JP6073350B2 - アセチル−補酵素a誘導イソプレノイドの生産 - Google Patents
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Description
本開示は、(遺伝子)操作された宿主細胞においてアセチル−CoAを生産するための組成物および方法に関する。
アセチル補酵素A(アセチル−CoA)は、ポリケチド、脂肪酸、イソプレノイド、フェノール類、アルカロイド、ビタミンおよびアミノ酸をはじめとする必要不可欠な生体化合物の合成における重要な中間体である。アセチル−CoAに由来する代謝産物には一次および二次代謝産物があり、それらは工業的に有用な化合物を含む。例えばイソプレノイドは、医薬製品において、ならびにバイオ燃料、食品添加物および他の特殊化学製品として使用される。イソプレノイド製品は、不規則なイソプレノイドおよびポリテルペンが報告されているが、典型的には、5炭素イソペンテニル二リン酸(IPP)繰り返し単位からなる。自然界では、イソプレノイドは、それらの前駆体IPPとその異性体ジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)の逐次的縮合によって合成される。これらの前駆体についての2つの経路が公知である。原核生物は、若干の例外はあるが、典型的にはデオキシキシルロース−5−リン酸(DXP)経路を利用してピルビン酸およびグリセルアルデヒド3−リン酸(G3P)をIPPおよびDMAPPに変換する。真核生物は、植物を除き、一般にはメバロン酸依存性(MEV)経路を使用してアセチル−CoAをIPPに変換し、その後、そのIPPがDMAPPに異性体化される。
本明細書に記載する組成物および方法は、アセチル−CoA由来イソプレノイドのエネルギー効率の良い、かつ補因子のバランスの取れた生産に備えるものである。異種アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(あるいは「アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化」、「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル化」または「ADA」(EC1.2.1.10)とも呼ばれる)をアセチル−CoAのサイトゾル生産のPDH−バイパスの代替として利用することにより、生産されるアセチル−CoAの分子1つにつき2当量のATPが保存される。ADAは、ATPを消費せずにアセトアルデヒドを直接アセチル−CoAに変換し、そのプロセスで1つのNAD+を1つのNADHに還元する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
(項目1)
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸と、
(b)アシル化アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ADA)をコードしている異種核酸と
を含む細胞。
(項目2)
前記MEV経路の1つ以上の酵素が、アセチル−CoAをマロニル−CoAと縮合させてアセトアセチル−CoAを形成する酵素を含む、項目1に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目3)
前記MEV経路の1つ以上の酵素が、アセチル−CoA:マロニル−CoAアシルトランスフェラーゼを含む、項目1または項目2に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目4)
前記MEV経路の1つ以上の酵素が、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoA(HMG−CoA)をメバロネートに変換するNADH使用酵素を含む、項目1から3のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目5)
前記MEV経路の1つ以上の酵素が、NADH使用HMG−CoAレダクターゼを含む、項目1から4のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目6)
ホスホケトラーゼ(PK)をコードしている異種核酸をさらに含む、項目1から5のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目7)
ホスホトランスアセチラーゼ(PTA)をコードしている異種核酸をさらに含む、項目1から6のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目8)
天然ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)−バイパスの1つ以上の酵素の機能破壊をさらに含む、項目1から7のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目9)
前記PDH−バイパスの1つ以上の酵素が、アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)から選択される、項目8に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目10)
ACS1が、機能的に破壊されている、項目9に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目11)
ACS2が、機能的に破壊されている、項目9に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目12)
ALD6が、機能的に破壊されている、項目9に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目13)
ACS1およびACS2が、機能的に破壊されている、項目9に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目14)
ACS1、ACS2およびALD6が、機能的に破壊されている、項目9に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目15)
アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)活性を有する1つ以上の酵素の機能破壊をさらに含む、項目1から14のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目16)
ADH活性を有する前記1つ以上の酵素が、アルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1)、アルコールデヒドロゲナーゼ3(ADH3)、アルコールデヒドロゲナーゼ4(ADH4)およびアルコールデヒドロゲナーゼ5(ADH5)から選択される、項目15に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目17)
前記ADAのアミノ酸配列が、配列番号2と少なくとも80%同一である、項目1から16のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目18)
前記アセチル−CoA:マロニル−CoAアシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列が、配列番号16と少なくとも80%同一である、項目3に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目19)
前記NADH使用HMG−CoAレダクターゼのアミノ酸配列が、配列番号20と少なくとも80%同一である、項目5に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目20)
前記ホスホケトラーゼ(PK)のアミノ酸配列が、配列番号12と少なくとも80%同一である、項目6に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目21)
前記ホスホトランスアセチラーゼ(PTA)のアミノ酸配列が、配列番号14と少なくとも80%同一である、項目7に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目22)
前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、アセチル−CoAの2つの分子を縮合させてアセトアセチル−CoAを形成する酵素を含む、項目1、4から17、および19から21のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目23)
前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、アセトアセチル−CoAをアセチル−CoAと縮合させてHMG−CoAを形成する酵素を含む、項目1から22のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目24)
前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、HMG−CoAをメバロネートに変換する酵素を含む、項目1から3、6から18、および20から22のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目25)
前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、メバロネートをメバロン酸5−リン酸にリン酸化する酵素を含む、項目1から24のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目26)
前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、メバロン酸5−リン酸をメバロン酸5−ピロリン酸に変換する酵素を含む、項目1から25のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目27)
前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、メバロン酸5−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素を含む、項目1から26のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目28)
前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、HMG−CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、項目1から27のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目29)
前記MEV経路の前記酵素のすべてをコードしている複数の異種核酸を含む、項目1から28のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目30)
前記MEV経路の1つ以上の酵素をコードしている前記1つ以上の異種核酸が、単一の転写調節因子の制御下にある、項目1から29のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目31)
前記MEV経路の1つ以上の酵素をコードしている前記1つ以上の異種核酸が、複数の異種転写調節因子の制御下にある、項目1から29のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目32)
イソペンテニルピロリン酸(IPP)をジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)に変換し得る酵素をコードしている異種核酸をさらに含む、項目1から31のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目33)
IPPおよび/またはDMAPP分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成し得る酵素をコードしている異種核酸をさらに含む、項目1から32のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目34)
IPPまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成し得る酵素をコードしている異種核酸をさらに含む、項目1から33のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目35)
IPPまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成し得る前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチュロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群より選択される、項目34に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目36)
前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペンおよびポリテルペンからなる群より選択される、項目34に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目37)
前記イソプレノイドが、セスキテルペンである、項目34に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目38)
前記イソプレノイドが、C 5 〜C 20 イソプレノイドである、項目34に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目39)
前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群より選択される、項目34に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目40)
前記細胞が、酵母細胞である、項目1〜39のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目41)
前記酵母細胞が、Aciculoconidium、Ambrosiozyma、Arthroascus、Arxiozyma、Ashbya、Babjevia、Bensingtonia、Botryoascus、Botryozyma、Brettanomyces、Bullera、Bulleromyces、Candida、Citeromyces、Clavispora、Cryptococcus、Cystofilobasidium、Debaryomyces、Dekkara、Dipodascopsis、Dipodascus、Eeniella、Endomycopsella、Eremascus、Eremothecium、Erythrobasidium、Fellomyces、Filobasidium、Galactomyces、Geotrichum、Guilliermondella、Hanseniaspora、Hansenula、Hasegawaea、Holtermannia、Hormoascus、Hyphopichia、Issatchenkia、Kloeckera、Kloeckeraspora、Kluyveromyces、Kondoa、Kuraishia、Kurtzmanomyces、Leucosporidium、Lipomyces、Lodderomyces、Malassezia、Metschnikowia、Mrakia、Myxozyma、Nadsonia、Nakazawaea、Nematospora、Ogataea、Oosporidium、Pachysolen、Phachytichospora、Phaffia、Pichia、Rhodosporidium、Rhodotorula、Saccharomyces、Saccharomycodes、Saccharomycopsis、Saitoella、Sakaguchia、Saturnospora、Schizoblastosporion、Schizosaccharomyces、Schwanniomyces、Sporidiobolus、Sporobolomyces、Sporopachydermia、Stephanoascus、Sterigmatomyces、Sterigmatosporidium、Symbiotaphrina、Sympodiomyces、Sympodiomycopsis、Torulaspora、Trichosporiella、Trichosporon、Trigonopsis、Tsuchiyaea、Udeniomyces、Waltomyces、Wickerhamia、Wickerhamiella、Williopsis、Yamadazyma、Yarrowia、Zygoascus、Zygosaccharomyces、Zygowilliopsis、およびZygozymaからなる群より選択される属に属する、項目40に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目42)
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe、Dekkera bruxellensis、Kluyveromyces lactis (以前はSaccharomyces lactisと呼ばれていた)、Kluveromyces marxianus、Arxula adeninivoransおよびHansenula polymorpha(今ではPichia angustaとして公知)からなる群より選択される、項目40に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目43)
前記酵母が、Candida lipolytica、Candida guilliermondii、Candida krusei、Candida pseudotropicalisおよびCandida utilisからなる群より選択される、項目40に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目44)
前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである、項目40に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目45)
前記酵母が、パン酵母、CBS 7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS 7963、CBS 7964、IZ−1904、TA、BG−1、CR−1、SA−1、M−26、Y−904、PE−2、PE−5、VR−1、BR−1、BR−2、ME−2、VR−2、MA−3、MA−4、CAT−1、CB−1、NR−1、BT−1およびAL−1からなる群より選択されるSaccharomyces
cerevisiaeの株である、項目44に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
(項目46)
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸と、
(b)アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)からなる群より選択される天然PDH−バイパスの少なくとも1つの酵素の機能破壊と、
(d)ホスホケトラーゼ(PK)をコードしている異種核酸と、
(e)ホスホケトラーゼ(PTA)をコードしている異種核酸と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。
(項目47)
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸であって、該1つ以上の酵素が、NADH使用HMG−CoAレダクターゼを含む、1つ以上の異種核酸と、
(b)アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)からなる群より選択される天然PDH−バイパスの少なくとも1つの酵素の機能破壊と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。
(項目48)
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸であって、該1つ以上の酵素が、NADH使用HMG−CoAレダクターゼを含む、1つ以上の異種核酸と、
(b)アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)からなる群より選択される天然PDH−バイパスの少なくとも1つの酵素の機能破壊と
(d)ホスホケトラーゼ(PK)をコードしている異種核酸と、
(e)ホスホケトラーゼ(PTA)をコードしている異種核酸と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。
(項目49)
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸であって、該1つ以上の酵素が、アセチル−CoA:マロニル−CoAアシルトランスフェラーゼを含む、1つ以上の異種核酸と、
(b)アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)からなる群より選択される天然PDH−バイパスの少なくとも1つの酵素の機能破壊と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。
(項目50)
イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の複数の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸であって、該複数の酵素が、アセチル−CoA:マロニル−CoAアシルトランスフェラーゼおよびNADH使用HMG−CoAレダクターゼを含む、1つ以上の異種核酸と、
(b)アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)からなる群より選択される天然PDH−バイパスの少なくとも1つの酵素の機能破壊と
(d)ホスホケトラーゼ(PK)をコードしている異種核酸と、
(e)ホスホケトラーゼ(PTA)をコードしている異種核酸と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。
(項目51)
イソプレノイドを生産するための方法であって、
(a)項目1から50のいずれか一項に記載の遺伝子改変された酵母細胞の集団を、炭素源を有する培地において、該イソプレノイド化合物の製造に適する条件下で培養すること;および
(b)該イソプレノイド化合物を培地から回収すること
を含む方法。
(項目52)
前記イソプレノイド化合物が、培地1リットルにつき約10グラムより多い量で生産される、項目51に記載の方法。
(項目53)
前記イソプレノイド化合物が、乾燥細胞重量1グラムにつき約50mgより多い量で生産される、項目51に記載の方法。
(項目54)
前記宿主細胞が、前記ADAをコードしている異種ヌクレオチド配列を含まない同じ宿主細胞と比較して増加された量のイソプレノイド化合物を生産する、項目51から53のいずれか一項に記載の方法。
(項目55)
前記増加された量が、少なくとも10%である、項目54に記載の方法。
5.1 用語
本明細書において用いる場合、用語「異種(の)」は、自然界で通常は見つけられないものを指す。用語「異種ヌクレオチド配列」は、自然界で所与の細胞において通常は見つけられないヌクレオチド配列を指す。したがって、異種ヌクレオチド配列は、(a)その宿主細胞にとって外来である(すなわち、その細胞にとって「外因性」である)ことがあり;(b)宿主細胞において天然に見つけられる(すなわち「内因性」である)が、その細胞内に不自然な量(例えば、その宿主細胞において天然に見つけられる量より多いもしくは少ない量)で存在することがあり;または(c)宿主細胞において天然に見つけられるが、その天然配座以外に位置することがある。用語「異種酵素」は、自然界での所与の細胞において通常は見つけられない酵素を指す。この用語は、(a)所与の細胞にとって外因性である(すなわち、その宿主細胞に天然に存在しないまたはその宿主細胞において所与の状況では天然に存在しないヌクレオチド配列によってコードされている);および(b)宿主細胞において天然に見つけられる(例えば、その酵素は、その細胞にとって内因性であるヌクレオチド配列によってコードされている)が、その宿主細胞内に不自然な量(例えば、天然に見つけられる量より多いまたは少ない量)で生産される酵素を包含する。
5.2.1 宿主細胞
本明細書に提供する組成物および方法に有用な宿主細胞としては、古細菌、原核細胞または真核細胞が挙げられる。
1つの態様では、アセチル−CoA由来イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(あるいは「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)」、「アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アシル化」、またはADA(EC1.2.1.10)と呼ばれる)をコードしている1つ以上の異種ヌクレオチド配列を含む細胞を、本明細書に提供する。
もう1つの態様では、高いin vivo性能を有するADAについてのスクリーニング方法を本明細書に提供する。このスクリーニング方法では、高いin vivo性能を有するADAを、(遺伝子)操作された宿主細胞を細胞死からレスキューするそれらの能力によって同定する。前記(遺伝子)操作された宿主細胞は、サイトゾルアセチル−CoA由来二次代謝産物、例えばイソプレノイド、の生産のための異種経路を含む。一部の実施形態において、前記(遺伝子)操作された宿主細胞は、機能的に破壊されたPDH−バイパス経路と、弱い活性のADAとをさらに含み、前記機能的に破壊されたPDH−バイパス経路と前記弱い活性のADAの総合活性は、(1)サイトゾルアセチル−CoA由来二次代謝物と(2)細胞生存、健康および/または成長に要するサイトゾルアセチル−CoA由来一次代謝物、両方の生産の要件を満たすために十分なサイトゾルアセチル−CoAを生じさせない。したがって、生存、健康および/または成長のために、前記宿主細胞は、増大したサイトゾルアセチル−CoAプールの生産が可能である活性ADAを要する。
(b)前記宿主細胞において対照ADAではなく試験ADAを発現させること(それによって、前記対照ADAを発現する宿主細胞と比較して前記試験ADAを発現する宿主細胞の生存度の増加より、前記試験ADAが前記対照ADAと比較して向上したin vivo性能を有すると確認される)を含む。
アセチル−CoAは、ミトコンドリアにおいてPDH複合体によって触媒されるピルベートの酸化的脱カルボキシル化によって形成され得る。しかし、S.cerevisiaeはアセチル−CoAをミトコンドリアから外に輸送することができないため、PDHバイパスは、サイトゾル区画へのアセチル−CoAの供給に不可欠な役割を有し、およびピルベートのアセチル−CoAへの変換のためのPDH反応への代替ルートを提供する。前記PDHバイパスは、酵素ピルビン酸デカルボキシラーゼ(PDC;EC4.1.1.1)、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ACDH;EC1.2.1.5およびEC1.2.1.4)およびアセチル−CoAシンセターゼ(ACS;EC6.2.1.1)を含む。ピルビン酸デカルボキシラーゼは、ピルベートのアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への脱カルボキシル化を触媒する。アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼは、アセトアルデヒドを酢酸に酸化させる。S.cerevisiaeにおけるアルデヒドデヒドロゲナーゼのファミリーは、5つのメンバーを含有する。ALD2(YMR170c)、ALD3(YMR169c)およびALD6(YPL061w)は、サイトゾルアイソフォームに対応し、その一方でALD4(YOR374w)およびALD5(YER073w)は、ミトコンドリア酵素をコードしている。主サイトゾルアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼアイソフォームは、ALD6によってコードされている。アセテートからのアセチル−CoAの形成は、ACSによって触媒され、ATPの加水分解を伴う。2つの構造遺伝子、ACS1およびACS2、はACSをコードしている。
、導入される単一塩基対置換は、タンパク質における重要部位での単一アミノ酸置換、および非機能性タンパク質の発現を生じ得る。しかしながら、非常に短い破壊配列を用いてもたらされる破壊は、自然突然変異によって野生型配列への復帰変異を起こしやすく、したがって、PDHバイパス機能の回復を宿主株にもたらすことは認識されるべきである。したがって、特定の実施形態において、破壊配列は、1〜2、3塩基対より長い。それとは正反対に、過剰な長さの破壊配列は、中程度の長さの破壊配列に優る少しの利点でも与える可能性は低く、トランスフェクションまたはターゲティングの効率を減少させる可能性がある。この関連における過剰な長さは、標的遺伝子における選択された相同配列間の距離より何倍も長い。このように、ある特定の実施形態において、破壊配列についての長さは、2塩基対から2,000塩基対までであり得る。他の実施形態において、破壊配列についての長さは、破壊構築物における相同配列とマッチする標的遺伝子座の領域間の距離とおよそ等しい長さである。
一部の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ACDH)活性をコードしている1つ以上の遺伝子を宿主細胞において機能的に破壊する。一部の実施形態において、前記アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ALD2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6、ならびにそれらの相同体および変異体からなる群より選択される遺伝子によってコードされている。
一部の実施形態では、アセチル−CoAシンターゼ(ACS)活性をコードしている1つ以上の遺伝子を宿主細胞において機能的に破壊する。一部の実施形態において、前記アセチル−CoAシンターゼは、ACS1、ACS2、ならびにその相同体および変異体からなる群より選択される遺伝子によってコードされている。
酵母において、アセチル−CoAは、解糖、トリカルボン酸(TCA)回路、酸化的リン酸化、およびビルビン酸代謝によってグルコースから生合成される。しかし、この生合成経路では、CO2が、ピルビン酸代謝中にピルビン酸カルボキシラーゼによって、ならびにTCA回路でピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびイソクエン酸デヒドロゲナーゼによって失われる。工業的発酵設定で、低解糖によってフラックスを低下させることの1つの利点は、ピルベートのアセトアルデヒドへの変換の際により少ないCO2が生産される点であり、したがって、より多くの炭素が最終製品内に捕捉され、その結果、最大理論収率を増加させることができる。第二の利点は、より少ないNADHが生産される点であり、したがって、それを再酸化させるために必要とされる酸素は有意に少ない。炭素原子の損失は、理論的には、TCA回路を迂回することによって回避することができる。これは、ホスホケトラーゼ(PK)(酵素クラスEC4.1.2.9、EC4.1.2.22)をホスホアセチルトランスフェラーゼ(PTA)(EC2.3.1.8)と併用することによって果たすことができる。
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、MEV経路の1つ以上の異種酵素を含む。一部の実施形態において、前記MEV経路の1つ以上の酵素は、アセチル−CoAをマロニル−CoAと縮合させてアセトアセチル−CoAを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、前記MEV経路の1つ以上の酵素は、アセチル−CoAの2つの分子を縮合させてアセトアセチル−CoAを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、前記MEV経路の1つ以上の酵素は、アセトアセチル−CoAをアセチル−CoAと縮合させてHMG−CoAを形成する酵素を含む。一部の実施形態において、前記MEV経路の1つ以上の酵素は、HMG−CoAをメバロネートに変換する酵素を含む。一部の実施形態において、前記MEV経路の1つ以上の酵素は、メバロネートをメバロン酸5−リン酸にリン酸化する酵素を含む。一部の実施形態において、前記MEV経路の1つ以上の酵素は、メバロン酸5−リン酸をメバロン酸5−ピロリン酸に変換する酵素を含む。一部の実施形態において、前記MEV経路の1つ以上の酵素は、メバロン酸5−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素を含む。
一部の実施形態において、前記遺伝子改変された宿主細胞は、アセチル−補酵素Aの2つの分子を縮合させてアセトアセチル−CoAを形成することができる酵素、例えば、アセチル−CoAチオラーゼをコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、(NC_000913 REGION:2324131.2325315;Escherichia coli)、(D49362;Paracoccus denitrificans)、および(L20428; Saccharomyces cerevisiae)が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、アセトアセチル−CoAを別のアセチル−CoA分子と縮合させて、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoA(HMG−CoA)を形成することができる酵素、例えばHMG−CoAシンターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、(NC_001145.補体19061.20536;Saccharomyces cerevisiae)、(X96617;Saccharomyces cerevisiae)、(X83882;Arabidopsis thaliana)、(AB037907;Kitasatospora griseola)、(BT007302;Homo sapiens)、および(NC_002758、Locus tag SAV2546、GeneID 1122571;Staphylococcus aureus)が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、HMG−CoAをメバロネートに変換することができる酵素、例えばHMG−CoAレダクターゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、HMG−CoAレダクターゼは、NADH使用ヒドロキシメチルグルタリル−CoAレダクターゼ−CoAレダクターゼである。HMG−CoAレダクターゼ(EC1.1.1.34;EC1.1.1.88)は、(S)−HMG−CoAの(R)−メバロネートへの還元的脱アシル化を触媒し、および該HMG−CoAレダクターゼを2つのクラス、クラスIおよびクラスII、にカテゴリー分けすることができる。クラスIは、真核生物および大部分の古細菌からの酵素を含み、クラスIIは、一定の原核生物および古細菌のHMG−CoAレダクターゼを含む。配列の相違に加えて、前記2つのクラスの酵素は、それらの補因子特異性に関して異なる。NADPHを排他的に利用するクラスI酵素とは異なり、クラスII HMG−CoAレダクターゼは、NADPHとNADHとを識別する能力が様々である。例えば、Hedlら、Journal of Bacteriology 186(7):1927−1932(2004)を参照されたし。抜粋したクラスII HMG−CoAレダクターゼについての補因子特異性を下に提供する。
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、メバロネートをメバロン酸−5−リン酸に変換することができる酵素、例えばメバロン酸キナーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、(L77688;Arabidopsis thaliana)、および(X55875;Saccharomyces cerevisiae)が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、メバロン酸5−リン酸をメバロン酸5−ピロリン酸に変換することができる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、(AF429385;Hevea brasiliensis)、(NM_006556;Homo sapiens)、および(NC_001145.補体712315.713670;Saccharomyces cerevisiae)が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、メバロン酸5−ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸(IPP)に変換することができる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、(X97557;Saccharomyces cerevisiae)、(AF290095;Enterococcus faecium)、および(U49260;Homo sapiens)が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、前記MEV経路によって産生されたIPPをジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)に変換することができる酵素、例えばIPPイソメラーゼ、をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。かかる酵素をコードしているヌクレオチド配列の例証となる例としては、(NC_000913,3031087.3031635;Escherichia coli)、および(AF082326;Haematococcus pluvialis)が挙げられるが、これらに限定されない。
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、IPPおよび/またはDMAPP分子を縮合させて、5個より多くの炭素を含有するポリプレニル化合物を形成することができるポリプレニルシンターゼをコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ポリプレニルを、ヘミテルペン、モノテルペン、セスキテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、ポリテルペン、ステロイド化合物、カロテノイドまたは修飾イソプレノイド化合物を形成するように修飾することができる酵素をコードしている異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
Planta 219(1):84−94(2004)。
上に記載した改変の1つ以上、例えば、ADA、NADH使用HMG−CoAレダクターゼ、AACS、PK、PTAおよび他のメバロン酸経路酵素から選択される1つ以上の酵素をコードする1つ以上の異種核酸(nucleic heterologous nucleic acids)、を含むように遺伝子操作されている宿主細胞を生産するための方法も、本明細書に提供する。宿主細胞における異種酵素の発現は、該酵素をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸を該宿主細胞に、該宿主細胞における発現を可能にする調節要素の制御下で導入することによって果たすことができる。一部の実施形態において、前記核酸は、染色体外プラスミドである。他の実施形態において、前記核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込むことができる染色体組み込みベクターである。
もう1つの態様では、イソプレノイドの生産方法であって、(a)本明細書に記載する遺伝子改変された宿主細胞のいずれかの集団を、炭素源を有する培地中、イソプレノイド化合物の作製に適する条件下で培養する工程;および(b)前記イソプレノイドを前記培地から回収する工程を含む方法を、本明細書に提供する。
微生物培養物の維持および成長のための材料および方法は、微生物学または発酵科学技術分野の当業者には周知である(例えば、Baileyら、Biochemical Engineering Fundamentals、第二版、McGraw Hill、New York、1986を参照されたし)。宿主細胞、発酵およびプロセスの特異的要件に依存して、好気性、微好気性または嫌気性条件のための適切な培養培地、pH、温度および要件を考慮しなければならない。
イソプレノイドが前記宿主細胞によって生産されたら、当該技術分野において公知の任意の適する分離および精製方法を用いて、後の使用のためにそれを回収または単離することができる。一部の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を遠心分離によって発酵から分離する。他の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相が発酵から自然に分離する。他の実施形態では、イソプレノイドを含む有機相を、発酵反応に解乳化剤および/または成核剤を添加することによって発酵から分離する。解乳化剤の例証となる例としては、凝集剤および凝固剤が挙げられる。成核剤の例証となる例としては、イソプレノイド自体の液滴、ならびに有機溶媒、例えばドデカン、ミリスチン酸イソプロピルおよびオレイン酸メチルが挙げられる。
6.1 実施例1:
NADH特異的HMG−CoAレダクターゼの同定および特徴づけ
この実施例は、NADH補因子特異性を有することが以前には公知でないHMG−CoAレダクターゼの同定および特徴づけを記載するものである。
6.1.1.1 株の(遺伝子)操作
野生型Saccharomyces cerevisiae株(CEN.PK2、Mat a、ura3−、TRP1+、leu2−、MAL2−8C、SUC2)を、(アセチル−CoAチオラーゼ(ERG10)がアセチル−CoAをアセトアセチル−CoAに変換し;HMG−CoAシンターゼ(ERG13)がアセトアセチル−CoAをHMG−CoAに変換し;そしてHMG−CoAレダクターゼがHMG−CoAをメバロネートに変換する(図1))メバロン酸(MevT)経路の発現のための宿主として使用した。
所与の酵母株のシングルコロニーを2%スクロースを有する3mLの酵母窒素塩基(YNB)培地中でスターター一夜培養物(overnight starter culture)として培養した。翌日、250mL使い捨てPETG滅菌フラスコ(Nalgene)内の40mL YNB−4%スクロース生産培養培地で前記スターター培養物から希釈した0.05の初期OD600を有する生産フラスコを用意した。前記フラスコを、下に示す継続時間にわたって250RPMで振盪することによって30℃でインキュベートした。
酵母細胞を48時間HMG−CoAレダクターゼ活性アッセイ(図8)のために、または72時間、メバロネートアッセイ(表4)のために成長させ、Falconチューブ用の固有のカートリッジを有するスインギング・バケット・ローターJS−5.3において15mL Falconチューブ中で10分間、4000×gで遠心分離することによって回収した。その細胞ペレットを1mLで再懸濁させ、冷溶解バッファー(Mini、EDTA不含プロテアーゼ阻害剤タブレット(Roche)を添加した100mM Tris pH7.0、1mM DTTおよび1mM EDTA)を使用して1回洗浄した。その後、Oリングキャップを有する2mLプラスチック製スクリューキャップマイクロチューブ(Fisher Brand 520−GRD)に細胞を移し、分解ビース(Disruption beads、0.5Mm、Fisher)およびビーズビーターを使用して1分間、6M/Sで細胞を溶解した。直ちにそれらのチューブを氷水浴内に、少なくとも5分間、置いた。チューブを最低8000×gで20分間、回転させた。その後、上清を新たな低温チューブに移した。タンパク質についての古典的ブラッドフォードアッセイ(Bradford MM、「A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein−dye binding」、Anal.Biochem 72、248−254(1976))を用いて、タンパク質濃度を測定した。
有機酸およびアルコールアッセイのための試料を、1mLの発酵ブロスを使い、それらの試料を1.5mLエッペンドルフチューブに移すことによって調製した。卓上エッペンドルフ遠心機を使用して1分間、13,000RPMで試料を回転させた。その後、その上清を15mM硫酸で希釈した(1:1 v/v)。その混合物をボルテックスにかけ、1分間、13,000RPMで遠心分離した。その清澄化された上清をHPLC分析用のバイアルに移した。
6.1.2.1 クラスII HMG−CoAレダクターゼについての補因子特異性の判定
図8に示すように、D.acidovoransおよびS.pomeroyiからのHMG−CoAレダクターゼは、NADHに対する高い特異性および高い比活性をin vitroで呈示する。これらのHMG−CoAレダクターゼは、NADPHの存在下では比活性を事実上表示しないが、NADHの存在下では比活性がほぼ400nmol/mg/分であった。同様に、P.mevaloniiからのHMG−CoAレダクターゼは、以前に発表された報告と一致して、補因子としてのNADHに対して選択性を明示した。例えば、Hedlら、J. Bacteriol 186(7):1927−1932 (2004)を参照されたし。対照的に、S.cerevisiae、S.aureusおよびH.aurantiacusからのHMG−CoAレダクターゼは、NADHの存在下で測定可能な活性を示さず、M.thermofilaからのHMG−CoAレダクターゼは、NADPHとNADH両方の存在下でかろうじて検出可能な活性を示した。これらの結果は、D.acidovoransおよびS.pomeroyiからのHMG−CoAレダクターゼが、P.mevaloniiからのHMG−CoAレダクターゼと同様の、NADH感受性HMG−CoAレダクターゼであることを示す。
図9〜11に示すように、メバロネート生産は、NADH使用HMG−CoAレダクターゼを含むMevT経路を含む細胞において、細胞内NADH濃度を増加させる代謝攪乱を導入すると、実質的に向上される。ADH1は、NADH依存様式でアセトアルデヒドをエタノールに還元する。adh1Δバックグラウンドでは、宿主細胞は、成長低下(図9)およびグリセロール生産増加(図10)を被り、これは、細胞内NADHの蓄積に起因する可能性が高い酸化還元不均衡を示す。しかし、NADPH使用HMG−CoAレダクターゼ(S.cerevisiae(Sc.)tHMG−CoAレダクターゼ)を含むMevT経路を含む細胞は、adh1Δバックグラウンドで低減されたメバロネート生産を表示するが、(P,mevalonii、D.acidovoransおよびS.pomeroyi、それぞれからの)NADH使用HMG−CoAレダクターゼを含むMevT経路を含む細胞は、同様に酸化還元ストレスの徴候を示すことにもかかわらず、メバロネート生産の実質的向上を表示する(図11)。これらのデータは、NADH使用HMG−CoAレダクターゼが、増加された細胞内NADHプールを利用してメバロネート生産を後押しすることができることを示唆する。これらの結果はまた、増加された細胞内NADH源の不在下では、NADH使用HMG−CoAレダクターゼが限定された補因子であることを示唆する。
この実施例は、サイトゾルアセチル−CoA生産への代替ルート、例えば、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、アセチル化(ADA、E.C.1.2.1.10)の異種発現による経路を、野生型PDH−バイパスの代わりに、および代替MEV経路酵素との様々な組み合わせで利用することによって、MEV経路からのメバロネートおよび下流イソプレノイド生産を向上させることができることを実証するものである。これらの結果は、NADPH生産PDH−バイパス酵素をNADH生産ADAで置換することによって導入される酸化還元不均衡を、1つには、ADA発現をMEV経路のNADH使用HMG−CoAレダクターゼと、ならびに/またはホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼの異種発現と併用することによって緩和することができることを示し、サイトゾルアセチル−CoA生産へのさらなる代替ルートも提供することができる。これらの結果は、MEV経路にアセチル−CoA基質を供給するためのADAの触媒能力が、アセチル−CoA:マロニル−CoAアシルトランスフェラーゼによってもたらされるものなどの、アセチル−CoAのアセトアセチル−CoAへの熱力学的に好適な下流の変換をもたらすことによって実質的に向上されることをさらに明示する。
6.2.1.1 株の(遺伝子)操作
表5に収載する株を構築して、(1)ADAをNADH使用HMG−CoAレダクターゼとペアにしたときの、NADPH使用HMG−CoAレダクターゼとペアにしたときに対しての、細胞成長および異種イソプレノイド生産に対する効果;(2)ADAの発現によって生ずる酸化還元不均衡に対するホスホケトラーゼおよびホスホトランスアセチラーゼ発現の効果;および(3)ADAを発現する株におけるメバロネートレベルに対するアセトアセチル−CoAシンターゼ発現の効果を判定した。
Y968は、野生型Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2,Matalphaである。Y12869、Y12746、およびそれらのすべての誘導体についての出発株は、Saccharomyces cerevisiae strain(CEN.PK2,Mat alpha,ura3−52,trp1−289,leu2−3,122,his3^1),Y003であった。S.cerevisiaeへのすべてのDNA媒介形質転換を、Gietz RWおよびWoods RA、Guide to Yeast Genetics and Molecular and Cell Biology、Part B、San Diego、CA:Academic Press Inc.、87−96頁(2002)によって記載されているような標準的酢酸リチウム法を用いて行い、すべての場合、それらの構築物の組み込みをゲノムDNAのPCR増幅によって確認した。
Y12869をY003への3回の逐次的組み込みによって産生した。先ず、遺伝子ACS2を、天然S.cerevisiae LEU2遺伝子からなる組み込み構築物(i2235;配列番号45)を導入することによって欠失させ、その結果、この構築物にACS2遺伝子座の上流および下流ヌクレオチド配列からなる配列が隣接した。S.cerevisiae宿主細胞の導入により、この構築物は、相同組換えによってそのゲノムのACS2遺伝子座と一体化し、それによってACS2コード配列をその組み込み配列で置換することによりACS2を機能的に破壊することができる。唯一の炭素源として2%EtOHを含有するCSM−leuプレートに形質転換体をプレーティングし、PCR増幅によって確認した。得られた株は、Y4940であった。
ms63907組み込み構築物(i84022;配列番号51)を下に示す。
96ウェルプレートのウェル内の、50mM コハク酸塩 pH5.0および20g/L スクロースを有するシード培地(15g/L 硫酸アンモニウム、8g/L リン酸カリウム、6.1g/L 硫酸マグネシウム、150mg/L EDTA、57.5mg/L 硫酸亜鉛、4.8mg/L 塩化コバルト、3.24mg/L 塩化マンガン、5mg/L 硫酸銅、29.4mg/L 塩化カルシウム、27.8mg/L 硫酸鉄、4.8mg/L モリブデン酸ナトリウム、0.6mg/L ビオチン、12mg/L パントテン酸カルシウム、12mg/L ニコチン酸、30mg/L イノシトール、12mg/L 塩酸チアミン、12mg/L 塩酸ピリドキシン、0.24mg/L パラ−アミノ安息香酸)にシングルコロニーを接種し、30℃で3日間、成長させた。その後、14.4uLの培養物を、50mM コハク酸塩 pH5.0および40g/L ガラクトースを有するシード培地に移して二次培養し、30℃で2日間、成長させた。
先ず、培養物を上で説明したように成長させた。ファルネセンを定量するために、600uLの2−ブトキシエタノールを、各200uLの3回の添加で150uLの全細胞ブロスに添加し、各添加間に96ウェルプレートシェーカーを用いて1000rpmで90秒間、振盪した。その後、それらの試料を40分間インキュベートした。8uLの2−ブトキシエタノール抽出物を96ウェルUVプレート(Costar 3635)において200uLのイソプロピルアルコールと混合し、その後、プレートリーダーで吸光度222について読取った。
96ウェルアッセイプレートにおいて、8uLの培養物を希釈液(20%PEG 200、20%エタノール、2%Triton X−114)と混合し、室温で30分間インキュベートした。そのアッセイプレートをボルテックスにかけた後、Beckman M5プレートリーダーでOD600を測定した。
Y967、Y12869およびY12746の接種培養物を、50mM コハク酸塩 pH5.0および20g/L スクロースを有する5mLのシード培地においてシングルコロニーから成長させた。3日の成長の後、それらの予備培養物を、50mM コハク酸塩pH5.0および40g/L スクロースを有する25mLのシード培地に移して二次培養して0.1の初期光学密度(OD)にした。10時間後、それらの培養物を、再び、50mM コハク酸塩pH5.0および40g/L スクロースを有する50mLのシード培地に移して二次培養して0.05のODにした。培養物を30℃で成長させた。ODがおおよそ3になったら、3つのフラスコを半分に分割し、回転沈降させ、培地を廃棄した。それらの培養物を、40g/L グルコース(コハク酸塩不含)を有する1.5Lシード培地に再懸濁させ、発酵槽に移した。2L Biostat B plus容器(Sartorius、ドイツ)において発酵実験を行った。撹拌を1200rpmに制御し、発酵槽を0.5L/分の空気で継続的にスパージした。14.4M NH4OHを用いてpHを5.0で維持し、温度を30℃で維持した。おおよそ1.5時間ごとに試料を抜き取って、OD、乾燥細胞重量、ならびに有機酸および糖を測定した。
6.2.2.1 ADA株は、NADPH使用HMGrとペアにしたときに対してNADH使用HMGrとペアにしたときのほうが多くのイソプレノイドを生産する
図12Aは、PDH−バイパスの欠失(acs1Δ acs2Δ ald6Δ)を含み、ADA(Dz.eutE)を異種発現する、株Y12869が、NADPH使用HMGrを含むMEV経路(構築物ms63909)よりNADH使用HMGrを含むMEV経路(構築物ms63907)を発現するときのほうが多くのファルネセンを生産することを示す。対照的に、図12Bは、インタクトPDH−バイパスを含む株Y968が、NADPH使用HMGrとペアにしたときにより多くのファルネセンを生産することを示す。これらの結果は、MEV経路からのイソプレノイド生産のためのADAの利用が、MEV経路がNADH使用HMGrを含むときに向上されることを明示する。
天然酵母は、解糖によって消費されるグルコース1つにつき2つのNADHを生産する。エタノールに発酵されると、2つのNADHは、NAD+に再び酸化される。しかし、グルコースの小部分はエタノールに発酵されずにバイオマスに変換され、その結果、過剰なNADHが生ずる。この過剰なNADHは、ジヒドロキシアセトンリン酸のグリセロール3リン酸への還元によってNAD+に再酸化され、グリセロール3リン酸は、グリセロールに加水分解される。アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼを天然PDH−バイパスの代わりに使用する株は、NADPHではなくNADHを生産し、その結果、さらなる過剰量のNADHが生ずる。バイオマスに変換される各グルコースに対して、ADAを天然PDH−バイパスの代わりに使用する株は、まさに2倍のNADHを生産し、これは、過剰なNADHを再酸化させるために2倍のグリセロールを生産しなければならないことを意味する。図13Aに示すように、Y12869(ADAを野生型PDH−バイパスの代わりに使用する株)は、Y968(インタクトPDH−バイパスを含む)の2倍のグリセロールを生産する一方で、バッチグルコース発酵において匹敵するレベルのグルコースを消費する。これらの結果は、ADA反応の化学量論によって予測されるようにY12869が酸化還元不均衡であることを明示する。
アセチル−CoAを形成するための天然PDH−バイパス反応は、この反応がATPのAMPへの加水分解に結びつけられるので、熱力学的に好適である。対照的に、アシル化アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ反応は、ATPに結びつけられず、アセチル−CoAを形成するための天然PDH−バイパス反応よりはるかに平衡に近い。それ故、メバロネートを生産するために天然S.cerevisiae経路遺伝子を使用すると、ADAおよびAld6のin vitroでの匹敵する動態特性にもかかわらず、ADAを用いる株のほうが野生型PDH−バイパスを使用する株よりはるかに少ないメバロネートを生産する。図14(第1および第2カラム)に示すように、ADA株(Y12869.ms63909)におけるメバロネート生産は、in vitroで測定される十分な動態能力にもかかわらず、等価の野生型株(Y968.ms63909)のものの約30%に過ぎない。この結果は、ADAによるアセトアルデヒドのアセチル−CoAの変換の背後にある熱力学的駆動力の不足を表す。
Claims (54)
- イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸と、
(b)アシル化アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)天然ピルビン酸デヒドロゲナーゼ(PDH)−バイパスの1つ以上の酵素の機能破壊と
を含む細胞。 - 前記MEV経路の1つ以上の酵素が、アセチル−CoAをマロニル−CoAと縮合させてアセトアセチル−CoAを形成する酵素を含む、請求項1に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の1つ以上の酵素が、アセチル−CoA:マロニル−CoAアシルトランスフェラーゼを含む、請求項1または請求項2に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の1つ以上の酵素が、3−ヒドロキシ−3−メチルグルタリル−CoA(HMG−CoA)をメバロネートに変換するNADH使用酵素を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の1つ以上の酵素が、NADH使用HMG−CoAレダクターゼを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- ホスホケトラーゼ(PK)をコードしている異種核酸をさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- ホスホトランスアセチラーゼ(PTA)をコードしている異種核酸をさらに含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記PDH−バイパスの1つ以上の酵素が、アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)から選択される、請求項1に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- ACS1が、機能的に破壊されている、請求項8に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- ACS2が、機能的に破壊されている、請求項8に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- ALD6が、機能的に破壊されている、請求項8に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- ACS1およびACS2が、機能的に破壊されている、請求項8に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- ACS1、ACS2およびALD6が、機能的に破壊されている、請求項8に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)活性を有する1つ以上の酵素の機能破壊をさらに含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- ADH活性を有する前記1つ以上の酵素が、アルコールデヒドロゲナーゼ1(ADH1)、アルコールデヒドロゲナーゼ3(ADH3)、アルコールデヒドロゲナーゼ4(ADH4)およびアルコールデヒドロゲナーゼ5(ADH5)から選択される、請求項14に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記ADAのアミノ酸配列が、配列番号2と少なくとも90%同一である、請求項1から15のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記アセチル−CoA:マロニル−CoAアシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列が、配列番号16と少なくとも90%同一である、請求項3に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記NADH使用HMG−CoAレダクターゼのアミノ酸配列が、配列番号20と少なくとも90%同一である、請求項5に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記ホスホケトラーゼ(PK)のアミノ酸配列が、配列番号12と少なくとも90%同一である、請求項6に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記ホスホトランスアセチラーゼ(PTA)のアミノ酸配列が、配列番号14と少なくとも90%同一である、請求項7に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、アセチル−CoAの2つの分子を縮合させてアセトアセチル−CoAを形成する酵素を含む、請求項1、4から16、および18から20のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、アセトアセチル−CoAをアセチル−CoAと縮合させてHMG−CoAを形成する酵素を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、HMG−CoAをメバロネートに変換する酵素を含む、請求項1から3、6から17、および19から21のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、メバロネートをメバロン酸5−リン酸にリン酸化する酵素を含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、メバロン酸5−リン酸をメバロン酸5−ピロリン酸に変換する酵素を含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、メバロン酸5−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素を含む、請求項1から25のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の前記1つ以上の酵素が、HMG−CoAシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼから選択される、請求項1から26のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- アセチル−CoAチオラーゼ、HMG−CoAシンターゼ、HMG−CoAレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼおよびメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードしている複数の異種核酸を含む、請求項1から27のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の1つ以上の酵素をコードしている前記1つ以上の異種核酸が、単一の転写調節因子の制御下にある、請求項1から28のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記MEV経路の1つ以上の酵素をコードしている前記1つ以上の異種核酸が、複数の異種転写調節因子の制御下にある、請求項1から28のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- イソペンテニルピロリン酸(IPP)をジメチルアリルピロリン酸(DMAPP)に変換し得る酵素をコードしている異種核酸をさらに含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- IPPおよび/またはDMAPP分子を縮合させてポリプレニル化合物を形成し得る酵素をコードしている異種核酸をさらに含む、請求項1から31のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- IPPまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成し得る酵素をコードしている異種核酸をさらに含む、請求項1から32のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- IPPまたはポリプレニルを修飾してイソプレノイド化合物を形成し得る前記酵素が、カレンシンターゼ、ゲラニオールシンターゼ、リナロールシンターゼ、リモネンシンターゼ、ミルセンシンターゼ、オシメンシンターゼ、α−ピネンシンターゼ、β−ピネンシンターゼ、γ−テルピネンシンターゼ、テルピノレンシンターゼ、アモルファジエンシンターゼ、α−ファルネセンシンターゼ、β−ファルネセンシンターゼ、ファルネソールシンターゼ、ネロリドールシンターゼ、パチュロールシンターゼ、ノートカトンシンターゼおよびアビエタジエンシンターゼからなる群より選択される、請求項33に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記イソプレノイドが、ヘミテルペン、モノテルペン、ジテルペン、トリテルペン、テトラテルペン、セスキテルペンおよびポリテルペンからなる群より選択される、請求項33に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記イソプレノイドが、セスキテルペンである、請求項33に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記イソプレノイドが、C5〜C20イソプレノイドである、請求項33に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記イソプレノイドが、アビエタジエン、アモルファジエン、カレン、α−ファルネセン、β−ファルネセン、ファルネソール、ゲラニオール、ゲラニルゲラニオール、イソプレン、リナロール、リモネン、ミルセン、ネロリドール、オシメン、パチュロール、β−ピネン、サビネン、γ−テルピネン、テルピノレンおよびバレンセンからなる群より選択される、請求項33に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記細胞が、酵母細胞である、請求項1〜38のいずれか一項に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記酵母細胞が、Aciculoconidium、Ambrosiozyma、Arthroascus、Arxiozyma、Ashbya、Babjevia、Bensingtonia、Botryoascus、Botryozyma、Brettanomyces、Bullera、Bulleromyces、Candida、Citeromyces、Clavispora、Cryptococcus、Cystofilobasidium、Debaryomyces、Dekkara、Dipodascopsis、Dipodascus、Eeniella、Endomycopsella、Eremascus、Eremothecium、Erythrobasidium、Fellomyces、Filobasidium、Galactomyces、Geotrichum、Guilliermondella、Hanseniaspora、Hansenula、Hasegawaea、Holtermannia、Hormoascus、Hyphopichia、Issatchenkia、Kloeckera、Kloeckeraspora、Kluyveromyces、Kondoa、Kuraishia、Kurtzmanomyces、Leucosporidium、Lipomyces、Lodderomyces、Malassezia、Metschnikowia、Mrakia、Myxozyma、Nadsonia、Nakazawaea、Nematospora、Ogataea、Oosporidium、Pachysolen、Phachytichospora、Phaffia、Pichia、Rhodosporidium、Rhodotorula、Saccharomyces、Saccharomycodes、Saccharomycopsis、Saitoella、Sakaguchia、Saturnospora、Schizoblastosporion、Schizosaccharomyces、Schwanniomyces、Sporidiobolus、Sporobolomyces、Sporopachydermia、Stephanoascus、Sterigmatomyces、Sterigmatosporidium、Symbiotaphrina、Sympodiomyces、Sympodiomycopsis、Torulaspora、Trichosporiella、Trichosporon、Trigonopsis、Tsuchiyaea、Udeniomyces、Waltomyces、Wickerhamia、Wickerhamiella、Williopsis、Yamadazyma、Yarrowia、Zygoascus、Zygosaccharomyces、Zygowilliopsis、およびZygozymaからなる群より選択される属に属する、請求項39に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記酵母が、Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Schizosaccharomyces pombe、Dekkera bruxellensis、Kluyveromyces lactis (以前はSaccharomyces lactisと呼ばれていた)、Kluveromyces marxianus、Arxula adeninivoransおよびHansenula polymorpha(今ではPichia angustaとして公知)からなる群より選択される、請求項39に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記酵母が、Candida lipolytica、Candida guilliermondii、Candida krusei、Candida pseudotropicalisおよびCandida utilisからなる群より選択される、請求項39に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記酵母が、Saccharomyces cerevisiaeである、請求項39に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- 前記酵母が、パン酵母、CBS 7959、CBS 7960、CBS 7961、CBS 7962、CBS 7963、CBS 7964、IZ−1904、TA、BG−1、CR−1、SA−1、M−26、Y−904、PE−2、PE−5、VR−1、BR−1、BR−2、ME−2、VR−2、MA−3、MA−4、CAT−1、CB−1、NR−1、BT−1およびAL−1からなる群より選択されるSaccharomyces cerevisiaeの株である、請求項43に記載の遺伝子改変された宿主細胞。
- イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸と、
(b)アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)からなる群より選択される天然PDH−バイパスの少なくとも1つの酵素の機能破壊と、
(d)ホスホケトラーゼ(PK)をコードしている異種核酸と、
(e)ホスホケトラーゼ(PTA)をコードしている異種核酸と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。 - イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸であって、該1つ以上の酵素が、NADH使用HMG−CoAレダクターゼを含む、1つ以上の異種核酸と、
(b)アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)からなる群より選択される天然PDH−バイパスの少なくとも1つの酵素の機能破壊と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。 - イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸であって、該1つ以上の酵素が、NADH使用HMG−CoAレダクターゼを含む、1つ以上の異種核酸と、
(b)アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)からなる群より選択される天然PDH−バイパスの少なくとも1つの酵素の機能破壊と
(d)ホスホケトラーゼ(PK)をコードしている異種核酸と、
(e)ホスホケトラーゼ(PTA)をコードしている異種核酸と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。 - イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の1つ以上の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸であって、該1つ以上の酵素が、アセチル−CoA:マロニル−CoAアシルトランスフェラーゼを含む、1つ以上の異種核酸と、
(b)アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)からなる群より選択される天然PDH−バイパスの少なくとも1つの酵素の機能破壊と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。 - イソプレノイドを生産する能力がある遺伝子改変された宿主細胞であって、
(a)イソペンテニルピロリン酸を作るためのメバロン酸(MEV)経路の複数の酵素をコードしている1つ以上の異種核酸であって、該複数の酵素が、アセチル−CoA:マロニル−CoAアシルトランスフェラーゼおよびNADH使用HMG−CoAレダクターゼを含む、1つ以上の異種核酸と、
(b)アセチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ(アセチル化)(ADA)をコードしている異種核酸と、
(c)アセチル−CoAシンターゼ1(ACS1)、アセチル−CoAシンターゼ2(ACS2)およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ6(ALD6)からなる群より選択される天然PDH−バイパスの少なくとも1つの酵素の機能破壊と
(d)ホスホケトラーゼ(PK)をコードしている異種核酸と、
(e)ホスホケトラーゼ(PTA)をコードしている異種核酸と
を含む、遺伝子改変された宿主細胞。 - イソプレノイドを生産するための方法であって、
(a)請求項1から49のいずれか一項に記載の遺伝子改変された酵母細胞の集団を、炭素源を有する培地において、該イソプレノイド化合物の製造に適する条件下で培養すること;および
(b)該イソプレノイド化合物を培地から回収すること
を含む方法。 - 前記イソプレノイド化合物が、培地1リットルにつき約10グラムより多い量で生産される、請求項50に記載の方法。
- 前記イソプレノイド化合物が、乾燥細胞重量1グラムにつき約50mgより多い量で生産される、請求項50に記載の方法。
- 前記宿主細胞が、前記ADAをコードしている異種ヌクレオチド配列を含まない同じ宿主細胞と比較して増加された量のイソプレノイド化合物を生産する、請求項50から52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増加された量が、少なくとも10%である、請求項53に記載の方法。
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