KR20130120495A - 글루칸 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 글루칸 및 겔화제로 구성되고, 융점 (졸에서 엘)이 37℃ 이상인, 겔 조성물 및 이러한 조성물의 치료, 특히 상처 치료, 용도에 관한 것이다.

Description

글루칸 조성물{Glucan compositions}
본 발명은 겔화제 및 글루칸으로 구성되는 새로운 조성물, 이의 약품, 의학 기구에 조합되는, 의학 기구, 기능식품, 화장품 또는 기타 등의 용도에 관한 것이다. 바람직하기로는 이러한 조성물은 상처 표면에 직접 적용되거나 기재에 제공되어 복합재를 형성하는 주요 상처 드레싱으로 사용된다. 또한 상처 치료를 위한 글루칸 조성물 적용 방법이 기재된다. 더 나아가 본원에서 상처 드레싱 및 키트가 기재된다.
글루칸은 무엇보다도 식물, 세균, 진균 및 원충의 세포벽에서 발견되는 글루코스 고분자의 이질적 그룹이다. 글루칸은 골격 사슬을 가지고 어떤 경우에는, 글루칸 유래에 따라, β(1,3), β(1,4) 및/또는 β(1,6)-결합 글루코실 단위들로 이루어진 곁사슬들을 가진다. 원천 및 분리방법에 따라, 베타-글루칸은 골격 및 곁사슬들에서 다양한 분지도 및 결합 유형을 가진다. 곁사슬들의 결합 빈도 및 유형은 분자들의 생물학적 활성과 높은 연관성이 있다. 또한 글루칸은 사슬 응집 성향뿐 아니라 분자량이 크게 다르며, 이들 두 특성들은 효능 프로필에 있어서 중요한 특징이다. 진균 및 효모 유래의 많은 베타-글루칸은 자연 상태에서 수불용성이지만, 산분해 또는 분자에 -인산염, -황산염, -아민, -카르복시메틸 등과 같은 외래기들 도입에 의한 유도화로 용해성으로 제조될 수 있다.
유럽, 아시아 및 미국에서, 특히 베이커 이스트 유래 베타-글루칸은 동물용 사료 첨가물, 화장품, 인간의 식이보충제, 예를 들면 상처치료에 있어서 면역조절제, 및 피부크림제제에서의 활성성분으로 오랫동안 사용되었다. 글루칸은 WO02/058711에서 보이는 바와 같이 암치료에 사용되고 있다. 베타-글루칸은, 이와 관련하여, 부분적으로는 양호하게 조절되고 국소적 염증반응을 유도하여 백혈구 활성을 증가시키는 면역자극제로 고려되었다. 또한 염증성 장질환 치료에서의 용도는 WO 2009/063221에 기재되어 있다. 상처 치료에 대한 글루칸의 추가적 적용은 EP 815144 및 US 6875754에 기재되고, 천식 및 알레르기 치료에 대한 적용은 US 12/528,215에 기술되어 있다.
곡물 글루칸은 일반적으로 β(1,3) 및 상당한 정도의 β(1,4) 결합들의 미분지 사슬들로 구성되고, 효모 글루칸은 β(1,3) 및 β(1,6) 결합된 글루코실 잔기들로 이루어진 곁사슬들의 분지점으로 작용하는 β(1,6) 결합들과 함께 주로 β(1,3) 결합된 글루코실 잔기들로 이루어진다. 글루칸으로 분류되는 기타 분자들로는, 분지가 없고 β(1,3) 결합 글루코실 잔기들로 이루어진 기본적으로 선형분자인 커들란을 포함한다. 렌티난은 β(1,3) 결합 골격이지만 골격에 실질적으로 규칙적으로 연결되어 머리빗 구조를 제공하는 단일 β(1,6) 결합 글루코실 잔기들이 포함되는 글루칸이다. 단일 β(1,6) 결합 글루코실 잔기들은 골격에 연결되어 β(1,3,6) 연결점과 동등하지만 이러한 연결점에 추가적인 분자들이 연결되지 않고 따라서 렌티난과 같은 글루칸은 곁사슬들을 가지지 않는다. 이러한 글루칸 류의 다른 예시로는 스클레로글루칸, 라미나린 및 쉬조필란이 있다.
곁사슬들의 분지도 및 길이 및 구조의 다양성은 대조적인 2차 및 3차 구조 및 이에 따른 생물학적 활성으로 이어진다. 글루칸의 고차 구조들은 상당히 다르고 분자량, 용해도 및 입자크기 모두는 일반적으로 예측불가능한 방식으로 활성에 영향을 미친다. 일부 생성물들은 표적 세포들에서 매우 잠재적인 염증성 시토카인의 유도자들이지만, 다른 것들은 시토카인 방출을 완전히 억제하는 역효과를 보인다. 많은 전형적인 불용성 베타-글루칸 생성물들은 전 범위의 염증성 반응들을 유도하고, 예를 들면 불용성 베타-글루칸 제제 주입은 육아종 형성, 관절염 유도 및 그람음성패열증 감수성 증가와 연관된다. 한편, 용해성 베타-글루칸은 이러한 부작용으로 인한 유해성이 보고되지 않았지만, 면역자극제로서의 효능이 실질적으로 가변적이라고 알려져 있다.
예를 들면, 선택적으로 (1,6) 결합된 곁사슬들을 제거하는 글루카나제 처리에 의해 변형된 효모 유래 글루칸 생성물은 천연의 (1,6) 결합된 곁사슬들을 가지는 생성물보다 어류의 면역계를 더욱 자극할 수 있다는 것이 밝혀졌다 (WO　95/30022).
글루칸은 치료제 및 보조제로서 상당한 잠재성을 가지지만 광범위한 구조적 다양성, 이러한 거대하고 복잡한 분자들에 대한 분석상의 문제들 및 이러한 분자들의 작용기작 및 수용체들에 대한 이해 부족으로, 개선된 글루칸 생성물, 특히 상처 치료에 효과적인 생성물에 대한 필요성은 여전히 존재한다.
베타-글루칸은 수많은 병원체 (미생물), 특히 진균 표면에서 발견되므로 소위 병원균 연관 분자 패턴으로 알려져 있다. 따라서 고차 생물체는 이러한 유형의 병원체에 속하는 침입자를 발견하고 파괴하기 위하여 이러한 유형의 구조를 인식하는 진화된 메커니즘을 가진다. 포유류에서 소위 선천성 면역세포들은 베타-글루칸을 인식하는 특이 수용체들을 발현하고, 가장 중요한 수용체들 중 하나는 덱틴-1이지만, 다른 수용체들도 이러한 인식 또는 베타-글루칸에 의해 유도되는 신호전달에 관여하고 이들은 무엇보다도 CD11b/CD18 (CR3), 및 톨 수용체들 2 및 4 (TLR2 및 TLR4)이다. 베타-글루칸 인식에 관여하는 세포들 중 전형적인 것은 선천 면역계의 식세포들, 즉 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 및 과립구이지만, 자연살해세포뿐 아니라 수많은 내피세포 및 기타 조직 특이 세포들도 베타-글루칸 수용체들을 발현할 수 있다.
표적 세포에서 생물학적 반응을 유도하는 중요한 단계는 수용체와의 초기 결합 및 또한 아마도 세포로의 적당한 신호-전달에 충분한 수의 수용체들을 교차결합하는 베타-글루칸 제제 능력이다. 본 발명은 특이 유형의 생물학적 활성 유도 능력을 가지는 생성물을 기술한다. 이는, 대량의 수용체들을 교차-결합하고 이차적으로 식균되어 다량의 반응들을 유도하고, 불용성 (또는 "결정 유사") 글루칸 성질로 인하여 세포의 리소좀이 파열되어 NLRP 염증조절결합체 활성을 유도하는 불용성 생성물과 대조된다. 또한 불용성 베타-글루칸은 염증조절결합체 활성을 촉발하여 바람직하지 않은 염증반응에 이르는 ROS (활성산소)을 유도한다.
본 발명은 여러 면역기작들을 활성 시키지만, 다수의 (응집된 불용성) 베타-글루칸 생성물에 전형적인 염증조절결합체 활성을 촉발시키지 않는 베타-글루칸 생성물을 기술한다.
이하 비-제한적 실시예들 및 도면들에서 본 발명을 더욱 상세하게 기술할 것이다.
도 1 은 <2% 반복적 β(1,6) 결합된 글루코실 단위들을 가지는 분지 β(1,3) 글루칸으로 형성되는 바람직한 효모 글루칸들을 dn/dc = 0.12으로 가정하고 0.5% LiCl의 DMAc에서 분석한 SEC-MALS-RI 크로마토그램을 보인다. 도시된 바와 같이 분자량 분포 범위는 단일사슬 수준에서 약 10,000 g/mol 내지 약 200,000 g/mol이다.
도 2 는 <2% 반복적 β(1,6) 결합된 글루코실 단위들을 가지는 분지 β(1,3) 글루칸으로 형성되는 바람직한 효모 글루칸들을 dn/dc = 0.15로 가정하고 완충수용액 (0.1 M NaNO 3 )에서 분석한 SEC-MALS-RI 크로마토그램을 보인다. 도시된 바와 같이 단일사슬 기준으로 분자량 분포 범위는 10,000 g/mol 내지 10,000,000 g/mol 이상이다. DMAc/LiCl에서의 결과와 함께 수용성 SEC-MALS-RI는, 바람직한 효모 글루칸들이 수용액에서 응집체/초분자 구조로 존재한다는 것을 보인다.
도 3 은 본 발명에 사용되는 용해성 베타 글루칸의 가정적 작용기작을 보인다. 본 도면은 베타 글루칸 (BG) 가지들이 예를 들면 대식세포 상의 수용체들과 동시에 결합하고 이에 따라 선천 면역계를 활성시키는 것을 보인다.
도 4 는 SG 단독 (2%), 카르복시메틸 셀룰로스 단독 (1% CMC), 둘의 조합물 (2% SG, 1% CMC) 대 비히클 (물) 및 양성대조군 (0.5% HPMC 및 1% CMC 중의 rh-PDGF-BB (10ug) + rh-TGF-α (1ug)의 국소 투여에 의해 자극된db/db 생쥐 모델 전층 절제 상처 봉합을 보인다.
도 5 는 시간 경과에 따른 잔류 상처 면적 평균% (± sem)을 보인다 - 그룹들: (1) 비히클 대조군, (4) 메토셀, (5) 인트라사이트, (9) 2% SG (1% CMC), (12) +ve 대조군 (HPMC), & (13) +ve 대조군 (CMC).
도 6 은 시간 경과에 따라 수축되어 봉합된 원 상처 면적 평균%를 보인다 (± sem) - 그룹들: (1) 비히클 대조군, (2) 1% CMC, (6) 2% SG, (9) 2% SG (1% CMC), (12) +ve 대조군 (HPMC), & (13) +ve 대조군 (CMC).
도 7 은 시간 경과에 따라 수축되어 봉합된 원 상처 면적 평균%를 보인다 (± sem) - 그룹들: (1) 비히클 대조군, (4) 메토셀, (5) 인트라사이트, (9) 2% SG (CMC), (12) +ve 대조군 (HPMC), & (13) +ve 대조군 (CMC).
도 8 은 두 종의 상이한 제제들인 Biotec Pharmacon의 Woulgan Biogel, 수화겔 단독, 귀리 베타-글루칸 생성물 대 비히클 (물) 및 양성대조군 (수화겔 중 rh-PDGF-BB (10ug) + rh-TGF-α (1ug))의 국소 투여에 의해 자극된db/db 생쥐 모델 전층 절제 상처 봉합을 보인다.
도 9 는 알루미늄 용기에 보관된 1,5% 카르복시메틸 셀룰로스과 혼합된 SG 및 SG를 보인다. T=0은 연구 개시 외관을 나타내고, T=6은 4 및 37℃ 사이로 매주 변경되는 온도에서 6개월 보관된 시료들을 나타낸다.
글루칸 생성물은 통상 수용액 중에서 입자성 또는 어떤 경우에는 완전 용해성이고, 후자의 경우에는, 예를 들면, US 특허 5,322,841에 기재된 바와 같이 유동성 투명 용액이거나 일부의 경우 Steiner 등 (Prog Colloid Polymer Science 77, 1988)에 기재된 바와 같이 점성액으로 제공된다. 용해성 베타-글루칸, 특히 용해성 효모 글루칸의 경우, 진정한 겔 형태는 일반적이지 않지만, 본 겔 생성물은 특히 상처 치료에 있어서, 기타 글루칸 생성물들과 비교할 때 우수한 생물학적 활성을 제공한다는 것을 알았다. 뛰어난 약학적 또는 의학적 기구 효능 프로필에 더하여, 상처 치료에 있어서 상처 보습을 확보하도록 약학적 또는 의학적 기구를 적용하는 것이 극히 중요하다. 또한 감염 방지를 위하여 최종 생성물들이 상처 표면을 덮고 바람직하게는 부착하고 의료 실무진에 의해 적절하게 판단되거나 또는 상처 유형에 따라 필요한 투여 프로필을 제공하여야 한다. 통상, 입자성, 반-용해성 또는 액상의 글루칸은, 효과적이지 않고 상처 치료 목적에 적용될 수 없는 상태이거나 또는 양자의 이유로 인하여, 이러한 기본 요건을 충족시키지 못한다. 본 발명의 글루칸 조성물은 이러한 필요 특성들을 조합하여 글루칸 겔 조성물이 도포될 수 있는 모든 용도에 유용하다. 엄격한 국소 도포뿐 아니라, 위장관 또는 구강 질환 치료와 같은 경구 및/또는 점막투여가 가능하다. 본 발명에 의한 글루칸 조성물은 우수한 부착 특성으로 작용 부위에 있는 점막 내층을 덮을 수 있어 치료 과정을 촉진시킨다. 따라서 본 발명의 글루칸 조성물은 구내 점막염 치료에 특히 유용하다.
놀랍게도, 본 발명자들은 베타 글루칸 및 겔화제의 조합으로 상승효과 및 이에 따른 개선된 상처 치료가 가능하다는 것을 알았다. 특정 이론에 구속되지 않고, 이러한 상승효과에 대한 가능한 설명은 면역세포의 패턴 인식 수용체 (PRR)에 대한 최적화된 베타 글루칸 제시로 인한 것일 수 있다. 이러한 PRR은 선천 면역계에 있는 세포의 세포막에서 발현되는 단백질이다. 이들 PRR은 병원미생물 및 세포 스트레스와 연관된 병원균 연관 분자 패턴 (PAMP)을 인식한다. PAMP는 식세포 및 항원제시세포로 하여금 추가적인 많은 작용자 기능들을 더욱 성숙시키고 활성시키도록 지시한다. 따라서, PAMP로 자극되지 않은 과립구 또는 대식세포는 표적세포들 및 미생물들을 살해하고 파괴시키는데 충분하지 않을 것이다. 또한 PAMP는 관련 자극 (예를 들면 미생물들)에 반응이 개시되고 자기-항원에는 그렇지 않다는 것을 보증하는 면역에 있어서 기본적인 것이다.
PAMP 인식에 기여하는 것으로 알려진 3종의 중심 PRR은 보체 수용체 3 (CD11b/CD18), 톨-유사 수용체 2 및 6의 이종이량체, 및 덱틴 -1 수용체이다. 이러한 수용체들을 효과적으로 자극하는 것이 선천 면역계 활성화에 중요한 단계이고 관여된 모든 세포들이 변형 상태가 된다. 베타 글루칸 및 겔화제와의 조합에 따른 긍정적 결과에 기초하여, 겔화제는 베타 글루칸이 이들 수용체에 위치하는PRR과의 정확한 연결 및 가교결합을 위한 수단으로 작용하여 이에 따라 연속적인 상처 치료 효능이 개선되는 것으로 보인다.
따라서, 일 양태에서, 본 발명은 글루칸 및 겔화제로 구성되며, 융점 (겔에서 졸)이 37oC 이상인 겔 조성물을 제공한다. 겔화제는 바람직하기로는 하나 이상의 탄수화물/다당체 (글루칸 외)로 구성되거나 이루어지거나 실질적으로 이루어지고 겔 구조체를 안정화시킬 수 있는 농도로 존재한다. 글루칸은 제제에서 겔로 존재하므로 입자성 글루칸 형태보다는 용해성이다. 바람직하기로는 글루칸은 25℃ 및 중성 pH에서 ≥ 1 % (예를 들면 1.5-6%) 농도로 물에 용해될 때 그 자체가 겔을 형성한다.
겔화제와 조합되면 베타-글루칸 성분 농도는 ≥ 0.1% 로 감소되고 첨가된 겔화제에 의해 원하는 겔 특성이 획득될 수 있다. 베타-글루칸 함량 상한은 첨가 겔화제 농도 및 성질에 따라 결정되지만, 전형적으로 4% 이하이다. 베타-글루칸 및 겔화제가 조합되는 최종 생성물은, 상기된 바와 같이 원하는 상처 치료 능력을 가지도록 조제된다. 예시로는 1 또는 1.5% 고분자량의 카르복시메틸셀룰로스가 조합되는 1 또는 2% 용해성 효모 베타-글루칸을 포함하며 안정한 겔을 제공하고 이들 두 조제들이 단독으로 사용될 때와 비교하여 개선된 상처 치료 성능을 보인다. 혼화되면 겔화제는 베타-글루칸의 분자 배열이 바람직한 초분자 유형의 배열이 되도록 유도한다. 새로운 겔의 약학적 적용에 있어서, 겔 내에서 베타-글루칸의 구조는 표적세포집단의 표면 수용체의 가교-결합을 가능하게 하는 형태로 안정화되어, 원하는 면역증가 활성을 제공하지만, 응집된 불용성 베타-글루칸 제제의 부작용은 보이지 않는다. 바람직하기로는 글루칸은 효모 글루칸이고 단일사슬기준으로 중량평균분자량은 15,000 내지 50,000　g/mol이고 수용액 중 응집체 기준으로 중량평균분자량은 4 내지 20　x　105　g/mol이다.
"단일사슬"이란 개별 글루칸 분자, 즉 글리코실 잔기들이 공유 결합된 하나의 분자를 의미한다. "응집체"는 수소결합으로 형성되며 초분자 또는 고차 구조체를 형성한다. 이러한 연결은 공유결합보다 덜 영구적이지만 본원에 기재된 방법에 의하면 인식가능한 패턴의 응집체가 제공되고, 이들의 평균분자량은 본원에 언급된 방법으로 분석될 수 있다. "수용액"은 전형적으로 pH 7이다.
수용액은 겔 상태일 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명의 겔은 바람직하기로는 수용액, 즉 수화겔이다. 겔 조성물은 바람직하기로는 수화된 친수콜로이드이다. 수화된 친수콜로이드는 탄성 및 점성 거동을 보인다. 친수콜로이드는 분자내- 또는 분자간- 내 수소결합이 물에 대한 수소결합보다 엔트로피를 극복할 정도로 우월할 때 전형적으로 겔을 형성한다.
겔화제는 바람직하기로는 수용액 중 자체로 수화겔을 형성할 수 있는 고분자이며, 글루칸과 조합하여, 글루칸　성분의 겔-형성 특성을 높일 수 있다.
바람직한 겔화제 예시로는 셀룰로스, 세균 또는 조류 유래 것들 예를 들면 히드로겔, 알기네이트, 젤란검 뿐 아니라 셀룰로스 고분자 및 유도체 예를 들면 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 및 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트이다. 이들 겔의 일부는 또한 추가 성분들 예를 들면 은과 결합된다. 따라서 겔화제는 바람직하기로는 비-글루칸 다당체이다. 겔화제는 바람직하기로는 친수콜로이드이고 적합한 친수콜로이드는 당 기반보다는 단백질성이다. 모든 경우에 겔화제는 화학적 또는 기타 처리방법에 의해 유도된 천연 조제 또는 전적으로 합성 조제일 수 있다.
검은 예를 들면 트래거캔스 및 잔탄검; 알긴산나트륨; 젤라틴 및 젤란검이 겔화제로 사용될 수 있다. 본 군의 대표인, 세균-유래 생성물인 젤란검은, AppliedGel, 피타겔 (Phytagel) 또는 Gelrite라는 상표로 증점제, 유화제, 및 안정제로 자주 사용된다. 젤란검은 슈도모나스 엘로데아 (Pseudomonas elodea) 순수배양에 의한 발효산물로 생성되고, 하나의 α-L-람노스, 하나의 β-D-글루쿠론산 및 2개의 β-D-글루코스 잔기들의 4당류 반복 단위를 가지는 음이온성, 고분자량의, 탈아세틸화 세포외 다당체 검이다.　4당류 반복 단위는 다음 구조를 가진다: [D-Glc(β1→4)D-GlcA(β1→4)D-Glc(β1→4)L-Rha(α1→3)]n. 4당류 단위들은 (α1→3) 글리코시드 결합으로 서로 연결된다. 젤란검의 정확한 분자식은 약간씩 다르다 (예를 들면, 글루쿠론산이 여러 염들로 중화되는 정도에 따라). 젤란검은 온도-의존성 및 양이온-유도 겔화 특성을 가진다. 1) 다당체 함량, 2) 다당체에서 o-아세틸 대체 비율 및 3) 단백질 함량 (핵산 잔류물 및 기타 유기 질소원을 포함)에 의해 특정되고 분류되는 3종의 기본 젤란검 형태가 있다.　2종의 형태로 가용된다 (고 아실 함량 또는 저 아실 함량). 아실기는 겔 특성에 큰 영향을 미친다. 고 아실 형태는 연성, 고도의 탄성 및 비-취성의 겔을 생성하지만, 저 아심 형태는 경성, 비-탄성 및 취성의 겔을 형성한다. 젤란검은 래트에 식이 또는 강제급식으로 단일 대량 투여 (5 g/kg b.w.)할 때 실제로 비-독성이다.
카르복시메틸 셀룰로스 또는 메틸셀룰로스와 같은 생성물은 긴 미분지 사슬들을 생성하는-CH2OH 기들이 배향된 β-D-글루코스 고분자인 셀룰로스 유래 겔화제 군의 대표이다. 셀룰로스는 식물체의 주요 구성 물질이다. 셀룰로스는 일부 또는 모든 수산기들을 다른 기들 예를 들면 메톡시드 (-OCH3) 기들 및 카르복시메틸 (-CH2-COOH) 기들로 대체하여 개질될 수 있다. 메틸 셀룰로스는 셀룰로스를 가성용액 (예를 들면 수산화나트륨 용액)과 함께 가열하고 이것을 염화메틸로 처리하여 합성적으로 제조될 수 있다. 다른 유형의 메틸 셀룰로스는 치환되는 수산기들 개수에 따라 제조된다. 카르복시메틸셀룰로스 (CMC)는 알칼리 및 클로로아세트산과의 셀룰로스 반응으로 형성된다. 상이한 CMC 제제는 상이한 정도의 치환체를 가지지만, 일반적으로는 단량체 단위 당 0.6 - 0.95 유도체 범위이다. CMC 분자들은 높고 낮은 치환 영역들을 보이는 비균일 유도화로 천연 셀룰로스보다 평균적으로 어느 정도 더 짧다. 대부분의 CMC는 냉수에 신속하게 용해되고 CMC는 전형적인 농도에서 칼슘이온 존재에서도 겔화되지 않으므로 겔화되지 않고 점도 조절용으로 주로 사용된다. 점도 조절 능력으로 증점제, 상 및 유화 안정제, 및 현탁제로 사용된다. 또한 특히 Ca2 + 염으로 사용될 때 CMC는 낮은 점도에서도 보수성이 높으므로 이러한 용도로 사용될 수 있다. 카르복시메틸 셀룰로스 (CMC) 또는 셀룰로스 검은 때로 나트륨염, 카르복시메틸 셀룰로스나트륨으로 사용된다.
알기네이트는 가장 풍부한 해양 생고분자이고, 셀룰로스 다음으로, 세상에서 가장 풍부한 생고분자이다. 알기네이트 주요 공급원은 자이언트 켈프 ( 마크로키스티스 피리페라 ) ( Macrocystis pyrifera)와 같은 갈조류의 세포벽 및 세포내 구간이다. 또한 알기네이트는 일부 세균 (예를 들면 아조토박터 및 슈도모나스 속)에 의해 합성된다. 알기네이트는 염이고 알긴산의 에스테르이다. 알기네이트의 화학적 구성은, 1→4 결합으로 연결된 β-D-만누론산 및 α-L-글루론산 사슬의 무작위 배열이다. 알기네이트는 물에 녹지 않지만 물을 쉽게 흡수한다. 대부분의 적용에 있어서 부동화제로서의 알기네이트 성능은 실온에서 구축되고 설정되는 열-안정한 강력 겔 형성 능력에 기초한다. 대부분 적용에 있어서 관심 사항은 칼슘 이온으로 알기네이트 겔을 형성하는 것이다.
본 발명에 따라 사용될 수 있는 기타 겔-형성제는, 제한적이지 않지만, 카보머; 친수성 고분자 예를 들면 산화폴리에틸렌, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 폴리비닐알코올이다.
본 발명의 조합은 임의의 용해성 글루칸 출발물질에서 겔 형태의 조성물을 포함하는 효과적인 글루칸을 제조하기 위하여 적용될 수 있다. 확인된 상승효과는, 주어진 글루칸 농도에 대하여, 겔 조성물은 뛰어난 활성을 보인다는 것이다. 용해성 글루칸 생성물은 기술자들에게 잘 알려져 있고 일부는 상업적으로 입수될 수 있다. 글루칸은 전형적으로 효모에서, 바람직하기로는 사카로미케스 세레비시에 ( Saccharomyces cerevisiae )에서 유래된다. 이들 글루칸의 기본 분자구조는, 전형적으로 β-1,3 곁사슬들 (β-1,3 결합들에 의해 연결되는 최소한 두 개의 글루코스 분자들의 사슬을 의미) 및 곁사슬들을 골격에 연결시키는β-1,3,6-결합점을 가지는 β-1,3-골격 (β-1,3 결합들에 의해 연결되는 글루코스 분자들의 사슬을 의미)이다. 또한, 효모 유래 글루칸은 곁사슬들에 연결되거나 골격에 직접 결합될 수 있는 β-1,6 결합들을 포함한다. 또 다른 유형의 결합들이 존재하지만 비교적 낮은 수준이다. 글루칸 공급원이 되는 다른 효모들로는 맥주 효모, 칸디다 속의 일종 ( Candida sp.) 예를 들면 칸디다 알비칸스 ( Candida albicans ), 칸디다 클로아케 ( Candida cloacae ), 칸디다 크로피칼리스 ( Candida tropicalis ), 칸디다 우틸리스( Candida utilis ,), 한세눌라 속의 일종( Hansenula sp.) 예를 들면 한세눌라 윈게이 (Hansenula wingei ), 한세눌라 아르니 ( Hansenula arni ), 한세눌라 헨리키이 ( Hansenula henricii) 및 한세눌라 아메리카나 ( Hansenula americana ), 히스토플라마 속의 일종 (Histoplasma sp.), 클로에케라 속의 일종 ( Kloeckera sp.), 클루이베로미케스 속의 일종 (Kluyveromyces sp.) 예를 들면 클루이베로미케스 락티스 ( Kluyveromyces lactis ), 클루이베로미케스 프라길리스 ( Kluyveromyces fragilis ), 클루이베로미케스 폴리스포루스( Kluyveromyces polysporus ), 피키아 속의 일종( Pichia sp.), 로도토룰라 속의 일종( Rhodotorula sp.), 사카로미케스 속의 일종( Saccharomyces sp.) 예를 들면 사카로미케스 델브루에키이 ( Saccharomyces delbruekii ), 사카로미케스 로세이( Saccharomyces rosei), 사카로미케스 미크로엘립소데스 ( Saccharomyces microellipsodes ), 사카로미케스 카를스벨겐시스( Saccharomyces carlsbergensis ) 또는 다른 사카로미케스 균주 (Saccharomyces strains ) 예를 들면 사카로미케스 세레비시에 R4 ( Saccharomyces cerevisiae R4) (NRRL Y-15903) 및 R4 Ad (ATCC No. 74181), 쉬조필룸 속의 일종 (Schizophyllum sp.), 쉬조사카로미케스 속의 일종( Schizosaccharomyces sp.) 예를 들면 쉬조사카로미케스 폼베 ( Schizosaccharomyces pombe), 토룰라 속의 일종( Torula sp.) 및 토룰롭시스 속의 일종 (Torulopsis sp.)이 포함된다.
그러나, 글루칸은, 세균, 진균 또는 곡물 글루칸과 같은 기타 적합한 공급원에서 유래될 수 있다. 베타-글루칸의 자체 겔 형성 능력 부족은 상기된 바와 같이 CMC와 같은 조제의 겔 형성 능력으로 보충되어, 바람직한 상처 치료 특성을 가지는 생성물이 제공된다. 다양한 글루칸의 치료적 활성은 본 분야에서 문서화되고, 본 발명의 조성물은 포괄적으로, 특히 본 발명자들에 의한 글루칸 생성물의 물리적 형태 및 분자간 구조가 특히 중요하다고 보여지는 상처 치료에서 글루칸 활성을 증가시키기 위하여 사용된다. 이론에 구속되지 않고, 경험칙에 의하면 본 발명에 조성물에 사용되는 글루칸 단일사슬 기준으로 중량평균분자량이 높을수록, 글루칸 겔의 효능이 높아진다는 것이다.
본 발명의 겔 형성 글루칸의 곁사슬들은 통상 2 이상의 β(1,3) 결합된 글루코실 단위들을 포함한다. 본 발명에 의하면, 주사슬에 연결되는 단일분자들은 "곁사슬들"로 고려되지 않는다.
겔 형성 글루칸은 바람직하기로는, 즉 β(1,3) 결합된 글루코실 단위들로 이루어지거나 실질적으로 이루어진 곁사슬들을 가진다 (즉, 최소한 2, 5, 10 또는 20 결합된 글루코실 잔기들의 곁사슬들). β(1, 3) 결합된 곁사슬들 외에도, 글루칸은 하나 이상의 β(1,6) 결합된 곁사슬들을 가질 수 있다. 구조의 사슬들을 변경시킴으로써 최종 생성물의 특성을 변경시킬 수 있다. 효소-처리, 포름산 또는 염산과 같은 산들 또는 다른 염기들뿐 아니라 기타 수단들의 사용을 포함하여 많은 방법들로 글루칸을 변경시킬 수 있다. 바람직한 글루칸은 산 (예를 들면 포름산) 또는 효소 또는 글루칸 내에서 반복적 (1,6)-결합 글루코스 분자들의 개수를 줄이거나 제거하는 기타 적당한 방법으로 처리된 것들이다. 이들 (1,6)-결합 글루코실 잔기들은 통상 효모 유래 베타-글루칸의 곁사슬들에서 발견된다. 생성된 글루칸은 β(1,3) 주사슬들 및 제거 처리에 의해 끊어지지 않는 단일 β(1,6) 결합으로 이에 연결되는 β(1,3) 곁사슬들을 가진다.
바람직한 글루칸은 반복적 β(1,6) 결합된 글루코실 잔기들이 실질적으로 존재하지 않는다. 분지점들 (β(1,3,6)-분지점들)에서 단일 (1,6) 결합들은 '반복적' β(1,6) 결합된 글루코실 단위들을 제공하지 않는다. '실질적으로 존재하지 않는'이란 전체 글루코실 단위들 중 6% 미만, 바람직하기로는 4% 미만 및 가장 바람직하기로는 3% 미만이라는 의미이다.
효소 처리와 같은 일부 처리에 따라 4개까지의 베타-1,6-결합된, 그러나 전형적으로 2개의 베타 1,6 결합된 글루코실 단위들이 곁사슬들에서 끊어지지 않고 남겨진다. 이러한 분자들도 반복적 베타 1,6-결합 글루코실 단위들이 '실질적으로 존재하지 않는' 것이다.
바람직한 글루칸 내에서 결합들 분포는 다음과 같이 나타난다:
Figure pct00001
β(1,3,6)은 골격에 (1,3) 결합되고 (1,6) 연결로 곁사슬을 제공하는 분지점 잔기들을 의미한다.
글루칸은 단일, 추출된 분획물 또는 다른 평균분자량들을 가지는 2 이상의 다른 분획물의 형태일 수 있다.
글루칸은 화학적 변형기들 관점에서 유도화되지 않는다.
글루칸 분자량은 여러 방법으로 결정될 수 있다. 용해성 글루칸 생성물의 경우 SEC-MALS-RI (다중-각 광산란 및 굴절률 검출 기능을 가지는 사이즈 배제 크로마토그래피) 분석으로 분자량을 간편하게 측정하고, 이러한 분석은 시료들에 대한 중량평균분자량 값 (MW) 뿐 아니라 시료내 상이한 분자량들의 분포를 제공한다. 본 발명에서, 중량평균분자량 (M w )은 다음과 같이 정의된다:
여기에서 n i 는 분자량 M i 을 가지는 분자들의 개수이다. 분자량 M i 을 가지는 분자들의 중량농도 c i 는 분자량 M i 및 분자들 개수 n i 에 비례한다.
Figure pct00003
크로마토그램의 각각 분획물에 대한 중량농도는 RI-검출기로 결정되고, 크로마토그램에서 각각의 분획물에 대한 분자량은 RI-검출기와 조합된 MALS-검출기로 측정된다. 계산들은 광산란 이론에 기초한다.
특히, (단일 사슬들에 대한) 평균분자량은 0.5% LiCl의 DMAc (0.5% 염화리튬의 디메틸아세트아미드)에서 본 용매에서 글루칸에 대한 dn/dc는 0.12라고 가정하고 SEC-MALS-RI로 측정된다. DMAc/LiCl 용매는 상기 글루칸을 단일사슬들로 충분히 용해시키고, 계속하여 용리액으로서 0.5% LiCl의 DMAc 로 SEC-MALS-RI 분석하면 단일사슬 수준의 분자량분포를 측정할 수 있다. 간단하게, DMAc/LiCl 중에서 글루칸 분석은 건조 글루칸을 대략 3 mg/ml 농도로 용매에 용해시키고 실온에서 밤샘 교반하고 1 시간 정도 100℃ 가열한 후 3 x PlgelPLgel Mixed-A LS 컬럼 및 용리액으로서 0.5% LiCl의 DMAc 을 이용하여 SEC-MALS-RI 분석한다. 글루칸의 중량평균분자량은 단일사슬 기준으로 바람직하기로는 15,000 내지 50,000 g/mol, 더욱 바람직하기로는 25,000 내지 45,000 g/mol, 가장 바람직하기로는 30,000 내지 40,000 g/mol이다.
수용액에서 존재하는 주요 고차 글루칸 구조체 및 응집체의 중량평균분자량은 바람직하기로는 4-20 x 105 g/mol, 더욱 바람직하기로는 5-15 x 105 g/mol, 및 가장 바람직하기로는 6-12 x 105 g/mol이다. 이들 평균은 바람직하게는 매우 큰 응집체, 즉 1.0　x　107　g/mol 이상의 분자량을 제외하고 계산된 것이다. 수용액 중의 글루칸 분석은 0.1 M NaNO3/0.02 % NaN3 에 대략 3 mg/ml로 겔 용액을 희석시키고, 30분 동안 밀봉 유리관에서 100 ℃로 가열시키고, 실온 냉각시킨 후, 0.2 um 실린지 필터로 여과시키고, TSKgel G5000 PWXL + TSKgel G4000 PWXL 컬럼 및 용리액으로서 0.1 M NaNO3/0.02 % NaN3을 사용하여 SEC-MALS-RI 분석으로 이루어진다. 유사한 설정들 예를 들면 용매/ 용리액으로서 0.05 M Na2SO4/ 0.01 M EDTA로도 동등한 결과들을 얻는다. 단일사슬들 및 수용액 중 고차 구조들/ 응집체에 대한 분자량 값들의 조합으로 전체로서 본 발명 제제에서 사용되는 바람직한 글루칸의 분자적 및 초분자적 구조는 양호하게 표시된다.
상기 글루칸은 본 발명에 의한 글루칸의 예시들이다. 이들 글루칸 생성물은 pH 4 내지 8의 25℃에서 겔 형태로 더욱 특정된다. 이들 글루칸 겔은 30℃ 이상 내지 80℃까지의, 바람직하게는 정상 신체 온도 이상의 겔 융점 (겔에서 졸)으로 예시되는 점도 프로필에 의해 더욱 특정된다.
글루칸 생성물의 겔 융점, 즉 겔 → 졸 전이온도는 Stresstech HR 또는 유사한 유량계를 이용한 소형 변형율 진동 측정계 및 글루칸 용액 냉각 (70 → 10 ℃) 및 가열 (10 → 70 ℃) 과정에서 점탄성 변화를 검사하여 간편하게 결정된다. 겔의 대략적인 융점 결정을 위한 다른 방법은 점도가 실질적으로 사라지고 (gone) 겔이 용액으로 전환될 때까지 온도를 순차적으로 상승시키면서 겔 점도 (예를 들면 회전식 점도계 사용)를 측정하는 것이다.
본 발명의 바람직한 글루칸은 생쥐 복막 대식세포에서 TNFα 및 CXCL2/MIP2α 발현을 촉발시킨다. 말초혈액 단핵구 유래 인간 골수 수지상 세포에서 약한 TNFα 유도를 보인다.
TNFα 방출에 대한 바람직한 베타 글루칸 효과는 용량-의존적이고 베타 글루칸 수용체 덱틴-1 과발현 RAW 세포주 변이체에서 소정의 역치 예를 들면 2-4 ug/ml 이상의 글루칸 농도에서는 감소하는 것으로 보인다. 적당한 내지 낮은 TNFα 및 CXCL-2 유도는 본 발명의 생성물에서 특이적인 것이다. TNFα 및 CXCL-2는 모두 상처 치료에 있어서 중요하다. 생쥐 케모카인 CXCL2은 세포이동 및 혈관형성을 자극하고, 염증성 육아조직에서 혈관형성 활성에 대한 대용지표로 활용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 글루칸은 IP-10 (CXCL-10)을 강하게 발현시키지 않는다. IP-10은 화학주성 시토카인인 알파 또는 시스테인-X 아미노산-시스테인 (CXC) 케모카인 계열의 멤버이다. 건선, 통상적인 피부 염증질환을 포함한 사람의 많은 만성적 염증성 병태들에서 고도의 IP-10 발현이 발견된다. 환자들은 일반적으로, 혈관 형성 손상과 함께 더욱 심한 염증기 및 장기적이고 지리멸렬한 육아기로 특정되는 상처치료 이상 반응을 보인다. 본 발명의 글루칸은 인간 수지상 세포로부터 LPS-유도 IP10 발현을 증가시키지 않고, 바람직하기로는 db/db 생쥐로부터 배양된 대식세포로부터 LPS 유도 IP-10 발현을 억제한다. 이러한 결과는, 본 발명에 의한 바람직한 글루칸은 상처 치료 과정의 유익한 요소들을 촉진시키지만, 장기적 치료기에 이르도록 하는 저해제들을 억제하는 것을 보이는 것이다.
또한, 본 발명인 겔 글루칸은 바람직하게 보체를 활성시킨다.
본 발명인 글루칸 조성물은 상처치료제로서, 실시예들에서 보이는 바와 같이, 우수한 생체내 효능을 가진다.
본 발명의 조성물에 사용되는 글루칸은 더욱 보강된 유형, 특히 인간 골수 수지상 세포를 염증 표현형으로 분화 유도하여, 수지상 세포에 의한 TNF-알파 분비를 크게 자극하고 G-CSF 및 IL-10 발현을 유도 능력을 가지는 용해성 베타 글루칸이다. 모든 경우에서, CXCL-10 분비는 기본적으로 기본 수준이고, 본원에 기재된 처리 즉 겔화제와의 조합에 따라 영향을 받지 않아야 한다. 이것은 바람직한 글루칸은 특정 세트 또는 조합의 시토카인의 분비를 자극한다는 것이 중요하고 이러한 사실을 보인다. 또한 바람직한 글루칸은 당뇨병 생쥐 (db/db)의 대식세포를 자극하여 PGE2 및 GM-CSF를 분비시킨다.
본 발명에 의한 실시예들에서 사용되는 글루칸 겔은 수용성 겔이고 겔 형태는 육안관찰로 확인될 수 있고, 또한 글루칸 겔의 비-뉴턴 점도 프로필 및 유사가소성 및 요변성은 예를 들면 회전식 점도계를 사용하여 점도를 측정하여 결정할 수 있다. 실시예들에서 적용되는 2% 글루칸 겔의 점도는 소형 시료 어댑터 및 스핀들 SC4-31 (전단속도 3,40 sec-1)이 구비된 Brookfield DV-II+ Pro Programmable 점도계를 사용하여 25 ℃ 및 회전속도10 rpm에서 측정할 때, 최소한 1000 cP, 바람직하기로는 최소한 1500 cP이다. 이러한 유사가소성 및 요변성 겔의 점도를 측정하는 편리한 방법은 소위-하향 속도기울기 (up-down rate ramp)를 이용하는 것이고, 예를 들면 2 rpm에서 개시하여 2 rpm 증가분으로 10 rpm까지 상승시킨 후 다시 2 rpm씩 내리는 것이다. 이러한 실험 데이터는 겔의 유사가소성 (전단속도 증가에 따른 점도 감소) 및 요변성 (전단력이 적용되는 동안 점도 감소)을 보일뿐 아니라 예를 들면 10 rpm 점도 측정치를 제공한다.
본 발명의 조성물에 사용되는 상기 유리한 특성을 가지는 글루칸은 하기되고, 실시예들에서 상세히 기술되는 두 가지 방법 중 하나로 제조될 수 있다. 각각의 경우에 글루칸 분자들 용액을 취하여 가열 (또는 기타 에너지원)하거나 존재하는 분자-간 수소결합을 분해하는 화학제로 처리한다. 그리고 그 생성물을 신속하게 냉각시켜 젤을 형성시키거나 글루칸 사슬간 수소결합 재형성을 촉진시키는 조제를 첨가한다. 하기된 바와 같이, 사슬-간 (및 잠재적으로 사슬-내) 수소결합을 끊는 처리단계 전에 겔화제가 첨가될 수 있다. 달리 겔화제는 본 단계 후에 첨가될 수 있지만 처리 단계 전에 첨가되면 수소결합 형성 및 이에 따라 겔이 형성된다.
따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 겔 조성물 제조방법을 제공하며:
a) 글루칸의 수소결합들을 분해하기 위하여, 선택적으로 겔화제와 함께, 글루칸 분자들 수용액을 처리하는 단계;
b) 선택적으로 겔화제를 단계 a) 생성물에 첨가하는 단계; 및
c) 글루칸 내 수소결합들을 재형성시키기 위하여 수용액을 처리하는 단계로 구성된다. 특히, 수소결합들은 글루칸 사슬들/분자들 간에 형성되고, 단계 a) 이후 상당량의 수소결합들이 감소된 후 단계 c)에서 증가되므로 이들 결합이 "재형성"되는 것이다. 출발물질 내의 수소결합 패턴이 다시 형성된다는 의미로 "재형성"되는 것이 아니라, 본 공정으로 다른 패턴이 형성된다.
상기 조성물의 바람직한 제조방법에 의하면, 글루칸 분자들 수용액은 120-130 ℃, 바람직하게는 120-125 ℃로 가열되고, 그 온도에서 10-30분 유지된 후, 글루칸 용액은 35-50 ℃, 바람직하게는 35-40 ℃로, 80 분 이내, 바람직하게는 60 분 이내, 예를 들면 50-60 분에 걸쳐 냉각된다. 더욱 소량 (예를 들면 100 리터 미만)인 경우 더 짧은 냉각 (예를 들면 25-50 분)이 적합하며, 상기 수치들은 출발생성물의 부피가 220 리터인 경우이다. 상기 냉각시간은 신속하게 진행되는 것이고, 실온으로 자연 냉각되는 것을 의미하지 않는다. 이러한 작업을 통하여 "열처리 (annealed)" 베타-글루칸 사슬들의 전형적인 3중 나선구조를 가지지 않는 고도의 무작위적 구조의 "건초더미" 겔을 제조할 수 있다. 이러한 가열 및 냉각 단계에 따라, 용해성 베타-글루칸 제제에 에너지가 제공되고 실질적으로 글루칸 겔을 용해시키고, 따라서 기존의 고차 구조를 분열시키며 대량의 자유 단일사슬 분자들을 가지는 무작위 구조를 유도한다.
신속냉각에 의해, 분자들은 분자간 상호작용을 신속하게 확립함으로써 3중 나선구조를 주로 형성시키지 않는 새로운 분자 구조로 "고정"된다. 분자들은 이렇게 더욱 무작위 분자 위치로 고정된다.
가열 단계는 바람직하기로는 생성물 전체 회분 (batch)을 유지하기에 충분한 크기이며 탱크 외부를 가열할 수 있는 자켓 또는 유사한 구조를 가지는 별도 및 교반 탱크에서 수행된다. 회분 용량, 가열시스템 성능, 탱크 부피 대비 면적비율 및 교반기 효율은 전체 회분이 합리적인 시간 동안 특정 온도로 가열될 수 있고 전체 회분이 균일하게 가열되도록 수지를 맞추어야 한다. 달리 에너지 제공 단계는 최종 용기에 생성물을 충전시킨 후 오토클레이브 내에서 가열하거나 대안적 에너지화 형태, 예를 들면 초음파 또는 마이크로파에 의해 구현될 수 있다.
에너지 제공 단계가 탱크 내의 전체 회분에 대하여 수행되면, 능동적 (active) 냉각은 바람직하기로는 동일 탱크에 대하여 수행되고, 탱크 표면을 냉각시킬 수 있는 탱크자켓을 사용할 필요가 있다. 재차 회분 용량, 가열시스템 성능, 탱크 부피 대비 면적 비율 및 교반기 효율은 전체 회분이 합리적인 시간 동안 특정 온도로 냉각될 수 있고 전체 회분이 균일하게 냉각되도록 수지를 맞추어야 한다. 이러한 초기 냉각은 최종 용기들에 생성물을 채운 후 이루어지고, 연속하여 실온까지 용기들을 냉각시켜야 한다. 바람직하기로는 냉각 단계는 가열 단계 직후, 즉 (장치를 이용할 수 있는 한) 글루칸이 상승온도에서 10-30 분간 유지된 직후 수행된다.
산업적 공정에서 가열 및 냉각 단계 수행에 적합한 절차는 실시예 1에 기재된다.
에너지화 단계를 최종 용기들에서 수행하면, 이러한 용기들을 상기 설정 시간 내에서 실온으로 냉각한다.
상기 가열 및 냉각 단계는, 예를 들면 1회 이상 반복될 수 있다.
가열 및 신속 냉각 단계 전 수용액 중 글루칸 농도는 바람직하기로는 1.5-6%이다.
상기 가열 및 냉각 단계는 임의의 글루칸 분자들 수용액에 구현될 수 있다; 변형 분지를 가지는 글루칸을 포함한 바람직한 글루칸이 상술되었고, 글루칸 용액은 바람직하기로는 효모 글루칸 용액이다. 가열 및 냉각 단계에서 출발물질은 겔 형태일 수 있고, 따라서 갸열을 통하여 졸로 전환되고 냉각을 통하여 출발물질 구조와는 다른 졸 구조가 형성된다. 출발 용액에서 글루칸의 중량평균분자량 (Mw)은 바람직하기로는 높고, 바람직하기로는, 단일사슬 기준으로, 용액 중 글루칸의 중량평균분자량은 15,000 이상, 더욱 바람직하기로는 20,000 이상, 가장 바람직하기로는 25,000　g/mol 이상이다. 이러한 중량치를 구하는 적합한 방법들은 상술되었다.
일반적으로 글루칸은 공급재료 (예를 들면 진균, 효모 또는 곡물)에서 입자성 형태로 추출되지만 입자성 글루칸으로부터 용해성 형태를 제조하는 방법은 본 분야에 공지되어 있고 WO　95/30022에 기재된 포름산분해 (formolysis) 단계와 같은 산 또는 알칼리 처리를 포함한다. 보리와 같은 곡물에서 얻은 용해성 글루칸 생성물은 Sigma Chemical에서 입수된다. 예를 들면 WO　95/30022의 실시예 1에 따라 제조되는 입자성 출발 물질은 바람직하기로는 최소한 2시간 동안 포름산에서 가열하여 용해된다. 입자성 글루칸 출발 물질에 수행되는 포름산분해는 간단히 임의의 β(1,6) 결합된 글루코실 곁사슬들을 선택적으로 제거할뿐 아니라 입자성 글루칸을 용해화시킨다.
또한 상기 제조방법은 상기된 가열 및 신속 냉각 단계 전에 포름산 처리된 생성물을 최소한 30 분 동안 끓이는 (>100℃) 예비 가열 단계를 포함한다. 생성물을 냉각시킨 후 본 분야에서 알려진 일반적인 방법 예를 들면 원심분리 또는 여과에 의해 입자성 물질들을 제거하도록 처리하는 것이 바람직하다.
발명에 따른 추가 공정을 위하여 용해성 형태를 수득하도록 처리되는 입자성 글루칸은 바람직하기로는 세포벽, 특히 단백질 성분들 및 기타 잔유물 예를 들면 세척하면 제거되는 만난 및 키틴을 포함하는 효모 세포벽에서 유래한다.
예시적으로 적합한 입자성 효모 글루칸 생성물은 Biotec Pharmacon ASA에서 생산되며, 이는 빵 효모 (사카로미케스 세레비시에)에서 유래하고 NBG Cos®로 알려져 있다. 다른 예시적 입자성 글루칸 원재료들은 제품 표기 (Imprime) WGP™와 같은 완전 (whole) 글루칸 입자들이다. NBG Cos®는 천연적인 미유도화된 (화학적 변형기들 관점에서) 입자성 β(1,3)/(1,6) 글루칸이고, NMR 및 화학 분석에 의해 베타-1,3 및 베타-1,6-결합 D-글루코스의 곁사슬들을 가지는 베타-1,3-결합 D-글루코스 고분자로 이루어진 것으로 특정된다.
상기 프로토콜의 대안으로, 글루칸 분자들의 동일 출발용액은 글루칸 사슬들 간의 수소결합을 분해할 수 있는 조제로 처리하고 이어 사슬 간 수소결합 상호작용을 회복시킬 수 있는 조제로 처리될 수 있다.
폴리-글루칸 사슬에 있는 OH-기들 간 수소결합을 분해하는 이러한 조제 중 하나는, 사슬에 있는 다수의 OH-기들을 탈양성자화 하기에 충분한 농도의 수산화나트륨 (NaOH)이다. 이에 따라 고분자량인 글루칸에서 전형적인 모든 분자간 결합들이 완전히 분해되어 용액 중 사슬들의 무작위적 구조가 형성된다. 알칼리를 중화시키는 산을 첨가하여 용액을 중화시키면, OH-기들이 재형성되고 사슬들 간 새로운 수소결합들이 확립된다.
조제로서 NaOH는 전형적으로 최종 농도가 50 mM 이상, 또는 더욱 바람직하게는 약 150 mM이 되도록 예를 들면 2M NaOH 용액을 용해성 글루칸 농도 1-6%, 더욱 바람직하게는 1,5-4% 또는 가장 바람직하게는 2-4%의 수용액에 첨가하는 것이다. 용액을 중화시키기 위하여 등몰량, 예를 들면 2M 염산 (HCl)이 충분한 중화가 보장되는 시간 동안, 예를 들면 1000 ml의 경우 1분 이내로 교반하면서 첨가되고, 이후 겔-구성이 확립되도록 예를 들면 1000 ml의 경우 1-10분 용액 방치한다. 임의의 다른 수소결합 분해 가능성 조제들이 NaOH를 대체할 수 있고, "건초더미" 유형의 겔을 형성시킬 수 있는 임의의 다른 신속한 수소결합 재-형성 조제들이 HCl을 대체할 수 있다. 기술자들은 수소결합들을 파괴하고 다시 회복시키는 기타 조제들을 선별할 수 있고, 수소결합을 분해하는 조제의 영향을 중화시키기 위하여 염기 및 산은 서로 수지를 맞추기에 특히 편리하다. 기타 강산들 예를 들면 포름산 또는 황산이 적용될 수 있다. 또한 제한되지는 않지만, 수산화칼륨, 수산화리튬, 및 수산화칼슘을 포함한 기타 알칼리염뿐 아니라 소위 초염기 예를 들면 수소화나트륨 또는 나트륨아미드 역시, 탈양성자화 및 수소결합들 분해를 위한 잠재적 조제일 수 있다. 적당한 품질의 임의의 산이 수소결합들을 회복시키고 용액을 중화시키기 위하여 적용될 수 있고- 제한적이지 않지만, 인산, 아세트산, 및 시트르산을 포함한다. 또한 요소 또는 포름아미드 역시 수소결합들 붕괴에 일반적으로 사용되고 본 공정에서 잠재적으로 적용될 수 있다. 회복조제 성질은 하류 적용에서 설정되는 요건들, 및 특히 염의 존재에 의해 지정될 수 있다.
대형의 복잡한 유기분자들이 관여되는 시스템에서, 모든 수소결합들이 분해되고 수소결합 회복 조건이 적용된 후 모든 분자 사슬들이 상당한 수소결합에 참가하는 것을 보장하는 것은 불가능하고 필요하지 않다는 것을 이해할 것이다.
그러나, 적용되는 조건들은 글루칸 용액 전체에서 수소결합의 구조 및 정도를 급속히 (radically) 변경시킬 수 있어야 한다. 기술자들은 예를 들면, 150　mM NaOH의 글루칸 용액에 대한 영향을 이해할 수 있고 이에 따라 기타 수소결합 분해제 농도를 선택할 수 있다. 수소결합들 재확립이 가능하도록 제공되는 조건들이 적용되는 제2 단계의 목적은, 수소결합 분해제 첨가로 유발된 분자간 정전기적 상호작용 효과를 효율적으로 신속하게 중화시키고 가역시키는 것이다. 따라서 제2 조제의 특성 및 농도는 수소결합 분해제의 선택에 따른다.
산업적 공정에서 이들 단계는 생성물 전체를 유지하기에 충분한 대형 탱크에서 간편하게 구현된다.
상기된 바와 같은 수소결합 분해 및 회복 단계들은, 예를 들면 1회 이상 반복될 수 있다.
조성물은 바람직하게는 0.1-6% 글루칸 수용액으로 구성되고, 바람직하게는 조성물은 0.2-2% 글루칸 수용액으로 구성된다. 목적 및 투여 방법에 따라 상이한 농도가 적용된다. 겔화제 또는 증점제 또는 이러한 조제들의 적합한 조합물은 조성물 중량비로 전형적으로 0.2-3%, 바람직하게는 0.25-2%, 더욱 바람직하게는 0.75-1.75%, 가장 바람직하게는 1-1.5% 존재한다.
겔 형성 및 점도 증가에 조력하는 기타 겔형성제 예를 들면, 제한적이지는 않지만, 아카시아, 한천, 아크릴산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산 및 이의 유도체 예를 들면 폴리부틸메타크릴레이트 및 폴리부틸메타크릴산, 폴리메타크릴레이트, 아스코빌팔리테이트, 카보머, 카나우바 왁스, 젤란겔, 알긴산 및 상응 염, 셀룰로스 유도체 예를 들면 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 로스카 멜로스 나트륨 (rosca mellose sodium), 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 관련 화합물들, 카르복시메틸셀룰로스 및 이의 염, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 히드로멜로스 프탈레이트, 세틸알코올 및 유도체, 미결정성 왁스, 폴록사머, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리우레탄, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐알코올, 실리콘 고무 및 유도체, 셸락, 트리글리세리드 유도체, 및 이들의 조합물들이 사용될 수 있다.
조성물은 보수제 또는 연화제 예를 들면, 제한적이지는 않지만, 글리세린, 프로필렌글리콜, 트라아세틴, 시클로메티콘, 폴리덱스트로스, 및 이들의 조합물을 가질 수 있다.
본 발명에 의한 겔 조성물의 예시로는 최종 농도가 1 또는 1.5%인 고분자량의 카르복시메틸 셀룰로스와 혼합된 1 또는 2% 용해성 글루칸일 수 있다.　 겔 조제는 1 또는 2% 글루칸 수용액에 적당량의 CMC를 첨가하여 구현될 수 있다. CMC가 완전히 용해된 후, 제제를 약 100℃ 이상으로 가열시키고 급속 냉각하여 적합한 특성을 가지는 겔을 형성한다.
겔 제제의 또 다른 예시로는 최종농도가 0.3%인 젤란겔과 혼합된 2% 글루칸이고, 여기에서 글루칸 용액을 약 100 ℃ 이상으로 가열시키고 적당량의 젤란검 건조분말이 투입된다. 분말이 용해되면 약 50 ℃까지 냉각시키고 겔 형성을 유도하기 위하여 최종농도가 약 5 mM가 되도록 CaCl2를 첨가시킨다. 이후 용액을 신속히 냉각시켜 형성된 겔을 안정화시킨다.
겔 제제의 제3 예시로는 최종농도가 0.5%인 젤란겔과 혼합된 0.5% 글루칸이고, 여기에서 글루칸 용액을 약 100 ℃ 이상으로 가열시키고 적당량의 젤란검 건조분말이 투입된다. 분말이 용해되면 약 50 ℃까지 냉각시키고 겔 형성을 유도하기 위하여 최종농도가 약 5 mM가 되도록 CaCl2를 첨가시킨다. 이후 용액을 신속히 냉각시켜 형성된 겔을 안정화시킨다.
겔 조성물의 제4예시로는 최종농도가 각각 1% 및 20%인 고분자량인 카르복시메틸셀룰로스 및 글리세롤과 혼합된 1% 글루칸이다.　본 겔 제제는 1% 글루칸 수용액에 적당량의 CMC를 첨가하면 구현될 수 있다. CMC가 완전히 용해된 후, 제제를 약 100℃ 이상으로 가열시키고 글리세롤을 첨가한다. 이후 제제를 급속 냉각하여 적합한 특성을 가지는 겔을 형성한다.
본 발명의 글루칸 조성물은 잠재적 치료제이고 또 다른 양태에서 본 발명은 특히 개체의 전신적 또는 국부적 면역반응 증가가 요구되는 병태들, 예를 들면 조직 손상 또는 감염이 있는 경우 치료 용도를 위하여 본원에 기재된 글루칸 조성물을 제공하는 것이다. 조성물은 특히 상처 또는 궤양 치료 및 구내점막염 치료를 조력하는데 유용하다. 또한 암 치료 또는 종양 크기 감소화에 유용하다.
또 다른 양태에서 본 발명은 따라서 개체의 상처 또는 궤양 치료 또는 구내점막염 또는 암 치료 또는 종양 크기 감소화에 조력하는 방법을 제공하고, 상기 개체에 본원에 기재된 본 발명의 글루칸 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
바람직하게는 글루칸은 경구 투여되고, 바람직하게는 200mg/kg/일, 더욱 바람직하게는 20 내지 100 mg/kg/일 용량으로 글루칸이 투여된다.
일부 상처들 또는 궤양들은 자연 치유되고 다른 것들은 그렇지 않고 본 발명의 글루칸 조성물이 상처 및 궤양 치료를 촉진시키는 것으로 보이므로 상처 또는 궤양 치료에 "조력"하는 것으로 언급된다. 어떤 경우에는, 처리하지 않고 만족스러운 치료가 진행되지 않는다. 치료 처리가 필요한 이러한 상처의 예시로는 당뇨병성 족부궤양 이다. 본 증상에서는 당뇨병이라는 근본 원인으로 환자들은 상처들이 생긴다. 때로 치료되지 않는 근본 원인 및 환자 족부에 상처들이 생긴다는 사실로 인하여, 이러한 궤양들은 자연 치유되지 않고 통상 족부 절단에 이르는 심각한 문제를 환자들에게 일으킨다.
적당한 약학적 조성물은 본원에 기재된 글루칸 및 겔화제 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체, 바람직하기로는 물 및 선택적으로 하나 이상의 생리적으로 허용되는 안정제 또는 추가 희석제 또는 담체로 구성된다. 본 조성물은 임의의 국소 투여 형태로 편리하게 제형될 수 있다. 국소 투여 형태는 크림, 로션, 용액, 겔, 연고, 페이스트, 스프레이, 필름, 기타 등이다. 바람직하게는 본 발명인 겔 조성물은 튜브 예를 들면 플라스틱 튜브에 저장되고 분배될 수 있다.
일부 변형예들에서, 본원에 기술된 조성물 연고 형태이다. 연고기제는 유지성 기제, 유화성 기제, 에멀션 기제, 또는 수용성 기제일 수 있다. 다른 변형예들에서, 본 발명에 의한 조성물은 크림 형태이다. 크림은 유-중-수 또는 수-중-유의 점성 액체 또는 반고상 에멀션일 수 있다. 크림 기제는 수-세척성일 수 있고, 오일상, 유화제 및 수상을 가질 수 있다. 또 다른 변형예들에서, 본 발명에 의한 조성물은 로션 형태이다. 로션은 고체 현탁액으로 조제되고 양호한 분산을 위하여 현탁조제를 함유한다. 본 발명에 의한 조성물은 또한 페이스트로 조제된다. 페이스트는 반고상 투여 형태이고 활성제는 적합한 기제에 현탁되어 있다. 기제 특성에 따라, 페이스트는 지방성 페이스트 또는 단일-상의 수상 겔로 제조된 페이스트로 구분된다.
일부 변형예들에서, 조성물 형태는 상처 표면에서의 필름일 수 있다. 필름 형성을 위하여, 필름 형성제 예를 들면, 제한적이지는 않지만, 아크릴산 및 이의 유도체, 폴리아크릴산 및 이의 유도체 예를 들면 폴리부틸메타크릴레이트 및 폴리메타크릴산, 폴리메타크릴레이트, 아스코빌 팔미테이트, 카보머, 카나우바 왁스, 셀룰로스 유도체 예를 들면 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트, 로스카 멜로스 소듐 (rosca mellose sodium), 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 관련 화합물들, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 프탈레이트, 히드로멜로스 프탈레이트, 세틸알코올 및 유도체, 미결정성 왁스, 폴록사머, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리우레탄, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐 아세테이트 프탈레이트, 폴리비닐알코올, 실리콘 고무 및 유도체, 셸락, 트리글리세리드 유도체, 및 이들의 조합물들이 사용될 수 있다.
또한 조성물은 필름 형성제에 의해 형성된 고분자 필름을 연화시켜 균열 또는 박리되지 않고 신체 면적에서 이동될 수 있도록 충분히 유연하도록 최소한 하나의 필름 가소제를 포함할 수 있다.
일부 변형예들에서, 조성물을 상처에 적용하기 전에 필름으로 주조하거나 상처에 직접 도포하며 여기에서 동시에 중합된다. "도포식 (spread-on)" 필름은 피부에 적용될 때 중합되고 튜브에서 크림 또는 연고로서, 롤-온식, 스프레이, 및 기타 등으로 전달될 수 있다. 외부 상에 실리콘 고무를 결부시켜 필름이 제조될 수 있다. 내부 상과 혼합되면, 생성 에멀션은 경화되고 "도포식" 필름을 제공하며, 상처에 적용될 때 중합된다. 에멀션은 기재에 도포되어 원하는 두께를 달성할 수 있다.
다른 실시예들에서, 조성물은 레이어 (layer) 또는 패치로 구현될 수 있다. 패치는 두께가 다양할 수 있다. 또한 패치는 일반적으로 상처 모서리에 맞는 형상으로 절단될 수 있다.
일부 변형예들에서, 패치는 상처 또는 피부에 패치를 부착시키는 약학적으로 허용되는 접착제를 포함할 수 있다. 패치 지지층이 포함될 수도 있다.
조성물은 직접 상처에 직접 배치되거나, 상처에 적용되는 기재에 배치된다. 임의의 기재 (운반체)는 본원에 기재된 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 직물, 부직물, 편물, 발포재 및 접착 기재들이 사용될 수 있다. 또한 흡수성 또는 비-흡수성 기재가 사용될 수 있다. 일부 변형예들에서, 조성물은 기재 상에 산포 또는 도포된다. 다른 변형예들에서, 조성물은 기재 내부로 함침된다.
상처 드레싱은 임의의 적합한 시간 주기 동안 적용된다. 예를 들면, 하루, 수일, 수주, 또는 수개월 이상의 주기로 진행될 수 있다. 일반적으로, 상처가 치유될 때까지 반복적으로 상처를 치료한다. 본원에 기재된 드레싱으로 상처를 치료하는 기간은 상처 유형, 상처 부위, 및 적용되는 조성물 형태와 같은 변수에 따라 다르다. 사용되는 조성물 형태에 따라, 조성물은 물로 세척되거나, 상처 부위에서 닦기거나 벗겨질 수 있다.
본원에 기재된 조성물들은 임의의 병인으로 인한 상처들을 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 상처들은 화상, 감염, 허혈, 림프부종, 종양, 신경병, 방사선 손상, 외과적 처치, 정맥부전증, 및 외상으로 인한 상처일 수 있다. 본 발명에 의한 조성물은 특히 상처 또는 궤양 치료 조력에 유용하다.
또한 본 발명은 물리적 지지체 (physical support), 예를 들면 본원에 기재된 본 발명인 조성물을 포화하는 것을 포함한 조성물에 적용되는 의학적 용도의 임의의 의학적 기구 또는 재료를 제공한다.
이러한 조성물 중 글루칸의 중요한 하나의 특성은 겔 치료를 촉진시킬 수 있는 비-중성 pH 조건 또는 양이온들 부재에서도 보수력 및 겔 형성 특성이다. 일부 베타-글루칸은 1% 정도의 낮은 농도, 그러나 더욱 전형적으로는 2-4% 농도 범위에서도 겔을 형성할 수 있다. 본원에 기재된 바람직한 글루칸과 같은 효모 유래 용해성 베타-글루칸은 수용액에서 1-6% 농도 및 pH 3-7로 용해될 때, 양이온 존재와는 무관하게 요변성 및 유사가소성 겔을 형성한다.
용어들 '상처' 및 '궤양'란 외상, 수술 상처, 화상, 개방골절, 다리 궤양, 아프타성 궤양, 당뇨병성 궤양 및 욕창 궤양을 포함한다. 상처들은 부상, 수술 또는 질환으로 인한 것일 수 있지만 이들 모두가 진피 일체성의 손실로 특징되고, 피부는 찢기거나, 끊어지거나 찔린 상태이고 개구부 (opening)를 밀봉시킬 필요가 있다. 본 발명의 조성물은 상처 봉합 (closure)을 촉진시키는 것을 밝혀졌다. 실시예들에서 보이는 바와 같이, 열린 상처 크기를 측정함으로써 용이하게 효능을 입증할 수 있다.
조성물들은 바람직하게는, 예를 들면 겔, 경피성 패치, 로션, 연고, 크림 등으로서 국소적으로 적용된다. 조성물은 매일, 다소 빈번히, 예를 들면 하루 2회 또는 이틀 간격 및 의사 또는 어떤 경우에는 환자 또는 기타 건강관리사 결정에 따른 기간 동안 적용된다. 일반적으로 호전 상태가 육안 검사로 쉽게 결정되고 치료 기간은 상처 또는 궤양의 성질 및 심각도에 따라 다르다.
국소 투여는 구강투여를 포함하고 구내점막 전달용으로 적합한 겔, 함당정제, 페이스트, 스프레이 등은 본 분야에서 공지되어 있다.
조성물은 의약 및 수의약에 유용하다. 본원에서 사용되는, 용어 '의학적'이란 수의학적 적용 및 상황들을 포함하는 것이다. 사람이 바람직한 치료 개체이지만 유익하게 치료될 수 있는 개체로서의 기타 동물들은 가축 및 반려 동물을 포함한다.
본 발명인 조성물은, 상처 또는 궤양 부위에 적용되는 물리적/고상 지지체 예를 들면 패치, 드레싱, 플라스터, 붕대, 필름, 거즈 등에 도포 또는 결합될 수 있고, 이러한 제품은 본 발명의 또 다른 양태를 구성한다.
본 발명의 바람직한 하나의 양태 또는 실시예는, 약간 변형된다면, 모든 양태들 및 실시예들에 적용될 수 있다는 것을 이해할 수 있다.
일반적으로, 식염수 또는 멸균수로 상처를 세척하고 괴사조직 및 경결 피부를 제거한다. 그리고 본 발명에 의한 조성물을 상처에 도포한다. 조성물 형태는 피-도포 상처 면적, 피-치료 상처 유형, 및 상처 부위와 같은 인자들에 따라 다르다. 예를 들면, 겔, 크림 또는 연고 형태의 조성물은 궤양 및 화상에 유용하고, 조성물 용액을 함침시킨 거즈는 수술 또는 외상 상처에 유용하다.
본 발명의 조성물은 키트 형태일 수 있다. 본원에 기재된 키트는 하나 이상의 본 발명인 조성물 및 사용 설명서를 포함할 수 있다. 하나 이상의 기재가 선택적으로 포함될 수 있다. 일부 경우, 조성물을 적용하기 위한 도포구가 제공될 수 있다. 키트에 포함되는 조성물은 동일하거나 상이한 국소 형태일 수 있다. 동일하거나 상이한 함량의 조성물이 적용될 수 있다. 또한 기재는 동일하거나 다른 형태일 수 있다. 또한 기재는 형상 및 두께가 다양할 수 있다.
실시예 1
겔 글루칸 생성물 제조 ( SG )
효모 글루칸 분자들의 1.5 - 2% 수용액을 다음과 같이 제조하였다. 입자성 글루칸 제제를 포름산 분해하여 선택적으로 β-1,6 곁사슬들을 제거하고 연속하여 입자성 물질 및 저분자 성분들 제거를 위하기 위하여 포름산분해액을 정제 및 정용여과하여 본 수용액을 제조하였다. 적합한 포름산분해 단계는 EP 0759089 B1의 실시예 3에 기재된다. 입자성 글루칸 자체는 빵 효모 (S. 세레비시에) 세포벽을 알칼리, 에탄올 및 물로 별도 추출한 후 적절하게 건조하여 (분무건조 및 진공건조) 제조하였다.
a. 열처리:
대략 60℃에서 대략 220 리터가 되도록 글루칸 용액 농도를 조절한 후 탱크 주위 자켓으로 스팀을 도입시켜 가열하는 밀폐되고 교반되는 800 리터 탱크에서 열처리한다.
전체 생성물이 가열되도록 생성물을 대략 105℃까지 서서히 가열한 후, 신속하게 123 ℃로 가열한다. 60℃에서 123 ℃까지 정상적인 가열 시간은 40 - 50 분이다. 이후 생성물을 123 - 125 ℃에서 20 분 동안 유지하다.
b. 능동적 (active) 냉각:
이후 능동적으로 냉각시킨다. 수동 밸브들을 직접 개방, 폐쇄하여 수작업으로 조작한다. 먼저 스팀을 주의깊게 자켓으로부터 방출시키고, 배출밸브는 개방되도록 방치한다. 이후 냉각수를 조심스럽게 자켓으로 주입시키되, 처음에는 서서히 주입시켜 강철 탱크에 대한 과도한 열응력을 피한다. 온도가 하강할수록 냉각수 주입속도를 높인다. 통상 생성물 온도가 35 - 40 ℃에 도달될 때까지 계속하여 냉각시킨다. 123℃에서 40 ℃까지 정상적인 냉각 시간은 50 - 60 분이다.
실시예 2
겔 글루칸 생성물 제조
1.5-2% 효모 글루칸 분자들 수용액을 다음과 같이 제조하였다. 실시예 1에 기재된 바와 같이, 입자성 글루칸 제제를 포름산 분해하여 선택적으로 β-1,6 곁사슬들을 제거하여 본 수용액을 제조하였다.
a. 수산화나트륨 첨가에 의한 수소결합 분해 (disruption):
대략 185 리터가 되도록 글루칸 용액 농도를 조절한 후 탱크 주위 자켓으로 스팀 또는 물을 도입시켜 가열, 냉각되고 밀폐된 800 리터 교반 탱크에서 수산화나트륨을 첨가하였다.
생성물 온도를 18 ℃로 조정하고, 정제수 약10리터에 용해된 24몰 (960g)의 NaOH를 탱크 창구를 통하여 서서히 (분 당 1 리터) 부었다.
b. 염산 첨가에 의한 수소결합 회복:
탱크에 NaOH를 모두 투입한 후 즉시 회복 공정을 개시하였다.
24 몰이 약간 안되는 HCl, 정제수 중 2.4M 용액 약 9리터를 비교적 신속하게 (약 2분) 탱크에 붓고, 생성물 pH를 측정하고, pH 4에 이를 때까지 산을 소량 더욱 첨가하였다. 첨가된 HCl 총량은 23.4 몰이었다.
c. 염 제거
단계 a 및 b에서 첨가된 이온들 (Na+ 및 Cl-)을 제거하기 위하여, 정제수 4 부피를 접선식 필터에 통과시켜 생성물을 정용여과하였다.
실시예 3
생체내 상처 치료 조성물
당뇨병 (db/db) 생쥐 모델 (즉 BKS.Cg-m Dock7m +/+ Leprdb /J 생쥐)의 전층 절제 피부상처들 회복을 분석하여 실시예 1로 제조된 겔 글루칸 단독 (SG), 비히클 (카르복시메틸셀룰로스 또는 젤란검) 단독, 또는 SG 및 비히클 조합물이 상처 치료에 미치는 영향을 조사하였다. 본 발명의 조성물은 본원에 기재되고 실시예 1에서 예시된 가열 및 신속 냉각방법에 따라 제조되었고, 간단하게, 글루칸 및 비히클을 수용액에 용해시키고 오토클레이브에서 120℃로 약 18분 동안 가열하였다. 이후 생성물을 신속하게 냉각시켜 실시예 1에세 기재된 바와 같이 겔이 형성되도록 하였다.
환경 적응시 (교란없이 5-7 일) 홈 오피스 규정들 및 당뇨병 동물들에 대한 특정 요건들에 따라 생쥐들을 5마리씩 그룹으로 수용하였다. 실험적 상처 유발 후, 생쥐들을 각각의 케이지 (케이지에는 주당 2회 교체되는 톱밥이 깔리고 치수는 35 x 15 x 15 cm)에 수용하고, 주변 온도 23℃ 및 12-시간 명/암 주기의 환경을 유지하였다. 생쥐들에게 사료 (Standard Rodent Diet) 및 물을 임의량 공급하였다. 모든 마취 절차후에는, 생쥐들을 가온 환경에 방치하고 마취에서 완전히 회복될 때까지 감시하였다. 수술 후 모든 생쥐들에게 적당한 진통제 (부프레놀핀) 및 필요한 경우 추가 진통제를 제공하였다. 모든 동물실험들은 홈 오피스 라이센스에 따라 홈 오피스 허가 기관에서 진행하였다 (PCD: 50/2505; PPL: 40/3300; PIL: 50/3482; PIL: 70/4934). 연구 과정에서 매일 생쥐 건강 상태를 관찰하였다.
0일에, 생쥐들을 마취시키고 (이소플루오란 & 에어) 등부를 면도하고 식염수에 젓인 거즈로 닦았다. 각 생쥐의 등쪽 좌측 옆구리에 단번의 표준화 전층 상처 (10.0mm x 10.0mm)를 만들었다. 모든 처리 그룹에서 상처들을 투명 필름 드레싱 Bioclusive™ (Systagenix Wound Management, UK)의 원주형 밴드로 상처를 치료하였다; 이후 29-게이지 주사바늘로 Bioclusive 필름을 통과시켜 SG, 비히클 또는 SG및 비히클의 조합물을 정제수에 용해된 용액 50 ul으로 주사하였다. 적절한 소프트웨어를 이용하여 치료법 중 하나로 당뇨병 생쥐들을 무작위 선발하였다.
상처-유발 후 2, 4 및 6일 다시 처방하였다. 이들 동물의 상처 부위들에 대하여 처리 조제들이 과도하게 축적되는지 및 상처 부위 수화가 과도한지를 면밀하게 관찰하였다; 과도한 조제 누적/수화가 명백한 경우, 이전에 처방된 물질을 흡입 제거하고 다시 처방하였다.
상처-유발 후 4, 8, 12, 16, 20 및 24일, 모든 생쥐들을 다시 마취시키고, 필름 드레싱 및 떨어진 모든 파편들을 제거하고, 상처들을 식염수를 젓인 거즈로 소독하였다. 4, 8, 12, 16, 20 및 24일째 사진 촬영 후, 상처들을 Bioclusive 필름 드레싱으로 상기와 같이 다시 상처 치료하였다. 상처 치료는 피브린, 육아조직, 혈관형성 및 재-상피화 존재에 따라 평가하였다 (비-정량적). 상기 인자들에 대한 외관에 기초하여 신-피부조직 형성 (치료)을: 매우 양호, 양호, 약간, 없음으로 분류하였다.
각 평가시점에 각 상처에 대한 상처 눈금 사진으로 상처 봉합 데이터를 추가로 결정하였다. 소정 시점에서의 상처 면적은 상처 유발 (즉 0일) 직후 상처 면적에 대한 백분율로 표시하였다. 각 그룹에 대하여 잔류 상처 면적의 평균백분율 (& 평균의 표준오차)을 계산하고 도식하였다. 각 글루칸 제제의 효과를 i). 비히클; 및 ii) PDGF-BB + TGF-α (양성대조군)이 적용된 상처의 경우와 비교하였다.
Figure pct00004
표 1의 결과는 글루칸 단독 처방된 경우 상처 치료 빈도가 비히클 단독 처방된 경우보다 더 높다는 것을 보인다. 이러한 결과는 단독 글루칸이 겔화제 (비히클)와 비교할 때 더욱 양호한 신-피부조직형성 유도자라는 것을 제안한다. 또한, 상처 치료 증가를 보이는 (양호에서 매우 양호로) 2%에서 4% 글루칸 용액으로의 농도-의존적 이동이 명백히 존재한다. 그러나, 글루칸 및 두 비히클들의 조합물은 각각의 조제 단독 사용의 경우보다 우수하였고 (약간에서 매우 양호로 상당한 이동), 조합 생성물의 상승효과를 의미한다.
실시예 4 : 본 발명에 의한 글루칸 제제의 상처 치료에 대한 효과
상처 치료 지연이 인정된 생체내 모델에서 본 발명의 글루칸-기반 제제의 조직회복 촉진 능력을 평가하였다. 당뇨병 환자들은 특히 족부궤양에 대한 상처 치료 능력이 손상되기 쉽다. 이러한 상처 치료 지연 현상은 당뇨병 유도(db/db) 생쥐 (즉 BKS.Cg-m Dock7m +/+ Leprdb /J 생쥐)를 포함한 당뇨병 동물에게도 해당된다.
본 연구에서, Biotec 글루칸 SG 131-9 (다양한 농도 및 다양한 비히클들 존재 또는 부재) 처방된 당뇨병 생쥐의 상처 치료를 비히클들: (i) 정제수 [주사용 물], (ii) 1.0% 카르복시-메틸-셀룰로스, 및 (iii) 0.3% 피타겔에 노출된 유사한 상처들 치료와 비교하였다. 또한 Biotech 글루칸 SG 131-9이 처방된 당뇨병성 상처 치료를 비교군들: (i) 메토셀 - 다당체 물질 비교군, 및 (ii) 인트라사이트 겔 - 시장 선두인 상처 치료 수화겔 제제의 경우와 비교하였다. 인간 재조합 형질전환성장인자-알파 (rh-TGF-α)와 조합된 인간 재조합 혈소판-유래 재조합 성장인자-BB (rh-PDGF-BB)를 본 연구에서 "양성대조군"으로 설정하였다. 본 양성대조군을 두 종의 운반체 - 0.5% 히드록시프로필메틸셀룰로스 (HPMC) 및 1.0% 카르복시메틸셀룰로스 (CMC)에 적용하였다.
물질들 및 방법
테스트 물질
1.주사용 물
2.정제수 중의1.0% 카르복시메틸셀룰로스 (CMC, Sigma C5013, 나트륨염)
3. 0.3% 피타겔 + 4mM CaCl2
4. 2.0% 메토셀
5. 인트라사이트
6. 2.0% SG
7. 4.0% SG
8. 1.0% CMC + 1.0% SG
9. 1.0% CMC + 2.0% SG
10. 1.0% CMC + 4.0% SG
11. 0.3% 피타겔 + 2.0% SG
12. 0.5% HPMC 중의 rh-PDGF-BB [10%] + rh-TGF-α [1%]
13. 1.0% CMC 중의 rh-PDGF-BB [10%] + rh-TGF-α [1%]
실시예 1 및 3에 기재된 방법으로 상기 물질들을 제조하였다. 피타겔은 언제나 CaCl2와 함께 사용하였다
BKS . Cg -m Dock7 m +/+ Lepr db /J 당뇨병 생쥐 모델
주령 약 5-6주의 생쥐를 UK로 반입하여 홈 오피스 규정 및 당뇨병 동물들의 특정 요건에 따라 주령 12 주령 (± 1 주)까지 자체 수용하였다.
간단히, 0일, 생쥐를 이소플로란 및 에어로 마취시키고; 프로토콜에 따라 등쪽 옆구리 피부를 결찰하고 세척하였다. 척추 바로 좌측에 단번의 표준화 전층 상처 (10.0mm x 10.0mm)를 만들었다. (하기 표에 기재된 바와 같이) 당뇨병 동물들을 무작위로 13 실험그룹들 중 하나로 할당하였다. 모든 그룹에서 상처들을 반-밀봉 필름 드레싱 Bioclusive™ (Systagenix Wound Management, UK)의 원주형 밴드로 상처를 덮고 Bioclusive 필름을 통과시켜 치료제 (50ul [1-11군] 및 100 ul [12 &13군])를 피하주사하였다. 연구 과정 내내 드레싱 재질 상태를 매일 검사하고 필요하면 교체하였다.
상처-유발 후 2, 4 및 6일째에 1-11군의 생쥐들을 결박하고 Bioclusive 필름을 통과시켜 치료제를 피하주사로 재-처방하였다. 재-처방 전에 수화/이전 조제 누적물을 제거하였다. 실험그룹 12&12 (양성대조군들)의 경우, 상처-유발 후 6일째 치료제를 재-처방하였다.
4일째 모든 생쥐들을 다시 마취시키고, 상처를 촬영한 후, 가온 환경 (34℃)에서 회복시켰다. Bioclusive™ 드레싱을 통하여 상처 영역들이 육안 관찰되므로, 반복된 드레싱 제거로 인한 상처-주변 손상을 최소화하기 위하여 본 평가시점에서는 필름 드레싱들을 유지하기로 하였다.
8 & 12, 16 & 20일째 모든 생쥐들을 다시 마취시키고, 필름 드레싱 및 떨어진 파편들을 제거하고, 멸균식염수를 젖인 멸균거즈로 상처를 세척하였다. 상처들을 촬영하고, 다시 Bioclusive™ 필름 드레싱으로 (상기와 같이) 상처 처리하고, 동물들을 가온 환경(34℃)에서 회복시켰다.
상처 유발 후 즉시, 및 이후 4, 8, 12, 16, 20 & 24일째 모든 상처들을 교정/확인판과 함께 디지털 촬영하였다 (가능하면- 필름드레싱 제거 및 상처 세척 이후).
Figure pct00005
상처 봉합 영상 분석:
Image Pro Plus 영상분석소프트웨어 (version 4.1.0.0, Media Cybernetics, USA)를 사용하여 평가시점들에 촬영된 상처 눈금 영상들로부터 상처봉합을 계산하였다. 상처봉합은 상처수축 (경계조직의 내향이동) 효과를 동반하므로, 이것 역시 결정하였다.
다음을 평가하였다:
1. 시간경과에 따른 잔류 상처면적 백분율
즉 상처 0일 직후 상처면적에 대한 소정 시점에서 여전히 개방된 상처면적
2. 시간경과에 따른 상처수축 백분율
즉 소정 시점에서 수축된 상처면적 및 원 상처면적의 차이 [원 상처면적의 백분율로서].
상처 치료 (신-피부조직발생) 개시 평가:
8일까지는 매일 - 이후 10, 12, 14, 16, 20 & 24일째 모든 상처들을 육안 평가하여 "치료" 상태를 구축하였다. "신-피부조직발생 활성"을 보이는지 여부 (즉 상처가 치료과정을 개시하였는지 여부)에 대하여 각각의 상처에 대하여 점수를 부여하였다. 독립적 두 명의 관찰자들이 각 상처를 평가하고, 각각의 평가시점에서 처리 그룹들 간 "신-피부조직발생 활성"을 보이는 상처의 평균 백분율을 비교하였다.
상처바닥 근막내 혈관이 덮힌 "물질"로 은폐될 때 신-피부조직형성이 개시된다고 감안하였다. 이러한 은폐는 탁한 삼출물, 중합화/반-중합화 피브린 또는 육아조직 형성에 의한 것일 수 있다. 분명한 것은, 신-피부조직개시의 첫번째 신호는 상처 공간 내부에 불그스럼한 삼출물이 형성되는 것이다.
결과
상처 봉합:
소정 시점에서 주어진 상처에 대하여, 상처 봉합을 손상 직후 (즉 0 일) 초기 상처면적에 대한 잔류 상처면적 백분율로 표시하였다. 모든 치료 그룹들에 대한 잔류상처면적 데이터 평균백분율은 하기 표 2에 기재된다.
Figure pct00006
표 2, 및 도 4 및 5에서 보이는 바와 같이, "시간경과에 따른 잔류 상처면적 %" 데이터의 상처 봉합 프로필은, 상이한 처지 그룹들 간에 상당히 달랐다. 물만을 처방받은 상처들은 가장 느린 상처 봉합을 보였고 양성대조군들 처방 상처들은 가장 빠른 봉합을 보였으며, 기타 모든 처치 그룹들은 이들 사이에 놓였다. 2% SG (CMC 중) 처방 상처들은 임의의 기타 실험 처치 그룹보다도 신속한 봉합을 보였다 (양성대조군들 제외).
비교군들 (메토셀 및 인트라사이트)은 물 처치와 비교하여 상처 봉합을 촉진하였다. 24 일 까지의 최종 상처 봉합 수준은 메토셀의 경우 ~91%이고 인트라사이트 경우 ~ 92%였다.
CMC 중의 SG 131-9 (1, 2 또는 4%)는 물 처치 대비 상처 봉합을 촉진하였다. 1% SG 131-9 (CMC 중) 처치 결과, 상처-유발 후 12일 내지 20일에 봉합을 상당히 상승시켰다. 2% SG 131-9 (CMC 중) 치료 결과 더욱 실질적이고 지속적인 효과를 보였고 12 일째부터 봉합을 상당히 촉진시켰다. 4% SG 131-9 (CMC 중)는 물 처치보다는 효과적이지만, 1% 및 2% 치료보다는 효과적이지 않았다. 24 일 까지의 최종 상처 봉합 수준은: 1% SG 131-9 (CMC 중)의 경우 90%, 2% SG 131-9 (CMC 중)의 경우 96%이고 4% SG 131-9 (CMC 중)의 경우는 89% 였다.
1% CMC 중에 적용된 2% SG 131-9는 물에 적용된 2% SG 131-9보다 더욱 상처 봉합을 상승시켰다. 3 종의 2% SG 131-9 치료법들을 비교하면, 모두가 각각의 비히클 대조군들 (즉 물, 1% CMC & 0.3% 피타겔)보다 크게 봉합을 촉진시켰다. 절대적으로, CMC 중의 2% SG는 가장 높은 봉합 수준을 보였다. 수중 2% SG 처리 그룹의 봉합 프로필은 피타겔 중 2% SG 처리 그룹의 것과 유사하고, 모두는 CMC 중의2% SG 131-9 제제과 처치된 상처보다 봉합 수준이 더 낮았다.
평가된 모든 SG 131-9 제제 중, 1% CMC 중의 2% SG 131-9가 가장 효과적인 것으로 보였다. 2% SG 131-9 (CMC 중)는 다당체 물질 비교군인 인트라사이트 및 상처 치료 수화겔 제제 시장 선두인 메토셀 보다 상처 봉합을 더욱 촉진하였다.
상처 수축
수축은 상체 "몸체" 내부 육아조직 밀집으로 인한 상처 경계의 중심 지향 이동이다. 이러한 과정을 유도하는 "밀집"력은 섬유아세포 계통의 세포에 있다고 생각된다. 본 연구에서, 수축 %은 다음과 같이 계산되었다:
Figure pct00007
상처 수축 결과를 하기 표 3 및 도 6 및 7에 나타낸다.
Figure pct00008
물만의 처치 그룹은 다른 기타 치료 그룹 대비 수축이 현저하게 낮다. 가장 높은 수축 수준은 2종의 양성대조군 치료법, 2% SG (CMC 중) 및 늦은 시점에서 (20 및 24)의 2% SG (피타겔 중)에서 관찰되었다.
2종의 비교군들, 메토셀 및 인트라사이트는 물-치료 대비 상처 수축을 촉진시켰다. 메토셀-치료 상처는 8, 20 및 24일째 물 처치보다 더욱 상당히 수축되고, 인트라사이트 처치 상처는 12 일 이후 더욱 상당히 수축되었다. 2종의 비교군 처리 모두 양성대조군-처치 상처보다는 상처 수축이 낮았다.
1% CMC 중의 SG 131-9 (1%, 2% 또는 4%) 제제 치료는 물-처치 대비 상처 수축을 촉진시켰다. 각 농도의 처치는 12 일 이후 물 처치보다 더욱 큰 수축을 보였다. 2% SG 131-9 (CMC 중)는 CMC 단독의 경우보다 상처 수축을 촉진시켰고, 16 및 24일 상당한 수축 상승이 관찰되었다. 2% SG (CMC 중)는 1% 및 4% SG 131-9 (in CMC) 모두의 경우보다 수축을 더욱 효과적으로 촉진시켰다. 2% SG (CMC 중) 처치는 양성대조군 처치 상처와 경우와 비교할 때 20 일까지 상당한 차이가 측정되지 않아 수축 수준이 비슷하지만; 상기된 바와 같이, CMC 단독의 경우는 양성대조군 처치의 경우보다 수축이 적었다. 흥미롭게도, 최종 평가시점에서 (24 일), 2% SG 131-9 (CMC 중)로 치료된 상처는 2종의 양성대조군 처치의 경우보다 수축이 더 컸다.
1% CMC 중에 적용된 2% SG 131-9는 물에 적용된 2% SG 131-9 보다 상처 수축을 더욱 상승시켰다. 절대적으로, CMC 중의 2% SG는 가장 높은 수축 수준을 보였다. 2% SG 131-9 (피타겔 중) 역시물 치료 및 피타겔 단독 치료와 비교하여 상처 수축을 촉진시켰다.
평가된 모든 SG 131-9 제제 중에서, 1% CMC 중의2% SG 131-9가 상처 수축에 있어서 가장 효과적인 것으로 보였다. 2% SG 131-9 (CMC 중)는 인트라사이트 및 메토셀보다 더욱 상처 수축을 촉진시켰다.
상처 치료 개시 (신-피부조직발생)
8일까지는 매일 - 이후 10, 12, 14, 16, 20 & 24일째 모든 상처들을 육안 평가하여 "치료" 상태를 구축하였다. "신-피부조직발생 활성"을 보이는지 여부 (즉 상처가 치료과정을 개시하였는지 여부)에 대하여 각각의 상처에 대하여 점수를 부여하였다. 독립적 두 명의 관찰자들이 각 상처를 평가하고, 각 평가시점에서 처리 그룹들 간 "신-피부조직발생 활성"을 보이는 상처의 평균 백분율을 비교하였다.
다른 처리 그룹들 상처는 상처 후 다양한 시간에 치료의 첫번째 신호를 보였다. 이들 데이터에 의하면 다른 그룹들 간 반응 순서는 빠른 순부터 느린 순으로:
Figure pct00009
물 처치 상처 10 중 7 (70%)은 연구 종료일 24일에 신-피부조직형성을 개시하였다. 모든 기타 그룹의 상처는 이 시점까지는 신-피부조직형성을 개시하였다.
1% CMC에서 조제된 SG를 고려하면, 2% 및 4% SG 처방된 상처가 반응이 첫번째이고, 이어 1% SG 처방의 경우이다. 물-처치의 경우와 비교하면, 1% SG 131-9 치료 상처의 상당히 더 많은 수는 6 일에서 14일에 반응하였고, 2% SG 131-9 처방의 경우 상당히 더 많은 수가 3일에서 14일에 반응하였고, 4% SG 131-9 처방의 경우 상당히 더 많은 수가 4일에서 14일에 반응하였다. 4 일 후 이들 3종의 처치 그룹 및 2종의 양성대조군 처치 그룹 간의 큰 차이는 보이지 않았다. 반응일 평균값에 있어서 모든 3종 농도의 경우는 물-처치 상처보다 상당히 조기에 반응하였다.
피타겔 중에 조제된 2% SG 처방된 상처는 피타겔 단독 처방 상처보다 조기에 반응하였다. 대조군 그룹들과 비교하면, 물 처치의 경우보다 2% SG (피타겔 중) 처방의 경우 상당히 더 많은 상처들이 4 일에서 14일에 반응하였다. 반응일 평균값에 있어서, 2% SG (피타겔)는 물 또는 피타겔 단독의 경우보다 상당히 조기에 반응하였다.
실시예 5 : 글루칸 겔 안정도
Woulgan®는 다음과 같이 제조되었다:
- 2,7% SBG (정제수 중의 Biotec 용해성 효모 베타 글루칸)
- 교반하면서, Blanose TM 　(7H4XF PH, Kirsch Pharma Gmbh, 약품등급 카르복시메틸 셀룰로스)을 최종 농도 1,5 % (w/v)로 첨가하였다.
- CMC이 용해될 때까지 교반하였다
- 글리세롤 (99,7 %)을 최종 농도 20%로 첨가하였다.
- 오토클레이브 120 ℃에서 18 분간 멸균하였다.
- 실시예 1에 도시된 바와 같이 급속 냉각하고 겔을 고화시켰다.
분해 촉진 조건들 (변경온도 4℃ 내지 37℃에서 진탕)에서 알루미늄 튜브에 6개월까지 보관하였다. SG 단독은, 즉 카르복시메틸 셀룰로스 부재에서, 실시예 1에 따라 제조되어 동일 조건에서 보관하였다. 출발물질 SBG은 실시예 1에 사용된 것과 동일한 출발물질이다.
도 9에 도시된 바와 같이, 이러한 보관 조건에 의해 SG 겔 분해가 높아졌다. 분해 신호, 즉 겔 수축은 이러한 조건들에서 1개월 조기에 육안관찰된다. 6 개월 후, SG 겔은 겔 수축의 분명한 신호를 보이고 매우 연성의, 투명한, 불균일한, 덩어리형, 균열성, 과립형 겔로 보이고, 카르복시메틸 셀룰로스 첨가된 SG로 이루어진 겔은 연구 초기 외관 대비 변화가 없었고 연구 내내 최소한 6개월까지는 균질성, 점성 겔을 유지하였다. 조성물은 SG 단독의 경우와 비교하면 안정성이 개선되었다.

Claims (31)

  1. 글루칸 및 겔화제로 구성되고, 융점 (졸에서 겔)이 37℃ 이상인, 겔 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 겔화제는 수용액에서 자체로 수화겔을 형성할 수 있는 고분자인, 겔 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 글루칸 및 겔화제는 수화겔로서 존재하는, 겔 조성물.
  4. 선행 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 겔화제는 비-글루칸 탄수화물인, 겔 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 겔화제는 비-글루칸 다당체인, 겔 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 겔화제는 카르복시메틸 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 및 히드록시프로필 메틸 셀룰로스 프탈레이트를 포함하는 셀룰로스 및 이의 유도체; 검 예를 들면 트래거캔스, 잔탄검 및 젤란검과 같은 검; 젤라틴; 알기네이트 및 산화폴리에틸렌, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 공중합체, 및 폴리비닐알코올과 같은 친수성 고분자에서 선택되는, 겔 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 겔화제는 셀룰로스 또는 이의 유도체인, 겔 조성물.
  8. 선행 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 글루칸은 효모에서 유래되는, 겔 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 글루칸은 사카로미케스 세레비시에 ( Saccharomyces cerevisiae)에서 유래하는, 겔 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 글루칸은 β-(1,3)-결합 글루코실 잔기들의 골격 및 β-(1,6)-결합을 통하여 골격이 연결되는 2 이상의 β-(1,3)-결합 글루코실 잔기들로 이루어진 곁사슬들로 구성되는 베타 글루칸인, 겔 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 글루칸은 반복적 β-(1,6)-결합 글루코실 잔기들이 실질적으로 부재하는, 겔 조성물.
  12. 선행 항들 중 어느 하나의 항에 있어서, 수용액에 글루칸 0.1-6% 및 겔화제 0.2-3%를 포함하는, 겔 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 글루칸 0.2-4% 및 겔화제 0.25-2%를 포함하는, 겔 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 치료 용도인, 겔 조성물.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상처 또는 궤양 치료 조력 용도인, 겔 조성물.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 조성물은 개체에 국소적으로 적용되는, 겔 조성물.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의한 조성물을 치료가 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체를 대상으로 상처 또는 궤양 치료에 조력하거나 또는 구내점막염 또는 암을 치료하는 방법.
  18. 제15항 내지 제17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 궤양은 당뇨병 궤양인, 조성물 또는 방법.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 구내점막염 또는 암 치료 용도로 사용되는, 겔 조성물.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의한 조성물을 적용하거나 내부에 함침시킨 물리적 지지체.
  21. 제20항에 있어서, 직물, 부직물, 편물, 발포재 및 접착 기재; 패치, 드레싱, 플라스터, 붕대, 필름 또는 거즈로 이루어진 군에서 선택되는, 물리적 지지체.
  22. 피부세포집단 및 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의한 조성물과의 접촉단계를 포함하는, 시험관내 피부세포 증식방법.
  23. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 겔은 25℃ 및 pH 4 내지 8에서 겔 상태로 존재하는, 겔 조성물.
  24. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 25℃에서 점도는 최소한 1000cP, 바람직하게는 최소한 1500cP인, 겔 조성물.
  25. a) 글루칸의 수소결합들을 분해하기 위하여, 선택적으로 겔화제와 함께, 글루칸 분자들 수용액을 처리하는 단계;
    b) 선택적으로 겔화제를 단계 a) 생성물에 첨가하는 단계; 및
    c) 글루칸 내 수소결합들을 재형성시키기 위하여 수용액을 처리하는 단계로 구성되는, 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 의한 조성물 제조방법.
  26. 제25항에 있어서, 단계 a)는 글루칸 분자들 수용액을, 겔화제 존재 또는 부재에서, 가열하는 단계를 포함하고 단계 c)는 글루칸 및 겔화제의 수용액을 냉각하는 단계를 포함하는, 조성물 제조방법.
  27. 제26항에 있어서, 수용액은, 겔화제 존재 또는 부재에서, 최소한 약 100℃로 가열되는, 조성물 제조방법.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 글루칸 및 겔화제의 혼합물은 단계 c)에서 급속 냉각되는, 조성물 제조방법.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 하나의 항에 있어서, 글루칸 및 겔화제의 혼합물은 40℃ 이하로 냉각되는, 조성물 제조방법.
  30. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 약 2%의 글루칸 및 약 1.5%의 카르복시메틸 셀룰로스를 포함하는, 겔 조성물.
  31. 제25항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 의한 방법으로 획득되는, 조성물.
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