JP2012528893A

JP2012528893A - アトピー治療用組成物

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Inventors: ヨンウォンソン
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Abstract

【課題】大黄、木通、梔子、車前子、ナデシコ及びニワヤナギをそれぞれ３〜１５重量部、３〜１０重量部、３〜１０重量部、８重量部、８重量部、８重量部で混合して熱水抽出した有効性分を含有するアトピー治療用組成物を提供する。
【解決手段】本発明のアトピー治療用組成物は、シュクシャ、白豆蒄、丁香、木香、乾薑、高麗人参、當歸、百茯苓、白朮、桔梗、陳皮、カッコウ、肉豆蒄、莪朮、石菖蒲、柴胡、檳榔、黄蓮、ボウフウ、呉茱萸、厚朴、大黄、天門冬、枳殼、黄柏、黄蓍、川椒、チョウセンオニウド、紫苑、香附子、甘草、小茴香、木通、麦門冬、三陵、白芍薬、肉桂、梔子、車前子、ナデシコ、ニワヤナギ、青皮をそれぞれ１〜１５重量部で混合して熱水抽出した有効性分を含有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、大黄、木通、梔子、車前子、ナデシコ及びニワヤナギをそれぞれ３〜１５重量部、３〜１０重量部、３〜１０重量部、８重量部、８重量部、８重量部で混合して熱水抽出した有効性分を含有するアトピー治療用組成物に関するものである。

本発明は、シュクシャ、白豆蒄、丁香、木香、乾薑、高麗人参、當歸、百茯苓、白朮、桔梗、陳皮、カッコウ、肉豆蒄、莪朮、石菖蒲、柴胡、檳榔、黄蓮、ボウフウ、呉茱萸、厚朴、大黄、天門冬、枳殼、黄柏、黄蓍、川椒、チョウセンオニウド、紫苑、香附子、甘草、小茴香、木通、麦門冬、三陵、白芍薬、肉桂、梔子、車前子、ナデシコ、ニワヤナギ、青皮をそれぞれ１〜１５重量部で混合して熱水抽出した有効性分を含有するアトピー治療用組成物に関するものである。

一般的に、皮膚疾患の範囲にはアトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状湿疹、苔蘚、うっ滞性皮膚炎、異汗性湿疹、皮脂欠乏性湿疹及び自家感作性湿疹などが含まれる。

このような皮膚疾患の発病原因はまだはっきりと知られていない状態であり、その日常症状も皮膚乾燥症、湿疹などと多様に現れるために発病原因がある一つだけで説明することができない。

すなわち環境的な要因と遺伝的な素因、免疫学的反応及び皮膚保護膜の異常などを主要な原因とみることができる。大きく見ると、外因性刺激物及び／または内因性分泌物によって皮膚疾患が発生すると見られる。

まず、外因性刺激物としては、産業化による媒煙など環境公害、西洋式住居形態によるカーペット、ベッド、ソファーの使用増加及び室内温度の上昇によるほこり、家ダニなどのアレルギーを起こす原因物質（アレルゲン）などを挙げることができる。

内因性分泌物の場合には、代表に自家免疫性過敏反応によって発生する各種物質により皮膚疾患、特にアトピー性皮膚炎などが発生することを挙げることができる。

具体的にみると、体内炎症過程においては誘導性ＮＯＳ（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅＮＯｓｙｎｔｈａｓｅ、ｉＮＯＳ、ＮＯＳ−ＩＩ）及びＣＯＸ２（ｃｙｃｌｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ２）により過量のＮＯ（ｎｉｔｒｉｃｏｘｉｄｅ）及びＰＧＥ_２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎＥ_２）などの炎症因子が形成される。

ここで、ＮＯＳ−ＩＩはＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）及び多様な炎症誘導サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ）に露出される場合に発現し、ＮＯＳの種類のうちでＮＯＳ−ＩＩによるＮＯ生成が絶対的に多く、病理学的に重要な作用をすると知られている。

ところが外因性刺激物や内因性分泌物のうち、いずれかによるアトピー性皮膚炎の場合でもかゆい皮膚を掻くことによって皮膚の障壁機能が破壊されて各種刺激物が容易に侵入することによって、さらに悪化する過程を体験する。

すなわち皮膚角質化細胞から分泌する蛋白質に対して免疫グロブリン（ＩｇＥ、ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎＥ）が作用して自家免疫性過敏反応を起こして皮膚疾患を悪化させるという点である。

具体的にみると、皮膚に存在するランゲルハンス細胞（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓｃｅｌｌ）は外部から侵入した抗原に対してＩｇＥと受容体ＦｃＲＩが共に結合するようになると、ＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎ１）及びインターロイキン−１６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１６）を分泌するようになる。

またランゲルハンス細胞は抗原をＴ−細胞に伝達してＴｈ２（ｈｅｌｐｅｒＴｃｅｌｌ２）の増殖を誘発するようになる。

Ｔｈ２により単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅ）が皮膚に集結し、単球は分化して炎症性樹枝状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌｓ、ＩＤＥＣ）に変わるようになる。この樹枝状細胞が炎症性サイトカインのＴＮＦ−α、ＩＬ-１（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）及びＩＬ−６を過剰分泌することによって、皮膚疾患が悪化する過程を体験するようになる。

ここで、ＩＬ−１ファミリーにはＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡが含まれ、ＩＬ−１αは前駆体にも生物活性があるが、ＩＬ−１βは成熟体にだけ生物活性があると知られている。

一方、従来にはアトピー性皮膚炎などの皮膚疾患に対する治療法として免疫抑制剤と生体反応調節物質などを開発する方向で研究が進行されてきた。免疫抑制剤としてはステロイド系列があり、生体反応調節物質としてはＩＦＮ−γ、抗ヒスタミンなどが代表的である。

しかし、これらの物質は消炎作用が迅速であるが、使用を中止する時は症状が悪化したり皮膚免疫系を遮断するためにかえって細菌感染の危険を増加させ、長期間使用することができない。よって、これに代替することができる補完製品の必要性が切実な実情である。

一方、天産物を利用した先行技術に対して検討してみると、まず、特許文献１にはナガバギシギシ、楡根皮、地黄、當歸、紫蘇を含む天然成分のアトピー治療剤が開示されている。

第二に、特許文献２にはかゆみの緩和効果を示すゴボウ、コブシ、あざみ、ウコン、五味子の混合抽出物が記載されている

第三に、特許文献３にはアトピー性皮膚疾患治療用特殊漢方組成物及びその製造工法に関する金銀花（スイカズラ）を含むドクダミ、當歸、モグサ、センキュウ、新鮮草、エンジュ、松芽、ハッカ、緑豆、アンズ種、松脂、メシマコブ、ショウガ、玄蔘、アワ、ヒエ、緑茶、金せん花、桔梗、黒豆の組成物が記載されている。

第四に、特許文献４にはアトピー性皮膚炎の予防効果を有する組成物に金銀花（スイカズラ）、當歸、浮き草、ヒソップ、金せん花、アロエ、コガネバナの混合抽出物が記載されている。

韓国特許公開第２００６−００５８５３０号公報韓国特許公開第２００７−００９５５８８号公報韓国特許公開第２００６−００７４０３８号公報

本発明の目的は、副作用を伴うことなく、持続的に服用することによって、アトピー皮膚炎を改善及び治療するための組成物を提供することにある。

前述の目的を達成するために、本発明は大黄、木通、梔子、車前子、ナデシコ及びニワヤナギをそれぞれ３〜１５重量部、３〜１０重量部、３〜１０重量部、８重量部、８重量部、８重量部で混合して熱水抽出した有効性分を含有するアトピー治療用組成物を提供する。

ここで、シュクシャ、白豆蒄、丁香、木香、乾薑、高麗人参、當歸、百茯苓、白朮、桔梗、陳皮、カッコウ、肉豆蒄、莪朮、石菖蒲、柴胡、檳榔、黄蓮、ボウフウ、呉茱萸、厚朴、大黄、天門冬、枳殼、黄柏、黄蓍、川椒、チョウセンオニウド、紫苑、香附子、甘草、小茴香、木通、麦門冬、三陵、白芍薬、肉桂、梔子、車前子、ナデシコ、ニワヤナギ、青皮をそれぞれ１〜１５重量部で混合して熱水抽出した有効性分を含有することが好ましい。

本発明のアトピー治療用組成物は、副作用を伴うことなく、持続的に服用することによって、アトピー皮膚炎を改善及び治療できる顕著な効果を保有している。

実施例１に係る試料の細胞毒性を実験した結果を示す図面である。実施例１に係る試料のＤＰＰＨ消去能を実験した結果を示す図面である。実施例１に係る試料のＮＯ生成抑制を実験した結果を示す図面である。実施例１に係る試料のＩＬ−１β生成に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。実施例１に係る試料のＩＬ−６生成に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。実施例１に係る試料のＭＣＰ−１生成に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。実施例１に係る試料のＴＮＦ−α生成に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。実施例２に係る試料のＴＮＦ−α遺伝子発現に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。実施例２に係る試料のＩＬ−６遺伝子発現に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。実施例２に係る試料のＣＯＸ２遺伝子発現に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。実施例２に係る試料のＮＯＳ−II遺伝子発現に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。実施例２に係る試料のＭＣＰ−１生成に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。実施例２に係る試料のＩＬ−６生成に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。実施例２に係る試料のＩＬ−８生成に及ぼす影響を実験した結果を示す図面である。

本明細書に記載された実施例及び図面に示された構成は、本発明の最も望ましい一実施例に過ぎず、本発明の技術的な思想のすべてを代弁するものではないため、本出願の時点においてこれらに代替できる多様な均等物及び変形例があり得ることを理解せねばならない。

アトピー治療用組成物の製造
１−１．組成物の製造背景
本出願人はアトピー疾患を漢方医学的観点で解析して治療用組成物を案出し、組成物の主要成分として大黄、木通、梔子、車前子、ナデシコ及びニワヤナギを使用する。以下、こてについて説明する。

しばしば、アトピーは胎熱とも呼ばれ、アトピー皮膚炎患者は共通的に体に熱が多いことが分かる。

その原因としては血に熱毒が蓄積されたと見ることができ、アトピー皮膚炎に同伴される症状である便泌、鼻炎、アレルギー、喘息などの症状もやはり熱毒から生じる症状である点を挙げられる。

第一に、大黄、木通、梔子は小腸及び大腸の熱により塞がった気運を疎通させる機能を行う。

すなわち、木に比喩すると、小根の役割を人体では小腸、大腸が行うが、アトピー患者らは便秘症状を同伴する場合が多く、これは小腸、大腸の気運が停滞して起こる症状であるとみることができる。

第二に、車前子、ニワヤナギ、梔子、ナデシコは膀胱の気を疎通させることによって、人体内の毒素を除去する機能を行う。

すなわち、膀胱は単純に小便排出用臟器ではなく、人体で最も下に位置して体の全体を融合させる重要な臟器として、人間の体温を調節する機能する。

これは男性の場合、前立腺や膀胱に熱や気が停滞していると、温度調節が容易ではないという点からも分かる。

１−２．アトピー治療用組成物の製造
本実施例１に使用するアトピー治療用組成物を製造するために、大黄３〜１５ｇ、木通３〜１０ｇ、梔子３〜１０ｇ、車前子８ｇ、ナデシコ８ｇ、ニワヤナギ８ｇを水１Ｌで２〜４時間加熱して抽出液を得た。

抽出液をろ過した後凍結乾燥して抽出物粉末を製造した。

ここで、抽出液のろ過過程はガーゼ及び／またはろ過紙（ｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒ）を利用し、濃縮したものに水を加えて凍結乾燥した。

前述のような過程を繰り返して、アトピー治療用組成物の抽出物試料を得て、試料を冷凍高に保管しながら使用した。

アトピー治療用組成物の製造
２−１．組成物の製造背景
まず、実施例１の組成物が熱毒を除去することに焦点を合せたものであれば、実施例２は熱毒を除去することは勿論、五臓六腑の均衡を合せる点に重点をおいて造成した点を予め明らかにする。

第一に、シュクシャ、白豆蒄、白朮、陳皮、カッコウ、檳榔、厚朴、乾薑、枳殼、白芍薬は低下した食欲を高めて胃腸及び消化力を高める機能を行う。

アトピー皮膚炎患者は胃腸や消火器に熱が多いため、食欲が低下し、食物のにおいをかぐことさえ嫌うので、脾胃の機能を向上させて食欲を増進させる。

第二に、木香、當歸、柴胡、三陵、莪朮、白芍薬、青皮、香附子は肝の怒りを下げ散在した肝の気運を引き上げる機能を行う。

アトピー皮膚炎患者は血に熱毒が蓄積されて生じる病気であるため、肝に多くのストレスが与えられ、疲れがちであるので、肝の機能を増進させる。

第三に、丁香、高麗人参、乾薑、當歸、香附子、ボウフウ、呉茱萸は冷たくなって消化吸収が機能が低下した腹の中を温める。

アトピー皮膚炎患者は一様に一般人達より体の全体で熱が多く発生するが、腹の中はその反対に冷たい。

したがって、腹の中を暖かくして食物の消化吸収を助け、胃や肝に負担を減らして生血、補血、退熱する。

第四に、黄蓮、梔子、ボウフウ、大黄、チョウセンオニウド、木通、肉豆蒄は小腸、大腸の熱により塞がった気運を疎通させる。

第五に、天門冬、黄蓍、紫苑、白芍薬、百茯苓、高麗人参、川椒、桔梗は人体中の皮膚を管掌する肺を潤沢にする。

かゆみにより掻いて傷が生じた皮膚に活性度を高め、皮膚表面にある熱も除去することによってかゆみを克服するようにする。

第六に、麦門冬、石菖蒲、肉桂、黄柏、小茴香は心臓、腎臓を保護して肝の清血、生血、補血を心臓、腎臓にさせるようにする。

第七に、車前子、ニワヤナギ、梔子、ナデシコを利用して膀胱の気を疎通させて人体内の毒素を除去する。

第八に、甘草を使用して各原料を調和させて強化になるようにし、薬毒を体に良いように解毒するようにする。

２−２．アトピー治療用組成物の製造
本実施例２に使用するアトピー治療用組成物を製造するために、シュクシャ、白豆蒄、丁香、木香、乾薑、高麗人参、當歸、百茯苓、白朮、桔梗、陳皮、カッコウ、肉豆蒄、莪朮、石菖蒲、柴胡、檳榔、黄蓮、ボウフウ、呉茱萸、厚朴、大黄、天門冬、枳殼、黄柏、黄蓍、川椒、チョウセンオニウド、紫苑、香附子、甘草、小茴香、木通、麦門冬、三陵、白芍薬、肉桂、梔子、車前子、ナデシコ、ニワヤナギ、青皮をそれぞれ１〜１５ｇずつ水１Ｌで２〜４時間加熱して抽出液を得た。

抽出液のろ過、粉末製造及び試料保管、獲得過程などは実施例１と同一に処理した。

一方、本実施例２の一例として、実施例１に使用したアトピー治療用組成物の構成である大黄３〜１５ｇ、木通３〜１０ｇ、梔子３〜１０ｇ、車前子８ｇ、ナデシコ８ｇ、ニワヤナギ８ｇに、シュクシャ、白豆蒄、丁香、木香、乾薑、高麗人参、當歸、百茯苓、白朮、桔梗、陳皮、カッコウ、肉豆蒄、莪朮、石菖蒲、柴胡、檳榔、黄蓮、ボウフウ、呉茱萸、厚朴、天門冬、枳殼、黄柏、黄蓍、川椒、チョウセンオニウド、紫苑、香附子、甘草、小茴香、麦門冬、三陵、白芍薬、肉桂、青皮をそれぞれ１〜１５ｇずつ混合して抽出する構成も可能であることを明らかにする。

アトピー治療用丸剤の製造
３−１．実施例１の造成比率を利用した丸剤の製造
実施例１に係るアトピー治療用組成物の大黄、木通、梔子、車前子、ナデシコ及びニワヤナギをそれぞれ粉砕して９０メッシュないし１２０メッシュの粉末を製造し、それぞれ３〜１５重量部、３〜１０重量部、３〜１０重量部、８重量部、８重量部、８重量部で混合し、練って直径０．３〜０．５ｃｍサイズの丸剤（錠剤）を製造した。

または大黄、木通、梔子、車前子、ナデシコ及びニワヤナギをそれぞれ３〜１５重量部、３〜１０重量部、３〜１０重量部、８重量部、８重量部、８重量部で混合した後に、粉砕して９０メッシュないし１２０メッシュの粉末を製造し、練って直径０．３〜０．５ｃｍサイズの丸剤（錠剤）を製造した。

ここで、粉末を練って丸を製造するために、コメ１０〜１５重量部及び水１０〜１５重量部でお粥を作った後に、前記原料粉末と共に混合し、練り、乾燥して丸を製造した。

３−２．実施例２の組成物を利用した丸剤の製造
実施例２に係るアトピー治療用組成物であるシュクシャ、白豆蒄、丁香、木香、乾薑、高麗人参、當歸、百茯苓、白朮、桔梗、陳皮、カッコウ、肉豆蒄、莪朮、石菖蒲、柴胡、檳榔、黄蓮、ボウフウ、呉茱萸、厚朴、大黄、天門冬、枳殼、黄柏、黄蓍、川椒、チョウセンオニウド、紫苑、香附子、甘草、小茴香、木通、麦門冬、三陵、白芍薬、肉桂、梔子、車前子、ナデシコ、ニワヤナギ、青皮をそれぞれ粉砕して９０メッシュないし１２０メッシュの粉末を製造し、それぞれ１〜１５重量部で混合し、練って直径０．３〜０．５ｃｍサイズの丸剤（錠剤）を製造した。

またはシュクシャ、白豆蒄、丁香、木香、乾薑、高麗人参、當歸、百茯苓、白朮、桔梗、陳皮、カッコウ、肉豆蒄、莪朮、石菖蒲、柴胡、檳榔、黄蓮、ボウフウ、呉茱萸、厚朴、大黄、天門冬、枳殼、黄柏、黄蓍、川椒、チョウセンオニウド、紫苑、香附子、甘草、小茴香、木通、麦門冬、三陵、白芍薬、肉桂、梔子、車前子、ナデシコ、ニワヤナギ、青皮をそれぞれ１〜１５重量部で混合した後に、粉砕して９０メッシュないし１２０メッシュの粉末を製造し、練って直径０．３〜０．５ｃｍサイズの丸剤（錠剤）を製造した。

［参考例１］
アトピー皮膚炎患者の服用例
１−１．実施例１の組成物及び実施例３−１の丸剤の服用例
まず、実施例１〜３に係る組成物及び丸剤は経口で投与し、組成物の投与量は患者の年齢、性別、体重、アトピー皮膚炎の程度によって適切な量を調節することを明らかにする。

また実施例１〜３に係る組成物及び丸剤の投与期間は２〜６ケ月程度の時間が必要である。

５才以下の患者は液体状態で服用するのが容易であり、１日に３回服用する。このとき食後３０分に５０ｃｃ程度服用し、５才以上の患者は１００ｃｃ程度服用することが好ましい。

丸剤は５〜１０才は７丸、１０〜１５才は１５丸、１５才以上は１８丸を服用することが好ましく、錠剤の薬は食後３０分に水で服用することが好ましい。幼い患者の場合苦味を緩和させる必要があるときは、砂糖や蜂蜜を混ぜて服用する。

１−２．実施例２の組成物及び実施例３−２の丸剤の服用例
５才以下の患者は液体状態で服用するのが容易であり、１日に３回服用する。このとき食後３０分に１２０ｃｃ程度服用し、５才以上の患者は２００ｃｃ程度服用することが好ましい。

丸剤は５〜１０才は３０丸、１０〜１５才は４０丸、１５才以上は５０丸を服用することが好ましい。

［実験例１］
実施例１に係る試料の細胞の毒性実験
１−１．試料準備
実施例１に係るアトピー治療用組成物の抽出物粉末（実験過程でＳｏｎｇ１−２として命名した）１００ｍｇを滅菌蒸溜水１０ｍｌに溶かした後、フィルターして使用した。

実験例２〜７の試料は本実験例１の試料準備過程を同一に行って獲得したことを明らかにする。

１−２．細胞の毒性実験
Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌｓは９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓに１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに分注して２４時間培養した後、試料をそれぞれ２５、５０、１００、２００mｇ／ｍｌの濃度で処理し、２４時間培養した。培養後、１０mｌのＷＳＴ溶液を添加した後ＣＯ_２培養器（３７℃、５％ＣＯ_２）で３０分反応させた後、４５０ｎｍで吸光度の変化を測定して対照群に対する細胞生存率を百分率で表示した。

図１に示したように、Ｒａｗ２６４．７細胞株で実施例１に係る試料は細胞毒性が現れなかったことが分かる。

１−３．統計処理
実験結果はＳＰＳＳ１１．０のｕｎｐａｉｒｅｄｓｔｕｄｅｎｔ’ｓＴ−ｔｅｓｔを使用して統計処理し、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１及びＰ＜０．００１水準で留意性を検定した。

実験例２〜１４の統計処理は本実験例１の統計処理方法を同一に適用したことを明らかにする。
［実験例２］
実施例１に係る試料のＤＰＰＨ消去能実験
自由ラジカル消去活性試験は安定な自由ラジカルＤＰＰＨを使用する方法で、エタノールに溶解させた０．２ｍＭのＤＰＰＨ溶液１５０mｌと試料（２５、５０、１００、２００、４００、８００mｇ／ｍｌ）１００mｌをそれぞれ混合し、３７℃で３０分間反応させた後、５１７ｎｍで吸光度を測定した。対照群は試料液の代わりに蒸溜水を入れ、ＤＰｐＨ溶液の代わりにエタノールを入れて補正値を得た。自由ラジカル消去率は下記の数式１によって計算し、その結果は自由ラジカルを５０％消去できる濃度（ＩＣ５０）で示した。

（数１）
消去率（％）=｛（対照群の吸光度−試料添加群の吸光度）／対照群の吸光度｝´１００
・・・（１）

図２に示したように、Ｒａｗ２６４．７細胞株において、実施例１に係る試料は、濃度依存した傾向で消去能が高く現れ、実施例１に係る試料が抗酸化効果を見せていることが分かる。
［実験例３］
実施例１に係る試料のＮＯ生成抑制実験
Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌｓは９６ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓに１０^４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌに分注して２４時間培養した後、試料それぞれの濃度２５、５０、１００、２００mｇ／ｍｌで処理し、ＬＰＳ１mｇ／ｍｌを処理し、また２４時間培養した。Ｎ１バッファーを５０mｌを各ｗｅｌｌに処理した後、１０分間常温で暗所反応後、Ｎ２バッファー５０mｌを各ｗｅｌｌに処理し、１０分間反応させた後、５４０ｎｍで吸光度を測定した。Ｎｉｔｒｉｔｅｓｔａｎｄａｒｄの濃度別標準曲線を利用して培養液のＮＯ濃度を決定した。

グラム陰性桿菌の細胞外膜に存在するＬＰＳ（ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）というＲａｗ２６４．７のような大食細胞（Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）または単球（ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ）でＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ−α）、ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＩＬ−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１β）のような炎症誘導サイトカインを増加させることと知られている。

図３に示したように、Ｒａｗ２６４．７細胞株で実施例１に係る試料は、濃度依存した傾向でＬＰＳにより誘導される総ＮＯの生成が減少しており、実施例１に係る試料が抗炎症効果を見せていることが分かる。

［実験例４］
実施例１に係る試料のＩＬ−１β生成に及ぼす影響
Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌｓを６ｗｅｌｌｐｌａｔｅｓに３´１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるように分注し、２４時間培養した後、試料をそれぞれ２５、５０、１００、２００mｇ／ｍｌの濃度で処理し、ＬＰＳ１mｇ／ｍｌを処理した。２４時間培養した後細胞培養液を回収して培養液に含まれていたＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＴＮＦ−αをｃｕｓｔｏｍ-ｍａｄｅ４−ｐｌｅｘｃｙｔｏｋｉｎｅＭｉｌｌｉｐｌｅｘｐａｎｅｌを利用して測定した。分析はＭｉｌｌｉｐｌｅｘａｎａｌｙｓｔを通じて行った。

図４に示したように、Ｒａｗ２６４．７細胞株で実施例１に係る試料は、濃度依存した傾向でＬＰＳにより誘導されるＩＬ−１βの生成が減少しており、実施例１に係る試料が抗炎症効果を見せていることが分かる。

［実験例５］
実施例１に係る試料のＩＬ−６生成に及ぼす影響
実験例４と同一の方式で実験を行い、その結果を図５に示した。

［実験例６］
実施例１に係る試料のＭＣＰ−１生成に及ぼす影響
実験例４と同一の方式で実験を行い、その結果を図６に示した。

［実験例７］
実施例１に係る試料のＴＮＦ−α生成に及ぼす影響
実験例４と同一の方式で実験を行い、その結果を図７に示した。

図７に示したように、Ｒａｗ２６４．７細胞株で実施例１に係る試料は、濃度依存した傾向でＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α生成が減少しており、実施例１に係る試料が抗炎症効果を見せていることが分かる。

実験例１〜７を総括的にまとめてみると、実施例１に係る試料はＲａｗ２６４．７細胞株で濃度依存した傾向でＤＰＰＨ消去能が高く現れ、ＬＰＳにより誘導される総ＮＯ、ＩＬ−１β及びＴＮＦ−α生成が減少しており、実施例１に係る試料は抗酸化及び抗炎症効果を見せていることが分かる。

［実験例８］
実施例２に係る試料のＴＮＦ−α遺伝子発現に及ぼす影響
８−１．試料準備
実施例２に係るアトピー治療用組成物の抽出物粉末１００Ｍｇを滅菌蒸溜水１０ｍｌに溶かした後、フィルターして使用した。

実験例９〜１４の試料は本実験例８の試料準備過程を同一に行って獲得したことを明らかにする。

８−２．遺伝子発現実験の準備
Ｒａｗ２６４．７細胞株は２４ｗｅｌｌｐｌａｔｅに１×１０６細胞で分注し、ここにそれぞれの試料１００、５０mｇ／ｍｌを処理し、１時間後ＬＰＳ２mｇ／ｍｌをそれぞれのｗｅｌｌに添加した後６時間培養し、２、０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。遠心分離後、上層液を除去し、ここにＲＮＡｚｏｌＢ５００mｌを入れて溶解するまで混合した。この混合富裕液にクロロホルム（ＣＨＣｌ_３）５０mｌを添加した後１５秒間また混合した。これを氷に１５分間放置した後、１３、０００ｒｐｍで遠心分離した後、約２００mｌの上層液を回収して２−プロパノール２００mｌと同量で混合した後、ゆっくり振って氷に１５分間放置した。これをさらに１３、０００ｒｐｍで遠心分離した後、８０％ＥｔＯＨで水洗し、３分間真空ポンプで乾燥してＲＮＡを抽出した。抽出したＲＮＡはピロ炭酸ジエチル（ＤＥＰＣ）を処理した２０mｌの蒸溜水に溶かし、７５℃の加熱ブロックで不活性化させた後、ｆｉｒｓｔｓｔｒａｎｄｃＤＮＡ合成に使用した。

逆転写（ｒｅｖｅｒｓｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）反応は用意した総ＲＮＡ３mｇをＤＮａｓｅＩ（１０Ｕ／mｌ）２Ｕ／ｔｕｂｅを３７℃加熱ブロックで３０分間反応した後、７５℃で１０分間変成させ、これに２．５mｌの１０ｍＭｄＮＴＰｓｍｉｘ、１mｌｒａｎｄｏｍｓｅｑｕｅｎｃｅｈｅｘａｎｕＣｌｅｏｔｉｄｅｓ（２５ｐｍｏｌｅ／２５mｌ）、ＲＮＡ抑制剤として１mｌのＲＮａｓｅ抑制剤（２０Ｕ／mｌ）、１mのｌ１００ｍＭＤＴＴ、４．５mのｌ５´ＲＴ緩衝液（２５０ｍＭ、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ８．３、３７５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ_２）を加えた後、１mｌのＭ-ＭＬＶＲＴ（２００Ｕ／mｌ）をさらに加え、ＤＥＰＣ処理した蒸溜水として最終体積が２０mｌになるようにした。この２０mｌの反応混合液をよく混ぜた後、２、０００ｒｐｍで５秒間遠心沈降し、３７℃加熱ブロックで６０分間反応させてｆｉｒｓｔ-ｓｔｒａｎｄｃＤＮＡを合成した後、９５℃で５分間放置してＭ-ＭＬＶＲＴを不活性化させた後、合成が完了したｃＤＮＡをｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）に使用した。

ＲｅａｌｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＰＣＲはＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ７５００ＦａｓｔＲｅａｌ-ＴｉｍｅＰＣＲｓｙｓｔｅｍ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を利用して行い、使用したプリマー（ｐｒｉｍｅｒｓ）は下記のとおりである。

ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲの条件は、５０℃で２分、９４℃で１０分間反応して予め変性（ｐｒｅ−ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）させた後、９５℃で１５秒、６０℃で１分間反応して４０回を繰り返し行った。試料投与群と対照群はｉｎｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄでＧＡＰＤＨを使用して下記の数式２でｔａｒｇｅｔｇｒｏｕｐの定量（Quantitative）ＰＣＲを行ってＲＱ（ｒｅｌａｔｉｖｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ）値を測定した。

（数２）
ｙ=ｘ(１＋ｅ)ｎ・・・（２）

上式で、ｘ=ｓｔａｒｔｉｎｇｑｕａｎｔｉｔｙ、ｙ=ｙｉｅｌｄ、ｎ=ｎｕｍｂｅｒｏｆｃｙｃｌｅｓ、ｅ=ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ

実験例９〜１１の遺伝子発現実験準備過程は本実験例８の過程と同一に行ったことを明らかにする。
８−３．ＴＮＦ−α遺伝子発現に及ぼす影響
実施例２の試料のＲａｗ２６４．７細胞株におけるＴＮＦ−α遺伝子発現に及ぼす影響を測定した結果は、正常群（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ）で０．０３、対照群（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ）で１、実験群１（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ＋試料１００mｇ／ｍｌ）で０．３６７、実験群２（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ＋試料５０mｇ／ｍｌ）で０．４１６であった。

図８に示したように、実施例２に係る試料はＲａｗ２６４．７細胞株でＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α遺伝子発現が減少していることが分かる。

［実験例９］
実施例２に係る試料のＩＬ−６遺伝子発現に及ぼす影響
実施例２の試料のＲａｗ２６４．７細胞株におけるＩＬ−６遺伝子発現に及ぼす影響を測定した結果は、正常群（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ）で０．００４、対照群（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ）で１、実験群１（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ＋試料１００mｇ／ｍｌ）で０．６８９、実験群２（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ＋試料５０mｇ／ｍｌ）で１．０９７であった。

図９に示したように、実施例２に係る試料はＲａｗ２６４．７細胞株でＬＰＳにより誘導されるＩＬ−６遺伝子発現が濃度依存的に減少していることが分かる。

［実験例１０］
実施例２に係る試料のＣＯＸ２遺伝子発現に及ぼす影響
実施例２の試料のＲａｗ２６４．７細胞株におけるＣＯＸ２遺伝子発現に及ぼす影響を測定した結果は、正常群（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ）で０．０５１、対照群（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ）で１、実験群１（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ＋試料１００mｇ／ｍｌ）で０．８３２、実験群２（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ＋試料５０mｇ／ｍｌ）で０．９３５であった。

図１０に示したように、実施例２に係る試料はＲａｗ２６４．７細胞株でＬＰＳにより誘導されるＣＯＸ２遺伝子発現が減少していることが分かる。

［実験例１１］
実施例２に係る試料のＮＯＳ−II遺伝子発現に及ぼす影響
実施例２の試料のＲａｗ２６４．７細胞株におけるＮＯＳ−II遺伝子発現に及ぼす影響を測定した結果は、正常群（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ）で０．０５１、対照群（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ）で１、実験群１（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ＋試料１００mｇ／ｍｌ）で０．３２５、実験群２（Ｒａｗ２６４．７ｃｅｌｌ＋ＬＰＳ＋試料５０mｇ／ｍｌ）で０．７８６であった。

図１１に示したように、実施例２に係る試料はＲａｗ２６４．７細胞株でＬＰＳにより誘導されるＮＯＳ−II遺伝子発現が濃度依存的に減少していることが分かる。

［実験例１２］
実施例２に係る試料のＭＣＰ−１生成に及ぼす影響
１２−１．実験準備
１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で分注したＴＨＰ−１細胞（人体団核細胞株）に試料を濃度別に（１００、５０mｇ／ｍｌ）で１時間前処理した後、ほこり、家ダニ（ｍｉｔｅ）１mｇ／ｍｌを処理した。

ＴＨＰ−１細胞を２４時間培養した後、上層液を集めてＭＣＰ−１とＩＬ−６、そしてＩＬ−８をＥＬＩＳＡｋｉｔを使用して測定した。

実験例１３〜１４は本実験例１２の実験準備過程を同様に行ったことを明らかにする。
１２−２．ＭＣＰ−１生成に及ぼす影響
実施例２の試料のＴＨＰ−１細胞におけるＭＣＰ−１生成に及ぼす影響を測定した結果は、正常群（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ）で１８１．３±２２．９、対照群（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ＋ｍｉｔｅ）で９１７．５±３５．４、実験群１（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ＋ｍｉｔｅ＋試料１００mｇ／ｍｌ）で５９６．３±１３．９、実験群２（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ＋ｍｉｔｅ＋試料５０mｇ／ｍｌ）で７７６．９±７９．６であった。

図１２に示したように、実施例２に係る試料はＴＨＰ−１細胞株でほこり、家ダニにより誘導されるＭＣＰ−１生成が減少していることが分かる。

［実験例１３］
実施例２に係る試料のＩＬ−６生成に及ぼす影響
実施例２の試料のＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−６生成に及ぼす影響を測定した結果は、正常群（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ）で９７．８±２６．９、対照群（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ＋ｍｉｔｅ）で８７７．８±９７．０、実験群１（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ＋ｍｉｔｅ＋試料１００mｇ／ｍｌ）で４６５．３±１０２．５、実験群２（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ＋ｍｉｔｅ＋試料５０mｇ／ｍｌ）で７６１．４±４６．９であった。

図１３に示したように、実施例２に係る試料はＴＨＰ−１細胞株でほこり、家ダニにより誘導されるＩＬ−６生成が減少していることが分かる。

［実験例１４］
実施例２に係る試料のＩＬ−８生成に及ぼす影響
実施例２の試料のＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−８生成に及ぼす影響を測定した結果は、正常群（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ）で６２５．２±１８１．９、対照群（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ＋ｍｉｔｅ）で２８４０．０±２２４。５、実験群１（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ＋ｍｉｔｅ＋試料１００mｇ／ｍｌ）で８６５．４±１００．９、実験群２（ＴＨＰ−１ｃｅｌｌｓ＋ｍｉｔｅ＋試料５０mｇ／ｍｌ）で１２１０．２±２３１．５であった。

図１４に示したように、実施例２に係る試料はＴＨＰ−１細胞株でほこり、家ダニにより誘導されるＩＬ−８生成が減少していることが分かる。実験例８〜１４を総括的にまとめてみると、実施例２に係る試料はＲａｗ２６４．７細胞株でＬＰＳにより誘導されるＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＣＯＸ２及びＮＯＳ−IIの遺伝子発現が減少していることが分かる。

また実施例２に係る試料はＴＨＰ−１細胞株でほこり、家ダニにより誘導されるＭＣＰ−１、ＩＬ−６及びＩＬ−８生成が減少していることが分かる。

したがって、実施例２に係る試料は炎症サイトカインの遺伝子発現及び炎症サイトカインの生成を抑制することによって、抗炎症効果を見せていることが分かる。

【００２２】
【特許文献】
【特許文献１】韓国特許公開第２００８-００７１７８１１０（特許出願１０−２００７−００１００８０）号公報
【特許文献２】韓国特許公開第２００６−００５８５３０号公報
【特許文献３】韓国特許公開第２００７−００９５５８８号公報
【特許文献４】韓国特許公開第２００６−００７４０３８号公報

Claims

大黄、木通、梔子、車前子、ナデシコ及びニワヤナギをそれぞれ３〜１５重量部、３〜１０重量部、３〜１０重量部、８重量部、８重量部、８重量部で混合して熱水抽出した有効性分を含有するアトピー治療用組成物。
シュクシャ、白豆蒄、丁香、木香、乾薑、高麗人参、當歸、百茯苓、白朮、桔梗、陳皮、カッコウ、肉豆蒄、莪朮、石菖蒲、柴胡、檳榔、黄蓮、ボウフウ、呉茱萸、厚朴、天門冬、枳殼、黄柏、黄蓍、川椒、チョウセンオニウド、紫苑、香附子、甘草、小茴香、麦門冬、三陵、白芍薬、肉桂、青皮をそれぞれ１〜１５重量部で追加混合して熱水抽出した有効性分を含有する請求項１に記載のアトピー治療用組成物。
シュクシャ、白豆蒄、丁香、木香、乾薑、高麗人参、當歸、百茯苓、白朮、桔梗、陳皮、カッコウ、肉豆蒄、莪朮、石菖蒲、柴胡、檳榔、黄蓮、ボウフウ、呉茱萸、厚朴、大黄、天門冬、枳殼、黄柏、黄蓍、川椒、チョウセンオニウド、紫苑、香附子、甘草、小茴香、木通、麦門冬、三陵、白芍薬、肉桂、梔子、車前子、ナデシコ、ニワヤナギ、青皮をそれぞれ１〜１５重量部で混合して熱水抽出した有効性分を含有するアトピー治療用組成物。
請求項１または請求項３に記載の組成物を混合して粉末を形成した後に、丸剤を製造したアトピー治療剤。