CN102106884B - 具有免疫调节功能的医药组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有免疫调节功能的医药组合物，包括一柴胡(Bupleurum)萃取物，该柴胡萃取物是由下列步骤所制得，包括将柴胡(Bupleurum)粉末加入一溶剂中，然后自该溶剂中分离出一萃取物，其中上述柴胡(Bupleurum)包括：阿尔泰柴胡(Bupleurum krylovianum)、长茎柴胡(Bupleurumlongicaule)、大叶柴胡(Bupleurum longiradiatum)、短茎柴胡(Bupleurumpusillum)、柳叶柴胡(Bupleurum salicifolium)、狭叶柴胡(Bupleurumscorzonerifolium)、黑柴胡(Bupleurum smithii)、序列识别号1、序列识别号2、序列识别号3、序列识别号4、序列识别号5、序列识别号6或与上述序列的差异值1％以内的柴胡；或它们的组合。

Description

具有免疫调节功能的医药组合物

技术领域

本发明涉及一种具有免疫调节功能的医药组合物，特别是涉及具有免疫调节功能的柴胡萃取物。

背景技术

近年来对于免疫系统所引起的疾病已有多篇研究其致病的生理机制，有多篇研究指向肿瘤坏死因子(TNF-α)的过量表现与免疫发炎疾病有关，例如类风湿性关节炎、克隆氏症、干癣性关节炎或僵直性关节炎等。

TNF-α的作用类似生物激素，例如调节细胞召集、细胞增殖、细胞死亡、或免疫调节。当TNF-α在组织中为低浓度时，可放大宿主对抗外来感染的防御机制。当其为高浓度时，TNF-α会导致过度的发炎反应而造成器官损伤。因此，Brennan等人提出移除在发炎部位多余的TNF-α可治疗过度发炎反应所造成的免疫疾病(Brennan et al.，1989，Inhibitory effect of TNF-αantibodies onsynovial cell interleukin-1 production in rheumatoid arthritis.Lancet 2，244-247)。

Feldmann等人提出TNF-α在类风湿性关节炎、克隆氏症、干癣、及其它疾病中，在致病发展过程的调节扮演特别重要角色，例如快速诱导IL-1β、IL-6等细胞激素(Feldmann et al.，2002，Discovery of TNF-α as a therapeutic target inrheumatoid arthritis：preclinical and clinical studies.Joint Bone Spine 69，12-18)。特别是在类风湿关节炎的小鼠疾病模式中，TNF-α明显地过度表现(Keffer et al.，1991，Transgenic mice expressing human tumor necrosis factor：a predictivegenetic model of arthritis.EMBO J10，4025-4031)。而且在类风湿性关节炎的治疗中发现，血清中IL-6的减少可能是TNF-α中和作用的直接影响(Charles et al.，1999，Regulation of cytokines，cytokine inhibitors，and acute-phase proteinsfollowing anti-TNF-αtherapy in rheumatoid arthritis.J Immunol 163，1521-1528)。

因此目前有许多抑制TNF-α的生物制剂问世，例如阿达里幕麦浦(adalimumab；音译)、艾坦能塞浦(etanercept；音译)、因佛里克希麦浦(infliximab；音译)等，或疾病调节抗风湿药物(DMARDs)，例如麦松崔克参(methotrexate；音译)等，或者非类固醇抗发炎药剂(NSAIDs)。这些生物制剂因为药效快、效果显著、且免疫耐受度佳，因此成为主流药物。然而也因为这些药剂的价格昂贵、必须以注射方式给药、以及可能引起免疫反应或者增加感染危险的副作用，还有发展其它更安全药物的空间。

柴胡(Bupleurum)自古即列为「神农本草经」上品药用植物，为「伤寒论」少阳病的主药，能解热、镇痛、解毒、消炎，主治胸胁苦满、口苦咽干、往来寒热、黄疸、肝炎、胃肠炎、与胆囊炎等。已知柴胡的利用主要在根部，也有相关文献指出萃取柴胡根部，可分离出含有皂苷(saikosaponin)、龙吉甙元(longispinogenin)、固醇、脂肪油、类黄醇及糖类，其中以皂苷为主要成份，在医学研究上也证实皂苷a、d具有疗效，((台湾)农业试验所技术服务/第58期/2004/6月/第10-12页)。

柴胡目前是肝炎治疗生药中积极开发的对象，然而，尚未有柴胡应用于调节免疫功能的研究或文献问世。

发明内容

本发明的目的在于通过研究柴胡的特定萃取方式，并确认其中的活性成分以及该活性成分与TNF-α、IL-6间的关系，从而研发出新颖调节免疫功能的医药组合物。

本发明提供一种具有免疫调节功能的医药组合物，包括一柴胡(Bupleurum)萃取物，该柴胡萃取物是经由一溶剂萃取。

上述柴胡可具体地选自下列所构成的群组：阿尔泰柴胡(Bupleurumkrylovianum)、长茎柴胡(Bupleurum longicaule)、大叶柴胡(Bupleurumlongiradiatum)、短茎柴胡(Bupleurum pusillum)、柳叶柴胡(Bupleurumsalicifolium)、狭叶柴胡(Bupleurum scorzonerifolium)、及黑柴胡(Bupleurumsmithii)。

由于传统上药材基原的鉴定是需要有多年经验的药学专家采用植株形态、性味及镜检的方式来鉴定，但对外观形态相似、或经过加工已失去原本性状的药材，则往往无法精确地区分，造成药效不彰或毒害等问题。尤其中药材品种繁多，市售中药材因正品不易取得，药材外观相近、同名异物、同物异名常见混用情形。因此，可利用植物染色体DNA多型性(polymorphism)的特性，以特定区域的DNA序列来鉴定药材的基源，其中又以核糖体rRNA的基因间ITS(Internal Transcribed Spacer)序列的差异常作为生物演化的比较依据，也是被广泛认同的方法。因此，本发明的柴胡也可包括特定ITS(基因内转录间隔区，Interal Transcribed Spacer)序列的序列识别号1(SEQ ID NO：1)、序列识别号2(SEQ ID NO：2)、序列识别号3(SEQ ID NO：3)、序列识别号4(SEQ IDNO：4)、序列识别号5(SEQ ID NO：5)、序列识别号6(SEQ ID NO：6)的柴胡、或与上述序列的差异值1％以内的柴胡。

上述柴胡可为整棵植株进行萃取，或者采用其根部进行萃取。

本发明中所谓「萃取」是采用溶剂萃取法(solvent extraction)。此谓「溶剂萃取法」是指将计划萃取的混合物质，加入适当的溶剂中，利用该混合物质中各成分对该溶剂的不同溶解度，萃取出目标物质。本发明的一实施例中，将上述柴胡(Bupleurum)经过研磨成粉末后，室温下浸于溶剂中，经过一段时间之后，在室温下干燥上述柴胡的萃取物。本发明的另一实施例中，将含有柴胡(Bupleurum)植物粉末的极性溶液进行加热回流的方法，萃取上述柴胡。

本发明所使用的溶剂较佳为C₁-C₁₂醇类、C₂-C₅乙酸酯类、C₅-C₆烷类或其组合，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、2-丁醇、叔丁醇、1，3-丁二醇、1，4-丁二醇、戊醇、异戊醇、2，3-戊二醇、2，4-戊二醇、环戊醇、己醇、环己醇、庚醇、辛醇、壬醇、癸醇、十一烷醇、十二烷醇、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸戊酯、正戊烷、环戊烷、正己烷、环己烷、或它们的组合，但不限于此。本发明一实施例中采用乙醇、乙酸乙酯和/或正戊烷作为萃取溶剂。本发明的一实施例中，采用乙醇水溶液作为萃取溶剂，乙醇浓度较佳为20wt％-95wt％，更佳为50wt％-75wt％(均为重量百分比浓度)。

上述所使用的溶剂的量较佳为柴胡的5倍以上，更佳为柴胡的5～10倍。

上述的萃取时间通常为2小时以上，较佳为2～24小时，更佳为4～5小时。

上述的萃取温度通常为室温，较佳为室温至乙醇水溶液沸腾回流的温度，更佳为乙醇水溶液沸腾回流的温度。

本发明的萃取方法可再包括一浓缩干燥过程，将上述经过加热回流后的萃取液浓缩、干燥成固体或结晶体。本发明的萃取方法也可反复操作数次，以获得纯度较高的萃取物。

本发明的柴胡萃取物，在下列的实施例中显示在生物体内具有抑制TNF-α或IL-6表现的活性，进而具备免疫调节功能。

再者，本发明的柴胡萃取物，经过进一步的再结晶纯化之后，可分离出一活性成分为二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)或其顺式异构物。二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)属于木脂素(lignan)类的化合物，化学式为反式-(3，4-二甲氧基亚芐基)-β-(3，4-亚甲基双氧基芐基)-γ-丁内酯(trans-(3，4-dimethoxybenzylidene)-β-(3，4-methylenedioxylbenzyl)-γ-butyrolactone))，为透明针状结晶，融点为131-132℃，化学式C₂₂H₂₂O₇，如式1所示。

式1

从柴胡中萃取及鉴定二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)的其它方法还公开于其它文献，例如窦后松等人(2000)小叶黑柴胡中kaerophyllin含量测定方法的研究，中国中药杂志2000年第25卷第8期p.488-490；或尚明远等人(2000)HLPC法测定宁夏产四种柴胡中kaerophyllin的含量，西北药学杂志2000年04期；Estevez-Braun A.et al.，1994，antibiotic activity and absolute configuration of8S-Heptadeca-2(Z)，9(Z)-diene-4，6-diyne-1，8-diol from Bupleurum salicifolium，J.Natural Products，57，1178-1182；Estevez-Braun A.et al.，1995，Busaliol andBusalicifol，two new tetrahydrofuran lignans from Bupleurum salicifolium，J.Natural Products，58，887-892。

在本发明的植物萃取物中发现，二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)容易与其顺式异构物形成混晶的形式存在，该顺式异构物为异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)，化学式为顺式-(3，4-二甲氧基亚芐基)-β-(3，4-亚甲基双氧基芐基)-γ-丁内酯(cis-(3，4-dimethoxybenzylidene)-β-(3，4-methylenedioxylbenzyl)-γ-butyrolactone)，为透明方形结晶，融点为146.5-148℃，化学式C₂₂H₂₂O₇，如式2所示。

式2

目前尚未有任何文献证实或确认二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)或其顺式异构物具有生理上的功能。但是本发明的下列实施例中显示，二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)及其顺式异构物在生物体内都具有抑制TNF-α或IL-6表现的活性，进而具备免疫调节功能。

因此，本发明的具有免疫调节功能的医药组合物，可用于治疗、缓减或预防与TNF-α或IL-6生理作用相关的疾病或症状，例如败血性休克、败血症、缺血后再灌注损伤、分枝杆菌(mycobacterial)感染、脑膜炎、干癣、充血性心脏衰竭、恶病质(cachexia)、移植排斥现象、皮肤T细胞淋巴瘤、血管新生疾病、自体免疫疾病、皮肤发炎疾病、克隆氏病(Crohn′s disease)、结肠炎、退化性关节炎及类风湿性关节炎、僵直性脊椎炎、干癣性关节炎、成人史提尔氏病(adult Still′s disease)、葡萄膜炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener′s granulomatosis)、伯克氏病(Behcehe disease)、修格伦氏症候群(Sjogren′s syndrome)、类肉瘤病、多肌炎、皮肌炎、多发性硬化症、坐骨神经痛、牙周疾病、后天免疫不全症候群、非胰岛素依赖性糖尿病、全身性红斑性狼疮、青光眼、原发性肺纤维化、支气管肺发育不良、视网膜疾病、硬皮病、骨质疏松症、肾缺血、心肌梗塞、脑中风、脑缺血、肾炎、肝炎、丝球体性肾炎、异位性皮肤炎、血管炎(vasculitis)、过敏、季节过敏性鼻炎、可逆性气道阻塞、成人呼吸窘迫症候群、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、支气管炎、或这些疾病的组合，但不限于此等疾病。

本发明的医药组合物还包括此技术领域中熟知的药学上可接受载体和/或添加剂，以适当比例添加。

本发明的医药组合物的给药可为，例如静脉内的、肌肉内的、口服的或皮下的给药，较佳为口服。也可在适当期间内对患者进行多重剂量投药，该投药疗程依据药学上例行方法加以测定。

附图说明

图1显示多种柴胡(Bupleurum)以95wt％乙醇水溶液萃取的萃取物HPLC图，其中(a)～(g)分别代表标准品二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)具有相同高峰的柴胡，序列识别号1、序列识别号2、序列识别号3、序列识别号4、序列识别号5和序列识别号6的柴胡。

图2显示阿尔泰柴胡(Bupleurum krylovianum)以95wt％乙醇水溶液萃取的萃取物HPLC图。

图3(a)显示二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)的光谱图，图3(b)显示异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)的光谱图。

图4(a)显示二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)纯化物的HPLC图，图4(b)显示异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)纯化物的HPLC图。

图5显示在LPS诱导发炎反应的小鼠模式中，不同剂量的柴胡的乙醇萃取物对TNF-α的抑制效果。

图6显示在LPS诱导发炎反应的小鼠模式中，不同剂量的柴胡的乙醇萃取物对IL-6的抑制效果。

图7显示LPS诱导发炎反应的小鼠模式中，柴胡的乙醇萃取物在生物体内的作用时间对TNF-α的抑制效果。

图8显示LPS诱导发炎反应的小鼠模式中，柴胡的乙醇萃取物在生物体内的作用时间对IL-6的抑制效果。

图9显示在鹿角胶(carrageenan)诱导脚肿胀的大鼠模式中柴胡的乙醇萃取物的抑制脚肿胀效应。

图10显示在辅剂(adjuvant)诱导脚肿胀的大鼠模式中柴胡的乙醇萃取物的抑制关节炎效应。

图11显示在胶原蛋白(collagen)引起的关节炎的鼠模式中柴胡的乙醇萃取物的抑制关节炎效应。

图12显示二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)纯化物对人类单核球细胞株U937的TNF-α抑制效果。

图13显示异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)纯化物对人类单核球细胞株U937的TNF-α抑制效果。

图14显示二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)纯化物对人类单核球细胞株U937的IL-6抑制效果。

图15显示异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)纯化物对人类单核球细胞株U937的IL-6抑制效果。

具体实施方式

本发明的具体实施详细说明如下，然而以下的实施例仅用于进一步公开本发明的技术内容，不应以此限制本案的发明范畴。

实施例1筛选植物材料

选取多种柴胡(Bupleurum)的植物根部，研磨成植物粉末。

取上述植物粉末0.5g，以25ml的95wt％乙醇在室温下振荡过夜后，经过干燥浓缩后以95wt％酒精回溶成2ml，进行高效液相层析法(HPLC)分析，HPLC分析条件如下：

层析柱(Column)：SymmetryShield^TM(Waters)，^RP18，5μm，250×4.6mmlD

移动相(Mobile phase)：A：H₂O，B：乙腈，C：甲醇

检测：UV/λ＝237nm。

在这些柴胡萃取物当中，选取与标准品二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)(图1中(a)线)具有相同高峰(图1中框出的高峰)的柴胡，图1中(b)线代表(b)柴胡(即序列识别号1)；(c)线代表阿尔泰柴胡(即序列识别号2的柴胡)；(d)线代表大叶柴胡(即序列识别号3的柴胡)；(e)线代表(e)柴胡(即序列识别号4)；(f)线代表(f)柴胡(即序列识别号5)；(g)线代表(g)柴胡(即序列识别号6)。

实施例2萃取活性成分

将实施例1选取的阿尔泰柴胡(Bupleurum krylovianum)植物磨碎，取2kg粉末加入16L的95wt％乙醇水溶液中，室温下经过5小时后，干燥浓缩，获得萃取率6.7±0.1％的萃取物，进行高效液相层析法(HPLC)分析，如图2所示，在30-40分钟间具有高峰。

HPLC分析条件：

层析柱(Column)：SymmetryShield^TM(Waters)，^RP18，5μm，250×4.6mmlD

移动相(Mobile phase)：A：H₂O，B：乙腈，C：甲醇

检测：UV/λ＝237nm

实施例3鉴定活性成分

将实施例1筛选的阿尔泰柴胡(Bupleurum krylovianum)18.5kg加入25L甲醇，在室温下经过4小时后，经浓缩干燥，获得18.5kg的残余物。取此残余物500mg，进行管柱层析法，以SiO₂为固定相，以己烷、乙酸乙酯、甲醇(6/4/1-3/2/1-0/0/1调整不同体积比例)为移动相，以极性梯度流洗管柱后，分别收集，进行薄层层析法(TLC)分析获得12个部分。将此12个部分进行下列的HLPC分析，12个部分分别溶于甲醇，浓度调整为1mg/ml，选取与标准品二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)具有相同高峰的部分，将此部分再进行一次上述的管柱层析法，分离出纯度较高的萃取物，再进一步结晶精制，获得一白色透明结晶物。

将此结晶物进行¹H、¹³C-NMR、MS光谱分析，如图3(a)所示，由光谱图上在6-8ppm及2.5-4ppm处的化学移动(chemical shift)，得知此两化合物为C3及C6的木脂素类化合物。再根据先前文献(Wen-Liang C.et al.，2003，Immunosuppressive flavones and lignans from Bupleurum scorzonerifolium，Phytochemistry 64，1375-1379)，比对确认此结晶物为二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin))，如表1、表2及图3(a)所示。

表1、实施例3的白色结晶物的¹H NMR

与二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)的比对

位置

文献中二芐基丁内酯型木脂素

本结晶物的δH mult值

	(kaerophyllin)的δH mult值
			3	3.78m	3.78
4α	4.24m	4.24
			4β	4.24m	4.24
5	7.50s	7.51
			6α	2.58dd(14.4，10.3)	2.59
6β	3.01dd(14.4，4.1)	3.01
			2’	7.02d(1.5)	7.03
5’	6.91d(8.4)	6.91
			6’	7.19dd(8.4，1.5)	7.19
2”	6.62d(1.5)	6.61
			5”	6.69d(7.8)	6.67
6”	6.59dd(7.8，1.5)	6.60
			3’-OMe	3.88s	3.88
4’-OMe	3.91s	3.92
			OCH2O	5.90d(1.5)	5.90

表2、实施例3的白色结晶物的¹³C NMR(CDCl₃)

与二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)的比对

位置	文献中二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)的δC值	本结晶物的δC值
			1	172.56	172.57
2	125.58	125.73
			3	39.60	39.72
4	69.46	69.53
			5	137.39	137.43
6	37.53	37.50
			1’	126.82	126.97
2’	112.87	113.06
			3’	150.65	150.80

4’	149.05	149.21
			5’	111.25	111.40
6’	123.54	123.54
			1”	131.43	131.54
2”	108.91	109.06
			3”	147.91	148.03
4”	146.49	146.61
			5”	108.41	108.50
6”	121.89	121.97
			3’-OMe	55.93	56.05
4’-OMe	55.96	56.05
			OCH2O	101.02	101.10

再由正己烷分层中进行再结晶，分离出透明方形结晶物，将此结晶物进行¹H、¹³C-NMR、MS光谱分析，如图3(b)所示，再根据先前文献(Wen-LiangC.et al.，Immunosuppressive flavones and lignans from Bupleurumscorzonerifolium，Phytochemistry 64，2003，1375-1379)，比对确认此结晶物为异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)，如表3、表4及图3(b)所示。

表3、实施例3的透明方形结晶物的¹H NMR

与异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)的比对

位置	文献中异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)的δH mult值	本结晶物的δHmult值
			3	3.28m	3.28
4α	4.09	4.09
			4β	4.30m	4.3
5	6.61s	6.61
			6α	2.77dd	2.76
6β	2.92dd	2.92
			2’	8.07d	8.07

5’	6.82d	6.81
			6’	7.15dd	7.14
2”	6.68d	6.67
			5”	6.74d	6.74
6”	6.62dd	6.61
			3’-OMe	3.89s	3.89
4’-OMe	3.92s	3.91
			OCH2O	5.93d	5.93

表4、实施例3的透明方形结晶物的¹³C NMR(CDCl₃)

与异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)的比对

位置	文献中异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)的δC值	本结晶物的δC值
			1	172.56	172.57
2	125.58	125.73
			3	39.6	39.72
4	69.46	69.53
			5	137.39	137.43
6	37.53	37.6
			1’	126.82	126.97
2’	112.87	113.06
			3’	150.65	150.8
4’	149.05	149.21
			5’	111.25	111.4
6’	123.54	123.54
			1”	131.43	131.54
2”	108.91	109.06
			3”	147.91	148.03
4”	146.49	146.61

5”	108.41	108.5
			6”	121.89	121.97
3’-OMe	55.93	56.05
			4’-OMe	55.96	56.05
OCH2O	101.02	101.1

将此二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)及其顺式异构物的纯化物同样进行下列的HPLC分析，二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)纯化物的高峰出现在约37分钟，如图4(a)所示。而异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)的高峰出现在约40分钟，如图4(b)所示。

HPLC分析条件：

层析柱(Column)：ODS 3V

移动相(Mobile phase)：CH₃OH/H₂O(0.1％H₃PO₄)进行梯度流洗

流洗速度：1.0ml/min

检测：UV/λ＝310nm。

实施例4不同乙醇浓度萃取物的抑制效果

将实施例1筛选的阿尔泰柴胡(Bupleurum krylovianum)植物粉末200g，分成四份各50g分别放入四个1L圆底瓶中，各自加入20％、50％、75％、95％比例的乙醇水溶液，加热回流2小时后，取出滤液，浓缩干燥之后，分别获得萃取物。

取上述萃取物各自以500mg/kg灌食BALB/c小鼠，两小时后给予BALB/c小鼠1mg/Kg的脂多糖体(lipopolysaccharide；LPS)(溶于Phosphate BufferedSaline，PBS)腹腔注射，经过1.5小时后采血。以酶联免疫吸附法(ELISA)(R&D)分别定量小鼠血浆中TNF-α及IL-6的浓度。以未灌食上述萃取物的小鼠体内TNF-α及IL-6血浆浓度为基准，计算血浆中TNF-α及IL-6的抑制率(％)，结果如表5所示。

表5

萃取的乙醇浓度

TNF-α抑制率(％)

IL-6抑制率(％)

25％	57.7	26.2
			50％	92.8	81.7
75％	92.4	74.0
			95％	71.4	40.3

实施例5不同溶剂萃取的抑制效果

a)以50％乙醇萃取：将实施例1筛选的阿尔泰柴胡(Bupleurum krylovianum)植物粉末50g加入1L圆底瓶中，加入500mL的50％乙醇，加热回流2小时后，取出滤液，浓缩干燥之后，获得一萃取物(a)，此萃取物(a)将进行以下的生理实验。

b)以正己烷萃取：将实施例1筛选的阿尔泰柴胡(Bupleurum krylovianum)植物粉末50g加入1L圆底瓶中，加入500mL的50％乙醇，加热回流2小时，取出滤液之后，再加入与此滤液等量的100％正己烷，以上述相同萃取步骤反复萃取三次，浓缩干燥之后，获得一萃取物(b)，此萃取物(b)将进行以下的生理实验。

c)以乙酸乙酯萃取：将实施例1筛选的阿尔泰柴胡(Bupleurum krylovianum)植物粉末50g加入1L圆底瓶中，加入500mL的50％乙醇，加热回流2小时，取出滤液之后，再加入与此滤液等量的乙酸乙酯，以上述相同萃取步骤反复萃取三次，浓缩干燥之后，获得一萃取物(c)，此萃取物(c)将进行以下的生理实验。

d)取上述萃取物(a)、(b)、(c)各自以500mg/kg灌食BALB/c小鼠，两小时后给予BALB/c小鼠1mg/Kg的LPS(溶于PBS)腹腔注射，经过1.5小时后采血。以酶联免疫吸附法(ELISA)(R&D

)分别定量小鼠血浆中TNF-α及IL-6的浓度。以未灌食上述萃取物的小鼠体内TNF-α及IL-6血浆浓度为基准，计算血浆中TNF-α及IL-6的抑制率(％)，结果如表6所示。

表6

溶剂名称	萃取物	TNF-α抑制率(％)	IL-6抑制率(％)
				50％乙醇	萃取物(a)	92.8	81.7

50％乙醇+正己烷	萃取物(b)	99.3	78.4
				50％乙醇+乙酸乙酯	萃取物(c)	98.6	83.0

实施例6不同溶剂的萃取结果

取实施例1筛选的阿尔泰柴胡(Bupleurum krylovianum)植物粉末5g，以1g/份分别放入5个不同的锥形瓶中，分别加入10ml的甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、及癸醇五种不同极性醇类，分别放置在超音波震荡器中震荡10分钟后取出液体，将这些萃取液定量至10ml，并以二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)分别配制成浓度为0.3，0.27，0.21，0.15，0.09，0.06及0.03mg/ml的标准品溶液，检验这些萃取液中活性成分二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)的含量比例，结果如表7。

表7

萃取溶剂	二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)含量比(％)
		甲醇	0.32
乙醇	0.30
		异丙醇	0.21
丁醇	0.08
		癸醇	0.10

实施例7不同萃取时间的抑制效果

取实施例1筛选的阿尔泰柴胡(Bupleurum krylovianum)植物粉末2.0Kg加入20L圆底瓶中，加入16.3L的50％乙醇加热回流，分别在回流2、3、4、5小时后取样，取出的滤液各自浓缩干燥，分别获得萃取物，并以二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)作为标准品分别配制成浓度为0.3，0.27，0.21，0.15，0.09，0.06及0.03mg/ml的标准品溶液，检验这些萃取液中活性成分二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)的含量比例，结果如表8。

另外，再取上述各萃取物分别以500mg/kg灌食BALB/c小鼠，两小时后给予BALB/c小鼠1mg/Kg的LPS(溶于PBS)腹腔注射，经过1.5小时后采血。以酶联免疫吸附法(ELISA)(R&D

)分别定量小鼠血浆中TNF-α及IL-6的浓度。以未灌食上述萃取物的小鼠体内TNF-α及IL-6血浆浓度为基准，计算血浆中TNF-α及IL-6的抑制率(％)，结果如表8所示。

表8

萃取时间	二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)含量比值	TNF-α抑制率(％)	IL-6抑制率(％)
				2小时	1.10	84.4	-34.7
3小时	1.08	70.5	-6.8
				4小时	1.06	100.0	46.0
5小时	1.06	99.7	-0.9

实施例8在LPS(脂多糖体)诱导发炎反应的小鼠模式中乙醇萃取物给药量的效应

取实施例5a)的萃取物(a)250mg/kg、500mg/kg、1000mg/kg、及2000mg/kg，分别灌食BALB/c小鼠。两小时后给予BALB/c小鼠1mg/Kg的LPS(溶于PBS)腹腔注射，经过1.5小时后采血。以酶联免疫吸附法(ELISA)(R&D)分别定量小鼠血浆中TNF-α及IL-6的浓度，如图5、6所示。控制组为10ml/kg的2％Tween 80载体。

实施例10在LPS(脂多糖体)诱导发炎反应的小鼠模式中乙醇萃取物给药时间的效应

取实施例5a)的萃取物(a)500mg/kg灌食BALB/c小鼠，在灌食后1小时、2小时、4小时、及6小时后分别给予BALB/c小鼠1mg/Kg的LPS(溶于PBS)腹腔注射，经过1.5小时后采血。以酶联免疫吸附法(ELISA)(R&D

)分别定量小鼠血浆中TNF-α及IL-6的浓度，如图7、8所示。控制组为10ml/kg的2％Tween 80载体。

实施例11在鹿角胶(carrageenan)诱导脚肿胀的大鼠模式中乙醇萃取物的抑制脚肿胀效应

取实施例5a)的萃取物(a)250、500、1000mg/kg、以及3mg/kg非类固醇止痛消炎药(indomethacin)作为正控制组，10ml/kg，2％Tween 80载体作为负控制组，分别灌食大鼠(Long-Evans)。1小时后，在大鼠的左脚注入0.1ml的1％鹿角胶(carrageenan)，在注射后的第0、1.5、3小时分别以足体积测量仪(plethysmometer)(Stoelting)测量大鼠左脚体积，如图9所示。

另外，根据公式计算抑制率：

抑制率(％)＝(Nt-Nv)/Nv×100

(Nt为喂食二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)萃取物的大鼠左后脚浮肿净值；Nv为喂食载体组的大鼠左后脚浮肿净值)

若二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)萃取物具有抗发炎效果，则计算出的抑制率为负值。结果如表9。

表9

试验品	第0小时的抑制率(％)	第1.5小时的抑制率(％)	第3小时的抑制率(％)
				载体	0	0	0
250mg/kg的乙醇萃取物	0	3	14
				500mg/kg的乙醇萃取物	0	55	52
1000mg/kg的乙醇萃取物	0	29	62
				3mg/kg的非类固醇消炎止痛药(indomethacin)	0	21	52

实施例12在辅剂(adjuvant)诱导的大鼠模式中乙醇萃取物的抑制关节炎效应

取每组5只大鼠在尾巴基部注射20mg/ml悬浮于鲛鲨烯(squalene)中牛型结核死菌(Mycobacterium butyricum)50μl，共注射三各点(150μl/rat)。在大鼠一开始诱发疾病时，各组分别立即灌食实施例5a)的萃取物(a)500mg/kg、1000mg/kg、以及非类固醇消炎止痛药(indomethacin)3mg/kg、皮质类固醇(dexamethasone)0.1mg/kg、及2％Tween 80载体10ml/kg，并进行关节炎症状评估。

关节炎的症状评估以分数(score)评分：

0：大鼠脚部没有红肿现象；

1：大鼠脚部有轻微红肿或是有一个趾关节有红肿现象；

2：大鼠脚部有轻微明显红肿或是有两个以上趾关节有红肿现象；

3：大鼠后脚不能踏地行走；

4：大鼠踝关节固定不能扳动。

评估结果如图10所示。相较于仅给药载体的关节肿胀现象，以乙醇萃取物呈现具有抑制关节炎的功效。非类固醇消炎止痛药(indomethacin)及皮质类固醇(dexamethasone)作为正控制组。P＜0.05。

实施例13在胶原蛋白(collagen)引起的关节炎的鼠模式中乙醇萃取物的抑制关节炎效应

将等量的胎牛II型胶原蛋白(2mg/ml)与完全辅剂(complete Freund’sadjuvant；CFA)或不完全辅剂(incomplete Freund’s adjuvant；IFA)以均质机Homogenizer)(IKA，RW20 DZM.n.)乳化。取8只一组、共四组的老鼠，在第一天以皮内注射方式施打每只老鼠50μg的胶原蛋白与CFA乳化液，并在第8天注射每只老鼠100μg的胶原蛋白与IFA乳化液。在各组老鼠开始诱发疾病时，各组立即分别灌食如实施例5a)的萃取物(a)50mg/kg、非类固醇止痛消炎药(celebrex)30mg/kg、1％羧甲基纤维素(Carboxymethyl Cellulose；CMC)10ml/kg为载体、或不灌食任何东西，并进行关节炎症状评估。如图11所示。

关节炎的症状评估以分数(score)评分：

0：大鼠脚部没有红肿现象；

1：大鼠脚部有轻微红肿或是有一个趾关节有红肿现象；

2：大鼠脚部有轻微明显红肿或是有两个以上趾关节有红肿现象；

3：大鼠后脚不能踏地行走；

4：大鼠踝关节固定不能扳动。

结果显示仅需要50mg/kg的乙醇萃取物，在两个星期后就有显著的关节炎抑制效果。非类固醇止痛消炎药(celebrex)30mg/kg作为正控制组；1％CMC载体10ml/kg为负控制组；不灌食任何东西为空白试验。

实施例14二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)及其顺式异构物对人类单核球细胞株U937的TNF-α抑制效果

将人类单核球细胞株U937培养在含有50ng/ml PMA(巴豆醇12-硬脂酸酯13-乙酯；phorbol 12-myristate 13-acetate；PMA)(Sigma)的RPMI细胞培养液(含有10％胎牛血清)(RPMI培养基；如Moore et.al.at Roswell Park MemorialInstitute所揭示)中24小时后，再将U937移到不含PMA的上述细胞培养液中继续培养48小时。将活化的U937细胞株植入96孔盘中，植入细胞数为1.6×10⁵个/孔，另外再加入分别含有12.5、25、50、100μg/ml二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)、及1、3、10、30μg/ml异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)或缓冲液10μl，最终使每孔体积为190μl。在37℃下反应30分钟。反应完成后，加入10μl的2μg/ml的LPS刺激细胞，在37℃下反应4小时，然后离心收集上清液。

利用ELISA(R&D

)分别测量上清液中TNF-α的含量，并以控制组(DMSO)为基准，分别计算TNF-α的含量比。另外以MTT(3-(4，5-dimethyl-thiazol-2-yl)2，5-diphenyltrazolium)(Sigma)分别检测细胞存活率。

结果为：图12显示二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)对细胞分泌TNF-α与及MTT分析(assay)的影响，其IC₅₀为44±5μg/ml。图13显示芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)对细胞分泌TNF-α与及MTT分析(assay)的影响，其IC₅₀为18±4μg/ml。可见二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)及其顺式异构物都具有抑制TNF-α分泌的效果。

实施例15二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)或其顺式异构物对人类单核球细胞株U937的IL-6抑制效果

将人类单核球细胞株U937培养在含有50ng/ml PMA(Sigma)的RPMI1细胞培养液(含有10％胎牛血清)中24小时，再将U937移到不含PMA的上述细胞培养液中继续培养48小时。将活化的U937细胞株植入96孔盘中，植入细胞数为1.6×10⁵个/孔，另外再加入分别含有6.3、12.5、25、50μg/ml二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)纯化物，及3.8、7.5、15、30μg/ml异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)纯化物或缓冲液10μl，最终使每孔体积为190μl。在37℃下反应30分钟。反应完成后，加入10μl的20μg/ml的LPS刺激细胞，在37℃下反应16-18小时，然后离心收集上清液。

利用ELISA(R&D

)分别测量上清液中IL-6的含量，并以控制组(DMSO载体)为基准，分别计算IL-6的含量比。另外以MTT(Sigma)分别检测细胞存活率。

图14显示二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)对细胞分泌IL-6与MTT分析(assay)的影响，其IC₅₀为13±2μg/ml。图15显示异二芐基丁内酯型木脂素(isokaerophyllin)对细胞分泌IL-6与MTT分析(assay)的影响，其IC₅₀为24±6μg/ml。可见二芐基丁内酯型木脂素(kaerophyllin)及其顺式异构物具有抑制IL-6分泌的效果。

实施例16对肠炎模式的乙醇萃取物的发炎抑制效果

自每只BABL/c小鼠肛门深入大肠内4公分注射1.75mg三硝基苯磺酸(TNBS)(Sigma)，经过TNBS刺激48小时后，取自肛门起6公分大肠，浸泡于PBS 2小时，以酶联免疫吸附法(ELISA)(R&D

)分别定量分析肠浸出液中发炎因子TNF-α、IL-6及G-CSF含量变化。取6只小鼠一组、共四组小鼠，50％酒精为TNBS溶剂对照组，1.75mg TNBS处理组，100mg/kgDLS01给药TNBS处理组以及0.6mg/kg皮质类固醇(dexamethasone；DEX)给药TNBS处理组，以1.75mg TNBS刺激但未灌食上述萃取物的小鼠肠浸出液中TNF-α、IL-6及G-CSF含量为基准，计算TNF-α、IL-6及G-CSF含量中TNF-α及IL-6的抑制率(％)，结果如表10所示，负值表示促进分泌：

表10

组别	TNF-α抑制率(％)	IL-6抑制率(％)	G-CSF抑制率(％)
				50％酒精对照组	74	96	93
1.75mg TNBS	0	0	0
				100mg/kg DLS01	50	43	60
0.6mg/kg DEX	9	-55	-38

实施例17在LPS(脂多糖体)诱导发炎反应的小鼠模式中不同种柴胡萃取物的效应

分别取实施例1筛选的六种柴胡属植物各60g磨碎，粉末过5网目(mesh)筛网。

a)以50％乙醇萃取：将本实施例的粉末各50g加入2L圆底瓶中，加入400mL的50％乙醇/水混合溶液，加热回流2小时后，取出滤液，浓缩干燥之后，获得一组对应实施例1中(b)～(g)柴胡的萃取物(1)～(6)，这组萃取物(1)～(6)将进行以下的生理实验。

b)取上述萃取物(1)以1000mg/kg及上述萃取物(2)、(3)、(4)、(5)、(6)各自以500mg/kg灌食BALB/c小鼠，两小时后给予BALB/c小鼠1mg/Kg的LPS(溶于PBS)腹腔注射，经过1.5小时后采血。以酶联免疫吸附法(ELISA)(R&D

)分别定量小鼠血浆中TNF-α及IL-6的浓度。以未灌食上述萃取物的小鼠体内TNF-α及IL-6血浆浓度为基准，计算血浆中TNF-α及IL-6的抑制率(％)，结果如表11所示。

表11

萃取物	TNF-α抑制率(％)	IL-6抑制率(％)
			柴胡(1)萃取物	44	-6
柴胡(2)萃取物	99	50
			柴胡(3)萃取物	75	42
柴胡(4)萃取物	25	29
			柴胡(5)萃取物	27	51
柴胡(6)萃取物	34	11

实施例18ITS序列确认柴胡品种

取实施例1筛选的六种柴胡属植物(b)～(g)各取0.5-1克样本于研钵中，加入液态氮研磨成粉末，倒入含7-10ml CTAB萃取缓冲液的离心管中，混合均匀后，于70℃摇荡30-60分钟。取出后加入5ml氯仿混合均匀，以8,000rpm在4℃下离心5分钟。取出上清液至新的离心管中，再加入2-2.5倍体积的沉淀液，以12,000rpm在4℃下离心20分钟，尽量倒掉上清液，加入3ml含RNase的1.2M NaCl溶液，于37℃中摇晃溶解30-60分钟，取出后再加入3ml的氯仿，混合均匀后，以8,000rpm在4℃下离心5分钟，取出上清液分置于新的1.5ml微量离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇于-20℃冰箱中沉淀过夜。再经过离心，以75％酒精洗过一次、晾干、并以50μL TE缓冲液回溶。最后以适当的DNA浓度及特定的引子对进行PCR(polymerase chain reaction)复制出各个柴胡的ITS片段。经由序列分析，获得序列识别号1(对应实施例1的(b)柴胡)、序列识别号2(对应实施例1的阿尔泰柴胡)、序列识别号3(对应实施例1的大叶柴胡)、序列识别号4(对应实施例1的(e)柴胡)、序列识别号5(对应实施例1的(f)柴胡)、及序列识别号6(对应实施例1的(g)柴胡)。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，然其并非用以限定本发明，任何熟悉此项技术的人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的权利要求书所界定的范围为准。

TWGQ180-09P1 sequence

<110>财团法人工业技术研究院

<120>具有免疫调节功能的医药组合物

<160>6

<170>patentin 2.0

<210>1

<211>629

<212>rRNA

<213>柴胡属(Bupleurum)

<400>1

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<213>柴胡属(Bupleurum)

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<213>柴胡属(Bupleurum)

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<210>4

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<212>rRNA

<213>柴胡属(Bupleurum)

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TWGQ180-09P1 sequence

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<212>rRNA

<213>柴胡属(Bupleurum)

<400>5

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<210>6

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<213>柴胡属(Bupleurum)

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<110>财团法人工业技术研究院

<120>具有免疫调节功能的医药组合物

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Claims (13)

1.一种柴胡Bupleurum萃取物用于制备治疗关节炎的药物的用途，所述柴胡萃取物是由下列步骤所制得，包括将柴胡粉末加入一溶剂中，然后自所述溶剂中分离出一萃取物，

其中上述柴胡Bupleurum为：阿尔泰柴胡Bupleurum krylovianum、长茎柴胡Bupleurum longicaule、大叶柴胡Bupleurum longiradiatum、短茎柴胡Bupleurum pusillum、柳叶柴胡Bupleurum salicifolium、狭叶柴胡Bupleurumscorzonerifolium、黑柴胡Bupleurum smithi、或它们的组合；

其中所述溶剂为20wt%-95wt%的乙醇水溶液。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述溶剂为50wt%-75wt%的乙醇水溶液。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述溶剂的体积为所述柴胡的5～10倍。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述柴胡经过2～24小时萃取。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述柴胡经过4～5小时萃取。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述柴胡萃取物还经过一加热回流的步骤。

7.根据权利要求1所述的用途，其中所述柴胡萃取物在室温至乙醇水溶液沸腾回流的温度下萃取。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述柴胡萃取物还经过一浓缩干燥的步骤。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述柴胡为整棵植株。

10.根据权利要求1所述的用途，其中所述柴胡为根部。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述柴胡萃取物包括一活性成分，所述活性成分为二芐基丁内酯型木脂素或其顺式异构物。

12.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物还包括一药学上可接受载体或添加剂。

13.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物是经口给药。

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