KR20110044809A

KR20110044809A - Ｔｎｆ-알파 저해제에 대해 부적절한 반응을 하는 환자에서의 자가면역 질환의 치료법

Info

Publication number: KR20110044809A
Application number: KR1020117008598A
Authority: KR
Inventors: 마크 벤유네스
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2003-04-09
Filing date: 2004-04-06
Publication date: 2011-04-29
Also published as: EP2062916A2; US7976838B2; MXPA05010778A; RU2005134394A; US20080213280A1; AU2004229376B2; RU2358762C2; RS51686B; CN1802176A; IL203019A; HK1086480A1; NZ587776A; UA99933C2; EP1613350A2; MA27838A1; NO20055253L; DE602004020061D1; JP2010047586A; RU2358762C9; HRP20050940A2

Abstract

본 출원은 CD20과 같은, B 세포 표면 마커에 결합하는 안타고니스트로의 치료법을 기재하고 있다. 특히, 본 출원은 TNF-α 저해제에 대해 부적절한 반응을 경험하는 환자에서 자가면역 질환을 치료하기 위한 그러한 항체의 용도를 기재하고 있다.
[색인어]
CD20, B 세포 표면 마커, 안타고니스트, TNF-알파, 자가면역 질환, 항체

Description

ＴＮＦ-알파 저해제에 대해 부적절한 반응을 하는 환자에서의 자가면역 질환의 치료법{THERAPY OF AUTOIMMUNE DISEASE IN A PATIENT WITH AN INADEQUATE RESPONSE TO A TNF-ALPHA INHIBITOR}

본 발명은 CD20과 같은, B 세포 표면 마커와 결합하는 안타고니스트로의 치료법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 TNFα-저해제에 대해 부적절한 반응을 경험하는 포유류에서 자가면역 질환을 치료하기 위한 그러한 안타고니스트의 용도에 관한 것이다.

림프구는 조혈 과정 동안 골수에서 생산되는 많은 유형의 백혈구 중 하나이다. 두 주요 집단의 림프구가 있다: B 림프구(B 세포) 및 T 림프구(T 세포). 여기에서 특히 관심있는 림프구는 B 세포이다.

B 세포는 골수 내에서 성숙하고 골수를 떠나 그들 세포 표면에 항원-결합 항체를 발현한다. 미반응(naive) B 세포가 처음으로 그의 막-결합 항체가 특이적인 항원을 만나면, 세포는 신속하게 분열하기 시작하고 그의 자손은 기억 B 세포와 "혈장 세포"로 불리는 이펙터 세포로 분화한다. 기억 B 세포는 더 긴 수명을 갖고 원래의 친 세포와 동일한 특이성을 갖는 막-결합 항체를 계속해서 발현한다. 혈장 세포는 막-결합 항체를 생산하지 않지만 그 대신 분비될 수 있는 형태로 항체를 생산한다. 분비된 항체는 체액성 면역의 주요 이펙터 분자이다.

CD20 항원(인간 B-림프구-제한된 분화 항원, Bp35로도 칭함)은 프리-B 및 성숙 B 림프구 상에 위치하는 대략 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 막횡단 단백질이다(Valentine 등, J. Biol . Chem . 264(19): 11282-11287(1989); 및 Einfeld 등, EMBO J. 7(3): 711-717(1988)). 이 항원은 또한 90% 초과의 B 세포 비-호치킨 림프종(NHL)에서 발현되지만(Anderson 등, Blood 63(6): 1424-1433(1984)), 조혈 줄기 세포, 프로-B 세포, 정상 혈장 세포나 기타 정상 조직에서는 발견되지 않는다(Tedder 등, J. Immunol . 135(2): 973-979(1985)). CD20은 세포 주기 개시와 분화를 위한 활성화 과정에서의 초기 단계(들)를 조절하고(상기 Tedder 등) 가능하게는 칼슘 이온 채널로서 기능한다(Tedder 등, J. Cell . Biochem . 14D: 195(1990)).

B 세포 림프종에서 CD20의 발현을 가정하면, 이 항원은 그러한 림프종의 "표적화"를 위한 후보로 역할을 할 수 있다. 본질적으로, 그러한 표적화는 아래와 같이 일반화될 수 있다: B 세포의 CD20 표면 항원에 특이적인 항체를 환자에게 투여한다. 이들 항-CD20 항체는 (표면상으로) 정상 및 악성 B 세포 모두의 CD20 항원에 특이적으로 결합한다; CD20 표면 항원에 결합된 항체는 신생 B 세포의 파괴와 고갈을 일으킬 수 있다. 부가적으로, 종양을 파괴하는 잠재력을 가진 화학 물질이나 방사성 표지를 그 물질이 신생 B 세포에 특이적으로 "전달"되도록 항-CD20 항체에 접합시킬 수 있다. 접근법에 무관하게, 일차적 목표는 종양을 파괴하는 것이다; 구체적 접근법은 사용되는 특정 항-CD20 항체에 의해 결정될 수 있고, 따라서, CD20 항원을 표적화하기 위해 이용가능한 접근법은 상당히 변화할 수 있다.

CD19는 B 계통 세포의 표면 상에 발현되는 다른 항원이다. CD20과 같이, CD19는 줄기 세포 단계로부터 혈장 세포로의 최종 분화 바로 전 단계까지 계통의 분화 전체에 걸쳐 세포 상에서 발견된다(Nadler, L. Lymphocyte Typing Ⅱ 2: 3-37 및 부록, Springer Verlag에 의해 Renling 등 eds.(1986)). 그러나 CD20과 달리, CD19에 결합하는 항체는 CD19 항원의 내재화를 유발한다. CD19 항원은 특히 HD237-CD19 항체("B4" 항체로도 칭함)에 의해 동정된다(Kiesel 등, Leukemia Research Ⅱ, 12: 1119(1987)). CD19 항원은 말초 혈액 단핵세포의 4-8%와 말초 혈액, 비장, 림프절 또는 편도선으로부터 분리된 B 세포의 90% 초과에 존재한다. CD19는 말초 혈액 T 세포, 단핵구 또는 과립구 상에서는 검출되지 않는다. 거의 모든 비-T 세포 급성 림프구성 백혈병(ALL), B 세포 만성 림프구성 백혈병(CLL) 및 B 세포 림프종은 항체 B4에 의해 검출가능한 CD19를 발현한다(Nadler 등 J. Immunol. 131: 244(1983)); 및 Progress in Hematology ⅩⅡ권 187-206면 Grune & Stratton, Inc.에 의해 Brown, E. ed.(1981)에 있는 Nadler 등).

B 세포 계통의 세포에 의해 발현되는 분화 단계-특이적 항원을 인식하는 부가적인 항체가 동정되어 있다. 이들 중 CD21 항원에 대한 B2 항체; CD22 항원에 대한 B3 항체; 및 CD10 항원에 대한 J5 항체(CALLA로도 칭함)가 있다. 1997년 1월 21일 등록된 미국특허번호 5,595,721을 참조한다(Kaminski 등).

리툭시맵(리툭산(RITUXAN)(등록상표)) 항체는 CD20 항원에 대한 유전적으로 조작된 키메라 쥐/인간 모노클로날 항체이다. 리툭시맵은 1998년 4월 7일 등록된 미국특허번호 5,736,137(Anderson 등)에서 "C2B8"이라 불리는 항체이다. 리툭산(등록상표)은 재발 또는 난치성 저급 또는 소낭, CD20 양성, B 세포 비-호치킨 림프종에 걸린 환자의 치료를 적응증으로 한다. 시험관 내 작용기작 연구는 리툭산(등록상표)이 인간 보체에 결합하고 보체-의존적 세포독성(CDC)을 통해 림프성 B 세포주를 용해함을 증명하였다(Reff 등, Blood 83(2): 435-445(1994)). 부가적으로, 그것은 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)에 대한 어세이에서 유의한 활성을 갖는다. 더욱 최근에, 리툭산(등록상표)은, 다른 항-CD19 및 CD20 항체가 그렇지 않음에 비해, 삼중수소화된 티미딘 도입 어세이에서 항-증식 효과를 갖고 고사를 직접적으로 유도하는 것으로 밝혀졌다(Maloney 등 Blood 88(10): 637a(1996)). 리툭산(등록상표)과 화학요법과 독소 간의 상승효과 또한 실험적으로 관찰되었다. 특히, 리툭산(등록상표)은 독소루비신, CDDP, VP-16, 디프테리아 독소 및 리신의 세포독성 효과에 대해 약물-내성 인간 B 세포 림프종 세포주를 감작시킨다(Demidem 등 Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12(3): 177-186(1997)). 생체 내 전임상 연구는 리툭산(등록상표)이, 아마도 보체 및 세포-매개된 과정을 통해, 사이노몰거스 원숭이의 말초 혈액, 림프절 및 골수로부터 B 세포를 고갈시킴을 보여주었다(Reff 등 Blood 83(2): 435-445(1994)).

CD20 항체에 관한 특허와 공개특허는, 각각 참조에 의해 여기에 명시적으로 도입되는, 미국특허번호 5,776,456, 5,736,137, 6,399,061 및 5,843,439, 및 미국특허출원번호 US2002/0197255A1 및 US2003/0021781A1(Anderson 등); 미국특허번호 6,455,043B1 및 WO00/09160(Grillo-Lopez, A.); WO00/27428(Grillo-Lopez 및 White); WO0O/27433(Grillo-Lopez 및 Leonard); WO00/44788(Braslawsky 등); WO01/10462(Rastetter, W.); WO01/10461(Rastetter 및 White); WO01/10460(White 및 Grillo-Lopez); 미국출원번호 US2002/0006404 및 WO02/04021(Hanna 및 Hariharan); 미국출원번호 US2002/0012665A1 및 WO01/74388(Hanna, N.); 미국출원번호 US2002/0009444A1, 및 WO01/80884(Grillo-Lopez, A.); WO01/97858(White, C.); 미국출원번호 US2002/0128488A1 및 WO02/34790(Reff, M.); WO02/060955(Braslawsky 등); WO2/096948(Braslawsky 등); WO02/079255(Reff 및 Davies); 미국특허번호 6,171,586B1, 및 WO98/56418(Lam 등); WO98/58964(Raju, S.); WO99/22764(Raju, S.); WO99/51642, 미국특허번호 6,194,551B1, 미국특허번호 6,242,195B1, 미국특허번호 6,528,624B1 및 미국특허번호 6,538,124(Idusogie 등); WO00/42072(Presta, L.); WO00/67796(Curd 등); WO01/03734(Grillo-Lopez 등); 미국출원번호 US2002/0004587A1 및 WO01/77342(Miller 및 Presta); 미국출원번호 US2002/0197256(Grewal, I.); 미국특허번호 6,090,365B1, 6,287,537B1, 6,015,542, 5,843,398 및 5,595,721(Kaminski 등); 미국특허번호 5,500,362, 5,677,180, 5,721,108 및 6,120,767(Robinson 등); 미국특허번호 6,410,391B1(Raubitschek 등); 미국특허번호 6,224,866B1 및 WO00/20864(Barbera-Guillem, E.); WO01/13945(Barbera-Guillem, E.); WO00/67795(Goldenberg); WO00/74718(Goldenberg 및 Hansen); WO00/76542(Golay 등); WO01/72333(Wolin 및 Rosenblatt); 미국특허번호 6,368,596B1(Ghetie 등); 미국출원번호 US2002/0041847A1(Goldenberg, D.); 미국출원번호 US2003/0026801A1(Weiner 및 Hartmann); WO02/102312(Engleman, E.)를 포함한다. 또한 미국특허번호 5,849,898 및 EP 출원번호 330,191(Seed 등); 미국특허번호 4,861,579 및 EP332,865A2(Meyer 및 Weiss); 및 WO95/03770(Bhat 등)을 참조한다.

리툭시맵을 이용한 치료법에 관한 간행물은 문헌 [Perotta 및 Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" 초록 # 3360 Blood 10(1)(part 1-2): 88B면(1998); Stashi 등 "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98(4): 952-957(2001); Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist(2001년 4월 7일); Leandro 등 "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61: 833-888(2002); Leandro 등 "Lymphocyte depletion in thrumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy and dose response. Arthritis and Rheumatism 44(9): S370(2001); Leandro 등 "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus", Arthritis & Rheumatism 46(1): 2673-2677(2002); Edwards 및 Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rhematology 40: 205-211(2001); Edwards 등 "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem . Soc . Trans . 30(4): 824-828(2002); Edwards 등 "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism 46(9): S197(2002); Levine 및 Pestronk "IgM antibody-related polyneuropathies: B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52: 1701-1704(1999); DeVita 등 "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheum 46: 2029-2033(2002); Hidashida 등 "Treatment of DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with rituximab." LA 2002 뉴올리언즈; 10월 24-29일; Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology에서 제출; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab-refractory rheumatoid arthritis with rituximab" LA 2002 뉴올리언즈; 10월 24-29일; Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology에서 제출]을 포함한다.

류마티스성 관절염(RA)은 미지의 병인의 자가면역 장애이다. 대부분의 RA 환자는 치료를 하더라도, 진행성 관절 파괴, 변형, 불능 및 심지어 조기 사망을 일으킬 수 있는 만성 과정의 질병으로 고통받는다. 1년에 9백만이 넘는 내과의 왕진과 250,000이 넘는 입원이 RA로부터 초래된다. RA 치료법의 목표는 관절 손상을 방지하거나 제어하고, 기능 상실을 방지하고 통증을 줄이는 것이다. RA의 최초 치료법은 아래 약물 중 하나 이상의 투여를 포함한다: 비스테로이드성 소염진통제(NSAID), 글루코코르티코이드(관절 주사를 통해) 및 저-용량 프레드니손. 문헌 ["Guidelines for the management of rheumatoid arthritis" Arthritis & Rheumatism 46(2): 328-346(2002년 2월)]을 참조한다. 새로 RA로 진단된 대다수의 환자는 진단 3 개월 내에 질환-변형 항류마티스 약물(disease-modifying antirheumatic drug(DMARD)) 요법으로 시작된다. RA에 보편적으로 사용되는 DMARD는 하이드록시클로로퀸, 설파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 에타네르셉트, 인플릭시맵(+ 경구 및 피하 메토트렉세이트), 아자티오프린, D-페니실아민, 금(경구), 금(근육내), 미노사이클린, 사이클로스포린, 스타피로코커스 단백질 A 면역흡착체이다.

신체는 RA 동안 종양 괴사 인자 알파(TNFα)를 생산하므로, TNFα 저해제가 그 질환의 치료법을 위해 사용되어 왔다.

에타네르셉트(엔브렐(ENBREL)(등록상표))는 활동성 RA의 치료법을 위해 미국에서 허가된 주사용 약물이다. 에타네르셉트는 TNFα에 결합하고 관절과 혈액으로부터 대부분의 TNRα를 제거하여, TNFα가 염증과 류마티스성 관절염의 기타 증상을 촉진하는 것을 방지한다. 에타네르셉트는 인간 IgG1의 Fc 부분에 결합된 인간 75 kD(p75) 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)의 세포외 리간드 결합 부분으로 구성된 "면역부착소" 융합 단백질이다. 이 약물은 심각한 감염과 패혈증, 다발성 경화증(MS)과 같은 신경계 장애를 포함하는 부정적인 부작용과 관련되어 있었다. 예를 들어, www.remicade-infliximab.com/pages/enbrel_embrel.html을 참조한다.

상품명 레미케이드(REMICADE)(등록상표)로 판매되는, 인플릭시맵은 RA와 크론병을 치료하는데 처방되는 면역-억제 약물이다. 인플릭시맵은 TNFα에 결합하고 염증을 일으키는 TNFα를 표적화하고 그에 결합함으로써 체내에서 염증을 감소시키는 키메라성 모노클로날 항체이다. 인플릭시맵은 심부전증와 결핵을 포함하는 감염과 같은 치명적인 반응과 MS를 초래하는 수초탈락과 연관되어 있었다.

2002년 12월에, 애보트 래보라토리즈는 이전에 D2E7으로 알려져 있던, 아달리무맵(adalimumab)(휴미라(HUMIRA)™)을 시판하도록 FDA 허가를 받았다. 아달리무맵은 TNFα에 결합하는 인간 모노클로날 항체이고 하나 이상의 전통적인 질환 변형 DMARD에 불충분한 반응을 나타내었던 중간 내지 심각한 활동성 RA에 걸린 성인에서 징후와 증상을 감소시키고 구조적 손상의 진행을 저해하기 위하여 허가되어 있다.

본 발명은 TNFα-저해제에 대해 부적절한 반응을 경험하는 포유류에서 자가면역 질환을 치료하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 제1 측면에서, 포유류에게 치료 유효량의 B 세포 표면 마커에 결합하는 안타고니스트를 투여하는 것을 포함하는, TNFα-저해제에 대한 부적절한 반응을 경험하는 포유류에서 자가면역 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

예를 들어, 본 발명은 포유류에게 치료 유효량의 CD20에 결합하는 항체를 투여하는 것을 포함하는, TNFα-저해제에 대한 부적절한 반응을 경험하는 포유류에서 류마티스성 관절염을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 자가면역 질환에 걸린 환자에게 치료 유효량의 B 세포 표면 마커에 결합하는 안타고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 감염, 심부전증 및 수초탈락으로 이루어진 군으로부터 선택되는 부정적 부작용의 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 상기 안타고니스트를 사용하여 TNFα-저해제에 대해 부적절한 반응을 경험하는 포유류에서 자가면역 질환을 치료할 수 있다.

Ⅰ. 정의

여기에서의 목적을 위해, "종양 괴사 인자 알파(TNFα)"는 문헌 [Pennica 등, Nature, 312: 721(1984) 또는 Aggarwal 등, JBC, 260: 2345(1985)]에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 인간 TNFα 분자를 말한다.

여기에서 "TNFα 저해제"는 일반적으로 TNFα에 결합하고 그의 활성을 중화하는 것을 통해, TNFα의 생물학적 기능을, 어느 정도로, 저해하는 물질이다. 여기에서 구체적으로 착상된 TNF 저해제의 예는 에타네르셉트(엔브렐(등록상표)), 인플릭시맵(레미케이드(등록상표)) 및 아달리무맵(휴미라™)이다.

용어 "TNFα-저해제에 대한 부적절한 반응"은 독성 및(또는) 부적절한 효능으로 인한 TNFα-저해제로의 이전 또는 현재 치료에 대한 부적절한 반응을 말한다. 부적절한 반응은 해당 질환을 치료하는데 능숙한 임상의에 의해 평가될 수 있다.

TNFα-저해제로의 이전 또는 현재 치료로부터 "독성"을 경험한 포유류는 감염(특히 심각한 감염), 울혈성 심부전증, 수초탈락(다발성 경화증에 이르게 함), 과민성, 신경 현상, 자가면역, 비-호치킨 림프종, 결핵(TB), 자가항체 등과 같은 그와 관련된 하나 이상의 부정적인 부작용을 경험한다.

"부적절한 효능"을 경험하는 포유류는 TNFα-저해제로의 이전 또는 현재 치료 후 활동성 질환을 계속해서 갖는다. 예를 들어, 환자는 TNFα-저해제로의 1 개월 또는 3 개월의 치료 후에 활동성인 질환 활성을 가질 수 있다.

"부정적 부작용의 위험을 감소시키는"은 B-세포 표면 마커에 결합하는 안타고니스트로의 치료로부터 기인하는 부작용의 위험을 TNFα-저해제로의 치료로 나타난 것 보다 더 낮은 정도로 감소시키는 것을 의미한다. 그러한 부작용은 감염(특히 심각한 감염), 심부전증 및 수초탈락(다발성 경화증) 등을 포함한다.

여기에서의 "B 세포 표면 마커"는 그에 결합하는 안타고니스트로 표적화될 수 있는 B 세포의 표면 상에 발현되는 항원이다. 예시적인 B 세포 표면 마커는 CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 및 CD86 백혈구 표면 마커를 포함한다. 특히 관심있는 B 세포 표면 마커는 포유류의 다른 비-B 세포 조직에 비해 B 세포 상에서 우선적으로 발현되고 전구 B 세포와 성숙 B 세포 모두에서 발현될 수 있다. 일 실시양태에서, 마커는 CD20이나 CD19와 같이, 줄기 세포 단계로부터 혈장 세포로의 최종 분화 직전 단계까지 계통의 분화 전체에 걸쳐 B 세포 상에서 발견되는 것이다. 여기에서 바람직한 B 세포 표면 마커는 CD20이다.

"CD20" 항원은 말초혈액이나 림프 기관으로부터의 B 세포의 90% 초과의 표면 상에서 발견되는 ~35 kDa의 비-글리코실화된 인단백질이다. CD20은 초기 프리-B 세포 발생 동안 발현되고 혈장 세포 분화까지 남아있다. CD20은 정상 B 세포와 악성 B 세포 모두에서 존재한다. 문헌에서 CD20에 대한 다른 이름은 "B-림프구-제한된 항원" 및 "Bp35"를 포함한다. CD20 항원은 예를 들어, 문헌 [Clark 등 PNAS(USA) 82: 1766(1985)]에 기재되어 있다.

여기에서의 "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직으로부터 유발되고 그에 대한 질환이나 장애이다. 자가면역 질환이나 장애의 예는 관절염(류마티스성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 골관절염, 건선성 관절염), 건선, 피부염, 다발성근염/피부근염, 독성 표피괴저성 분리증, 전신성 피부경화증 및 경화증, 염증성 장 질환과 관련된 반응, 크론병, 궤양성 결장염, 호흡 장애 증후군, 성인 호흡 장애 증후군(ARDS), 수막염, 뇌염, 포도막염, 결장염, 사구체신염, 알레르기성 이상, 습진, 천식, T 세포 침윤과 만성 염증성 반응이 연루된 이상, 아테롬성경화증, 자가면역성 심근염, 백혈구 부착 결핍증, 전신 홍반성 루푸스(SLE), 소아 발병 당뇨, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염, 사이토카인과 T 림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연 과민성과 관련된 면역 반응, 결핵, 유육종증, 베거너 육아종증을 포함하는 육아종증, 무과립구증, 혈관염(ANCA 포함), 재생불량성 빈혈, 다이아몬드 블랙팬 빈혈, 자가면역 용혈성 빈혈(AIHA)을 포함하는 면역 용혈성 빈혈, 악성 빈혈, 순수 적혈구 무형성증(PRCA), 제Ⅷ 인자 결핍, 혈우병 A, 자가면역 호중구감소증, 범혈구감소증, 백혈구감소증, 백혈구 유출이 연루된 질환, 중추신경계(CNS) 염증 장애, 다발성 기관 손상 증후군, 중증근무력증, 항원-항체 복합체 매개된 질환, 항-사구체 기저 막 질환, 항-인지질 항체 증후군, 알레르기성 신경염, 베체트병, 캐슬만 증후군, 굿패스쳐 증후군, 램버트-이튼 근무력 증후군, 레이노 증후군, 쇼그렌 증후군, 스티븐스-존슨 증후군, 고형 기관 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 수포성 유천포창, 천포창, 자가면역 다발성 내분비선 이상, 라이터병, 근강직성 증후군, 거대세포 동맥염, 면역 복합체 신염, IgA 신증, IgM 다발신경병증 또는 IgM 매개된 신경병증, 특발성 혈소판감소 자색반병(ITP), 혈전성 혈소판감소 자색반병(TTP), 자가면역 혈소판감소증, 자가면역 고환염 및 난소염을 포함하는 고환과 난소의 자가면역 질환, 원발성 갑상선기능저하증; 자가면역 갑상선염, 만성 갑상선염(하시모토 갑상선염), 아급성 갑상선염, 특발성 갑상선기능저하증, 애디슨병, 그레이브스병, 자가면역 다선 증후군(또는 다선 내분비 이상 증후군), 인슐린-의존성 진성 당뇨(IDDM)로도 불리는 Ⅰ형 당뇨 및 쉬한 증후군을 포함하는 자가면역 내분비 질환; 자가면역 간염, 림프 간질성 폐렴(HIV), 폐색성 세기관지염(비-이식편) 대 비특이적 간질성 폐렴 (NSIP), 귈레앙-바레 증후군, 대형 혈관 혈관염(류마티스성 다발성근육통 및 거대세포(타카야스) 동맥염 포함), 중간 혈관 혈관염(카와사키병과 결절 다발동맥염 포함), 강직성 척추염, 버거스병(IgA 신증), 신속하게 진행하는 사구체신염, 원발성 담도폐쇄증, 복강 스프루우(글루텐 장질환), 한랭글로불린혈증, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 관상동맥 질환 등을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

"안타고니스트"는, B 세포 표면 마커에 결합 시, 포유류에서 B 세포를 파괴하거나 고갈시키고(거나) 예를 들어, B 세포에 의해 촉발되는 체액성 반응을 감소시키거나 방지함으로써, 하나 이상의 B 세포 기능을 방해하는 분자이다. 안타고니스트는 바람직하게는 그로 처리된 포유류에서 B 세포를 고갈(즉, 순환 B 세포 수준을 감소)시킬 수 있다. 그러한 고갈은 항체-의존성 세포 매개된 세포독성(ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성(CDC), B 세포 증식의 저해 및(또는) B 세포 사멸의 유도(예를 들어, 고사를 통해)와 같은 다양한 기작을 통해 달성될 수 있다. 본 발명의 범위 내에 포함되는 안타고니스트는, 임의로 세포독성제와 접합되거나 융합된, B 세포 마커에 결합하는 항체, 합성 또는 천연 서열 펩티드 및 소분자 안타고니스트를 포함한다. 바람직한 안타고니스트는 항체를 포함한다.

"항체-의존적 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연 킬러(NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상에 결합된 항체를 인식하고 이어서 표적 세포의 용해를 유발하는 세포-매개된 반응을 말한다. 단핵구가 FcγⅠ, FcγⅡ 및 FcγⅢ를 발현함에 비해, ADCC를 매개하는 일차적 세포, NK 세포는 FcγⅢ만을 발현한다. 조혈 세포 상의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch 및 Kinet, Annu . Rev . Immunol 9: 457-92(1991)의 464면의 표 3]에 요약되어 있다. 관심있는 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위하여, 미국특허번호 5,000,362 또는 5,821,337에 기재되어 있는 것과 같은, 시험관 내 ADCC 어세이가 수행될 수 있다. 그러한 어세이를 위해 유용한 이펙터 세포는 말초혈액 단핵세포(PBMC) 및 자연 킬러(NK) 세포를 포함한다. 대안으로 또는 부가하여, 관심있는 분자의 ADCC 활성은 예를 들어, 문헌 [Clynes 등, PNAS ( USA ) 95: 652-656(1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서, 생체 내에서 평가될 수 있다.

"인간 이펙터 세포"는 하나 이상의 FcR를 발현하고 이펙터 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 세포는 적어도 FcγⅢ를 발현하고 ADCC 이펙터 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예는 말초혈액 단핵구(PBMC), 자연 킬러(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구를 포함하고; PBMC와 NK 세포가 바람직하다.

용어 "Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 부위에 결합하는 수용체를 기술하는데 사용된다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 더욱이, 바람직한 FcR은 IgG 항체(감마 수용체)에 결합하는 것이고 FcγⅠ, FcγⅡ 및 FcγⅢ 서브클래스의 수용체를, 이들 수용체의 대립형질 변이체와 대체 스플라이스된 형태를 포함하여, 포함한다. FcγⅡ 수용체는 일차적으로 그 세포질 영역에서 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는, FcγⅡA("활성화 수용체")와 FcγⅡB("저해 수용체")를 포함한다. 활성화 수용체 FcγⅡA는 그 세포질 영역에 면역수용체 티로신-기초 활성화 모티프(ITAM)를 함유한다. 저해 수용체 FcγⅡB는 그의 세포질 영역에 면역수용체 티로신-기초 저해 모티프(ITIM)을 함유한다(문헌 [Daeron, Annu . Rev . Immunol. 15: 203-234(1997)] 참조). FcR은 문헌 [Ravetch 및 Kinet, Annu . Rev . Immunol. 9: 457-92(1991); Capel 등, Immunomethods 4: 25-34(1994); 및 de Haas 등, J. Lab . Clin . Med. 126: 330-41(1995)]에서 검토되어 있다. 장래에 동정될 것들을 포함하는, 다른 FcR은 여기에서 용어 "FcR"에 의해 포함된다. 용어는 또한 모체 IgGs를 태아에게 전달하는 것을 담당하는, 신생 수용체, FcRn을 포함한다(Guyer 등, J. Immunol . 117: 587(1976) 및 Kim 등, J. Immunol . 24: 249(1994)).

"보체 의존적 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재 하에 표적을 용해하는 분자의 능력을 말한다. 보체 활성화 경로는 동족 항원과 복합체화된 분자(예를 들어, 항체)에 대한 보체 시스템(C1q)의 제1 성분의 결합에 의해 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위하여, 문헌 [Gazzano-Santoro 등, J. Immunol . Methods 202: 163(1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 어세이가 수행될 수 있다.

"성장 저해" 안타고니스트는 안타고니스트가 결합하는 항원을 발현하는 세포의 증식을 방지하거나 감소시키는 것들이다. 예를 들어, 안타고니스트는 시험관 내 및(또는) 생체 내에서 B 세포의 증식을 방지하거나 감소시킬 수 있다.

"고사를 유도하는" 안타고니스트는 어넥신 Ⅴ의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포 단편화 및(또는) 막 소포의 형성(고사체라고 칭함)과 같은, 표준 고사 어세이에 의해 결정되는 바, 예를 들어, B 세포의, 프로그램된 세포 사멸을 유도하는 것들이다.

여기에서의 용어 "항체"는 최광의로 사용되고 구체적으로 완전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 적어도 두 완전 항체로부터 형성된 다중특이성 항체(예를 들어, 이중특이성 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함한다.

"항체 단편"은 완전한 항체의, 바람직하게는 그의 항원-결합 또는 가변영역을 포함하는, 부분을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함한다.

"천연 항체"는 보통, 두 동일한 경(L)쇄와 두 동일한 중(H)쇄로 이루어지는, 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 디설파이드 결합의 수가 상이한 면역글로불린 이소타입의 중쇄 간에 변화하는 반면, 각 경쇄는 하나의 공유적 디설파이드 결합에 의해 중쇄에 연결된다. 각각의 중쇄와 경쇄는 또한 규칙적으로 간격을 두고 배치된 쇄내 디설파이드 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 일 말단에 하나의 가변영역(V_H)에 이어서 많은 불변영역을 갖는다. 각각의 경쇄는 일 말단에 하나의 가변영역(V_L)과 그의 다른 말단에 하나의 불변영역을 갖는다; 경쇄의 불변영역은 중쇄의 제1 불변영역과 정렬되고, 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변영역과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄와 중쇄 가변영역 간의 경계를 형성하는 것으로 여겨진다.

용어 "가변"은 가변영역의 어느 부분이 항체 간 서열에서 크게 상이하고 각각의 특정 항체의 그의 특정 항원에 대한 결합 및 특이성에 사용되는 사실을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변영역 전체에 균일하게 분포되어 있지 않다. 그것은 경쇄와 중쇄 가변영역 둘다에서 고가변 부위라 불리는 세 조각에 집중되어 있다. 가변영역의 보다 더 보존된 부분은 프레임워크 부위(FR)라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변영역은 각각 β-시트 구조를 연결하고, 일부 경우 그의 일부를 형성하는 루프를 형성하는, 세 고가변 부위에 의해 연결되는, 대개 β-시트 배열을 채택하는, 네 FR(각각 FR1, FR2, FR3 및 FR4)를 포함한다. 각 쇄의 고가변 부위는 FR에 의해 가까운 근위부에 함께 유지되고, 다른 쇄로부터의 고가변 부위와 함께 항체의 항원-결합 위치의 형성에 기여한다(문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991), 647-669면] 참조). 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관여하지 않지만, 항체 의존적 세포 독성(ADCC)에서 항체의 참여와 같은, 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.

항체의 파파인 분해는 각각 단일 항원-결합 위치를 갖는, "Fab" 단편이라 불리는, 두 동일한 항원-결합 단편과, 그 이름이 용이하게 결정화하는 그의 능력을 반영하는, 잔여 "Fc" 단편을 생산한다. 펩신 처리는 두 항원-결합 위치를 갖고 여전히 항원을 교차-결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성한다.

"Fv"는 완전한 항원-인식 및 항원-결합 위치를 함유하는 최소 항체 단편이다. 이 부위는 견고한, 비-공유적 결합된 한 중쇄와 한 경쇄 가변영역의 다이머로 구성된다. 그것은 각 가변영역의 세 고가변 부위가 상호작용하여 V_H-V_L 다이머의 표면 상에 항원-결합 위치를 결정하는 이 배열로 있다. 총괄적으로, 6개의 고가변 부위는 항체에 항원-결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일의 가변영역(또는 단지 항원에 특이적인 세 고가변 부위만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 비록 전체 결합 위치 보다 낮은 친화도일지라도, 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

Fab 단편은 또한 경쇄의 불변영역과 중쇄의 제1 불변영역(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 경첩부로부터의 하나 이상의 시스테인(들)을 포함하는 중쇄 CH1 영역의 카르복실 말단에서 소수 잔기의 첨가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 여기에서 불변영역의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올 그룹을 갖는 Fab'에 대한 명명이다. F(ab')₂ 항체 단편은 원래 그들 사이에 경첩 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 생산되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 또한 알려져 있다.

어느 척추동물 종으로부터의 항체(면역글로불린)의 "경쇄"는 그들 불변영역의 아미노산 서열에 기초하여, 카파(κ)와 람다(λ)로 불리는, 두개의 분명하게 구별되는 유형 중 하나로 지정될 수 있다.

그들 중쇄의 불변영역의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 상이한 클래스로 지정될 수 있다. 완전한 항체의 5개의 주요 클래스: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM가 있고, 이들의 몇몇은 서브클래스(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더 나뉘어질 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변영역은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다. 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조와 삼차원 배열은 잘 알려져 있다.

"단일-쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 V_H 및 V_L 영역으로서, 이들 영역이 단일의 폴리펩티드 쇄에 존재하는 것을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 sFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있도록 하는 V_H와 V_L 영역 간의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함한다. sFv의 검토를 위해 문헌 [Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113권, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, 269-315면(1994)]을 참조한다.

용어 "디아바디"(diabody)는 단편이 동일한 폴리펩티드 쇄에 경쇄 가변영역(V_L)에 연결된 중쇄 가변영역(V_H)을 포함하는(V_H-V_L), 두 항원-결합 위치를 갖는 소 항체 단편을 말한다. 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 두 영역 간의 쌍형성을 허용하지 못하는 링커를 사용함으로써, 영역은 다른 쇄의 상보적인 영역과 쌍을 형성하도록 강제되며 두 항원-결합 위치를 창출한다. 디아바디는 예를 들어, EP404,097; WO93/11161; 및 문헌 [Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 90: 6444-6448(1993)]에 더 상세히 기재되어 있다.

여기에서 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체, 즉, 그 집단을 구성하는 개개의 항체가 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 말한다. 모노클로날 항체는 매우 특이적이며, 단일의 항원 위치에 대해 지향되어 있다. 더욱이, 상이한 결정기(에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적(폴리클로날) 항체 제제와 반대로, 각 모노클로날 항체는 단일의 항원 상 결정기에 대해 지향되어 있다. 그들의 특이성에 더하여, 모노클로날 항체는 그들이 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않은, 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 우수하다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 얻어지는 항체의 특성을 가리키고 어느 특정 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler 등, Nature 256: 495(1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조되거나, 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국특허번호 4,816,567 참조)에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어 문헌 [Clackson 등, Nature 352: 624-628(1991) 및 Marks 등, J. Mol . Biol . 222: 581-597(1991)]에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있다.

여기에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 쇄(들)의 나머지가 또다른 종으로부터 유래되거나 또다른 항체 클래스나 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동적이면서, 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스나 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동적인 "키메라" 항체(면역글로불린)와, 그러한 항체의 단편을, 그들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한, 포함한다(미국특허번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 81: 6851-6855(1984)]). 여기에서 관심있는 키메라 항체는 비인간 영장류(예를 들어, 개코원숭이, 붉은털원숭이, 또는 사이노몰거스 원숭이와 같은, 구세계 원숭이)로부터 유래된 가변영역 항원-결합 서열을 포함하는 "영장류화된" 항체를 포함한다(미국특허번호 5,693,780).

비-인간(예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소의 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 부분에 대해, 인간화된 항체는 인간 면역글로불린(수혜자 항체)이고 여기에서 수혜자의 고가변 부위 잔기는 원하는 특이성, 친화도 및 용량을 갖는 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은, 비-인간 종(공여자 항체)의 고가변 부위로부터의 잔기에 의해 대체된다. 일부 경우, 인간 면역글로불린의 프레임워크 부위(FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 더욱이, 인간화된 항체는 수혜자 항체나 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 개량하기 위하여 가해진다. 일반적으로, 인간화된 항체는 모든 또는 실질적으로 모든 고가변 루프가 비-인간 면역글로불린의 것들에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR이 인간 면역글로불린 서열의 것들인, 실질적으로 모든 적어도 하나, 전형적으로 두개의, 가변영역을 포함할 것이다. 인간화된 항체는 임의로 또한 면역글로불린 불변영역(Fc), 전형적으로 인간 면역글로불린의 것의 적어도 일부를 포함할 것이다. 더 상세한 것에 대해, 문헌 [Jones 등, Nature, 321: 522-525(1986); Reichmann 등, Nature, 332: 323-329(1986); 및 Presta, Curr . Op . Struct . Biol ., 2: 593-596(1992)]을 참조한다.

여기에서 사용될 때 용어 "고가변 부위"는 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 고가변 부위는 "상보성 결정 부위" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기(즉, 경쇄 가변영역의 잔기 24-34(L1), 50-56(L2) 및 89-97(L3)과 중쇄 가변영역의 31-35(H1), 50-65(H2) 및 95-102(H3); 문헌 [Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5판, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991)]) 및(또는) "고가변 루프"로부터의 그들 잔기(즉, 경쇄 가변영역의 잔기 26-32(L1), 50-52(L2) 및 91-96(L3)과 중쇄 가변영역의 26-32(H1), 53-55(H2) 및 96-101(H3); [Chothia 및 Lesk, J. Mol . Biol. 196: 901-917(1987)])를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 여기에 정의된 바와 같은 고가변 부위 잔기 이외의 그들 가변영역 잔기이다.

관심있는 항원, 예를 들어, B 세포 표면 마커에 "결합하는" 안타고니스트는 안타고니스트가 항원을 발현하는 세포를 표적화하기 위한 치료제로 유용하도록 충분한 친화도 및(또는) 능력으로 그 항원에 결합할 수 있는 것이다.

CD20 항원에 결합하는 항체의 예는 이제 "리툭시맵"(리툭산(등록상표))으로 불리는 "C2B8"(참조에 의해 여기에 명시적으로 도입되는 미국특허번호 5,736,137); "Y2B8"로 명명된 이트륨-[90]-표지된 2B8 쥐 항체(참조에 의해 여기에 명시적으로 도입되는 미국특허번호 5,736,137); "¹³¹I-B1" 항체를 생성하기 위하여 임의로 ¹³¹I로 표지된 쥐 IgG2a "B1"(벡사르(BEXXAR)™)(참조에 의해 여기에 명시적으로 도입되는 미국특허번호 5,595,721); 쥐 모노클로날 항체 "1F5"(Press 등, Blood 69(2): 584-591(1987)); "키메라 2H7 항체"(참조에 의해 여기에 명시적으로 도입되는 미국특허번호 5,677,180); "인간화된 2H7 v16"(아래 참조); huMax-CD20(젠맵, 덴마크); AME-133(어플라이드 몰레큘라 에볼류션); 및 International Leukocyte Typing Workshop(Valentine 등, Leukocyte Typing Ⅲ(McMichael, Ed., 440면, Oxford University Press(1987))으로부터 입수가능한 모노클로날 항체 L27, G28-2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2:를 포함한다.

CD19 항원에 결합하는 항체의 예는 문헌 [Hekman 등, Cancer Immunol . Immunother. 32: 364-372(1991) 및 Vlasveld 등 Cancer Immunol . Immunother . 40: 37-47(1995)의 항-CD19 항체; 및 Kiesel 등, Leukemia Research Ⅱ, 12: 1119(1987)]의 B4 항체를 포함한다.

용어 "리툭시맵" 또는 "리툭산(등록상표)"은 참조에 의해 여기에 명시적으로 도입되는, 미국특허번호 5,736,127에서 "C2B8"로 명명된 CD20 항원에 대한 유전적으로 조작된 키메라 쥐/인간 모노클로날 항체를 말한다. 이 항체는 쥐 경 및 중쇄 가변영역 서열과 인간 불변영역 서열을 포함하는 IgG₁ 카파 면역글로불린이다. 리툭시맵은 대략 8.0 nM의 CD20 항원에 대한 결합 친화도를 갖는다.

순수하게 여기에서의 목적을 위해, "인간화된 2H7 v16"은 아래 나타낸 가변 경쇄 및 가변 중쇄 서열을 포함하는 항체를 말한다.

hu2H7 v16의 가변 경쇄 영역

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR(서열 1)

hu2H7 v16의 가변 중쇄 영역

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSS(서열 2)

바람직하게는 인간화된 2H7 v16은 경쇄 아미노산 서열 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(서열 3); 및 중쇄 아미노산 서열 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(서열 4)를 포함한다.

"분리된" 안타고니스트는 동정되고 그의 자연 환경의 성분으로부터 분리 및(또는) 회수된 것이다. 그의 자연 환경의 오염성분은 안타고니스트의 진단 또는 치료적 용도를 방해하는 물질이고, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 안타고니스트는 (1) 라우리법에 의해 결정되는 바로 95 중량% 초과, 가장 바람직하게는 99 중량% 초과의 안타고니스트로, (2) 스피닝 컵 서열결정기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15 잔기를 수득하는데 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루 또는, 바람직하게는, 은 염색을 이용하여 환원 또는 비환원 조건 하에서 SDS-PAGE에 의한 상동성까지 정제될 수 있다. 분리된 안타고니스트는 재조합 세포 내 인 사이츄의 안타고니스트를 안타고니스트의 자연 환경의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않으므로 포함한다. 그러나, 통상적으로, 분리된 안타고니스트는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

치료 목적을 위한 "포유류"는 인간, 개, 말, 고양이, 소 등과 같은, 가축 및 농장 동물, 및 동물원, 스포츠 또는 애완 동물을 포함하는, 포유류로 분류되는 어느 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유류는 인간이다.

"치료"는 치료적 치료와 예방적 또는 방지적 처치 둘다를 말한다. 치료를 필요로 하는 이들은 이미 질환이나 장애에 걸린 사람들과 질환이나 장애가 예방되어야 하는 사람들을 포함한다. 따라서, 포유류는 질환이나 장애를 갖는 것으로 진단되었거나 질환에 걸리기 쉽거나 민감성일 수 있다.

표현 "치료 유효량"은 해당 자가면역 질환을 예방, 완화 또는 치료하기 위해 유효한 안타고니스트의 양을 말한다.

보조 요법을 위해 여기에 사용된 바 용어 "면역억제제"는 여기에서 치료되는 포유류의 면역 시스템을 억제하거나 차단하는 작용을 하는 물질을 말한다. 이것은 사이토카인 생산을 억제하거나, 자가-항원 발현을 하향조절하거나 억제하거나, MHC 항원을 차단하는 물질을 포함한다. 그러한 물질의 예는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘(개시내용이 참조에 의해 여기에 도입되는 미국특허번호 4,665,077); 비스테로이드성 소염진통제(NSAID); 아자티오프린; 사이클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 답손; 글루타르알데히드(미국특허번호 4,120,649에 기재된 바와 같이, MHC 항원을 차단함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 사이클로스포린 A; 글루코코르티코이드, 예를 들어, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손과 같은 스테로이드; 메토트렉세이트(경구 또는 피하); 하이드록시클로로퀸; 설파살라진; 레플루노마이드; 항-인테페론 γ, β 또는 α항체, 항-종양괴사인자-α 항체(인플릭시맵 또는 아달리무맵), 항-TNFα 면역부착소(에타네르셉트), 항-종양괴사인자-β 항체, 항-인터류킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체를 포함하는 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 안타고니스트; 항-CD11a 및 항-CD18 항체를 포함하는 항-LFA-1 항체; 항-L3T4 항체; 이종 항-림프구 글로불린; 범-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 영역을 함유하는 가용성 펩티드(90년 7월 26일에 공개된 WO90/08187); 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체(Cohen 등, 미국특허번호 5,114,721); T-세포 수용체 단편(Offner 등, Science, 251: 430-432(1991); WO90/11294; Ianeway, Nature, 341: 482(1989); 및 WO91/01133); 및 T10B9와 같은 T 세포 수용체 항체(EP 340,109)를 포함한다.

여기에 사용된 바 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해 또는 방지하고(거나) 세포의 파괴를 유발하는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소(예를 들어, At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제, 및 소분자 독소와 같은 독소나 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 또는 그의 단편을 포함하고자 하는 것이다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 티오테파 및 사이클로포스파미드(시톡산(CYTOXAN)™)와 같은 알킬화제; 부설판, 임프로설판 및 피포설판과 같은 알킬 설포네이트; 벤조포다, 카보쿠온, 메튜레도파 및 우레도파와 같은 아지리딘; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 클로람뷰실, 클로르나파진, 클로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드와 같은 질소 머스타드; 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴과 같은 니트로소우레아; 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 칼리케아미신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 테토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 펩로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신과 같은 항생제; 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU)과 같은 항-대사물; 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트와 같은 폴산 유사체; 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌과 같은 퓨린 유사체; 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스우리딘, 5-FU와 같은 피리미딘 유사체; 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤과 같은 안드로겐; 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄과 같은 항-아드레날; 프롤린산과 같은 폴산 보충제; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레뷸린산; 암사크린; 베스트라뷰실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미톡산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK(등록상표); 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, 파클리탁셀(탁솔(TAXOL)(등록상표), NJ, 프린스톤, 브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지) 및 도세탁셀(탁소티어(TAXOTERE)(등록상표), 프랑스, 안토니, 롱-프랑 로라); 클로람뷰실; 겜시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 시스플라틴 및 카보플라틴과 같은 백금 유사체; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포사이드; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 저해제 RFS2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라미신; 카페시타빈; 및 상기한 것 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 이 정의에 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해 4(5)-이미다졸, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 토레미펜(파레스톤)을 포함하는 항-에스트로겐; 플루타미드, 니루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린과 같은 항-안드로겐; 및 상기한 것 중 어느 것의 약제학적으로 허용되는 염, 산 또는 유도체와 같은 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 저해하는 작용을 하는 항-호르몬제도 포함된다.

용어 "사이토카인"은 세포간 매개자로서 다른 세포에 작용하는 한 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 포괄적 용어이다. 그러한 사이토카인의 예는 림포카인, 모노카인 및 전통적 폴리펩티드 호르몬이다. 사이토카인 중에 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬과 같은 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴렉신; 프로릴렉신; 여포자극호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체형성호르몬(LH)과 같은 당단백질 호르몬; 간 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프로락틴; 태반 락토젠; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 뮬러리안-저해 물질; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); NGF-β와 같은 신경 성장 인자; 혈소판-성장 인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 형질전환 성장 인자(TGF); 인슐린-양 성장 인자-Ⅰ 및 -Ⅱ; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자; 인터페론-α, -β 및 -γ와 같은 인터페론; 대식세포-CSF(M-CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 및 과립구-CSF(G-CSF)와 같은 콜로니 자극 인자(CSF); IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15와 같은 인터류킨(ILs); TNF-α 또는 TNF-β와 같은 종양 괴사 인자; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 포함하는 기타 폴리펩티드 인자도 포함된다. 여기에 사용된 바, 용어 사이토카인은 자연 출처나 재조합 세포 배양물로부터의 단백질과 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 균등물을 포함한다.

본 출원에서 사용된 바 용어 "프로드럭"은 친 약물에 비해 종양 세포에 대해 덜 세포독성이고 더 활성적인 친 형태로 효소적으로 활성화되거나 전환될 수 있는 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 말한다. 예를 들어, 문헌 [Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, 375-382면, 615th Meeting Belfast(1986) 및 Stella 등, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt 등(ed.), 247-267면, Humana Press(1985)]를 참조한다. 본 발명의 프로드럭은 보다 활성적인 세포독성 유리 약물로 전환될 수 있는 포스페이트-함유 프로드럭, 티오포스페이트-함유 프로드럭, 설페이트-함유 프로드럭, 펩티드-함유 프로드럭, D-아미노산-변형된 프로드럭, 글리코실화된 프로드럭, β-락탐-함유 프로드럭 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드-함유 프로드럭, 5-플루오로시토신 및 기타 5--플루오로우리딘 프로드럭을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용하기 위해 프로드럭 형태로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예는 상기된 화학요법제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

"리포좀"은 포유류로 약물(예컨대, 여기에 개시된 안타고니스트와, 임의로, 화학요법제)을 전달하기 위해 유용한 다양한 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 소 액포이다. 리포좀의 성분은 생체 막의 지질 배열과 유사하게, 이중층 형태로 보편적으로 배열된다.

Ⅱ. 안타고니스트의 생산

본 발명의 제조 방법과 물품은 B 세포 표면 마커에 결합하는 안타고니스트를 사용하거나 도입한다. 따라서, 그러한 안타고니스트를 생성하는 방법이 여기에 설명될 것이다.

안타고니스트(들)를 생산, 또는 스크리닝하기 위해 사용되는 B 세포 표면 마커는 예를 들어, 원하는 에피토프를 함유하는 항원의 가용성 형태 또는 그의 일부일 수 있다. 대안으로, 또는 부가하여, B 세포 표면 마커를 그들 세포 표면에 발현하는 세포가 안타고니스트(들)를 생성하거나 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 안타고니스트를 생성하는데 유용한 다른 형태의 B 세포 표면 마커는 당업자에게 명백할 것이다. 바람직하게는, B 세포 표면 마커는 CD20 항원이다.

바람직한 안타고니스트가 항체인 반면, 항체 이외의 안타고니스트가 여기에서 착상된다. 예를 들어, 안타고니스트는 세포독성제(예컨대, 여기에 기재된 것들)에 임의로 융합되거나, 그와 접합된, 소분자 안타고니스트를 포함할 수 있다. 그 항원에 결합하는 소분자를 동정하기 위하여 소분자의 라이브러리가 여기에서 관심있는 B 세포 표면 마커에 대해 스크린될 수 있다. 소분자는 추가로 그의 길항 성질에 대해 스크린되고(거나) 세포독성제와 접합될 수 있다.

안타고니스트는 또한 논리적 설계나 파지 디스플레이에 의해 생성된 펩티드일 수 있다(예를 들어, 1998년 8월 13일에 공개된 WO98/35036을 참조함). 일 실시양태에서, 선택되는 분자는 항체의 CDR에 기초하여 설계된 "CDR 모사체"나 항체 유사체일 수 있다. 그러한 펩티드가 그들 자체로 길항적일 수 있는 반면, 펩티드는 임의로 펩티드의 길항 성질을 부가하거나 증진시키기 위하여 세포독성제에 융합될 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 항체 안타고니스트의 생산을 위한 예시적 기술에 관한 설명이 따른다.

(ⅰ) 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 바람직하게는 관련 항원과 애쥬번트의 여러 피하(sc) 또는 복강내(ip) 주사에 의해 동물에서 생성된다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시숙신이미드(리신 잔기를 통한), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R 및 R¹이 상이한 알킬기인 R¹N=C=NR을 이용하여, 관련 항원을 면역화되는 포유류에서 면역원적인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 저해제에 접합하는 것이 유용할 수 있다.

동물은 예를 들어 100 ㎍ 또는 5 ㎍의 단백질 또는 접합체(각각 토끼나 마우스에 대해)를 3 부피의 프로인트 완전 애쥬번트와 배합하고 용액을 여러 위치에 피내 주사함으로써 항원, 면역원적 접합체 또는 유도체에 대해 면역화된다. 한달 후 동물은 여러 위치에 피하 주사에 의해 프로인트 완전 애쥬번트 중의 원래 량의 펩티드 또는 접합체의 1/5 내지 1/10로 부스트된다. 7 내지 14일 후 동물을 출혈시키고 혈청을 항체 역가에 대해 어세이한다. 동물은 역가 평탄역까지 부스트된다. 바람직하게는, 동물은 동일한 항원이지만, 상이한 단백질에 및(또는) 상이한 가교결합제를 통해 접합된 접합체로 부스트된다. 또한 접합체는 단백질 융합물로서 재조합 세포 배양물에서 제조될 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제가 면역반응을 증진시키기 위하여 적당하게 사용된다.

(ⅱ) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득되며, 즉, 집단을 이루는 개개 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 분리되는 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 표시한다.

예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler 등, Nature, 256:495(1975)]에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법을 이용하여 제조되거나, 재조합 DNA 방법(미국특허번호 4,816,567)에 의해 제조될 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 마우스나 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물은 면역화를 위해 사용되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유발하기 위하여 여기에서 위에 기재된 바와 같이 면역화된다. 다르게는, 림프구는 시험관 내에서 면역화될 수 있다. 그런 다음 림프구는 폴리에틸렌글리콜과 같은 적절한 융합제를 이용하여 골수종 세포와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다(Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Practice, 59-103면(Academic Press, 1986)).

그렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은, 친 골수종 세포의 성장이나 생존을 저해하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적당한 배양 배지에 접종되고 성장된다. 예를 들어, 친 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)를 결여하면, 하이브리도마의 배양 배지는 전형적으로 HGPRT-결핍 세포의 성장을 방지하는 물질인 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(HAT 배지)을 포함할 것이다.

바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고-수준 생산을 지지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것들이다. 이들 중, 바람직한 골수종 세포주는 USA 캘리포니아, 샌디에고, 샐크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center)로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것들, 및 USA 메릴랜드, 록크빌, 어메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수가능한 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포와 같은, 쥐 골수종 주이다. 인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해 기재되어 있다(Kozbor, J. Immunol ., 133: 3001(1984); Brodeur 등, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63면, Marcel Dekker, Inc., New York; 1987).

하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 항원에 대한 모노클로날 항체의 생산에 대해 어세이된다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전이나 방사성면역어세이(RIA) 또는 효소-결합 면역흡착 어세이(ELISA)와 같은 시험관 내 결합 어세이에 의해 결정된다.

모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 문헌 [Munson 등, Anal . Biochem., 107: 220(1980)]의 스캣챠드 분석에 의해 결정될 수 있다.

원하는 특이성, 친화도 및(또는) 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 동정된 후, 클론은 희석 과정을 제한함으로써 서브클로닝되고 표준 방법에 의해 성장될 수 있다(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103면(Academic Press, 1986)). 이 목적을 위해 적당한 배양 배지는 예를 들어, DMEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로 생체 내에서 성장될 수 있다.

서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로스, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제과정에 의해 배양 배지, 복수 액, 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 쉽게 분리되고 통상적인 과정을 이용하여 서열결정된다(예를 들어, 쥐 항체의 중쇄와 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함). 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 바람직한 출처로 역할한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터로 위치되어, 그런 다음 그렇지 않으면 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 얻는다. 항체를 코딩하는 DNA의 세균에서의 재조합 발현에 관한 검토 논문은 문헌 [Skerra 등, Curr . Opinion in Immunol ., 5:256-262(1993) 및 Plukthun, Immunol . Revs ., 130: 151-188(1992)]을 포함한다.

추가 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 문헌 [McCafferty 등, Nature, 348: 552-554(1990)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 문헌 [Clackson 등, Nature, 352: 624-628(1991) 및 Marks 등, J. Mol . Biol ., 222: 581-597(1991)]은 파지 라이브러리를 이용하여, 각각, 쥐와 인간 항체의 분리를 기재하고 있다. 잇따른 간행물은 쇄 셔플링(Marks 등, Bio/Technology, 10: 779-783(1992)), 및 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체 내 재조합(Waterhouse 등, Nuc . Acids . Res ., 21: 2265-2266(1993))에 의한 고친화도(nM 범위) 인간 항체의 생산을 기술하고 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 분리를 위한 전통적 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 유효한 대안이다.

DNA는 또한 예를 들어, 상동적 쥐 서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변영역의 코딩 서열을 치환하거나(미국특허번호 4,816,567; 문헌 [Morrison, 등, Proc . Nat . Acad. Sci . USA, 81: 6851(1984)]), 면역글로불린 코딩 서열에 비-면역글로불린 폴리펩티드의 코딩 서열의 전체 또는 일부를 공유적으로 결합시킴으로써, 변형될 수 있다.

전형적으로 그러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변영역 대신 치환되거나, 항체의 하나의 항원-결합 위치의 가변영역 대신 치환되어 하나의 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-결합 위치와 상이한 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원-결합 위치를 포함하는 키메라 이중특이성 항체를 창제한다.

(ⅲ) 인간화된 항체

비인간 항체를 인간화하는 방법이 당업계에 알려져 있다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 비인간 출처로부터 그로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 자주 전형적으로 "수입(import)" 가변영역으로부터 취해지는, "수입" 잔기로 언급된다. 인간화는 윈터 (Winter)와 공동작업자의 방법에 따라 고가변 부위 서열을 인간 항체의 상응하는 서열 대신 치환함으로써, 필수적으로 수행될 수 있다(Jones 등, Nature, 321: 522-525(1986); Riechmann 등, Nature, 332: 323-327(1988); Verhoeyen 등, Science, 239: 1534-1536(1988)). 따라서, 그러한 "인간화된" 항체는 실질적으로 완전한 인간 가변영역 미만이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된, 키메라 항체(미국특허번호 4,816,567)이다. 실제로, 인간화된 항체는 전형적으로 일부 CDR 잔기와 가능하게는 일부 고가변 부위 잔기가 설치류 항체의 유사 위치로부터의 잔기에 의해 치환된 인간 항체이다.

인간화된 항체를 제조하는데 사용되는, 경쇄와 중쇄 모두, 인간 가변영역의 선택이 항원성을 감소시키기 위하여 매우 중요하다. 소위 "베스트-피트" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변영역의 서열이 기지의 인간 가변영역 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크린된다. 그런 다음 설치류의 것에 가장 근접한 인간 서열이 인간화된 항체의 인간 프레임워크 부위(FR)로서 수용된다(Sims 등, J. Immunol ., 151: 2296(1993); Chothia 등, J. Mol . Biol ., 196: 901(1987)). 다른 방법은 경 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 특정 프레임워크 부위를 이용한다. 동일한 프레임워크가 몇몇 상이한 인간화된 항체를 위해 사용될 수 있다(Carter 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89: 4285(1992); Presta 등, J. Immunol ., 151: 2623(1993)).

항체가 항원에 대한 친화도와 다른 바람직한 생물학적 성질을 보유하면서 인간화되는 것이 추가로 중요하다. 이 목적을 달성하기 위하여, 바람직한 방법에 따르면, 인간화된 항체는 친 서열과 인간화된 서열의 삼차원 모델을 이용하여 친 서열과 다양한 개념적인 인간화 산물의 분석 과정에 의해 제조된다. 삼차원 면역글로불린 모델은 보편적으로 이용가능하고 당업자에게 익숙하다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 삼차원 형태 구조를 보여주고 배치하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 배치의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에서 잔기의 개연성있는 역할의 분석, 즉 후보 면역글로불린의 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이 방법으로, FR 잔기는 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화도와 같은, 원하는 항체 특성이 얻어지도록 수혜자 및 수입 서열로부터 선별되고 결합될 수 있다. 일반적으로, 고가변 부위 잔기는 항원 결합에 영향을 미치는데 직접적이고 가장 실질적으로 관여한다.

(ⅳ) 인간 항체

인간화에 대한 대안으로, 인간 항체가 생성될 수 있다. 예를 들어, 이제 면역화 시, 내생적 면역글로불린 생산의 부재 하에 인간 항체의 완전한 레파토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 배아계 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 부위(J_H) 유전자의 동형접합적 결실이 내생적 항체 생산의 완전한 저해를 일으키는 것이 기재되어 있다. 그러한 배아계 돌연변이 마우스에서 인간 배아계 면역글로불린 유전자 어레이의 도입은 항원 공격 시 인간 항체의 생산을 일으킬 것이다. 예를 들어, 문헌 [Jakobovits 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 90, 2551-255(1993); Jakobovits 등, Nature 362, 255-258(1993); Bruggerman 등, Year in Immuno ., 7: 33(1993)] 및 미국특허번호 5,591,669, 5,589,369 및 5,545,807을 참조한다.

다르게는, 파지 디스플레이 기술(McCafferty 등, Nature 348: 552-553(1990))이 비면역화된 공여체로부터의 면역글로불린 가변(V) 영역 유전자 레파토리로부터, 시험관 내에서 인간 항체와 항체 단편을 생산하는데 사용될 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 영역 유전자는 M13이나 fd와 같은 필라멘트상 박테리오파지의 주 또는 부 외피 단백질 유전자로 프레임에 맞게 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로서 배치된다. 필라멘트상 입자는 일본쇄 DNA 카피의 파지 게놈을 함유하므로, 항체의 기능적 성질에 기초한 선별은 또한 그들 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자의 선별을 낳는다. 따라서, 파지는 B-세포의 성질 중 일부를 모사한다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행될 수 있다; 그들의 검토를 위해, 예를 들어, 문헌 [Johnson, Kevin S. 및 Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571(1993)]을 참조한다. V-유전자 조각의 몇몇 출처가 파지 디스플레이를 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Clackson 등, Nature 352: 624-628(1991)]은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 다양한 어레이의 항-옥사졸론 항체를 분리하였다. 비면역화된 인간 공여자로부터의 V 유전자의 레파토리가 제작될 수 있고 다양한 어레이의 항원(자가-항원 포함)에 대한 항체가 필수적으로 문헌 [Marks 등, J. Mol. Biol . 222: 581-597(1991)]이나, 문헌 [Griffith 등, EMBO J. 12: 725-734(1993)]에 의해 기재된 기술에 따라 분리될 수 있다. 또한 미국특허번호 5,565,332 및 5,573,905를 참조한다.

인간 항체는 또한 시험관 내 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다(미국특허번호 5,567,610 및 5,229,275 참조).

(ⅴ) 항체 단편

다양한 기술이 항체 단편의 생산을 위해 개발되었다. 전통적으로, 이들 단편은 완전한 항체의 단백분해적 분해를 통해 유래되었다(예를 들어, 문헌 [Morimoto 등, Journal of Biomedical and Biophysical Methods 24: 107-117(1992) 및 Brennan 등, Science 229: 81(1985)] 참조). 그러나, 이들 단편은 이제 재조합 숙주 세포로부터 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 위에 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 다르게는, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다(Carter 등, Bio / Technology 10: 163-167(1992)). 다른 접근법에 따르면, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 단편의 다른 생산기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택되는 항체는 단일쇄 Fv 단편(scFv)이다. WO93/16185; 미국특허번호 5,571,894; 및 미국특허번호 5,587,458을 참조한다. 항체 단편은 또한 예를 들어, 예를 들어 미국특허번호 5,641,870에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수 있다. 그러한 선형 항체 단편은 단일특이성 또는 이중특이성일 수 있다.

(ⅵ) 이중특이성 항체

이중특이성 항체는 적어도 두 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적인 이중특이성 항체는 B 세포 표면 마커의 두 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다른 그러한 항체는 제1 B 세포 마커에 결합하고 추가로 제2 B 세포 표면 마커에 결합할 수 있다. 다르게는, B 세포에 대한 세포 방어 기작을 촛점화하기 위하여 항-B 세포 마커 결합 암은 T-세포 수용체 분자(예를 들어, CD2 또는 CD3), FcγRⅠ(CD64), FcγRⅡ(CD32) 및 FcγRⅢ(CD16)과 같은 IgG에 대한 Fc 수용체(FcγR)와 같은 백혈구 상의 촉발 분자에 결합하는 암과 결합될 수 있다. 이들 항체는 B 세포 마커-결합 암과 세포독성제(예를 들어, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 합텐)와 결합하는 암을 갖는다. 이중특이성 항체는 전장 항체나 항체 단편(예를 들어, F(ab')₂ 이중특이성 항체)으로서 제조될 수 있다.

이중특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있다. 전장 이중특이성 항체의 전통적 생산은 두 중쇄가 상이한 특이성을 갖는, 두 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동발현에 기초한다(Millstein 등, Nature 305, 537-539(1983)). 면역글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위적 분류로 인해, 이들 하이브리도마(쿼드로마)는 단지 하나만이 정확한 이중특이성 구조를 갖는 10개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산한다. 친화도 크로마토그래피 단계에 의해 보통 행해지는, 정확한 분자의 정제는 다소 부담스럽고 산물 수율이 낮다. 유사한 과정이 WO93/08829와, 문헌 [Traunecker 등, EMBO J., 10: 3655-3659(1991)]에 개시되어 있다.

상이한 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성(항체-항원 결합 위치)을 갖는 항체 가변영역이 면역글로불린 불변영역 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 경첩, CH2 및 CH3 부위의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변영역과이다. 융합물 중 적어도 하나에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 위치를 함유하는 제1 중쇄 불변영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및 원하는 경우, 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA가 별도 발현 벡터에 삽입되고, 적당한 숙주 유기체에 공동형질감염된다. 이것은 제작에 사용되는 동일하지 않은 비율의 세 폴리펩티드 쇄가 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 세 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정할 때 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 두 폴리펩티드 쇄의 발현이 높은 수율을 낳거나 비율이 특별한 의미를 갖지 않을 때 하나의 발현 벡터에 두개 또는 모든 세개의 폴리펩티드 쇄의 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

이 접근법의 바람직한 구체예에서, 이중특이성 항체는 한 암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄와, 나머지 암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 이루어진다. 이중특이성 분자의 단지 절반에서만의 면역글로불린 경쇄의 존재는 용이한 분리방법을 제공하므로, 이 비대칭적 구조는 원치않는 면역글로불린 쇄 조합물들로부터 원하는 이중특이성 화합물의 분리를 용이하게 하는 것으로 밝혀졌다. 이 접근법은 WO94/04690에 개시되어 있다. 이중특이성 항체를 생성하는 추가 상세사항에 대해서는, 예를 들어, 문헌 [Suresh 등, Methods in Enzymology 121: 210(1986)]을 참조한다.

미국특허번호 5,731,168에 기재된 다른 접근법에 따르면, 항체 분자 쌍 간의 경계는 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로다이머의 백분율을 최대화하기 위하여 조작될 수 있다. 바람직한 경계는 항체 불변영역의 C_H3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제1 항체 분자의 경계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄가 더 큰 측쇄(예를 들어, 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄(들)와 동일하거나 유사한 크기의 보상적 "강"(cavity)이 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것들(예를 들어, 알라닌 또는 트레오닌)로 대체함으로써 제2 항체 분자의 경계면에 창출된다. 이것은 호모다이머와 같은 다른 원치않는 최종산물에 비해 헤테로다이머의 수율을 증가시키기 위한 기작을 제공한다.

이중특이성 항체는 가교결합 또는 "헤테로컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로컨쥬게이트에 있는 항체의 하나는 아비딘에, 나머지는 바이오틴에 커플링될 수 있다. 그러한 항체는 예를 들어, 원치않는 세포에 대해 면역 체계 세포를 표적화하기 위해(미국특허번호 4,676,980), 또한 HIV 감염의 치료를 위해(WO91/00360, WO92/200373 및 EP03089) 제안되어 있다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 어느 편리한 가교결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적당한 가교결합제는 당업계에 잘 알려져 있고 많은 가교결합 기술과 함께, 미국특허번호 4,676,980에 개시되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이성 항체를 생성하기 위한 기술 또한 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 문헌 [Brennan 등, Science, 229: 81(1985)]은 완전한 항체가 단백분해적으로 절단되어 F(ab')₂ 단편을 생성하는 과정을 기술하고 있다. 이들 단편은 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지하기 위하여 디티올 복합화제 나트륨 아르세나이트 존재 하에 환원된다. 그런 다음 생성된 Fab' 단편은 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. 그런 다음 Fab'-TNB 유도체 중 하나는 머캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 재전환되고 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이중특이성 항체를 형성한다. 생산된 이중특이성 항체는 효소의 선별적 고정화를 위한 물질로 사용될 수 있다.

최근 발전이 화학적으로 커플링되어 이중특이성 항체를 형성할 수 있는, 이. 콜라이로부터의 Fab'-SH 단편의 직접적 회수를 용이하게 하였다. 문헌 [Shalaby 등, J. Exp . Med ., 175: 217-225(1992)]는 완전히 인간화된 이중특이성 항체 F(ab')₂ 분자를 기술하고 있다. 각각의 Fab' 단편은 이. 콜라이로부터 별도로 분비되고 시험관 내에서 특이적 화학 커플링에 가해져 이중특이성 항체를 형성하였다. 그렇게 형성된 이중특이성 항체는 ErbB2 수용체를 과잉발현하는 세포와 정상적 인간 T세포에 결합할 뿐 아니라, 인간 유방암 표적에 대해 인간 세포독성 림프구의 용해 활성을 촉발할 수 있었다.

재조합 세포 배양물로부터 직접 이중특이성 항체 단편을 제조하고 분리하는 다양한 기술이 또한 기술되어 있다. 예를 들어, 이중특이성 항체는 류신 지퍼를 이용하여 생산되었다 [Kostelny 등, J. Immunol ., 148(5): 1547-1553(1992)]. Fos와 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 두 상이한 항체의 Fab' 부분에 결합되었다. 항체 호모다이머는 경첩부에서 환원되어 모노머를 형성한 후 재산화되어 항체 헤테로다이머를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 호모다이머를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 문헌 [Hollinger 등, Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 90: 6444-6448(1993)]에 의해 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이성 항체 단편을 제조하기 위한 대체 기작을 제공하였다. 단편은 너무 짧아서 동일한 쇄 상의 두 영역 간의 쌍형성을 허용하지 못하는 링커에 의해 경쇄 가변영역(V_L)에 연결된 중쇄 가변영역(V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H와 V_L 영역은 다른 단편의 상보적인 V_L과 V_H 영역과 쌍을 형성하도록 강제되며 두 항원-결합 위치를 형성한다. 단일-쇄 Fv(scFv) 다이머를 이용하여 이중특이성 항체 단편을 제조하는 다른 전략 또한 보고되어 있다. 문헌 [Gruber 등, J. Immunol ., 152: 5368(1994)]를 참조한다.

2 이상의 결합가를 갖는 항체가 착상된다. 예를 들어, 삼중특이성 항체가 제조될 수 있다 [Tutt 등, J. Immunol . 147: 60(1991)].

Ⅲ. 안타고니스트의 접합체 및 기타 변형

여기에서의 방법에 사용되거나 제조물품에 포함되는 안타고니스트는 임의로 세포독성제와 접합된다.

그러한 안타고니스트-세포독성제 접합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기되어 있다.

안타고니스트와 칼리케아미신, 마이탄신(미국특허번호 5,208,020), 트리코텐 및 CC1065와 같은, 하나 이상의 소분자 독소의 접합체 또한 여기에서 착상된다. 본 발명의 일 실시양태에서, 안타고니스트는 하나 이상의 마이탄신 분자(안타고니스트 분자 당 약 1 내지 약 10 마이탄신 분자)와 접합된다. 마이탄신은 예를 들어, May-SH3로 환원되고 변형 안타고니스트와 반응하여 마이탄신-안타고니스트 접합체를 생성할 수 있는 May-SS-Me로 전환될 수 있다(Chari 등, Cancer Research 52: 127-131(1992)).

대안으로, 안타고니스트는 하나 이상의 칼리케아미신 분자와 접합된다. 칼리케아미신 훼밀리의 항생제는 피코몰 이하 농도에서 이본쇄 DNA 파괴를 생성할 수 있다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 유사체는 γ1^I, α2^I, α3^I, N-아세틸-γ1^I, PSAG 및 θ^I1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(Hinman 등, Cancer Research 53: 3336-3342(1993) 및 Lode 등, Cancer Research 58: 2925-2928(1998)).

사용가능한 효소적으로 활성적인 독소와 그의 단편은 디프테리아 A 쇄, 디프테이라 독소의 비결합 활성 단편, 엑소톡신 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데킨 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPⅠ, PAPⅡ 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 리스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 예를 들어, 1993년 10월 28일에 공개된 WO93/21232를 참조한다.

본 발명은 추가로 핵용해 활성을 갖는 화합물(예를 들어, 데옥시리보뉴클레아제; DNase와 같은 리보뉴클레아제나 DNA 엔도뉴클레아제)과 접합된 안타고니스트를 착상한다.

다양한 방사성 동위원소가 방사성접합된 안타고니스트의 생산을 위해 이용가능하다. 예는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다.

안타고니스트와 세포독성제의 접합체는 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미딜메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체(예컨대, 디메틸아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예컨대, 디숙신이미딜 수베르에이트), 알데히드(예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예컨대, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예컨대, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이관능성 단백질 커플링제를 이용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소가 문헌 [Vitetta 등, Science 238: 1098(1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)이 안타고니스트에 방사성핵종을 접합하기 위한 예시적 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디설파이드-함유 링커(Chari 등, Cancer Research 52: 127-131(1992))가 사용될 수 있다.

대안으로, 안타고니스트와 세포독성제를 포함하는 융합단백질이 예를 들어, 재조합 기술이나 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다.

또다른 실시양태에서, 안타고니스트는 안타고니스트-수용체 접합체가 환자에게 투여된 후, 세정제를 이용하여 순환으로부터 미결합 접합체를 제거한 후 세포독성제(예를 들어, 방사성핵종)에 접합된 "리간드"(예를 들어, 아비딘)을 투여하는 종양 예비표적화에서 사용하기 위한 "수용체"(예컨대, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있다.

본 발명의 안타고니스트는 또한 프로드럭(예를 들어, 펩티딜 화학요법제, WO81/01145 참조)을 활성 항-암 약물로 전환시키는 프로드럭-활성화 효소와 접합될 수 있다. 예를 들어, WO88/07378과 미국특허번호 4,975,278을 참조한다.

그러한 접합체의 효소 성분은 그것을 그의 더 활성적인, 세포독성 형태로 전환할 수 있는 방식으로 프로드럭 상에 작용할 수 있는 어떠한 효소도 포함한다.

본 발명의 방법에서 유용한 효소는 포스페이트-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 알칼라인 포스파타제; 설페이트-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 아릴설파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암 약물, 5-플루오로우라실로 전환시키는데 유용한 시토신 디아미나제; 펩티드-함유 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 세라티아 프로테아제, 써모리신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 카텝신(예컨대, 카텝신 B 및 L)과 같은 프로테아제; D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키는데 유용한 D-알라닐카복시펩티다제; 글리코실화된 프로드럭을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 β-갈락토시다제와 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단 효소; 및 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 그룹으로 그들의 아민 질소에서 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는데 유용한 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 대안으로, "애브자임"(abzyme)으로 당업계에 알려져 있기도 한 효소 활성을 갖는 항체가 본 발명의 프로드럭을 유리 활성 약물로 전환시키는데 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Massey, Nature 328: 457-458(1987)] 참조). 안타고니스트-애브자임 접합체는 애브자임을 종양 세포 집단으로 전달하기 위하여 여기에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.

본 발명의 효소는 위에서 논의된 헤테로이관능성 가교결합제의 사용과 같은 당업계에 잘 알려진 기술에 의해 안타고니스트에 공유적으로 결합될 수 있다. 다르게는, 본 발명의 효소의 적어도 기능적으로 활성인 부분에 결합된 본 발명의 안타고니스트의 적어도 항원 결합 부분을 포함하는 융합 단백질이 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 이용하여 제작될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Neuberger 등, Nature, 312: 604-608(1984)] 참조).

안타고니스트의 다른 변형이 여기에서 착상된다. 예를 들어, 안타고니스트는 다양한 비단백질성 폴리머, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜, 폴리프로필렌글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌글리콜과 폴리프로필렌글리콜의 공중합체 중 하나에 연결될 수 있다.

여기에 개시된 안타고니스트는 또한 리포좀으로 제제화될 수 있다. 안타고니스트를 함유하는 리포좀은 문헌 [Epstein 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 82: 3688(1985); Hwang 등, Proc . Natl Acad . Sci . USA, 77: 4030(1980)]; 미국특허번호 4,485,045 및 4,544,545; 및 1997년 10월 23일 공개된 WO97/38731에 기재된 바와 같은, 당업계에 알려진 방법에 의해 제조된다. 순환시간이 증가된 리포좀은 미국특허번호 5,013,556에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)를 포함하는 액체 조성물로 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포좀은 정해진 공극 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포좀을 생성한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디설파이드 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin 등, J. Biol . Chem . 257: 286-288(1982)]에 기재된 바와 같은 리포좀에 접합될 수 있다. 화학요법제는 임의로 리포좀 내에 함유된다. 문헌 [Gabizon 등, J. National Cancer Inst . 81(19) 1484(1989)]를 참조한다.

여기에 기재된 단백질 또는 펩티드 안타고니스트의 아미노산 서열 변형(들)이 착상된다. 예를 들어, 안타고니스트의 결합 친화도 및(또는) 다른 생물학적 성질을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 안타고니스트의 아미노산 서열 변이체는 안타고니스트 핵산으로 적절한 뉴클레오티드 변화를 도입하거나, 펩티드 합성에 의해 제조된다. 그러한 변형은 예를 들어, 안타고니스트의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및(또는) 삽입 및(또는) 치환을 포함한다. 최종 제작물이 원하는 특성을 갖는 한, 결실, 삽입 및 치환의 어떠한 조합도 최종 제작물에 도달하기 위해 가해진다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 위치의 수나 위치 변화와 같이, 안타고니스트의 번역후 과정을 변화시킬 수 있다.

돌연변이유발을 위해 바람직한 위치인 안타고니스트의 특정 잔기나 부위를 동정하는 유용한 방법은 문헌 [Cunningham 및 Wells Science, 244: 1081-1085(1989)]에 의해 기재된 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 불린다. 여기에서, 표적 잔기의 잔기나 그룹이 동정되고(예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기) 중성 또는 음으로 하전된 아미노산(가장 바람직하게는 알라닌이나 폴리알라닌)으로 대체되어 항원과 아미노산의 상호작용에 영향을 미친다. 그런 다음 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 그들 아미노산 위치가 치환 위치에, 또는 그 대신, 추가 또는 다른 변이체를 도입함으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하는 위치가 미리 결정되는 반면, 돌연변이의 성질 자체는 미리 결정될 필요가 없다. 예를 들어, 주어진 위치에서 돌연변이의 성능을 분석하기 위하여, ala 스캐닝이나 무작위 돌연변이유발이 표적 코돈이나 부위에서 수행되고 발현되는 안타고니스트 변이체가 원하는 활성에 대해 스크리닝된다.

아미노산 서열 삽입은 하나의 잔기에서 백개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드 길이 범위의 아미노 및(또는) 카르복시-말단 융합, 및 단일 또는 여러 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 안타고니스트나 세포독성 폴리펩티드에 융합된 안타고니스트를 포함한다. 안타고니스트 분자의 다른 삽입성 변이체는 효소나, 안타고니스트의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드의 안타고니스트의 N- 또는 C- 말단에 대한 융합물을 포함한다.

변이체의 다른 타입은 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기에 의해 치환된 안타고니스트 분자의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는다. 항체 안타고니스트의 치환 돌연변이유발을 위해 가장 관심있는 위치는 고가변 부위를 포함하지만, FR 변형 또한 착상된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환"이라는 제목 하에 표 1에 나타내어져 있다. 그러한 치환이 생물학적 활성의 변화를 일으키면, 표 1에서 "예시적 치환"으로 명명되거나, 아미노산 클래스에 관하여 아래에서 더 설명되는 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입되고 산물이 스크리닝된다.

원래 잔기	예시적 치환	바람직한 치환
Ala(A) Arg(R) Asn(N) Asp(D) Cys(C) Gln(Q) Glu(E) Gly(G) His(H) Ile(I) Leu(L) Lys(K) Met(M) Phe(F) Pro(P) Ser(S) Thr(T) Trp(W) Tyr(Y) Val(V)	val; leu; ile lys; gln; asn gln; his; lys; arg glu; asn ser; ala asn; glu asp; glu pro; ala asn; gln; lys; arg leu; val; met; ala; phe; 노르류신 노르류신; ile; val; met; ala; phe arg; gln; asn leu; phe; ile leu; val; ile; ala; tyr ala thr ser tyr; phe trp; phe; thr; ser ile; leu; met; phe; ala; 노르류신	val lys gln glu ser asn asp ala arg leu ile arg leu tyr ala thr ser tyr phe leu

안타고니스트의 생물학적 성질의 실질적 변형은 (a) 예를 들어, 시트나 나선 형태와 같은, 치환 영역에 있는 폴리펩티드 백본의 구조, (b) 표적 위치에 있는 분자의 전하나 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피를 유지하는데 대한 그들의 영향에서 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연 발생 잔기는 공통적 측쇄 성질에 기초하여 그룹들로 나뉜다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비보존적 치환은 이들 클래스 중 하나의 구성원을 다른 클래스로 바꾸는 것을 필요로 할 것이다.

안타고니스트의 적당한 형태를 유지하는데 관여하지 않는 어느 시스테인 잔기 또한 일반적으로 세린으로 치환되어, 분자의 산화 안정성을 향상시키고 이상적 가교결합을 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합(들)이 안타고니스트에 첨가되어 그의 안정성을 향상시킬 수 있다(특히 안타고니스트가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

치환 변이체의 특히 바람직한 타입은 친 항체의 하나 이상의 고가변 부위 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 개발을 위해 선택되는 결과 변이체(들)는 그들이 생성된 친 항체에 대해 상대적으로 개선된 생물학적 성질을 가질 것이다. 그러한 치환 변이체를 생성하는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용한 친화도 성숙이다. 간략하게, 몇몇 고가변 부위 위치(예를 들어, 6-7 위치)가 돌연변이되어 각각의 위치에서 모든 가능한 아미노산 치환을 생성한다. 그렇게 생성된 항체 변이체는 각각의 입자 내에 팩키지된 M13의 유전자 Ⅲ 산물에 대한 융합물로서 필라멘트상 파지 입자로부터 일가 양식으로 디스플레이된다. 그런 다음 파지-디스플레이된 변이체는 여기에 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성(예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다. 변형을 위한 후보 고가변 부위 위치를 동정하기 위하여, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 수행되어 항원 결합에 유의하게 기여하는 고가변 부위를 동정할 수 있다. 대안으로, 또는 부가하여, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 항체와 항원 간의 접촉 점을 동정하는 것이 유익할 수 있다. 그러한 접촉 잔기와 이웃 잔기는 여기에 연구된 기술에 따른 치환을 위한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 생성되면, 변이체 패널은 여기에 기재된 바와 같이 스크리닝되고 하나 이상의 관련 어세이에서 우수한 성질을 갖는 항체가 추가 개발을 위해 선별될 수 있다.

안타고니스트의 아미노산 변이체의 다른 유형은 안타고니스트의 원래 글리코실화 양상을 변화시킨다. 변화는 안타고니스트에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 부위를 제거하고(거나), 안타고니스트에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 위치를 첨가하는 것을 의미한다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-결합 또는 O-결합이다. N-결합은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 탄수화물 부위의 부착을 말한다. X가 프롤린을 제외한 어느 아미노산인 트리펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌이 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 부위의 효소적 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이들 트리펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 위치를 창출한다. O-결합된 글리코실화는 하이드록시아미노산, 비록 5-하이드록시프롤린이나 5-하이드록시리신 또한 사용될 수 있을지라도, 가장 보편적으로 세린이나 트레오닌에 대한 당 N-아세틸갈락토스아민, 갈락토스 또는 자일로스 중 하나의 부착을 말한다.

안타고니스트에 대한 글리코실화 위치의 부가는 그것이 (N-결합 글리코실화 위치를 위한) 하나 이상의 상기 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 달성된다. 변형은 또한 원래 안타고니스트의 서열에 대한 하나 이상의 세린이나 트레오닌 잔기의 첨가, 또는 치환에 의해 가해질 수 있다(O-결합 글리코실화 위치를 위함).

안타고니스트의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 자연 출처로부터의 분리(자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우)나 올리고뉴클레오티드-매개(또는 부위-특이적) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발, 및 안타고니스트의 먼저 제조된 변이체나 비변이체 버젼의 카세트 돌연변이유발에 의한 제조를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.

예를 들어, 안타고니스트의 항원-의존 세포-매개 세포독성(ADCC) 및(또는) 보체 의존 세포독성(CDC)을 증진시키기 위하여, 이펙터 기능에 관하여 본 발명의 안타고니스트를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체 안타고니스트의 Fc 부위에 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안으로 또는 부가하여, 시스테인 잔기(들)가 Fc 부위에 도입되어, 이 부위에서 쇄간 디설파이드 결합 형성을 허용할 수 있다. 그렇게 생성된 호모다이머 항체는 향상된 내재화 능력 및(또는) 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 갖는다. 문헌 [Caron 등, J. Exp Med . 176: 1191-1195(1992) 및 Shopes, B. J. Immunol . 148: 2918-2922(1992)]를 참조한다.

증가된 항-종양 활성을 갖는 호모다이머 항체 또한 문헌 [Wolff 등, Cancer Research 53: 2560-2565(1993)]에 기재된 바와 같은 헤테로이관능성 가교결합제를 이용하여 제조될 수 있다. 다르게는, 이중적 Fc 부위를 갖고 그에 의해 증진된 보체 용해 및 ADCC 능력을 가질 수 있는 항체가 조작될 수 있다. 문헌 [Stevenson 등, Anti - Cancer Drug Design 3: 219-230(1989)]를 참조한다.

안타고니스트의 혈청 반감기를 증가시키기 위하여, 예를 들어, 미국특허번호 5,739,277에 기재된 바와 같은 안타고니스트(특히 항체 단편)로 샐비지 수용체 결합 에피토프를 도입할 수 있다. 여기에 사용된 바, 용어 "샐비지 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체 내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)의 Fc 부위의 에피토프를 말한다.

Ⅳ. 약제학적 제제

본 발명에 따라 사용되는 안타고니스트의 치료 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 안타고니스트를 임의의 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제와 혼합하여(Remington's Pharmaceutical Sciences 16판, Osol, A. Ed.(1980)), 동결건조된 제제나 수용액의 형태로 저장을 위해 제조된다. 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 용량과 농도에서 노출되는 수혜자에게 비독성이고 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제(옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토니움 클로라이드; 벤즈알코니움 클로라이드, 벤즈에토니움 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대이온; 금속 복합체(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및(또는) 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.

예시적 항-CD20 항체 제제는 참조에 의해 여기에 명시적으로 도입되는, WO98/56418에 기재되어 있다. 이 간행물은 2-8 ℃에서 2년 저장의 최소 저장 수명을 갖는 pH 5.0의 리툭시맵 40 ㎎/㎖, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로스, 0.9% 벤질알콜, 0.02% 폴리솔베이트 20을 포함하는 액체 다중용량 제제를 기재하고 있다. 관심있는 다른 항-CD20 제제는 염화나트륨 9.0 ㎎/㎖, 시트르산나트륨 이수화물 7.35 ㎎/㎖, 폴리솔베이트 80 0.7 ㎎/㎖ 및 주사용 멸균수, pH 6.5 중에 리툭시맵 10 ㎎/㎖를 포함한다.

피하 투여를 위해 적합화된 동결건조 제제가 WO97/04801에 기재되어 있다. 그러한 동결건조 제제는 높은 단백질 농도로 적당한 희석제로 재구성되고 재구성된 제제는 여기에서 치료되는 포유류에게 피하로 투여될 수 있다.

여기에서의 제제는 또한 치료되는 특정 적응증을 위해 필요한 하나 초과의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 부정적으로 영향을 미치지 않는 보충적 활성을 갖는 것들을 함유할 수 있다. 예를 들어, 세포독성제, 화학요법제, 사이토카인 또는 면역억제제(예를 들어, 사이클로스포린이나 T 세포에 결합하는 항체와 같은, T 세포 상에 작용하는 것, 예를 들어, LFA-1에 결합하는 것)를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 다른 약제의 유효량은 제제에 존재하는 안타고니스트의 양, 질환이나 장애나 치료의 유형, 및 위에 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로 여기에서 앞서 사용된 것과 동일한 용량과 투여경로로 또는 지금까지 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다.

활성성분은 또한 예를 들어, 코아세르베이트화 기술이나 경계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼에 봉입될 수 있다. 그러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16판, Osol, A. Ed.(1980)]에 개시되어 있다.

서방성 제제가 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적당한 예는 성형 물품, 예를 들어, 필름 형태의 안타고니스트를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투성 매트릭스나, 마이크로캡슐을 포함한다. 서방성 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔(예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸-메타크릴레이트)나 폴리(비닐알콜)), 폴리락타이드(미국특허번호 3,773,919), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌 비닐 아세테이트, 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™(락트산-글리콜산 공중합체와 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사용 마이크로스피어)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산을 포함한다.

생체 내 투여를 위해 사용되는 제제는 멸균이어야만 한다. 이것은 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.

Ⅴ. 안타고니스트로의 치료

본 발명은 TNFα-저해제로의 이전 또는 현재 치료에 대해 부적절한 반응을 경험하는 자가면역 질환에 걸리거나 걸리기 쉬운 포유류의 아집단, 특히 인간의 치료법에 관한 것이다. 일반적으로, 여기에서 치료되는 포유류는 에타네르셉트(엔브렐(등록상표)), 인플릭시맵(레미케이드(등록상표)) 또는 아달리무맵(휴미라™)과 같은 하나 이상의 TNFα-저해제(들)로의 1회 이상의 치료로의 치료법 후, 독성 및(또는) 부적절한 효능으로 인해 TNFα-저해제로의 이전 또는 현재 치료에 대해 부적절한 반응을 경험하는 것으로, 확인될 것이다. 그러나, 본 발명은 그러한 TNFα-저해제로의 이전 치료 단계로 제한되지 않는다; 예를 들어, 환자는 TNFα-저해제로 그로의 치료가 시작되기 전에 독성, 예를 들어, 심장 독성을 경험하는 경향이 있는 것으로 간주되거나, 환자는 TNFα-저해제로의 치료법에 반응하지 않을 것 같은 사람으로 결정될 수 있다.

여기에서 치료되는 다양한 자가면역 질환은 위 정의 란에 수록되어 있다. 여기에서의 바람직한 적응증은 류마티스성 관절염, 건선성 관절염, 또는 크론병이다.

일반적으로, 여기에서 치료되는 포유류는 B-세포 악성물로 고통받지 않을 것이다.

여기에 착상된 발명의 일 실시양태에 따르면, 치료적 접근은 TNFα-저해제로의 치료법과 관련된 부정적인 부작용(감염, 심부전증 및 수초탈락)을 감소시킬 것이다.

B 세포 표면 마커에 결합하는 안타고니스트를 포함하는 조성물은 우수한 의학적 관행에 일치하는 양식으로 제제화, 용량화 및 투여될 것이다. 본문에서 고려 인자는 치료되는 특정 질환이나 장애, 치료되는 특정 포유류, 개개 환자의 임상 상태, 질환이나 장애의 원인, 약제의 전달 위치, 투여방법, 투여일정, 및 의사에게 알려진 다른 인자를 포함한다. 투여되는 안타고니스트의 치료 유효량은 그러한 고려에 의해 결정될 것이다.

일반적 제안으로서, 투약 당 비경구로 투여되는 안타고니스트의 치료 유효량은 1일 당 환자 체중의 약 0.1 내지 20 ㎎/㎏ 범위이고, 사용되는 안타고니스트의 전형적인 최초 범위는 약 2 내지 10 ㎎/㎏ 범위일 것이다.

바람직한 안타고니스트는 세포독성제에 접합되지 않은 항체, 예를 들어 리툭산(등록상표)과 같은 항체이다. 비접합된 항체의 적당한 용량은 예를 들어, 약 20 ㎎/㎡ 내지 1000 ㎎/㎡ 범위에 있다. 일 실시양태에서, 항체의 용량은 리툭산(등록상표)에 대해 현재 권고되는 것과 상이하다. 예를 들어, 용량이 약 20 ㎎/㎡ 내지 약 250 ㎎/㎡, 예를 들어, 약 50 내지 약 200 ㎎/㎡ 범위에 있는, 실질적으로 375 ㎎/㎡ 미만의 항체의 하나 이상의 용량을 환자에게 투여할 수 있다.

예시적 용량 투여계획은 매주 375 ㎎/㎡ ×4; 또는 1000 ㎎×2(예를 들어, 1 일과 15일에)를 포함한다.

더욱이, 후속 용량(들) 중 항체의 ㎎/㎡ 용량이 최초 용량(들) 중 항체의 ㎎/㎡ 용량을 초과하지 않는, 항체의 하나 이상의 최초 용량(들)에 이어서 하나 이상의 후속 용량(들)을 투여할 수 있다.

그러나, 위에서 주목된 바와 같이, 안타고니스트의 이들 제안된 양은 많은 치료적 판단을 받는다. 적절한 용량과 일정을 선택하는데 핵심적 인자는 위에 표시된 바와 같이, 얻어지는 결과이다. 예를 들어, 상대적으로 더 높은 용량이 진행중인 급성 질환의 치료를 위해 처음에 요구될 수 있다. 질환이나 장애에 따라, 가장 효과적인 결과를 얻기 위하여, 안타고니스트는 질환이나 장애의 첫번째 징후, 진단, 출현 또는 발생에 가능한 한 가깝게 또는 질환이나 장애의 재발 중에 투여된다.

안타고니스트는 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비내, 및 원하는 경우 국소적 면역억제 치료를 위해, 병변내 투여를 포함하는, 어느 적당한 수단에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 동맥내, 복강내, 또는 피하 투여를 포함한다. 또한, 안타고니스트는 예를 들어 안타고니스트의 용량을 감소시키면서, 펄스 주입에 의해 적당하게 투여될 수 있다. 바람직하게는 투약은, 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지 여부에 따라, 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 주어진다.

여기에서의 안타고니스트와 함께 세포독성제, 화학요법제, 면역억제제 및(또는) 사이토카인과 같은 다른 화합물을 투여할 수 있다. 병용 투여는 분리된 제제나 단일의 약제학적 제제를 이용하는 공동투여와, 바람직하게는 양(또는 모든) 활성 약제가 동시에 그들의 생물학적 활성을 나타내는 동안의 시기에 있는, 어느 한 순서로의 연속적 투여를 포함한다. RA와, 다른 자가면역 질환에 대해, 안타고니스트(예를 들어, CD20 항체)는 하이드록시클로로퀸, 설파살라진, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 아자티오프린, D-페니실아민, 금(경구), 금(근육내), 미노사이클린, 사이클로스포린, 스타피로코커스 단백질 A 면역흡착체와 같은 질환-변형 항류마티스 약물(DMARD); 정맥내 면역글로불린(IVIG); 비스테로이드성 소염진통제(NSAID); 글루코코르티코이드(예를 들어, 관절 주사를 통함); 코르티코스테로이드(예를 들어, 메틸프레드리솔론 및(또는) 프레드니손); 폴레이트 등 중 어느 하나 이상과 병용될 수 있다. 바람직하게는, TNFα-저해제는 CD20 안타고니스트로의 치료 기간 중에 포유류에게 투여되지 않는다.

환자에게 단백질 안타고니스트의 투여와 별도로 본 출원은 유전자 요법에 의한 안타고니스트의 투여를 착상한다. 안타고니스트를 코딩하는 핵산의 그러한 투여는 표현 "치료 유효량의 안타고니스트를 투여하는"에 의해 포함된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자 요법의 사용에 관한 1996년 3월 14일에 공개된 WO96/07321을 참조한다.

환자 세포로 핵산(임의로 벡터에 함유된)을 도달시키는 두 주요 접근법이 있다; 생체 내 및 생체 외. 생체 내 전달을 위해 핵산은 보통 안타고니스트가 요구되는 위치에서, 환자에게 직접 주사된다. 생체 외 치료를 위해, 환자 세포가 제거되고, 핵산은 이들 분리된 세포로 도입되고 변형된 세포가 환자에게 직접 또는 환자에게 이식되는 다공성 막 내에 캡슐화되어 환자에게 투여된다(예를 들어, 미국특허번호 4,892,538 및 5,283,187 참조). 살아있는 세포로 핵산을 도입하기 위해 이용가능한 다양한 기술이 있다. 핵산이 시험관 내에서 배양된 세포로, 또는 의도되는 숙주의 세포에서 생체 내에서 도입되는지에 따라 기술은 변화한다. 시험관 내에서 포유류 세포로 핵산을 도입하는데 적당한 기술은 리포좀의 사용, 전기천공, 미세주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 인산칼슘 침전법 등을 포함한다. 유전자의 생체 외 전달을 위해 보편적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 선호되는 생체 내 핵산 전달 기술은 바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스, 허피스 심플렉스 Ⅰ 바이러스, 또는 아데노-관련 바이러스) 및 지질-기초 시스템(유전자의 지질-매개된 도입을 위해 유용한 지질은 예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다)으로의 형질감염을 포함한다. 일부 상황에서 핵산 출처에게 세포 표면 막 단백질이나 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등과 같은, 표적 세포를 표적화하는 물질을 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 엔도시토시스와 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질이 특정 세포 타입에 대해 지향성인 예를 들어 캡시드 단백질이나 그의 단편, 순환 시 내재화를 수행하는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 배치를 표적으로 하고 세포내 반감기를 증가시키는 단백질을 표적화하고(거나) 획득을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 수용체-매개된 엔도시토시스의 기술은 예를 들어, 문헌 [Wu 등, J. Biol. Chem . 262: 4429-4432(1987); 및 Wagner 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 87: 3410-3414(1990)]에 의해 기재되어 있다. 현재 알려진 유전자 마킹 및 유전자 요법 프로토콜의 검토를 위해서는 문헌 [Anderson 등, Science 256: 808-813(1992)]을 참조한다. 또한 WO93/25673과 그 중에 인용된 참조문헌을 참조한다.

본 발명의 추가 상세사항은 아래 비제한적 실시예에 의해 설명된다. 본 명세서의 모든 인용문헌의 개시내용은 참조에 의해 여기에 명시적으로 도입된다.

실시예 1

1 이상의 TNFα-저해제 치료법에 대해 부적절한 반응을 가진 활동성 류마티스성 관절염에 걸린 환자를 B-세포 표면 항원, CD20에 결합하는 항체로 치료한다.

이 실시예에 따른 치료법을 위한 후보는 독성이나 부적절한 효능으로 인해 에타네르셉트, 인플릭시맵 및(또는) 아달리무맵으로의 이전 또는 현재 치료에 대해 부적절한 반응을 경험한 사람들을 포함한다(1주에 2회 25 ㎎으로 ≥3개월 동안 에타네르셉트 또는 ≥3 ㎎/㎏으로 인플릭시맵의 적어도 4회 주입).

환자들은 스크리닝과 무작위화에서 부은 관절 계수(SJC)≥8(66 관절 계수)과, 약한 관절 계수(TJC)≥8(68 관절 계수); CRP≥1.5 ㎎/㎗(15 ㎎/ℓ) 또는 ESR≥28 ㎜/시간; 및(또는) 중심 판독 위치에 의해 결정된 바, 류마티스성 관절염에 기인하는 명백한 침식이 있는 적어도 하나의 관절의 X선 사진 증거(손, 손목 또는 발의 어느 관절이 손의 DIP 관절을 제외하고 고려될 수 있다)를 가질 수 있다.

치료법을 위해 사용되는 CD20 항체는 리툭시맵(제넨테크, 인크.로부터 상업적으로 입수가능한) 또는 인간화된 2H7 v16일 수 있다.

환자는 치료 유효 용량, 예를 들어, 1일 및 15일에 1000 ㎎ i.v., 또는 매주 375 ㎎/㎡×4의 CD20 항체로 치료된다.

환자는 또한 CD20 항체 주입 30 분전 100 ㎎ i.v. 메틸프리드니솔론 및 2-7 일에 60 ㎎ p.o., 8-14일에 30 ㎎ p.o., 16일에 기저 용량으로 돌아가는, 프레드니손으로 구성되는 코르티코스테로이드 투여계획과 함께, 동시적 MTX(10-25 ㎎/주 경구(p.o.) 또는 비경구)를 받을 수 있다. 환자는 또한 단일 용량 또는 분할된 일일 용량으로서 제공되는 폴레이트(5 ㎎/주)를 받을 수 있다. 환자는 임의로 치료 기간 전체에 걸쳐 임의의 배경 코르티코스테로이드(≤10 ㎎/일 프레드니손 또는 균등물)를 계속 받는다.

일차적 종점은 류마티스 인자와 부위를 위해 조정된, 그룹 차이를 비교하기 위한 코크란-만텔-헨젤(Cochran-Mantel-Haenszel(CMH)) 시험을 이용하여 24 주에 ACR20 반응을 갖는 환자의 비율일 수 있다.

가능한 이차적 종점은 하기를 포함한다.

1. 24 주에 ACR50과 70 반응을 갖는 환자의 비율. 이들은 일차적 종점에 대해 구체화된 바와 같이 분석될 수 있다.

2. 스크리닝부터 24 주까지 질환 활성 점수(DAS)의 변화. 이들은 기저선 DAS, 류마티스 인자 및 치료를 모델의 관점으로 하는 ANOVA 모델을 이용하여 평가될 수 있다.

3. 24 주에 카테고리화된 DAS 반응자(EULAR 반응). 이들은 류마티스 인자를 위해 조정된 CMH 시험을 이용하여 평가될 수 있다.

4. ACR 코어 셋(SJC, TJC, 환자와 의사의 전체 평가, HAQ, 통증, CRP 및 ESR)에서 스크리닝으로부터의 변화. 기술적 통계학이 이들 지수에 대해 보고될 수 있다.

5. SF-36에서의 스크리닝으로부터의 변화. 기술적 통계학이 8 영역 점수와 정신적 및 육체적 성분 점수에 대해 보고될 수 있다. 또한, 정신적 및 육체적 성분 점수는 추가로 카테고리화되고 분석될 수 있다.

6. 변형된 샤프 X선사진 총 점수, 침식 점수, 및 관절 공간 협착 점수에서의 변화. 이들은 적절한대로, 연속적 또는 카테고리적 방법을 이용하여 분석될 수 있다.

예비적 종점 및 분석은 8, 12, 16, 20, 24주에 걸친 ACR(20/50/70 및 ACR n) 및 DAS 반응에서의 변화가 적절한대로, 이진 또는 연속 반복 측정 모델을 이용하여 평가될 것이다. 침식 진행이 없는 환자의 비율을 포함하는 예비 X선사진 분석이 24 주 이후에 평가될 수 있다.

추가의 예비적 종점(예를 들어 완전한 임상적 반응, 질환이 없는 기간)이 연장된 관찰 기간의 일부로서 기술적으로 분석될 것이다.

FACIT-F 피로의 스크린으로부터의 변화가 기술적 통계학으로 분석될 것이다.

상기한 바와 같은 TNFα 저해제 치료법에 대해 부적절한 반응을 갖는 환자에서 CD20 항체로의 RA의 치료는 위에서 주목된 종점 중 어느 하나 이상에 따라 유익한 임상적 반응을 가져올 것이다.

<110> GENENTECH, INC. BENYUNES, MARK C. <120> THERAPY OF AUTOIMMUNE DISEASE IN A PATIENT WITH AN INADEQUATE RESPONSE TO A TNF-ALPHA INHIBITOR <130> P2027R1 PCT <140> PCT/US2004/010509 <141> 2004-04-06 <150> US 60/461,481 <151> 2003-04-09 <160> 4 <210> 1 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> humanized sequence <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 80 85 90 Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105 Lys Arg <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> humanized sequence <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser 95 100 105 Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser <210> 3 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> humanized sequence <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 1 5 10 15 Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser 20 25 30 Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro 35 40 45 Leu Ile Tyr Ala Pro Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp 80 85 90 Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 95 100 105 Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 110 115 120 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 125 130 135 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp 140 145 150 Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln 155 160 165 Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu 170 175 180 Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val 185 190 195 Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg 200 205 210 Gly Glu Cys <210> 4 <211> 452 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> humanized sequence <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr 20 25 30 Ser Tyr Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr 50 55 60 Asn Gln Lys Phe Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Val Tyr Tyr Ser Asn Ser 95 100 105 Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 110 115 120 Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 125 130 135 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 140 145 150 Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 155 160 165 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln 170 175 180 Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 185 190 195 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 200 205 210 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 215 220 225 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 230 235 240 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 245 250 255 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 260 265 270 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 275 280 285 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 290 295 300 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 305 310 315 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 320 325 330 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys 335 340 345 Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 350 355 360 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 365 370 375 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 380 385 390 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 395 400 405 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser 410 415 420 Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 425 430 435 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 440 445 450 Gly Lys

Claims

TNFα-저해제에 대해 부적절한 반응을 경험하는 포유류에게 치료 유효량의 B 세포 표면 마커에 결합하는 안타고니스트를 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유류에서 자가면역 질환을 치료하는 방법.