KR102110425B1

KR102110425B1 - 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102110425B1
Application number: KR1020190169302A
Authority: KR
Inventors: 김이화; 김용민
Original assignee: 세명대학교 산학협력단
Priority date: 2019-12-17
Filing date: 2019-12-17
Publication date: 2020-05-13

Abstract

본 발명은 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 세포 독성이 없으며, 항산화 성능이 우수하고, NO 생성능을 감소시키며, β-hexosaminidase 억제능이 우수하고, 염증매개물질 발현을 현저히 저해하는 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물{Herbal cosmetic composition having anti-allergic and anti-inflammatory effect}

염증반응은 인체가 항상성 유지하기 위해 외부 자극원에 대한 인체의 방어 기작으로 미생물 유래의 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 외부 자극원과 아라키돈산(arachidonic acid)과 같은 내부 자극원들을 매개로 하여 발생한다.

LPS는 그람 음성박테리아의 세포벽 최외각층에 존재하는 물질로서 병원성 세균과 진핵생물간의 상호작용에 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히LPS는 인체에서 외래물질로 인식되어 세포 방어시스템을 활성화시키고, 이로 인해 면역 방어시스템 중 하나인, 염증유발경로가 활성화된다.

세포가 LPS 등의 외부 자극원에 의해 자극을 받게 되면, iNOS(유도형NO synthas) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현이 유도되고, 이로 인해 염증반응을 매개하는 세포 내 신호 전달 물질인 일산화질소(nitric oxide, NO)와 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE2)을 방출하게 된다. 이렇게 과다 방출된NO 및PGE2로 인해 인체 및 조직에 염증반응이 일어나게 된다.

일반적으로 NO는 생리적인 현상인 혈압조절과 신경전달 매개체로 작용하는 등 정상적인 생리활성의 조절작용을 하는 조절물질이며, 면역반응에 있어서도 중추적인 조절물질 역할을 하고 있다. 하지만, iNOS에 의해 과발현된 NO는 염증반응을 일으키고 면역체계의 이상을 유발한다. 또한, COX-2는 아라키돈산을 프로스타글란딘(PGE2)로 전환시키는 효소로서, COX-2가 과발현하게 되면, PGE2가 과다 생성되어 또 다른 염증유발경로 역할을 하게 된다.

대부분의 염증 질환의 치료제로서 널리 사용되고 있는 제제인 비스테로이드성 소염제(non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDS)는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)라고 하는 아라키돈산(arachidonicacid)로부터 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성에 관여하는 효소 활성을 억제함으로써, 항염증 작용을 나타내는데, 주 치료작용 외에 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기하기므로 장기간의 사용에 있어서 제약이 따르는 실정이다(Rajakariar R et al. 2006).

따라서 부작용이 거의 없어 장기간 사용하는데 무리가 없으면서 항염증 효능에 탁월한 새로운 소염 진통제의 개발이 널리 요구되고 있으며, 이는 최근 천연 자원으로부터의 효능 검증을 통한 소재 개발 연구가 활성화되고 있는 이유이기도 하며, 최근에 천연자원을 이용한 항염 효과가 있는 피부 외용제, 화장품에 대한 인기가 증가하고 있으며, 이러한 부작용 없는 천연 화장품 소재 및 제품에 대한 연구가 증대하고 있다. 특히, 천연 한약재로 알려진 해방풍을 이용한 응용제품이 미비한 실정이다.

대한민국 등록특허 제10-1964809호

이에 본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 세포 독성이 없으며, 항산화 성능이 우수하고, NO 생성능을 감소시키며, β-hexosaminidase 억제능이 우수하고, 염증매개물질 발현을 현저히 저해할 수 있는 한방 화장료 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 해결과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물은 상기 피부상태 개선을 위한 것으로서, 피부상태 개선은 피부 주름 개선, 피부 미백 개선, 피부 보습 개선, 피부 탄력 개선, 안면 처짐 개선, 피부 윤기 개선, 피부 노화 방지, 다크써클 개선 및 피부 각질 개선으로 구성된 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 스킨, 세럼, 로션, 에멀전, 크림, 에센스, 화장수, 파운데이션, 팩, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 스프레이 및 파우더로 구성된 군으로부터 선택된 제형을 갖는다.

발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은, 유효 성분으로서의 상기 복합물 이 외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및/또는 담체를 포함하는 것일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 오일, 파우더 및 스프레이 등으로 제형화 될 수 있으며, 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는, 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 및/또는 산화아연 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 및/또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판 및 부탄, 및/또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 및/또는 유탁화제가 이용될 수 있으며, 예를 들어 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 소르비탄의 지방산 에스테르를 이용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는, 담체 성분으로서 물, 에탄올 및/또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및/또는 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 및/또는 트라칸트 등이 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에 따른 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물은 복령, 택사, 목통, 저령, 치자, 지각 및 차전자 중 적어도 하나의 약재를 포함하는 제1한방 약재를 추출한 제1한방 약재 추출물; 및 백출, 백봉령, 길경, 율피 및 황기를 포함하는 제2한방 약재 중 적어도 하나의 약재를 추출한 제2한방 약재 추출물;을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물에 있어서, 제1한방 약재 추출물은 복령 100중량부를 기준으로, 택사 50~150중량부, 목통 50~150중량부, 저령 50~150중량부, 치자 50~150중량부, 지각 50~150중량부 및 차전자 50~150중량부로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물에 있어서, 제2한방 약재 추출물은 상기 제1한방 약재 추출물 100중량부를 기준으로 10~50중량부인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물에 있어서, 제2한방 약재 추출물은 상기 제1한방 약재 추출물 100중량부를 기준으로 율피 5~10중량부 및 황기 5~10중량부인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물은 2형 비변성 콜라겐을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물은 접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염 또는 건성의 완화, 억제 또는 개선하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물은 복령, 택사, 목통, 저령, 치자, 지각 및 차전자 중 적어도 하나의 약재를 포함하는 제1한방 약재와, 백출, 백봉령, 길경, 율피 및 황기를 포함하는 제2한방 약재를 정량한 후 증류수로 10배 가수하고 heating mantle을 이용하여 1~10시간 동안 가열하여 얻은 추출물을 냉각시킨 후 여과한 다음, 여과액을 감압 농축하여 농축액을 얻은 후 냉각시키고 동결건조한 건조 분말인 것을 특징으로 한다. 그리고 상기 추출물은 열수 추출 이외에도 알코올 등의 용매를 이용하여 추출할 수도 있다.

이상과 같은 구성의 본 발명에 따른 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물에 의하면, 세포 독성이 없으며, 항산화 성능이 우수하고, NO 생성능을 감소시키며, β-hexosaminidase 억제능이 우수하고, 염증매개물질 발현을 현저히 저해할 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

도 1a 내지 도 1d는 각각 탁리십보산, 삼기내탁산, 천금목단피산, 대분청음의 추출물이 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프들이다.
도 2a 내지 도 2f는 각각 길경, 복령, 율피, 백출, 대분청음 및 대분청음 가미방의 추출물이 DPPH 라디칼 소거 시험에 미치는 영향을 나타낸 그래프들이다.
도 3a 내지 도 3f는 길경, 복령, 율피, 백출, 대분청음 및 대분청음 가미방의 추출물이 RAW 264.7 세포에서 세포 생존에 미치는 영향을 나타낸 그래프들이다.
도 4a 내지 도 4f는 길경, 복령, 율피, 백출, 대분청음 및 대분청음 가미방의 추출물이 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 5a 내지 도 5e는 길경, 율피, 백출, 대분청음 및 대분청음 가미방의 추출물이 IgE- 유도된 RBL-2H3 비만 세포에서 β-hexosaminidase 분석에 의한 한방 추출물의 β-hexosaminidase 발현 억제능을 나타낸 그래프들이다.
도 6a 내지 6b는 LPS로 유도 된 RAW 264.7 세포에서 COX-2 및 iNOS mRNA 발현에 대한 길경 추출물의 효과를 나타낸 그래프들이고, 도 6c 및 도 6d는 LPS로 유도 된 RAW 264.7 세포에서 COX-2 및 iNOS mRNA 발현에 대한 율피 추출물의 효과를 나타낸 그래프들이며, 도 6e 및 도 6f는 LPS로 유도 된 RAW 264.7 세포에서 COX-2 및 iNOS mRNA 발현에 대한 대분청음 가미방 추출물의 효과를 나타낸 그래프들이다.
7a 및 7b는 2형비변성콜라겐을 포함한 대분청음가미방에 대한 MTT, NO 실험에 대한 결과를 나타내는 그래프들이고, 7c 내지 7i는 2형비변성콜라겐을 포함한 대분청음 가미 처방 Realtime PCR 결과를 나타내는 그래프들이다.
도 8은 피부 자극 평가 기준을 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명의 실시 예를 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자의 의도 또는 판례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

[실험방법]

1) 시료의 제조

- 건조 한약재를 정량한 후 3차 증류수로 10배 가수하고 heating mantle을 이용하여 4시간 가열하였다. 추출물을 6시간 냉각시킨 후 여과를 진행하였다. 여과액을 감압 농축하여 농축액을 얻은 후 초저온 냉동고에서 24시간 냉각시키고 동결건조기를 이용하여 건조 분말 얻었다.

2) 항산화능 실험

시료의 Free radical 소거 활성은 stable radical인 DPPH에 대한 활성을 측정한 것으로 Methanol에 녹여 사용하였다. 시료를 농도별로 100㎕를 취하여 250μM의 DPPH 용액 100㎕를 넣어 20분간 반응시켰다. 그 후 515nm에서 흡광도를 측정하였다. DPPH에 대한 활성은 아래의 식 1에 따라 계산하였다.

(식 1)

DPPH radical scavenging activity(%) = (1-시료첨가군의 흡광도/시료무첨가군의 흡광도) X 100

3) 항염증 실험

3-1) 세포배양

실험에 사용된 RAW 264.7 세포는 ATCC에서 분양 받아 사용하였다. DMEM 배지에 10% FBS와 1% Penicillin/streptomycin를 첨가하여 사용하였으며, 37℃, 상대습도 90%, 5% CO₂ incubator 배양하여 사용하였다.

3-2) 세포생존율

RAW 264.7 세포를 96 well plate에 5 x 105cells/well의 농도로 분주하고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거하고 FBS가 함유되지 않은 DMEM 배지에 시료를 농도별로 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. MTT solution (5㎎/㎖)을 10㎕씩 첨가하고 4시간 동안 추가 배양하였다. 배지를 제거하고 Dimethyl Sulfoxide (DMSO)를 100㎕을 첨가하고 570nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포생존율은 아래의 식 2에 따라 계산하였다.

(식 2)

세포생존율(%)= (시료첨가군의 흡광도/시료무첨가군의 흡광도) X 100

3-3) NO assay

RAW 264.7 세포를 96 well plate에 5x 105cells/well의 농도로 분주하고 10% FBS가 함유된 DMEM 배지에서 24 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거 하고 DMEM(Serum free)에 시료를 희석하여 LPS에 1㎍/㎖ 농도로 처리하여 다시 24시간 배양하였다. Griess Reagent 시약을 100㎕ 넣은 다음 10분간 반응 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. NO 생성 억제능은 아래의 식 3에 따라 계산하였다.

(식 3)

NO 생성 억제능(%)= (시료첨가군의 O.D. at 540nm/시료무첨가군의 O.D. at 540nm) X 100

4) Real time PCR

mRNA 발현량을 확인하기 위해 6 well plate에 RAW 264.7 세포를 5 x 105cells/well가 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간동안 배양하였다. 그 후 LPS(1㎍/㎖)와 시료를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 Trizol reagent를 사용하여 RNA를 추출하였다. RNA는 diethyl pyrocarbonate 20㎕로 용해하고 Nano Drop 2000으로 정량하였다. Total RNA는 2㎍으로 보정한 후 cDNA 합성 kit를 사용해 cDNA로 합성하였다. cDNA로부터 COX-2, iNOS의 유전자 발현량을 확인하기 위해 Tagman master mix 10㎕, 멸균수 4㎕, primer 1㎕, cDNA 5㎕를 혼합하여 Realtime PCR을 수행하였다.

5) 항알러지 실험(B-hexosaminidase 억제 실험)

100 mm dish 2개에서 90% 배양된 RBL-2H3 cell을 96 well plate에 1×104 cells/well의 조건으로 seeding하여 37℃, CO2 5% incubator에 넣어 24시간 배양하였다. 96 well plate에 세포를 분주하고 24시간이 되면, 배지를 suction system으로 제거해 주고, 1×PIPES Ⅰ buffer 500㎕로 wash 하였다. 2㎍/㎖ Rat anti-DNP-BSA IgE를 배지에 (Final 농도 0.1 ㎍/㎖) 섞어서 각 well에 100㎕씩 처리하고, 37℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 배지를 suction system으로 제거해 주고, 1×PIPES Ⅰ buffer 200㎕로 2~3번 세척하였다. 세척 후 1×PIPES Ⅱ buffer에 sample을 농도 별로 희석하여 각 well에 처리한 후, 37℃에서 20분간 incubation 시켰다. 2㎍/㎖ DNP-BSA를 10㎕(Final 농도 0.1㎍/㎖) 처리하고, 37℃에서 20분간 incubation 시켰다. (Blank에는 처리하지 않음) Ice에 10분간 넣어두어 반응을 정지시켰다. 새로운 96 well plate에 well 당 50㎕씩 넣고, substrate (pNAG)를 50㎕씩 넣은 다음 37℃에서 1시간 incubation 시켰다. Stop buffer를 200㎕씩 넣은 뒤 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

각각의 시료에 대한 저해율은 아래와 같은 식 4를 이용하여 계산하였다.

(식 4)

억제능 (%) = [(C-B)-(T-B)] / (C-B)

[실험결과]

1) 한약재 및 한방처방의 스크리닝

1-1) 한약재 스크리닝

길경, 복령, 율피, 백출, 황기 등의 소재는 동의보감, 방약합편 등의 문헌, 논문을 통하여 스크리닝 하였다.

길경, 복령, 율피, 백출 중 항산화, NO 억제능이 있는 한약재와 황기를 스크리닝 한 한방 처방에 첨가하여 새로운 한방 처방을 만들고자 하였다.

① 길경

- 동의보감 : 성질이 약간 따뜻하며[微溫, 평(平)하다고도 함] 맛이 매우면서 쓰고[辛苦] 독이 약간 있음. 폐기로 숨이 찬 것을 치료하고 기를 내리며 목구멍이 아픈 것과 가슴, 옆구리가 아픈 것을 낫게 함.

- 논문

: Cyclophosphamide 에 의해 유도된 면역 저해 마우스에서 도라지 추출물의 면역기능 조절 효과, 이은별외 14명, 동아시아식생활학회, 29(4), 303~309(2019)

: Lipopolysaccharide로 유도된 RAW264.7 세포에서 발효도라지추출물의 항염증 상승효과 물질 탐색, 송희원외 4명, 한국식품영양학회지, 48(2), 282~289(2019)

: 길경 사포닌 분획의 NO생성과 관련된 면역조절작용을 통한 대식세포의 항암활성에 미치는 효과, 정명근 외1, 한국자원식물학회, 24(5), 557~563(2011)

: 홍도라지 추출물이 마우스에서 분리한 비장세포에서 lipopolysaccharide로 유도된 염증에 미치는 영향, 박은정외 4명, 한국영양학회지, 52(3), 243-249(2019)

② 복령

- 동의보감 : 성질은 평[平]하고 맛은 달고[甘] 폐경, 비경, 심경, 방광경에 작용. 소변을 잘 보게 하고 비를 보하며 담을 삭이고 정신을 안정시킴.

- 논문

: 추출용매 와 부위별 복령의 항산화, 항주름, 항염증평가, 장영아 외 1, 아시안뷰티화장료학술지, 13(3), 377~383(2019)

: 초임계 복령피 추출물의 생리활성 및 경피투과 펩티드를 이용한 경피 약물전달의 응용, 김민기 외 4, 한국응용과학기술학회지, 36(3), 766~778(2019)

: 토복령의 Raw 264.7 세포에 대한 항염 효과, 오성원 외 1, 대한한방내과학회, 30(2), 288~297(2009)

: 복령(Poria cocos) 균사체의 항산화성 및 아질산염 소거작용, 김대곤 외 4, 한국식품영양과학회, 36(6), 1097~1101(2002)

: 혈관내피세포에서 토복령의 항산화 및 항염증 효과, 이창현 외 6, 대한본초학회, 24(3), 39~50(2009)

③ 율피

- 동의보감 : 꿀을 개어 바르면 피부가 수축 됨.

- 논문

: 감초, 연교, 황련, 율피 복합물의 항염증 효능 및 화장료의 안정성 평가, 장영아외 3, 한국미용학회지, 20(5), 827~833(2014)

: 율피추출물에 의한 tyrosinase 억제활성 및 melanin 생성억제효과, 양민진 외 4, 한국환경위생학회지, 25(1), 37~473(1999)

: 블루베리, 상황, 율피, 승미 복합추출물의 화장료 소재로서의 효능, 장영아, 아시안뷰티화장료학회, 15(3), 281~290(2017)

: 율피, 솔잎, 호프의 아세톤 추출물의 항산화 작용, 오승희 외 2, 한국식생활문화학회지, 19(4), 399~406(2004)

④ 백출

- 동의보감 : 성질이 따뜻하고[溫], 맛이 쓰고 달며[苦甘] 독이 없다. 비위를 든든하게 하고 설사를 멎게 하고 습을 없앰. 소화를 시키고 명치 밑이 몹시 그득한 것과 토사곽란으로 토하고 설사하는 것이 멎지 않는 것을 치료함.

- 논문

: 황금, 산조인, 백출추출물의 생리활성, 박찬성 외 1, 대한본초학회지, 23(3), 41~51(2008)

: 약용식물 추출물의 xanthine oxidase 활성저해효과, 도재호 외 4, 한국응용생명과학회지, 62(3), 275~280(2019)

: 황기, 백출 및 오가피의 항산화성 및 미백효과에 관한 연구, 김일출 외 1, 한국응용과학기술학회지, 26(2), 110~116(2009)

: 보중익기탕의 한국, 중국, 일본 처방의 대한 항염증 및 항산화 효과 비교연구, 최혜민 외 2, 한국본초학회지, 29(1), 53~60(2014)

⑤ 황기

- 동의보감 : 성질이 약간 따뜻하고[微溫] 맛은 달며[甘] 독이 없음. 허손증으로 몹시 여윈데 씀. 기를 돕고 살찌게 하며 추웠다 열이 나는 것을 멎게 하고 신이 약해서 귀가 먹은 것을 치료하며 옹저를 없애고 오래된 헌데서 고름을 빨아내며 아픈 것을 멎게 함.

- 논문

: 황기와 몽고황기 추출물의 항산화 활성 및 Nitric oxide 생성능, 이광재 외 7, 한국식품영양과학회지, 40(12), 1793~1796(2011)

: 황기의 메탄올 분획물이 생쥐의 체액성 면역기능에 미치는 영향, 김정훈외 5, 대한약학회, 45(6), 670~676, (2001)

: 황기 에탄올 추출물 및 생물전환 추출물의 항산화, 미백, 항염증 효과에 대한 생리활성, 배혜경 외 1, 아시안부티화장료학?, 15(4), 489~499(2017)

: 황기추출물의 항노화 효과, 김미진 외 3, 대한화장료학회, 33(1), 33~40(2007)

: 산수유, 황기, 감초 추출물의 생리활성, 박찬성 외 2, 대한본초학회지, 23(1), 93~101(2008)

1-2) 한방처방 스크리닝[예비실험]

문헌, 논문을 통해 탁리십보산, 삼기내탁산, 천금목단피산, 대분청음 등의 소재를 선택하여 NO 실험을 통해 스크리닝하였다.

각 소재의 NO 실험 결과는 도 1a 내지 도 1d에 나타내었으며, 4가지 소재 중 대분청음이 가장 NO 억제 활성이 높아 한방 처방 중 대분청음을 한방 처방 소재로 선택하였다.

2) 항산화능

체내에서 일어나는 산화 반응은 노화의 유발 및 세포 변이를 유발하여 암세포를 생성한다고 알려져 있는데 이에 항산화 활성은 체내의 부정적인 반응을 억제하기 위한 것으로 사람들의 관심이 높다. DPPH 라디칼 소거 활성은 항산화제가 안정한 자유라디칼인 DPPH와 반응하면 DPPH를 DPPHH로 환원시키고, 흡광도를 감소시키는 원리를 이용하는, 가장 널리 사용되는 항산화 활성 측정법이다.

도 2a 내지 도 2d에 나타난 바와 같이 시료 중 백출은 125㎍/㎖에서 1,000㎍/㎖ 로 농도가 증가함에 9.40±0.08%에서 65.29±1.50%으로 항산화능이 농도 의존적으로 증가하였고 율피는 125㎍/㎖ l에서 78.49±0.12%, 1,000㎍/㎖ l에서는 83.00±0.82%로 낮은 농도 및 높은 농도에서도 높은 항산화 효과가 있는 것으로 나타났다.

도 2e 및 도 2f를 참조하면, 대분청음과 대분청음 가미방의 항산화능을 측정한 결과 대분청음은 125㎍/㎖에서 1000㎍/㎖으로 증가할수록 78.49±0.12에서 78.49±0.12로 증가하였고 대분청음 가미방은 125㎍/㎖에서 1000㎍/㎖으로 증가할수록 78.49±0.12에서 78.49±0.12로 증가하였다.

3) 항염실험(NO)

3-1) MTT

길경, 복령, 율피, 백출의 RAW 264.7 cell 에서의 세포 생존율을 확인하였다. 그 결과는 도 3a 내지 도 3d에 나타내었다. 도 3a 내지 도 3d에 나타난 바와 같이 길경, 복령, 율피, 백출 모두 1,000㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.

그리고 도 3e 및 도 3f에 나타난 바와 같이 대분청음, 대분청음 가미방 모두 1,000㎍/㎖ 이하의 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 나타났다.

3-2) 항염실험(NO)

NO(Nitric Oxide)는 혈액응고 및 혈압조절 기능, 암세포에 대한 면역 기능 등에 중요한 역할을 하지만 ROS처럼 산화되어 활성 NO로 변화된다. 이는 단백질 및 지질의 과산화를 유도하고 세포독성을 야기하는 강력한 산화제인 peroxynitrite (ONOO^-)를 생산한다. 염증성 매개 물질에 노출된 세포에 의해서 생성된 NO의 증가는 NO가 생체 방어와 자유기에 의해 유발된 조직 손상에 기여한다고 알려져 있으며 다양한 염증성 질환시 증가된다. NO 활성도는 대사산물인 nitrate (NO₃ ^-)와 nitrite (NO₂ ^-)의 생성 농도를 확인할 수 있으며 이를 그리스 반응 (Griess reaction)을 통해 확인한다. 질산환원효소를 이용하여 NO₃ ^-를 NO₂ ^-로 환원 시키고 Griess 시약을 이용한 발색반응으로 NO₂ ^-의 농도를 측정할 수 있다.

RAW 264.7 cell에 길경, 복령, 율피, 백출을 농도별로 처리하여 NO 생성 억제 효과를 측정하였다. 도 4a 내지 도 4d에 나타난 바와 같이 길경 추출물은 1,000㎍/㎖에서 65.07±1.86%로 NO 생성을 억제하였고 율피는 추출의 농도별로 94.19 ± 3.02%, 90.16±3.71 %, 87.07 ± 1.80%, 71.62 ± 3.67% 및 46.32 ± 4.17%으로 LPS(1㎍/㎖)만 처리한 세포에 비해 NO의 생성능이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.

도 4e 및 도 4f에 나타난 바와 같이 대분청음은 시료 농도가 62.5㎍/㎖ l에서 1,000㎍/㎖로 증가할수록 81.25±7.14%에서 59.31±6.95%로, 대분청음 가미방은 62.5㎍/㎖에서 1,000㎍/㎖로 증가할수록 95.78±3.79%에서 54.83±2.18%로 농도가 증가할수록 농도 의존적으로 NO 생성능이 감소하는 것을 확인하였다.

4) β-hexosaminidase 억제능

길경, 율피, 백출, 대분청음 및 대분청음 가미방을 농도별로 β-hexosaminidase assay를 진행하였다. 도 5b에 나타난 바와 같이 율피가 125㎍/㎖에서 1,000㎍/㎖로 농도가 증가할수록 117.41±1.54에서 134.82 ± 0.77%로 저해율이 증가하였으며, 도 5e에 나타난 바와 같이 대분청음 가미방이 500㎍/㎖에서 1,000㎍/㎖에서 농도가 증가할수록 112.85 ± 4.047, 118.45 ± 5.66%으로 β-hexosaminidase 저해율이 증가하는 것을 확인하였다.

5) Realtime PCR

iNOS는 염증 등의 자극에 의해서 활성화된 대식세포에서 유래하고 NF-κB에 의해 활성화 된다. COX는 arachidonic acid를 prostaglandins로 전환하는 효소로 COX-1과 COX-2로 구분된다. COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽 보호, 신장 기능의 유지 등 정상적인 생체 기능에 작용하고, COX-2는 염증 등의 자극에 의해 발현되며 따라서 COX-2에 의해 생성된 prostaglandin이 염증 반응과 세포 증식에 관여한다고 알려져 있다. RAW 264.7 cell에서의 iNOS, COX-2 발현 억제 효과를 확인하기 위해 realtime PCR 분석을 진행하였다.

Realtime PCR 결과 도 6a 내지 6f를 참조하면 iNOS의 발현 억제는 NO의 생성 억제와 유사한 경향을 보였으며, NO의 생성 억제는 iNOS의 발현 저해에 기인하여 나타난 것임을 알 수 있었다. COX-2 및 iNOS의 발현 또한 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하여 각각의 한약재 및 대분청음가미방이 염증매개물질 발현 저해를 통해 항염증 효능을 나타내었다.

이하에서는, 본 발명에 따른 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물에 대한 보다 바람직한 실시예를 살펴본다.

본 실시예에 따른 제1한방 약재 추출물은 복령 100중량부를 기준으로, 택사 80~90중량부, 목통 80~90중량부, 저령 80~90중량부, 치자 80~90중량부, 지각 80~90중량부 및 차전자 80~90중량부를 열수 추출하여 수득하며, 제2한방 약재 추출물은 상기 제1한방 약재 추출물 100중량부를 기준으로 율피 5~10중량부 및 황기 5~10중량부를 열수 추출하여 수득하여 얻어지고, 제1한방 약재 추출물 100중량부를 기준으로 2형 비변성 콜라겐 10~30중량부를 포함한다.

[실험예 1] 2형비변성콜라겐을 포함한 대분청음가미방에 대한 MTT, NO 실험

7a 및 7b는 2형비변성콜라겐을 포함한 대분청음가미방에 대한 MTT, NO 실험에 대한 결과를 나타내는 그래프들이다.

7a 및 7b를 참조하면, 2형비변성 콜라겐을 첨가한 대분청분가미 처방의 세포생존율을 측정하여 1000ug/ml 이하의 농도에서 독성이 없는 것을 확인하였다. 그리고 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성에 대한 2형 비변성 콜라겐을 첨가한 대분청음가미 처방의 저해 효과를 측정한 결과, LPS 처리군에 비하여 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.

[실험예 2] 2형비변성콜라겐을 포함한 대분청음 가미 처방 Realtime PCR 결과

7c 내지 7i는 2형비변성콜라겐을 포함한 대분청음 가미 처방 Realtime PCR 결과를 나타내는 그래프들이다.

7c 내지 7i를 참조하면, 2형 콜라겐을 포함한 대분청음가미처방을 이용하여 LPS로 유도된 RAW 264.7 대식세포에서 갖는 TNF-α,COX-2, iNOS, IL-1α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현을 분석하였다.

유전자의 발현은 LPS 처리군과 비교하였을 때 COX-2, iNOS, IL-6, NF-kB가 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인하였다.

이하에서는 본 발명의 실시예 1의 화장료 조성물을 포함하는 각각의 화장품을 제조하여 인체적용시험을 하였다.

[인체적용시험 1]

1. 시험방법

화장품의 일차 피부 자극 반응을 평가하는 단회첩포시험은 연구자의 성향이나 시험 물질의 특성에 따라 24시간 혹은 28시간 첩포 중에서 선택하여 시험할 수 있으며, 인체적용시험의 경우 24시간 패치 이후 3차에 걸친 판독과정으로 자극 반응을 평가하였다.

24시간 패치의 경우 일반적으로 2회 판독을 실시하나 본 시험의 경우 반응의 강도 추이를 반복적이고 지속적으로 관찰하여 acute & delayed type의 자극과 감작을 평가함으로 단회첩포시험이 가지는 기술적 한계를 극복하기 위해 3회 판독을 선택하여 평가하였다. 본 시험에 사용된 방법은 단회밀폐첩포시험으로 피부 자극 반응을 유발하는 패치부탁단계와, 피부 자극 및 감작을 전문가에 의한 육안 평가 단계로 구분하여 시험을 시행하였다. 그리고 시험 대상자는 선정기준에 적합한 30명을 선정하여 시험하였다.

2. 측정 결과

시험 제품에 의한 평균 피부 자극 지수

평가기준에 따라 평가 후 평균 자극 지수를 계산식에 따라 계산하고 판정 기준에 다라 피부 자극 강도를 평가하였다.

제품에 따른 safety zone, 시험 대상자 20% 초과 빈도로 자극 유발 제품, 매회 판독 시 +2 이상 자극 반응이 총 시험 대상자의 10% 이상에서 관찰되는 시험 제품 등 3가지 기준에 따라 최종 피부 자극 유발 여부를 판정하여 제품의 적부를 최종적으로 예측하여 표 4에 나타내었다.

본 인체적용시험 결과 세명대학교에서 의뢰한 "항염 미스트"의 경우 패치 제거 후 30분, 24시간, 48시간 모두에서 자극이 관찰되지 않았다. 평균 피부반응도는 0.00으로 피부 첩포시험의 판정기준에 따라 "항염 미스트"는 무자극으로 판정하였다.

[인체적용시험 2]

1. 시험방법

2. 측정 결과

시험 제품에 의한 평균 피부 자극 지수

제품에 따른 safety zone, 시험 대상자 20% 초과 빈도로 자극 유발 제품, 매회 판독 시 +2 이상 자극 반응이 총 시험 대상자의 10% 이상에서 관찰되는 시험 제품 등 3가지 기준에 따라 최종 피부 자극 유발 여부를 판정하여 제품의 적부를 최종적으로 예측하여 아래 표 8에 나타내었다.

본 인체적용시험 결과 세명대학교에서 의뢰한 "항염 에센스"의 경우 패치 제거 후 30분, 24시간, 48시간 모두에서 자극이 관찰되지 않았다. 평균 피부반응도는 0.00으로 피부 첩포시험의 판정기준에 따라 "항염 에센스"는 무자극으로 판정하였다.

[인체적용시험 3]

1. 시험방법

2. 측정 결과

시험 제품에 의한 평균 피부 자극 지수

제품에 따른 safety zone, 시험 대상자 20% 초과 빈도로 자극 유발 제품, 매회 판독 시 +2 이상 자극 반응이 총 시험 대상자의 10% 이상에서 관찰되는 시험 제품 등 3가지 기준에 따라 최종 피부 자극 유발 여부를 판정하여 제품의 적부를 최종적으로 예측하여 아래 표 12에 나타내었다.

본 인체적용시험 결과 세명대학교에서 의뢰한 "항염 크림"의 경우 패치 제거 후 30분, 24시간, 48시간 모두에서 자극이 관찰되지 않았다. 평균 피부반응도는 0.00으로 피부 첩포시험의 판정기준에 따라 "항염 크림"은 무자극으로 판정하였다.

본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

복령 100중량부를 기준으로, 택사 80~90중량부, 목통 80~90중량부, 저령 80~90중량부, 치자 80~90중량부, 지각 80~90중량부 및 차전자 80~90중량부를 열수 추출한 제1한방 약재 추출물;
상기 제1한방 약재 추출물 100중량부를 기준으로, 율피 5~10중량부 및 황기 5~10중량부를 열수 추출한 제2한방 약재 추출물; 및
상기 제1한방 약재 추출물 100중량부를 기준으로, 2형 비변성 콜라겐 10~30중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 한방 화장료 조성물은
접촉성 피부염, 알레르기성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염 또는 건성의 완화, 억제 또는 개선하는 것을 특징으로 하는 항알레르기 및 항염증 효과를 갖는 한방 화장료 조성물.