KR20140093981A - 아세틸-코엔자임 a로부터 유래되는 이소프레노이드의 제조 방법 - Google Patents

아세틸-코엔자임 a로부터 유래되는 이소프레노이드의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 숙주 세포에서 아세틸-CoA-유래 이소프레노이드를 이종적으로 제조하기 위한 조성물과 방법을 제공한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 아세트알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA, E.C. 1.2.1.10)를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열과 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제를 포함하는 MEV 경로를 포함하도록 유전자 변형된다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 ADA를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열과 아세토아세틸-CoA 신타제를 포함하는 MEV 경로를 포함하도록 유전자 변형된다. 일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 포스포케톨라제 및 포스포트랜스아세틸라제를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 천연적인 PDH-바이패스의 기능적 파괴를 더 포함한다. 본원에 기술된 조성물과 방법은 아세틸-CoA-유래 이소프레노이드를 이종적으로 생산하기 위한 에너지 효율적이며 레독스 균형적인 경로를 제공한다.

Description

아세틸-코엔자임 A로부터 유래되는 이소프레노이드의 제조 방법 {PRODUCTION OF ACETYL-COENZYME A DERIVED ISOPRENOIDS}
본 출원은 2011년 11월 9일자 미국 가출원 번호 61/557,893호에 대해 우선권을 주장하며, 이 문헌의 전체 내용이 원용에 의해 본 발명에 포함된다.
본 발명은 조작된 숙주 세포에서 아세틸-CoA 유래 이소프레노이드를 제조하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
아세틸 코엔자임 A (아세틸-CoA)는 폴리케티드, 지방산, 이소프레노이드, 페놀계, 알칼로이드, 비타민 및 아미노산 등의 필수적인 생물학적 화합물의 합성시, 중요한 중간산물이다. 특히 아세틸-CoA로부터 유래된 대사산물들은 공업적으로 유용한 화합물을 비롯하여 일차 및 이차 대사산물이다. 예를 들어, 이소프레노이드는 제약학적 제품에, 그리고 생물 연료로서, 식품 첨가제로서, 그리고 그외 특수 화학제로서 사용된다. 이소프레노이드 산물은, 비규칙적인 이소프레노이드와 폴리테르펜도 보고된 바 있지만, 전형적으로는 5 탄소의 이소펜테닐 다이포스페이트 (IPP) 단위가 반복되어 구성된다. 이소프레노이드는, 천연적으로, 이의 전구체 IPP와 이의 이성질체인 다이메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)의 연속적인 축합을 통해 합성된다. 이들 전구체에 대해서는 2가지 경로가 알려져 있다. 원핵 생물은, 몇 종을 제외하고는, 전형적으로, 데옥시자일룰로스-5-포스페이트 (DXP) 경로를 사용하여 피루베이트와 글리세르알데하이드 3-포스페이트 (G3P)를 IPP와 DMAPP로 변환한다. 진핵 생물의 경우, 식물을 제외하고는, 일반적으로, 메발로네이트-의존성 (MEV) 경로를 이용하여 아세틸-CoA를 IPP로 변환하며, IPP는 DMAPP로 이성질체화된다.
단세포성 진균인 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)와 이와 비슷한 유기체들은 2가지 내인성 경로를 이용하여 아세틸-CoA를 합성한다. 한가지 경로는 미토콘드리아 매트릭스에서 이루어지는데, PDH 복합체가 당분해 반응을 통해 글루코스로부터 발생된 피루베이트의 산화적 데카르복시화를 촉매함으로써, 아세틸-CoA가 합성된다. PDH 복합체는 60개의 폴리펩타이드 체인, 즉 리포아미드 리덕타제-트랜스아세틸라제 체인 24개, 다이하이드롤리필 데하이드로게나제 체인 12개 및 피루베이트 탈카르복실라제 체인 12개로 이루어져 있다. 이 거대 복합체는 피루베이트를 아세틸-CoA로 변환하면서 부산물로서 NADH를 생성한다. 발생된 아세틸-CoA는 이후 에너지 생산을 위해 시트르산 사이클을 통해 CO2와 H2O로 완전히 산화되거나, 또는 미토콘드리아에서 수행되는 생합성 반응에 이용될 수 있다.
미코콘드리아에서 만들어지는 아세틸-CoA는 미토콘드리아 막을 통해 세포질로 이동할 수 없다. 그래서, 주요 일차 및 이차 대사산물을 생합성하는데 필요한 세포질 아세틸-CoA를 만들어내기 위해, 사카로마이세스 세레비지애는 "PDH-바이패스"라고 하는 세포질에 위치한 독립적인 기전을 이용한다. 이 다단계 경로는 다음과 같은 반응을 촉매한다: (1) 피루베이트 데카르복실라제 (PDC, EC 4.1.1.1)에 의한 피루베이트의 아세트알데하이드로의 데카르복시화; (2) NADP+ 한개를 NADPH 한개로 환원하는 아세트알데하이드 데하이드로게나제 (ACDH, EC 1.2.1.5 및 EC 1.2.1.4)에 의한 아세트알데하이드의 아세테이트로의 변환; 및 (3) 2 ATP를 2 ADP로 가수분해하는 것과 에너지가 동일한, 1 ATP를 1 AMP로 가수분해하는, 아세틸-CoA 신테타제 (ACS, EC 6.2.1.1)에 의한 아세테이트와 CoA로부터 아세틸-CoA의 합성.
자연은 아세틸-CoA로부터 유래되는 다수의 생분자를 추출함에 있어 수율이 낮은 소스만 제공하기 때문에, 유전자 변형된 미생물을 이용한 발효학적 제조 방법에 이들의 제조 방법으로서 유망한 대안책이다. 그러나, 아세틸-CoA 중간산물을 생산하기 위해 천연적인 아세틸-CoA 경로를 이용하는 방법에는 몇가지 한계가 있다. 예를 들어, 천연적인 MEV 경로를 통해 이소프레노이드를 생산하기 위해서는, 도 1에 도시된 바와 같이, 생산되는 메발로네이트 각 분자 당 아세틸-CoA 분자 3개와 NADPH 2개의 산화가 요구된다. PDH-바이패스는 생성되는 아세틸-CoA 당 NADPH 1개를 생성하지만, 이 과정에서 ATP는 2 당량이 소비된다. 그래서, NADPH 생성은 천연적인 MEV 경로의 조인자 요구성 측면에서는 유익하지만, 생성되는 메발로네이트 당 ATP 6개가 소모되고, 예컨대, 생성물의 수율을 희생하면서까지 더 많은 탄소원들을 TCA 사이클 및 산화적 인산화를 통한 ATP 합성에 사용하여야 하므로, 에너지 측면에서 비효율적인 반응이다.
즉, 아세틸-CoA로부터 유래되는 화합물들을 효율적으로 제조하는 생산 숙주를 설계함에 있어, 문제점들 중 하나는 ATP 요구량을 최소화하면서도 생합성 경로의 요건과 조인자를 총족시키도록 아세틸-CoA 생산을 최적화하는 것이다. 본원에 제시된 조성물과 방법은 이러한 과제를 해결하며, 아울러 관련 이점을 제공한다.
본원에 기술된 조성물 및 방법은, 에너지 효율적이고 조인자 측면에서 균형적인, 아세틸-CoA 유래 이소프레노이드의 제조를 제공한다. 아세틸-CoA를 세포질에서 생산하기 위한 PDH-바이패스의 대안으로서, 이종의 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제 (다른 예로, "아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화," "아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아실화," 또는 "ADA" (EC 1.2.1.10))를 이용함으로써, 제조되는 아세틸-CoA 분자 당 ATP 2 당량을 절약한다. ADA는 ATP를 소비하지 않고도 아세트알데하이드를 아세틸-CoA로 직접 변환하는데, 이 과정에서 1개의 NAD+가 1개의 NADH로 환원된다.
PDH-바이패스를 ADA로 대체함으로써 달성되는 ATP 절약은 생성물의 수율을 보다 높이는 방향으로 사용될 수 있지만, 천연적인 메발로네이트 경로와 ADA를 조합하여 사용하는 방법에는 잠재적인 문제점들이 존재한다. 첫번째로, 천연 PDH-바이패스의 불활성화는 NADPH 소스 하나를 없애게 되며, ADA에 의해 촉매되는 반응을 통해 NADH가 제조된다. 즉, 추가적인 경로의 변형 없이 PDH-바이패스를 ADA로 치환하면, NADPH를 소비하는 이소프레노이드 합성에 레독스 불균형이 발생하게 된다.
두번째로, ADA는 다음과 같은 가역적인 반응을 촉매한다:
아세트알데하이드 + NAD+ + 코엔자임 A ⇔ 아세틸-CoA + NADH + H+
아세틸-CoA를 형성하는 천연적인 PDH-바이패스 반응은, ATP를 AMP로 가수분해하는 반응과 커플링되어 있어, 열역학적으로 우호적이다. 반면에, ADA 반응은 ATP와 커플링되어 있지 않으며, 아세틸-CoA를 형성함에 있어 천연적인 PDH-바이패스 반응 보다 평형에 훨씬 더 근접해 있다. 따라서, ADA에 의해 촉매되는 반응은 아세트알데하이드를 아세틸-CoA로 변환하는데 보다 낮은 열역학적 구동력을 가지므로, 추가적으로 경로를 변형하지 않으면 ADA에 의한 이론적인 에너지 획득은 실현되지 않을 수 있다.
본원에 기술된 조성물 및 방법은 이런 문제들을 해결한다. 일부 구현예들에서, PDH-바이패스를 ADA로 치환함으로써 발생되는 레독스 불균형을 해결하기 위해, 유전자 변형된 숙주 세포는 이소프레노이드 경로에서 ADA에 의해 생성되는 NADH를 소비하는데 NADH-가용성 효소 (NADH-가용성 효소)를 추가로 활용한다. 따라서, ADA-매개에 의한 아세트알데하이드의 아세틸-CoA로의 변환으로 생성되는 NADH 풀은 이소프레노이드 합성에 직접 활용될 수 있다. 일부 구현예들에서, NADH-가용성 효소는 이소프레노이드 경로에서 비-천연적인 효소이다. 예를 들어, NADH-가용성 효소는 이소프레노이드 경로의 천연적인 NADPH-가용성 효소를 대체할 수 있다. 특정 구현예에서, NADH-가용성 효소는 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환하는 NADH-가용성 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA 리덕타제 (HMG-CoA 리덕타제)이다.
일부 구현예들에서, ADA 반응에서 낮은 열역학적 구동력을 해결하기 위해, 유전자 변형된 숙주 세포는 메발로네이트 경로에서 제1 단계로서 아세틸-CoA 바로 다음 차례에 열역학적으로 유리한 반응을 추가로 이용하여, ADA 반응에 풀 온 (pull on)을 제공한다. 일부 구현예들에서, 아세틸-CoA로부터 아세토아세틸-CoA의 형성은 아세토아세틸-CoA 신타제 (AACS; 다른 예로, 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제로 지칭됨)에 의해 촉매된다. AACS에 의해 촉매되는 반응은, 아세틸-CoA 카르복실라제에 의한 말로닐-CoA 생성으로부터 발생되는 ATP 1 분자의 가수분해로 인해 (도 5), 천연 메발로네이트 경로의 아세틸-CoA 티올라제에 의해 촉매되는 반응 보다 열역학적으로 더 유리하다. 즉, AACS는 ADA 반응을 정방향으로 구동하기 위한 보다 강력한 견인력을 아세틸-CoA에 제공한다.
이러한 변형과 조합하여 이종의 ADA를 이용하는 이점은 MEV 경로를 포함하는 숙주 세포에서의 세스퀴테르펜 파르네센의 이론적인 수율 개선으로 설명된다. 천연적인 메발로네이트 경로를 통한 이소프레노이드 제조는 도 1과 도 2에 예시된다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 세포질 아세틸-CoA가 천연적인 효모 대사 네트워크에서 이루어지는 화학 반응만을 이용하여 글루코스로부터 합성되는 경우, 메발로네이트 경로를 통한 글루코스의 파르네센으로의 변환시 잠재적인 최대 화학량론적 수율은 23.6 wt%이며, 파르네센 1 분자를 합성하는데 글루코스 분자 4.77개가 요구된다. 파르네센 분자 1개 당 ATP 27개가 필요한데, 이 중 18개는 PDH-바이패스를 통해 아세트알데하이드로부터 세포질 아세틸-CoA를 합성하는데 소모된다. 그러나, 도 4에 예시된 바와 같이, ADA와 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제에 의해 촉매되는 반응을 메발로네이트를 제조하는 대사 네트워크에 도입하면, 최대 이론적인 화학량론적 수율은 25.2 wt%로 개선된다. 특히, ADA는 ATP 투입 없이도 아세트알데하이드를 아세틸-CoA로 변환하는데; 이는 파르네센을 합성하는데 필요한 ATP 당량을 9개로 낮추므로써, 합성되는 파르네센 분자 1개 당 ATP 18 당량을 절약한다 (2 ATP 당량 / 아세틸-CoA x 9 아세틸-CoA / 1 파르네센). 아세틸-CoA 제조 중에 이루어지는 이러한 ATP 소비 절약은 파르네센을 제조하기 위해 TCA 사이클을 구동하기 위한 세포의 산소 요구성을 소거시킨다. 글루코스를 파르네센으로 변환하기 위한 산소 요구량을 글루코스 당 소비되는 O2 분자를 7.8개에서 6개로 감소시킴으로써, 발효기에 산소를 공급하는데 따른 주된 제조 단가를 일정한 규모로 떨어뜨린다. 아울러, 레독스 불균형은 ADA에 의해 생성된 NADH를 소비하는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제의 공동-도입에 의해 완화된다.
도 4에 나타낸 바와 같이, ADA 및 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 둘다를 포함하는 균주에는 ATP가 화학량론적 과잉으로 발생되며, 세포는 이를 유지와 생육에 이용할 수 있다. 다른 예로, 이러한 과잉의 ATP 중 일부는, 아세토아세틸-CoA 신타제 (AACS)를 도입함으로써, 아세토아세틸-CoA 제조의 카이네틱스를 개선시키는 방향으로 활용할 수 있다. 도 5에 예시된 바와 같이, AACS는 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA로부터 아세토아세?-CoA를 합성하는 효소이다. 말로닐-CoA를 합성하는데에는 변환된 아세틸-CoA 1 분자 당 ATP 1개의 에너지 투입이 요구된다 (아세틸-CoA 카르복실라제에 의해 촉매되며, 아세틸-CoA로부터 아세토아세틸-CoA를 합성하기 위한 열역학적 구동력이 개선됨). 중요한 점은, 도 6에 예시된 바와 같이, 이것은 이 균주 설계에서 이용가능한 과잉의 ATP가 여전히 존재하기 때문에, 그 경로의 당 또는 산소 요구량이 파르네센의 최대 화학량론적 수율에 영향을 미치지 않는다는 것이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 부가적인 효과는 포스포케톨라제 (PK)와 포스포트랜스아세틸라제 (PTA) 효소의 도입을 통해 달성될 수 있다. PK 및 PTA는 프럭토스-6-포스페이트 (F6P) 또는 자일룰로스-5-포스페이트 (X5P)를 아세틸-CoA로 변환하는 반응을 촉매한다. 이들 이용가능한 대사 경로를 이용하여, 가장 바람직하게는, 반응 네트워크는 최대 이론적인 수율에서 현저하게 증가된 중량 (mass) 수율 29.8 wt% 또는 그 이상에 도달할 수 있다. 이 해법은 탄소를 저 당분해 (lower glycolysis) (G3P → 피루베이트)로부터 전환 (divert)시키는 단계를 포함하며, 이로써 ATP 및 NADH는 적게 생성되지만, 이 둘다 ADA 및 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 변형을 포함하는 네트워크에 이미 과량으로 존재한다. 저 당분해를 통한 흐름 (flux)을 줄이는 한가지 이점은, 피루베이트에서 아세트알데하이드로의 변환시 CO2가 적게 발생되며, 따라서, 최종 산물에 더 많은 탄소가 포획됨으로써, 네트워크의 최대 이론적인 수율을 높일 수 있다는 것이다. 두번째 이점은, NADH가 적게 생성되므로, 이를 재산화하는데 산소가 훨씬 적게 필요하다는 것이다. 특히, 가장 바람직한 산소 요구량은 소비되는 글루코스 1 분자 당 O2 분자 1.84개에 불과하다. 글리세롤 생산이 야생형 수준으로 돌아가는 경우, 도 13에 예시된 바와 같이, ADA 백그라운드에 PK 및 PTA를 부가함으로써 발생되는 레독스 충격은 마이크로스케일의 낮은 수율에서도 명백하다.
따라서, 본 발명은 아세틸-CoA-유래 이소프레노이드를 제조하기 위한 유전자 변형된 숙주 세포 및 이의 이용 방법을 제공한다. 일 측면에서, 본 발명은, (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종 핵산; 및 (b) 아실화 아세틸알데하이드 데하이드로게나제를 코딩하는 이종의 핵산을 포함하는, 이소프레노이드를 제조할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포를 제공한다.
일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA와 축합하여 아세토아세틸-CoA를 만드는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제 (즉, 아세토아세틸-CoA 신타제 (AACS))를 포함한다.
일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환하는 NADH-가용성 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 NADH를 사용하는 HMG-CoA 리덕타제를 포함한다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 포스포케톨라제를 코딩하는 이종의 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 포스포트랜스아세틸라제를 코딩하는 이종의 핵산을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, ADA의 아미노산 서열은 서열번호 2와 80% 이상 동일하다. 일부 구현예들에서, 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 서열번호 16과 80% 이상 동일하다. 일부 구현예들에서, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제의 아미노산 서열은 서열번호 20과 80% 이상 동일하다. 일부 구현예들에서, 포스포케톨라제의 아미노산 서열은 서열번호 12와 80% 이상 동일하다. 일부 구현예들에서, 포스포트랜스아세틸라제의 아미노산 서열은 서열번호 14와 80% 이상 동일하다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 천연적인 피루베이트 데하이드로게나제 (PDH)-바이패스의 하나 이상의 효소에 대한 기능적 파괴 (functional disruption)를 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, PDH-바이패스의 하나 이상의 효소는 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, ACS1이 기능적으로 파괴된다. 일부 구현예들에서, ACS2가 기능적으로 파괴된다. 일부 구현예들에서, ALD6가 기능적으로 파괴된다. 일부 구현예들에서, ACS1 및 ACS2가 기능적으로 파괴된다. 일부 구현예들에서, ACS1, ACS2 및 ALD6가 기능적으로 파괴된다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 알코올 데하이드로게나제 (ADH) 활성을 가진 하나 이상의 효소에 대한 기능적 파괴를 더 포함한다. 일부 구현예들에서, ADH 활성을 가진 하나 이상의 효소는 알코올 데하이드로게나제 1 (ADH1), 알코올 데하이드로게나제 3 (ADH3), 알코올 데하이드로게나제 4 (ADH4) 및 알코올 데하이드로게나제 5 (ADH5)로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 아세틸-CoA 분자 2개를 축합하여 아세토아세틸-CoA를 합성하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 아세토아세틸-CoA를 아세틸-CoA와 축합하여 HMG-CoA를 합성하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 인산화하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 메발로네이트 5-포스페이트를 메발로네이트 5-피로포스페이트로 변환하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 메발로네이트 5-피로포스페이트를 이소펜테닐 피로포스페이트로 변환하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 HMG-CoA 신타제, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제 및 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라제로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로의 효소 전체를 코딩하는 복수의 이종의 핵산을 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산은 단일한 전사 조절인자의 통제를 받는다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산은 복수의 이종의 전사 조절인자들의 통제를 받는다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)를 다이메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 IPP 및/또는 DMAPP 분자를 축합하여 폴리프레닐 화합물을 합성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 IPP 또는 폴리프레닐을 변형하여 이소프레노이드 화합물을 합성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예들에서, IPP 또는 폴리프레닐을 변형하여 이소프레노이드 화합물을 합성할 수 있는 효소는 카렌 신타제, 게라니올 신타제, 리날롤 신타제, 리모넨 신타제, 미르센 신타제, 옥시멘 신타제, α-피넨 신타제, β-피넨 신타제, γ-테르피넨 신타제, 테르피놀렌 신타제, 아모르파디엔 신타제, α-파르네센 신타제, β-파르네센 신타제, 파르네솔 신타제, 네롤리돌 신타제, 패출리올 (patchouliol) 신타제, 노트카톤 (nootkatone) 신타제, 및 아비에타디엔 신타제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 이소프레노이드는 헤미테르펜, 모노테르펜, 다이테르펜, 트리테르펜, 테트라테르펜, 세스퀴테르펜 및 폴리테르펜으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 이소프레노이드는 C5-C20 이소프레노이드이다. 일부 구현예들에서, 이소프레노이드 아비에타디엔, 아모르파디엔, 카렌, α-파르네센, β-파르네센, 파르네솔, 게라니올, 게라닐게라니올, 이소프렌, 리날롤, 리모넨, 미르센, 네롤리돌, 옥시멘, 패출롤, β-피넨, 사비넨, γ-테르피넨, 테르피놀렌 및 발렌센으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 효모 세포이다. 일부 구현예들에서, 효모는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)이다.
다른 측면에서, 본 발명은, (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종 핵산; (b) 아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA)를 코딩하는 이종의 핵산; (c) 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연적인 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소의 기능적 파괴; (d) 포스포케톨라제 (PK)를 코딩하는 이종의 핵산; 및 (e) 포스포트랜스아세틸라제 (PTA)를 코딩하는 이종의 핵산을 포함하는, 이소프레노이드를 제조할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종 핵산으로서, 상기 한가지 이상의 효소는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제를 포함함; (b) 아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA)를 코딩하는 이종의 핵산; 및 (c) 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연적인 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소에 대한 기능적 파괴를 포함하는, 이소프레노이드를 제조할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종 핵산으로서, 상기 한가지 이상의 효소는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제를 포함함; (b) 아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA)를 코딩하는 이종의 핵산; (c) 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연적인 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소의 기능적 파괴; (d) 포스포케톨라제 (PK)를 코딩하는 이종의 핵산; 및 (e) 포스포트랜스아세틸라제 (PTA)를 코딩하는 이종의 핵산을 포함하는, 이소프레노이드를 제조할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종 핵산으로서, 여기서 하나 이상의 효소는 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제를 포함함; (b) 아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA)를 코딩하는 이종의 핵산; 및 (c) 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연적인 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소에 대한 기능적 파괴를 포함하는, 이소프레노이드를 제조할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 복수의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산으로서, 여기서 복수의 효소는 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제와 NADH-가용성의 HMG-CoA 리덕타제를 포함함; (b) 아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA)를 코딩하는 이종의 핵산; (c) 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연적인 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소의 기능적 파괴; (d) 포스포케톨라제 (PK)를 코딩하는 이종의 핵산; 및 (e) 포스포트랜스아세틸라제 (PTA)를 코딩하는 이종의 핵산을 포함하는, 이소프레노이드를 제조할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포를 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은, (a) 이소프레노이드 화합물을 합성하는데 적합한 조건에서 탄소원이 구비된 배지에서 본원에 기술된 유전자 변형된 효모 세포 개체군을 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배지로부터 상기 이소프레노이드 화합물을 회수하는 단계를 포함하는, 이소프레노이드 제조 방법을 제공한다.
도 1은 이소펜테닐 다이포스페이트 ("IPP")를 제조하기 위한 메발로네이트 ("MEV") 경로를 개략적으로 도시한 것이다.
도 2는 IPP 및 다이메틸알릴 피로포스페이트 ("DMAPP")를 게라닐 피로포스페이트 ("GPP"), 파르네실 피로포스페이트 ("FPP") 및 게라닐게라닐 피로포스페이트 ("GGPP")로 변환하는 과정을 개략적으로 도시한 것이다.
도 3은 세포질 아세틸-CoA를 "야생형" PDH-바이패스를 통해 합성하는, 메발로네이트 경로를 통한, 글루코스의 파르네센으로의 변환에 있어 탄소 및 대사 요구량의 최적 흐름에 대한 개략적인 도시와 수율을 나타낸 것이다.
도 4는 세포질 아세틸-CoA가 ADA를 통해 합성되며 메발로네이트 경로가 NADPH-가용성 HMGr 대신 NADH-가용성 HMGr을 포함하는, 메발로네이트 경로를 통한 글루코스의 파르네센으로의 변환에 있어, 탄소 및 대사 요구량의 최적의 흐름과 수율을 개략적으로 도시한 것이다.
도 5는 아세토아세틸-CoA (AcAcCoA)가 아세토아세틸-CoA 신타제 (AACS)에 의해 말로닐-CoA와 아세틸-CoA (AcCoA)로부터 합성되는, 아세틸-CoA로부터 파르네센의 합성을 개략적으로 도신한 것이다. 말로닐-CoA 합성에는 변환되는 아세틸-CoA 1 분자 당 ATP 1개의 에너지 투입이 요구된다 (아세틸-CoA 카르복실라제 (ACC1)에 의해 촉매됨).
도 6은 세포질 아세틸-CoA가 ADA를 통해 합성되며 메발로네이트 경로가 NADPH-가용성 HMGr 대신 NADH-가용성 HMGr을 포함하며 아세토아세틸-CoA가 아세토아세틸-CoA 신타제에 의해 말로닐-CoA와 아세틸-CoA로부터 합성되는, 메발로네이트 경로를 통한 글루코스의 파르네센으로의 변환에 있어, 탄소 및 대사 요구량의 최적의 흐름과 수율을 개략적으로 도시한 것이다.
도 7은 세포질 아세틸-CoA가 ADA를 통해 합성되며 메발로네이트 경로가 NADPH-가용성 HMGr 대신 NADH-가용성 HMGr을 포함하며 포스포케톨라제 (PK)와 포스포트랜스아세틸라제 (PTA)가 프럭토스-6-포스페이트 (F6P)의 아세틸-CoA로의 변환하는 반응을 촉매하는, 메발로네이트 경로를 통한 글루코스의 파르네센으로의 변환에 있어, 탄소 및 대사 요구량의 최적의 흐름과 수율을 개략적으로 도시한 것이다.
도 8은 사카로마이세스 세레비지애 (Sacchormyces cerevisiae) (Sc. tHMG-CoA 리덕타제), 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii) (Pm.), 델프티아 액시도보란스 (Delftia acidovorans) (Da.) 및 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi) (Sp.) 유래 하이드록시메틸글루타릴-CoA 리덕타제의 NADPH-특이적인 또는 NADH-특이적인 활성을 제시한다 (nmol/mg/min로 측정함).
도 9는 야생형 ADH1, 및 ADH1 낫 아웃 (adh1Δ) 백그라운드 각각에서 NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 (Sc. tHMG-CoA 리덕타제) 또는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 (Pm. - 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii); Da. -- 델프티아 액시도보란스 (Delftia acidovorans); Sp. -- 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi))를 포함하는 이종의 MevT 경로를 구비한, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)(Sc.)의 24시간 및 48시간 이후의 세포 밀도 (OD600로 측정함)를 나타낸 것이다.
도 10은 야생형 ADH1, 및 ADH1 낫 아웃 백그라운드 각각에서, NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 (Sc. tHMG-CoA 리덕타제) 또는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 (Pm. -슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii); Da. -- 델프티아 액시도보란스 (Delftia acidovorans); Sp. -- 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi))를 포함하는 이종의 MevT 경로를 구비한, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)(Sc.)의 24시간 및 48시간 후 글리세롤 생산 (g/L로 측정함)을 나타낸 것이다.
도 11은 야생형 ADH1 및 ADH1 낫 아웃 (adh1Δ) 백그라운드 둘다에서, NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 (Sc. tHMG-CoA 리덕타제) 또는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 (Pm. -슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii); Da. -- 델프티아 액시도보란스 (Delftia acidovorans); Sp. -- 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi))를 포함하는 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)(Sc.)의 24시간 및 48시간 후 메발로네이트 생산 (g/L로 측정함)을 나타낸 것이다.
도 12는 (A) acs1Δ acs2 Δ ald6Δ가 커플링된 이종적으로 발현되는 ADA (Dz.eutE), 및 NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 또는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 중 어느 하나를 포함하는 MEV 경로; (B) 무손상 (야생형) PDH-바이패스, 및 NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 또는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 중 어느 하나를 포함하는 MEV 경로를 포함하는, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) 균주의 파르네센 생산과 세포 밀도를 나타낸 것이다. "Empty"로 표시된 막대는 배지만 (세포 무존재) 존재하는 웰이다.
도 13은 (A) 야생형 균주 (Y968); ADA (Dz.eutE)를 이종적으로 발현하는 균주 (Y12869); 및 (B) ADA (Dz.eutE), 포스포케톨라제 (PK)와 포스포트랜스아세틸라제 (PTA)를 이종적으로 발현하는 균주 (Y12745)에 의한, 글리세롤 생산 (상단 패널) 및 글루코스 소비 (하단 패널)를 도시한 것이다.
도 14는 무손상 (야생형) PDH-바이패스 또는 acs1Δ acs2 Δ ald6Δ가 커플링된 이종적으로 발현된 ADA (Dz.eutE) 중 어느 하나; 및 ERG10 (아세틸-CoA 티올라제) 또는 nphT7 (아세토아세틸-CoA 신타제) 중 어느 하나를 포함하는 MEV 경로를 포함하는, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) 균주에 의한 메발로네이트 생산을 도시한 것이다.
5.
5.1 용어
본원에서, 용어 "이종의"는, 통상 천연적으로 발견되지 않는 것을 지칭한다. 용어 "이종의 뉴클레오티드 서열"은 자연에서 소정의 세포에서 정상적으로 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이와 같이, 이종의 뉴클레오티드 서열은, (a) 이의 숙주 세포에 외래적 (즉, 세포에 "외인성")이거나; (b) 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지만 (즉, "내인성"), 세포에서 비천연적인 양으로 존재 (즉, 숙주 세포에서 천연적으로 확인되는 양 보다 많거나 적음)하거나; 또는 (c) 숙주 세포에서 본래 확인되지만 이의 본래의 위치에서 벗어난 위치에 있을 수 있다. 용어 "이종의 효소"는 자연에서 소정의 세포에서 정상적으로는 확인되지 않는 효소를 지칭한다. 이 용어는, (a) 소정의 세포에 외인성이고 (즉, 숙주 세포에 본래 존재하지 않거나 또는 해당 문맥에서 숙주 세포에서 본래 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨); 및 (b) 숙주 세포에서 본래 발견되지만 (예, 효소가 세포에 내인성인 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩됨), 숙주 세포에서 비정상적인 양 (예, 본래 확인되는 양 보다 많거나 적게)으로 제조되는 효소를 포괄한다.
한편, 본원에서, 분자, 특히 효소 및 핵산에 대한 "천연적인" 또는 "내인성"이라는 언급의 용어는, 천연 미생물에서 분자의 발현 수준 보다 낮거나, 동일하거나 또는 높을 수 있는 발현 수준과는 무관하게, 자연에서 기원하거나 발견되는 유기체에서 발현되는 분자를 지칭한다. 천연 효소 또는 폴리뉴클레오티드의 발현은 재조합 미생물에서 변형될 수 있는 것으로 이해된다.
본원에서, 타겟 유전자, 예컨대 PDH-바이패스의 하나 이상의 유전자의, 예컨대 "기능적으로 파괴한다" 또는 "기능적 파괴"는, 타겟 유전자가, 타겟 유전자에 의해 코딩된 단백질의 활성을 숙주 세포에서 낮추는 방식으로 변형되는 것을 의미한다. 마찬가지로, 타겟 단백질, 예를 들어 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소를, 예컨대, "기능적으로 파괴한다" 또는 "기능적 파괴"는, 타겟 단백질이 단백질의 활성을 숙주 세포에서 낮추는 방식으로 변형되는 것을 의미한다. 일부 구현예들에서, 타겟 유전자에 의해 코딩되는 타겟 단백질의 활성이 숙주 세포에서 소거된다. 다른 구현예들에서, 타겟 유전자에 의해 코딩되는 타겟 단백질의 활성이 숙주 세포에서 감소된다. 타겟 유전자의 기능적 파괴는, 유전자 발현이 없어지거나 감소되도록, 또는 유전자 산물의 활성이 사라지거나 감소되도록, 유전자 전체 또는 일부를 결손시킴으로써 달성될 수 있다. 또한, 타겟 유전자의 기능적 파괴는, 발현이 소거 또는 감소되도록 유전자의 조절 인자, 예컨대, 유전자의 프로모터를 돌연변이시키거나, 또는 유전자 산물의 활성이 없어지거나 또는 감소되도록 유전자의 코딩 서열을 돌연변이시킴으로써, 달성될 수 있다. 일부 구현예들에서, 타겟 유전자의 기능적 파괴로 타겟 유전자의 오픈 리딩 프레임 전체가 제거된다.
본원에서, 용어 "부모 세포"는, 변형된 숙주 세포에서 조작되는 한가지 이상의 특정 유전자에 대한 변형, 예컨대, ADA의 이종 발현, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제의 이종 발현, AACS의 이종 발현, 포스포케톨라제의 이종 발현, 포스포트랜스아세틸라제의 이종 발현 및 메발로네이트 경로의 하나 이상의 효소의 이종 발현으로 이루어진 군으로부터 선택되는 한가지 이상의 변형을 포함하지 않는다는 것을 제외하고는, 본원에 언급된 유전자 변형된 숙주 세포와 동일한 유전자 백그라운드를 가지는 세포를 지칭한다.
본원에서, 용어 "생산"은 일반적으로 본원에 제시된 유전자 변형된 숙주 세포에 의해 제조되는 일정량의 이소프레노이드를 지칭한다. 일부 구현예들에서, 생산은 숙주 세포의 이소프레노이드의 수율로서 표시된다. 다른 구현예들에서, 생산은 이소프레노이드 생산에 대한 숙주 세포의 생산성으로 표시된다.
본원에서, 용어 "생산성"은, 숙주 세포를 경시적으로 (시간 당) (부피) 배양한 발효 배지 양 당 제조되는 이소프레노이드 (중량) 양으로 표시되는, 숙주 세포에 의한 이소프레노이드의 생산을 지칭한다.
본원에서, 용어 "수율"은 숙주 세포에 의해 소비되는 탄소원의 양 당 생산되는 이소프레노이드의 양을 중량으로 표시한, 숙주 세포에 의한 이소프레노이드의 생산을 지칭한다.
5.2 아세틸-CoA로부터 이소프레노이드를 제조하는 유전자 변형된 미생물
5.2.1 숙주 세포
본원에 제공되는 숙주 세포에 유용한 조성물과 방법은 고세균 (archae), 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다.
적합한 원핵생물 숙주로는, 비제한적인 예로, 다양한 그람-양성, 그람-음성 또는 그람-가변성 박테리아 모두를 포함한다. 예로는, 비제한적으로, 다음의 속에 속하는 세포를 포함한다: 아그로박테리움 (Agrobacterium), 알리사이클로바실러스 (Alicyclobacillus), 아나바에나 (Anabaena), 아나시스티스 (Anacystis), 아르트로박터 (Arthrobacter), 아조박터 (Azobacter), 바실러스 (Bacillus), 브레비박테리움 (Brevibacterium), 크로마티움 (Chromatium), 클로스트리듐 (Clostridium), 코리네박테리움 (Corynebacterium), 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 에스케리키아 (Escherichia), 락토바실러스 (Lactobacillus), 락토코커스 (Lactococcus), 메소리조븀 (Mesorhizobium), 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 마이크로박테리움 (Microbacterium), 포르미듐 (Phormidium), 슈도모나스 (Pseudomonas), 로도박터 (Rhodobacter), 로도슈도모나스 (Rhodopseudomonas), 로도스피릴룸 (Rhodospirillum), 로도코커스 (Rhodococcus), 살모넬라 (Salmonella), 세네데스문 (Scenedesmun), 세라티아 (Serratia), 시겔라 (Shigella), 스타플로코커스 (Staphlococcus), 스트렙토마이세스 (Strepromyces), 신네코쿠스 (Synnecoccus) 및 자이모모나스 (Zymomonas). 원핵생물 균주의 예로는, 비제한적으로, 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis), 바실러스 아밀로리퀘팍시네스 (Bacillus amyloliquefacines), 브레비박테리움 암모니아게네스 (Brevibacterium ammoniagenes), 브레비박테리움 임마리오필럼 (Brevibacterium immariophilum), 클로스트리듐 베이예린키이 (Clostridium beigerinckii), 엔테로박터 사카자키 (Enterobacter sakazakii), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis), 메소리조쥼 로티 (Mesorhizobium loti), 슈도모나스 에어루지노사 (Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii), 슈도모나스 푸디카 (Pseudomonas pudica), 로도박터 캡슐라투스 (Rhodobacter capsulatus), 로도박터 스페어로이데스 (Rhodobacter sphaeroides), 로도스피릴룸 루브럼 (Rhodospirillum rubrum), 살모넬라 엔테리카 (Salmonella enterica), 살모넬라 티피 (Salmonella typhi), 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium), 시겔라 다이센테리아 (Shigella dysenteriae), 시겔라 플렉스네리 (Shigella flexneri), 시겔라 소네이 (Shigella sonnei) 및 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)를 포함한다. 특정 구현예에서, 숙주 세포는 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 세포이다.
적합한 고세균 숙주로는, 비제한적인 예로, 다음과 같은 속에 속하는 세포를 포함한다: 에어로피룸 (Aeropyrum), 아르케글로부스 (Archaeglobus), 할로박테리움 (Halobacterium), 메타노코커스 (Methanococcus), 메타노박테리움 (Methanobacterium), 피로코커스 (Pyrococcus), 설폴로부스 (Sulfolobus), 및 써모플라스마 (Thermoplasma). 고세균 균주의 예로는, 비제한적으로, 아르케오글로부스 풀기두스 (Archaeoglobus fulgidus), 할로박테리움 (Halobacterium) sp., 메타노코커스 야나스키 (Methanococcus jannaschii), 메타노박테리움 써모오토트로피쿰 (thermoautotrophicum), 써모플라스마 액시도필룸 (Thermoplasma acidophilum), 써모플라스마 볼카늄 (Thermoplasma volcanium), 피로코커스 호리코시 (Pyrococcus horikoshii), 피로코커스 아비시 (Pyrococcus abyssi) 및 에어로피룸 퍼닉스 (Aeropyrum pernix)를 포함한다.
적합한 진핵생물의 숙주로는, 비제한적인 예로, 진균 세포, 해조류 세포, 곤충 세포 및 식물 세포를 포함한다. 일구 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용가능한 효모는 미생물 기탁 기관 (예, IFO, ATCC 등)에 기탁되었으며, 다음과 같은 속에 속하는 효모를 포함한다: 특히, 액시쿨로코니듐 (Aciculoconidium), 암브로시오지마 (Ambrosiozyma), 아르트로아스쿠스 (Arthroascus), 아릭시오지마 (Arxiozyma), 아쉬비아 (Ashbya), 바브제비아 (Babjevia), 벤싱토니아 (Bensingtonia), 보트리오아스쿠스 (Botryoascus), 보트리오지마 (Botryozyma), 브레타노마이세스 (Brettanomyces), 불레라 (Bullera), 불레로마이세스 (Bulleromyces), 칸디다 (Candida), 시테로마이세스 (Citeromyces), 클라비스포라 (Clavispora), 크립토코커스 (Cryptococcus), 시스토필로바시듐 (Cystofilobasidium), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 데카라 (Dekkara), 디포다스콥시스 (Dipodascopsis), 디포다스쿠스 (Dipodascus), 에니엘라 (Eeniella), 엔도마이콥셀라 (Endomycopsella), 에레마스쿠스 (Eremascus), 에레모테시움 (Eremothecium), 에리트로바시듐 (Erythrobasidium), 펠로마이세스 (Fellomyces), 필로바시듐 (Filobasidium), 갈락토마이세스 (Galactomyces), 제오트리쿰 (Geotrichum), 귈리리에르몬델라 (Guilliermondella), 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 한세눌라 (Hansenula), 하세가와이 (Hasegawaea), 폴터마니아 (Holtermannia), 호르모아스쿠스 (Hormoascus), 하이포피키아 (Hyphopichia), 이사첸티아 (Issatchenkia), 클로엑케라 (Kloeckera), 클로엑케라스포라 (Kloeckeraspora), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 콘도아 (Kondoa), 쿠라이시아 (Kuraishia), 쿠르츠마모마이세스 (Kurtzmanomyces), 루코스포리듐 (Leucosporidium), 리포마이세스 (Lipomyces), 로데로마이세스 (Lodderomyces), 말라세지아 (Malassezia), 메츠니코위아 (Metschnikowia), 므라키아 (Mrakia), 믹소지마 (Myxozyma), 나드소니아 (Nadsonia), 나카자와이 (Nakazawaea), 네마토스포라 (Nematospora), 오가타에 (Ogataea), 오스포리디움 (Oosporidium), 파키솔렌 (Pachysolen), 파키티코스포라 (Phachytichospora), 파피아 (Phaffia), 피키아 (Pichia), 로도스포리듐 (Rhodosporidium), 로도토룰라 (Rhodotorula), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 사카로마이코데스 (Saccharomycodes), 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis), 사이토엘라 (Saitoella), 사카구키아 (Sakaguchia), 사투라노스포라 (Saturnospora), 스키조블라스토스포리온 (Schizoblastosporion), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 슈반니오마이세스 (Schwanniomyces), 스포리디오볼루스 (Sporidiobolus), 스포로볼로마이세스 (Sporobolomyces), 스포로파키더미아 (Sporopachydermia), 스테파노아스쿠스 (Stephanoascus), 스테리그마토마이세스 (Sterigmatomyces), 스테리그마토스포리듐 (Sterigmatosporidium), 심비오타프리나 (Symbiotaphrina), 심포디오마이세스 (Sympodiomyces), 심포디오마이콥시스 (Sympodiomycopsis), 토룰라스포라 (Torulaspora), 트리코스포리엘라 (Trichosporiella), 트리코스포론 (Trichosporon), 트리고놉시스 (Trigonopsis), 츠키야에아 (Tsuchiyaea), 우데니오마이세스 (Udeniomyces), 발토마이세스 (Waltomyces), 윅커하미아 (Wickerhamia), 윅커하미엘라 (Wickerhamiella), 빌리옵시스 (Williopsis), 야마다지마 (Yamadazyma), 야로위니아 (Yarrowia), 자이고아스쿠스 (Zygoascus), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 자이고빌리옵시스 (Zygowilliopsis), 및 자이고지마 (Zygozyma).
일부 구현예에서, 숙주 미생물은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 피키아 패스토리스 (Pichia pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 데케라 브룩셀렌시스 (Dekkera bruxellensis), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) (기존에는 사카로마이세스 락티스 (Saccharomyces lactis)로 지칭됨), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluveromyces marxianus), 아르술라 아데니니보란스 (Arxula adeninivorans), 또는 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha) (피키아 앙구스타 (Pichia angusta)라고도 함)이다. 일부 구현예에서, 숙주 미생물은 칸디다 (Candida) 속의 균주, 예컨대 칸디다 리폴리티카 (Candida lipolytica), 칸디다 길리어몬디이 (Candida guilliermondii), 칸디다 크루세이 (Candida krusei), 칸디다 슈도트로피칼리스 (Candida pseudotropicalis) 또는 칸디다 유틸리스 (Candida utilis)이다.
특정 구현예에서, 숙주 미생물은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)이다. 일부 구현예들에서, 숙주는 빵 효모, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1 및 AL-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주이다. 일부 구현예들에서, 숙주 미생물은 PE-2, CAT-1, VR-1, BG-1, CR-1 및 SA-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주이다. 특정 구현예에서, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주는 PE-2이다. 다른 특정 구현예에서, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주는 CAT-1이다. 다른 특정 구현예에서, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주는 BG-1이다.
일부 구현예들에서, 숙주 미생물은 산업 발효에 적합한 미생물이다. 특정 구현예에서, 미생물은, 산업 발효 환경에서 공인된 스트레스 조건인, 용매 고농도, 고온, 확장된 기질 이용성, 영양 제한, 당 및 염으로 인한 삼투 스트레스, 산도, 설파이트 및 박테리아 오염 또는 이들의 조합 하에 존속하도록 조건화된다.
5.2.2 아세틸-CoA를 제조하기 위한 이종의 ADA
일 측면에서, 본 발명은, 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제 (이명. "아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화," "아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아실화," 또는 ADA (EC 1.2.1.10))를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 아세틸-CoA 유래 이소프레노이드를 제조할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포를 제공한다.
본원에 제공되는 조성물 및 방법에 사용가능한 이 방법을 촉매할 수 있는 단백질은 다음과 같은 4가지 유형의 단백질을 포함한다:
(1) 아세틸-CoA의 아세트알데하이드로의 가역적인 변환과, 후속적인 아세트알데하이드의 에탄올로의 가역적인 변환을 촉매하는, 2가지 기능의 단백질. 이 유형의 단백질의 예는 E. coli의 AdhE 단백질 (Gen Bank No: NP_415757)이다. AdhE는 유전자 융합체의 진화 산물인 것으로 보인다. AdhE 단백질의 NH2-말단 영역은 알데하이드:NAD+ 옥시도리덕타제에 대해 상동성이 높은 반면, COOH-말단 영역은 Fe2+-의존성 에탄올:NAD+ 옥시도리덕타제 패밀리에 상동적이다 (Membrillo-Hernandez et al., (2000) J. Biol. Chem. 275: 33869-33875). E. coli AdhE는 금속-촉매성 산화를 수행하며, 따라서, 산소에 민감하다 (Tamarit et al. (1998) J. Biol. Chem. 273:3027-32).
(2) 엄격 또는 선택적인 혐기성 미생물에서 아세틸-CoA의 아세트알데하이드로의 가역적인 변환을 촉매하지만, 알코올 데하이드로게나제 활성은 가지지 않는, 단백질. 이 유형의 단백질에 대한 예는 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri)에서 보고된 바 있다 (Smith et al. (1980) Arch. Biochem. Biophys. 203: 663-675). ADA는 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri) DSM 555의 게놈 (등재번호: EDK33116)에 주석으로 달려 있다. 상보적인 단백질 AcdH는 락토바실러스 플라타룸 (Lactobacillus plantarum)의 게놈에서 확인된다 (등재 번호: NP_784141). 이 유형의 단백질에 대한 다른 예는 클로스트리듐 베이예린키이 (Clostridium beijerinckii) NRRL B593의 ald 유전자 산물이다 (Toth et al. (1999) Appl. Environ. Microbiol. 65: 4973-4980, 등재 번호: AAD31841).
(3) 에탄올아민 이화 작용에 참여하는 단백질. 에탄올아민은 다수의 장내세균들이 탄소원 및 질소원으로 이용할 수 있다 (Stojiljkovic et al. (1995) J. Bacteriol. 177: 1357-1366). 에탄올아민은 먼저 에탄올아민 암모니아 리아제에 의해 암모니아와 아세트알데하이드로 변환된 다음, 아세트알데하이드는 ADA에 의해 아세틸-CoA로 변환된다. 이 유형의 ADA의 예가 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium)의 EutE 단백질이다 (Stojiljkovic et al. (1995) J. Bacteriol. 177: 1357-1366, 등재 번호: AAL21357; U18560.1도 참조함). 또한, E. coli는 에탄올아민을 이용할 수 있으며 (Scarlett et al. (1976) J. Gen. Microbiol. 95:173-176), 살모넬라 티피무리움 (S. typhimurium)의 EutE 단백질과 상동적인 EutE 단백질을 가지고 있다 (등재 번호: AAG57564; U897722.1).
(4) 4-하이드록시-2-케토발레레이트 이화작용에 관여하는 2가지 기능의 알돌라제-데하이드로게나제 복합체의 일부인 단백질. 상기한 2가지 기능의 효소는, 다수 박테리아 종들에서 페놀, 톨레이트, 나프탈렌, 바이페닐 및 그외 방향족 화합물의 분해의 중간산물인, 카테콜의 메타-절단 경로의 마지막 2 단계를 촉매한다 (Powlowski and Shingler (1994) Biodegradation 5, 219-236). 4-하이드록시-2-케토발레레이트는 4-하이드록시-2-케토발레레이트 알돌라제에 의해 먼저 피루베이트와 아세트알데하이드로 변환된 다음, ADA에 의해 아세트알데하이드는 아세틸-CoA로 변환된다. 이 유형의 ADA의 예가 슈도모나스 (Pseudomonas) sp CF600의 DmpF 단백질 (등재 번호: CAA43226)이다 (Shingler et al. (1992) J. Bacteriol. 174:71 1-24). E. coli는 슈도모나스 (Pseudomonas) sp. CF600의 DmpF 단백질에 상동적인 MphF 단백질을 가지고 있다 (Ferrandez et al. (1997) J. Bacteriol. 179: 2573-2581, 등재 번호: NP_414885).
일부 구현예들에서, 본원에 기술된 조성물 및 방법에 사용가능한 ADA (또는 이러한 활성을 코딩하는 핵산 서열)는, 국제 출원 공개번호 WO 2009/013159에 기술된 바와 같이, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) adhE, 엔타모에바 히스톨리티카 (Entamoeba histolytica) adh2, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) adhE, 피로마이세스 (Piromyces) sp.E2 adhE, 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri) (EDK33116), 락토바실러스 플라타룸 (Lactobacillus plantarum) acdH 및 슈도모나스 푸티타 (Pseudomonas putida) (YP 001268189)로 이루어진 군으로부터 선택되며, 이들은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 일부 구현예들에서, ADA는 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum) eutE (FR745875.1), 데설포탈리에 피크로필라 ( Desulphotalea psychrophila) eutE (CR522870.1), 액시네토박터 (Acinetobacter) sp. HBS-2 eutE (ABQ44511.2), 칼디트릭스 아비시 (Caldithrix abyssi) eutE (ZP_09549576) 및 할로루브룸 라쿠스프로푼디 (Halorubrum lacusprofundi) ATCC 49239 (YP_002565337.1)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 본원에 제공되는 조성물 및 방법에 사용가능한 ADA는 딕케야 지아 (Dickeya zeae)의 eutE이다. 딕케야 지아 (Dickeya zeae)의 대표적인 eutE 뉴클레오티드 서열은 등재 번호 NC_012912.1:1110476..1111855와 본원에 제시된 서열번호 1을 포함한다. 딕케야 지아 (Dickeya zeae)의 대표적인 eutE 단백질 서열은 등재 번호 YP_003003316 및 본원에 제공된 서열번호 2를 포함한다.
또한, 본원에 제공된 조성물 및 방법에 유용한 ADA는 본원에 기술된 임의의 ADA의 "유도체"로 지칭될 수 있는 분자를 포함한다. 이러한 "유도체"는 다음과 같은 특징을 가진다: (1) 본원에 기술된 임의의 ADA와 상당한 상동성을 고유함, (2) 아세트알데하이드의 아세틸-CoA로의 변환을 촉매할 수 있음. ADA의 유도체는, 이 유도체의 아미노산 서열이 본원에 기술된 임의의 ADA와 80% 이상, 85% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일하다면, ADA와 "실질적인 상동성"을 공유하는 것으로 지칭된다.
5.2.2.1 기능성 ADA를 동정하는 방법
다른 측면에서, 본 발명은 생체내 성능이 강화된 ADA를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 스크리닝 방법에서, 생체내 성능이 강화된 ADA는 조작된 숙주 세포를 세포 사멸로부터 구제하는 능력으로 동정한다. 조작된 숙주 세포는 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물, 예컨대, 이소프레노이드를 제조하는 이종 경로를 포함한다. 일부 구현예들에서, 조작된 숙주 세포는 기능적으로 파괴된 PDH-바이패스 경로와 활성이 약한 ADA를 추가로 포함하며, 여기서 기능적으로 파괴된 PDH-바이패스 경로와 활성이 약한 ADA의 조합 작용은, (1) 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물; 및 (2) 세포 생존, 건강 및/또는 생육에 필요한 세포질 아세틸-CoA 유래 일차 대사산물의 생산 요구성을 충족시킬 만큼 충분히 세포질 아세틸-CoA를 제조하지 못한다. 생존, 건강 및/또는 생육을 위해, 따라서, 숙주 세포는 세포질 아세틸-CoA를 증가된 풀로 제조할 수 있는 활성형 ADA를 필요로 한다.
일부 구현예들에서, 생체내 성능이 강화된 ADA의 스크리닝 방법은,
(a) 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물을 증가된 수준으로 제조하도록 기능적으로 파괴된 PDH-바이패스 경로를 가진 숙주 세포에서 대조군 ADA를 발현시키는 단계로서, 상기 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물이 증가된 수준으로 제조되면 상기 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물이 증가된 수준으로 제조하지 않는 부모 세포에 비해, 상기 숙주 세포의 생존성 (viability)이 감소되는 것인 단계; 및
(b) 상기 대조군 ADA 대신 테스트 ADA를 상기 숙주 세포에서 발현시키는 단계로서, 이로써 상기 대조군 ADA를 발현하는 상기 숙주 세포에 비해 상기 ADA를 발현하는 상기 숙주 세포의 생존성 증가가, 상기 대조군 ADA에 비해 증가된 생체내 성능을 가지는 것으로서 상기 테스트 ADA를 식별하는 단계를 포함한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포에서 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물의 수준은 유도 가능하다. 유도는 유도제 (예, 갈락토스) 또는 특이 배양 조건 (예, 배양 온도)에 반응하여 이루어질 수 있다. 유도제가 존재하지 않는 조건에서 배양하면, 숙주 세포의 ADA 활성은 숙주 세포가 생존하는데 필요한 세포질 아세틸-CoA을 생산하는데 충분하다. 그러나, 유도제의 존재 하에 배양하면, 숙주 세포의 ADA 활성은 숙주 세포가 생존하는데 필요한 세포질 아세틸-CoA와 증가된 수준의 세포질 아세틸-CoA로부터 유래된 이차 대사산물을 둘다 생산하기에는 충분하지 않다. 후자의 경우, 숙주 세포는 세포질 아세틸-CoA를 증가된 풀로서 생산할 수 있는 더 강한 활성을 가진 ADA가 생존을 위해 필요로 한다. 숙주 세포에서 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물의 생산은 부모 세포에서의 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물의 생산에 대해 약 10% 내지 적어도 약 1,000배, 또는 그 보다 높을 수 있다.
부모 세포와 비교하여, 대조군 ADA를 발현하는 숙주 세포의 생존성 감소는 세포 증식 감소 내지 치사 수준일 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 대조군 ADA를 발현하는 숙주 세포는 부모 세포에 비해 액체 배지 또는 아가 플레이트에서 후손 세포를 수적으로 감소된 수로 생산한다. 다른 구현예들에서, 대조군 ADA를 발현하는 숙주 세포는 부모 세포에 비해 액체 배지 또는 아가 플레이트에서 후손 세포를 생산하지 않는다. 즉, 대조군 ADA 대신 테스트 ADA를 발현하는 숙주 세포의 생존성 증가는, 대조군 ADA를 발현하는 숙주 세포에 의해 생산되는 후손 세포의 수 또는 콜로니 크기와 비교하여, 더 많은 수의 후손 세포로 액체 배지에서, 또는 보다 큰 콜로니 크기로 아가 플레이트에서 명백할 수 있다.
숙주 세포에서 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물 또는 이의 전구체의 생산에 관여하는 효소의 발현 및/또는 활성의 변형을 통해, 숙주 세포에서 세포질 아세틸-CoA로부터 유래되는 증가된 수준의 이차 대사산물의 생산에 영향을 가할 수 있다. 일부 이러한 구현예들에서, MEV 또는 DXP 경로의 효소의 발현 및/또는 활성을 변형시킨다. 일부 이러한 구현예들에서, HMG-CoA 리덕타제 및/또는 메발로네이트 키나제의 발현 및/또는 활성을 변형시킨다.
대조군 ADA 및 테스트 ADA는 천연성 ADA 또는 비-천연성 ADA일 수 있다. 일부 구현예들에서, 테스트 ADA는, 대조군 ADA와 하나 이상의 아미노산의 치환, 결손 및/또는 부가 차이가 있는, 대조군 ADA의 변이체이다. 일부 구현예들에서, 테스트 ADA는 대조군 ADA와 동일한 아미노산을 포함하지만, 이들 아미노산을 코딩하는 코돈들이 테스트 ADA와 대조군 ADA 간에 상이하다. 일부 이러한 구현예들에서, 코돈은 숙주 세포에서의 사용 (usage)을 최적화한다. 일부 구현예들에서, 대조군 ADA ?/또는 테스트 ADA는 피루베이트 데카르복실라제에 융합된다. 일부 구현예들에서, 테스트 ADA의 발현은 강력한 프로모터의 조절성 통제를 받는다. 일부 구현예들에서, 테스트 ADA의 발현은 중간 세기의 프로모터의 조절성 통제를 받는다. 일부 구현예들에서, 테스트 ADA의 발현은 약한 프로모터의 조절성 통제를 받는다.
테스트 ADA의 존재 하에 숙주 세포의 생존성 증가는 대조군 보다 활성이 강한 테스트 ADA 또는 대조군 ADA와 활성이 비슷하거나 낮지만 보다 많이 발현되는 테스트 ADA에 의해 달성될 수 있다. 활성이 증가된 테스트 ADA의 동정은 숙주 세포에서 비슷한 수준으로 대조군 ADA와 테스트 ADA를 발현시킴으로써 달성할 수 있다. 이는, 예를 들어, 동일한 조절 인자들의 통제를 받도록 숙주 세포에서 대조군 ADA와 테스트 ADA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 위치시킴으로써, 달성할 수 있다. 상기한 방법이, 예를 들어, 원하는 발현 수준을 제공하는 조절 인자 (예, 프로모터)를 동정하기 위해 사용되는, 다른 구현예들에서, 테스트 ADA는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 상으로는 대조군 ADA와 차이가 없지만 발현 수준에는 차이가 있다. 이러한 구현예들에서, 대조군 ADA와 테스트 ADA를 발현하기 위해 다른 조절 인자들을 사용할 수 있으며, 숙주 세포의 생존성 비교를 통해 테스트 ADA의 활성에 대한 정보는 제공하지 않지만, 테스트 ADA의 발현을 구동하는 조절 인자들의 세기에 대한 정보는 제공할 수 있다.
개선된 ADA 변이체라기 보다는 증식 촉진 돌연변이를 포함하는 빠른 증식성 위 양성 숙주 세포가 숙주 세포 배양물이 되는 경쟁적인 배양 상황을 방지하기 위해, 스크리닝 방법에 대한 일 구현예는 아가-플레이트를 이용한 선별 시스템을 포함한다. 이러한 구현예에서, 숙주 세포를 아가 플레이트 상에 도말하고, 생체내 성능이 향상된 테스트 ADA 변이체를 포함하는 숙주 세포를 콜로니 증식에 의해 동정한다.
본원에 기술된 스크리닝 방법의 실질적인 이점은 단순성과 높은 효율의 구현력이다. ADA 변이체는 단순히 세포 생존성으로 동정하므로, 다른 비용이 많이 들고 시간이 소요되는 스크리닝 방법들이 실제 필요없다. 즉, 일 구현예에서, 본 방법은 생체내 성능이 개선된 ADA 변이체들에 대해 ADA 변이체 콜렉션 (예, 돌연변이 ADA 라이브러리)을 스크리닝하는데 사용된다. 이러한 구현예에서, 숙주 세포는 단일한 테스트 ADA를 발현하진 않지만, 숙주 세포의 콜렉션은 테스트 ADA의 콜렉션을 발현한다. 숙주 세포를 이 후 아가 플레이트에서 배양할 수 있으며, 생체내 성능이 개선된 ADA 변이체를 발현하는 숙주 세포를 콜로닝 배양을 토대로 동정할 수 있다. 일부 구현예들에서, ADA 변이체 콜렉션은 ADA 변이체를 2 - 5, 5 - 10, 10 - 50, 50 - 100, 100 - 500, 500 - 1,000, 1,000 - 10,000, 10,000 - 100,000, 100,000 - 1,000,000개로, 그리고 더 많은 수로 포함한다.
본원에 기술된 스크리닝 방법의 다른 주요 이점인, 반복적인 양상으로 보다 우수한 ADA 변이체를 선별하는 이의 지속적인 역량으로서, 여기서, 반복을 통해 동정된 테스트 ADA는 이후의 반복에서는 대조군 ADA로서 사용된다. 이러한 구현예는, 그러나, 각 반복에서, 숙주 세포에서 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물의 생산을 체크하고, 숙주 세포가 새로운 대조군 ADA (즉, 이전의 반복에서의 테스트 ADA임)를 발현하는 경우, (예컨대, 효소의 발현 수준을 높이거나 낮춤으로써, 효소를 부가 또는 제거함으로써, 유전자의 카피 수를 높이거나 낮춤으로써, 효소의 발현을 조절하는 프로모터를 치환함으로써, 또는 유전자 돌연변이에 의해 효소를 변형시킴으로써), 생존성 감소를 유발하는 수준으로 잠재적으로 증가시킨다. 다른 예로, 또는 아울러, 각 반복에서, 감소된 대조군 ADA 활성을 제공하기 위해 (예, 발현을 낮추거나, 더 약한 프로모터를 사용하거나, 또는 대조군 ADA 전사체 또는 폴리펩타이드의 안정성을 낮춤으로써) 대조군 ADA의 발현을 감소시킬 수 있다. 다음번 반복에서, 이전 반복의 테스트 ADA와 비교하여 생체내 성능이 증가된 테스트 ADA를 동정할 수 있다.
본원에 기술된 스크리닝 방법의 다른 주된 이점은 시험관내 보다는 생체내에서 개선된 ADA의 선별이 이루어진다는 것이다. 그 결과, ADA 변이체의 생체내 성능을 강화하는 복수의 효소 특성들에 대한 개선을 수득할 수 있다.
본원에 기술된 스크리닝 방법을 이용하여 개발된 효소는, 비제한적인 예로, 형광 스크린 및/또는 기체 크로마토그래피에 의한 세포질 아세틸-CoA 유래 이차 대사산물의 직접 정량화 등의, 다른 선택적인 스크리닝 방법으로 수행할 수 있다. 보다 구체적으로, 이는 파르네센 등의 세스퀴테르펜 생산을 측정하기 위한 나일 레드-기반의 고효율의 형광 분석, 및 피르네센 등의 세스퀴테르펜의 역가를 측정하기 위한 기체 크로마토그래피 (GC)를 이용한 직접 정량화를 포함한다. 또한, 개선된 효소는 유도성 돌연변이 등의 유전자 조작 방법으로 추가로 개선시킬 수 있다. 이로써, 최종 효소 성능을 강화하는 효소의 여러 특성들을 순차적으로 개선시킴으로써, 가장 효과적인 효소 변이체를 동정한다.
5.2.3 PDH-바이패스의 기능적 파괴
아세틸-CoA는 PDH 복합체에 의해 촉매되는 피루베이트의 산화적 데카르복시화에 의해 미토콘드리아에서 형성될 수 있다. 그러나, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)가 미토콘드리아 밖으로 아세틸-CoA를 이동시키지 못하기 때문에, PDH 바이패스는 세포질 구획에 아세틸-CoA를 제공하는데 필수적인 역할을 하며, 피루베이트를 아세틸-CoA로 변환하는 PDH 반응에 대한 대안 경로를 제공한다. PDH 바이패스에는, 효소 피루베이트 데카르복실라제 (PDC; EC 4.1.1.1), 아세트알데하이드 데하이드로게나제 (ACDH; EC 1.2.1.5 및 EC 1.2.1.4), 및 아세틸-CoA 신테타제 (ACS; EC 6.2.1.1)가 참여한다. 피루베이트 데카르복실라제는 피루베이트의 아세트알데하이드와 이산화탄소로의 데카르복시화를 촉매한다. 아세트알데하이드 데하이드로게나제는 아세트알데하이드를 아세트산으로 산화한다. 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)에서, 알데하이드 데하이드로게나제 패밀리는 5종의 멤버를 포함한다. ALD2 (YMR170c), ALD3 (YMR169c) 및 ALD6 (YPL061w)는 세포질 이소형이며, ALD4 (YOR374w) 및 ALD5 (YER073w)는 미토콘드리아 효소를 코딩한다. 주요 세포질 아세트알데하이드 데하이드로게나제 이소형은 ALD6에 의해 코딩된다. 아세테이트로부터 아세틸-CoA의 형성은 ACS에 의해 촉매되며, ATP의 가수분해를 수반한다. 2종의 구조 유전자 ACS1과 ACS2에 의해 ACS가 코딩된다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 PDH-바이패스 경로의 하나 이상의 유전자에 대한 기능적 파괴를 포함한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포의 PDH-바이패스의 하나 이상의 유전자에 대한 파괴로, 다음과 같은 한가지 이상의 반응을 촉매하는 능력이 손상된 유전자 변형된 미생물 세포가 만들어진다: (1) 피루베이트 데카르복실라제에 의한 피루베이트의 아세트알데하이드로의 데카르복시화; (2) 아세트알데하이드 데하이드로게나제에 의한 아세트알데하이드의 아세테이트로의 변환; 및 (3) 아세틸-CoA 신테타제에 의한 아세테이트 및 CoA로부터 아세틸-CoA의 합성.
일부 구현예들에서, 부모 세포와 비교하여, 숙주 세포는 PDH-바이패스 경로의 하나 이상의 유전자에 대한 기능적 파괴를 포함하며, 여기서, 감소된-기능적 또는 비-기능적 PDH-바이패스 경로의 활성은 단독으로 또는 약한 ADA와의 조합시, 숙주 세포의 증식, 생존성 및/또는 건강을 뒷받침하는데 충분하지 않다.
일부 구현예들에서, PDH-바이패스의 하나 이상의 내인성 단백질의 활성 또는 발현은 약 50% 이상까지 감소된다. 다른 구현예에서, PDH-바이패스의 하나 이상의 내인성 단백질의 활성 또는 발현은, PDH-바이패스의 하나 이상의 내인성 단백질의 활성 또는 발현에 대한 감소 또는 결손을 포함하지 않는 재조합 미생물에 비해, 약 60% 이상까지, 약 65% 이상까지, 약 70% 이상까지, 약 75% 이상까지, 약 80% 이상까지, 약 85% 이상까지, 약 90% 이상까지, 약 95% 이상까지, 또는 약 99% 이상까지 감소된다.
당해 기술 분야의 당업자가 숙지하는 바와 같이, PDH-바이패스의 단백질 등의 단백질의 활성을 감소 또는 파괴하는데 유용한 수 종의 기전들, 비제한적인 예로, 조절된 프로모터의 사용, 약한 구성적인 프로모터의 사용, 이배체 효모에서 단백질을 코딩하는 유전자 2 카피 중 한개 파괴, 이배체 효모에서 유전자 카피 모두의 파괴, 안티센스 핵산의 발현, siRNA의 발현, 내인성 프로모터의 네거티브 조절인자의 과다 발현, 내인성 또는 이종 유전자의 활성 변형, 비활성이 낮은 이종 유전자의 사용 등 또는 이들의 조합들이 존재한다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 PDH-바이패스의 단백질을 코딩하는 하나 이상의 유전자에 대한 돌연변이를 포함하며, 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드는 활성이 저하된다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 PDH-바이패스의 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 파괴를 포함하며, 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드는 활성이 저하된다. 다른 구현예에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 PDH-바이패스 단백질을 코딩하는 유전자의 전체 결손을 포함하며, 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드는 활성이 저하된다. 또 다른 구현예로, 유전자 변형된 숙주 세포는 PDH-바이패스의 단백질을 코딩하는 유전자와 관련된 조절 영역의 변형을 포함하며, 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드는 발현이 저하된다. 또 다른 구현예로, 유전자 변형된 숙주 세포는, PDH-바이패스의 단백질을 코딩하는 유전자의 전사 감소를 야기하는, 전사 조절인자의 변형을 포함한다. 또 다른 구현예로, 유전자 변형된 숙주 세포는, PDH-바이패스의 단백질을 코딩하는 모든 유전자들에 대한 돌연변이를 포함하며, 이로써, 상기 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드(들)의 활성이 감소된다. 일 구현예에서, PDH-바이패스의 단백질의 활성 또는 발현이 약 50% 이상 감소된다. 다른 구현예에서, PDH-바이패스의 단백질의 활성 또는 발현이, PDH-바이패스의 단백질의 활성 또는 발현 감소를 포함하지 않는 재조합 미생물과 비교하여, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 또는 약 99% 이상 감소된다.
일부 구현예들에서, PDH-바이패스의 하나 이상의 유전자 파괴는, 미생물 세포에 구조체를 도입하였을 때 PDH-바이패스의 유전자를 특이적으로 파괴함으로써 파괴된 유전자에 비-기능성을 부여할 수 있는, "파괴 구조체"를 이용함으로써 달성된다. 일부 구현예들에서, 타겟 유전자의 파괴는 기능성 단백질의 발현을 방지한다. 일부 구현예들에서, 타겟 유전자의 파괴로 파괴된 유전자로부터 비-기능성의 단백질이 발현된다. 일부 구현예들에서, PDH-바이패스의 유전자 파괴는, 타겟 유전자 좌내 "파괴 유전자"를 상동적인 재조합에 의해 도입함으로써 달성된다. 이러한 구현예들에서, 상기 파괴 구조체는 타겟 유전자 좌 (상동 서열)의 한쌍의 뉴클레오티드 서열과 상동적인 한쌍의 뉴클레오티드 서열이 측면에 위치한 파괴 서열을 포함한다. 타겟 유전자의 타겟 부위가 파괴 구조체로 치환되면, 파괴 서열은 기능성 단백질의 발현을 방지하거나, 또는 타겟 유전자로부터 비-기능성 단백질이 발현되게 한다.
PDH-바이패스의 유전자를 파괴할 수 있는 파괴 구조체는 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 표준 분자생물 기법을 이용하여 구축할 수 있다. 예로, ambrook et al., 2001, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 및 Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY을 참조한다. 본 발명의 방법의 실시에서 다변화될 수 있는 파괴 구조체에 대한 파라미터로는, 비제한적인 예로, 상동적인 서열의 길이; 상동적인 서열의 뉴클레오티드 서열; 파괴 서열의 길이; 파괴 서열의 뉴클레오티드 서열; 및 타겟 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 각 상동적인 서열의 길이에 대한 유효 범위는 50 - 5,000 bp (base pair)을 포함한다. 특정 구현예에서, 각 상동적인 서열의 길이는 약 500 bp이다. 유전자 타겟팅에 필요한 상동체 길이에 대한 내용으로 Hasty et al., Mol Cell Biol 11:5586-91 (1991)을 참조한다. 일부 구현예들에서, 상동적인 서열은 타겟 서열의 코딩 서열을 포함한다. 다른 구현예들에서, 상동적인 서열은 타겟 유전자의 상류 또는 하류 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 하나의 상동적인 서열은 타겟 유전자의 코딩 서열의 5'에 위치한 뉴클레오티드 서열에 상동적이며, 다른 상동적인 서열은 타겟 유전자의 코딩 서열의 3'에 위치한 뉴클레오티드 서열에 상동적이다. 일부 구현예들에서, 파괴 서열은 파괴 서열을 포함하는 미생물을 선별할 수 있는 선별 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 즉, 이러한 구현예들에서, 파괴 구조체는 듀얼 기능, 즉, 타겟 유전자를 기능적으로 파괴하는 기능과 타겟 유전자가 기능적으로 파괴된 세포를 동정하기 위한 선별 마커를 제공하는 기능을 제공한다. 일부 구현예들에서, 종결 코돈 (termination codon)은, 타겟 유전자에 코딩된 야생형 단백질의 활성을 약간 가지는 융합 단백질을 만들 수 있는, 번역 리드-스로우 (translational read-through)를 예방하기 위해, 선별 마커를 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 인-프레임으로, 그리고 하류에 위치된다. 일부 구현예들에서, 파괴 서열의 길이는 1 bp이다. 1 bp의 삽입은, 코딩 서열에 1 bp의 삽입이 기능성 단백질의 발현을 예방할 수 있는 프레임 쉬프트 돌연변이를 만들 수 있기 때문에, 타겟 유전자를 파괴하는데 충분할 수 있다. 일부 구현예들에서, 파괴 서열의 서열은 상동적인 서열들 사이에 위치한 타겟 유전자의 뉴클레오티드 서열과 1 bp 차이를 가진다. 타겟 유전자내 뉴클레오티드 서열을 파괴 서열로 치환하면, 도입되는 1 bp 치환으로 단백질의 주요부에 하나의 아미노산 치환과 비-기능성 단백질의 발현이 이루어질 수 있다. 그러나, 매우 짧은 파괴 서열을 이용하여 수행되는 파괴는 자연적인 돌연변이를 통해 야생형 서열로 복구되기 쉬워, 숙주 균주에서 PDH-바이패스가 기능적으로 복원됨을, 인지하여야 한다. 즉, 특정 구현예에서, 파괴 서열은 1 - 수개 bp 보다 길다. 다른 극단적인 예로, 과도하게 긴 길이의 파괴 서열은 보통 길이의 파괴 서열에 비해 임의의 이점을 부여하기 어려울 것이며, 형질감염 또는 타겟팅 효과가 사라질 수도 있다. 이 문맥에서, 과도하게 긴 길이는 타겟 유전자에서 선정된 상동적인 서열들 간의 거리 보다 수배 더 길다. 즉, 특정 구현예들에서, 파괴 서열의 길이는 2 - 2,000 bp일 수 있다. 다른 구현예들에서, 파괴 서열의 길이는, 파괴 구조체내 상동적인 서열들에 부합되는 타겟 유전자 좌의 영역들 사이의 간격과 대략 동일한 길이이다.
일부 구현예들에서, 파괴 구조체는 선형 DNA 분자이다. 다른 구현예들에서, 파괴 구조체는 원형 DNA 분자이다. 일부 구현예들에서, 원형의 파괴 구조체는 전술한 바와 같이 파괴 서열에 의해 분리되어 있는 한쌍의 상동적인 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 원형의 파괴 구조체는 하나의 상동적인 서열을 포함한다. 이러한 원형의 파괴 구조체는, 타겟 유전자 좌로의 도입시, 선형화될 것이며, 각 말단에 상동적인 서열 부분이 위치되고, 파괴 구조체의 나머지 세그먼트들은 어떠한 타겟 유전자 뉴클레오티드 서열을 치환하지 않고도 타겟 유전자에 삽입되어 이를 파괴한다. 특정 구현예에서, 원형의 파괴 구조체의 단일한 상동적인 서열은 타겟 유전자의 코딩 서열내에 위치한 서열과 상동적이다.
파괴 구조체는 비제한적인 예로 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의 방법으로 미생물 세포에 도입할 수 있다. 이러한 방법으로는, 비제한적으로, 세포에 의한 용액으로부터의 분자의 직접 흡수, 또는 예를 들어 리포좀 또는 이뮤노리포좀을 이용한 리포펙션을 통한 촉매화된 흡수; 입자 매개 형질감염 등을 포함한다. 예로, 미국 특허 5,272,065; Goeddel et al., eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc., CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; 및 Ausubel et al., eds., Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY를 참조한다. 효소 세포를 형질전환하는 구체적인 방법들은 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1292-3 (1978); Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385 (1985)를 참조한다. 기법의 예로는, 비제한적으로, 스페로플라스팅 (spheroplasting), 전기충격 (electroporation), PEG 1000 매개 형질전환 및 리튬 아세테이트 또는 리튬 클로라이드 매개의 형질전환을 포함한다.
5.2.3.1 ALD4 및 ALD6
일부 구현예들에서, 알데하이드 데하이드로게나제 (ACDH) 활성을 코딩하는 하나 이상의 유전자가 숙주 세포에서 기능적으로 파괴된다. 일부 구현예들에서, 알데하이드 데하이드로게나제는 ALD2, ALD3, ALD4, ALD5, ALD6 및 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자, 및 이들의 변이체에 의해 코딩된다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 ALD4의 기능적 파괴를 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 대표적인 ALD4 뉴클레오티드 서열은 등재번호 NM_001183794 및 본원에 제시된 서열번호 7을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 대표적인 Ald4 단백질 서열은 등재번호 NP_015019.1 및 본원에 제시된 서열번호 8을 포함한다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 세포질 알데하이드 데하이드로게나제 (ALD6)의 기능적 파괴를 포함한다. Ald6p는 천연적인 PDH-바이패스에서 아세트알데하이드를 아세테이트로 변환하는 기능을 한다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 대표적인 ALD6 뉴클레오티드 서열은 등재번호 SCU56604 및 본원에 제시된 서열번호 9를 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 대표적인 Ald6 단백질 서열은 등재번호 AAB01219 및 본원에 제시된 서열번호 10을 포함한다.
당해 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) 이외의 효소에서 알데하이드 데하이드로게나제에 대한 천연 상동체는 본원에 기술된 방법을 이용하여 유사하게 불활화할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자가 이해하는 바와 같이, 2 이상의 알데하이드 데하이드로게나제의 활성 또는 발현이 감소 또는 없어질 수 있다. 일 특정 구현예에서, ALD4 및 ALD6, 또는 이의 상동체 또는 변이체의 활성 또는 발현이 감소 또는 소실된다. 다른 특정 구현예에서, ALD5 및 ALD6, 또는 이의 상동체 또는 변이체의 활성 또는 발현이 감소 또는 소실된다. 또 다른 특정 구현예에서, ALD4, ALD5 및 ALD6, 또는 이의 상동체 또는 변이체의 활성 또는 발현이 감소 또는 소실된다.
또 다른 특정 구현예에서, 세포질에 위치한 알데하이드 데하이드로게나제, ALD2, ALD3 및 ALD6, 또는 이들의 상동체 또는 변치에의 활성 또는 발현이, 감소 또는 소실된다. 또 다른 특정 구현예에서, 미토콘드리아에 위치한 알데하이드 데하이드로게나제, ALD4 및 ALD5, 또는 이들의 상동체 또는 변치에의 활성 또는 발현이, 감소 또는 소실된다.
5.2.3.2 ACS1 및 ACS2
일부 구현예들에서, 아세틸-CoA 신타제 (ACS) 활성을 코딩하는 하나 이상의 유전자가 숙주 세포에서 기능적으로 파괴된다. 일부 구현예들에서, 아세틸-CoA 신타제는 ACS1, ACS2 및 상동체로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자, 및 이들의 변이체에 의해 코딩된다.
일부 구현예들에서, 아세틸-CoA 신타제 (ACS) 활성을 코딩하는 하나 이상의 유전자가 숙주 세포에서 기능적으로 파괴된다. ACS1과 ACS2는, 둘다, 아세테이트를 아세틸-CoA로 변환할 수 있는, 아세틸-CoA 신타제이다. ACS1은 호흡 조건 (respiratory condition)에서만 발현되는 반면, ACS2는 구성적으로 발현된다. ACS3가 낫 아웃되면, 균주는 호흡 조건 (예, 에탄올, 글리세롤, 또는 아세테이트 매질)에서 증식할 수 있지만, 발효가능한 탄소원 (예, 슈크로스, 글루코스)에서는 사멸한다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 ACS1의 기능적인 파괴를 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)의 ACS1 유전자 서열은 기존에 공지되었다. 예로, Nagasu et al., Gene 37 (1-3):247-253 (1985)을 참조한다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 대표적인 ACS1 뉴클레오티드 서열은 등재번호 X66425와 본원에 제시된 서열번호 3을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 대표적인 Acs1 단백질 서열은 등재번호 AAC04979와 본원에 제시된 서열번호 4를 포함한다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 ACS2의 기능적인 파괴를 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)의 ACS2 유전자 서열은 기존에 공지된 바 있다. 예로, Van den Berg et al., Eur. J. Biochem. 231(3):704-713 (1995)을 참조한다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 대표적인 ACS2 뉴클레오티드 서열은 등재번호 S79456과 본원에 제시된 서열번호 5를 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 대표적인 Acs2 단백질 서열은 등재번호 CAA97725와 본원에 제시된 서열번호 6을 포함한다.
당해 기술 분야에서 이해되는 바와 같이, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) 이외의 효소에서 아세틸-CoA 신타제에 대한 천연 상동체는 본원에 기술된 방법을 이용하여 유사하게 불활화할 수 있다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 호흡 조건에서 (즉, 숙주 세포를 예컨대 에탄올, 글리세롤 또는 아세테이트의 존재 하에 배양하였을 때) 아세테이트를 아세틸-CoA로 변환할 수 있는, 세포질 아세틸-coA 신타제 활성을 포함한다. 일부 이러한 구현예에서, 숙주 세포는 ACS1 활성을 포함하는 효모 세포이다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포는, 부모 세포와 비교하여, 호흡 조건에서 내인성 아세틸-CoA 신타제 활성을 포함하지 않거나, 감소된다. 이러한 일부 구현예들에서, 숙주 세포는, 부모 세포와 비교하여, ACS1 활성이 없거나 감소된, 효소 세포이다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 무-호흡 조건에서 (즉, 숙주 세포를 발효가능한 탄소원 (예, 슈크로스, 글루코스)의 존재 하에 배양하였을 때) 아세테이트를 아세틸-CoA로 변환할 수 있는, 세포질 아세틸-coA 신타제 활성을 포함한다. 일부 이러한 구현예들에서, 숙주 세포는 ACS2 활성을 포함하는 효모 세포이다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포는, 부모 세포와 비교하여, 무-호흡 조건에서는 내인성 아세틸-CoA 신타제 활성이 없거나 감소된다. 일부 이러한 구현예들에서, 숙주 세포는, 부모 세포와 비교하여, ACS2 활성이 없거나 감소된, 효모 세포이다.
5.2.4 포스포케톨라제 (PK) 및 포스포트랜프아세틸라제 (PTA)
효모에서, 아세틸-CoA는 당분해 반응, 트리카르복시산 (TCA) 사이클, 산화적 인산화 및 피루베이트 대사를 통해 글루코스로부터 생합성된다. 그러나, 이러한 생합성 경로에서, 피루베이트 카르복실라제에 의한 피루베이트 대사 과정, 피루베이트 데하이드로게나제 및 이소사이트레이트 데하이드로게나제에 의한 TCA 사이클에서 CO2가 소모된다. 산업 발효 현장에서, 저 당분해를 통한 흐름을 줄이는 한가지 이점은, 피루베이트를 아세트알데하이드로 변환하는 중에 CO2가 적게 생산되며, 따라서 최대 이론 수율이 증가된다는 것이다. 2번째 이점은 NADH가 적게 생산되어, 이를 재산화하는데 필요한 산소가 현저하게 적게 필요하다는 것이다. 탄소 원자의 감소는 이론적으로는 TCA 사이클을 바이패스함으로써 피할 수 있다. 이는, 포스포케톨라제 (PK) (효소 클래스 EC 4.1.2.9, EC 4.1.2.22)를 포스포아세틸트랜스퍼라제 (PTA) (EC 2.3.1.8)와 조합 사용함으로써 달성할 수 있다.
PK와 PTA는 프럭토스-6-포스페이트 (F6P) 또는 자일룰로스-5-포스페이트 (X5P)를 아세틸-CoA로 변환하는 반응을 촉매한다 (도 7). PK는 펜토스 포스페이트 중간산물인 자일룰로스 5-포스페이트로부터, 또는 당분해 중간산물인 D-프럭토스 6-포스페이트 (F6P)로부터 나오며; PK는 X5P를 글리세르알데하이드 3-포스페이트 (G3P)와 아세틸 포스페이트로, 또는 F6P를 에리트로스 4-포스페이트 (E4P)로 분할한다. 그런 후, PTA는 아세틸 포스페이트를 아세틸-CoA로 변환한다. G3P는 저 당분해 과정에 재투입될 수 있으며, E4P는 펜토스 포스페이트 경로 또는 당분해 반응에 트랜스알돌라제 및 트랜스케톨라제의 비-산화적인 펜토스 포스페이트 경로를 통한 사이클링에 의해 재진입할 수 있다.
일부 구현예들에서, 본원에 제공되는 유전자 변형된 숙주 세포는 포스포케톨라제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 포스포케톨라제는 루코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides)로부터 유래된다 (Lee et al., Biotechnol Lett. 27(12);853-858 (2005). 루코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides)의 대표적인 포스포케톨라제 뉴클레오티드 서열로는 등재번호 AY804190와 본원에 제시된 서열번호 11을 포함한다. 루코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides)의 대표적인 포스포케톨라제 단백질 서열은 등재번호 YP_819405, AAV66077.1 및 본원에 제시된 서열번호 12를 포함한다. 다른 사용가능한 포스포케톨라제로는, 비제한적으로, 비피도박테리움 덴티움 (Bifidobacterium dentium) ATCC 27678 (ABIX02000002.1:2350400..2352877; EDT46356.1); 비피도박테리움 애니말리스 (Bifidobacterium animalis) (NC_017834.1:1127580..1130057; YP_006280131.1); 및 비피도박테리움 슈돌롱검 (Bifidobacterium pseudolongum) (AY518216.1:988..3465; AAR98788.1)로부터 유래된 것을 포함한다.
또한, 본원에 제시된 조성물 방법에 사용가능한 포스포케톨라제로는, 본원에 기술된 임의의 포스포케톨라제의 유도체로 지칭되는 분자를 포함한다. 이러한 "유도체"는 다음과 같은 특징을 가진다: (1) 이는 본원에 기술된 임의의 포스포케톨라제과 상당한 상동성을 공유함; 및 (2) X5P를 글리세르알데하이드 3-포스페이트 (G3P)와 아세틸 포스페이트로 변환하거나; 또는 F6P를 에리트로스 4-포스페이트 (E4P)로 변환하는 과정을 촉매할 수 있음. 포스포케톨라제의 유도체는, 유도체의 아미노산 서열이 포스포케톨라제의 서열과 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일하다면, 포스포케톨라제와 "상당한 상동성"을 공유한다고 언급한다.
일부 구현예들에서, 본원에 제시된 유전자 변형된 숙주 세포는 포스포트랜스아세틸라제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 포스포트랜스아세틸라제는 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri)로부터 유래된다. 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri)의 대표적인 포스포트랜스아세틸라제 뉴클레오티드 서열은 등재번호 NC_009706.1:1428554..1429555, 및 본원에 제시된 서열번호 13을 포함한다. 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri)의 대표적인 포스포트랜스아세틸라제 단백질 서열은 등재번호 YP_001394780과 본원에 제시된 서열번호 14를 포함한다. 그외 사용가능한 포스포트랜스아세틸라제는, 비제한적으로, 락토바실러스 루테리 (Lactobacillus reuteri) (NC_010609.1:460303..461277; YP_001841389.10); 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis) (NC_014479.1:3671865..3672836; YP_003868063.1); 및 메타노사르시나 서모필라 (Methanosarcina thermophila) (L23147.1:207..1208; AAA72041.1)로부터 유래된 것을 포함한다.
또한, 본원에 제공되는 조성물과 방법에 사용가능한 포스포트랜스아세틸라제는, 본원에 기술된 임의의 포스포트랜스아세틸라제의 유도체로 지칭되는 분자를 포함한다. 이러한 "유도체"는 다음과 같은 특징을 가진다: (1) 이는 본원에 기술된 임의의 포스포트랜스아세틸라제와 상당한 상동성을 공유함; 및 (2) 아세틸 포스페이트의 아세틸-CoA로의 변환을 촉매할 수 있음. 포스포트랜스아세틸라제의 유도체는, 유도체의 아미노산 서열이 포스포트랜스아세틸라제의 서열과 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일하다면, 포스포트랜스아세틸라제와 "상당한 상동성"을 공유한다고 언급된다.
5.2.5 MEV 경로
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로의 하나 이상의 이종의 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는, 아세틸-CoA를 말로닐-CoA와 축합하여 아세토아세틸-CoA를 형성하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 아세틸-CoA 2분자를 축합하여 아세토아세틸-CoA를 형성하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 아세토아세틸-CoA를 아세틸-CoA와 축합하여 HMG-CoA를 형성하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 인산화하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 메발로네이트 5-포스페이트를 메발로네이트 5-피로포스페이트로 변환하는 효소를 포함한다. 일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 메발로네이트 5-피로포스페이트를 이소펜테닐 피로포스페이트로 변환하는 효소를 포함한다.
일부 구현예들에서, MEV 경로의 하나 이상의 효소는 아세틸-CoA 티올라제, 아세토아세틸-CoA 신타제, HMG-CoA 신타제, HMG-CoA 리덕타제, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제 및 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라제로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예들에서, 아세토아세틸-CoA의 형성을 촉매할 수 있는 MEV 경로 효소와 관련하여, 유전자 변형된 숙주 세포는, 아세틸-CoA 2 분자를 축합하여 아세토아세틸-CoA를 형성하는 효소, 예컨대 아세틸-CoA 티올라제; 또는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA와 축합하여 아세토아세틸-CoA를 형성하는 효소, 예컨대 아세토아세틸-CoA 신타제 중 어느 하나를 포함한다. 일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 아세틸-CoA 2 분자를 축합하여 아세토아세틸-CoA를 형성하는 효소, 예로, 아세틸-CoA 티올라제; 및 아세틸-CoA를 말로닐-CoA와 축합하여 아세토아세틸-CoA를 형성하는 효소, 예컨대 아세토아세틸-CoA 신타제를 둘다 포함한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로의 1개 보다 많은 수의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로의 2종의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환할 수 있는 효소 및 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로의 3종의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로의 4종의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로의 5종의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로의 6종의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로의 7종의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 MEV 경로의 모든 효소를 코딩하는 복수의 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)를 다이메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 핵산을 더 포함한다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 IPP 및/또는 DMAPP 분자를 축합하여 폴리프레닐 화합물을 형성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 핵산을 더 포함한다. 일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 IPP 또는 폴리프레닐을 변형시켜 이소프레노이드 화합물을 형성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 핵산을 추가로 포함한다.
5.2.5.1 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 변환
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 아세틸-코엔자임 A 2분자를 축합하여 아세토아세틸-CoA를 형성하는 효소, 예컨대 아세틸-CoA 티올라제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예시적인 예로는, 비제한적으로, (NC_000913 REGION: 2324131.2325315; 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)), (D49362; 파라코커스 데니트리피칸스 (Paracoccus denitrificans)), 및 (L20428; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae))를 포함한다.
아세틸-CoA 티올라제는 아세틸-CoA 2 분자의 아세토아세틸-CoA로의 가역적인 축합을 촉매하지만, 이 반응은 열역학적으로는 비우호적이며; 아세토아세틸-CoA 티올라이시스(thiolysis)가 아세토아세틸-CoA 합성 보다 우호적이다. 아세토아세틸-CoA 신타제 (AACS) (이명, 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제; EC 2.3.1.194)는 아세틸-CoA를 말로닐-CoA와 축합하여 아세토아세틸-CoA를 형성한다. 아세틸-CoA 티올라제와는 반대로, AACS-촉매화된 아세토아세틸-CoA 합성은, 조합된 말로닐-CoA의 데카르복시화로 인해, 기본적으로 에너지-우호적인 반응이다. 아울러, AACS는 또한 아세토아세틸-CoA에 대해서는 티올라이시스 활성을 나타내지 않으므로, 반응은 비가역적이다.
이종의 ADA와 아세틸-CoA 티올라제를 포함하는 숙주 세포에서, 아세토아세틸-CoA 티올라이시스에 우호적인 아세틸-CoA 티올라제에 의해 촉매되는 가역적인 반응으로, 대규모 아세틸-CoA 풀이 만들어질 수 있다. 가역적인 ADA 활성 측면에서, 이러한 아세틸-CoA 풀은 아세틸-CoA를 아세트알데하이드로 변환하는 가역적인 반응쪽으로 ADA를 향하게 할 수 있으며, 이로써 ADA에 의해 제공되는 아세틸-CoA가 생산되는 방향으로 가게 하는 이점이 없어질 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 아세틸-CoA를 ADA의 정방향 반응으로 가게 하는 강력한 견인력을 제공하기 위해, 본원에 제공된 유전자 변형된 숙주 세포의 MEV 경로는 아세토아세틸-CoA 신타제를 이용하여 아세틸-CoA와 말로닐-CoA로부터 아세토아세틸-CoA를 형성한다.
일부 구현예들에서, AACS는 스트렙토마이세스 sp. strain CL190로부터 유래된다 (Okamura et al., Proc Natl Acad Sci USA 107(25):11265-70 (2010). 스트렙토마이세스 sp. strain CL190의 대표적인 AACS 뉴클레오티드 서열은 등재번호 AB540131.1과 본원에 제시된 서열번호 15를 포함한다. 스트렙토마이세스 sp. strain CL190의 대표적인 AACS 단백질 서열은 등재번호 D7URV0, BAJ10048과 본원에 제시된 서열번호 16을 포함한다. 본원에 제공되는 조성물 및 방법에 이용가능한 다른 아세토아세틸-CoA 신타제로는, 비제한적으로, 스트렙토마이세스 sp. (AB183750; KO-3988 BAD86806); 스트렙토마이세스 아눌라쿠스 (S. anulatus) strain 9663 (FN178498; CAX48662); 스트렙토마이세스 sp. KO-3988 (AB212624; BAE78983); 액티노플란스 (Actinoplanes) sp. A40644 (AB113568; BAD07381); 스트렙토마이세스 sp. C (NZ_ACEW010000640; ZP_05511702); 노카르디옵시스 다손빌레이 (Nocardiopsis dassonvillei) DSM 43111 (NZ_ABUI01000023; ZP_04335288); 마이코박테리움 얼세란스 (Mycobacterium ulcerans) Agy99 (NC_008611; YP_907152); 마이코박테리움 마리눔 (Mycobacterium marinum) M (NC_010612; YP_001851502); 스트렙토마이세스 sp. Mg1 (NZ_DS570501; ZP_05002626); 스트렙토마이세스 sp. AA4 (NZ_ACEV01000037; ZP_05478992); 스트렙토마이세스 로세오스포루스 (S. roseosporus) NRRL 15998 (NZ_ABYB01000295; ZP_04696763); 스트렙토마이세스 sp. ACTE (NZ_ADFD01000030; ZP_06275834); 스크렙토마이세스 비리도크로모게네스 (S. viridochromogenes) DSM 40736 (NZ_ACEZ01000031; ZP_05529691); 프랜키아 (Frankia) sp. CcI3 (NC_007777; YP_480101); 노카르디아 브라실렌시스 (Nocardia brasiliensis) (NC_018681; YP_006812440.1); 및 오스트윅키아 첼로네 (Austwickia chelonae) (NZ_BAGZ01000005; ZP_10950493.1)를 포함한다. 추가적인 적정 아세토아세틸-CoA 신타제로는 미국 특허 공개공보 2010/0285549와 2011/0281315에 기술되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
또한, 본원에 제공되는 조성물 및 방법에 사용가능한 아세토아세틸-CoA 신타제는, 본원에 기술된 임의의 아세토아세틸-CoA 신타제의 유도체로 지칭되는 분자를 포함한다. 이러한 "유도체"는 다음과 같은 특징을 가진다: (1) 이는 본원에 기술된 임의의 아세토아세틸-CoA 신타제와 상당한 상동성을 공유함; 및 (2) 아세틸-CoA와 말로닐-CoA를 축합하여 아세토아세틸-CoA로 변환하는 비가역적인 축합을 촉매할 수 있음. 아세토아세틸-CoA 신타제의 유도체는, 유도체의 아미노산 서열이 아세토아세틸-CoA 신타제의 서열과 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일하다면, 아세토아세틸-CoA 신타제와 "상당한 상동성"을 공유한다고 언급된다.
5.2.5.2 아세토아세틸-CoA의 HMG-CoA로의 변환
일부 구현예들에서, 숙주 세포는, 아세토아세틸-CoA를 다른 아세틸-CoA 분자와 축합하여 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA)를 형성할 수 있는 효소, 예컨대 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예시적인 예로는, 비제한적으로, (NC_001145. complement 19061.20536; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)), (X96617; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)), (X83882; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (AB037907; 키타사토스포라 그리세올라 (Kitasatospora griseola)), (BT007302; 호모 사피엔스 (Homo sapiens)), 및 (NC_002758, Locus tag SAV2546, GeneID 1122571; 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus))를 포함한다.
5.2.5.3 HMG-CoA의 메발로네이트로의 변환
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 HMG-CoA 리덕타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 구현예들에서, HMG-CoA 리덕타제는 NADH-가용성 하이드록시메틸글루타릴-CoA 리덕타제-CoA 리덕타제이다. HMG-CoA 리덕타제 (EC 1.1.1.34; EC 1.1.1.88)는 (S)-HMG-CoA의 (R)-메발로네이트로의 환원적인 탈아실화를 촉매하며, 클래스 I과 클래스 II HMGr 2종의 클래스로 분류될 수 있다. 클래스 I은 진핵생물과 대부분의 고세균의 효소를 포함하며, 클래스 II는 일부 원핵생물과 고세균의 HMG-CoA 리덕타제를 포함한다. 서열 다양성 외에도, 2종류의 효소는 또한 이들의 조인자 특이성에 차이가 있다. NADPH만을 이용하는 클래스 I 효소와는 달리, 클래스 II HMG-CoA 리덕타제는 NADPH와 NADH를 구별하는 능력에 차이가 있다. 예로, Hedl et al., Journal of Bacteriology 186 (7): 1927-1932 (2004)를 참조한다. 클래스 II HMG-CoA 리덕타제를 선별하기 위한 조인자 특이성은 아래에 나타낸다.
표 1. 클래스 II HMG-CoA 리덕타제를 선별하기 위한 조인자 특이성
소스 코엔자임 특이성 K m NADPH (μM) K m NADH (μM)
슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii)
NADH 80
아르케오글로부스 풀기두스 (A. fulgidus) NAD(P)H 500 160
스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) NAD(P)H 70 100
엔테로코커스 패칼리스 ( E. faecalis) NADPH 30
본원에 제시된 조성물 및 방법에서 사용가능한 HMG-CoA 리덕타제는 조인자로서 NADH를 이용할 수 있는 HMG-CoA 리덕타제, 예컨대 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii), 아르케오글로부스 풀기두스 (A. fulgidus) 또는 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 유래의 HMG-CoA 리덕타제를 포함한다. 특정 구현예에서, HMG-CoA 리덕타제는 조인자로서 NADH만을 이용하며, 예컨대, 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii), 실리시박터 포메로이 (S. pomeroyi) 또는 델프티아 액시도보란스 (D. acidovorans) 유래의 HMG-CoA 리덕타제이다.
일부 구현예들에서, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제는 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii)로부터 유래된다. HMG-CoA 리덕타제 (E.C. 1.1.1.88)를 코딩하는 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii)의 야생형 mvaA 유전자 서열은 이전에 개시된 바 있다. Beach 및 Rodwell, J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989)을 참조한다. 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii)의 대표적인 mvaA 뉴클레오티드 서열은 등재번호 M24015, 및 본원에 제시된 서열번호 17을 포함한다. 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii)의 대표적인 HMG-CoA 리덕타제 단백질 서열은 등재번호 AAA25837, P13702, MVAA_PSEMV 및 본원에 제시된 서열번호 18을 포함한다.
일부 구현예들에서, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제는 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi)로부터 유래된다. 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi)의 대표적인 HMG-CoA 리덕타제 뉴클레오티드 서열은 등재번호 NC_006569.1, 및 본원에 제시된 서열번호 19를 포함한다. 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi)의 대표적인 HMG-CoA 리덕타제 단백질 서열은 등재번호 YP_164994 및 본원에 제시된 서열번호 20을 포함한다.
일부 구현예들에서, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제는 델프티아 액시도보란스 (Delftia acidovorans)로부터 유래된다. 델프티아 액시도보란스 (Delftia acidovorans)의 대표적인 HMG-CoA 리덕타제 뉴클레오티드 서열은 NC_010002 REGION: complement(319980..321269), 및 본원에 제시된 서열번호 21을 포함한다. 델프티아 액시도보란스 (Delftia acidovorans)의 대표적인 HMG-CoA 리덕타제 단백질 서열은 등재번호 YP_001561318 및 본원에 제시된 서열번호 22를 포함한다.
일부 구현예들에서, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제는 솔라눔 투베로숨 (Solanum tuberosum)으로부터 유래된다 (Crane et al., J. Plant Physiol. 159:1301-1307 (2002)).
또한, 본원에 제공되는 조성물 및 방법에 사용가능한 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제는, 본원에 언급된 임의의 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제, 예컨대 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii), 실리시박터 포메로이(S. pomeroyi) 및 델프티아 액시도보란스 (D. acidovorans)로부터 유래된 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제에 대한 "유도체"로 지칭되는 분자를 포함함다. 이러한 "유도체"는 다음과 같은 특징을 가진다: (1) 이는 본원에 기술된 임의의 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제와 상당한 상동성을 공유함; 및 (2) 조인자로서 선호적으로 NADH를 이용하면서 (S)-HMG-CoA의 (R)-메발로네이트로의 환원적인 탈아실화를 촉매할 수 있음. NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제의 유도체는, 유도체의 아미노산 서열이 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제의 서열과 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일하다면, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제와 "상당한 상동성"을 공유한다고 지칭된다.
본원에서, "NADH-가용성"이라는 표현은, 예를 들어, NADPH 보다 NADH에 대해 높은 비활성 (specific activity)을 나타냄으로써, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제가 조인자로서 NADPH에 비해 NADH에 대해 선택적이라는 것을 의미한다. 일부 구현예들에서, 조인자로서 NADH에 대한 선택성은 k cat (NADH)/ k cat (NADPH) 비로 표시된다. 일부 구현예들에서, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제는 k cat (NADH)/ k cat (NADPH) 비가 적어도 5, 10, 15, 20, 25 또는 > 25이다. 일부 구현예들에서, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제는 NADH만을 이용한다. 예를 들어, NADH만을 사용하는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제는 시험관내에서 유일한 조인자로서 제공되는 NADH를 이용하여 일부 활성을 나타내며 (예, 실시예 1 및 아래 섹션 6.1.1.3), NADPH가 유일한 조인자로서 제공되는 경우 검출가능한 활성을 나타내지 않는다. Kim et al., Protein Science 9:1226-1234 (2000); 및 Wilding et al., J. Bacteriol. 182(18):5147-52 (2000)에 개시된 방법을 비롯하여, 당해 기술 분야에 공지된 조인자 특이성을 확인하기 위한 임의의 방법을 이용하여, 조인자로서 NADH에 대해 선호성을 가지는 HMG-CoA 리덕타제를 동정할 수 있으며, 이들의 내용은 그 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예들에서, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제는, 예를 들어 조인자-결합 포켓에 부위 특이적인 돌연변이를 유발하여, NAPDH에 비해 NADH에 선택적이도록 조작된다. NADH-선택성을 조작하는 방법은 Watanabe et al., Microbiology 153:3044-3054 (2007)에 기술되어 있으며, HMG-CoA 리덕타제의 조인자 특이성을 확인하는 방법은 Kim et al., Protein Sci. 9:1226-1234 (2000)에 기술되어 있으며, 그 내용은 전체가 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
일부 구현예들에서, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제는, 메발로네이트 분해 경로를 천연적으로 포함하는 숙주 종, 예컨대, 이의 단독 탄소원으로서 메발로네이트를 이화하는 숙주 종으로부터 유래된다. 이들 구현예들에서, 천연 숙주 세포에서 내재화된 (R)-메발로네이트의 (S)-HMG-CoA로의 산화적인 아실화를 정상적으로 촉매하는, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제를 이용하여, 역 반응 (reverse reaction), 즉, 메발로네이트 생합성 경로를 포함하는 유전자 변형된 숙주 세포에서 (S)-HMG-CoA의 (R)-메발로네이트로의 환원적인 탈아실화를 촉매한다. 단독 탄소원으로서 메발로네이트에서 증식할 수 있는 원핵생물은 Anderson et al., J. Bacteriol, 171(12):6468-6472 (1989); Beach et al., J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989); Bensch et al., J. Biol. Chem. 245:3755-3762; Fimongnari et al., Biochemistry 4:2086-2090 (1965); Siddiqi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 8:110-113 (1962); Siddiqi et al., J. Bacteriol. 93:207-214 (1967); 및 Takatsuji et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.110:187-193 (1983)에 기술되어 있으며, 그 전체 내용이 원용에 의해 본 명세서에 포함된다.
본원에 제시된 조성물 및 방법에 대한 일부 구현예들에서, 숙주 세포는 NADH-가용성 HMGr과 NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 둘다를 포함한다. NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로: (NM_206548; 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster)), (NC_002758, Locus tag SAV2545, GeneID 1122570; 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)), (AB015627; 스트렙토마이세스 sp. KO 3988), (AX128213, 절단된 HMG-CoA 리덕타제를 코딩하는 서열 제공; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)), 및 (NC_001145: complement (115734.118898; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae))를 포함한다.
5.2.5.4 메발로네이트의 메발로네이트-5-포스페이트로의 변환
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 메발로네이트 키나제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예시적인 예로는, 비제한적으로: (L77688; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)) 및 (X55875; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae))를 포함한다.
5.2.5.5 메발로네이트-5-포스페이트의 메발로네이트-5-피로포스페이트로의 변환
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 메발로네이트 5-포스페이트를 메발로네이트 5-피로포스페이트로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예시적인 예로는, 비제한적으로: (AF429385; 헤베아 브라실렌시스 (Hevea brasiliensis)), (NM_006556; 호모 사피엔스 (Homo sapiens)), 및 (NC_001145. complement 712315.713670; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae))를 포함한다.
5.2.5.6 메발로네이트-5-피로포스페이트의 IPP로의 변환
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 메발로네이트 5-피로포스페이트로를 이소펜테닐 다이포스페이트 (IPP)로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예시적인 예로는, 비제한적으로, (X97557; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)), (AF290095; 엔테로코커스 패슘 (Enterococcus faecium)), 및 (U49260; 호모 사피엔스 (Homo sapiens))를 포함한다.
5.2.5.7 IPP의 DMAPP로의 변환
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 further comprises MEV 경로를 통해 만들어진 IPP를 다이메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)로 변환할 수 있는 효소, 예컨대 IPP 이소머라제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예시적인 예로는, 비제한적으로, (NC_000913, 3031087.3031635; 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli)), 및 (AF082326; 헤마토코커스 프루바이얼리스 (Haematococcus pluvialis)를 포함한다.
5.2.5.8 폴리프레닐 신타제
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 IPP 및/또는 DMAPP 분자를 축합하여 탄소를 5개 보다 많이 포함하는 폴리프레닐 화합물을 형성할 수 있는 폴리프레닐 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 IPP 한 분자와 DMAPP 1 분자를 축합하여 게라닐 피로포스페이트 ("GPP") 1 분자를 형성할 수 있는 효소, 예로 GPP 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예시적인 예로는, 비제한적으로, (AF513111; 아비에스 그란디스 (Abies grandis)), (AF513112; 아비에스 그란디스 (Abies grandis)), (AF513113; 아비에스 그란디스 (Abies grandis)), (AY534686; 안티리눔 마주스 (Antirrhinum majus)), (AY534687; 안티리눔 마주스 (Antirrhinum majus)), (Y17376; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (AE016877, Locus AP11092; 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus); ATCC 14579), (AJ243739; 시트러스 시넨시스 (Citrus sinensis)), (AY534745; 클라르키아 브루어리 (Clarkia breweri)), (AY953508; 입스 피니 (Ips pini)), (DQ286930; 라이코퍼시콘 에스쿨렌툼 (Lycopersicon esculentum)), (AF182828; 멘타 x 피페리타 (Mentha x piperita)), (AF182827; 멘타 x 피페리타 (Mentha x piperita)), (MPI249453; 멘타 x 피페리타 (Mentha x piperita)), (PZE431697, Locus CAD24425; 파라코커스 제아산티니팍시엔스 (Paracoccus zeaxanthinifaciens)), (AY866498; 피크로리자 쿠로아 (Picrorhiza kurrooa)), (AY351862; 비티스 비니페라 (Vitis vinifera)), 및 (AF203881, Locus AAF12843; 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis))를 포함한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 IPP 2 분자를 DMAPP 1 분자와 축합하거나, 또는 IPP 분자에 GPP 분자를 부가하여, 파르네실 피로포스페이트 ("FPP") 분자를 형성할 수 있는 효소, 예로, FPP 신타제를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 예시적인 예로는, 비제한적으로, (ATU80605; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (ATHFPS2R; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (AAU36376; 아르테미시아 아누아 (Artemisia annua)), (AF461050; Bos taurus), (D00694; 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) K-12), (AE009951, Locus AAL95523; 푸조박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) subsp. nucleatum ATCC 25586), (GFFPPSGEN; 지베렐라 푸이쿠로이 (Gibberella fujikuroi)), (CP000009, Locus AAW60034; 글루코노박터 옥시단스 (Gluconobacter oxydans) 621H), (AF019892; 헬리안투스 안누스 (Helianthus annuus)), (HUMFAPS; 호모 사피엔스 (Homo sapiens)), (KLPFPSQCR; 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis)), (LAU15777; 루피누스 알부스 (Lupinus albus)), (LAU20771; 루피누스 알부스 (Lupinus albus)), (AF309508; 무스 무스쿨러스 (Mus musculus)), (NCFPPSGEN; 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)), (PAFPS1; 파르테늄 아르겐타툼 (Parthenium argentatum)), (PAFPS2; 파르테늄 아르겐타툼 (Parthenium argentatum)), (RATFAPS; 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus)), (YSCFPP; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)), (D89104; 스키조사카로마이세스 폼베 (스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe))), (CP000003, Locus AAT87386; 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)), (CP000017, Locus AAZ51849; 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)), (NC_008022, Locus YP_598856; 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) MGAS10270), (NC_008023, Locus YP_600845; 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) MGAS2096), (NC_008024, Locus YP_602832; 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes) MGAS10750), (MZEFPS; 지 메이스 (Zea mays)), (AE000657, Locus AAC06913; 아퀴펙스 에어올리쿠스 (Aquifex aeolicus) VF5), (NM_202836; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (D84432, Locus BAA12575; 바실러스 섭틸리스 (Bacillus subtilis)), (U12678, Locus AAC28894; 브래디리조븀 자포니쿰 (Bradyrhizobium japonicum) USDA 110), (BACFDPS; 지오바실러스 스테아로서모필러스 (Geobacillus stearothermophilus)), (NC_002940, Locus NP_873754; 헤모필러스 두크레이 (Haemophilus ducreyi) 35000HP), (L42023, Locus AAC23087; 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenza)e Rd KW20), (J05262; 호모 사피엔스 (Homo sapiens)), (YP_395294; 락토바실러스 사케이 (Lactobacillus sakei) subsp. sakei 23K), (NC_005823, Locus YP_000273; 펩토스피라 인테로간스 (Leptospira interrogans) serovar Copenhageni str. Fiocruz L1-130), (AB003187; 마이크로코커스 루테우스 (Micrococcus luteus)), (NC_002946, Locus YP_208768; 네이세리아 고노로이에 (Neisseria gonorrhoeae) FA 1090), (U00090, Locus AAB91752; 리조븀 (Rhizobium) sp. NGR234), (J05091; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisae), (CP000031, Locus AAV93568; 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi)) DSS-3), (AE008481, Locus AAK99890; 스트렙토코커스 뉴모니아 (Streptococcus pneumonia)e R6), 및 (NC_004556, Locus NP 779706; 크실렐라 파스티도사 (Xylella fastidiosa) Temecula1)를 포함한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 IPP를 DMAPP와, 또는 IPP를 FPP와 조합하여 게라닐게라닐 피로포스페이트 ("GGPP")를 형성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 이러한 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (ATHGERPYRS; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (BT005328; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (NM_119845; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (NZ_AAJM01000380, Locus ZP_00743052; 바실러스 투린지엔시스 (Bacillus thuringiensis) serovar israelensis, ATCC 35646 sq1563), (CRGGPPS; 카타란투스 로세우스 (Catharanthus roseus)), (NZ_AABF02000074, Locus ZP_00144509; 푸조박테리움 뉴클레아툼 (Fusobacterium nucleatum) subsp. vincentii, ATCC 49256), (GFGGPPSGN; 지베렐라 푸이쿠로이 (Gibberella fujikuroi)), (AY371321; 징코 빌로바 (Ginkgo biloba)), (AB055496; 헤베아 브라실렌시스 (Hevea brasiliensis)), (AB017971; 호모 사피엔스 (Homo sapiens)), (MCI276129; 무코르 시르시넬로이데스 f. 루시타니쿠스 (Mucor circinelloides f. lusitanicus)), (AB016044; 무스 무스쿨러스 (Mus musculus)), (AABX01000298, Locus NCU01427; 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)), (NCU20940; 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa)), (NZ_AAKL01000008, Locus ZP_00943566; 랄스토니아 솔라나세아룸 (Ralstonia solanacearum) UW551), (AB118238; 라투스 노르베기쿠스 (Rattus norvegicus)), (SCU31632; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)), (AB016095; 시네코코쿠스 엘롱가테스 (Synechococcus elongates)), (SAGGPS; 시나피스 알바 (Sinapis alba)), (SSOGDS;설폴로부스 액시도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius)), (NC_007759, Locus YP_461832; Syntrophus aciditrophicus SB), (NC_006840, Locus YP_204095; 비브리오 피세리 (Vibrio fischeri) ES114), (NM_112315; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (ERWCRTE; 판토에아 어글로머란스 (Pantoea agglomerans)), (D90087, Locus BAA14124; 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananatis)), (X52291, Locus CAA36538; 로도박터 캡슐라투스 (Rhodobacter capsulatus)), (AF195122, Locus AAF24294; 로도박터 스페어로이데스 (Rhodobacter sphaeroides)), 및 (NC_004350, Locus NP_721015; 스트렙토코커스 무탄스 (Streptococcus mutans) UA159)를 포함한다.
5.2.5.9 테르펜 신타제
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 폴리프레닐을 변형시켜, 헤미테르펜, 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 다이테르펜, 트리테르펜, 테트라테르펜, 폴리테르펜, 스테로이드 화합물, 카로테노이드 또는 변형된 이소프레노이드 화합물을 형성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 카렌 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (AF461460, REGION 43.1926; 피세아 아비에스 (Picea abies)) 및 (AF527416, REGION: 78.1871; 살비아 스테노필라 (Salvia stenophylla))를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 게라니올 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (AJ457070; 신나모뭄 테누이필럼 (Cinnamomum tenuipilum)), (AY362553; 오시뭄 바실리쿰 (Ocimum basilicum)), (DQ234300; 펠릴라 프루테센스 (Perilla frutescens) strain 1864), (DQ234299; 페릴라 시트리오도라 (Perilla citriodora) strain 1861), (DQ234298; 페릴라 시트리오도라 (Perilla citriodora) strain 4935), 및 (DQ088667; 페릴라 시트리오도라 (Perilla citriodora))를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 리날롤 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (AF497485; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (AC002294, Locus AAB71482; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (AY059757; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (NM_104793; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (AF154124; 아르테미시아 아누아 (Artemisia annua)), (AF067603; 클라르키아 브루어리 (Clarkia breweri)), (AF067602; 클라르키아 콘시나 (Clarkia concinna)), (AF067601; 클라르키아 브루어리 (Clarkia breweri)), (U58314; 클라르키아 브루어리 (Clarkia breweri)), (AY840091; 라이코퍼시콘 에스쿨렌툼 (Lycopersicon esculentum)), (DQ263741; 라반둘라 안구스티폴리아 (Lavandula angustifolia)), (AY083653; 멘타 사이트레이트 (Mentha citrate)), (AY693647; 오시뭄 바실리쿰 (Ocimum basilicum)), (XM_463918; 오리자 사티바 (Oryza sativa)), (AP004078, Locus BAD07605; 오리자 사티바 (Oryza sativa)), (XM_463918, Locus XP_463918; 오리자 사티바 (Oryza sativa)), (AY917193; 페릴라 시트리오도라 (Perilla citriodora)), (AF271259; 펠릴라 프루테센스 (Perilla frutescens)), (AY473623; 피세아 아비에스 (Picea abies)), (DQ195274; 피세아 시첸시스 (Picea sitchensis)), 및 (AF444798; 펠릴라 프루테센스 (Perilla frutescens) var. crispa cultivar No. 79)를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 리모넨 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (+)-리모넨 신타제 (AF514287, REGION: 47.1867; 시트러스 리몬 (Citrus limon) 및 AY055214 (REGION: 48.1889; 아가스타케 루고사 (Agastache rugosa)) 및 (-)-리모넨 신타제 (DQ195275, REGION: 1.1905; 피세아 시첸시스 (Picea sitchensis)), (AF006193, REGION: 73.1986; 아비에스 그란디스 (Abies grandis)), 및 (MHC4SLSP, REGION: 29.1828; 멘타 스피카타 (Mentha spicata))를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 미르센 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (U87908; 아비에스 그란디스 (Abies grandis)), (AY195609; 안티리눔 마주스 (Antirrhinum majus)), (AY195608; 안티리눔 마주스 (Antirrhinum majus)), (NM_127982; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) TPS10), (NM_113485; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) ATTPS-CIN), (NM_113483; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) ATTPS-CIN), (AF271259; 펠릴라 프루테센스 (Perilla frutescens)), (AY473626; 피세아 아비에스 (Picea abies)), (AF369919; 피세아 아비에스 (Picea abies)), 및 (AJ304839; 퀘르쿠스 일렉스 (Quercus ilex))를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 옥시멘 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (AY195607; 안티리눔 마주스 (Antirrhinum majus)), (AY195609; 안티리눔 마주스 (Antirrhinum majus)), (AY195608; 안티리눔 마주스 (Antirrhinum majus)), (AK221024; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana)), (NM_113485; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) ATTPS-CIN), (NM_113483; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) ATTPS-CIN), (NM_117775; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) ATTPS03), (NM_001036574; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) ATTPS03), (NM_127982; 아라비옵시스 탈리아나 (Arabidopsis thaliana) TPS10), (AB110642; 시트러스 운시우 (Citrus unshiu) CitMTSL4) 및 (AY575970; Lotus corniculatus var. japonicus)를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 알파-피넨 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (+) 알파-피넨 신타제 (AF543530, REGION: 1.1887; 피누스 타에다 (Pinus taeda)), (-)알파-피넨 신타제 (AF543527, REGION: 32.1921; 피누스 타에다 (Pinus taeda)), 및 (+)/(-)알파-피넨 신타제 (AGU87909, REGION: 6111892; 아비에스 그란디스 (Abies grandis))를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 베타-피넨 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (-) 베타-피넨 신타제 (AF276072, REGION: 1.1749; 아르테미시아 아누아 (Artemisia annua)) 및 (AF514288, REGION: 26.1834; 시트러스 리몬 (Citrus limon))을 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 사비넨 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, AF051901 (REGION: 26.1798, 살비아 오피시날리스 (Salvia officinalis) 유래)를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 감마-테르피넨 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는: (AF514286, REGION: 30.1832, 시트러스 리몬 (Citrus limon)) 및 (AB110640, REGION 1.1803, 시트러스 운시우 (Citrus unshiu))를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 테르피놀렌 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (AY693650, 오스시뭄 바실리툼 (Oscimum basilicum)) 및 (AY906866, REGION: 10.1887, 슈도츠가 멘지에시 (Pseudotsuga menziesii))를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 아모르파디엔 신타제를 코딩한다. 적정 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예는, 미국 특허 공개공보 2004/0005678의 서열번호 37이다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 알파-파르네센 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, DQ309034, 피루스 코무니스 (Pyrus communis) cultivar d'Anjou (배; 유전자명 AFS1) 및 AY182241, 말루스 도메스티카 (Malus domestica) (사과; 유전자 AFS1)를 포함한다. Pechouus et al., Planta 219(1):84-94 (2004).
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 베타-파르네센 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, 멘타 x 피페리타 (Mentha x piperita)의 등재번호 AF024615 (peppermint; gene Tspa11), 및 아르테미시아 아누아 (Artemisia annua)의 AY835398을 포함한다. Picaud et al., Phytochemistry 66(9): 961-967 (2005).
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 파르네솔 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, 지 메이스 (Zea mays)의 등재번호 AF529266와 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)의 YDR481C (유전자 Pho8)를 포함한다. Song, L., Applied Biochemistry and Biotechnology 128:149-158 (2006).
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 네롤리돌 신타제제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, 지 메이스 (Zea mays)의 AF529266 (옥수수; 유전자 tps1)을 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 패출리올 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, AY508730 (REGION: 포고스테몬 카블린 (Pogostemon cablin)의 1.1659)을 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 노트카톤 (nootkatone) 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, AF441124 (REGION: 1.1647, 시트러스 시넨시스 (Citrus sinensis)) 및 AY917195 (REGION: 1.1653, 펠릴라 프루테센스 (Perilla frutescens))를 포함한다.
일부 구현예들에서, 이종의 뉴클레오티드는 아비에타딘 (abietadiene) 신타제를 코딩한다. 적합한 뉴클레오티드 서열에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, (U50768; 아비에스 그란디스 (Abies grandis)) 및 (AY473621; 피세아 아비에스 (Picea abies))을 포함한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 C5 이소프레노이드를 생산한다. 이 화합물은 하나의 이소프렌 유닛으로부터 파생되며, 또한 헤미테르펜으로도 불리운다. 헤미테르펜에 대한 예시적인 예가 이소프렌이다. 다른 구현예들에서, 이소프레노이드는 C10 이소프레노이드이다. 이 화합물은 이소프렌 2개의 유닛으로부터 파생되며, 모노테르펜으로도 지칭된다. 모노테르펜에 대한 예시적인 예로는 리모넨, 시트라넬롤, 게라니올, 멘톨, 페릴릴 알코올, 리날롤, 튜온 (thujone) 및 미르센이 있다. 다른 구현예들에서, 이소프레노이드는 C15 이소프레노이드이다. 이 화합물은 이소프렌 3개의 유닛으로부터 파생되며, 세스퀴테르펜으로도 지칭된다. 세스퀴테르펜에 대한 예시적인 예로는 페리플라논 (periplanone) B, 징콜라이드 (gingkolide) B, 아모르파디엔, 아르테미시닌 (artemisinin), 아르테미신산 (artemisinic acid), 발렌센 (valencene), 노트카톤 (nootkatone), 에피-세드롤 (epi-cedrol), 에피-아리스톨로켄 (epi-aristolochene), 파르네솔 (farnesol), 고시폴 (gossypol), 사노닌 (sanonin), 페리플라논, 포르스콜린 (forskolin), 및 패촐롤 (패촐리 알코올이라고도 함)이 있다. 다른 구현예들에서, 이소프레노이드는 C20 이소프레노이드이다. 이 화합물은 이소프렌 4개의 유닛으로부터 파생되며, 또한 다이테르펜으로도 지칭된다. 다이테르펜에 대한 예시적인 예로는 카르벤 (casbene), 엘루테로빈 (eleutherobin), 파클리탁셀, 프로스트라틴 (prostratin), 슈도프테로신 (pseudopterosin) 및 탁사디엔 (taxadiene)이 있다. 또 다른 예로, 이소프레노이드는 C20+ 이소프레노이드이다. 이 화합물은 4개 보다 많은 수의 이소프렌 유닛들로부터 파생되며, 트리테르펜 (이소프렌 6개의 유닛으로부터 파생된 C30 이소프레노이드 화합물), 예컨대 아르브루시드 (arbruside) E, 브루세안틴 (bruceantin), 테스토스테론, 프로게스테론, 코르티손, 디지톡신 (digitoxin) 및 스쿠알렌; 테트라테르펜 (이소프레노이드 8개로부터 파생된 C40 이소프레노이드 화합물), 예컨대 베타-카로텐; 및 폴리테르펜 (8개 보다 많은 수의 이소프렌 유닛으로부터 파생된 C40+ 이소프레노이드 화합물), 예컨대 폴리이소프렌을 포함한다. 일부 구현예들에서, 이소프레노이드는 아비에타디엔, 아모르파디엔, 카렌, 알파-파르네센, 베타-파르네센, 파르네솔, 게라니올, 게라닐게라니올, 이소프렌, 리날롤, 리모넨, 미르센, 네롤리돌, 옥시멘, 패출롤, 베타-피넨, 사비넨, 감마-테르피넨, 페르피놀렌 및 발렌센으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이소프레노이드 화합물은, 또한, 비제한적으로, 카로테노이드 (예, 라이코펜, 알파- 및 베타-카로텐, 알파- 및 베타-크립토잔틴, 빅신 (bixin), 제아잔틴 (zeaxanthin), 아스타잔틴 (astaxanthin) 및 루테인), 스테로이드 화합물, 및 다른 화학 기로 변형된 이소프레노이드로 구성된 화합물들, 예컨대 혼성 테르펜-알카로이드 및 코엔자임 Q-10을 포함한다.
5.3 유전자 변형된 세포의 제조 방법
또한, 본 발명은, 전술한 한가지 이상의 변형, 예컨대 ADA, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제, AACS, PK, PTA 및 그외 메발로네이트 경로 효소로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산을 포함하도록 유전자 조작된 숙주 세포의 제조 방법을 제공한다. 숙주 세포에서 이종의 효소의 발현은, 숙주 세포에, 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 조절 인자의 통제를 받도록 상기 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 도입함으로써, 달성될 수 있다. 일부 구현예들에서, 핵산은 염색체외 플라스미드이다. 다른 구현예들에서, 핵산은 숙주 세포의 염색체로 뉴클레오티드 서열을 삽입할 수 있는 염색체 삽입 벡터이다.
이들 단백질을 코딩하는 핵산은, 비제한적인 예로, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 임의의 방법을 이용하여 숙주 세포로 도입할 수 있다 (예를 들어, Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1292-3; Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385; Goeddel et al. eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc. , CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; Ausubel et al. , eds. , Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY을 참조함). 기법의 예로는, 비제한적으로, 스페로플라스팅, 전기충격, PEG 1000 매개 형질전환 및 리튬 아세테이트 또는 리튬 클로라이드 매개의 형질전환을 포함한다.
숙주 세포내 효소의 카피 수는, 이 효소를 코딩하는 유전자의 전사를 수정함으로써 변형시킬 수 있다. 이는, 예를 들어, 이 효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 변형시킴으로써 (예로, 뉴클레오티드 서열을 포함하는 고카피수 또는 저카피수 발현 벡터를 이용하거나, 또는 숙주 세포의 게놈에 뉴클레오티드 서열의 부가 카피를 도입하거나 숙주 세포의 게놈에서 뉴클레오티드 서열을 결손 또는 파괴함으로써), 또는 오페론의 폴리시스트론 mRNA에서 코딩 서열의 순서를 바꾸거나 또는 오페론을 자신의 조절 인자를 가진 각각의 개개 유전자로 분할함으로써, 또는 뉴클레오티드 서열엘 작동가능하게 연결된 프로모터나 오퍼레이터의 세기를 높임으로써, 달성할 수 있다. 다른 예로, 또는 아울러, 숙주 세포에서 효소의 카피 수는, 이 효소를 코딩하는 mRNA의 번역 수준을 수정함으로써 변형시킬 수 있다. 이는, 예를 들어, mRNA의 안정성을 변형시키거나, 리보솜 결합부의 서열을 변형시키거나, 리보솜 결합부와 효소 코딩 서열의 개시 코돈 사이의 거리나 서열을 변형시킴으로써, 효소 코딩 영역의 개시 코돈의 5' 측의 "상류" 또는 인접하게 위치한 시스트론 사이 영역을 변형시킴으로써, mRNA 전사체의 3'-말단을 헤어핀 또는 특수 서열을 이용하거나 안정화하거나, 효소의 코돈 용법을 변형시키거나, 효소의 생합성에 사용되는 희귀 코돈 tRNA의 발현을 변형시키거나, 및/또는 효소의 안정성을 예를 들어 이의 코딩 서열의 돌연변이를 통해 높이므로써, 달성할 수 있다.
숙주 세포에서 효소의 활성은, 비제한적인 예로, 숙주 세포에서 증가된 또는 감소된 가용성을 나타내는 변형된 형태의 효소를 발현하거나, 효소의 활성을 저해하는 도메인이 결핍된 변형된 형태의 효소를 발현하거나, 기질에 대한 Kcat가 높거나 낮은, 또는 Km이 낮거나 높은 변형된 형태의 효소를 발현하거나, 또는 경로에서 다른 분자에 의한 피드백 또는 피드-포워드 조절에 의해 영향을 많이 또는 적게 받는 변형된 형태의 효소를 발현하는 등의, 다수 방식으로 변형시킬 수 있다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포를 유전자 변형하기 위해 사용되는 핵산은 형질전환된 숙주 세포의 선별과 외래 DMA를 유지하도록 숙주 세포에 선택압을 부여하는데 유용한 하나 이상의 선별 마커를 포함한다.
일부 구현예들에서, 선별 마커는 항생제 내성 마커이다. 항생제 내성 마커에 대한 예시적인 예로는, 비제한적으로, BLA, NAT1, PAT, AUR1-C, PDR4, SMR1, CAT, 마우스 dhfr, HPH, DSDA, KAN R , 및 SH BLE 유전자 산물을 포함한다. E. coli 유래 BLA 유전자 산물은 베타-락탐 항생제 (예, 스펙트럼이 좁은 세팔로스포린, 세파마이신 및 카르바페넴 (에르타페넴), 세파만돌 및 세포페라존)과, 테모실린을 제외한 모든 항-그람-음성 박테리아 페니실린에 대해 내성을 부여하며; 스트렙토마이세스 노우르세이 (S. noursei) 유래의 NAT1 유전자 산물은 노르세오트리신 (nourseothricin)에 대해 내성을 부여하며; 스크렙토마이세스 비리도크로모게네스 (S. viridochromogenes) Tu94 유래 PAT 유전자 산물은 비알로포스 (bialophos)에 대해 내성을 부여하며; 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 유래 AUR1-C 유전자 산물은 아우에로바시딘 A (Auerobasidin A) (AbA)에 대해 내성을 부여하며; PDR4 유전자산물은 세룰레닌 (cerulenin)에 대해 내성을 부여하며; SMR1 유전자 산물은 설포메투론 메틸에 대해 내성을 부여하며; Tn9 트랜스포손 유래 CAT 유전자 산물은 클로람페니콜에 대해 내성을 부여하며; 마우스 dhfr 유전자 산물은 메토트렉세이트에 대해 내성을 부여하며; 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumonia)의 HPH 유전자 산물은 히그로마이신 B에 대해 내성을 부여하며; E. coli 유래 DSDA 유전자 산물은 단일 질소원으로서 D-세린이 첨가된 플레이트에서 세포 생육을 허용하며; Tn903 트랜스포존의 KAN R 유전자는 G418에 대해 내성을 부여하며; 스트렙토알로테이쿠스 힌더스타누스 (Streptoalloteichus hindustanus) 유래 SH BLE 유전자 산물은 제오신 (Zeocin) (블레오마이신)에 대해 내성을 부여한다. 일부 구현예들에서, 항생제 내성 마터는 본원에 기술된 유전자 변형된 숙주 세포를 분리한 후에 제거된다.
일부 구현예들에서, 선별 마커는 유전자 변형된 미생물에서 영양요구성 (예, 영양분 영양요구성)을 구제한다. 이러한 구현예에서, 부모 미생물은, 아미노산 또는 뉴클레오티드 생합성 경로에서 기능하지만 부모 세포에게 비-기능성을 부여하였을 때 한가지 이상의 영양분의 보충없이 배지에서 생육할 수 없게 하는, 하나 이상의 유전자 산물에 대한 기능적 파괴를 포함한다. 이러한 유전자 산물로는, 비제한적으로, 효모에서의 HIS3, LEU2, LYS1, LYS2, MET15, TRP1, ADE2 및 URA3 유전자 산물을 포함한다. 이후, 영양요구성 표현형은 파괴된 유전자 산물의 기능적 카피를 코딩하는 발현 벡터 또는 염색체 삽입 구조체를 부모 세포에 형질전환함으로써, 복구할 수 있으며, 제조되는 유전자 변형된 숙주 세포는 부모 세포의 영양 요구성 표현형의 소실을 기초로 선별할 수 있다. URA3, TRP1 및 LYS2 유전자의 선별 마커로서의 이용은 파지티브 및 네거티브 선별이 모두 가능하기 때문에 현저한 이점을 가진다. 파지티브 선별은 URA3, TRP1 및 LYS2 돌연변이의 영양요구성 보완에 의해 수행되는 반면, 네거티브 선별은 특정 저해제, 즉, 프로토트로픽 균주의 생육은 방지하지만 각각 URA3, TRP1 및 LYS2 돌연변이의 생육을 허용하는, 5-플루오로-오로트산 (FOA), 5-플루오로안트라닐산 및 아미노아디프산 (aAA)을 이용한다. 다른 구현예들에서, 선별 마커는 공지 선별 방법으로 동정할 수 있는 그외 비-치사적 결핍 또는 표현형을 복원한다.
본원은 본원의 방법, 조성물 및 유기체에 이용가능한 특정 유전자와 단백질을 기술하지만; 이러한 유전자에 대한 완전한 동정이 필수적이지 않는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 폴리펩타이드 또는 효소를 코딩하는 서열을 포함하는 특정 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에 변형을 가하여, 활성을 스크리닝할 수 있다. 전형적으로, 이러한 변경은 보존적인 돌연변이와 침묵 돌연변이를 포함한다. 이러한 변형된 또는 돌연변이된 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩타이드는 당해 기술 분야에 공지된 방법을 이용하여 기능성 효소의 발현을 스크리닝할 수 있다.
유전자 코드의 선천적인 축중 (degeneracy)으로 인해, 기능적으로 동일하거나 등가의 폴리펩타이드를 실질적으로 코딩하는 다른 폴리뉴클레오티드도 사용하여, 이러한 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 클로닝하고 발현할 수 있다.
당해 기술 분야의 당업자에게 이해되는 바와 같이, 특정 숙주에서 이의 발현을 강화하도록 코딩 서열을 변형시키는 것이 유익할 수 있다. 유전자 코드는 가능한 코돈 64종으로 많지만, 대부분의 유기체는 전형적으로 이들 코돈의 서브세트를 이용한다. 종들에서 가장 흔히 사용되는 코돈을 최적 코돈이라고 하며, 이용하지 않는 코돈은 희귀 또는 저-가용성 코돈으로 분류된다. 코돈은 "코돈 최적화" 또는 "종에서 코돈 편향 조절"로 종종 치징되는 프로세스에서, 숙주의 선호적인 코돈 사용을 반영하여 치환할 수 있다.
특정 원핵생물 또는 진핵생물 숙주에 선호되는 코돈을 포함하는 최적화된 코딩 서열 (Murray et al., 1989, Nucl Acids Res. 17: 477-508)을, 예를 들어, 비-최적화된 서열로부터 만들어지는 전사체와 비교하여, 긴 반감기 등의 바람직한 특성을 가진 재조합 RNA 전사체를 생산하거나 또는 번역 속도를 높이도록, 준비할 수 있다. 또한, 번역 정지 코돈은 숙주 선호성을 반영하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)와 포유류의 전형적인 정지 코돈은 각각 UAA와 UGA이다. 단자엽 식물의 전형적인 정지 코돈은 UGA이고, 곤충과 E. coli는 통상 정지 코돈으로 UAA를 이용한다 (Dalphin et al., 1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8).
당해 기술 분야의 당업자는, 유전자 코드의 축중 특성으로 인해, 뉴클레오티드 서열에 차이가 있는 다양한 DNA 분자들을 사용하여 본원의 소정의 효소를 코딩할 수 있다는 것을 알 것이다. 전술한 생합성 효소를 코딩하는 천연 DNA 서열은 단지 본원의 일 구현예를 예시하기 위해 참조하며, 본원은 본원의 방법에서 사용되는 효소의 폴리펩타이드 및 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 임의의 서열의 DNA 분자를 포함한다. 비슷한 방식으로. 폴리펩타이드는 전형적으로 바람직한 활성의 소실 또는 유의한 소실 없이, 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산의 치환, 결손 및 삽입을 허용할 수 있다. 본원은, 변형된 또는 변이체 폴리펩타이드가 참조 폴리펩타이드의 효소적 이화 활성 또는 동화 활성을 가지는 한, 본원에 기술된 특정 단백질과 다른 아미노산 서열을 가진 상기한 폴리펩타이드를 포함한다. 아울런, 본원에 나타낸 DNA 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열은 단지 본원의 구현예들을 예시한다.
아울러, 본원에 제시된 조성물 및 방법에서 사용가능한 효소의 상동체도 본원에 포함된다. 일부 구현예들에서, 2종의 단백질 (또는 단백질의 영역)은, 아미노산 서열이 적어도 약 30%, 40%, 50% 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 동일성을 가지는 경우에, 실질적으로 상동하다. 2종의 아미노산 서열 또는 2종의 핵산 서열의 동일성 %를 확인하기 위해, 서열들을 최상으로 비교할 목적으로 정렬한다 (예, 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 양쪽에 갭을 도입할 수 있으며, 비-상동적인 서열은 비교를 위해 무시할 수 있음). 일 구현예에서, 비교 목적으로 정렬한 기준 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 30%, 전형적으로 적어도 40%, 보다 전형적으로 50%, 보다 더 전형적으로 적어도 60%, 보다 더 전형적으로 적어도 70%, 80%, 90%, 100%이다. 그 후 대응되는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기와 뉴클레오티드를 비교한다. 제1 서열의 한 위치에 제2 서열의 대응되는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 있는 경우, 이 분자는 그 위치에서 동일하다 (본원에서, 아미노산 또는 핵산 "동일성 (identity)"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 등가이다). 2개의 서열 간의 동일성 %는, 2종의 서열을 최적으로 정렬하기 위해 동입되어야 하는 갭 수와 각 갭의 길이를 고려하여, 서열들이 공유하는 동일한 위치의 갯수에 대한 함수이다.
"상동성"이 단백질 또는 펩타이드를 언급하는데 사용된다면, 동일하지 않은 잔기 위치들은 흔히 보존적인 아미노산 치환 차이가 있는 것으로 인지된다. "보존적인 아미노산 치환"은, 아미노산 잔기가 비슷한 화학적 특성 (예, 전하 또는 소수성)을 가진 측쇄 (R 기)를 가진 다른 아미노산 잔기로 치환된 것이다. 일반적으로, 보존적인 아미노산 치환은 단백질의 기능적인 특성을 실질적으로 바꾸지 않을 것이다. 2개 이상의 아미노산 서열이 보존적인 치환에 의해 서로 차이가 있을 경우, 서열의 동일성 % 또는 상동성 정도는 치환의 보존적인 특성을 보정하는 것 이상으로 조정될 수 있다. 이러한 조정을 가하는 수단은 당해 기술 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다 (예컨대, Pearson W. R., 1994, Methods in Mol Biol 25: 365-89).
다음과 같은 6가지 그룹들 각각은 서로에 대한 보존적인 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K); 5) 이소루신 (I), 루신 (L), 알라닌 (A), 발린 (V), 및 6) 페닐알라닌 (F), 티로신 (Y), 트립토판 (W).
또한 서열 동일성 %로 언급되는 폴리펩타이드의 서열 상동성은, 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정한다. 여러가지 유기체로부터 유래된 다수의 서열을 포함하는 데이타베이스에 대해 분자를 비교하는데 사용되는 전형적인 알고리즘은 컴퓨터 프로그램 BLAST이다. 여러가지 다수 유기체로부터 유래된 서열이 포함된 데이타베이스를 검색하는 경우, 아미노산 서열을 비교하는 것이 전형적이다.
아울러, 외래 효소를 코딩하는 임의 유전자 (또는 본원에 언급된 임의의 기타 (또는 이의 발현을 통제 또는 조절하는 임의의 조절 인자)는, 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된, 방향성 진화 또는 합리적인 돌연변이 유발 등의 유전자/단백질 조작 기법에 의해 최적화할 수 있다. 이러한 행위는 당해 기술 분야의 당업자가 효모에서 효소의 발현 및 활성을 최적화할 수 있게 한다.
아울러, 이들 효소를 코딩하는 유전자는 다른 진균 및 세균 종들에서 동정할 수 있으며, 이 경로를 조절하도록 발현시킬 수 있다. 비제한적인 예로, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) 및 사카로마이세스 우바룸 (S. uvarum) 등의 사카로마이세스 (Saccharomyces) spp., 클루이베로마이세스 써모톨러란스 (K. thermotolerans), 클루이베로마이세스 락티스 (K. lactis) 및 클루이베로마이세스 막시아누스 (K. marxianus) 등의 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) spp, 피키아 (Pichia) spp., 한세눌라 폴리모르파 (H. polymorpha) 등의 한세눌라 (Hansenula) spp., 칸디다 (Candida) spp., 트리코스포론 (Trichosporon) spp., 야마다지마 스티피티스 (Y. spp. stipitis) 등의 야마다지마 (Yamadazyma) spp., 토룰라스포라 프레토리엔시스 (Torulaspora pretoriensis), 이사첸키아 오리엔탈리스 (Issatchenkia orientalis), 스키조사카로마이세스 폼베 (S. pombe) 등의 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces) spp., 크립토코커스 (Cryptococcus) spp., 아스퍼질러스 (Aspergillus) spp., 뉴로스포라 (Neurospora) spp., 또는 우스틸라고 (Ustilago) spp. 등의, 다양한 유기체들이 이들 효소의 소스로서 사용될 수 있다. 혐기성 진균 유래 유전자의 소스로는, 비제한적으로, 피로마이세스 (Piromyces) spp., 오르피노마이세스 (Orpinomyces) spp., 또는 네오칼리마스틱스 (Neocallimastix) spp.를 포함한다. 사용가능한 원핵생물 효소의 소스로는, 비제한적으로, 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 자이모모나스 모빌리스 (Zymomonas mobilis), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 바실러스 (Bacillus) spp., 클로스트리듐 (Clostridium) spp., 코리네박테리움 (Corynebacterium) spp., 슈도모나스 (Pseudomonas) spp., 락토코커스 (Lactococcus) spp., 엔테로박터 (Enterobacter) spp., 및 살모넬라 (Salmonella) spp.를 포함한다.
당해 기술 분야에 공지된 기법들은 추가적인 상동성 유전자와 상동성 효소를 동정하는데 적합할 수 있다. 일반적으로, 유전자 상동체 및/또는 효소 상동체들을 기능적 분석을 통해 동정할 수 있으며, 기능적 유사성을 가질 것이다. 당해 기술 분야의 당업자에게 공지된 기법들은 유전자 유사체와 효소 유사체를 동정하는데 적합할 수 있다. 예를 들어, ADA 유전자, 단백질 또는 효소의 상동체 또는 유사체를 동정하기 위해, 비제한적으로, ADA 유전자/효소의 공개 서열을 토대로 한 프라이머를 이용한 PCR에 의해 또는 ADA 유전자들에서 보존적인 영역을 증폭하도록 설계된 축중 프라이머를 이용한 축중 PCR에 의해 유전자를 클로닝하는 등의, 기법들을 포함할 수 있다. 아울러, 당해 기술 분야의 당업자는 기능성 상동성 또는 유사성을 가진 유전자, 단백질 또는 효소의 상동체 또는 유사체를 동정하기 위해 기법들을 이용할 수 있다. 기법으로는 (예, 본원에 기술된 바와 같이, 또는 Kiritani, K., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970에 기술된 바와 같이) 활성에 대한 시험관내 효소 분석을 통해 효소의 촉매 활성을 세포 또는 세포 배양물에서 검사한 다음, 정제를 통해 상기 활성을 가진 효소를 분리하고, 에드만 분해, 가능성 있는 핵산 서열에 대한 PCR 프라이머 설계, PCR을 통한 상기 DNA 서열의 증폭 및 상기 핵산 서열의 클로닝 등의 기법을 통해 효소의 단백질 서열을 결정하는 것을 포함한다. 상동적이거나 유사한 유전자 및/또는 상동적이거나 유사한 효소, 유전자 유사체 및/또는 효소 또는 단백질의 유사체를 동정하기 위해, 또한, 기법은 BRENDA, KEGG 또는 MetaCYC 등의 데이타베이스를 이용하여 후보 유전자나 효소에 대한 데이타를 비교하는 것을 포함한다. 후보 유전자 또는 효소는 본원의 교시 내용에 따라 전술한 데이타베이스에서 동정할 수 있다.
5.4 이소프레노이드의 생산 방법
다른 측면에서, 본 발명은, (a) 본원에 기술된 임의의 유전자 변형된 숙주 세포 개체군을 이소프레노이드 화합물을 제조하는데 적합한 조건 하에서 탄소원이 부가된 배지에서 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배지로부터 상기 이소프레노이드 화합물을 회수하는 단계를 포함하는, 이소프레노이드의 생산 방법을 제공한다.
일부 구현예들에서, 유전자 변형된 숙주 세포는 ADA의 이종의 발현, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제의 이종의 발현, AACS의 이종의 발현, 포스포케톨라제의 이종의 발현, 포스포트랜스아세틸라제의 이종의 발현, 및 한가지 이상의 메발로네이트 경로 효소의 이종의 발현으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 변형을 포함하며; 유전자 변형된 숙주 세포는 상기 하나 이상의 변형을 포함하지 않는 부모 세포 또는 유전자 변형된 숙주 세포의 상기 하나 이상의 변형의 서브세트만을 포함하지만 유전적으로 동일한 부모 세포에 비해, 증가된 양으로 이소프레노이드 화합물을 생산한다. 일부 구현예들에서, 증가량은, 예를 들어 수율, 생산, 생산성을, 세포 배양물 L 당 g, 건조 세포 중량 g 당 mg, 세포 배양물 기준 (basis) 단위 체적 당, 건조 세포 중량 기준 단위 당, 세포 배양물 단위 부피/시간 기준 또는 건조 세포 중량 단위/단위 시간 기준으로 측정시, 적어도 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100% 또는 >100% 높다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 발효 배지 L 당 약 10 g 이상의 증가된 수준으로 이소프레노이드를 생산한다. 일부 이러한 구현예에서, 이소프레노이드는 세포 배양물 L 당 약 10 - 약 50 g, > 약 15 g, > 약 20 g, > 약 25 g 또는 > 약 30 g으로 생산된다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는 건조 세포 중량 g 당 약 50 mg 이상의 증가된 수준으로 이소프레노이드를 생산한다. 일부 이러한 구현예에서, 이소프레노이드는 건조 세포 중량 g 당 약 50 - 약 1500 mg, > 약 100 mg, > 약 150 mg, > 약 200 mg, > 약 250 mg, > 약 500 mg, > 약 750 mg, 또는 > 약 1000 mg으로 생산된다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는, 세포 배양물 기준 단위 부피 당, 부모 세포에서 생산되는 이소프레노이드 수준의, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배, 또는 적어도 약 1,000배이거나 또는 그 보다 많은, 증가된 수준으로 이소프레노이드를 생산한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는, 건조 세포 중량 기준 단위 당, 부모 세포에서 생산되는 이소프레노이드 수준의, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2. 5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배 또는 적어도 약 1,000배이거나 또는 그 보다 많은, 증가된 수준으로 이소프레노이드를 생산한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는, 세포 배양물 단위 부피/단위 시간 기준 당, 부모 세포에서 생산되는 이소프레노이드 수준의, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2. 5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배 또는 적어도 약 1,000배이거나 또는 그 보다 많은, 증가된 수준으로 이소프레노이드를 생산한다.
일부 구현예들에서, 숙주 세포는, 건조 세포 중량 단위/단위 시간 기준 당, 부모 세포에서 생산되는 이소프레노이드 수준의, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 적어도 약 100배, 적어도 약 200배, 적어도 약 300배, 적어도 약 400배, 적어도 약 500배 또는 적어도 약 1,000배이거나 또는 그 보다 많은, 증가된 수준으로 이소프레노이드를 생산한다.
대부분의 구현예들에서, 숙주 세포에 의한 증가된 수준으로의 이소프레노이드 생산은 유도성 화합물에 의해 유도가능하다. 이러한 숙주 세포는 상기 유도성 화합물의 부재시에 쉽게 조작할 수 있다. 유도성 화합물을 그런 후 첨가하여 숙주 세포에서 증가된 수준으로 이소프레노이드를 생산하도록 유도한다. 다른 구현예들에서, 숙주 세포에 의한 증가된 수준으로의 이소프레노이드 생산은 예를 들어 배양 온도, 배지 조성 등의 배양 조건에 변화를 줌으로써 유도가능하다.
5.4.1 배양 배지 및 조건
미생물 배양물을 유지 및 증식시키기 위한 재료와 방법들은 미생물학 또는 발효 과학 분야의 당업자들에게 잘 알려져 있다 (예를 들어, Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, second edition, McGraw Hill, New York, 1986). 숙주 세포의 특이적인 요구성, 발효 및 공정에 따라, 적절한 배양 배지, pH, 온도 및 호기, 미세호기 또는 혐기성 조건 등의 요건에 대해 고려가 이루어져야 한다.
본원에 제공되는 이소프레노이드 생산 방법은, 비제한적인 예로, 세포 배양 플레이트, 플라스크 또는 발효기 등의 적정 용기에서, 적정 배양 배지 (예, 판토테네이트 보충물이 첨가되거나 첨가되지 않은 배지)에서 수행될 수 있다. 또한, 본 방법은 미생물 생산의 산업적인 생산을 뒷받침하기 위해 당해 기술 분야에 공지된 임의의 발효 규모로 수행할 수 있다. 교반형 탱크 발효기, 에어리프트 발효기, 버블 발효기 또는 이들의 임의 조합 등의 임의의 적정 발효기가 사용될 수 있다. 숙주 세포로서 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)를 사용하는 특정 구현예에서, 균주는 Kosaric, et al, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sixth Edition, Volume 12, pages 398-473, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KDaA, Weinheim, Germany에 상세하게 기술된 발효기에서 배양할 수 있다.
일부 구현예들에서, 배양 배지는 이소프레노이드를 생산할 수 있는 유전자 변형된 미생물을 존속시킬 수 있는, 즉 증식과 생존을 유지시킬 수 있는, 모든 배양 배지이다. 일부 구현예들에서, 배양 배지는 동화할 수 있는 탄소원, 질소원 및 인원을 포함하는 수성 배지이다. 또한, 이러한 배지는 적정 염, 미네랄, 금속 및 기타 영양분을 포함할 수 있다. 일부 구현예들에서, 탄소원과 세포 필수 영양분들 각각은 발효 배지에 증가시키면서 또는 계속적으로 첨가하며, 각각의 필요 영양분은, 예를 들어, 탄소원을 바이오메스로 변환하는 세포의 대사 기능 또는 호흡 작용을 기초로 사전 결정된 세포 생육 곡선에 따라, 기본적으로 증식하는 세포에 의한 효율적인 동화에 필요한 최소 수준으로 유지된다.
미생물을 배양하기 위한 적정 조건과 적정 배지는 당해 기술 분야에 잘 공지되어 있다. 일부 구현예들에서, 적정 배지에는, 예를 들어, 유도제 (예, 유전자 산물을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 유도 프로모터의 통제를 받는 경우), 억제제 (예, 유전자 산물을 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열이 억제 프로모터의 통제를 받는 경우), 또는 선별 물질 (예, 유전자 변형을 포함하는 미생물을 선별하기 위한 항생제) 등의 한가지 이상의 추가적인 물질이 보충된다.
일부 구현예들에서, 탄소원은 단당류 (단순 당), 이당류, 다당류, 비-발효성 탄소원 또는 이들의 하나 이상의 조합이다. 적합한 단당류에 대한 비제한적인 예로는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 프럭토스, 리보스 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 이당류에 대한 비제한적인 예로는 슈크로스, 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로바이오스 (cellobiose) 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 다당류에 대한 비제한적인 예로는 스타치, 글리코겐, 셀룰로스, 키틴, 및 이들의 조합을 포함한다. 적합한 비-발효성 탄소원에 대한 비제한적인 예로는 아세테이트와 글리세롤을 포함한다.
배양 배지에서 글루코스와 같은 탄소원의 농도는 세포의 증식을 촉진시키지만, 사용되는 미생물의 증식을 억제할 만큼 높지 않아야 한다. 전형적으로, 배양은, 원하는 증식 및 바이오메스 수준을 달성하기 위한 수준이지만 미미한 수준 (검출 한계가 약 < 0.1g/l임)으로 첨가하면서 글루코스와 같은 탄소원과 함께 진행된다. 다른 구현예들에서, 글루코스와 같은 탄소원의 배양 배지에서의 농도는 > 약 1 g/L, 바람직하게는 > 약 2 g/L, 더 바람직하게는 > 약 5 g/L이다. 또한, 글루코스와 같은 탄소원의 배양 배지에서의 농도는 전형적으로 < 약 100 g/L, 바람직하게는 < 약 50 g/L, 더 바람직하게는 < 약 20 g/L이다. 배지 성분 농도에 대한 언급은 처음 및/또는 진행 중인 성분의 농도 둘다를 지칭할 수 있는 것임에 유념하여야 한다. 어떤 경우에는, 배양 중에 탄소원이 고갈되도록 배양 배지를 두는 것이 바람직할 수도 있다.
적합한 배양 배지에 사용할 수 있는 동화가능한 질소원으로는, 비제한적으로, 단순 질소원, 유기 질소원 및 복합 질소원을 포함한다. 이러한 질소원으로는 동물, 식물 및/또는 미생물 기원의 무수 암모니아, 암모늄 염 및 기질을 포함한다. 적합한 질소원으로는, 비제한적으로, 단백질 가수분해물, 미생물 바이오메스 가수분해물, 펩톤, 효모 추출물, 암모늄 설페이트, 우레아 및 아미노산을 포함한다. 전형적으로, 배양 배지내 질소원의 농도는 > 약 0.1 g/L, 바람직하게는 > 약 0.25 g/L, 더 바람직하게는 > 약 1.0 g/L이다. 그러나, 특정 농도를 초과하여, 배양 배지에 질소원을 첨가하는 것은 미생물의 배양에 유익하지 않다. 그 결과, 배양 배지내 질소원의 농도는 < 약 20 g/L, 바람직하게는 < 약 10 g/L, 더 바람직하게는 < 약 5 g/L이다. 또한, 일부 경우들에서는, 배양 중에 배양 배지에서 질소원이 고갈되게 하는 것이 바람직할 수 있다.
유효 배양 배지는 무기염, 비타민, 미량 금속 및 증식 촉진제 등의 다른 화합물도 포함할 수 있다. 또한, 이러한 다른 화합물들은 유효 배지에 탄소원, 질소원 또는 미네랄원으로서 존재하거나, 또는 배지에 특이적으로 첨가될 수 있다.
또한, 배양 배지는 적정 인원을 포함할 수 있다. 이러한 인원으로는 무기 인원과 유기 인원을 둘다 포함한다. 바람직한 인원으로는, 비제한적으로, 모노 또는 다이베이직 소듐 및 포타슘 포스페이트 등의 포스페이트 염, 암모늄 포스페이트 및 이의 혼합물을 포함한다. 전형적으로, 배양 배지에서 인 농도는 > 약 1.0 g/L, 바람직하게는 > 약 2.0 g/L, 더 바람직하게는 > 약 5.0 g/L이다. 그러나, 특정 농도를 초과하여, 배양 배지에 인을 첨가하는 것은 미생물의 배양에 유익하지 않다. 즉, 배양 배지내 인 농도는 전형적으로 < 약 20 g/L, 바람직하게는 < 약 15 g/L, 더 바람직하게는 < 약 10 g/L이다.
또한, 배양 배지는 적정 마그네슘 소스를, 비슷한 양의 마그네슘에 기여하는 농도로 다른 마그네슘 소스들도 사용될 수 있지만, 바람직하게는 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트 등의 생리적으로 허용가능한 염 형태로, 포함할 수 있다. 전형적으로, 배양 배지에서 마그네슘의 농도는 > 약 0.5 g/L, 바람직하게는 > 약 1.0 g/L, 더 바람직하게는 > 약 2.0 g/L이다. 그러나, 특정 농도를 초과하여, 배양 배지에 마그네슘을 첨가하는 것은 미생물의 배양에 유익하지 않다. 즉, 배양 배지내 마그네슘의 농도는 전형적으로 < 약 10 g/L, 바람직하게는 < 약 5 g/L, 더 바람직하게는 < 약 3 g/L이다. 또한, 어떤 경우에는, 배양 중에 배양 배지에서 마그네슘 소스를 고갈되게 하는 것이 바람직할 수 있다.
일부 구현예들에서, 배양 배지는 트리소듐 사이트레이트의 이수화물 (dihydrate) 등의 생물학적으로 허용가능한 킬레이트를 또한 포함할 수 있다. 이 경우, 배양 배지내 킬레이트의 농도는 > 약 0.2 g/L, 바람직하게는 > 약 0.5 g/L, 더 바람직하게는 > 약 1 g/L이다. 그러나, 특정 농도를 초과하여, 배양 배지에 킬레이트제를 첨가하는 것은 미생물의 배양에 유익하지 않다. 즉, 배양 배지내 킬레이트제의 농도는 전형적으로 < 약 10 g/L, 바람직하게는 < 약 5 g/L, 더 바람직하게는 < 약 2 g/L이다.
또한, 배양 배지는 배양 배지의 바람직한 pH를 유지하기 위해 생물학적으로 허용가능한 산 또는 염기를 처음에 포함할 수 있다. 생물학적으로 허용가능한 산으로는, 비제한적으로, 염산, 황산, 질산, 인산 및 이의 혼합물을 포함한다. 생물학적으로 허용가능한 염기로는, 비제한적으로, 암모늄 하이드록사이드, 소듐 하이드록사이드, 포타슘 하이드록사이드 및 이의 혼합물을 포함한다. 일부 구현예들에서, 사용되는 염기는 암모늄 하이드록사이드이다.
또한, 배양 배지는, 비제한적인 예로, 칼슘 클로라이드 등의 생물학적으로 허용가능한 칼슘염을 포함할 수 있다. 전형적으로, 칼슘 클로라이드, 이수화물 등의 칼슘원의 배양 배지에 농도는 약 5 mg/L - 약 2000 mg/L, 바람직하게는 약 20 mg/L - 약 1000 mg/L, 더 바람직하게는 약 50 mg/L - 약 500 mg/L의 범위이다.
또한, 배양 배지는 소듐 클로라이드를 포함한다. 전형적으로, 배양 배지에서 소듐 클로라이드의 농도는 약 0.1 g/L - 약 5 g/L, 바람직하게는 약 1 g/L - 약 4 g/L, 더 바람직하게는 약 2 g/L - 약 4 g/L의 범위이다.
일부 구현예들에서, 배양 배지는 또한 미량 금속을 포함할 수 있다. 이러한 미량 금속은, 편의상, 배양 배지의 나머지 부분과 별도로 준비할 수 있는, 스톡 용액으로서 배양 배지에 첨가할 수 있다. 전형적으로, 배양 배지에 첨가되는 이러한 미량 금속 용액의 양은 > 약 1 ml/L, 바람직하게는 > 약 5 mL/L, 더 바람직하게는 > 약 10 mL/L이다. 그러나, 특정 농도를 초과하여, 배양 배지에 미량 금속을 첨가하는 것은 미생물의 배양에 유익하지 않다. 즉, 배양 배지에 첨가되는 미량 금속 용액은 전형적으로 < 약 100 mL/L, 바람직하게는 < 약 50 mL/L, 더 바람직하게는 < 약 30 mL/L이다. 아울러, 스톡 용액에 미량 금속을 첨가하기 위해, 개개 성분들을, 미량 금속 용액의 상기 범위로 표시된 성분들의 양에 독립적으로 해당되는 범위로 각각 개별적으로 첨가할 수 있다는 것에 유념하여야 한다.
배양 배지는 판토테네이트, 바이오틴, 칼슘, 판토테네이트, 이노시톨, 피리독신-HCl 및 티아민-HCl 등의 다른 비타민을 포함할 수 있다. 이 비타민을, 편의상, 배양 배지의 나머지 부분과 별도로 준비할 수 있는, 스톡 용액으로서 배양 배지에 첨가할 수 있다. 그러나, 특정 농도를 초과하여, 배양 배지에 비타민을 첨가하는 것은 미생물의 배양에 유익하지 않다.
본원에 기술된 발효 방법은, 비제한적으로, 배치식, 피드-배치식, 세포 리사이클, 연속 및 반-연속식을 포함하는, 통상적인 배양 방식으로 수행할 수 있다. 일부 구현예들에서, 발효는 피드-배치 모드로 수행한다. 이러한 예에서, 배지 성분들의 일부는 배양 중에, 예컨대 판토테네이트는 발효의 생산 단계 중에 고갈된다. 일부 구현예들에서, 증식 및/또는 이소프레노이드 생산이 첨가가 필요한 시점 이전에 일정 기간 동안 유지되도록, 배양물에, 예를 들어, 생산 단계의 시작시에 상기한 성분을 상대적으로 고 농도로 첨가할 수 있다. 이들 성분들의 바람직한 범위는 수준이 배양에 의해 고갈됨에 따라 첨가함으로써 배양 중에 유지시킨다. 배양 배지내 성분들의 수준은, 예를 들어, 배양 배지를 주기적으로 샘플링하여 농도를 분석함으로써, 모니터링할 수 있다. 다른 예로, 표준 배양 공정이 전개되면, 배양 중 특정 시점에 공지된 수준에 해당되는 시간 조절된 간격으로 첨가를 행할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자에게 공지되는 바와 같이, 배지의 세포 밀도가 증가됨에 따라 배양 중에 영양분의 소비 속도는 빨라진다. 아울러, 외래 미생물이 배양 배지에 도입되는 것을 방지하기 위해, 당해 기술 분야에 공지된 바와 같이, 무균 첨가 방법을 이용하여 첨가한다. 아울러, 소포제 (anti-foaming agent)도 소량 배양 중에 첨가할 수 있다.
배양 배지의 온도는 유전자 변형된 세포의 배양 및/또는 이소프레노이드의 생산에 적합한 모든 온도일 수 있다. 예를 들어, 배양 배지에 접종물을 접종하기 전에, 배양 배지를 약 20℃ - 약 45℃, 바람직하게는 약 25℃ - 약 40℃, 더 바람직하게는 약 28℃ - 약 32℃의 범위내 온도로 만들어 유지할 수 있다.
배양 배지의 pH는 배양 배지에 산 또는 염기를 첨가함으로써 조절할 수 있다. pH를 조절하기 위해 암모니아를 사용하는 경우, 배양 배지에 질소원으로서 이것이 편리하게 사용된다. 바람직하게는, pH는 약 3.0 - 약 8.0, 더 바람직하게는 약 3.5 - 약 7.0, 가장 바람직하게는 약 4.0 - 약 6.5로 유지된다.
일부 구현예들에서, 배양 배지의 글루코스 농도 등의 탄소원 농도는 배양 중에 모니터링한다. 배양 배지의 글루코스 농도는, 예를 들어, 상층액, 예컨대 배양 배지의 무세포성 성분에서 글루코스 농도를 모니터링하는데 사용할 수 있는, 글루코스 옥시다제 효소 테스트 또는 고압 액체 크로마토그래피를 이용하는 등의, 공지 기법을 이용하여 모니터링할 수 있다. 이전에 언급된 바와 같이, 탄소원의 농도는 세포 배양 저해가 이루어지는 수준 보다 낮게 유지되어야 한다. 이 농도는 유기체에 따라 달라질 수 있지만, 탄소원으로서 글루코스의 경우, 세포 배양 저해는, > 약 60 g/L의 글루코스 농도에서 이루어지며, 실험을 통해 쉽게 측정할 수 있다. 즉, 탄소원으로서 글루코스를 사용하는 경우, 글루코스가 바람직하게는 발효기에 공급되며 검출 한계 이하로 유지된다. 다른 예로, 배양 배지내 글루코스 농도는 약 1 g/L - 약 100 g/L, 더 바람직하게는 약 2 g/L - 약 50 g/L, 더 더 바람직하게는 약 5 g/L - 약 20 g/L의 범위로 유지된다. 탄소원의 농도는 예를 들어 실질적으로 순수한 글루코스 용액을 첨가함으로써 바람직한 수준으로 유지시킬 수 있지만, 오리지날 배양 배지의 분액을 첨가함으로써 배양 배지의 탄소원 농도를 유지하는 것이 허용되며, 바람직할 수 있다. 오리지날 배양 배지의 분액 사용은, 배지내 다른 영양분의 농도 (예, 질소원 및 인원)를 동시에 유지시킬 수 있기 때문에, 바람직할 수 있다. 이와 같이, 미량 금속 농도도 미량 금속 용액의 분액을 첨가함으로써 배양 배지에서 유지시킬 수 있다.
5.4.2 이소프레노이드 회수
숙주 세포에서 이소프레노이드가 생산되면, 이는 당해 기술 분야에 공지된 방법으로 임의의 적정 분리 및 정제를 이용하여 후속적인 사용을 위해 회수 또는 분리할 수 있다. 일부 구현예들에서, 원심분리에 의해 발효물로부터 이소프레노이드를 포함하는 유기상을 분리한다. 다른 구현예들에서, 이소프레노이드를 포함하는 유기상을 발효물로부터 자연적으로 분리한다. 다른 구현예들에서, 이소프레노이드를 포함하는 유기상은 발효 반응물에 탈유화제 (deemulsifier) 및/또는 핵제 (nucleating agent)를 첨가함으로써, 발효물로부터 분리한다. 탈유화제에 대한 예시적인 예로는 응결제 및 응집제를 포함한다. 핵제에 대한 예시적인 예로는 이소프레노이드 자체와 도데칸, 이소프로필 미리스트레이트 및 메틸 올리에이트 등의 유기 용매로 구성된 액적을 포함한다.
이들 세포에서 생산되는 이소프레노이드는 배양 상층물에 존재하거나 및/또는 숙주 세포와 조합하여 존재할 수 있다. 이소프레노이드가 숙주 세포와 조합하여 존재하는 구현예에서, 이소프레노이드의 회수는 세포를 투과화하거나 세포 용혈시키는 방법을 포함한다. 다른 예로, 또는 동시에, 배양 배지내 이소프레노이드는, 비제한적인 예로, 크로마토그래피, 추출, 용매 추출, 막 분리, 전기투석, 역 삼투, 증류, 화학 유도체화 및 결정화 등의, 회수 공정을 이용하여 회수할 수 있다.
일부 구현예들에서, 이소프레노이드는 유기 상에 존재할 수 있는 다른 산물들로부터 분리한다. 일부 구현예들에서, 분리는 흡착, 증류, 가스-액체 추출 (스트립핑), 액체-액체 추출 (용매 추출), 한외여과 및 표준 크로마토그래피 기법을 이용하여 달성한다.
6. 실시예
6.1 실시예 1:
NADH-특이적인 HMG-CoA 리덕타제의 동정 및 특정화
본 실시예는 NADH 조인자 특이성을 가지는 것으로 이전에 공지되지 않은 HMG-CoA 리덕타제의 동정과 특정화에 대해 기술한다.
6.1.1 재료 및 방법
6.1.1.1 균주 조작
야생형 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주 (CEN.PK2, Mat a, ura3 - , TRP1+, leu2 - , MAL2-8C, SUC2)를 메발로네이트 (MevT) 경로를 발현하기 위한 숙주 세포로 사용하였다 (이로써, 아세틸-CoA 티올라제 (ERG10)는 아세틸-CoA를 아세토아세틸-CoA로 변환함; HMG-CoA 신타제 (ERG13)는 아세토아세틸-CoA를 HMG-CoA로 변환함; HMG-CoA 리덕타제는 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환함 (도 1)).
본 균주를, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) (ZP_06815052), 헤르페토시폰 아우란티아쿠스 (Herpetosiphon aurantiacus) (YP_001546303), 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii) (P13702), 델프티아 액시도보란스 (Delftia acidovorans) (YP_001561318), 멘타노세이타 써모필라 (Menthanosaeta thermofila) (YP_843364) 또는 살리시박터 포메오이리 (Silicibacter pomeoyri) (YP_164994)로부터 유래된 이종의 클래스 II HMG-CoA 리덕타제; 또는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) HMG-CoA 리덕타제 (tHMG-CoA 리덕타제) (EEU05004)의 N-말단이 절단된 버전 중 어느 하나를 코딩하는 플라스미드로 형질전환하였다. 클래스 II HMG-CoA 리덕타제는 효모에서의 발현을 위해 코돈 최적화되었으며, C-말단 FLAG-HIS 테그를 가미하여 화학적으로 합성하였으며, 단 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii) HMG-CoA 리덕타제는 다음과 같은 부가적인 변형을 가미하여 합성하였다.
NotI 사이트 - GAL1 프로모터 - NdeI 사이트 - [슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii) HMG-CoA 리덕타제] - EcoRI 사이트 - FLAG 테그 - HIS 테그 - 정지 코돈 - PGK1 종결인자 - NotI 사이트
이 DNA를 pBluescript SK+ 벡터 (Stratagene)의 NotI 사이트에 클로닝하였다. 야생형 CENPK2 균주의 게놈 DNA 추출물을 주형으로 이용하고, 올리고뉴클레오티드인 YT_164_30_Gal7F (5' 말단에 SacI과 NotI 제한 효소 부위가 포함됨)와 YT_164_30_Gal7R (3'-말단에 NdeI 제한 효소 부위가 포함됨)를 이용하여, 효모 Gal7 프로모터를 PCR로 증폭하였다 (표 2). PCR 산물을 pCR II-TOPO 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. 양 플라스미드를 SacI과 NotI으로 자르고, 절단된 Sc.GAL7 프로모터를 이용하여 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii) HMG-CoA 리덕타제 유전자의 상류 Gal1 프로모터와 치환하였다. 제조되는 플라스미드와 pAM70 (서열번호 23), 즉 URA3 마커를 가진 효모 에피좀 벡터 pRS426 둘다를 NotI으로 절단하였다. 그런 후, pAM70의 NotI 절단부에 NotI 단편을 연결함으로써, 플라스미드 pAM01147 (서열번호 24)을 구축하였다. 이 플라스미드는, 플라스미드를 NdeI과 EcoRI으로 자른 후, 5'-말단과 3'-말단에 각각 NdeI 및 EcoRI 사이트를 가지는 절단한 대상 HMG-CoA 리덕타제 코딩 서열과 연결함으로써, 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii) HMG-CoA 리덕타제 코딩 서열을 임의의 대상 HMG-CoA 리덕타제 코딩 서열 (효모 tHMG-CoA 리덕타제가 포함됨)로 치환하기 위한 베이스 플라스미드로 사용하였다. 플라스미드 DNA 증폭은 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli) 균주 DH5알파에서 수행하였다. 그 후, 균주 Y1389에 여러가지 HMG-CoA 리덕타제의 코딩 서열을 보유한 플라스미드를 형질전환하고, 형질전환체를 2% 글루코스가 포함된 우라실 무첨가 CSM 배지 플레이트에서 선별하였다. 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)로의 모든 DNA 매개 형질전환은, Gietz RW and Woods RA, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology, Part B. San Diego, CA: Academic Press Inc. pp. 87-96 (2002)에 기술된 바와 같은, 표준 리튬 아세테이트 공정을 이용하여 수행하였다.
Sc. 아세토아세틸-CoA 티올라제 (ERG10) 및 Sc.HMG-CoA 신타제 (ERG13)의 게놈내 삽입은, 하기 나타낸 삽입 구조체 (서열번호 25)를 이용하여 숙주 균주의 Gal80 유전자 좌를 타겟팅하였다.
Figure pct00001
삽입 구조체의 각 성분을 주형으로 Y002 게놈 DNA 100 ng을 이용하여 PCR 증폭하였다. -1000에서 -1 위치의 상류 GAL80 유전자 좌의 PCR 증폭을 올리고뉴클레오티드 YT_164_36_001 및 YT_164_36_003 (표 2)을 이용하여 수행하였다. 효모 ERG10 및 ERG13 유전자의 PCR 증폭은, ERG13의 경우 올리고뉴클레오티드들 YT_164_36_002 및 YT_164_36_005와, ERG10의 경우 YT_164_36_006 및 YT_164_36_009 쌍을 이용하여 수행하였다. 올리고뉴클레오티드들 YT_164_36_004 및 YT_164_36_007을 사용하여 GAL1/10 프로모터를 증폭하였으며, 프라이머 YT_164_36_008 및 YT_164_36_011은 이를 이용하여 LEU2 유전자를 증폭하였다. (정지 코돈 이후의) 23에서 1000에 위치한 하류 GAL80 유전자 좌는 올리고뉴클레오티드들 YT_164_36_010 및 YT_164_36_012를 이용하여 PCR 증폭하였다. 각 DNA 조각 100 fmol을 하나의 시험관에 넣고, 프라이머 YT_164_36_001과 YT_164_36_012를 이용한 스티칭 PCR 반응에 의해 조립하였다. 예상된 분자량을 가지는 PCR 산물들을 겔에서 정제하였다.
표 2. 균주 조작에 사용된 프라이머들
프라이머 명 서열번호 프라이머 서열
YT_164_36_001 서열번호 26 GCCTGTCTACAGGATAAAGACGGG
YT_164_36_002 서열번호 27 TCCCGTTCTTTCCACTCCCGTCTATATATATATCATTGTTATTA
YT_164_36_003 서열번호 28 TAATAACAATGATATATATATAGACGGGAGTGGAAAGAACGGGA
YT_164_36_004 서열번호 29 CCAACAAAGTTTAGTTGAGAGTTTCATTTATATTGAATTTTCAAAAATTCTTAC
YT_164_36_005 서열번호 30 GTAAGAATTTTTGAAAATTCAATATAAATGAAACTCTCAACTAAACTTTGTTGG
YT_164_36_006 서열번호 31 GTCAAGGAGAAAAAACTATAATGTCTCAGAACGTTTACATTGTATCGACTGCCAGAACCC
YT_164_36_007 서열번호 32 GGGTTCTGGCAGTCGATACAATGTAAACGTTCTGAGACATTATAGTTTTTTCTCCTTGAC
YT_164_36_008 서열번호 33 GTGTGCCTTTTGACTTACTTTTACGTTGAGCCATTAGTATCA
YT_164_36_009 서열번호 34 TGATACTAATGGCTCAACGTAAAAGTAAGTCAAAAGGCACAC
YT_164_36_010 서열번호 35 GATATTTCTTGAATCAGGCGCCTTAGACCCCCCAGTGCAGCGAACGTTATAAAAAC
YT_164_36_011 서열번호 36 GTTTTTATAACGTTCGCTGCACTGGGGGGTCTAAGGCGCCTGATTCAAGAAATATC
YT_164_36_012 서열번호 37 AAATATGACCCCCAATATGAGAAATTAAGGC
YT_164_30_Gal3F 서열번호 38 GAGCTCGCGGCCGC GTACATACCTCTCTCCGTATCCTCGTAATCATTTTCTTGT
YT_164_30_Gal3R 서열번호 39 CATATGACTATGTGT TGCCCTACCTTTTTACTTTTATTTTCTCTTT
YT_164_30_Gal7F 서열번호 40 GAGCTCGCGGCCGC GTGTCACAGCGAATTTCCTCACATGTAGGGACCGAATTGT
YT_164_30_Gal7R 서열번호 41 CATATGTTTTGAGGGAATATTCAACTGTTTTTTTTTATCATGTTGA
RYSE 0 서열번호 42 GACGGCACGGCCACGCGTTTAAACCGCC
RYSE 19 서열번호 43 CCCGCCAGGCGCTGGGGTTTAAACACC
(전술한) 여러가지 HMG-CoA 리덕타제로 형질전환된 Y1389 유도체에, 아래 표 3에 열거된 균주를 구축하기 위해, ERG 10/ERG13 삽입 구조체를 형질전환하였다. 형질전환체들을 우라실과 루신이 무첨가된 2% 글루코스를 함유하는 CSM 배지 플레이트에서 선별하였다. 모든 유전자 파괴 및 치환은 표현형 분석과 콜러니 PCR로 검증하였다.
표 3: 균주 설명
균주 # 설명 adh1 낫 아웃한 이후의 균주 #
Y1431 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) tHMG-CoA 리덕타제를 구비한 MevT Y1804
Y1432 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) HMG-CoA 리덕타제를 구비한 MevT 　
Y1433 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii) HMG-CoA 리덕타제를 구비한 MevT Y1805
Y1435 델프티아 액시도보란스 (D. acidovorans) HMG-CoA 리덕타제를 구비한 MevT Y1806
Y1436 멘타노세이타 써모필라 (M. thermofila) HMG-CoA 리덕타제를 구비한 MevT 　
Y1486 헤르페토시폰 아우란티아쿠스 (H. aurantiacus) HMG-CoA 리덕타제를 구비한 MevT 　
Y1487 실리시박터 포메로이(S. pomeroyi) HMG-CoA 리덕타제를 구비한 MevT Y1807
균주 Y1431, Y1433, Y1435 및 Y1487의 경우, ADH1 유전자는 하기 나타낸 파괴 구조체를 이용하여 낫아웃하였다 (서열번호 44):
Figure pct00002
파괴 구조체는 미국 특허 8,221,982에 기술된 폴리뉴클레오티드 조립 방법에 의해 제작하였다. 삽입 구조체의 ADH1 5' 상동성 영역은 ADH1 코딩 서열의 -563에서 -77 위치와 상동적이며, ADH1 3' 상동성 영역은 (ADH1 유전자의 정지 코돈 하류) 87에서 538 위치와 상동적이다. 프라이머 RYSE 0 및 RYSE 19를 사용하여 산물을 증폭시켰다. 균주 Y1431, Y1433, Y1435 및 Y1487 (표 2)은 산물로 형질전환하였고, 형질전환체를 2% 글루코스 및 G418 (제네티신 (Geneticin))이 첨가된 YPD 배지 플레이트에서 선별하였다. ADH1 유전자의 파괴는 표현형 분석과 콜로니 PCR로 검증하였다.
6.1.1.2 세포 배양
해당 효모 균주의 콜로니 하나를 2% 슈크로스가 첨가된 효모 질소 베이스 (YNB) 3 ml에서 밤새 스타터 배양으로서 배양하였다. 다음날, 250 ml 일회용 PETG 멸균 플라스크 (Nalgene)에서 40 ml YNB-4% 슈크로스 생산용 배양 배지에서 배양한 스타터 배양물을 최초 OD600 0.05로 희석하여, 생산용 플라스크를 준비하였다. 이 플라스크는 아래 나타낸 기간 동안 250 RPM으로 교반하면서 30℃에서 인큐베이션하였다.
6.1.1.3 세포 무함유성 추출물을 이용한 HMG-CoA 리덕타제의 활성 분석
효모 세포를 HMG-CoA 리덕타제 활성 분석 (도 8)을 위해 48시간, 또는 메발로네이트 분석 (표 4)을 위해 72시간 배양하고, 15 mL 팔콘 시험관에서 팔콘 시험관용의 적절한 캐리지가 장착된 스윙 버켓 로터 JS-5.3를 이용하여 10분간 4000 x g로 원심분리하여 회수하였다. 세포 펠렛을 1 ml에 재현탁하고, 차가운 세포용혈 완충액 (100 mM Tris pH 7.0 + Mini, EDTA 프리 프로테아제 저해제 정제 (Roche) 추가됨, 1 mM DTT 및 1 mM EDTA)으로 1번 헹구었다. 그런 후, 세포를 O 고리 캡이 장착된 2 mL 플라스틱 스크류 캡의 마이크로퓨즈 시험관 (Fisher Brand 520-GRD)으로 옮기고, 파괴 비드 (Disruption beads, 0.5Mm, Fisher)와 비드 비터를 6 M/S으로 1분간 사용하여, 세포를 용혈시켰다. 이 시험관을 즉시 빙수조에 적어도 5분간 두었다. 시헌관을 20분간 최소 8000 x g로 원심분리하였다. 상층액을 새로운 차가운 시험관으로 옮겼다. 단백질에 대한 고전적인 브래드포드 분석을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다 (Bradford MM A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem 72, 248-254 (1976)).
HMG-CoA 리덕타제 분석을 위해, 반응 완충액 (100 mM 포스페이트 완충제 pH 7.0, 100 mM KCl, 1 mM DTT + 1 mM EDTA)을 먼저 30℃에서 96웰 플레이트에서 예비-인큐베이션하였다. 최종 농도 150 μM으로 NADH 또는 NADPH, 최종 농도 400 μM으로 HMG-CoA 및 최종 농도 5 mM으로 DTT를 각 웰에 최종 부피 190 ㎕로 첨가하였다. 분석은, 먼저, 직선형 활성 범위로 희석한 세포 무함유 추출물을 10 ㎕ 첨가함으로써 개시하였다. 반응물은 Molecular Devices Spectramax M5 플레이트 리더를 이용하여 340 nm에서 NADPH 또는 NADH 흡광도 감소를 측정함으로써, 모니터링하였다. 340 nm에서의 단백질 농도에 따른 흡광 곡선의 기울기를 이용하여 각 세포-무함유 추출물에서의 HMGr 비활성을 계산하였다.
6.1.1.4 유기 산 및 알코올 측정
유기 산 및 알코올 분석용 샘플은, 발효 배지 1 ml을 취한 후, 이를 1.5 ml 에펜도르프 관에 넣어 준비하였다. 샘플을 테이블 에펜도르프 원심분리기를 이용하여 13,000 RPM으로 1분간 회전시켰다. 그런 후, 상층액을 15 mM 황산에 희석 (1:1 v/v)하였다. 혼합물을 볼텍싱하고, 13,000 RPM으로 1분간 원심분리하였다. 투명해진 상층액을 HPLC 분석을 위해 바이얼로 옮겼다.
HPLC 분석은, HPLC Thermofisher를 이용하고, Column Waters IC-Pak 7.8 mm x 300 mm, 7 mm, 50 Å(Waters)과 굴절지수 (RI) 검출 (Thermofisher)을 이용한 크기 배제 크로마토그래피에 의해, 글리세롤 및 메발로네이트 함량에 대해 수행하였다. 용출은 유속 0.6 mL/min의 15mM 황산 수용액을 이동상으로 이용하여 등전점에 의해 수행하였다.
6.1.2 결과
6.1.2.1 클래스 II HMG-CoA 리덕제의 조인자 특이성 결정
도 8에 나타낸 바와 같이, 델프티아 액시도보란스 (D. acidovorans) 및 실리시박터 포메로이(S. pomeroyi) 유래의 HMG-CoA 리덕타제는 NADH에 대해 높은 특이성과 시험관내 높은 비활성을 나타낸다. 이들 HMG-CoA 리덕타제는 NADPH의 존재 하에서는 비활성을 실제 나타내지 않았지만, NADH의 존재 하에서는 비활성이 400 nmol/mg/min에 달하였다. 마찬가지로, 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii) 유래 HMG-CoA 리덕타제는 조인자로서 NADH에 대해 선택성을 나타내었으며, 이는 이전에 공개된 보고서와 일치한다. 예로, Hedl et al., J. Bacteriol 186(7):1927-1932 (2004)를 참조한다. 반면에, 사카로마이세스 세레비지아 (S. cerevisiae), 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 및 헤르페토시폰 아우란티아쿠스 (H. aurantiacus) 유래의 HMG-CoA 리덕타제들은 NADH의 존재 시에 측정가능한 활성을 나타내지 않았으며, 멘타노세이타 써모필라 (M. thermofila)의 HMG-CoA 리덕타제는 NADPH 및 NADH가 둘다 존재하는 조건에서 겨우 검출가능한 수준의 활성을 나타내었다. 이러한 결과들은, 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii) 유래의 HMG-CoA 리덕타제와 마찬가지로, 델프티아 액시도보란스 (D. acidovorans) 및 실리시박터 포메로이(S. pomeroyi)로부터 유래된 HMG-CoA 리덕타제들이 NADH-선택적인 HMG-CoA 리덕타제이라는 것을 의미한다.
아울러, 표 4는, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 (슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii), 델프티아 액시도보란스 (D. acidovorans) 및 실리시박터 포메로이 (S. pomeroyi)로부터 각각 유래됨)를 포함하는 MevT 경로를 가진 균주가, NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 (사카로마이세스 세레비지아 (S. cerevisiae), 스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 및 헤르페토시폰 아우란티아쿠스 (H. aurantiacus)로부터 각각 유래됨)를 포함하는 MevT 경로를 가진 균주에 비해 메발로네이트를 실질적으로 적게 생산함을 보여주다. 이는, 생체내에서, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제가 메발로네이트와 하류 이소프레노이드 생산 쪽으로 진행하게 하는 촉매적인 역량을 모두 활용하기 위해서는, NADH의 추가적인 소스가 필요하다는 것을 시사한다.
표 4. NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 대 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제로부터 메발로네이트의 생산
HMG-CoA 리덕타제의 소스 메발로네이트 생산 (g/L) 조인자 특이성
사카로마이세스 세레비지아 (S. cerevisiae) 1.11 NADPH
스타필로코커스 아우레우스 (S. aureus) 1.74 NADPH
헤르페토시폰 아우란티아쿠스 (H. aurantiacus) 1.84 NADPH
슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii) 0.41 NADH
델프티아 액시도보란스 (D. acidovorans) 0.42 NADH
실리시박터 포메로이 (S. pomeroyi) 0.57 NADH
6.1.2.2 세포내 NADH 증가는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제의 활성을 향상시킨다.
도 9-11에 나타낸 바와 같이, 메발로네이트 생산은, 대사적 교란이 도입되었을 때, NADH의 세포내 농도를 증가시키는, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제를 포함하는 MevT 경로를 구비한 세포에서, 실질적으로 향상된다. ADH1은 NADH-의존적인 방식으로 아세트알데하이드를 에탄올로 환원한다. adh1Δ 백그라운드에서, 숙주 세포는 증식 감소 (도 9)와 글리세롤 생산 증가 (도 10)를 겪으며, 이는 세포내 NADH의 축적을 초래할 수 있는 레독스 불균형을 의미한다. 그러나, NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 (사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)(Sc.) tHMG-CoA 리덕타제)를 포함하는 MevT 경로를 구비한 세포가 adh1Δ 백그라운드에서 메발로네이트 생산 감소를 나타내는 반면, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 (슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii), 델프티아 액시도보란스 (D. acidovorans) 및 실리시박터 포메로이(S. pomeroyi) 각각으로부터 유래된)를 포함하는 MevT 경로를 구비한 세포는, 레독스 스트레스 신호도 나타냄에도 불구하고, 메발로네이트 생산에 실질적인 향상을 나타낸다 (도 11). 이들 데이타는, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제가 증가된 세포내 NADH 풀을 활용하여 메발로네이트 생산을 부스팅할 수 있다는 것을, 시사해준다. 또한, 이들 결과는, 세포내 NADH 풀 증가가 이루어지지 않은 경우, NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제가 조인자에 의해 제한됨을 시사한다.
특히, 이전의 공개된 보고서에서는, 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii)의 HMG-CoA 리덕타제가 메발로네이트 분해에 활용되는 것으로 개시된 바 있다. Anderson et al.,J. Bacteriol., (171(12):6468-6472 (1989)를 참조한다. 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii)는 유일한 탄소원으로서 메발로네이트에 대해 유효할 수 있는 것으로 동정된 소수의 원핵생물이다. 그러나, 본원에 제시된 결과는 메발로네이트의 생합성 경로에 사용하기 위한 슈도모나스 메발로니 (P. mevalonii) HMG-CoA 리덕타제의 예측하지 못한 유용성을 보여준다.
6.2 실시예 2: 아세틸-CoA에 대한 대안 경로 및 대안적인 MEV 경로 효소를 이용한 이소프레노이드 생산 및 레독스 밸런싱 개선
본 실시예는, MEV 경로부터 메발로네이트 및 하류 이소프레노이드 생산을, 세포질 아세틸-CoA 생산하는 대안적인 경로를 이용함으로써, 예컨대 야생형 PDH-바이패스 대신, 아세트알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA, E.C. 1.2.1.10)의 이종 발현을 통해, 및 대안적인 MEV 경로 효소들과의 다양한 조합으로, 개선시킬 수 있음을 보여준다. 이들 결과는, NADPH-생산하는 PDH-바이패스 효소를 NADH-생산하는 ADA로 치환함으로써 도입되는 레독스 불균형은, ADA 발현을, MEV 경로의 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 및/또는 포스포케톨라제 및 포스포트랜스아세틸라제의 이종의 발현과 조합함으로써, 일부 완화시킬 수 있으며, 이는 또한, 세포질 아세틸-CoA를 생산하는 추가적인 대안 경로를 제공할 수 있음을 보여준다. 이들 결과는, 또한, MEV 경로에 아세틸-CoA 기질을 제공하는 ADA의 촉매적 능력이, 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제에 의해 제공되는 것과 같은, 아세틸-CoA의 아세토아세틸-CoA로의 열역학적으로 우호적인 하류 변환을 제공함으로써, 실질적으로 향상된다는 것을, 추가적으로 입증해준다.
6.2.1 재료 및 방법
6.2.1.1 균주 조작
표 5에 열거된 균주들을 구축하여, (1) ADA를 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제 대 NADPH-가용성 HMG-CoA 리덕타제와 쌍을 이루었을 때, 세포 증식과 이종적인 이소프레노이드의 생산에 대한 효과; (2) ADA의 발현에 의해 형성되는 레독스 불균형에 대한 포스포케톨라제 및 포스포트랜스아세틸라제의 발현이 미치는 효과; 및 (3) ADA를 발현하는 균주들에서 메발로네이트 수준에 대한 아세토아세틸-CoA 신타제의 발현이 미치는 효과를 확인하였다.
표 5.
균주 명 설명
Y968 야생형 CEN.PK2
Y12869 acs1^acs2^ald6^; 2x Dz.eutE
Y12746 acs1^acs2^ald6^; 2x Dz.eutE; 3x Lm.PK; 1x Ck.PTA
Y12869.ms63908 구조체 ms63908을 구비한 Y12869
Y12869.ms63909 구조체 ms63909를 구비한Y12869
Y968.ms63908 구조체 ms63908을 구비한 Y968
Y968.ms63909 구조체 ms63909를 구비한 Y968
Y12869.ms63907.ms64472 구조체 ms64472를 구비한 Y12869.ms63907
Y12869.ms63909.ms64472 구조체 ms64472를 구비한 Y12869.ms63909
Y968.ms63907.ms64472 구조체 ms64472를 구비한 Y968.ms63907
Y968.ms63909.ms64472 구조체 ms64472를 구비한 Y968.ms63909
6.2.1.1.1 Y968
Y968은 야생형 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) CEN.PK2, Matalpha이다. Y12869, Y12746 및 이의 파생 유도체 전체에 대한 출발 균주는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주 (CEN.PK2, Mat alpha, ura3-52, trp1-289, leu2-3,122, his3^1), Y003이다. Gietz RW and Woods RA, Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology. Part B. San Diego, CA: Academic Press Inc. pp. 87-96 (2002)에 기술된 바와 같은 표준 리튬 아세테이트 공정을 이용하여, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)에 대해 임의의 DNA-매개 형질전환을 수행하였으며, 모든 경우들에서, 구조체의 삽입은 게놈 DNA를 PCR 증폭시켜 검증하였다.
6.2.1.1.2 Y12869
Y003에 3번의 연속적인 삽입을 통해 Y12869를 구축하였다. 먼저, ACS2 유전자 좌의 상류와 하류 뉴클레오티드 서열로 구성된 서열이 측면에 위치한, 천연 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)LEU2 유전자로 구성된, 삽입 구조체 (i2235; 서열번호 45)를 도입함으로써, 유전자 ACS2를 제거하였다. 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) 숙주 세포로 도입되면, 이 구조체는 게놈의 ACS2 유전자 좌로 상동적인 재조합에 의해 삽입되어, ACS2 코딩 서열이 이의 삽입 서열로 치환됨으로써, ACS2가 기능적으로 파괴된다. 형질전환체를 유일한 탄소원으로서 2% EtOH가 포함된 CSM-leu 플레이트에 도말하여, PCR 증폭에 의해 검증하였다. 제조되는 균주는 Y4940이었다.
다음으로, ALD6를 제거하고, 딕케야 지아 (Dickeya zeae) eutE를 Y4940에 하기 도시된 삽입 구조체 (i74804; 서열번호 46)를 이용하여 도입하였다.
Figure pct00003
이 삽입 구조체는 선별 마커 (TRP1)와 딕케야 지아 (Dickeya zeae) 유래 유전자 eutE (NCBI 참조 서열: YP_003003316.1)를 코딩하는 2 카피의 효모-코돈-최적화된 서열을, TDH3 프로모터 (천연적인 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) TDH3 코딩 영역의 상류 840 bp)와 TEF2 종결인자 (천연적인 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) TEF2 코딩 영역의 하류 508 bp)의 통제 하에 포함한다. 이들 컴포넌트들은 측면에 ALD6 유전자 좌의 상류 및 하류 뉴클레오티드들이 위치한다. 숙주 세포로 도입되면, 이 구조체는 숙주 세포의 게놈으로 상동적인 재조합에 의해 삽입되어, ALD6 코딩 서열이 이의 삽입 서열로 치환됨으로써, ALD64가 기능적으로 파괴된다. 이 구조체는 미국 특허 8,221,982에 기술된 방법을 이용하여 조립하였다. 구조체를 Y4940에 형질전환하고, 형질전환체를 2% 글루코스가 첨가된 CSM-TRP 플레이트에서 선별하여, PCR 증폭에 의해 검증하였다. 제조되는 균주는 12602이었다.
다음으로, 자신의 프로모터와 종결인자의 통제 하에 위치한 천연적인 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) HIS3 유전자와 이의 측면에 위치한 ACS1의 상류 및 하류 뉴클레오티드 서열로 구성된 삽입 구조체 (i76220; 서열번호 47)를 도입함으로써, Y12602에서 ACS1을 제거하였다. 형질전환체를 단독 탄소원으로서 2% 글루코스가 첨가된 CSM-his 플레이트에 도말하고, PCR 증폭에 의해 검증하였다. 제조되는 균주는 Y12747이었다.
다음으로, Y12747에 천연 URA3 서열에서 증폭시킨 PCR 산물을 형질전환하였다. 이 서열은 ura3-52 돌연변이를 복원시킨다. Rose and Winston, Mol Gen Genet 193:557-560 (1984)을 참조한다. 형질전환체를 단독 탄소원으로서 2% 글루코스가 첨가된 CSM-ura 플레이트에 도말하고, PCR 증폭에 의해 검증하였다. 제조되는 균주는 Y12869이었다.
6.2.1.1.3 Y12746
Y4940에 3번의 연속적인 삽입을 통해 Y12746을 구축하였다. 먼저, Y4940에 아래에 도시된 삽입 구조체 (i73830; 서열번호 48)를 형질전환하였다.
Figure pct00004
이 삽입 구조체는, 선별 마커 (URA3); TDH3 프로모터 (TDH3 코딩 서열의 상류 870 bp) 및 TDH3 종결인자 (TDH3 코딩 서열의 하류 259 bp)의 통제 하에 위치한, 루코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) (NCBI 참조 서열 YP_819405.1) 유래 효모-코돈 최적화된 포스포케톨라제 버전; TDH3 프로모터 (TDH3 코딩 서열의 상류 870 bp) 및 PGK1 종결인자 (PGK1 코딩 서열의 하류 259 bp)의 통제 하에 위치한, 효모 코돈-최적화된 버전의, 클로스트리듐 클루이베리 (Clostridium kluyveri) 포스포트랜스아세틸라제 (NCBI 참조 서열: YP_001394780.1); 측면에 위치한, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) BUD9 유전자 좌의 상류 및 하류 뉴클레오티드 서열로 구성된 상동적인 서열을 포함한다. 숙주 세포로 도입되면, 이 구조체는 숙주 세포의 게놈으로 상동적인 재조합에 의해 삽입되어, BUD9 코딩 서열이 이의 삽입 서열로 치환됨으로써, BUD9은 기능적으로 파괴된다. 이 구조체는 미국 특허 8,221,982에 기술된 방법을 이용하여 조립하였다. 형질전환체는 2% 글루코스가 첨가된 CSM-URA 플레이트에서 선별하였다.
제조되는 균주에, 하기 도시된 삽입 구조체 (i74810; 서열번호 49)를 형질전환하였다.
Figure pct00005
이 구조체는 선별 마커 (TRP1); TDH3 프로모터 (TDH3 코딩 서열의 상류 870 bp) 및 TDH3 종결인자 (TDH3 코딩 서열의 하류 259 bp)의 통제 하에 위치한 2 카피의 루코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) 유래 포스포케톨라제; 이들의 양 측면에 위치한, ALD6 유전자 좌의 상류 및 하류 뉴클레오티드 서열로 구성된 상동적인 서열을 포함한다. 숙주 세포로 도입되면, 이 구조체는 숙주 세포의 게놈으로 상동적인 재조합에 의해 삽입되어, ALD6 코딩 서열이 이의 삽입 서열로 치환됨으로써, ALD6가 기능적으로 파괴된다. 이 구조체는 미국 특허 8,221,982에 기술된 방법을 이용하여 조립하였다. 형질전환체를 2% 글루코스가 첨가된 CSM-URA 플레이트에서 선별하여, PCR 증폭에 의해 검증하였다.
마지막으로, 제조되는 균주에 하기 도시된 구조체 (i76221; 서열번호 50)를 형질전환하였다.
Figure pct00006
이 구조체는, 선별 마커 (HIS3); 및 TDH3 프로모터 (천연적인 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) TDH3 코딩 영역의 상류 840 bp) 및 TEF2 종결인자 (천연적인 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) TEF2 코딩 영역의 하류 508 bp)의 통제 하에 위치한, 딕케야 지아 (Dic-keya zeae) 유래 유전자 eutE를 코딩하는 효모-코돈-최적화된 서열 (NCBI 참조 서열: YP_003003316.1) 2 카피를 포함한다. 이들 컴포넌트들은 측면에 ACS1 유전자 좌의 상류 및 하류 뉴클레오티드들이 위치한다. 숙주 세포로 도입되면, 이 구조체는 숙주 세포의 게놈으로 상동적인 재조합에 의해 삽입되어, ACS1 코딩 서열이 이의 삽입 서열로 치환됨으로써, ACS1이 기능적으로 파괴된다. 이 구조체는 미국 특허 8,221,982에 기술된 방법을 이용하여 조립하였다. 형질전환체를 2% 글루코스가 첨가된 CSM-HIS 플레이트에서 선별하여, PCR 증폭에 의해 검증하였다. 제조되는 균주는 Y12746이었다.
6.2.1.1.4 ms63907, ms63908, ms63909 및 ms64472 삽입 구조체
ms63907 삽입 구조체 (i84022; 서열번호 51)를 아래에 나타낸다.
Figure pct00007
이 구조체는, 선택 마커(URA3); 자신의 프로모터 하에 위치한 천연적인 효모 GAL4 전사 인자 1 카피; 메발로네이트 경로의 천연 효모 효소 2종 (아세토아세틸-CoA 티올라제를 코딩하는 ERG10, HMG-CoA 신타제를 코딩하는 ERG13), 및 실리시박터 포메로이 (Silicibacter pomeroyi)) HMG-CoA 리덕타제의 효모 코돈-최적화된 버전 2 카피, 모두 갈락토스 유도성 프로모터 (사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) 유전자 GAL1 및 GAL10의 프로모터) 하에 위치됨, 뿐만 아니라, 측면에 위치한, 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) HO 엔도뉴클레아제 유전자 좌의 상류 및 하류 뉴클레오티드로 구성된 상동적인 서열을 코딩하는, 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 숙주 세포로 도입되면, ms63907 구조체는 숙주 세포의 게놈으로 상동적인 삽입에 의해 삽입되어, HO 코딩 서열이 이의 삽입 서열로 치환됨으로써, HO가 기능적으로 파괴된다. 이 구조체는 미국 특허 8,221,982에 기술된 방법을 이용하여 조립하였다. 형질전환체를 2% 글루코스가 첨가된 CSM-URA 플레이트에서 선별하여, PCR 증폭에 의해 검증하였다.
ms63908 삽입 구조체 (i84024; 서열번호 52)는, 2가지만 제외하고는, ms63907과 동일하다: 첫째, ERG10이, AHP1 종결인자 (사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae)의 AHP1 코딩 서열의 하류 125 bp)가 융합된, 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제 (accession no. AB540131.1)를 코딩하는, 스트렙토마이세스 sp.의 nphT7 유전자의 효모 코돈-최적화된 버전으로 치환되며; 두번째로, 실리시박터 포메로이(S. pomeroyi) HMG-CoA 리덕타제를 코딩하는 서열이 천연적인 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) HMG-CoA 리덕타제를 코딩하는 절단된 HMG1 코딩 서열인, tHMGr로 치환됨.
ms63909 삽입 구조체 (i84026; 서열번호 53)는, 한가지만 제외하고는, ms63907과 동일하다: 실리시박터 포메로이(S. pomeroyi) HMG-CoA 리덕타제를 코딩하는 서열이 천연적인 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) HMG-CoA 리덕타제를 코딩하는 절단된 HMG1 코딩 서열인, tHMGr로 치환됨.
ms64472 삽입 구조체 (i85207; 서열번호 54)를 하기에 도시한다.
Figure pct00008
이 구조체는, 선별 마커 (URA3); 에르고스테롤 경로의 5종의 천연 효모 효소들 (메발로네이트 키나제를 코딩하는 ERG12, 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 ERG8, 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 ERG19, 다이메틸알릴 다이포스페이트 이소머라제를 코딩하는 IDI1, 및 파르네실 피로포스페이트 신테타제를 코딩하는 ERG20), 뿐만 아니라, 진화된, 효모 코돈-최적화된 버전의 아르테미시아 아누아 (Artemisia annua) 파르네센 신타제, 이들 모두 갈락토스-유도성 프로모터의 통제 하에 위치함 (사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) 유전자 GAL1, GAL10 및 GAL7의 프로모터들)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이들 서열들에는, GAL80의 상류 및 하류 뉴클레오티드 서열로 구성된 상동적인 서열들이 측면에 위치한다. 숙주 세포로 도입되면, ms64472 구조체는 숙주 세포의 게놈으로 상동적인 삽입에 의해 삽입되어, GAL80 코딩 서열이 이의 삽입 서열로 치환됨으로써, GAL80이 기능적으로 파괴된다. 이 구조체는 미국 특허 8,221,982에 기술된 방법을 이용하여 조립하였다. 형질전환체를 2% 글루코스가 첨가된 CSM-URA 플레이트에서 선별하여, PCR 증폭에 의해 검증하였다.
6.2.1.2 메발로네이트의 정량화
콜로니 하나를 96웰 플레이트의 웰에 50 mM 숙시네이트 pH 5.0 및 20 g/L 슈크로스가 첨가된 시드 배지 (15 g/L 암모늄 설페이트, 8 g/L 포타슘 포스페이트, 6.1 g/L 마그네슘 설페이트, 150 mg/L EDTA, 57.5 mg/L 아연 설페이트, 4.8 mg/L 코발트 클로라이드, 3.24 mg/L 망간 클로라이드, 5 mg/L 구리 설페이트, 29.4 mg/L 칼슘 클로라이드, 27.8 mg/L 철 설페이트, 4.8 mg/L 소듐 몰리브데이트, 0.6 mg/L 바이오틴, 12 mg/L 칼슘 판토테네이트, 12 mg/L 니코틴산, 30 mg/L 이노시톨, 12 mg/L 티아민 하이드로클로라이드, 12 mg/L 피리독신 하이드로클로라이드, 0.24 mg/L 파라-아미노벤조산)에 접종하여, 3일간 30℃에서 배양하였다. 그런 후, 배양물 14.4 ㎕를 50 mM 숙시네이트 pH 5.0 및 40 g/L 갈락토스가 첨가된 시드 배지에서 서브배양하고, 2일간 30℃에서 배양하였다.
분비되는 메발로네이트를 정량하기 위해, 전 세포 배지를 먼저 5분간 14,000 RPM으로 스핀 다운하였다. 그런 후, 투명하게 된 배지 10 ㎕에, 분석 완충제 (1 mM CoA, 2 mM NAD, 정제 및 동결건조한 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii) HMG-CoA 리덕타제, 0.2 mg/ml, 정제 및 동결건조한 슈도모나스 메발로니 (Pseudomonas mevalonii) HMG-CoA 리아제, 0.1 mg/ml, 95 mM TrisCl pH8.5, 20 mM MgCl2 및 5 mM DTT) 190 ㎕와 함께 인큐베이션하였다. 30℃에서 30분간 샘플에서 인큐베이션한 다음, Beckman M5 플레이트 리더에서 340 nm에서 흡광도를 분석하였다. 메발로네이트 농도는, 정제한 메발로네이트로 작성한 표준 그래프에 플로팅함으로써 정량하였다.
6.2.1.3 파르네센 정량
배양물을 전술한 바와 같이 먼저 배양하였다. 파르네센을 정량하기 위해, 2-부톡시에탄올 600 ㎕를, 각 200 ㎕ 씩 3번, 전 세포 배지 150 ㎕에, 각 첨가 사이에 96웰 플레이트 교반기에서 1000 rpm으로 90초간 교반하면서, 첨가하였다. 그런 후, 샘플을 40분간 인큐베이션하였다. 2-부톡시에탄올 추출물 8 ㎕를 이소프로필 알코올 200 ㎕와 96웰 UV 플레이트 (Costar 3635)에서 혼합한 다음 흡광도 222을 플레이트 리더에서 판독하였다.
6.2.1.4 광학 밀도 정량
96웰 분석 플레이트에서, 배양물 8 ㎕를 희석제 (20% PEG 200, 20% 에탄올, 2% Triton X-114)와 혼합하여, 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 이 분석 플레이트를 볼텍싱한 후, Beckman M5 플레이트 리더에서 OD600을 측정하였다.
6.2.1.5 배치 발효
콜로니 하나를 50 mM 숙시네이트 pH 5.0 및 20 g/L 슈크로스가 첨가된 시드 배지 5 ml에서 배양하여, Y967, Y12869 및 Y12746의 접종 배양물을 배양하였다. 배양 3일 후, 사전배양물을 50 mM 숙시네이트 pH 5.0 및 40 g/L 슈크로스가 첨가된 시드 배지 25 ml에서 첫 광학 밀도 (OD) 0.1로 서브배양하였다. 10시간 후, 배양물을 다시, 50 mM 숙시네이트 pH 5.0 및 40 g/L 슈크로스가 첨가된 시드 배지 50 ml에 OD 0.05로 서브배양하였다. 배양물을 30℃에서 배양하였다. OD가 약 3이 되면, 3개의 플라스크를 절반으로 나누고, 스핀 다운한 후, 배지를 버렸다. 배양물을 40 g/L 글루코스 (숙시네이트 무첨가)가 첨가된 시드 배지 1.5 L에 재현탁하고, 발효기로 옮겼다. 발효 실험은 2 L Biostat B plus vessel (Sartorius, Germany)에서 수행하였다. 교반을 1200 rpm으로 조절하고, 발효기에 공기를 0.5 L/min으로 계속 주입하였다. 14.4 M NH4OH로 pH를 5.0으로 유지하였고, 온도를 30℃로 유지하였다. 거의 1.5시간 마다 샘플을 취하여 OD, 건조 세포 중량, 유기 산 및 당을 측정하였다.
6.2.2 결과
6.2.2.1 ADA 균주는 NADPH-가용성 HMGr 보다는 NADH-가용성 HMGr와 쌍을 이루었을 때 이소프레노이드를 더 많이 생산한다.
도 12A는, PDH-바이패스 (acs1Δ acs2 Δ ald6Δ)의 결손 및 이종적으로 발현되는 ADA (Dz.eutE)를 포함하는, 균주 Y12869가, NADPH-가용성 HMGr을 포함하는 MEV 경로 (구조체 ms63909) 보다는 NADH-가용성 HMGr을 포함하는 MEV 경로 (구조체 ms63907)를 발현할 때, 파르네센을 더 많이 생산함을 보여준다. 반면에, 도 12B는, 무손상 PDH-바이패스를 포함하는 균주 Y968은 NADPH-가용성 HMGr와 쌍을 이루었을 때 파르네센을 더 많이 생산함을 보여준다. 이들 결과는, MEV 경로로부터 이소프레노이드를 생산하기 위한 ADA의 활용은, MEV 경로가 NADH-가용성 HMGr을 포함할 때 개선됨을 보여준다.
6.2.2.2 ADA의 발현은 레독스 불균형을 야기하지만, PK와 PTA가 당분해와 흐름을 공유할 때 완화된다
천연 효모는 당분해를 통해 소모되는 글루코스 1개 당 NADH 2개를 생산한다. 에탄올로 발효하였을 때, NADH 2개가 NAD+로 다시 산화된다. 그러나, 글루코스 분획은 에탄올로 발효되기 보다는 바이오메스로 변환되어, 과량의 NADH가 만들어진다. 이 과량의 NADH는, 다이하이드록시아세톤 포스페이트의 글리세롤 3-포스페이트로의 환원을 통해, NAD+로 다시 산화되며, 글리세롤 3-포스페이트는 글리세롤로 가수분해된다. 천연적인 PDH-바이패스 대신 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제를 이용하는 균주는, NADPH 대신, NADH를 생산하므로, 추가의 과잉의 NADH가 생성된다. 바이오메스로 변환되는 각 글루코스의 경우, 천연적인 PDH-바이패스 대신 ADA를 이용하는 균주는 실제 NADH를 2배 많이 생산하는데, 이는 과량의 NADH를 다시 산화하기 위해서는 2배 정도로 많은 글리세롤을 생산하여야 한다는 것을 의미한다. 도 13A에 나타낸 바와 같이, Y12869 (야생형 PDH-바이패스 대신 ADA를 이용하는 균주)는 (무손상 PDH-바이패스를 포함하는) Y968의 2배 많은 글리세롤을 생산하지만, 배치 글루코스 발효에서 글루코스를 유사한 수준으로 소비한다. 이러한 결과들은, Y12869에서 ADA 반응의 화학량론으로 예측되는 바와 같이 레독스 불균형이 발생됨을 입증해준다.
ADA 균주에 포스포케톨라제 및 포스포트랜스아세틸라제를 부가하면, 글루코스로부터 AcCoA를 합성하는 대안적인 비-당분해성 경로가 제공되어, 당분해를 통한 NADH 생산이 감소되고 레독스 균형이 향상된다. 도 13B에 나타낸 바와 같이, Y12745 (ADA 외에도, 포스포케톨라제 및 포스포트랜스아세틸라제를 보유한 균주)는 Y12869의 절반으로 글리세롤을 생산하지만, 배치 글루코스 발효시 글루코스는 비슷한 수준으로 소비한다.
6.2.2.3 ADA 균주에서 ATP 절약은 열역학적인 구동력을 희생하게 되지만 아세틸-CoA에 대한 강력한 견인력에 의해 완화된다.
아세틸-CoA를 형성하기 위한 천연적인 PDH-바이패스 반응은, ATP의 AMP로의 가수분해와 커플링되기 때문에, 열역학적으로 우호적이다. 반면 아실화 아세트알데하이드 데하이드로게나제 반응은 ATP와 커플링되어 있지 않으며, 아세틸-CoA 합성에 있어 천연적인 PDH-바이패스 반응 보다 훨씬 평형에 가깝다. 메발로네이트를 생산하기 위해 천연적인 사카로마이세스 세레비지애 (S. cerevisiae) 경로 유전자를 이용하는 경우, ADA를 이용하는 균주는, ADA 및 Ald6의 시험관내에서의 비슷한 카이네틱 특성에도 불구하고, 야생형 PDH-바이패스를 이용하는 균주 보다 메발로네이트를 훨씬 적게 생산한다. 도 14 (첫번째 및 2번째 컬럼)에 나타낸 바와 같이, 시험관내에서 측정한 충분한 카이네틱 역량에도 불구하고, ADA 균주 (Y12869.ms63909)에서의 메발로네이트 생산은 야생형의 등가 균주 (Y968.ms63909)의 ~30%에 불과하다. 이 결과는, ADA에 의한 아세트알데하이드의 아세틸-CoA로의 변환을 뒷받침하는 열역학적인 구동력의 결핍을 반영한다.
Erg10 아세틸-CoA 티올라제는, 열역학적으로 비우호적인 반응인 아세틸-CoA 2개로부터 아세토아세틸-CoA를 형성하는 반응을 촉매한다. nphT7에 코딩된 아세토아세틸-CoA 신타제 (즉, 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제)는, 말로닐-CoA의 데카르복시화로 인해 열역학적으로 우호적인 반응인, 아세틸-CoA와 말로닐-CoA로부터 아세토아세틸-CoA를 합성하는 과정을 촉매한다. AcCoA 생산의 바로 하류에 이러한 열역학적으로 우호적인 반응을 투입하면, ADA의 정방향 활성을 증가시키는 열역학적인 구동력이 부여된다. 도 14 (3번째 및 4번째 컬럼)에 나타낸 바와 같이, nphT7을 ERG10 대신 과다 발현하면, Y968.ms63908와 Y12869.ms63908은 메발로네이트를 비슷한 수준으로 만들어낸다. 아울러, 이들 균주는 MEV 경로의 첫번째 단계에서 ERG10을 이용하는 등가의 균주 (Y968.ms63909 및 Y12869.63909) 보다 메발로네이트를 실질적으로 더 많이 생산한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은, 각 개별 간행물 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 원용에 의해 본 명세서에 포함되는 바와 같이, 원용에 의해 본 명세서에 포함된다. 전술한 본 발명은 예시적인 방식으로, 명확한 이해를 위한 예로 기술되어 있지만, 당해 기술 분야의 당업자라면 본 발명의 교시 내용에 비추어, 첨부된 청구항의 사상 및 범위로부터 이탈되지 않으면서 특정한 변형과 수정을 가할 수 있음을 쉽게 알 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> AMYRIS, INC. GARDNER, Timothy Stevens HAWKINS, Kristy Michelle MEADOWS, Adam Leon TSONG, Annie Ening TSEGAYE, Yoseph <120> PRODUCTION OF ACETYL-COENZYME A DERIVED ISOPRENOIDS <130> 107345.00374 <150> US 61/557,893 <151> 2011-11-09 <160> 54 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1380 <212> DNA <213> Dickeya zeae <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1380) <223> Dickeya zeae eutE gene sequence <400> 1 atggagcatt cagttatcga accgacagtg cccatgccgc tgccagccat gtttgacgcg 60 ccatctggaa tcttttctag cctggacgat gcagtccagg cggcaaccct ggcacaacaa 120 cagttgtcgt ctgtggagtt acgccagcaa gttattaaag caattagagt tgcaggcgaa 180 cgctatgcac aggttctggc ggaaatggcg gtggctgaaa caggtatggg tcgggtagtg 240 gataaataca ttaaaaatgt ttcacaggct cgccatacac ccggcattga atgtctgagc 300 gcggaagttc tgacaggcga caatggcctg acactgattg aaaatgcccc ttggggagtg 360 gtggcttccg tgacgccaag cacgaaccca gccgccacag tcatcaataa tgcaatttcc 420 atgattgcgg cagggaattc agtcgttttt gcaccgcacc catccgccaa aaatgtgtcc 480 ttacgcacaa tatcgcttct taacaaagca attgtggcga 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Saccharomyces cerevisiae <220> <221> misc_feature <222> (1)..(500) <223> Saccharomyces cerevisiae cytosolic aldehyde dehydrogenase 6 (ALD6) protein sequence <400> 10 Met Thr Lys Leu His Phe Asp Thr Ala Glu Pro Val Lys Ile Thr Leu 1 5 10 15 Pro Asn Gly Leu Thr Tyr Glu Gln Pro Thr Gly Leu Phe Ile Asn Asn 20 25 30 Lys Phe Met Lys Ala Gln Asp Gly Lys Thr Tyr Pro Val Glu Asp Pro 35 40 45 Ser Thr Glu Asn Thr Val Cys Glu Val Ser Ser Ala Thr Thr Glu Asp 50 55 60 Val Glu Tyr Ala Ile Glu Cys Ala Asp Arg Ala Phe His Asp Thr Glu 65 70 75 80 Trp Ala Thr Gln Asp Pro Arg Glu Arg Gly Arg Leu Leu Ser Lys Leu 85 90 95 Ala Asp Glu Leu Glu Ser Gln Ile Asp Leu Val Ser Ser Ile Glu Ala 100 105 110 Leu Asp Asn Gly Lys Thr Leu Ala Leu Ala Arg Gly Asp Val Thr Ile 115 120 125 Ala Ile Asn Cys Leu Arg Asp Ala Ala Ala Tyr Ala Asp Lys Val Asn 130 135 140 Gly Arg Thr Ile Asn Thr Gly Asp Gly Tyr Met Asn Phe Thr Thr Leu 145 150 155 160 Glu Pro Ile Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Ile 165 170 175 Met Met 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tcaccgccgc cgtgggtctg gcgcagaaca tggccgccat ccgcgcgctg 1140 gcgaccgaag gcatccagcg cggtcacatg acccttcatg cgcgcaacat cgcgatcatg 1200 gccggcgcaa caggcgccga tatcgaccgc gtcacccggg tcattgtcga agcgggcgac 1260 gtcagcgtgg cccgtgcaaa acaggtgctg gaaaacacct ga 1302 <210> 20 <211> 433 <212> PRT <213> Silicibacter pomeroyi <220> <221> misc_feature <222> (1)..(433) <223> Silicibacter pomeroyi hydroxymethylglutaryl-CoA reductase protein sequence <400> 20 Met Thr Gly Lys Thr Gly His Ile Asp Gly Leu Asn Ser Arg Ile Glu 1 5 10 15 Lys Met Arg Asp Leu Asp Pro Ala Gln Arg Leu Val Arg Val Ala Glu 20 25 30 Ala Ala Gly Leu Glu Pro Glu Ala Ile Ser Ala Leu Ala Gly Asn Gly 35 40 45 Ala Leu Pro Leu Ser Leu Ala Asn Gly Met Ile Glu Asn Val Ile Gly 50 55 60 Lys Phe Glu Leu Pro Leu Gly Val Ala Thr Asn Phe Thr Val Asn Gly 65 70 75 80 Arg Asp Tyr Leu Ile Pro Met Ala Val Glu Glu Pro Ser Val Val Ala 85 90 95 Ala Ala Ser Tyr Met Ala Arg Ile Ala Arg Glu Asn Gly Gly Phe Thr 100 105 110 Ala His Gly Thr Ala Pro Leu Met Arg Ala 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atcggcgctc 7680 gcggcctgca ggtttcctca tcctagtatg tatagcttgt acccattaaa cgaattttat 7740 catgccgccg aaaggaacaa tttcaagtac tatcggaaga tgaatggtta gatgttaagc 7800 gcggtcactt caaacttcac atttataaag atgtcacatg gaccactatt atctacctta 7860 agttatttat caagataagt ttccggatct ttttctttcc taacacccca gtcagcctga 7920 gttacatcca gccattgaac cttagaaaat cttttgtcat cagcggtttg agccctaaga 7980 tcaacatctt gcttagcaat cactgcaatg gcgtcataac caccagcacc aggtattaag 8040 caagtaagaa ctccttttaa ggtctggcaa tcatccaata agctagtttg tacgggaggt 8100 tcgatatcgg caccagattc tttagttatt tttctaaagg aacgtctaat tgtggcaact 8160 gcatctctaa cttctgtgat ctcaggatac ttttgacagg tacagtcatt cctctcaaga 8220 gactcaaata tctgatcgct gtaatcgtca tgagtctcgt gtaagcgatc tagtttagat 8280 agtccatcca taaatctaga atttgcatga tcgagttctg tatatatttt caagctttcc 8340 ggcatatgcg aatcatacca attttttacc ttctggacca gttttactgt ttctgaacca 8400 ttcttaatat cgcccatcca taaagttaat cccgaaggta aatggttact tttaatcgtt 8460 atattccagt cttcttcatt aaccaaatgc gccagtttac tgccgtaagt 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gtcgatgctg tgtggttctc 11040 catttaacca caaagtgtcg cgttcaaact caggtgcagt agccgcagag gtcaacgttc 11100 tgaggtcatc ttgcgataaa gtcactgata tggacgaatt ggtgggcaga ttcaacttcg 11160 tgtccctttt cccccaatac ttaagggttg cgatgttgac gggtgcggta acggatgctg 11220 tgtaaacggt cattgtgaag gtagttcgat tttggaggtc gcgggaggtt actttttttt 11280 tggatggacg caaagaagtt taataatcat attacatggc aataccacca tatacatatc 11340 catatctaat cttacttata tgttgtggaa atgtaaagag ccccattatc ttagcctaaa 11400 aaaaccttct ctttggaact ttcagtaata cgcttaactg ctcattgcta tattgaagta 11460 cggattagaa gccgccgagc gggcgacagc cctccgacgg aagactctcc tccgtgcgtc 11520 ctggtcttca ccggtcgcgt tcctgaaacg cagatgtgcc tcgcgccgca ctgctccgaa 11580 caataaagat tctacaatac tagcttttat ggttatgaag aggaaaaatt ggcagtaacc 11640 tggccccaca aaccttcaaa tcaacgaatc aaattaacaa ccataggata ataatgcgat 11700 tagtttttta gccttatttc tggggtaatt aatcagcgaa gcgatgattt ttgatctatt 11760 aacagatata taaatgcaaa agctgcataa ccactttaac taatactttc aacattttcg 11820 gtttgtatta cttcttattc aaatgtcata 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gagtatatat ctatgtaaaa caaccatatc atttcttgtt ctgaactttg 13560 tttacctaac tagttttaaa tttccctttt tcgtgcatgc gggtgttctt atttattagc 13620 atactacatt tgaaatatca aatttcctta gtagaaaagt gagagaaggt gcactgacac 13680 aaaaaataaa atgctacgta taactgtcaa aactttgcag cagcgggcat ccttccatca 13740 tagcttcaaa catattagcg ttcctgatct tcatacccgt gctcaaaatg atcaaacaaa 13800 ctgttattgc caagaaataa acgcaaggct gccttcaaaa actgatccat tagatcctca 13860 tatcaagctt cctcatagaa cgcccaatta caataagcat gttttgctgt tatcaccggg 13920 tgataggttt gctcaggcgg tttaaacgcg tggccgtgcc gtc 13963

Claims (55)

  1. 이소프레노이드를 생산할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포로서,
    상기 세포는,
    (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종 핵산; 및
    (b) 아실화 아세틸알데하이드 데하이드로게나제 (ADA)를 코딩하는 이종 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 아세틸-CoA를 말로닐-CoA와 축합하여 아세토아세틸-CoA를 형성하는 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 3-하이드록시-3-메틸글루타릴-CoA (HMG-CoA)를 메발로네이트로 변환하는 NADH-가용성 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한항에 있어서, 포스포케톨라제 (PK)를 코딩하는 이종의 핵산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한항에 있어서, 포스포트랜스아세틸라제 (PTA)를 코딩하는 이종의 핵산을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한항에 있어서, 천연적인 피루베이트 데하이드로게나제 (PDH)-바이패스의 하나 이상의 효소가 기능적으로 파괴된 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소가 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  10. 제9항에 있어서, ACS1이 기능적으로 파괴된 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  11. 제9항에 있어서, ACS2가 기능적으로 파괴된 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  12. 제9항에 있어서, ALD6가 기능적으로 파괴된 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  13. 제9항에 있어서, ACS1 및 ACS2가 기능적으로 파괴된 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  14. 제9항에 있어서, ACS1, ACS2 및 ALD6가 기능적으로 파괴된 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한항에 있어서, 알코올 데하이드로게나제 (ADH) 활성을 가진 하나 이상의 효소가 기능적으로 파괴된 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 ADH 활성을 가진 하나 이상의 효소가 알코올 데하이드로게나제 1 (ADH1), 알코올 데하이드로게나제 3 (ADH3), 알코올 데하이드로게나제 4 (ADH4) 및 알코올 데하이드로게나제 5 (ADH5)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한항에 있어서, 상기 ADA의 아미노산 서열이 서열번호 2와 80% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  18. 제3항에 있어서, 상기 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제의 아미노산 서열이 서열번호 16과 80% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  19. 제5항에 있어서, 상기 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제의 아미노산 서열이 서열번호 20과 80% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  20. 제6항에 있어서, 상기 포스포케톨라제 (PK)의 아미노산 서열이 서열번호 12와 80% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  21. 제7항에 있어서, 상기 포스포트랜스아세틸라제 (PTA)의 아미노산 서열이 서열번호 14와 80% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  22. 제1항, 제4항 내지 제17항 또는 제19항 내지 제21항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 아세틸-CoA 분자 2개를 축합하여 아세토아세틸-CoA를 형성하는 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 아세토아세틸-CoA를 아세틸-CoA와 축합하여 HMG-CoA를 형성하는 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  24. 제1항 내지 제3항, 제6항 내지 제18항, 또는 제20항 내지 제22항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 HMG-CoA를 메발로네이트로 변환하는 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 메발로네이트를 메발로네이트 5-포스페이트로 인산화하는 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 메발로네이트 5-포스페이트를 메발로네이트 5-피로포스페이트로 변환하는 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 메발로네이트 5-피로포스페이트를 이소펜테닐 피로포스페이트로 변환하는 효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소가 HMG-CoA 신타제, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제 및 메발로네이트 피로포스페이트 데카르복실라제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 MEV 경로의 모든 효소를 코딩하는 복수의 이종의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산이 단일 전사 조절인자의 통제를 받는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한항에 있어서, 상기 MEV 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산이 복수의 이종 전사 조절인자의 통제를 받는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한항에 있어서, 이소펜테닐 피로포스페이트 (IPP)를 다이메틸알릴 피로포스페이트 (DMAPP)로 변환할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한항에 있어서, IPP 및/또는 DMAPP 분자를 축합하여 폴리프레닐 화합물을 형성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한항에 있어서, IPP 또는 폴리프레닐을 변형하여 이소프레노이드 화합물을 형성할 수 있는 효소를 코딩하는 이종의 핵산을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  35. 제34항에 있어서, 상기 IPP 또는 폴리프레닐을 변형하여 이소프레노이드 화합물을 형성할 수 있는 효소가 카렌 신타제 (carene synthase), 게라니올 신타제 (geraniol synthase), 리날롤 신타제 (linalool synthase), 리모넨 신타제 (limonene synthase), 미르센 신타제 (myrcene synthase), 옥시멘 신타제 (ocimene synthase), α-피넨 신타제 (α-pinene synthase), β-피넨 신타제 (β-pinene synthase), γ-테르피넨 신타제 (γ-terpinene synthase), 테르피놀렌 신타제 (terpinolene synthase), 아모르파디엔 신타제 (amorphadiene synthase), α-파르네센 신타제 (α-farnesene synthase), β-파르네센 신타제 (β-farnesene synthase), 파르네솔 신타제 (farnesol synthase), 네롤리돌 신타제 (nerolidol synthase), 패출리올 신타제 (patchouliol synthase), 노트카톤 신타제 (nootkatone synthase) 및 아비에타디엔 신타제 (abietadiene synthase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  36. 제34항에 있어서, 상기 이소프레노이드는 헤미테르펜, 모노테르펜, 다이테르펜, 트리테르펜, 테트라테르펜, 세스퀴테르펜 및 폴리테르펜으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  37. 제34항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 세스퀴테르펜인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  38. 제34항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 C5-C20 이소프레노이드인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  39. 제34항에 있어서, 상기 이소프레노이드가 아비에타디엔, 아모르파디엔, 카렌, α-파르네센, β-파르네센, 파르네솔, 게라니올, 게라닐게라니올, 이소프렌, 리날롤, 리모넨, 미르센, 네롤리돌, 옥시멘, 패출롤, β-피넨, 사비넨, γ-테르피넨, 테르피놀렌 및 발렌센으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한항에 있어서, 상기 세포가 효모 세포인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  41. 제40항에 있어서, 상기 효모 세포가 액시쿨로코니듐 (Aciculoconidium), 암브로시오지마 (Ambrosiozyma), 아르트로아스쿠스 (Arthroascus), 아릭시오지마 (Arxiozyma), 아쉬비아 (Ashbya), 바브제비아 (Babjevia), 벤싱토니아 (Bensingtonia), 보트리오아스쿠스 (Botryoascus), 보트리오지마 (Botryozyma), 브레타노마이세스 (Brettanomyces), 불레라 (Bullera), 불레로마이세스 (Bulleromyces), 칸디다 (Candida), 시테로마이세스 (Citeromyces), 클라비스포라 (Clavispora), 크립토코커스 (Cryptococcus), 시스토필로바시듐 (Cystofilobasidium), 데바리오마이세스 (Debaryomyces), 데카라 (Dekkara), 디포다스콥시스 (Dipodascopsis), 디포다스쿠스 (Dipodascus), 에니엘라 (Eeniella), 엔도마이콥셀라 (Endomycopsella), 에레마스쿠스 (Eremascus), 에레모테시움 (Eremothecium), 에리트로바시듐 (Erythrobasidium), 펠로마이세스 (Fellomyces), 필로바시듐 (Filobasidium), 갈락토마이세스 (Galactomyces), 제오트리쿰 (Geotrichum), 귈리리에르몬델라 (Guilliermondella), 한세니아스포라 (Hanseniaspora), 한세눌라 (Hansenula), 하세가와이 (Hasegawaea), 폴터마니아 (Holtermannia), 호르모아스쿠스 (Hormoascus), 하이포피키아 (Hyphopichia), 이사첸티아 (Issatchenkia), 클로엑케라 (Kloeckera), 클로엑케라스포라 (Kloeckeraspora), 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces), 콘도아 (Kondoa), 쿠라이시아 (Kuraishia), 쿠르츠마모마이세스 (Kurtzmanomyces), 루코스포리듐 (Leucosporidium), 리포마이세스 (Lipomyces), 로데로마이세스 (Lodderomyces), 말라세지아 (Malassezia), 메츠니코위아 (Metschnikowia), 므라키아 (Mrakia), 믹소지마 (Myxozyma), 나드소니아 (Nadsonia), 나카자와에아 (Nakazawaea), 네마토스포라 (Nematospora), 오가타에 (Ogataea), 오스포리디움 (Oosporidium), 파키솔렌 (Pachysolen), 파키티코스포라 (Phachytichospora), 파피아 (Phaffia), 피키아 (Pichia), 로도스포리듐 (Rhodosporidium), 로도토룰라 (Rhodotorula), 사카로마이세스 (Saccharomyces), 사카로마이코데스 (Saccharomycodes), 사카로마이콥시스 (Saccharomycopsis), 사이토엘라 (Saitoella), 사카구키아 (Sakaguchia), 사투라노스포라 (Saturnospora), 스키조블라스토스포리온 (Schizoblastosporion), 스키조사카로마이세스 (Schizosaccharomyces), 슈반니오마이세스 (Schwanniomyces), 스포리디오볼루스 (Sporidiobolus), 스포로볼로마이세스 (Sporobolomyces), 스포로파키더미아 (Sporopachydermia), 스테파노아스쿠스 (Stephanoascus), 스테리그마토마이세스 (Sterigmatomyces), 스테리그마토스포리듐 (Sterigmatosporidium), 심비오타프리나 (Symbiotaphrina), 심포디오마이세스 (Sympodiomyces), 심포디오마이콥시스 (Sympodiomycopsis), 토룰라스포라 (Torulaspora), 트리코스포리엘라 (Trichosporiella), 트리코스포론 (Trichosporon), 트리고놉시스 (Trigonopsis), 츠키야에아 (Tsuchiyaea), 우데니오마이세스 (Udeniomyces), 왈토마이세스 (Waltomyces), 윅커하미아 (Wickerhamia), 윅커하미엘라 (Wickerhamiella), 빌리옵시스 (Williopsis), 야마다지마 (Yamadazyma), 야로위니아 (Yarrowia), 자이고아스쿠스 (Zygoascus), 자이고사카로마이세스 (Zygosaccharomyces), 자이고빌리옵시스 (Zygowilliopsis) 및 자이고지마 (Zygozyma)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속에 속하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  42. 제40항에 있어서, 상기 효모가 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 피키아 패스토리스 (Pichia pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 데케라 브룩셀렌시스 (Dekkera bruxellensis), 클루이베로마이세스 락티스 (Kluyveromyces lactis) (이전 명칭: 사카로마이세스 락티스 (Saccharomyces lactis)), 클루이베로마이세스 마르시아누스 (Kluyveromyces marxianus), 아르술라 아데니니보란스 (Arxula adeninivorans) 및 한세눌라 폴리모르파 (Hansenula polymorpha) (현재 피키아 앙구스타 (Pichia angusta)라고도 함)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  43. 제40항에 있어서, 상기 효소가 칸디다 리폴리티카 (Candida lipolytica), 칸디다 길리어몬디 (Candida guilliermondii), 칸디다 크루세이 (Candida krusei), 칸디다 슈도트로피칼리스 (Candida pseudotropicalis) 및 칸디다 유틸리스 (Candida utilis)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  44. 제40항에 있어서, 상기 효모가 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  45. 제44항에 있어서, 상기 효모가 빵 효모, CBS 7959, CBS 7960, CBS 7961, CBS 7962, CBS 7963, CBS 7964, IZ-1904, TA, BG-1, CR-1, SA-1, M-26, Y-904, PE-2, PE-5, VR-1, BR-1, BR-2, ME-2, VR-2, MA-3, MA-4, CAT-1, CB-1, NR-1, BT-1 및 AL-1으로 이루어진 군으로부터 선택되는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주인 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  46. 이소프레노이드를 생산할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포로서,
    상기 세포는,
    (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산;
    (b) 아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA)를 코딩하는 이종의 핵산;
    (c) 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연적인 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소의 기능적 파괴;
    (d) 포스포케톨라제 (PK)를 코딩하는 이종의 핵산; 및
    (e) 포스포트랜스아세틸라제 (PTA)를 코딩하는 이종의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  47. 이소프레노이드를 생산할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포로서,
    상기 세포는,
    (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산으로서, 상기 하나 이상의 효소는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제를 포함하는 것인, 핵산;
    (b) 아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA)를 코딩하는 이종의 핵산; 및
    (c) 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연적인 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소의 기능적 파괴를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  48. 이소프레노이드를 생산할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포로서,
    상기 세포는,
    (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산으로서, 상기 하나 이상의 효소는 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제를 포함하는 것인, 핵산;
    (b) 아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA)를 코딩하는 이종의 핵산;
    (c) 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연적인 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소의 기능적 파괴;
    (d) 포스포케톨라제 (PK)를 코딩하는 이종의 핵산; 및
    (e) 포스포트랜스아세틸라제 (PTA)를 코딩하는 이종의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  49. 이소프레노이드를 생산할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포로서,
    상기 세포는,
    (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 하나 이상의 이종의 핵산으로서, 상기 하나 이상의 효소는 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제를 포함하는 것인, 핵산;
    (b) 아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA)를 코딩하는 이종의 핵산; 및
    (c) 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연적인 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소의 기능적 파괴를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  50. 이소프레노이드를 생산할 수 있는 유전자 변형된 숙주 세포로서,
    상기 세포는,
    (a) 이소펜테닐 피로포스페이트를 제조하기 위한 메발로네이트 (MEV) 경로의 하나 이상의 효소를 코딩하는 복수의 이종 핵산으로서, 상기 복수의 효소는 아세틸-CoA:말로닐-CoA 아실트랜스퍼라제와 NADH-가용성 HMG-CoA 리덕타제를 포함하는 것인, 핵산;
    (b) 아세틸알데하이드 데하이드로게나제, 아세틸화 (ADA)를 코딩하는 이종의 핵산;
    (c) 아세틸-CoA 신타제 1 (ACS1), 아세틸-CoA 신타제 2 (ACS2) 및 알데하이드 데하이드로게나제 6 (ALD6)로 이루어진 군으로부터 선택되는 천연적인 PDH-바이패스의 하나 이상의 효소의 기능적 파괴;
    (d) 포스포케톨라제 (PK)를 코딩하는 이종의 핵산; 및
    (e) 포스포트랜스아세틸라제 (PTA)를 코딩하는 이종의 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 변형된 숙주 세포.
  51. 이소프레노이드의 제조 방법으로서,
    (a) 제1항 내지 제50항 중 어느 한항에 따른 유전자 변형된 효소 세포를, 상기 이소프레노이드 화합물을 생산하기에 적합한 조건 하에, 탄소원이 구비된 배지에서 배양하는 단계; 및
    (b) 상기 이소프레노이드 화합물을 상기 배지로부터 회수하는 단계를 포함하는 것인, 제조 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 이소프레노이드 화합물이 배지 1 L 당 > 약 10 mg의 양으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  53. 제51항에 있어서, 상기 이소프레노이드 화합물이 건조 세포 중량 1 g 당 > 약 50 mg의 양으로 제조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  54. 제51항 내지 제53항 중 어느 한항에 있어서, 상기 숙주 세포가 상기 ADA를 코딩하는 이종의 뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는 동일 숙주 세포에 비해 이소프레노이드 화합물을 증가된 양으로 제조하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 증가된 양이 10% 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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