或IgG4(SEQ ID No.13);而IgD係IgD1(SEQ ID No.54)或IgD2(SEQ ID No.55)。
該抑制區120之鉸鏈結構在附著於該功能性抗體110後,會在空間上地遮蔽該功能性抗體110之配位子結合部位。因此,該鉸鏈抗體100在非切割狀態時,幾乎不與預期的配位子相互作用。根據文中所提供的工作示例,在非切割狀態時,該功能性抗體110對它的配位子的結合能力會降低至至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、及甚至100%。
根據本發明各種實施例,當該功能性抗體110耦合至該抑制區120且其預期的配位子存在時,該功能性抗體110便不會(或實質上不會)結合至它的配位子,或該功能性抗體110與其配位子之結合比起該功能性抗體110沒有耦合至該抑制區120時不會超過0.001%、0.02%、0.1%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、或30%。
另一個現有抑制區120的優點在於它的多方面的適用性。可預期的是,該抑制區120並非根據它對功能性抗體110及/或對預期配位子的
專一互動來設計的,也因此該抑制力並非取決於該功能性抗體110。同樣的,大多的治療抗體共享常見且相似骨幹,促進其抑制區120的附著。
除了理想的抑制力及多方面的適用性以外,現有的抑制區120之優勢在於它是源自免疫球蛋白的鉸鏈區。因此,不像前案的外源性的遮蔽配位子一樣,本發明的抑制區120並不會在治療對象體內引起不必要的免疫反應。
該抑制區120係透過該可切割之多胜肽鏈連接體130附著於該功能性抗體。特別的是各個四個可切割之多胜肽鏈連接體130分別連接該抑制區120的兩個胜肽臂122之一至該功能性抗體110的兩個輕鏈112及兩個重鏈114之一的N端。該可切割之多胜肽鏈連接體130包含一可由酵素切割的受質胜肽,其可專一地或高度地表現於目標細胞或組織內(諸如治療對象的病灶部位)如此一來該鉸鏈抗體100便可活化於目標細胞或組織。
如上述,該抑制區120對該功能性抗體110的附著會導致該功能性抗體110對其興趣配位子的結合被抑制。然而一旦酵素消化了可切割之多胜肽鏈連接體130,該抑制區120便會從鉸鏈抗體100分離,因而恢復該功能性抗體110的結合能力。
在特定實施例中,該受質胜肽可透過以下任何的酵素來切割:基質金屬蛋白酶(例如:MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-13及MMP-14)、細胞自溶酶(例如:CTS A、CTS B、CTS D、CTS E及CTS K)、半胱天冬酶(例如:CASP-1、CASP-2、CASP-3、CASP-4、CASP-5、CASP-6、CASP-7、CASP-9、CASP-10、CASP-11、CASP-12、CASP-13及CASP-14)或解整合素與金屬蛋白酶(例如:
ADAM-10、ADAM-12、ADAM-17、ADAM-TS、及ADAM-TS5)。
基質金屬蛋白酶是一組鋅依賴性內切胜肽酶的家族,用來降解基質蛋白。MMPs包括膠原蛋白酶(collagenase)、明膠蛋白酶(gelatinase)、基質、釉質溶解酶(enamelysins)、金屬彈性蛋白酶(metalloelastases)、基質裂解酶(stromelysins)及其他結構性蛋白及受體溶素。MMPs參與了正常生理作用的胞外基質裂解,諸如胚胎發育和複製、以及病程,諸如關節炎及癌細胞轉移。
例如,MMP-2(也被稱為明膠蛋白酶A或72kDa第四型膠原蛋白酶)及MMP-9(也被稱為明膠蛋白酶B或92kDa第四型膠原蛋白酶)兩個都在發炎反應中扮演一個角色。於此,這些蛋白比起治療對象的其他細胞/組織來說,在治療對象的發炎部位有高度表現。同樣的,MMP-2及MMP-9的表現增加與腫瘤進程(包括入侵、轉移、生長、及血管新生)有正相關。因此,這些蛋白的受質胜肽適合用於當作可切割之多胜肽鏈連接體130,如此一來該鉸鏈抗體100便可活化於發炎部位或癌變部位。更進一步來說,因MMP-2/MMP-9在非病灶部位的細胞/組織之表現量相對地低,比起在病灶部位來說,本發明的鉸鏈抗體100在這些非病灶部位的細胞/組織的活化程度便很稀少。因此本發明的鉸鏈抗體100具有改善的選擇性,可操作來治療疾病。
根據一些實施例,各個可切割之多胜肽鏈連接體130包含胺基酸序列Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg(GPLGVR;SEQ ID No.16),其為MMP-2或MMP-9的受質胜肽。非限制的MMP-2或MMP-9受質胜肽的例子包括:Pro-Leu-Gly-Met-Trp-Ser-Arg(PLGMWSR;SEQ ID No.51)、
Pro-Leu-Gly-Leu-Trp-Ala-(d)-Arg(PLGLWA-(d)-R;SEQ ID No.52)、及Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln-(d)-Arg(PQGIAGQ-(d)-R;SEQ ID No.53)。
透過可活化的,這代表該鉸鏈抗體100在非切割狀態或是非活化狀態時,對有興趣的配位子表現一第一結合親和力,且在切割狀態或是活化狀態時對有興趣的配位子表現一第二結合親和力,其中該第二結合親和力大於該第一結合親和力。例如,活化的功能性抗體110對它的興趣配位子的結合親和力可大於非切割狀態之鉸鏈抗體100對於同樣的配位子之結合親和力至少2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或甚至是1,000倍。
由於該可切割之多胜肽鏈連接體130係根據其對一在目標部位高度表現之酵素的專一性來選擇,應當理解的是鉸鏈抗體100的活化主要都在目標部位發生。作用點的高選擇性與非切割狀態的顯著抑制力實質上避免了功能性抗體110的脫靶作用。
本發明進一步的優勢在於脫離的抑制區120並不會干擾活化的功能性抗體110及其興趣配位子的結合。於此,一旦該鉸鏈抗體100透過切割該可切割之多胜肽鏈連接體130而活化,該功能性抗體110的結合親和力實質上便恢復了。例如,在該鉸鏈抗體100與於目標部位高度表現的酵素(例如:MMP-2)接觸一特定時間後,比起該功能性抗體110不耦合至該抑制區120來說,活化的功能性抗體110與其目標配位子之間有至少70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、
94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的結合。
在本發明特定實施例中,該功能性抗體110係一抗-TNF-α抗體,且包含胺基酸序列SEQ ID No.1,各個可切割之多胜肽鏈連接體130包含胺基酸序列SEQ ID No.14;且各個該抑制區120包含胺基酸序列SEQ ID No.8。
根據本發明的實施例,該鉸鏈抗體可以是合成產生的或可以是重組地表現及純化。
例如,該鉸鏈抗體可以透過一般通常使用的方法,諸如t-BOC或FMOC保護alpha氨基來合成。這兩種方法皆需要逐步的合成,藉此,一個單一的胺基酸會在每個步驟加在胜肽的C端上。本發明的鉸鏈抗體亦可透過熟知的固相肽合成法(solid phase peptide synthesis)來合成。
對於鉸鏈抗體重組生產,載體的構造或是用來運送與表現鉸鏈抗體編碼的核酸分子。各種可在原核或真核細胞內表現的載體構造在所屬技術領域裡為已知的。表現載體的構建通常是經過挑選的,這是為了能與讓表現載體作用的宿主細胞相容。在特定實施例,該載體會編碼功能性抗體的輕鏈及重鏈、抑制區、及可切割之多胜肽鏈連接體。
圖3是一根據本發明之核酸分子200示例圖示。在適合的情況下,該核酸分子200會被轉譯,且該表現的多核苷酸接著被修飾及/或被組合成目前的鉸鏈抗體,例如如上述的鉸鏈抗體100。圖3為一示意圖,說明一核酸分子編碼一根據本發明特定實施例之鉸鏈抗體,例如如上述的鉸鏈抗體100。
在特定的實施例,該合成的核酸分子200包含一第一核酸序
列210、一第二核酸序列220、及一連結核酸序列230。該第一核酸序列210從5’端到3’端包含一第一抑制區編碼區域212、一第一可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域214、及一輕鏈編碼區域216。該第一抑制區編碼區域212編碼一本發明的鉸鏈抗體之抑制區(諸如說明於圖1的抑制區120)的第一胜肽臂(諸如說明於圖一的一個胜肽臂122)。在特定實施例中,該抑制區可以是IgA、IgD、或是IgG的鉸鏈區,或是該鉸鏈區的片段。該第一可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域214編碼一受質胜肽,該受質胜肽可被在目標細胞或組織專一地或高度地表現的酵素來切割。該輕鏈編碼區域216編碼一功能性抗體的輕鏈(例如說明於圖1的輕鏈102),該功能性抗體在活化態時可以治療病況。該第二核酸序列220從5’端到3’端包含一第二抑制區編碼區域222、一第二可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域224、及一重鏈編碼區域226。該第二抑制區編碼區域222編碼一該抑制區(例如說明於圖1的抑制區120)的第二胜肽臂(諸如圖1的另一個胜肽臂122)。該第二可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域224編碼該同樣的受質胜肽(例如說明於圖1的可切割之多胜肽鏈連接體)。該重鏈編碼區域226編碼該功能性抗體的重鏈(諸如重鏈104)。
該連接核酸序列230係用來連接該第一核酸序列210及該第二核酸序列220,以形成該單一核酸序列200。
在任選的實施例中,該第一核酸序列210及該第二核酸序列220結合於一單一開放讀序框(opening reading frame),且隨著該轉譯產物分泌出來,該轉譯產物便被修飾來產生重組的鉸鏈抗體。例如,如說明於圖3,一Furin-2A編碼序列230提供於該第一及第二核酸序列210及220之
間。或者,一IRES序列(未顯示於圖上)可以用來連接該第一核酸序列210及該第二核酸序列220,因此這兩個核酸序列便會分開地轉錄成兩個多肽。
根據本發明各種實施例,該合成的核酸分子200包含任一個上述提到的鉸鏈抗體及其相等之核苷酸序列。例如,該合成的核酸分子可具有核苷酸序列SEQ ID Nos.17至50之任一個。根據本發明的其他實施例,該第一及第二核酸序列建構於兩個分開的載體,該第一核酸序列為SEQ ID Nos.67、69、71、73、75、及77之任一個,而該第二核酸序列為SEQ ID Nos.68、70、72、74、76、及78之任一個。
同樣的,SEQ ID No.56為一可以編碼IgD1鉸鏈區(具有SEQ ID No.54)的核酸分子示例序列;而SEQ ID No.57為一可以編碼IgD2鉸鏈區(具有SEQ ID No.55)的核酸分子示例序列。
用來表現上述合成核酸分子220的載體通常透過連結該合成核酸分子200與一個或多個調控序列而構成,如此一來該合成核酸分子200的轉錄及/或轉譯便會在調控序列的操控之下。調控序列的非限制性範例包括啟動子、強化子、終止子、操控子、抑制子,及誘導子。
表現載體構建如果需要或想要的話,通常也提供一可誘導或構成的轉錄及轉譯的起始區域,而該編碼區在該轉錄起始區域及轉錄和轉譯終止區域的轉錄控制之下係可操作地連結的。這些控制區可能是物種(從該物種獲得核酸)天生的,或是可能源自外源性來源。表現載體結構亦可以包括一可選擇的標記,運行於宿主內來促進例如包含興趣構建的宿主細胞之生長。此類的可選擇之標記基因可為真核細胞培養轉換的宿主細胞之選擇提供一表型特徵,諸如dihydrofolate還原酵素或新黴素抗藥性。
如同可理解的,當該第一核酸序列210及該第二核酸序列220建構於一單一開放讀序框時,該表現載體可能包含一個調控序列,可操作地連接至該第一核酸序列及該第二核酸序列。另一方面,當該第一核酸序列210及該第二核酸序列220排於不同的讀序框時,該表現載體可能具有至少兩個調控序列,分別地可操作地連結至第一核酸序列及第二核酸序列。
在其他實施例,第一核酸序列及第二核酸序列並不是建構於一單一載體,而是提供於兩個分開的載體,各自具有自己的轉錄及轉譯起始區域、可選擇的標記、及/或調控序列。
本發明的鉸鏈抗體有益於治療疾病或醫療病況,這些疾病或病況可透過該鉸鏈抗體的功能性抗體來治療。透過抗體基礎治療法可治療的疾病或醫療病況大多為癌症或自體免疫疾病。
為了治療具有此類疾病的對象,本發明的鉸鏈抗體或包含本發明鉸鏈抗體的醫藥組合物以一治療有效劑量投於對象。於此,該醫藥組合物及治療方法亦落於本發明的範圍之內。
除了鉸鏈抗體,所謂的醫藥組合物進一步包含一醫藥上可接受之載體(carrier)。於本文中所使用之「醫藥上可接受之載體」代表一醫藥上可接受的材料、組合物、或媒介,諸如抑體或固體填料、稀釋劑、賦形劑、溶劑、或膠囊填充材料,用於從一器官或身體的一部分運送或運輸活性劑(例如鉸鏈抗體)至另一個器官或身體的一部分。此載體(carrier)在基於可與其他配方的成分兼容的面向上,必須是「可接受的」,且是選來將任何有效劑的降解降至最低,及將任何對投藥對象有害的副作用降至最低。該醫藥組合物可進一部包含一個或多個醫藥上可接受之添加物,包
括黏合劑、矯味劑、緩衝劑(buffering agents)、增稠劑、呈色劑、抗氧化劑、稀釋劑、固定劑、緩衝劑(buffers)、乳化劑、分散劑、懸浮劑、防腐劑,及其類似物。
用在結合目前的鉸鏈抗體胜肽的醫藥上可接受之載體的選擇基本上是取決於組合物投藥的方法。本發明的醫藥組合物可透過皮下注射、靜脈注射、鞘內注射,或肌肉注射來投藥。
用來投藥的注射劑可製備於滅菌的水溶液或非水溶液、懸浮劑,及乳化劑。非水溶劑的例子包括但不限於丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)及可注射的有機酯(如油酸乙酯)。水溶液載體(carrier)的說明性例子包括水、乙醇/水的溶液、乳化劑、或懸浮劑,包括生理食鹽水及緩衝介質。常見的非口服投藥媒介包括氯化鈉溶液(sodium chloride solution)、林格式葡萄糖、葡萄糖及氯化鈉、乳酸林格氏液、或非揮發性油;而皮下注射媒介通常包括液體及營養成分補充物、電解質補充物(諸如那些根據林格氏葡萄糖的電解質補充物),及其類似物。
如同可理解的,由於目前的鉸鏈抗體在病灶部位為切割狀態及活化狀態,而在身體其他區域則維持為非切割狀態及非活化狀態,因此本發明的治療方法的益處則是可降低或甚至消除起因於脫靶作用的全身性中和作用而造成副作用。且本發明的治療方法改善了現有的治療抗體之功效。
以下的範例用來對實行本發明之所屬技術領域之人提供本發明特定態樣的說明。這些範例在各方面並不限制本發明之範圍。在不用進一步的詳述之下,所屬技術領域之人根據本文中之敘述,可以最大程度
來利用本發明。所有於本文中所引述之公開發表刊物皆全文併入本文作參考。
範例1
材料及方法
1.1細胞株及細胞培養
表現SV40T抗原之人類胚胎腎細胞株(293T)、人類乳癌細胞株(SKBr3)、人類大腸直腸癌細胞株(SW480)、及Huh 7購買於美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)。這些細胞培養於Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM;Sigma-Aldrich),以10% Cosmic calf serum(CCS;Sigma-Aldrich)、1%(10,000μ/ml)penicillin,and 1%(10,000μ/ml)streptomycin(Invitrogen)補充於37℃、5% CO2。Phoenix amphitropic包裝細胞培養於DMEM//Nutrient F-12 Ham(DMEM/F12)培養基中,以10%的胎牛血清蛋白(FBS;Sigma-Aldrich)、1%(10,000μ/ml)盤尼西林、及1%(10,000μ/ml)鏈黴素補充於37℃、5% CO2。為了繼代培養,293T細胞及Phoenix細胞以一倍的Versene(EDTA)溶液處理3至5分鐘,而SKBr3,SW480及Huh7細胞則以胰蛋白酶處理3至5分鐘。細胞接著依所實驗所需而繼代培養於不同的濃度之中。
1.2 生化試劑
TransIT®-LT1轉染試劑係購於Mirus Bio LLC.。Opti-MEM及EDTA係購於Invitrogen。牛血清白蛋白(BSA)及第四型MMP-2(Gelatinase A)係購於Sigma-Aldrich。HRP-Goat-α人類-IgG Fcγ抗體及FITC-Goat-α人類-IgGAM Fcγ係購於Jackson。
1.3 質體構建
為了建構用來編碼抗-TNF-α抗體(infliximab)的核酸構建,一Furin-2A胜肽編碼核酸構造便用來連結該輕鏈編碼序列及中鏈編碼序列於一單一質體。接著執行聚合酶連鎖反應(PCR)來引入NheI、HindIII及SfiI於輕鏈的N端、XhoI於輕鏈的C端、BglII於重鏈的N端、及ClaI和AscI於中鏈的C端。接著,IgG1鉸鏈編碼序列及MMP2基質編碼序列被引至該輕鏈其重鏈編碼序列的上游,來產生一核酸構建(SEQ ID No.43)編碼IgG1鉸鏈/MMP2/infliximab。同樣的步驟被應用於核酸構建的建構,以編碼其他抗體或鉸鏈/MMP2/抗體,諸如IgG1鉸鏈/MMP2/ipilimumab(SEQ ID No.17)、IgG2鉸鏈/MMP2/ipilimumab(SEQ ID No.18)、IgG3鉸鏈/MMP2/ipilimumab(SEQ ID No.19)、IgG4鉸鏈/MMP2/ipilimumab(SEQ ID No.20)、IgA1鉸鏈/MMP2/ipilimumab(SEQ ID No.21)、IgA2鉸鏈/MMP2/ipilimumab(SEQ ID No.22)、IgG1鉸鏈/MMP2/tremelimumab(SEQ ID No.23)、IgG2鉸鏈/MMP2/tremelimumab(SEQ ID No.24)、IgG3鉸鏈/MMP2/tremelimumab(SEQ ID No.25)、IgG4鉸鏈/MMP2/tremelimumab(SEQ ID No.26)、IgA1鉸鏈/MMP2/tremelimumab(SEQ ID No.27)、IgA2鉸鏈/MMP2/tremelimumab(SEQ ID No.28)、IgG1鉸鏈/MMP2/adalimumab(SEQ ID No.29)、IgG2鉸鏈/MMP2/adalimumab(SEQ ID No.30)、IgG3鉸鏈/MMP2/adalimumab(SEQ ID No.31)、IgG4鉸鏈/MMP2/adalimumab(SEQ ID No.32)、IgA1鉸鏈/MMP2/adalimumab(SEQ ID No.33)、IgA2鉸鏈/MMP2/adalimumab(SEQ ID No.34)、IgG1鉸鏈/MMP2/panitumumab(SEQ ID No.35)、IgG1鉸鏈/MMP2/denosumab(SEQ ID No.36)、IgG2
鉸鏈/MMP2/denosumab(SEQ ID No.37)、IgG3鉸鏈/MMP2/denosumab(SEQ ID No.38)、IgG4鉸鏈/MMP2/denosumab(SEQ ID No.39)、IgA1鉸鏈/MMP2/denosumab(SEQ ID No.40)、IgA2鉸鏈/MMP2/denosumab(SEQ ID No.41)、IgG1鉸鏈/MMP2/efalizumab(SEQ ID No.42)、IgG2鉸鏈/MMP2/infliximab(SEQ ID No.44)、IgG3鉸鏈/MMP2/infliximab(SEQ ID No.45)、IgG4鉸鏈/MMP2/infliximab(SEQ ID No.46)、IgA1鉸鏈/MMP2/infliximab(SEQ ID No.47)、IgA2鉸鏈/MMP2/infliximab(SEQ ID No.48)、IgG1鉸鏈/MMP2/ustekinumab(SEQ ID No.49)、及IgG1鉸鏈/MMP2/trastuzumab(SEQ ID No.50)。
用來編碼infliximab及鉸鏈/MMP2/infliximab的構建接著分別被引入pLKO AS3w.puro質體,其質體包含延伸的病毒包裝訊號(ψ+)、嘌呤黴素抗藥基因(Puror)、及安比西林抗藥基因來產生表現載體(infliximab-pLKO質體及鉸鏈/MMP2/infliximab-pLKO質體)。用來表現其他和酸構建的質體可透過相同的步驟來製備。
1.4慢病毒轉染
Phoenix細胞以Versene處理,且分離的細胞(1.5x106cells/well)種於CellBind六孔盤。在37℃的培養箱培養24小時之後,移除原本的細胞培養液並添加一半容量的10%FBS培養液之DMEM。
1.25μg的鉸鏈/MMP2/infliximab-pLKO質體(在125μL Opti-MEM加上1.125μg pCMV-△R8.91質體及0.125μg pMD.G質體)慢慢地加入反應溶液(其包含7.5μL TransIT®試劑於125μL Opti-MEM)。該混合物放置30分鐘,然後慢慢地加到6孔盤裡,接著在加入一半容量的新鮮培
養基(DMEM/F12+10%FBS+1% BSA+1x p/s)之前,於37℃培養箱裡搖晃16小時。在接下來的三天裡,每24小時收取一次2ml的上清液並且加入2ml新鮮的培養基。收集起來的上清液以1250rmp離心5分鐘,接著將上清液儲存於4℃冰箱。
至於濃縮病毒液,冷藏的上清液在室溫下回溫,然後過濾進蛋白離心過濾管內,接著以3500rmp在4℃離心,直到體積降至1.5ml。該濃縮物接著被分裝且儲存於-80℃直到要使用為止。
為了轉染293T細胞,293T細胞種於6孔盤,一格4x104個細胞。隔天,細胞生長密度達10-20%便進行轉染。原本的培養基先被移除,然後沿著孔加入感染培養基(1ml的生長培養基(DMEM+10% CCS+1% P/S)+150μl病毒液+8μg/ml凝聚胺試劑(polybrene))。搖晃24小時之後,該培養基接著被移除,然後加入新的生長培養基,並使用抗生素嘌呤黴素(puromycene)(3-5mg/ml)來篩選293T細胞。生長培養基每兩天就利用嘌呤黴素(puromycene)篩選更新一次,並持續兩個禮拜。接著收取細胞,並以西方墨點法(western blotting)偵測細胞是否穩定地表現鉸鏈/MMP2/infliximab。穩定地表現infliximab的293T細胞可透過同樣的步驟來製備。
1.5 抗體純化
轉染的293T細胞種於培養盤(15cm)然後以10% CCS及1% penicillin-streptomycin的DMEM培養,直到細胞生長密度達80-90%。原本的培養基被移除,然後培養盤以10ml的PBS清洗來移除血清。該細胞接著培養於15ml的無血清DMEM培養基兩天,接著收取上清液,並在4℃下以
3500rpm離心10分鐘。接著收取上清液並儲存在-80℃直到要使用。
至於純化,135ml的冷凍上清液於37℃水浴槽內回溫。該上清液接著在一蛋白濃縮過濾離心管做30倍濃縮。該抗體將利用ProteinA sepharose純化系統來被純化,而與Protein A結合的抗體會被0.1M(pH 3.0)的甘胺酸洗滌緩衝液(glycine elute buffer)洗滌出來。洗出液的pH值可利用1M的Tris-base(pH 8.0)及6N的HCL調整至7.4。該樣品接著被收集至一透析膜(Regenerated cellulose tubular membrane T4,MWCO:12000-14000,CelluSep)且以1倍的PBS(pH 7.4)被透析兩次,持續1至2小時。該產物接著透過10% SDS-PAGE分離,然後用Comassie Brilliant Blue染色10分鐘來進行確認。
1.6 MMP2基質切割
鉸鏈/MMP2/infliximab(5μg於36μl的PBS裡)與MMP2(0.8μg於4μl的DMEM裡,最終濃度為20μg/ml)在冰上反應0、1、5、10、30、或60分鐘。抗-TNF-α抗體(infliximab)用來當作控制組。接著將該反應混合物加到一還原染劑裡,並使之在100℃沸騰10分鐘來終止MMP2的活性。MMP2的基質切割透過10% SDS-PAGE及西方墨點法來確認。
至於西方墨點法檢測,將收集的細胞及上清液以6:1(v/v)的比例加入還原染劑,並使之在100℃沸騰10分鐘。接著,蛋白被10% SDS-PAGE分離,並轉移至硝化纖維紙(nitrocellulose paper)上,然後以5%牛奶在4℃下阻斷(block)過夜。用HRP-Goat抗-人類IgG Fcγ(HRP-Goat anti-human IgG Fcγ)抗體(0.4μg/ml於5%脫脂牛奶)來鑑定該抗體。
1.7 酵素免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent
assay,ELISA)
鉸鏈/MMP2/抗體的活性透過抗原基礎(antigen-based)ELISA或細胞基礎(cell-based)ELIA來測定。
(A)Plate coating
為了測定鉸鏈/MMP2/infliximab或鉸鏈/MMP2/adalimumab的活性,TNF-α(0.3μg/ml)被稀釋於塗覆液(100mM Na2CO3,ph 8.0)且在37℃培養兩小時並吸附上ELISA(Nunc-Maxisorp)。至於鉸鏈/MMP2/denosumab,96孔盤在37℃下以塗覆液(100mM Na2CO3,pH 8.0)被塗覆上50μl/well的RANKL(0.3μg/ml)持續2小時。為了測定鉸鏈/MMP2/Ipilimumab或/MMP2/tremelimumab的活性,96孔盤在37℃下以塗覆液(100mM Na2CO3,pH 8.0)被塗覆上50μl/well的CTLA4(0.3μg/ml)持續2小時。
關於blocking,將200μl of 5%的脫脂牛奶加進96孔盤的各個盤孔,然後儲存於4℃冰箱一整夜。
鉸鏈/MMP2/抗-EGFR之抗體及鉸鏈/MMP2/抗HER2之抗體的活性透過細胞基礎ELISA來測定。簡而言之,將EGFR-positive SW480細胞或HER2-positive SKBr3細胞透過200μl的生長培養基(DMEM+10% CCS+1% P/S)以每格105顆細胞種入96孔盤,並且培養於37℃一整夜。
(B)MMP2處理
取20μL的MMP2酵素(200μg/ml於無血清DMEM之中)在冰上與180μL的轉染293T細胞上清液反應0、1、10、30、60或90分鐘,然後加入20μL的CCS來終止反應。
(C)抗體活性
隔天,在移除96孔盤裡原本的培養液之後,以0.05% PBST(200μl/孔)洗滌孔盤一次,及PBS(200μl/孔)一次(或是如果是細胞基礎的ELIA的話,則以DMEM(200μl/孔)洗滌一次),然後移除盤孔裡的液體。以MMP2處理的鉸鏈/MMP2/抗體(50μl/孔)接著加入盤孔裡兩倍(或三倍,如果是細胞基礎的ELIA),然後在室溫下反應2小時。反應後,移除上清液,接著以0.05% PBST(200μl/孔)洗滌兩次,及PBS(200μl/孔)洗滌一次(或是如果是細胞基礎的ELIA,則以DMEM(200μl/孔)洗滌兩次)以移除游離的抗體。接著在PBS(或如果是細胞基礎CLIA,則為DMEM+2% CCS)的2%脫脂牛奶裡的1μg/ml的HRP-goat抗-人類IgG Fcγ抗體以每格50μl被分配到96孔盤裡,並在室溫下反應1小時。在從盤孔吸量HRP-goat抗-人類IgG Fcγ抗體之後,以0.05% PBST(200μl/孔)(或是如果是細胞基礎的ELIA的話,則以DMEM)洗滌孔盤兩次,及PBS(200μl/孔)洗滌一次。
以MMP2處理的鉸鏈/MMP2/抗體之活性透過一基質2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)的氧化作用來測定。包含ABTS及30%的H2O2(ABTS:H2O2=3000:1)的反應混合物以150μl/孔被加入到孔盤裡。伴隨著ABTS的氧化作用可以得到405nm的吸收光。酵素活性根據吸光強度來評估。其他抗體的活性可根據同樣的步驟來測定。
1.8 以hinge/MMP2/infliximab中和TNF-α之訊號
Huh 7細胞以胰蛋白酶(Trypsin,0.05%)處理,且分離的
細胞(7x104細胞/孔)被種於CellBind的24孔盤。在37℃培養箱培養24小時之後,移除原本的細胞培養液,並加入10% FBS培養液的DMEM。
將0.5μg的NF-kB-Luc報告基因質體加入一反應溶液,該反應溶液含有1.5μL TransIT®-LT1 Transfection Reagent於30μL的無血清DMEM。將該混合物緩慢地加入24孔盤,並在37℃培養箱裡搖晃24小時。
在轉染經過24小時之後,以任一方式處理細胞:(1)培養基(作為負調控);(2)20ng TNF-α(作為正調控);(3)20ng TNF-α及100mg/ml infliximab;(4)20ng TNF-α、100mg/ml infliximab、及20mg/ml MMP2;(5)20ng TNF-α及100mg/ml IgG1鉸鏈/MMP2/infliximab;及(6)20ng TNF-α、100mg/ml IgG1鉸鏈/MMP2/infliximab、及20mg/ml MMP2。在細胞處理後24小時,將Steady-Glo及PBS加入96盤孔,並利用螢光素酶讀取器偵測螢光素酶活性。
1.9 動物實驗
所有於本發明中所使用之工作示例動物住在溫度控制(24-25℃)的動物房,且光暗循環為12:12。標準實驗室的食物和自來水皆無限制地供應。該實驗步驟係為高雄醫學大學審查委員會(高雄市,台灣,ROC)所認可,且係依據國家動物福利規範。
範例2
Hinge/MMP2/infliximab之純化
Hinge/MMP2/infliximab的3D結構係經由電腦模擬來產生。參考圖4,該IgG1鉸鏈區係由兩個以雙硫鍵相互連接的胜肽所組成,且該infliximab之輕鏈及重鏈的互補決定區域(complimentarity determining
region,CDR)被擺動的抑制區(源自IgG1的鉸鏈區)所阻擋。
純化作用係透過如上述範例1.5來執行,且其純化產物係透過SDS PAGE(圖5)來確認。該純化產物確認為55kDa的IgG1 hinge/MMP2/infliximab重鏈(圖5左),該產物的大小相似於infliximab(圖5中間)。並可判斷該純化產物之純度為85%。
範例3
IgG1 Hinge/MMP2/Infliximab在MMP2處理後之抑制區切除之情形
IgG1 Hinge/MMP2/infliximab或infliximab(抗-TNF-α抗體)如範例1.6之敘述以MMP2(20μg/ml)處理。圖6為西方墨點法的分析結果,說明infliximab的分子量大小(約53.5kDa)在MMP2處理之前及之後是不變的。另一方面,在MMP2處理之前,IgG1 hinge/MMP2/infliximab的分子量大小約為55kDa,而在MMP2處理之後,分子量55kDa產物的band強度逐漸減少,而分子量53.5kDa產物的band強度則隨著時間而增加。此結果指出本發明之鉸鏈抗體的抑制區可以在MMP2的處理之下從功能性抗體中被移除。
範例4
Hinge/MMP2/anti-TNF-α抗體之抗原結合力的抑制及恢復
在MMP2處理之前及之後的純化hinge/MMP2/infliximab之抗原結合力(範例1.6)係以ELISA來測量,且其結果總結於圖7。在此分析中,抗-TNF-α抗體結合至TNF-α的結合能力設定為100%,據此去計算hinge/MMP2/infliximab之相對的百分比。
ELISA的結果指出在以MMP2處理之前的hinge/MMP2/infliximab結合至TNF-α之結合能力約為0.5%,由此確認該抑制區的附著實質上會抑制該功能性抗-TNF-α區的結合能力99.5%。此數據亦透露以MMP2處理1小時是足夠活化hinge/MMP2/infliximab的結合能力,還原至約110%。以MMP2處理2小時之後,活化的hinge/MMP2/infliximab之結合能力比起Infliximab更進一步提升至約120%。
範例5
以Hinge/MMP2/infliximab中和TNF-α訊號
範例1.8係執行來了解在MMP2處理之後,IgG1 hinge/MMP2/infliximab是否仍然具有中和TNF-α訊號的能力。其結果總結於圖8指出,與正控制組(第2組)比起來,傳統的infliximab無論含有MMP2(第4組)或不含有MMP2(第3組)都可有效屏蔽TNF-α的訊號。相比之下,未被MMP2處理的IgG1 hinge/MMP2/infliximab(第5組)實質上無法中和TNF-α訊號,而以MMP2處理的IgG1 hinge/MMP2/infliximab(第6組)可有效降低TNF-α訊號。這些結果說明本發明所請求的抑制區可有效屏蔽功能性抗體區及功能性抗體的興趣配位子之間的結合。此外,此實驗亦證實本發明的鉸鏈抗體之功能區的功能性可透過MMP2的處理而被還原。
範例6
各種Hinge/MMP2/antibodies之抗原結合力的抑制及恢復
圖9、10、及表格1為在MMP2處理之前及之後的各種Hinge/MMP2/anti-HER2抗體之抗原結合能力的總結。
參考圖9及表格1,在MMP2處理之前,非活化態的IgG1 hinge/MMP2/trastuzumab之抗原結合能力約為27%,其表示約73%的功能性抗-HER2區之結合能力被附著的抑制區所抑制。在MMP2處理後約1.5小時,該IgG1 hinge/MMP2/trastuzumab抗體實質上被活化,且該結合能力被還原至約97%。
在MMP2處理之前的非活化的IgG1 hinge/MMP2/panitumumab之抗原結合力約為11%,代表約89%的功能性抗-EGFR區之結合力被附著的抑制區所抑制。基本上IgG1
hinge/MMP2/panitumumab的活化可在MMP2處理後2小時達成,以抗原結合能力約90%來證明。
簡而言之,各種IgG1 hinge/MMP2/antibodies對鉸鏈抗體及他們對應的配位子之間之結合力展現約73%至99.5%的抑制力,且該結合親和力在MMP2處理後可恢復至約100%。
為了瞭解該鉸鏈區在鉸鏈抗體上的抑制能力之效果,來自不同免疫球蛋白(例如:IgG 1、IgG 2、IgG 3、IgG 4、IgA1及IgA2)的鉸鏈區被附著至功能性抗體(如上述)。當鉸鏈抗體為非活化時,所有的鉸鏈區皆具有實質上可抑制鉸鏈抗體對其興趣配位子之結合力。尤其是在MMP2處理前,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2 hinge/MMP2/anti-TNF-α抗體之抗原結合能力分別為0.5%、6%、1%、31.5%、2.5%及23.5%(圖10)。此外,在被MMP2活化後,這些活化的抗體之結合能力會被還原至100%(圖10)。
這些結果指出本發明所請之抑制區可阻擋約73至99.5%功能性抗體區的結合親和力,且該鉸鏈抗體的結合親和力可透過以MMP2的處理被還原至約90至100%,意味著在本設計的構想下,目前的鉸鏈抗體可被應用於任何臨床上可得的抗體上。
範例7
動物模型中Hinge-αEGFR抗體的局部化及活化
Panitumumab(抗-αEGFR抗體)已被使用來治療有表現EGFR的大腸直腸癌。在此範例,hinge/MMP2/panitumumab(以下稱為hinge-αEGFR antibody)被製備,且其in vivo的局部化及活化係透過使用
患有大腸癌的老鼠來檢測。
抗-αEGFR抗體(panitumumab)及hinge-αEGFR antibody係透過上述範例1所闡述之步驟來製備。該anti-αEGFR antibody及hinge-αEGFR antibody接著與市面上可得之cyanine dye,IR820(購於Sigma 543365)來結合。
平均體重為20克之裸鼠被移植人類大腸癌細胞,HCT116(EGFR+/MMP+)。具有HCT116(EGFR+/MMP+)癌細胞的老鼠分別以靜脈注射5mg/kg的IR820-anti-αEGFR antibody或IR820-hinge-αEGFR antibody,再分別注射PBS或MMP抑制劑(5mg/kg的1.10-phenanthroline monohydrate,購於Sigma)。在注射後48小時用IVIS Spectrum/CT imaging系統(Caliper Life Sciences,PE),以激發波長710nm及發射波長820nm對老鼠執行光學成像。在成像過程中,老鼠維持在37℃氣體麻醉(5% isoflurane)狀態下。圖11為其代表圖。
該光學成像提供了非侵入性的活體螢光訊號3D分布定量測量。理論上,一旦hinge-αEGFR antibody到達腫瘤部位,hinge-αEGFR antibody便會在MMP2蛋白酶的作用下被活化,且接著該活化的功能性抗體便可與EGFR-positive的腫瘤細胞結合。
如在圖11中可見,該活化的hinge-αEGFR antibody(從左數來第三張)如anti-αEGFR antibody(從左數來第一張),被選擇性地局部化至腫瘤部位。更進一步,根據圖像的顏色來判斷,活化的hinge-αEGFR antibody在腫瘤部位所積累的程度與anti-αEGFR antibody在腫瘤部位所積累的程度相等。
此外,比較圖11這兩組分別以anti-αEGFR antibody及hinge-αEGFR antibody處理的照片,可注意到在有MMP抑制劑存在之下,較少的hinge-αEGFR antibody被活化並結合至EGFR-positive腫瘤細胞。這些資料指出hinge-αEGFR antibody的活化會被MMP抑制劑所抑制。此外,此結果證實根據本發明實施例的hinge/MMP2 antibody之活化可透過切割酵素(諸如MMP2)的作用來達成。
範例8
動物模型中Hinge-TNFα Antibody的抗發炎效果
抗-TNFα抗體(例如adalimumab)已被用來治療一些需要抑制發炎反應的病況。在此範例研究IgG1 hinge/MMP2/adalimumab(於下文稱為hinge-TNFα antibody)治療膠原誘導關節炎(collagen-induced arthritis,CIA)的功效。CIA係人類類風溼性關節炎的慢性自體免疫模型,且廣泛使用於研究類風溼性關節炎的分子及細胞媒介。
抗-TNFα抗體(adalimumab)及hinge-TNFα antibody係根據前文範例1所述之步驟來製備。
膠原蛋白誘導關節炎的動物模型建立如下。公DBA/1小鼠(8至10週大)在尾巴根部皮內注射100μg的第二型牛膠原蛋白(Chondrex,Inc.,Redmond,WA,USA)來引發免疫反應;此第二型牛膠原蛋白以同樣體積的弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant)(Chondrex,Inc.,Redmond,WA,USA)來乳化。在第一次免疫作用後三個禮拜,重複該步驟。接著每隔2至3天檢查小鼠,且各個有表現紅斑及/或一隻或多隻腳的爪子有膨脹的小鼠被分派為治療研究。在產生關節炎的開始時,給予小鼠腹腔注射
PBS、anti-TNFα antibody、或hinge-TNFα antibody(100μg/小鼠)。四肢爪子的發炎反應可根據以下分為0至4級:0=沒有膨脹及病灶發紅反應;1=指頭關節的膨脹;2=腳踝或手腕關節輕微的膨脹;3=整隻腳爪嚴重發炎;4=變形或關節僵硬。各個腳爪被分級,且四個分數加總,故每隻小鼠的可能發炎分數之最大值為16。其結果總結於圖12。
圖12的資料指出以anti-TNFα antibody(adalimumab)及hinge-TNFα antibody治療的小鼠,其發炎分數比其他以PBS處理的小鼠來得低。此外,以目前的hinge-TNFα antibody處理的小鼠,其發炎分數比起以市面上可得的anti-TNFα antibody處理的小鼠來得低。因此,這些資料可證明目前的hinge-TNFα antibody可被用來治療類風濕性關節炎。
應注意的是雖然上述實施例及工作示例之鉸鏈抗體係源自單株抗體,本發明並不對其限制。而本發明所提供的應用設計構想可應用於其他抗體基礎的治療法。例如,本發明所請之抑制區可透過於文中所討論之相似的方法來附著於雙功能性的抗體(例如:catumaxomab)之N端。其他適用於本發明的抗體基礎治療法包括但不限雙功能性雙鏈抗體、三功能性之Fab3抗體、二價體微型抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、單鏈變異區片段(scFv)片段、Fab片段、及Bis-scFv片段。
可理解的是上述之實施例係僅以範例之方式提供,且所屬技術領域之一般通常知識者可對其進行各種修飾。上述說明書、範例、及資料為本發明之架構及示例的實施例之使用提供一完整的說明。雖然本發明之各種實施例在特定程度下或是在一個或多個做為參考的實施例之下被描述,惟本發明所屬技術領域之人可在不背離本發明之精神或範圍內,對本
發明之實施例做各種修改。
<110> DCB-USA LLC 高雄醫學大學
<120> 一種可屏蔽抗體活性的閉鎖器/ANTIBODY LOCKER FOR THE INACTIVATION OF PROTEIN DRUG
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<160> 78
<170> BiSSAP 1.3
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> infliximab輕鏈
<400> 1
<210> 2
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Panitumumab輕鏈
<400> 2
<210> 3
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Trastuzumab輕鏈
<400> 3
<210> 4
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> adalimumab輕鏈
<400> 4
<210> 5
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列/人工序列
<220>
<223> DENOSUMAB輕鏈
<400> 5
<210> 6
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> lpilimumab輕鏈
<400> 6
<210> 7
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tremelimumab輕鏈
<400> 7
<210> 8
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> efalizumab輕鏈
<400> 8
<210> 9
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ustekinumab輕鏈
<400> 9
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1鉸鏈
<400> 10
<210> 11
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2鉸鏈
<400> 11
<210> 12
<211> 62
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG3鉸鏈
<400> 12
<210> 13
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4絞鏈
<400> 13
<210> 14
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA1絞鏈
<400> 14
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA2絞鏈
<400> 15
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP2 substrate
<400> 16
<210> 17
<211> 2445
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge lpilimumab
<400> 17
<210> 18
<211> 2427
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 Hinge lpilimumab
<400> 18
<210> 19
<211> 2727
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG3 Hinge lpilimumab
<400> 19
<210> 20
<211> 2427
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Hinge lpilimumab
<400> 20
<210> 21
<211> 2469
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA1 Hinge lpilimumab
<400> 21
<210> 22
<211> 2415
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA2 Hinge lpilimumab
<400> 22
<210> 23
<211> 2451
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge Ticilimumab
<400> 23
<210> 24
<211> 2433
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 Hinge Ticilimumab
<400> 24
<210> 25
<211> 2733
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG3 Hinge Ticilimumab
<400> 25
<210> 26
<211> 2433
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Hinge Ticilimumab
<400> 26
<210> 27
<211> 2475
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA1 Hinge Ticilimumab
<400> 27
<210> 28
<211> 2421
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA2 Hinge Ticilimumab
<400> 28
<210> 29
<211> 2451
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge Humira
<400> 29
<210> 30
<211> 2433
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 Hinge Humira
<400> 30
<210> 31
<211> 2732
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG3 Hinge Humira
<400> 31
<210> 32
<211> 2433
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Hinge Humira
<400> 32
<210> 33
<211> 2475
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA1 Hinge Humira
<400> 33
<210> 34
<211> 2420
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA2 Hinge Humira
<400> 34
<210> 35
<211> 2465
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge Panitumumab
<400> 35
<210> 36
<211> 2439
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge Prolia
<400> 36
<210> 37
<211> 2421
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 Hinge Prolia
<400> 37
<210> 38
<211> 2759
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG3 Hinge Prolia
<400> 38
<210> 39
<211> 2421
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Hinge Prolia
<400> 39
<210> 40
<211> 2463
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA1 Hinge Prolia
<400> 40
<210> 41
<211> 2409
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA2 Hinge Prolia
<400> 41
<210> 42
<211> 2419
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge Raptiva
<400> 42
<210> 43
<211> 2448
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge Remicade
<400> 43
<210> 44
<211> 2430
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 Hinge Remicade
<400> 44
<210> 45
<211> 3048
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG3 Hinge Remicade
<400> 45
<210> 46
<211> 2430
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Hinge Remicade
<400> 46
<210> 47
<211> 2421
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA1 Hinge Remicade
<400> 47
<210> 48
<211> 2418
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA2 Hinge Remicade
<400> 48
<210> 49
<211> 2413
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge Stelara
<400> 49
<210> 50
<211> 2459
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge Trastuzumab
<400> 50
<210> 51
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP2 substrate
<400> 51
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP2 substrate
<400> 52
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MMP2 substrate
<400> 53
<210> 54
<211> 35
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgD1 Hinge
<400> 54
<210> 55
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgD2鉸鏈
<400> 55
<210> 56
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgD1鉸鏈
<400> 56
<210> 57
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgD2鉸鏈
<400> 57
<210> 58
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> infliximab heavy chain
<400> 58
<210> 59
<211> 385
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Panitumumab heavy chain
<400> 59
<210> 60
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Trastuzumab heavy chain
<400> 60
<210> 61
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> adalimumab heavy chain
<400> 61
<210> 62
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> denosumab heavy chain
<400> 62
<210> 63
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> lpilimumab heavy chain
<400> 63
<210> 64
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tremalimumab heavy chain
<400> 64
<210> 65
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> efalizumab heavy chain
<400> 65
<210> 66
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> ustekinumab heavy chain
<400> 66
<210> 67
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge+ lpilimumab light chain
<400> 67
<210> 68
<211> 1440
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG1 Hinge+ lpilimumab heavy chain
<400> 68
<210> 69
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 Hinge+ lpilimumab light chain
<400> 69
<210> 70
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG2 Hinge+ lpilimumab heavy chain
<400> 70
<210> 71
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG3 Hinge+ lpilimumab light chain
<400> 71
<210> 72
<211> 1581
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG3 Hinge+ lpilimumab heavy chain
<400> 72
<210> 73
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Hinge+ lpilimumab light chain
<400> 73
<210> 74
<211> 1431
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4 Hinge+ lpilimumab heavy chain
<400> 74
<210> 75
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA1 Hinge+ lpilimumab light chain
<400> 75
<210> 76
<211> 768
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA1 Hinge+ lpilimumab heavy chain
<400> 76
<210> 77
<211> 729
<212> DMA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA2 Hinge+ lpilimumab light chain
<400> 77
<210> 78
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IgA2 Hinga+ lpilimumab heavy chain
<400> 78
100‧‧‧鉸鏈抗體
110‧‧‧功能性抗體
112‧‧‧輕鏈
114‧‧‧重鏈
116‧‧‧雙硫鍵
120‧‧‧抑制區
122‧‧‧胜肽臂
124‧‧‧雙硫鍵
130‧‧‧可切割之多胜肽鏈連接體
Claims (24)
- 一種鉸鏈抗體,可選擇性地活化於一目標細胞或組織中,來治療其中之一病徵,該鉸鏈抗體包含:一功能性抗體,包含兩個輕鏈及兩個重鏈,於活化狀態時可用於治療一病況;兩個抑制區,其中各個抑制區係由兩個透過雙硫鍵相互連接的胜肽臂所組成;以及四個可切割之多胜肽鏈連接體,其中各個可切割之多胜肽鏈連接體包含一可被酵素切割的受質胜肽,該酵素專一地或高度地表現於目標細胞或組織中,且該可切割之多胜肽鏈連接體連結該兩個抑制區之兩個胜肽臂之一於該功能性抗體之兩個輕鏈及兩個重鏈之其中一個的N端。
- 如申請專利範圍第1項之鉸鏈抗體,其中該功能性抗體係選自由抗-TNF-α抗體、抗-RANKL抗體、抗-CTLA-4抗體、抗-HER2抗體、抗-EGFR抗體、抗-VEGF抗體、抗-VEFGR2抗體、抗-IL6R抗體、抗-IL12/23抗體、抗-CD3抗體、抗-CD11a抗體、抗-CD20抗體、抗-CD25抗體、抗-CD30抗體、抗-CD33抗體、及抗-CD52抗體所組成之群組。
- 如申請專利範圍第1項之鉸鏈抗體,其中該功能性抗體之輕鏈具有選自胺基酸序列SEQ ID Nos.1、2、3、4、5、6、7、8、或9之任一個,且該功能性抗體之重鏈具有選自胺基酸序列SEQ ID Nos.58、59、60、61、62、63、64、65、及66之任一個。
- 如申請專利範圍第1項之鉸鏈抗體,其中各個該兩個抑制區係一免疫球蛋白A(IgA)、一免疫球蛋白D(IgD)、或一免疫球蛋白G(IgG)之鉸 鏈區,或是該鉸鏈區之一片段。
- 如申請專利範圍第4項之鉸鏈抗體,其中該IgA係IgA1或IgA2。
- 如申請專利範圍第4項之鉸鏈抗體,其中該IgG係IgG1、IgG2、IgG3、或IgG4。
- 如申請專利範圍第4項之鉸鏈抗體,其中各個該抑制區包含胺基酸序列SEQ ID Nos.10、11、12、13、14、15、54或55之任一個。
- 如申請專利範圍第1項之鉸鏈抗體,其中該受質胜肽可被以下任一個酵素所切割:一基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMP)、一細胞自溶酶(cathepsin,CTS)、一半胱天冬酶(caspase,CASP)、或一解整合素與金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)。
- 如申請專利範圍第8項之鉸鏈抗體,其中該酵素係MMP-2或MMP-9,且各個可切割之多胜肽鏈連接體包含胺基酸序列SEQ ID No.16。
- 如申請專利範圍第1項之鉸鏈抗體,其中該功能性抗體係一抗-TNF-α抗體,其中其輕鏈包含胺基酸序列SEQ ID No.1,且其抗體之重鏈包含胺基酸序列SEQ ID No.58;各個該可切割之多胜肽鏈連接體包含胺基酸序列SEQ ID No.16;以及各個該抑制區包含胺基酸序列SEQ ID No.10。
- 一種用於產生一鉸鏈抗體之表現系統,該鉸鏈抗體可選擇性地活化於一目標細胞或組織中,來治療其中之一病徵,該表現系統包含:一第一核酸序列,從5’端至3’端包含一第一抑制區編碼區域,編碼該鉸鏈抗體之抑制區的第一胜肽臂,其中該抑制區包含一免疫球蛋白之鉸鏈區或是該鉸鏈區之片段、 一第一可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域,編碼該鉸鏈抗體之可切割之多胜肽鏈連接體,其中該可切割之多胜肽鏈連接體係一可由酵素所切割之受質胜肽,該酵素專一地或高度地表現於該目標細胞或組織中、及一輕鏈編碼區域,編碼該鉸鏈抗體之功能性抗體之輕鏈,其中該功能性抗體於活化狀態時可用於治療該病徵;以及一第二核酸序列,從5’端至3’端包含一第二抑制區編碼區域,編碼該鉸鏈抗體之抑制區的第二胜肽臂、一第二可切割之多胜肽鏈連接體編碼區域,編碼該鉸鏈抗體之可切割之多胜肽鏈連接體、及一重鏈編碼區域,編碼該鉸鏈抗體之功能性抗體的重鏈。
- 如申請專利範圍第11項之表現系統,進一步包含一連結核酸序列,連結該第一核酸序列與該第二核酸序列,其中該連結核酸序列係一Furin-2A編碼序列或是一內部核醣體進入位置(internal ribosome entry site,IRES)序列。
- 如申請專利範圍第12項之表現系統,進一步包含一調控序列,可操作地連結於該第一核酸序列與該第二核酸序列來表現該第一核酸序列、該第二核酸序列、及該連結核酸序列。
- 如申請專利範圍第11項之表現系統,進一步包含一第一調控序列,可操作地連結於該第一核酸序列來表現該第一核酸序列;以及一第二調控序列,可操作地連結於該第二核酸序列來表現該第二核酸序 列。
- 如申請專利範圍第14項之表現系統,其中,該第一核酸序列及該第一調控序列建構於一第一表現載體裡;以及該第二核酸序列及該第二調控序列建構於一第二表現載體裡。
- 如申請專利範圍第14項之表現系統,其中該第一核酸序列、該第一調控序列、該第二核酸序列、及該第二調控序列建構於一單一表現載體裡。
- 如申請專利範圍第11項之表現系統,其中該功能性抗體係選自由抗-TNF-α抗體、抗-RANKL抗體、抗-CTLA-4抗體、抗-HER2抗體、抗-EGFR抗體、抗-VEGF抗體、抗-VEGFR2抗體、抗-IL6R抗體、抗-IL12/23抗體、抗-CD3抗體、抗-CD11a抗體、抗-CD20抗體、抗-CD25抗體、抗-CD30抗體、抗-CD33抗體、及抗-CD52抗體所組成之群組。
- 如申請專利範圍第11項之表現系統,其中該免疫球蛋白係一免疫球蛋白A(IgA)、一免疫球蛋白D(IgD)、或一免疫球蛋白G(IgG)。
- 如申請專利範圍第18項之合成核酸分子,其中該IgA係IgA1或IgA2。
- 如申請專利範圍第18項之合成核酸分子,其中該IgG係IgG2、IgG3、或IgG4。
- 如申請專利範圍第11項之合成核酸分子,其中該受質胜肽可被以下任一個酵素所切割:一基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinases,MMP)、一細胞自溶酶(cathepsin,CTS)、一半胱天冬酶(caspase,CASP)、或一解整合素與金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)。
- 如申請專利範圍第11項之合成核酸分子,其中該合成核酸分子具有一核苷酸序列SEQ ID Nos.17至50之任一個。
- 一種用於治療癌症或一自體免疫疾病於一對象之方法,包含給予該對象一治療有效劑量之申請專利範圍第1至10項任一項之鉸鏈抗體。
- 如申請專利範圍第23項之方法,其中該鉸鏈抗體透過皮下、口服、靜脈注射、鞘內注射、或肌肉內注射給予。
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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