KR20120113804A

KR20120113804A - 천연물질을 이용한 아토피 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20120113804A
Application number: KR1020127022740A
Authority: KR
Inventors: 송용원
Original assignee: 송용원
Priority date: 2010-09-14
Filing date: 2011-09-10
Publication date: 2012-10-15
Also published as: KR101287688B1; WO2012036446A3; JP5176008B2; WO2012036446A2; JP2012528893A

Abstract

본 발명은, 대황, 목통, 치자, 차전자, 구맥 및 편축을 각각 3?15 중량부, 3?10 중량부, 3?10 중량부, 8 중량부, 8 중량부, 8중량부로 혼합하여 열수 추출한 유효성분을 함유하는 아토피 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은, 공사인, 백두구, 정향, 목향, 건강, 인삼, 당귀, 백복령, 백출, 길경, 진피, 곽향, 육두구, 봉출, 석창포, 시호, 빈랑, 황련, 방풍, 오수유, 후박, 대황, 천문동, 지각, 황백, 황기, 천초, 강활, 자원, 향부자, 감초, 소회향, 목통, 맥문동, 삼능, 백작약, 육계, 치자, 차전자, 구맥, 편축, 청피를 각각 1?15 중량부로 혼합하여 열수 추출한 유효성분을 함유하는 아토피 치료용 조성물에 관한 것이다.

Description

천연물질을 이용한 아토피 치료용 조성물{COMPOSITION FOR TREATING ATOPIC DERMATITIS USING NATURAL MATERIALS}

본 발명은, 대황, 목통, 치자, 차전자, 구맥 및 편축을 각각 3?15 중량부, 3?10 중량부, 3?10 중량부, 8 중량부, 8 중량부, 8중량부로 혼합하여 열수 추출한 유효성분을 함유하는 아토피 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은, 공사인, 백두구, 정향, 목향, 건강, 인삼, 당귀, 백복령, 백출, 길경, 진피, 곽향, 육두구, 봉출, 석창포, 시호, 빈랑, 황련, 방풍, 오수유, 후박, 대황, 천문동, 지각, 황백, 황기, 천초, 강활, 자원, 향부자, 감초, 소회향, 목통, 맥문동, 삼능, 백작약, 육계, 치자, 차전자, 구맥, 편축, 청피를 각각 1?15 중량부로 혼합하여 열수 추출한 유효성분을 함유하는 아토피 치료용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로, 피부질환의 범위에는 아토피성 피부염, 접촉피부염, 지루성 피부염, 화폐상 습진, 태선, 울체성(鬱滯性) 피부염, 이한성(異汗性) 습진, 피지결핍성 습진 및 자가 감작성 습진 등이 포함된다.

이러한 피부질환의 발병 원인은 아직 확실하게 알려져 있지 않은 상태이며, 그 일상 증상도 피부건조증, 습진 등으로 다양하게 나타나기 때문에 발병 원인이 어느 한 가지로만 설명될 수는 없다.

즉 환경적인 요인과 유전적인 소인, 면역학적 반응 및 피부보호막의 이상 등을 주요한 원인으로 볼 수 있는데, 크게 보면 외인성 자극물 및/또는 내인성 분비물에 의해서 피부질환이 발생된다고 볼 수 있겠다.

먼저, 외인성 자극물로서는, 산업화로 인한 매연 등 환경 공해, 서구식 주거 형태로 인한 카펫, 침대, 소파의 사용 증가 및 실내 온도 상승으로 인한 집먼지, 진드기 등의 알레르기를 일으키는 원인 물질(알레르겐) 등을 들 수 있겠다.

내인성 분비물의 경우에는, 대표적으로 자가 면역성 과민반응에 따라 발생되는 각종 물질로 인하여 피부질환 특히 아토피성 피부염 등이 발생되는 것을 들 수 있다.

구체적으로 보면, 체내 염증 과정에서는 유도성 NOS(inducible NO synthase, iNOS, NOS-II) 및 COX2(cyclooxygenase2)에 의해 과량의 NO(nitric oxide) 및 PGE₂(prostaglandin E₂) 등의 염증인자가 형성된다.

여기에서, NOS-II는 LPS(lipopolysaccharide) 및 다양한 염증 유도 사이토카인(cytokines)에 노출되는 경우에 발현되는데, NOS의 종류 중에서 NOS-II에 의한 NO 생성이 절대적으로 많으며 병리학적으로 중요한 작용을 한다고 알려져 있다.

그런데 외인성 자극물이나 내인성 분비물 중 어느 것에 의한 아토피성 피부염의 경우라도 가려운 피부를 긁게 됨에 따라 피부의 장벽기능이 파괴되어 각종 자극물이 쉽게 침입함으로써, 더욱 악화되는 과정을 겪는다.

즉 피부각질화세포에서 분비되는 단백질에 대하여 이뮤노글로블린 E(IgE, immunoglobulin E)가 작용하여 자가 면역성 과민반응을 일으켜서 피부질환을 악화시킨다는 점이다.

구체적으로 보면, 피부에 존재하는 랑게르한스 세포(Langerhans cell)는 외부에서 침입한 항원에 대하여 IgE와 수용체 FcRI가 함께 결합하게 되면, MCP-1(monocyte chemotactic protein 1) 및 인터루킨-16(interleukin-16) 을 분비하게 된다.

또한 랑게르한스 세포는 항원을 T-세포에 전달하여 Th 2(helper T cell 2) 증식을 유발하게 된다.

Th 2에 의해 단핵구(monocyte)가 피부로 집결하여 단핵구는 분화하여 염증성 수지상세포(dendritic cells, IDEC)로 변하게 되는데, 이 수지상세포가 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1(Interleukin-1) 및 IL-6를 과잉 분비함으로써 피부질환이 악화되는 과정을 겪게 된다.

여기에서, IL-1 패밀리에는 IL-1α, IL-1β, IL-1RA가 포함되며, IL-1α는 전구체에도 생물활성이 있지만 IL-1β는 성숙체에만 생물활성이 있다고 알려져 있다.

한편 종래에는 아토피성 피부염 등의 피부질환에 대한 치료법으로서 면역억제제와 생체반응조절물질 등을 개발하는 방향으로 연구가 진행되어 왔다.

면역억제제로는 스테로이드 계열이 있으며, 생체반응조절물질로는 IFN-γ, 항히스타민 등이 대표적이다.

그러나 이들은 소염작용이 신속하나 사용을 중지시 증상이 악화되기도 하고 피부 면역계를 차단하기 때문에 도리어 세균감염의 위험을 증가시켜서 장기간 사용할 수 없는바, 이를 대체할 수 있는 보완제품의 필요성이 절실한 실정이다.

한편 천연물을 이용한 선행기술에 대하여 검토해보면, 먼저, 한국특허출원 제10-2007-0010080호에서는 소리쟁이 뿌리, 유근피, 지황, 당귀, 자소를 포함하는 천연성분의 아토피 치료제가 개시되어 있다.

두 번째, 한국특허공개 제2006-0058530호에는 가려움증 완화 효과를 나타내는 우엉, 신이화, 엉겅퀴, 울금, 오미자의 혼합 추출물이 기재되어 있다

세 번째, 한국특허공개 제2007-0095588호에는 아토피성 피부질환 치료용 특수 한방 조성물 및 그 제조공법에 관한 금은화를 포함하는 어성초, 당귀, 약쑥, 천궁, 신선초, 홰나무, 솔싹, 박하, 녹두, 살구씨, 송진, 상황버섯, 생강, 현삼, 조피, 녹차, 금잔화, 도라지, 검은콩의 조성물이 기재되어 있다.

네 번째, 한국특허공개 제2006-0074038호에는 아토피성 피부염의 예방효과를 가지는 조성물에 금은화, 당귀, 부평초, 우슬, 금잔화, 알로에, 황금의 혼합추출물이 기재되어 있다.

본 발명의 목적은, 부작용을 가져오지 않으면서 지속적으로 복용함으로써, 아토피 피부염을 개선 및 치료하기 위한 조성물을 제공함에 있다.

본 발명은, 대황, 목통, 치자, 차전자, 구맥 및 편축을 각각 3?15 중량부, 3?10 중량부, 3?10 중량부, 8 중량부, 8 중량부, 8중량부로 혼합하여 열수 추출한 유효성분을 함유하는 아토피 치료용 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명은, 공사인, 백두구, 정향, 목향, 건강, 인삼, 당귀, 백복령, 백출, 길경, 진피, 곽향, 육두구, 봉출, 석창포, 시호, 빈랑, 황련, 방풍, 오수유, 후박, 대황, 천문동, 지각, 황백, 황기, 천초, 강활, 자원, 향부자, 감초, 소회향, 목통, 맥문동, 삼능, 백작약, 육계, 치자, 차전자, 구맥, 편축, 청피를 각각 1?15 중량부로 혼합하여 열수 추출한 유효성분을 함유하는 아토피 치료용 조성물을 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.

본 발명인 아토피 치료용 조성물은, 부작용을 가져오지 않으면서 지속적으로 복용함으로써, 아토피 피부염을 개선 및 치료할 수 있는 현저한 효과를 보유하고 있다.

도 1은 실시예 1에 따른 시료의 세포 독성을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 실시예 1에 따른 시료의 DPPH 소거능을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 실시예 1에 따른 시료의 NO 생성 억제를 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 실시예 1에 따른 시료의 IL-1β 생성에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 실시예 1에 따른 시료의 IL-6 생성에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 실시예 1에 따른 시료의 MCP-1 생성에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7은 실시예 1에 따른 시료의 TNF-α 생성에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8은 실시예 2에 따른 시료의 TNF-α 유전자 발현에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 실시예 2에 따른 시료의 IL-6 유전자 발현에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10은 실시예 2에 따른 시료의 COX2 유전자 발현에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 11은 실시예 2에 따른 시료의 NOS-II 유전자 발현에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 12는 실시예 2에 따른 시료의 MCP-1 생성에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 13은 실시예 2에 따른 시료의 IL-6 생성에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.
도 14는 실시예 2에 따른 시료의 IL-8 생성에 미치는 영향을 실험한 결과를 나타내는 도면이다.

본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

실시예 1. 아토피 치료용 조성물의 제조

1-1. 조성물의 제조배경

본 출원인은 아토피 질환을 한의학적 관점에서 해석하여 치료용 조성물을 안출하였으며, 조성물의 주요 성분으로 대황, 목통, 치자, 차전자, 구맥 및 편축을 사용하고 있는바 이에 대하여 살펴본다.

흔히, 아토피는 태열(胎熱)이라고도 불리는데, 아토피 피부염 환자들은 공통적으로 몸에 열이 많은 것을 알 수 있다.

그 원인으로는 혈에 열독이 쌓인 것으로 볼 수 있는데, 아토피 피부염에 동반되는 증상들인 변비, 비염, 알레르기, 천식 같은 증상들 역시 열독에서 오는 증상이라는 점에서 드러난다.

첫 번째, 대황, 목통, 치자는 소장 및 대장의 열로 막힌 기운을 소통시키는 기능을 수행한다.

즉 나무로 비유하면 잔뿌리의 역할을 인체에서는 소장, 대장이 수행하는데, 아토피 환자들은 변비증상을 동반하는 경우가 많고, 이는 소장, 대장의 기운이 정체되어서 오는 증상이라고 볼 수 있다.

두 번째, 차전자, 편축, 치자, 구맥은 방광의 기를 소통시킴으로써, 인체 내의 독소를 제거하는 기능을 수행한다.

즉 방광은 단순히 소변 배출용 장기가 아니고 인체에서 가장 아래에 위치하며 몸 전체를 아우르는 중요한 장기로서, 우리 몸의 온도를 조절하는 기능을 한다.

이는 남성들의 경우 전립선이나 방광에 열이나 기가 정체되어 있으면 온도 조절이 쉽지 않다는 점에서도 알 수 있다.

1-2. 아토피 치료용 조성물의 제조

본 실시예 1에 사용될 아토피 치료용 조성물을 제조하기 위하여, 대황 3?15g, 목통 3?10g, 치자 3?10g, 차전자 8g, 구맥 8g, 편축 8g을 물 1L에서 2?4시간 동안 가열하여 추출액을 얻었다.

추출액을 여과한 후 동결건조하여 추출물 분말을 제조하였다.

여기에서, 추출액의 여과 과정은 거즈 및/또는 여과지(filter paper)를 이용하였으며, 농축한 것에 물을 가하여 동결건조하였다.

위와 같은 과정을 반복하여, 아토피 치료용 조성물의 추출물 시료를 얻었으며, 시료를 냉동고에 보관하면서 사용하였다.

실시예 2. 아토피 치료용 조성물의 제조

2-1. 조성물의 제조배경

먼저, 실시예 1의 조성물이 열독을 제거하는 것에 초점을 맞춘 것이라면, 실시예 2는 열독을 제거함은 물론 오장육부의 균형을 맞추는 점에 중점을 두어 조성하였다는 점을 미리 밝혀둔다.

첫 번째, 공사인, 백두구, 백출, 진피, 곽향, 빈랑, 후박, 건강, 지각, 백작약은 떨어진 식욕을 높이고 위장 및 소화력을 높이는 기능을 수행한다.

아토피 피부염 환자들은 위장이나 소화기에 열이 많아, 식욕이 없고 음식 냄새를 맡기조차 싫어하므로, 비위의 기능을 향상시켜 식욕을 증진시킨다.

두 번째, 목향, 당귀, 시호, 삼능, 봉출, 백작약, 청피, 향부자는 간의 화를 내리우고 흩어진 간의 기운을 끌어올리는 기능을 수행한다.

아토피 피부염 환자들은 혈에 열독이 쌓여서 오는 병이므로 간에 스트레스를 많이 받고 지치기가 쉬우므로, 간의 기능을 증진시킨다.

세 번째, 정향, 인삼, 건강, 당귀, 향부자, 방풍, 오수유는 차가워져서 소화 흡수가 잘 안 되는 뱃속을 덥힌다.

아토피 피부염 환자들은 한결같이 일반인들보다 몸 전체에서 열이 많이 발생되나, 뱃속은 그 반대로 차다.

따라서 뱃속을 따뜻하게 해서 음식물의 소화 흡수를 돕고 위나 간에 부담을 덜어 생혈, 보혈, 퇴열한다.

네 번째, 황련, 치자, 방풍, 대황, 강활, 목통, 육두구는 소장, 대장의 열로 막힌 기운을 소통시킨다.

다섯 번째, 천문동, 황기, 자원, 백작약, 백복령, 인삼, 천초, 길경은 인체 중 피부를 관장하는 폐를 윤택하게 한다.

가려움으로 인해 긁어 상처가 생긴 피부에 활성도를 높이고 피부 표면에 있는 열도 제거함으로써 가려움을 극복하게 한다.

여섯 번째, 맥문동, 석창포, 육계, 황백, 소회향은 심장, 신장을 보해서 간의 청혈, 생혈, 보혈을 심장, 신장으로 하여금 하게 한다.

일곱 번째, 차전자, 편축, 치자, 구맥을 이용하여 방광의 기를 소통시켜 인체 내의 독소들을 제거한다.

여덟 번째, 감초를 사용하여 각 원료를 조화시켜 강화되도록 하며 약독을 몸에 좋게 해독하도록 한다.

2-2. 아토피 치료용 조성물의 제조

본 실시예 2에 사용될 아토피 치료용 조성물을 제조하기 위하여, 공사인, 백두구, 정향, 목향, 건강, 인삼, 당귀, 백복령, 백출, 길경, 진피, 곽향, 육두구, 봉출, 석창포, 시호, 빈랑, 황련, 방풍, 오수유, 후박, 대황, 천문동, 지각, 황백, 황기, 천초, 강활, 자원, 향부자, 감초, 소회향, 목통, 맥문동, 삼능, 백작약, 육계, 치자, 차전자, 구맥, 편축, 청피를 각각 1?15g 씩 물 1L에서 2?4시간 동안 가열하여 추출액을 얻었다.

추출액 여과, 분말 제조 및 시료 보관, 획득 과정 등은 실시예 1과 동일하게 처리하였다.

한편 본 실시예 2의 일 예로서, 실시예 1에 사용된 아토피 치료용 조성물의 구성인 대황 3?15g, 목통 3?10g, 치자 3?10g, 차전자 8g, 구맥 8g, 편축 8g에, 공사인, 백두구, 정향, 목향, 건강, 인삼, 당귀, 백복령, 백출, 길경, 진피, 곽향, 육두구, 봉출, 석창포, 시호, 빈랑, 황련, 방풍, 오수유, 후박, 천문동, 지각, 황백, 황기, 천초, 강활, 자원, 향부자, 감초, 소회향, 맥문동, 삼능, 백작약, 육계, 청피를 각각 1?15g 씩 혼합하여 추출하는 구성도 가능함을 밝혀둔다.

실시예 3. 아토피 치료용 환제의 제조

3-1. 실시예 1의 조성 비율을 이용한 환제의 제조

실시예 1에 따른 아토피 치료용 조성물인 대황, 목통, 치자, 차전자, 구맥 및 편축을 각각 분쇄하여 90메쉬 내지 120메쉬 분말로 제조하여 각각 3?15 중량부, 3?10 중량부, 3?10 중량부, 8 중량부, 8 중량부, 8중량부로 혼합 반죽하여 지름 0.3?0.5cm 크기의 환(알약)으로 제조한다.

또는 대황, 목통, 치자, 차전자, 구맥 및 편축을 각각 3?15 중량부, 3?10 중량부, 3?10 중량부, 8 중량부, 8 중량부, 8중량부로 혼합한 후에 분쇄하여 90메쉬 내지 120메쉬 분말로 제조한 후에 반죽하여 지름 0.3?0.5cm 크기의 환(알약)으로 제조한다.

상기에서 분말을 반죽하여 환을 제조하기 위해서, 쌀 10?15중량부 및 물 10?15중량부로 죽을 만든 후에, 상기 원료 분말과 함께 혼합 반죽 후 건조하여 환으로 제조한다.

3-2. 실시예 2의 조성물을 이용한 환제의 제조

실시예 2에 따른 아토피 치료용 조성물인 공사인, 백두구, 정향, 목향, 건강, 인삼, 당귀, 백복령, 백출, 길경, 진피, 곽향, 육두구, 봉출, 석창포, 시호, 빈랑, 황련, 방풍, 오수유, 후박, 대황, 천문동, 지각, 황백, 황기, 천초, 강활, 자원, 향부자, 감초, 소회향, 목통, 맥문동, 삼능, 백작약, 육계, 치자, 차전자, 구맥, 편축, 청피를 각각 분쇄하여 90메쉬 내지 120메쉬 분말로 제조하여 각각 1?15 중량부로 혼합 반죽하여 지름 0.3?0.5cm 크기의 환(알약)으로 제조한다.

또는 공사인, 백두구, 정향, 목향, 건강, 인삼, 당귀, 백복령, 백출, 길경, 진피, 곽향, 육두구, 봉출, 석창포, 시호, 빈랑, 황련, 방풍, 오수유, 후박, 대황, 천문동, 지각, 황백, 황기, 천초, 강활, 자원, 향부자, 감초, 소회향, 목통, 맥문동, 삼능, 백작약, 육계, 치자, 차전자, 구맥, 편축, 청피를 각각 1?15 중량부로 혼합한 후에 분쇄하여 90메쉬 내지 120메쉬 분말로 제조한 후에 반죽하여 지름 0.3?0.5cm 크기의 환(알약)으로 제조한다.

참고예 1. 아토피 피부염 환자의 복용예

1-1. 실시예 1의 조성물 및 실시예 3-1의 환제의 복용예

먼저, 실시예1?3에 따른 조성물 및 환제는 경구를 통해 투여되며, 조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 아토피 피부염의 정도에 따라 적절한 양을 조절함을 밝혀둔다.

또한 실시예1?3에 따른 조성물 및 환제의 투여기간은 2?6개월 정도의 시간이 소요된다.

5세 이하의 환자는 액체상태로 복용하는 것이 용이하고, 1일 세 번을 복용하는데 식후 30분에 50cc정도 복용하고, 5세 이상의 환자는 100cc 정도 복용하는 것이 바람직하다.

환제는 5?10세는 7환, 10?15세는 15환, 그 이상은 18환을 복용하는 것이 바람직하며, 알약은 식후 30분에 물로 복용하는 것이 바람직한데, 어린 환자일 경우 쓴맛을 완화시킬 필요가 있을 시에는 설탕이나 꿀을 희석해서 복용한다.

1-2. 실시예 2의 조성물 및 실시예 3-2의 환제의 복용예

5세 이하의 환자는 액체상태로 복용하는 것이 용이하고, 1일 세 번을 복용하는데 식후 30분에 120cc정도 복용하고, 5세 이상의 환자는 200cc 정도 복용하는 것이 바람직하다.

환제는 5?10세는 30환, 10?15세는 40환, 그 이상은 50환을 복용하는 것이 바람직하다.

실험예 1. 실시예 1에 따른 시료의 세포 독성 실험

1-1. 시료준비

실시예 1에 따른 아토피 치료용 조성물의 추출물 분말(실험과정에서 Song1-2로 명명하였음) 100mg을 멸균 증류수 10ml에 녹인 후 필터하여 사용하였다.

실험예 2?7의 시료는 본 실험예 1의 시료준비 과정을 동일하게 수행하여 획득하였음을 밝혀둔다.

1-2. 세포 독성 실험

Raw 264.7 cells은 96well plates에 10⁴ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 한 후, 시료를 각각 25, 50, 100, 200ug/ml의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 10ul의 WST solution을 첨가한 후 CO₂ 배양기 (37℃, 5％ CO₂)에서 30분 반응시킨 후, 450nm에서 흡광도의 변화를 측정하여 대조군에 대한 세포 생존율을 백분율로 표시하였다.

도 1에 나타나있듯이, Raw 264.7 세포주에서 실시예 1에 따른 시료는 세포 독성이 나타나지 않았음을 알 수 있다.

1-3. 통계처리

실험 결과는 SPSS 11.0의 unpaired student's T-test를 사용하여 통계처리 하였으며 P＜0.05, P＜0.01 및 P＜0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.

실험예 2?14의 통계처리는 본 실험예 1의 통계처리 방법을 동일하게 적용하였음을 밝혀둔다.

실험예 2. 실시예 1에 따른 시료의 DPPH 소거능 실험

자유라디칼 소거 활성 시험은 안정한 자유라디칼 DPPH를 사용하는 방법으로 에탄올에 용해시킨 0.2mM의 DPPH 용액 150ul와 시료(25, 50, 100, 200, 400, 800ug/ml) 100ul 를 각각 혼합하고, 37℃에서 30분간 반응 시킨 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료액 대신 증류수를 넣었으며, DPPH 용액대신 에탄올을 넣어 보정값을 얻었다. 자유라디칼 소거율은 아래의 식에 따라 계산하였으며, 그 결과는 자유라디칼을 50％ 소거할 수 있는 농도(IC50)로 나타내었다.

소거율(％)={(대조군의 흡광도-시료첨가군의 흡광도)/대조군의 흡광도}x100

도 2에 나타나있듯이, Raw 264.7 세포주에서 실시예 1에 따른 시료는 농도 의존적인 경향으로 소거능이 높게 나타나는바, 실시예 1에 따른 시료가 항산화 효과를 보이고 있음을 알 수 있다.

실험예 3, 실시예 1에 따른 시료의 NO 생성 억제 실험

Raw 264.7 cells은 96well plates에 10⁴ cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 한 후, 시료 각각의 농도 25, 50, 100, 200ug/ml로 처리하고, LPS 1ug/ml을 처리하여, 다시 24시간 동안 배양하였다. N1 buffer를 50ul를 각 well에 처리한 후, 10분간 상온에서 암소반응 후, N2 buffer 50ul를 각 well에 처리하고, 10분간 반응시킨 후, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. Nitrite standard의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액의 NO 농도를 결정하였다.

그람음성균의 세포외막에 존재하는 LPS(lipopolysaccharide)는 Raw 264.7 과 같은 대식세포(Macrophage) 또는 단핵구(monocytes)에서 TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-6(Interleukin-6), IL-1β(Interleukin-1β)와 같은 염증 유도 사이토카인을 증가시키는 것으로 알려져 있다.

도 3에 나타나있듯이, Raw 264.7 세포주에서 실시예 1에 따른 시료는 농도 의존적인 경향으로 LPS에 의해 유도되는 Total NO 생성을 감소시키고 있는바, 실시예 1에 따른 시료가 항염증 효과를 보이고 있음을 알 수 있다.

실험예 4. 실시예 1에 따른 시료의 IL -1β 생성에 미치는 영향

Raw 264.7 cells을 6 well plates에 3X10⁵ cells/ml이 되도록 분주하고, 24시간 동안 배양한 후, 시료를 각각 25, 50, 100, 200ug/ml의 농도로 처리하고, LPS 1ug/ml을 처리하였다. 24시간 동안 배양한 후 세포배양액을 수거하여 배양액에 함유된 IL-1β, IL-6, MCP-1, TNF-α를 custom-made 4-plex cytokine Milliplex panel을 이용하여 측정하였다. 분석은 Milliplex analyst를 통해 이루어 졌다.

도 4에 나타나있듯이, Raw 264.7 세포주에서 실시예 1에 따른 시료는 농도 의존적인 경향으로 LPS에 의해 유도되는 IL-1β 생성을 감소시키고 있는바, 실시예 1에 따른 시료가 항염증 효과를 보이고 있음을 알 수 있다.

실험예 5. 실시예 1에 따른 시료의 IL -6 생성에 미치는 영향

실험예 4와 동일한 방식으로 실험이 수행되었으며, 그 결과가 도 5에 나타나있다.

실험예 6. 실시예 1에 따른 시료의 MCP -1 생성에 미치는 영향

실험예 4와 동일한 방식으로 실험이 수행되었으며, 그 결과가 도 6에 나타나있다.

실험예 7. 실시예 1에 따른 시료의 TNF -α 생성에 미치는 영향

실험예 4와 동일한 방식으로 실험이 수행되었으며, 그 결과가 도 7에 나타나있다.

도 7에 나타나있듯이, Raw 264.7 세포주에서 실시예 1에 따른 시료는 농도 의존적인 경향으로 LPS에 의해 유도되는 TNF-α 생성을 감소시키고 있는바, 실시예 1에 따른 시료가 항염증 효과를 보이고 있음을 알 수 있다.

실험예 1?7을 총괄적으로 정리하여 보면, 실시예 1에 따른 시료는 Raw 264.7 세포주에서 농도 의존적인 경향으로 DPPH 소거능이 높게 나타나고, LPS에 의해 유도되는 Total NO, IL-1β 및 TNF-α 생성을 감소시키고 있는바, 실시예 1에 따른 시료는 항산화 및 항염증 효과를 보이고 있음을 알 수 있다.

실험예 8. 실시예 2에 따른 시료의 TNF -α 유전자 발현에 미치는 영향

8-1. 시료준비

실시예 2에 따른 아토피 치료용 조성물의 추출물 분말 100mg을 멸균 증류수 10ml에 녹인 후 필터하여 사용하였다.

실험예 9?14의 시료는 본 실험예 8의 시료준비 과정을 동일하게 수행하여 획득하였음을 밝혀둔다.

8-2. 유전자 발현 실험준비

Raw 264.7 세포주는 24 well plate에 1×10⁶ 세포로 분주하였고, 여기에 시료 각 100, 50 ㎍/㎖를 처리하고 1시간 후 LPS 2 ㎍/㎖를 각각의 well에 첨가한 후 6시간 배양하고 2,000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액을 제거하고, 여기에 RNAzolB 500 ㎕를 넣고 용해될 때까지 혼합하였다. 이 혼합 부유액에 chloroform (CHCl3) 50 ㎕를 첨가한 후 15초간 다시 혼합하였다. 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 약 200 ㎕의 상층액을 회수하여 2-propanol 200 ㎕와 동량 혼합 후 천천히 흔들고 얼음에서 15분간 방치하였다. 이를 다시 13,000 rpm에서 원심 분리한 후 80％ EtOH로 수세하고 3분간 vaccum pump에서 건조하여 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 diethyl pyrocarbonate (DEPC)를 처리한 20 ㎕의 증류수에 녹여 heating block 75℃에서 불활성화 시킨 후 first strand cDNA합성에 사용하였다.

역전사 (reverse transcription) 반응은 준비된 total RNA 3 ㎍을 DNase I (10 U/㎕) 2 U/tube를 37℃ heating block에서 30분간 반응한 후 75℃에서 10분 동안 변성시키고, 이에 2.5 ㎕ 10 mM dNTPs mix, 1 ㎕ random sequence hexanucleotides (25 pmole/ 25 ㎕), RNA inhibitor로서 1 ㎕ RNase inhibitor (20 U/㎕), 1 ㎕ 100 mM DTT, 4.5 ㎕ 5×RT buffer (250 mM, Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2)를 가한 후, 1 ㎕의 M-MLV RT (200 U/㎕)를 다시 가하고 DEPC 처리된 증류수로서 최종 부피가 20 ㎕가 되도록 하였다. 이 20 ㎕의 반응 혼합액을 잘 섞은 뒤 2,000 rpm에서 5초간 원심 침강하여 37℃ heating block에서 60분 동안 반응시켜 first-strand cDNA를 합성한 다음, 95℃에서 5분 동안 방치하여 M-MLV RT를 불활성화 시킨 후 합성이 완료된 cDNA를 polymerase chain reaction (PCR)에 사용하였다.

Real time quantitative PCR은 Applied Biosystems 7500 Fast Real -Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용하여 수행하였으며, 사용된 프라이머(primers)는 아래와 같다.

Real time PCR의 조건은, 50℃에서 2분, 94℃에서 10분간 반응하여 pre-denaturation 시킨 뒤, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분간 반응하여 40회 반복 수행하였다. 시료 투여군과 대조군은 internal standard로 GAPDH를 사용하여 아래의 수식으로 target group의 Quantitative PCR을 정량하여 RQ (relative quantitative)값을 측정하였다.

y = x (1+e)n, x = starting quantity, y = yield, n = number of cycles, e = efficiency

실험예 9?11의 유전자 발현 실험준비 과정은 본 실험예 8의 과정과 동일하게 수행되었음을 밝혀둔다.

8-3. TNF -α 유전자 발현에 미치는 영향

실시예 2의 시료의 Raw 264.7 세포주에서의 TNF-α 유전자 발현에 미치는 영향을 측정한 결과는, 정상군(Raw 264.7 cell)에서 0.03, 대조군(Raw 264.7 cell + LPS)에서 1, 실험군 1(Raw 264.7 cell + LPS + 시료 100ug/ml)에서 0.367, 실험군 2( Raw 264.7 cell + LPS + 시료 50ug/ml)에서 0.416 이었다.

도 8에 나타나 있듯이, 실시예 2에 따른 시료는 Raw 264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도되는 TNF-α 유전자 발현을 감소시키고 있음을 알 수 있다.

실험예 9. 실시예 2에 따른 시료의 IL -6 유전자 발현에 미치는 영향

실시예 2의 시료의 Raw 264.7 세포주에서의 IL-6 유전자 발현에 미치는 영향을 측정한 결과는, 정상군(Raw 264.7 cell)에서 0.004, 대조군(Raw 264.7 cell + LPS)에서 1, 실험군 1(Raw 264.7 cell + LPS + 시료 100ug/ml)에서 0.689, 실험군 2( Raw 264.7 cell + LPS + 시료 50ug/ml)에서 1.097 이었다.

도 9에 나타나 있듯이, 실시예 2에 따른 시료는 Raw 264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도되는 IL-6 유전자 발현을 농도 의존적으로 감소시키고 있음을 알 수 있다.

실험예 10. 실시예 2에 따른 시료의 COX2 유전자 발현에 미치는 영향

실시예 2의 시료의 Raw 264.7 세포주에서의 COX2 유전자 발현에 미치는 영향을 측정한 결과는, 정상군(Raw 264.7 cell)에서 0.051, 대조군(Raw 264.7 cell + LPS)에서 1, 실험군 1(Raw 264.7 cell + LPS + 시료 100ug/ml)에서 0.832, 실험군 2( Raw 264.7 cell + LPS + 시료 50ug/ml)에서 0.935 이었다.

도 10에 나타나 있듯이, 실시예 2에 따른 시료는 Raw 264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도되는 COX2 유전자 발현을 감소시키고 있음을 알 수 있다.

실험예 11. 실시예 2에 따른 시료의 NOS - II 유전자 발현에 미치는 영향

실시예 2의 시료의 Raw 264.7 세포주에서의 NOS-II 유전자 발현에 미치는 영향을 측정한 결과는, 정상군(Raw 264.7 cell)에서 0.051, 대조군(Raw 264.7 cell + LPS)에서 1, 실험군 1(Raw 264.7 cell + LPS + 시료 100ug/ml)에서 0.325, 실험군 2( Raw 264.7 cell + LPS + 시료 50ug/ml)에서 0.786 이었다.

도 11에 나타나 있듯이, 실시예 2에 따른 시료는 Raw 264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도되는 NOS-II 유전자 발현을 농도 의존적으로 감소시키고 있음을 알 수 있다.

실험예 12. 실시예 2에 따른 시료의 MCP -1 생성에 미치는 영향

12-1. 실험준비

1 × 10⁶cells/㎖의 농도로 분주해 놓은 THP-1 세포(인체단핵세포주)에 시료를 농도별로(100, 50 ㎍/㎖)로 1시간 동안 전 처리한 후 집먼지진드기 (mite) 1 ㎍/㎖을 처리하였다.

THP-1 세포를 24시간 배양한 후 상층액을 모아 MCP-1과 IL-6, 그리고 IL-8을 ELISA kit를 사용하여 측정하였다.

실험예 13?14는 본 실험예 12의 실험준비 과정을 동일하게 수행하였음을 밝혀둔다.

12-2. MCP -1 생성에 미치는 영향

실시예 2의 시료의 THP-1 세포에서의 MCP-1 생성에 미치는 영향을 측정한 결과는, 정상군(THP-1 cells)에서 181.3±22.9, 대조군(THP-1 cells + mite)에서 917.5±35.4, 실험군 1(THP-1 cells + mite + 시료 100ug/ml)에서 596.3±13.9, 실험군 2( THP-1 cells + mite + 시료 50ug/ml)에서 776.9±79.6 이었다.

도 12에 나타나 있듯이, 실시예 2에 따른 시료는 THP-1 세포주에서 집먼지진드기에 의해 유도되는 MCP-1 생성을 감소시키고 있음을 알 수 있다.

실험예 13. 실시예 2에 따른 시료의 IL -6 생성에 미치는 영향

실시예 2의 시료의 THP-1 세포에서의 IL-6 생성에 미치는 영향을 측정한 결과는, 정상군(THP-1 cells)에서 97.8±26.9, 대조군(THP-1 cells + mite)에서 877.8±97.0, 실험군 1(THP-1 cells + mite + 시료 100ug/ml)에서 465.3±102.5, 실험군 2( THP-1 cells + mite + 시료 50ug/ml)에서 761.4±46.9 이었다.

도 13에 나타나 있듯이, 실시예 2에 따른 시료는 THP-1 세포주에서 집먼지진드기에 의해 유도되는 IL-6 생성을 감소시키고 있음을 알 수 있다.

실험예 14. 실시예 2에 따른 시료의 IL -8 생성에 미치는 영향

실시예 2의 시료의 THP-1 세포에서의 IL-8 생성에 미치는 영향을 측정한 결과는, 정상군(THP-1 cells)에서 625.2±181.9, 대조군(THP-1 cells + mite)에서 2840.0±224.5, 실험군 1(THP-1 cells + mite + 시료 100ug/ml)에서 865.4±100.9, 실험군 2( THP-1 cells + mite + 시료 50ug/ml)에서 1210.2±231.5 이었다.

도 14에 나타나 있듯이, 실시예 2에 따른 시료는 THP-1 세포주에서 집먼지진드기에 의해 유도되는 IL-8 생성을 감소시키고 있음을 알 수 있다.

실험예 8?14를 총괄적으로 정리해보면, 실시예 2에 따른 시료는 Raw 264.7 세포주에서 LPS에 의해 유도되는 TNF-α, IL-6, COX2 및 NOS-II의 유전자 발현을 감소시키고 있음을 알 수 있다.

또한 실시예 2에 따른 시료는 THP-1 세포주에서 집먼지진드기에 의해 유도되는 MCP-1, IL-6 및 IL-8 생성을 감소시키고 있음을 알 수 있다.

따라서 실시예 2에 따른 시료는 염증 사이토카인의 유전자 발현 및 염증 사이토카인의 생성을 억제함으로써, 항염증 효과를 보이고 있음을 알 수 있다.

Claims

대황, 목통, 치자, 차전자, 구맥 및 편축을 각각 3?15 중량부, 3?10 중량부, 3?10 중량부, 8 중량부, 8 중량부, 8중량부로 혼합하여 열수 추출한 유효성분을 함유하는 아토피 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서, 공사인, 백두구, 정향, 목향, 건강, 인삼, 당귀, 백복령, 백출, 길경, 진피, 곽향, 육두구, 봉출, 석창포, 시호, 빈랑, 황련, 방풍, 오수유, 후박, 천문동, 지각, 황백, 황기, 천초, 강활, 자원, 향부자, 감초, 소회향, 맥문동, 삼능, 백작약, 육계, 청피를 각각 1?15 중량부로 추가 혼합하여 열수 추출한 유효성분을 함유하는 아토피 치료용 조성물.
공사인, 백두구, 정향, 목향, 건강, 인삼, 당귀, 백복령, 백출, 길경, 진피, 곽향, 육두구, 봉출, 석창포, 시호, 빈랑, 황련, 방풍, 오수유, 후박, 대황, 천문동, 지각, 황백, 황기, 천초, 강활, 자원, 향부자, 감초, 소회향, 목통, 맥문동, 삼능, 백작약, 육계, 치자, 차전자, 구맥, 편축, 청피를 각각 1?15 중량부로 혼합하여 열수 추출한 유효성분을 함유하는 아토피 치료용 조성물.
청구항 1 또는 청구항 3의 조성물을 혼합하여 분말을 형성한 후에 환제로 제조한 아토피 치료제.