KR20100054750A - 고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 고분자 미립구 - Google Patents

고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 고분자 미립구 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 고분자 미립구에 관한 것으로, 구체적으로는 고분자 화합물, 약물, 수불용성 유기용매 및 분산용매를 포함하는 유제를 제조하는 단계 및 제조된 유제에 염기 또는 산을 첨가하여 유제에서 수불용성 유기용매를 제거하는 단계를 포함하는 고분자 미립구의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 고분자 미립구 및 상기 미립구를 포함하는 약물전달용 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 수불용성 유기용매를 염기 또는 산을 이용하여 유제에서 제거하는 새로운 고분자 미립구의 제조방법, 상기 제조방법에 따라 제조된 고분자 미립구 및 상기 고분자 미립구를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 기존의 용매증발 또는 용매추출 공정과는 달리, 적은 양의 물을 사용하여 폐수 발생을 최소화하면서 빠른 시간 내에 간편하게 목적하는 약물 함유 고분자 미립구를 제조하는 데에 사용할 수 있다.
고분자 미립구, PLGA, 가수분해, 약물전달

Description

고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 고분자 미립구{Method for preparing microspheres and microspheres produced thereby}
본 발명은 고분자 미립구의 제조방법 및 그 방법에 의해 제조된 고분자 미립구에 관한 것으로, 구체적으로는 고분자 화합물, 약물, 수불용성 유기용매 및 분산용매를 포함하는 유제를 제조하는 단계 및 제조된 유제에 염기 또는 산을 첨가하여 유제에서 수불용성 유기용매를 제거하는 단계를 포함하는 고분자 미립구의 제조방법, 그 방법에 의해 제조된 고분자 미립구 및 상기 미립구를 포함하는 약물전달용 조성물에 관한 것이다.
수액제, 현탁제 및 유제와 같은 종래 주사제형들은 근육이나 피하 투여 후 재빨리 체내에서 제거되기 때문에 만성질환 치료시에는 빈번한 주사투여가 필수적이었다. 이러한 문제점을 해결하고자 고안된 마이크로캅셀화(microencapsulation)는 고분자 화합물로 구성된 미립구(microsphere, 이하의 서술에서 미립구는 초미립구(nanosphere)를 포함함) 제형에 약물을 봉입시키는 제조공정을 지칭하는데, 미립구는 보통 ㎛ 단위의 크기를 지니므로 인체나 동물에 근육 또는 피하주사로 투여 가능하며, 다양한 약물 방출속도를 지니도록 제조할 수 있어 약물 전달기간을 제어할 수 있다. 그러므로, 단 한 번의 투여만으로도 장시간 동안 유효한 치료약물농도를 유지할 수 있어 치료에 필요한 약물 총 투여량을 극소화시킬 수 있으며, 환자의 약물치료 순응도를 향상시킬 수 있어, 현재 유수한 전 세계 제약회사에서 약물 함유 고분자 미립구 제조에 지대한 관심을 보이고 있다.
마이크로캅셀화를 통해 고분자 미립구를 제조하는 데에 폴리-d,l-락타이드-코-글리콜라이드(poly-d,l-lactideco-glycolide, PLGA)가 고분자 화합물로서 가장 널리 사용된다. PLGA는 생체 내에서 가수분해되어 무독성의 락트산(lactic acid)과 글리콜산(glycolic acid)으로 변환되는 생체친화적인 고분자 화합물이다. 그러므로, 제약 산업계는 PLGA를 사용한 의약품 제형의 개발에 많은 노력을 기울이고 있는데, 현재 시판되는 PLGA로 만든 미립구 제품의 예로서 리스퍼달 콘스타(Risperdal Consta), 산도스타틴(Sandostatin) LAR, 비비트롤(Vivitrol), 그리고 루프론 데포트(Lupron Depot) 등을 들 수 있다. 이들 각각은, 환자에게 1회 주사투여되어 리스페리돈(risperidone), 옥트레오타이드 아세테이트(octreotide acetate), 날트렉손(naltrexone) 및 루프롤라이드 아세테이트(leuprolide acetate)의 방출을 2주에서 4개월까지 조절한다.
이러한 약물 함유 고분자 미립구는 메틸렌 클로라이드 및 에틸 아세테이트와 같은 유기용매를 사용하는 용매증발법 또는 용매추출법에 의해 통상적으로 제조된 다.
먼저, 용매증발법에 대하여 간략히 설명하자면(미국 특허 제6,471,996호, 제5,985,309호 및 제5,271,945호 참조), 고분자 화합물을 녹인 유기용매 상에 약물을 분산 또는 녹인 후, 물과 같은 분산매에 유화시켜 수중유형(O/W, oil-in-water) 유제를 제조한 다음, 유제에 있는 유기용매를 분산매로 확산시켜 공기/물 계면을 통하여 유기용매를 증발시킴으로써 약물 함유 고분자 미립구를 형성한다. 이때, 유기용매의 분산매로의 확산을 촉진하기 위하여 감압, 온도 상승, 과량의 물을 사용한 유기용매 추출 등의 기법을 활용한다. PLGA 고분자 화합물을 녹이기 위해 일반적으로 사용되는 분산유기용매는 메틸렌 클로라이드로서, 이 메틸렌 클로라이드가 다양한 분자량과 락타이드:글리콜라이드 비를 지닌 PLGA 공중합체를 잘 녹일 수 있고, 물 용해도가 1.32 중량%로 낮아 물과 잘 섞이지 않으므로 수중유형 형태의 유제를 만들기에 적합하기 때문이다. 그리고, 39.8℃의 낮은 끓는점(비점)에 기인하여 유제 액체방울로부터 물로 확산한 소량의 메틸렌 클로라이드 분자들이 물과 공기 계면을 통하여 잘 증발된다. 이러한 과정이 지속적으로 반복되면 유제방울로부터 메틸렌 클로라이드가 제거됨에 따라 미립구가 만들어진다. 마지막으로, 낮은 비점 덕분에 미립구에 존재하는 잔류 메틸렌 클로라이드를 건조하여 제거하는 것이 매우 손쉽다는 장점을 갖는다.
이처럼, 메틸렌 클로라이드는 강한 휘발성을 지니고 물과 잘 섞이지 않으며 물 보다 훨씬 낮은 비점을 갖는 등유제를 만들기 위한 최적의 유기용매임에도 불구하고, 다음과 같은 심각한 문제점들을 갖는다: (a) 실험적으로 확인된 발암물질이다; (b) 대기의 오존층을 파괴시켜 환경독성을 야기하며, 이러한 결과로 인체 피부암 발생을 증가시킨다; (c) 미국 보건복지부 소속의 독성 물질 및 질병 담당 부서(Agency for Toxic Substances and Disease Registry)에서 규정하고 있는 가장 위험한 38가지 독성 유해물질 중의 하나에 속한다; (d) 물용해도가 약 1.32 중량%로 낮아 사용된 총량의 메틸렌 클로라이드 중 극히 일부만이 물에 용해되어 증발되므로 유제방울에 있는 메틸렌 클로라이드가 완전히 제거되려면 상당한 시간이 소요된다. 예로서, 미국 특허 제6,884,435호에서는 유제로부터 메틸렌 클로라이드를 제거하기 위하여 밤새 유제를 교반하고 있으며, 미립구 제조시간을 단축하기 위해 반응조(reactor)의 온도를 상승시키거나 또는 감압조건을 도입하기도 한다(미국 특허 제3,691,090호, 제3,891,570호, 제6,270,700호 및 제6,572,894호 참조).
한편, 약물 함유 고분자 미립구의 제조에 사용되는 용매추출법은 유제방울에 있는 유기용매를 대량의 가용화 용매를 사용하여 효과적으로 추출하는 방법이다. 유기용매가 유제방울로부터 추출되면, 녹아있던 고분자 화합물이 경화되어 유제방울이 미립구로 전환된다. 일반적으로 사용되는 가용화 용매는 물인데, 유기용매의 물 용해도 정도가 필요로 되는 물의 양에 큰 영향을 미친다. 예를 들면, 메틸렌 클로라이드의 경우 물용해도가 1.32 중량%이므로 매우 많은 양의 물을 사용해야만 유제에 있는 메틸렌 클로라이드를 추출할 수가 있다. 하지만, 이 경우 메틸렌 클로라 이드를 함유하는 폐수가 다량 생성되어 이러한 폐수의 처리가 또한 문제가 되므로, 용매추출법에는 메틸렌 클로라이드에 비하여 물용해도가 높은 에틸 아세테이트가 주로 사용된다. 에틸 아세테이트는 물용해도가 8.7 중량% 에 달하여 메틸렌 클로라이드에 비하여 상대적으로 적은 양의 물로도 추출이 가능하며, 또한 비할로겐화 유기용매라는 장점을 갖는다. 하지만, 에틸 아세테이트의 비점은 77℃로서 메틸렌 클로라이드의 비점인 39.8℃보다 훨씬 높아 건조시 잔류용매를 제거하는 것이 상대적으로 힘들다는 단점을 갖는다. 또한, 특정 분자량과 락타이드:글리콜라이드 비를 지닌 PLGA 고분자화합물이 에틸 아세테이트에 잘 녹지 않는 물성을 나타낸다.
이에, 미국 특허 제4,389,840호, 제4,530,840호, 제6,544,559호, 제6,368,632호 및 제6,572,894호 등은 용매증발법과 용매추출법을 동시에 활용하는 기술을 개시한다. 즉, 유제를 만든 후 일부 유기용매는 증발과정을 통하여 제거하고 잔존하는 유기용매는 용매추출법을 사용하여 제거한다. 예를 들면, 미국 특허 제4,389,840호의 경우, 약물과 PLGA 고분자 화합물을 메틸렌 클로라이드에 녹인 후 물에 유화시켜 수중유형 유제를 제조한 다음, 40 내지 60 중량%의 메틸렌 클로라이드를 증발과정을 통해 제거하고 잔존하는 메틸렌 클로라이드를 다량의 물로 추출함으로써 미립구를 제조하는 방법을 개시하고 있다.
그러나, 이들 기존의 방법은 모두 사용된 유기용매의 물 용해도가 충분히 높지 않기 때문에 아주 과량의 물(유기용매의 물용해도 × 10배 이상)을 사용해야 한 다. 따라서, 이를 위해 매우 큰 용량의 반응조가 필요하고, 유기용매를 함유하는 폐수가 다량 생성되어 폐수 처리를 위한 부대비용이 증가하는 비효율성 문제에 직면하게 된다. 또한, 미립구 내에 잔존하는 유기용매를 효과적으로 제거하기도 어렵다는 문제점을 갖는다.
특히, 미립자에 현저한 양의 유기용매가 잔류하는 경우 건조 도중 발생하는 미립자간의 응집 현상이 두드러진다. 그러므로 건조 후 미립자가 개별적으로 분산되지 않아 주사과정에 문제가 발생할 소지가 커지고, 약물방출 재현성이 떨어지며, 또한 잔류용매 양이 허가 한계치를 초과하여 규제당국으로부터 제품허가를 받기가 어려워지는 문제점이 발생한다.
이에 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하고 간편하게 약물 함유 고분자 미립구를 제조할 수 있는 방법을 연구하던 중, 수불용성 유기용매 및 분산용매를 포함하는 유제를 만든 다음 염기 또는 산을 이용하여 물에 존재하는 유기용매를 화학반응으로 분해하여 수용성 용매로 변화시켜 유제방울에 있는 유기용매가 수상으로 계속 확산되도록 유도하여 분해반응을 효과적으로 유발시키고, 이러한 과정을 통해 유제방울을 미립구로 경화시킴으로써 간편하게 고분자 미립구를 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 고분자 화합물, 약물, 수불용성 유기용매 및 분산용매를 포함하는 유제에 염기 또는 산을 첨가하여 수불용성 유기용매를 제거하는 새로운 고분자 미립구의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 고분자 화합물, 약물, 수불용성 유기용매 및 분산용매를 포함하는 O/W(oil-in-water)형, O/O(oil-in-oil)형 또는 W/O/W(water-in oil-in-water)형 유제를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 제조한 유제에 염기 또는 산 용액을 첨가하여 유제에 서 수불용성 유기용매를 제거하는 단계를 포함하는 고분자 미립구의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 고분자 미립구를 제공한다.
본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고분자 미립구를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명의 내용을 보다 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 고분자 미립구 제조방법은
(a) 고분자 화합물, 약물, 수불용성 유기용매 및 분산용매를 포함하는 O/W(oil-in-water)형, O/O(oil-in-oil)형 또는 W/O/W(water-in oil-in-water)형 유제를 제조하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계에서 제조한 유제에 염기 용액 또는 산을 첨가하여 유제에서 수불용성 유기용매를 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 고분자 미립구 제법을 단계별로 나누어 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
(a) 단계 : 유제를 제조하는 단계
고분자 화합물, 약물, 수불용성 유기용매 및 분산용매를 포함하는 O/W(oil-in-water)형, O/O(oil-in-oil)형 또는 W/O/W(water-in oil-in-water)형 유제를 제조한다.
유제의 제조는 당업계에 공지된 통상적인 방법이 이용될 수 있으며, 보다 구체적으로, O/W(oil-in-water)형 또는 O/O(oil-in-oil)형 유제의 제조를 위해서는 고분자 화합물, 약물 및 수불용성 유기용매를 포함하는 분산상을 분산용매에 첨가하여 제조할 수 있으며, W/O/W(water-in-oil-in-water)형 유제의 제조를 위해서는 약물이 녹아있는 수용액을 고분자 화합물이 녹아있는 수불용성 유기용매에 유화시켜 W/O(water-in-oil)형 유제를 만든 후 이를 다시 분산용매에 첨가하여 W/O/W(water-in-oil-in-water)형 유제를 제조할 수 있다.
고분자 미립구의 제조를 위하여 사용되는 고분자 화합물은 당업계에 공지되어 있는 것이라면 제한없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체 및 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
본 발명에 사용되는 약물은 친수성 약물과 소수성 약물을 모두 포함하며, 고분자 미립자에 봉입될 수 있으면 제한없이 사용할 수 있다. 상기 약물은 예를 들어, 프로게스테론(progesterone) 할로페리돌(haloperidol), 티오틱센(thiothixene), 올란자핀(olanzapine), 클로자핀(clozapine), 브롬페리돌(bromperidol), 피모자이드(pimozide), 리스페리돈(risperidone), 지프라시돈(ziprasidone), 디아제프마(diazepma), 에틸 로플라제페이트(ethyl loflazepate), 알프라졸람(alprazolam), 네모나프라이드(nemonapride), 플루옥세틴(fluoxetine), 세르트랄린(sertraline), 베늘라팍신(venlafaxine), 도네페질(donepezil), 타크린(tacrine), 갈란타민(galantamine), 리바스티그민(rivastigmine), 셀레길린(selegiline), 로피니롤(ropinirole), 페르골리드(pergolide), 트리헥시페니딜(trihexyphenidyl), 브로모크립틴(bromocriptine), 벤즈트로핀(benztropine), 콜치킨(colchicine), 노르다제팜(nordazepam), 에티졸람(etizolam), 브로마제팜(bromazepam), 클로티아제팜(clotiazepam), 멕사졸룸(mexazolum), 부스피론(buspirone), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 소마토트로핀(somatotropin), 루프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate), 옥트레오티드(octreotide), 세트로렐릭스(cetrorelix), 산도스타틴 아세테이트(sandostatin acetate), 고나도트로핀(gonadotropin), 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 미조리빈(mizoribine), 사이클로스포린(cyclosporin), 타크롤리무스(tacrolimus), 날록손(naloxone), 날트렉 손(naltrexone), 클라드리빈(cladribine), 클람부실(chlorambucil), 트레티노인(tretinoin), 카르무시틴(carmusitne), 아나그렐리드(anagrelide), 독소루비신(doxorubicin), 아나스트로졸(anastrozole), 이다루비신(idarubicin), 시스플라틴(cisplatin), 닥티노마이신(dactinomycin), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 랄티트렉세드(raltitrexed), 에피루비신(epirubicin), 레트로졸(letrozole), 메플로퀸(mefloquine), 프리마퀸(primaquine), 옥시부티닌(oxybutynin), 톨테로딘(tolterodine), 알릴에스트레놀(allylestrenol), 로보스타틴(lovostatin), 심바스타틴(simvastatin), 프로바스타틴(provastatin), 아트로바스타틴(atrovastatin), 알렌드로네이트(alendronate), 살카토닌(salcatonin), 랄록시펜(raloxifene), 옥사드롤론(oxadrolone), 콘쥬게이티드 에스트로겐(conjugated estrogen), 에스트라디올(estradiol), 에스트라디올 발러레이트(estradiol valerate), 에스트라디올 벤조에이트(estradiol benzoate), 에티닐 에스트라디올(ethinylestradiol), 에토노게스트렐(etonogestrel), 레보노르게스트렐(levonorgestrel), 티볼론(tibolone), 피록시캄(piroxicam), 노르에티스테론(norethisterone)일 수 있으며, 단백질, 핵산 등과 같은 고분자 물질일 수도 있다.
본 발명의 수불용성 유기용매는 당업계에 공지되어 있는 고분자 미립구의 제조를 위하여 사용되는 고분자 화합물을 녹일 수 있으며, 산이나 염기에 의해 가수분해 되며, 가수분해 산물이 모두 물에 잘 녹는 성분이면 제한 없이 사용될 수 있 다. 일반적으로 아미드(amide), 에스테르(ester), 안하이드라이드(anhydride) 및 할로겐 산(halogen acid) 구조를 가진 화합물은 산/염기에 의해 가수분해 되는 것으로 잘 알려져 있다.
안하이드라이드 구조를 가진 화합물은 가수분해 반응을 거쳐 수용성인 카르복시산이 생성되며, 에스테르 구조를 가진 화합물은 수용성인 카르복시산과 알코올로 가수분해된다. 할로겐산 구조를 가진 화합물은 수용성인 카르복시산과 할로겐산(HF, HCl, HBr, HI 등)으로 가수분해된다. 아미드 구조를 가진 화합물의 경우 카르복시산과 아민으로 가수분해되므로 이때 생성되는 아민이 물에 용해되는 산물인 경우 상기 아미드는 본 발명의 수불용성 유기용매에 포함된다.
본 발명에서의 수불용성 유기용매는 할로겐산(acid halogen) 구조를 지닌 화합물, 안하이드라이드(anhydride) 구조를 지닌 화합물, 포스포릭 안하이드라이드(phosphoric anhydride) 화합물, 에스테르 구조를 지닌 화합물, 카르복실 에스테르(carboxylic esters) 화합물, 포스포릭 에스테르(phosphoric esters) 화합물, 황산 에스테르 화합물, 질산 에스테르 화합물, 붕산 에스테르 화합물, 아미드(amide) 구조를 지닌 화합물 및 카르복실 아미드(carboxylic amides) 화합물일 수 있으며, 바람직하게는 메틸 아세테이트(methyl acetate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 프로필 아세테이트(propyl acetate), 이소프로필 아세테이트(isopropyl acetate), 부틸 아세테이트(butyl acetate), 메틸 포르메이트(methyl formate), 에틸 포르메이트(ethyl formate), 이소프로필 포르메이트(isopropyl formate), 프로필 포르메 이트(propyl formate), 부틸 포르메이트(butyl formate), 메틸 다이클로로아세테이트(methyl dichloroacetate), 메틸 클로로아세테이트(methyl chloroacetate), 에틸 클로로아세테이트(ethyl chloroacetate), 에틸 다이클로로아세테이트(ethyl dichloroacetate), 메틸 플루로아세테이트(methyl fluoroacetate), 메틸 다이플루로아세테이트(methyl difluoroacetate), 에틸 플루로아세테이트(ethyl fluoroacetate), 에틸 다이플루로아세테이트(ethyl difluoroacetate), 말레익 안하이드라이드(maleic anhydride), 아세트 안하이드라이드(acetic anhydride), 프로피오닉 안하이드라이드(propionic anhydride), 포스포릭 안하이드라이드(phosphoric anhydride), 아세트아마이드(acetamide), 프로피온아마이드(propionamide), 부틸아마이드(butylamide) 및 카르복실 아마이드(carboxyl amide) 일 수 있다.
더 바람직하게는 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 메틸 아세테이트(methyl acetate), 메틸 포르메이트(methyl formate), 에틸 포르메이트(ethyl formate), 이소프로필 포르메이트(isopropyl formate), 프로필 포르메이트(propyl formate), 아세트 안하이드라이드(acetic anhydride) 또는 프로피오닉 안하이드라이드(propionic anhydride) 일 수 있다.
아울러, 필요에 따라, 수불용성 유기용매는 1종 이상의 다른 유기용매가 혼합된 공용매를 사용함으로써 미립구에 봉입하고자 하는 약물의 용해도를 조절하거나 유제방울의 경화속도를 원하는 바에 따라 제어할 수 있다.
본 발명에 사용되는 분산용매는 유화제를 함유하는 수성 분산용매 또는 비수성 분산용매를 포함하며, O/W형 및 W/O/W형 유제 제조시에는 수성 분산용매가, O/O형 유제 제조시에는 비수성 분산용매가 사용된다. 수성 분산용매로는 친수성 유화제, 예컨대 폴리비닐 알콜 및 폴리소베이트(Polysorbate) 계열(예를 들면 폴리소베이트 20, 폴리소베이트 60, 폴리소베이트 65, 폴리소베이트 80, 폴리소베이트 85)과 같은 유화제를 함유하는 수용액 또는 이의 공용매를 사용할 수 있다. 비수성 분산용매로는 친유성 유화제, 예컨대 글리세린지방산에스터(Glycerin Esters of Fatty Acids), 레시틴(lecithin)과 같은 유화제를 함유하는 실리콘 오일, 야채 기름, 톨루엔 또는 자일렌을 사용할 수 있다. 상기 분산용매에 함유되어 있는 유화제의 농도는 0.05 내지 15 %(w/v)일 수 있다.
상기 고분자 화합물은 약물 1 중량부를 기준으로 1 내지 500 중량부, 바람직하게는 1 내지 50 중량부의 양으로 사용할 수 있으며, 유제에 함유되어 있는 고분자 화합물의 농도는 3 내지 30 %(w/v)일 수 있다.
또한, 상기 분산상 또는 W/O(water-in-oil)형 유제와 분산용매의 부피비는 1:1-100, 바람직하게는 1:3-15 범위일 수 있다. 그리고 약물이 녹아있는 수용액과 고분자 화합물이 녹아있는 수불용성 유기용매의 부피비는 1:1-50, 바람직하게는 1:2-20 범위일 수 있다.
(b) 단계 : 유제에서 수불용성 유기용매를 제거하는 단계
상기 (a) 단계에서 제조된 O/W형, W/O/W형 또는 O/O형 유제에 염기 또는 산 용액을 첨가하여 유제에서 수불용성 유기용매를 제거하는 단계이다.
본 발명에서 염기 또는 산 용액을 첨가하여 유제에서 수불용성 유기용매를 제거하는 단계는 바람직하게는 가수분해 반응에 의하여 이루어진다. 가수분해 반응은 물이 첨가되어 2가지 물질로 분해되는 반응으로 에스테르 구조를 가진 화합물의 경우에는 카르복시산과 알코올로 가수분해되며, 안하이드라이드 구조를 가진 화합물의 경우에는 카르복시산으로 가수분해되며, 아마이드 구조를 가진 화합물의 경우에는 카르복시산과 아민으로 가수분해되며, 할로겐산 구조를 가진 화합물의 경우에는 카르복시산과 할로겐산(HF, HCl, HBr, HI 등)으로 가수분해되는 반응을 말한다. 이를 통해 하나의 층(예를 들어, 수층(water phase))에 소량으로 확산되어 있는(또는 녹아 있는) 상기 수불용성 유기용매를 물에 완전히 용해되는 수용성 유기용매로 변환시키고, 변환된 만큼 수불용성 유기용매가 수층으로 확산될 수 있도록 한다. 이러한 과정이 계속적으로 진행되어 유제 내에 수불용성 유기용매가 제거되어 유제방울을 미립구로 경화시킴으로써 목적하는 약물 함유 고분자 미립구를 제조할 수 있다. 상기에서 유제 내에서의 수불용성 유기용매의 제거는 수불용성 유기용매를 완전히 또는 실질적으로(검출되지 않는 수준으로) 없애는 것 뿐만 아니라, 수불용성 유기용매를 산 또는 염기 투입전의 초기 수준에 비해 감소시키는 것을 포함한다. 이 때, 유제방울의 빠른 경화에 기인하여 유제방울 입자간의 상호작용이 억제되어 응집 없이 목적하는 미립구를 얻을 수 있다. 이 때, 산은 상기 반응을 촉매하고 염기는 반응에 소모되며 일단 첨가되면 그 양이 수불용성 유기용매에 비해 적거나 많아도 상기 반응이 일어나는 데에는 크게 지장이 없다. 다만, 너무 많은 몰수의 산 또는 염기를 첨가하면 약물과 고분자 화합물의 안정성에 문제가 있을 수 있어 적절한 양을 고려해야 한다. 바람직하게는 염기 용액은 수불용성 유기용매의 몰 수와 염기 용액의 몰 수 비가 1:0.1 내지 10 이 되도록 첨가될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1:0.2 내지 5, 더 더욱 바람직하게는 1:0.3 내지 3, 가장 바람직하게는 1:0.5 내지 1.5가 되도록 첨가 될 수 있다.
염기는 바람직하게는 수산화나트륨(NaOH), 수산화리튬(LiOH), 수산화칼륨(KOH), 수산화암모늄(NH4OH), 수산화구리(Cu(OH)2), 및 수산화철(Fe(OH)3)일 수 있으며, 산은 바람직하게는 염산(HCl), 질산(HNO3), 황산(H2SO4), 아세트산(CH3COOH), 붕산(H3BO3) 및 탄산(H2CO3)일 수 있다. 한편, 상기 염기 또는 산은 본 발명에서 분해시액이라고도 기재되었다.
이와 같은 본 발명 방법에 의해 제조된 고분자 미립구는 0.1 내지 3500 ㎛, 바람직하게는 10 내지 350 ㎛의 평균 입경을 가지며, 원하는 바에 따라 다양한 중량의 약물을 함유할 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 방법에 의하면, 기존의 용매증발 또는 용매추출 공정을 필요로 하지 않고, 적은 양의 물을 사용하여 폐수 발생을 최소화하면서 빠른 시간 내에 간편하게 약물 함유 고분자 미립구를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 고분자 미립구를 사용하는 경우 고분자 미립구에 포함되는 약물을 효과적으로 전달할 수 있으므로 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 고분자 미립구를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다.
본 발명의 약물 전달용 조성물은 포함되는 약물에 따라 대상 질환이 달라질 수 있으며, 이는 당업자가 용이하게 이해할 수 있다.
참고로, 상기에서 언급한 뉴클레오티드 및 단백질 작업에는 다음의 문헌을 참조할 수 있다(Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)).
본 발명의 일 실시예에서는 산 또는 염기를 이용하여 에틸 아세테이트, 에틸 포르메이트, 프로필 포르메이트, 이소프로필 포르메이트가 수상에서 분해되는지 GC 분석을 통해 알아 보었다. 그 결과, 수상에 아무런 시액을 첨가하지 않은 경우(Blank) 시간이 경과함에 따라 에틸 아세테이트, 에틸 포르메이트, 프로필 포르메이트, 이소프로필 포르메이트 일부가 수상으로 조금씩 전이되어 수상에서의 농도가 증가되고 나중에는 포화되어 더 이상 수상으로의 전이가 진행되지 않으나, 산 또는 염기를 첨가한 경우 가수 분해되어 가수분해 산물인 에탄올 농도가 계속 증가됨을 알 수 있었다.
본 발명의 다른 실시예에서는 산 또는 염기에 의하여 프로피오닉 안하이드라이드가 가수분해되어 수상에 혼합되는지를 알아보았다. 그 결과 산이나 염기를 첨가하지 아니한 경우 0.5% 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol)에 혼합된 프로피오닉 안하이드라이드는 유제상태를 유지하지만, 산이나 염기가 첨가된 경우 유제 상태가 사라져 맑고 투명한 하나의 상의 모습을 보이는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 이소프로필 포르메이트를 이용하고 분해시액으로 염기를 사용하여, 수불용성 유기용매의 몰수에 비해 적은 양에서 많은 양까지 다양한 몰수의 분해시액을 수상에 가하여 모든 경우에서 유제 방울을 빨리 미립자로 경화시킬 수 있음을 보여주었다. 이에 비해 수상에 분해 시액을 첨가하지 않은 경우는 유제 방울이 미립자로 경화되지 않아, 분해 시액의 사용이 미립자 제조에 중요함을 알 수 있었다.
또한, 본 발명의 다른 실시예에서는 프로게스테론, 아나스트라졸, 올란자핀을 모델 약물로 선정하고 이를 여러가지 조건으로 봉입한 다양한 미립자를 제조하여, 이의 성상, 봉입률, 유기용매 잔류량 등을 살펴보았다. 그 결과, 각각의 약물에 대해서 구형의 미립자가 잘 제조되었으며, 높은 봉입률을 가짐을 알 수 있었다. 아울러, 매우 낮은 수준의 유기용매 잔류량을 가짐을 알 수 있었다.
한편, 본 발명의 도면은 다음의 기재를 참조할 수 있다.
도 1은 에틸 아세테이트/수상(aqueous phase) 시스템을 서서히 교반시킨 후 시간 경과에 따른 수상 시료에 대한 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC)의 크로마토그램을 나타낸다. 각각 수상에 아무런 분해시액을 넣지 않은 경우 및 2 ml과 5 ml의 10 M NaOH를 첨가한 경우에 관측된 결과(EA = 에틸 아세테이트; IS = 내부 표준물질(internal standard), EtOH = 에탄올).
도 2는 시간의 경과에 따른 수상의 에탄올과 에틸 아세테이트 농도의 변화를 나타낸다. (A) 2 ml과 5 ml의 10 M NaOH 사용 시 관측되는 수상의 에탄올 농도. (B) NaOH를 전혀 사용하지 않았을 때 및 2 ml과 5 ml의 10 M-NaOH를 사용하였을 때 시간의 경과에 따른 수상의 에틸 아세테이트 농도 변화.
도 3은 에틸 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨후 시간별에 따른 수 상 시료에 대한 GC 크로마토그램을 나타낸다. 수상에 아무런 분해시액을 넣지 않은 경우 및 2 ml과 5 ml의 10 M NaOH를 첨가한 경우에 관측된 결과(EF = 에틸 포르메이트; IS = 내부 표준물질, EtOH = 에탄올).
도 4는 에틸 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨후 시간별에 따른 수상 시료의 GC 크로마토그램을 나타낸다. 수상에 아무런 분해시액을 넣지 않은 경우 및 2 ml과 6 ml의 10 M-HCl을 첨가한 경우에 관측된 결과(EF = 에틸 포르메이트; IS = 내부 표준물질, EtOH = 에탄올).
도 5는 시간의 경과에 따른 수상의 에탄올 농도의 변화를 나타낸다. (A) 2 ml과 5 ml의 10 M NaOH 사용 시 생성되는 수상의 에탄올 농도. (B) 2 ml과 6 ml의 10 M HCl 사용 시 시간의 경과에 따라 변화하는 수상의 에탄올 농도.
도 6은 프로필 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨 후 각 시간 별로 취한 수상 시료의 GC 크로마토그램을 나타낸다. 수상에 아무런 분해시액을 넣지 않은 경우 및 2 ml과 5 ml의 10 M NaOH를 첨가한 경우에 관측된 결과(PF = 프로필 포르메이트; IS = 내부 표준물질, PrOH = 프로판올).
도 7은 시간의 경과에 따른 수상의 프로판올/프로필 포르메이트 농도의 변화를 나타낸다. (A) 2 ml과 5 ml의 10 M NaOH 사용 시 생성되는 수상의 프로판올 농도. (B) 수상에 아무런 분해시액을 넣지 않은 경우 및 2 ml 및 5 ml의 10 M NaOH 사용 시 생성되는 수상의 프로필 포르메이트 농도.
도 8은 프로필 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨 후 각 시간 별로 취한 수상 시료의 GC 크로마토그램을 나타낸다. 수상에 아무런 분해시액을 넣지 않 은 경우 및 2 ml과 5 ml의 10 M-HCl을 첨가한 경우에 관측된 결과(PF = 프로필 포르메이트; IS = 내부 표준물질, PrOH = 프로판올).
도 9는 시간의 경과에 따른 수상의 프로판올/프로필 포르메이트 농도의 변화를 나타낸다. (A) 2 ml 및 5 ml의 10 M HCl 사용 시 생성되는 수상의 프로판올 농도. (B) 수상에 아무런 분해시액을 넣지 않은 경우 및 2 ml 및 5 ml의 10 M-HCl 사용 시 생성되는 수상의 프로필 포르메이트 농도.
도 10은 이소프로필 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨 후 시간 별로 취한 수상 시료의 GC 크로마토그램을 나타낸다. 수상에 아무런 분해시액을 넣지 않은 경우 및 2 ml과 5 ml의 10 M NaOH를 첨가한 경우에 관측된 결과(IF = 이소프로필 포르메이트; IS = 내부 표준물질).
도 11은 시간의 경과에 따른 수상의 이소프로판올/이소프로필 포르메이트 농도의 변화를 나타낸다. (A) 2 ml 및 5 ml의 10 M NaOH 사용 시 생성되는 수상의 이소프로판올 농도. (B) 수상에 아무런 분해시액을 넣지 않은 경우 및 2ml 및 6 ml의 10 M NaOH 사용 시 생성되는 수상의 이소프로필 포르메이트 농도.
도 12는 이소프로필 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨후 시간 별로 취한 수상 시료의 GC 크로마토그램을 나타낸다. 수상에 2 ml과 5 ml의 10 M-HCl을 첨가한 경우에 관측된 결과 (IF = 이소프로필 포르메이트; IS = 내부 표준물질).
도 13은 시간 경과에 따른 수상의 이소프로판올 농도 변화를 나타낸다. 2 ml 또는 5 ml의 10 M HCl을 첨가하였을 때 이소프로필 포르메이트가 분해되어 이소프로판올이 형성됨을 보여줌.
도 14는 프로피오닉 안하이드라이드/수상 시스템을 (A) 산이나 염기를 가하지 아니하고 그냥 교반하였을 때, (B) 진한 염산 2ml을 가하고 교반하였을 때, (C) 10M-NaOH 3ml을 가하고 교반하였을 때 시간 경과에 따른 유제의 변화 결과 사진임. 시간이 경과함에 따라 산, 염기를 첨가하지 아니한 경우 2상을 유지하나 산(B) 이나 염기(C)를 첨가한 경우 유제상태가 사라지고 투명한 1상의 모습을 보임.
도 15는 아이소프로필 포르메이트를 유기용매로 사용하고 분해시액으로 NaOH를 농도별로 사용하여 제조한 7E 미립자의 광학현미경 사진을 나타낸다. 도 15A는 NaOH를 첨가하지 않은 것이며(0 ml), 도 15B부터 도 15F까지는 10M의 NaOH를 1ml부터 5ml까지 각각 첨가하여 제조한 7E의 사진이다. NaOH를 첨가하지 않는 경우 유제방울이 응집되어 polymeric film이 형성되는 것이 보인다.
도 16은 에틸 아세테이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 7E 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다. (a)와 (c)는 60 mg의 프로게스테론을 사용하여 제조한 미립자의 외부 및 내부 모습이며, (b)와 (d)는 250 mg의 프로게스테론을 사용하여 제조한 미립자의 외부 및 내부 모습임.
도 17은 에틸 포르메이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 7E 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다. (a)와 (c)는 60 mg의 프로게스테론을 사용하여 제조한 미립자의 외부 및 내부 모습이며, (b)와 (d)는 250 mg의 프로게스테론을 사용하여 제조한 미립자의 외부 및 내부 모습임.
도 18은 4A PLGA 0.25 g과 에틸 아세테이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다. (a)와 (c)는 60 mg의 프로게스테론 을 사용하여 제조한 미립자의 외부 및 내부 모습이며, (b)와 (d)는 250 mg의 프로게스테론을 가지고 제조한 미립자의 외부 및 내부 모습임.
도 19는 4A PLGA 0.25 g과 에틸 포르메이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다. (a)와 (c)는 60 mg의 프로게스테론을 사용하여 제조한 미립자의 외부 및 내부 모습이며, (b)와 (d)는 250 mg의 프로게스테론을 가지고 제조한 미립자의 외부 및 내부 모습임.
도 20은 이소프로필 포르메이트 분해시액으로 10 M NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 외부형상을 보여주는 전자현미경 사진을 나타낸다. (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)의 경우 사용한 프로게스테론의 양은 각각 0, 60, 100, 160, 200 및 250 mg이었음.
도 21은 이소프로필 포르메이트 분해시액으로 10 M NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 내부형상을 보여주는 전자현미경 사진을 나타낸다. (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f)의 경우 사용한 프로게스테론의 양은 각각 0, 60, 100, 160, 200 및 250 mg이었음.
도 22는 프로필 포르메이트를 유기용매로 사용하고 분해시액으로 2 ml의 HCl을 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다. (a) 0.25 g의 7E 고분자만을 가지고 제조한 미립자. (b) 0.25 g의 7E 고분자와 250 mg의 프로게스테론을 사용하여 제조한 미립자.
도 23은 미립자 샘플의 열질량분석결과를 나타낸다. 프로게스테론 함유한 미립자의 경우 휘발성 잔류유기용매의 함량은 극히 미미함을 알 수 있으며, 프로게 스테론을 함유하지 않은 미립자보다 적은 함량의 잔류유기용매를 지님을 보여줌.
도 24는 아나스트라졸 60 mg/7E 0.15 g/4A 0.1 g을 사용하고, 에틸 아세테이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 25는 아나스트라졸 60 mg/7E 0.15 g/4A 0.1 g을 사용하고, 에틸 포르메이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 26은 아나스트라졸 봉입률 분석 조건 하에서 관측된 다양한 시료들의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다: (a) 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran)과 50% 아세토니트릴(acetonitrile) 수용액의 혼합용액 (b) 에틸 아세테이트를 (a) 검체에 스파이킹(spiking) 한 용액 (c) 약물을 함유하지 않는 블랭크(blank) 미립자를 실험조건에 따라 처리한 여액 (d) 아나스트라졸 함유하고 있는 미립자로부터 실험조건에 따라 처리한 여액 (e) 50% 아세토니트릴 수용액을 사용하여 제조한 아나스트라졸 표준용액. 두 종류의 미립자 검체로부터 아주 소량의 에틸 아세테이트가 검출됨을 보여주고 있으며, 아나스트라졸 변형 산물은 본 실험조건 하에서는 생성되지 않는 점을 보여준다.
도 27은 올란자핀 60 mg/7E 0.15 g/4A 0.1 g을 사용하고, 에틸 아세테이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 28 리스페리돈 60mg/4A 0.25g을 사용하고, 에틸 포르메이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 29 아리피프라졸 40mg/4A 0.25g을 사용하고, 에틸 포르메이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 수불용성 유기용매를 염기 또는 산을 이용하여 유제에서 제거하는 단계를 포함하는 새로운 고분자 미립구의 제조방법, 상기 제조방법에 따라 제조된 고분자 미립구 및 상기 고분자 미립구를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 기존의 용매증발 또는 용매추출 공정을 필요로 하지 않고, 적은 양의 물을 사용하여 폐수 발생을 최소화하면서 빠른 시간 내에 간편하게 목적하는 약물 함유 고분자 미립구를 제조하는 데에 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
산 또는 염기를 이용한 유기용매(에틸 아세테이트) 제거 확인
에틸 아세테이트가 산 또는 염기에 의하여 분해되어 제거되는지를 확인하였다. 에틸 아세테이트(ethyl acetate)가 산이나 염기에 의해 분해되면 수용성의 에 탄올과 아세트산이 형성된다. 이에 착안하여 수용액 중에 녹아있는 에틸 아세테이트와 에탄올을 가스크로마토그래피(GC, gas chromatography) 방법으로 정량하였다.
비이커에 0.5% 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol) 수용액 40 ml를 담고 10 M-NaOH 또는 10 M-HCl 해당량(대조군의 경우 미첨가, 실험군의 경우 2ml 또는 5ml 첨가)을 넣은 다음 에틸 아세테이트 4 ml을 기벽을 따라 가했다. 두 상이 완전히 섞이지 않도록 교반하면서 3, 15, 25, 35, 45, 60 및 75분에 수상(water phase)으로부터 각각 200 의 샘플을 취하여 GC 분석을 실시하였다.
GC 분석은 GC-2010(Shimadzu, Japan)으로 실시하였으며, 분석칼럼으로 6%-시아노프로필페닐-94%-메틸 폴리실록산(6%-cyanopropylphenyl-94%-methyl polysiloxane)을 고정상으로 한 제브론(Zebron) ZB-624(Phenomenex, USA)를 사용하였다. 이소프로판올을 내부표준물질로 하여 에틸 아세테이트의 분해산물인 에탄올과 에틸 아세테이트의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에서 보듯이, 수상에 아무런 시액을 첨가하지 않은 경우(Blank) 시간이 경과함에 따라 에틸 아세테이트 일부가 수상으로 조금씩 전이되어 수상에 녹은 에틸 아세테이트의 농도가 증가되고 나중에는 일정한 농도에 도달됨을 알 수 있었다. 이는 곧 수상이 에틸 아세테이트에 의해 포화되어짐을 의미하며, 에틸 아세테이트가 분해되지 않아 에탄올은 전혀 수상에서 검출되지 않는 것도 확인할 수 있었다.
이와는 반대로 10 M-NaOH를 5 ml를 가한 경우 에틸 아세테이트의 가수분해 산물 중 하나인 에탄올의 농도가 계속 증가됨을 알 수 있었다. 이는 수상에 녹는 에틸 아세테이트가 가수분해되어 에탄올과 아세트산 나트륨(sodium acetate)가 형성되기 때문이다. 아울러, 수상에 녹아있는 에틸 아세테이트는 NaOH에 의해 재빨리 분해되므로 검출되지 않는 것도 확인할 수 있었다. 아울러, 반응 종결 후에는 초기의 두 상(two phases)은 완전히 섞여 한 가지 상(one phase)로 변하는 것도 확인할 수 있었다.
또한, 10 M-NaOH 2 ml를 가한 경우에는 초기에는 수상에 녹는 에틸 아세테이트를 효과적으로 분해시켜 에탄올이 생성되지만, 시간 경과 후 NaOH가 다 소비되는 경우 에탄올 양은 더 이상 증가하지 않고, 수상에 녹아있는 에틸 아세테이트가 검출됨을 알 수 있었다.
<실시예 2>
산 또는 염기를 이용한 유기용매(에틸 포르메이트) 제거 확인
에틸 포르메이트가 산 또는 염기에 의하여 분해되어 제거되는지를 확인하였다. 에틸 포르메이트(ethyl formate)가 산이나 염기에 의해 분해되면 수용성의 에탄올과 포름산(formic acid)가 형성된다. 이에 착안하여, 다양한 실험조건 하에서, 수용액 중에 녹아있는 에틸 포르메이트와 에탄올을 아래의 GC 크로마토그래피 방법 으로 정량하였다.
비이커에 0.5% 폴리비닐 알코올 (PVA) 수용액 40 ml을 담고 2 또는 6 ml의 10 M-NaOH 또는 10 M-HCl을 넣은 다음(대조군(Blank)의 경우 미첨가) 에틸 포르메이트 4 ml을 기벽을 따라 가했다. 그리고 두 상이 섞이지 않도록 교반하면서 에틸 포르메이트의 일부가 수상으로 확산될 수 있게 하였다. 교반 시작 후 5, 10, 15, 20, 30, 45 및 60분에서 수상으로부터 각각 200 의 샘플을 취하여 GC 분석을 실시하였다.
GC 분석은 GC-2010(Shimadzu, Japan)으로 실시하였으며, 분석칼럼으로 6%-시아노프로필페닐-94%-메틸 폴리실록산을 고정상으로 한 제브론(Zebron) ZB-624 (Phenomenex, USA)를 사용하였다. 메탄올을 내부표준물질로 하여 에틸 포르메이트의 분해산물인 에탄올과 에틸 포르메이트의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 3 및 도 4에서 보듯이, 수상(water phase)에 아무런 시액을 첨가하지 않은 경우 시간이 경과함에 따라 사용한 에틸 포르메이트 일부가 수상으로 조금씩 전이되어 수상에 존재하는 에틸 포르메이트의 농도가 증가되고 나중에는 일정한 농도에 도달함을 알 수 있었다. 이는 곧 수상이 에틸 포르메이트에 의해 포화되어짐을 의미하며, 에틸 포르메이트가 분해되지 않아 에탄올은 전혀 수상에서 검출되지 않는 것도 확인할 수 있었다.
이와는 반대로 10 M-NaOH를 6 ml를 가한 경우 에틸 포르메이트의 가수분해 산물 중 하나인 에탄올의 농도가 계속 증가됨을 알 수 있었다. 이는 에틸 포르메이트가 가수분해되어 에탄올과 포름산 나트륨(sodium formate)이 형성되기 때문이다. 아울러, 수상에 녹아있는 에틸 포르메이트는 NaOH에 의해 재빨리 분해되므로 검출되지 않는 것도 확인할 수 있었다. 아울러, 반응 종결 후에는 초기의 두 상(two phases)은 완전히 섞여 한 가지 상(one phase)로 변하는 것도 확인할 수 있었다.
또한, 10 M-NaOH 2 ml를 가한 경우에는 초기에는 수상에 녹는 에틸 포르메이트를 효과적으로 분해시켜 에탄올이 형성되지만, 시간 경과 후 NaOH가 다 소비되는 경우 에탄올 양은 더 이상 증가하지 않고, 수상에 녹아있는 에틸 포르메이트가 검출됨을 알 수 있었다.
한편, 10 M-NaOH 대신에 10 M-HCl을 에틸 포르메이트 분해시액으로 사용한 경우, 도 4 및 도 5B에서 보듯이, HCl을 사용하면 NaOH와는 달리 6 ml이나 2 ml을 사용하더라도 반응시간을 연장하면 에틸 포르메이트 모두를 효과적으로 분해할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 반응 중 NaOH는 소모되지만, HCl은 소모되지 않고 촉매로 작용하기 때문이다.
<실시예 3>
산 또는 염기를 이용한 유기용매(프로필 포르메이트) 제거 확인
프로필 포르메이트가 산 또는 염기에 의하여 분해되어 제거되는지를 확인하였다. 프로필 포르메이트가 산이나 염기에 의해 분해되어지면 수용성의 프로판올(propanol)과 포름산이 형성된다. 이에 착안하여 수용액 중에 녹아있는 프로필 포르메이트와 프로판올을 가스크로마토그래피 방법으로 정량하였다.
비이커에 0.5% 폴리비닐 알코올 수용액 40 ml을 담고 10 M-NaOH 또는 10 M-HCl을 해당량(대조군의 경우 미첨가, 실험군의 경우 2ml 또는 5ml 첨가) 넣은 다음 프로필 포르메이트(propyl formate) 4 ml을 기벽을 따라 가했다. 그리고 두 상이 섞이지 않도록 교반하면서 교반 시작 후 5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 85, 120 및 160분에서 수상으로부터 각각 200 의 샘플을 취하여 GC 분석을 실시하였다.
GC 분석은 GC-2010(Shimadzu, Japan)으로 실시하였으며, 분석칼럼으로 6%-시아노프로필페닐-94%-메틸 폴리실록산을 고정상으로 한 제브론(Zebron) ZB-624 (Phenomenex, USA)를 사용하였다. 에탄올을 내부표준물질로 하여 프로필 포르메이트의 분해산물인 프로판올과 프로필 포르메이트의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 6 및 도 7에서 보듯이, 수상(water phase)에 아무런 시액을 첨가하지 않은 경우 시간이 경과함에 따라 사용한 프로필 포르메이트 일부가 수상으로 조금씩 전이되어 수상에 존재하는 프로필 포르메이트의 농도가 증가되고 나중에는 일정한 농도에 도달함을 알 수 있었다. 이는 곧 수상이 프로필 포르메이트에 의해 포화되어 짐을 의미하며, 프로필 포르메이트가 분해되지 않아 프로판올은 전혀 수상에서 검출되지 않는 것도 확인할 수 있었다.
이와는 반대로 10 M-NaOH를 5 ml를 가한 경우 프로필 포르메이트의 가수분해 산물 중 하나인 프로판올의 농도가 계속 증가됨을 알 수 있었다. 이는 프로필 포르메이트가 가수분해되어 프로판올과 포름산 나트륨(sodium formate)이 형성되기 때문이다. 아울러, 수상에 녹아있는 프로필 포르메이트는 NaOH에 의해 재빨리 분해되므로 검출되지 않는 것도 확인할 수 있었다. 아울러, 반응 종결 후에는 초기의 두 상(two phases)은 완전히 섞여 한 가지 상(one phase)로 변하는 것도 확인할 수 있었다.
또한, 10 M-NaOH 2 ml를 가한 경우에는 초기에는 수상에 녹는 프로필 포르메이트를 효과적으로 분해시켜 프로판올이 형성되지만, 시간 경과 후 NaOH가 다 소비되는 경우 프로판올 양은 더 이상 증가하지 않고, 수상에 녹아있는 프로필 포르메이트가 검출됨을 알 수 있었다.
한편, 10 M-NaOH 대신에 10 M-HCl을 프로필 포르메이트 분해시액으로 사용한 경우, 도 8 및 도 9에서 보듯이, HCl을 사용하면 NaOH와는 달리 6 ml이나 2 ml을 사용하더라도 반응시간을 연장하면 프로필 포르메이트 모두를 효과적으로 분해할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 반응 중 NaOH는 소모되지만, HCl은 소모되지 않고 촉매로 작용하기 때문이다.
<실시예 4>
산 또는 염기를 이용한 유기용매(이소프로필 포르메이트) 제거 확인
이소프로필 포르메이트가 산 또는 염기에 의하여 분해되어 제거되는지를 확인하였다. 이소프로필 포르메이트가 산이나 염기에 의해 분해되면 수용성의 이소프로판올과 포름산이 형성되어진다. 이에 착안하여 수용액 중에 녹아있는 이소프로필 포르메이트와 이소프로판올을 가스크로마토그래피 방법으로 정량하였다.
비이커에 0.5% 폴리비닐 알코올 수용액 40 ml 을 담고 10 M-NaOH 또는 10 M-HCl 해당량(대조군의 경우 미첨가, 실험군의 경우 2ml 또는 5ml 첨가)을 넣은 다음 4 ml의 이소프로필 포르메이트를 가하였다. 두 상이 완전히 섞이지 않도록 교반하면서 3, 15, 25, 35, 45, 60, 75, 90, 120, 150 및 180분에서 수상으로부터 각각 200 의 샘플을 취하여 GC 분석을 실시하였다.
GC 분석은 GC-2010(Shimadzu, Japan)으로 실시하였으며, 분석칼럼으로 6%-시아노프로필페닐-94%-메틸 폴리실록산을 고정상으로 한 제브론(Zebron) ZB-624 (Phenomenex, USA)를 사용하였다. 에탄올을 내부표준물질로 하여 이소프로필 포르메이트의 분해산물인 이소프로판올과 이소프로필 포르메이트의 양을 측정하였다.
그 결과, 도 10 및 도 11에서 보듯이, 수상(water phase)에 아무런 시액을 첨가하지 않은 경우 시간이 경과함에 따라 사용한 이소프로필 포르메이트 일부가 수상으로 조금씩 전이되어 수상에 존재하는 이소프로필 포르메이트의 농도가 증가 되고 나중에는 일정한 농도에 도달함을 알 수 있었다. 이는 곧 수상이 이소프로필 포르메이트에 의해 포화되어 짐을 의미하며, 이소프로필 포르메이트가 분해되지 않아 이소프로판올은 전혀 수상에서 검출되지 않는 것도 확인할 수 있었다.
이와는 반대로 10 M-NaOH를 5 ml를 가한 경우 이소프로필 포르메이트의 가수분해 산물 중 하나인 이소프로판올의 농도가 계속 증가됨을 알 수 있었다. 이는 이소프로필 포르메이트가 가수분해되어 이소프로판올과 포름산 나트륨(sodium formate)이 형성되기 때문이다. 아울러, 수상에 녹아있는 이소프로필 포르메이트는 NaOH에 의해 재빨리 분해되므로 검출되지 않는 것도 확인할 수 있었다. 아울러, 반응 종결 후에는 초기의 두 상(two phases)은 완전히 섞여 한 가지 상(one phase)로 변하는 것도 확인할 수 있었다.
또한, 10 M-NaOH 2 ml를 가한 경우에는 초기에는 수상에 녹는 이소프로필 포르메이트를 효과적으로 분해시켜 이소프로판올이 형성되지만, 시간 경과 후 NaOH가 다 소비되는 경우 이소프로판올 양은 더 이상 증가하지 않고, 수상에 녹아있는 이소프로필 포르메이트가 검출됨을 알 수 있었다.
한편, 10 M-NaOH 대신에 10 M-HCl을 이소프로필 포르메이트 분해시액으로 사용한 경우, 도 12 및 도 13에서 보듯이, HCl을 사용하면 NaOH와는 달리 6 ml이나 2 ml을 사용하더라도 반응시간을 연장하면 이소프로필 포르메이트 모두를 효과적으로 분해할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 반응 중 NaOH는 소모되지만, HCl은 소모되지 않고 촉매로 작용하기 때문이다.
<실시예 5>
산 또는 염기를 이용한 유기용매(프로피오닉 안하이드라이드) 제거 확인
프로피오닉 안하이드라이드(Propionic anhydride)가 산 또는 염기에 의하여 분해되어 제거되는지를 확인하였다.
프로피오닉 안하이드라이드가 산이나 염기에 의해 분해되면 수용성의 프로피오닉산(propionic acid)이 형성되어진다. 이에 착안하여 초기의 두 상(two phase)이 반응 종결 후 완전히 섞여 한 가지 상(one phase)으로 변하는지를 확인하였다.
비이커에 0.5% 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol)수용액 40mL을 담고 3mL의 10M-NaOH (또는 2 mL의 진한 염산)를 가한 후 교반기의 교반 속도를 550rpm으로 설정하였다. 여기에 4mL의 프로피오닉 안하이드라이드를 가한 후 시간에 따른 상(phase) 변화를 관찰하였다. 대조실험(control experiment)으로 NaOH나 HCl을 가해주지 않고 4mL의 프로피오닉 안하이드라이드를 40mL의 0.5% 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol) 수용액에 유화시킨 후 상 변화를 관찰하였다.
그 결과 도 14에서 보는바와 같이, 산이나 염기를 가해주지 않은 경우에는 교반 후 20분이 지나더라도 유제 상태가 유지되어 뿌연 상태(실제로는 두개의 상) 로 관찰되었다. 즉 수상은 사용한 프로피오닉 안하이드라이드 일부에 의해 쉽게 포화되어지고 나머지 프로피오닉 안하이드라이드(propionic anhydride)는 분산상인 유제방울에 계속 존재하고 있음을 증명하고 있다. 하지만 산이나 염기를 가해준 경우에 모두 20분 이내에 유제 상태는 사라져 맑고 투명한 하나의 상의 모습을 보여주었다. 이러한 결과는 바로 산/염기 반응에 의해 수불용성의 프로피오닉 안하이드라이드가 수용성의 프로피오닉산으로 완전히 변화됨을 증명하고 있다.
<실시예 6>
유기용매를 분해하는 분해시액의 양에 따른 미립자 경화
본 실시예 6 내지 12에 사용한 고분자화합물은 폴리-d,l-락티드-코-글리콜리드(poly-d,l-lactide-co-glycolide, PLGA)이었으며, 구체적으로 PLGA75:25 (i.v. = 0.70 dL/g in CHCl3 본문 중 약자로 사용할 때는 7E로 표현) 및 PLGA 50:50(i.v. = 0.46 dL/g in CHCl3 본문 중 약자로 사용할 때는 4A로 표현) 및 PLGA 50:50(i.v. = 0.18 dL/g in CHCl3 본문 중 약자로 사용할 때는 2A로 표현)를 사용하였다.
유기용매 아이소프로필 포르메이트(isopropyl formate) 4mL에 0.25g의 7E를 완전히 녹였다. 본 분산상을 0.5% 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol) 수용액 40mL이 들어있는 비이커에 넣고 교반기로 유화시켰다. 본 유제에 0, 1, 2, 3, 4, 및 5mL의 10 M-NaOH를 가한 후 15분 교반시켰다. 이후에 샘플 일부를 취해 glass slide 위에 놓고 광학현미경으로 관찰하였다.
그 결과 도 15에서 보는 바와 같이 유기용매로서 아이소프로필 포르메이트를 사용한 경우 NaOH를 가해주지 않으면 15분 동안 교반하더라도 유제방울은 액체상태로 그대로 존재하였다. 그러므로 교반을 멈추고 광학현미경을 찍기 위해 glass slide 위에 샘플을 두었을 때 유제방울은 서로 응집되어져(coalesced) 미립자가 아닌 필름 형태의 응집체(aggregates)가 되었다. 하지만 1mL의 10M NaOH를 가해준 경우에는 유제방울의 응집현상이 방지되는 것을 확인하였다. 2mL 내지 5mL의 NaOH를 넣어주었을 경우에도 유제방울들의 응집현상을 효과적으로 방지할 수 있었다.
<실시예 7>
프로게스테론을 봉입한 미립자의 제조
<7-1> 에틸 아세테이트 또는 에틸 포르메이트를 사용한 프로게스테론을 봉입한 미립자의 제조
0.25 g의 7E 또는 4A를 4 ml의 에틸 아세테이트에 넣어 녹였다. 여기에 다양한 함량의 프로게스테론(progesterone)(60 또는 250 mg)을 넣어 녹인 분산상을 0.5% 폴리비닐 알코올(PVA) 수용액 40 ml에 넣어 교반시켜 o/w(oil-in-water) 형의 유제를 제조하였다. 이후 유제에 10 M-NaOH 5 ml을 넣어 30분 동안 반응시키고 증류수 40ml을 넣고 교반시킨 후 여과시켜 미립자를 회수하였다. 본 미립자를 0.5% PVA 용액 16 ml에 재분산시키고 증류수로 총 80 ml로 맞춘 후 교반시켰다. 여과 후 미립자를 진공건조기에서 밤새 건조시켰다.
아울러, 에틸 포르메이트의 경우 에틸 아세테이트 대신에 에틸 포르메이트를 사용한 것 및 분해시액으로 6 ml의 10 M-NaOH 또는 5 ml의 10 M-HCl을 사용한 것을 제외하고는 상기 방법과 동일하게 하여 프로게스테론이 봉입된 미립자를 제조하였다.
그 결과, 도 16, 도 17, 도 18 및 도 19에서 보듯이, 각각의 프로게스테론이 봉입된 구형의 미립자가 잘 제조됨을 알 수 있었다. 에틸 아세테이트와 에틸 포르메이트를 유기용매로 사용하였을 때 미립자의 내부 및 외부 형상은 서로 유사하였다. 7E 고분자를 사용하였을 때에는 프로게스테론의 양에 관계없이 미립자의 외부는 약물 크리스탈이 보이지 않는 매끈한 형상을 나타내었다.
<7-2> 프로게스테론의 봉입률의 분석
상기 실시예 <7-1>에서 제조한 미립자 일부를 정확하게 칭량한 후 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran) 4 ml에 녹이고, 메탄올로 6배 희석한 후 필터로 여과하여 PLGA 침전물을 제거하였다. 여액 일부 (20 μl)를 HPLC (Shimadzu LC-20AD, Luna 5 m C18(2) 칼럼)에 주입하여 프로게스테론의 농도를 측정하였다. 다음의 식을 사용하여 약물의 이론 부하량(%)과 실제 부하량 (%)을 구하고 그 백분율을 약물 봉입률(%)로 정의하였다.
약물의 이론 부하량 (%) = (사용한 약물중량(mg) / 사용한 PLGA 중량(mg) + 사용한 약물중량(mg)) x 100
약물의 실제 부하량 (%) = (미립자에 봉입된 약물중량(mg) / 봉입률 측정을 위하여 사용한 미립자의 중량(mg)) x 100
약물봉입률 (%) = (약물의 실제 부하량 (%) / 약물의 이론 부하량(%)) x 100
그 결과, 하기 표 1(에틸 아세테이트)과 표 2(에틸 포르메이트)에서 보듯이, 사용한 대부분의 프로게스테론이 미립자에 봉입되어짐을 알 수 있었다. 사용한 유기용매 종류는 프로게스테론의 봉입률에 현저한 차이를 유발하지 않았다. 또한 에틸 포르메이트를 사용한 경우 10M-NaOH나 10 M-HCl은 유사한 봉입률을 보여주었다. 각각의 실험에 대해서 모든 경우 배치 재현성이 관측되어 배치별 봉입률은 일정함을 알 수 있었다.
PLGA 종류 / 양 프로게스테론
(mg)		 분해시액 봉입률(%)
배치 1 배치 2 배치 3
7E / 0.25g 60 10M NaOH 5ml 93.8 92.3 96.0
7E / 0.25g 250 10M NaOH 5ml 92.8 92.0 97.7
4A / 0.25g 60 10M NaOH 5ml 90.5 92.8 95.3
4A / 0.25g 250 10M NaOH 5ml 93.2 92.2 98.5
PLGA 종류 / 양 프로게스테론
(mg)		 분해시액 봉입률(%)
배치 1 배치 2 배치 3
7E / 0.25g 60 10M NaOH 6ml 93.9 94.0 91.6
7E / 0.25g 250 10M NaOH 6ml 95.5 98.5 99.7
4A / 0.25g 60 10M NaOH 6ml 92.0 93.3 95.6
4A / 0.25g 250 10M NaOH 6ml 96.2 93.2 100.7
7E / 0.25g 60 10M HCl 5ml 84.1 88.7 86.1
7E / 0.25g 100 10M HCl 5ml 89.0 92.8 91.5
7E / 0.25g 160 10M HCl 5ml 98.9 102.0 96.9
7E / 0.25g 200 10M HCl 5ml 99.2 102.0 95.5
7E / 0.25g 250 10M HCl 5ml 101.0 101.0 99.6
<7-3> 프로필 포르메이트 또는 이소프로필 포르메이트를 사용한 프로게스테론을 봉입한 미립자 제조
7E 0.25 g을 이소프로필 포르메이트 또는 프로필 포르메이트 4 ml을 넣고 녹였다. 여기에 각각의 함량에 따라 60 내지 250 mg의 프로게스테론을 녹여 분산상을 만들었다. 이 용액을 0.5% 폴리비닐 알코올(PVA) 수용액 40 ml에 넣어 교반시켰다. 본 o/w(oil-in-water) 유제에 10 M-NaOH 4 ml을 넣어 30분 동안 반응시키고 증류수 40 ml을 넣고 교반시킨후 여과시켜 미립자를 회수하였다. 본 미립자를 0.5% PVA 수용액 16 ml에 재분산시키고 증류수로 총 80 ml로 맞춘 후 교반시켰다. 이후 여과하여 미립자를 진공건조기에서 건조시켰다.
그 결과, 도 20, 도 21 및 도 22에서 보듯이, 이소프로필 포르메이트 또는 프로필 포르메이트를 사용한 경우 프로게스테론이 봉입된 구형의 미립자가 잘 제조됨을 알 수 있었다.
<7-4> 프로게스테론의 봉입률의 분석
상기 실시예 <7-3>에서 제조한 각각의 미립자에 대해서 상기 실시예 <7-2>의 방법에 따라 프로게스테론의 봉입률을 분석하였다.
그 결과, 표 3(프로필 포르메이트) 및 표 4(이소프로필 포르메이트)에서 보듯이, 사용한 대부분의 프로게스테론이 미립자에 봉입되어짐을 알 수 있었다. 사용한 유기용매 종류 및 프로게스테론의 양은 프로게스테론의 봉입률에 현저한 차이를 유발하지 않았다.
PLGA 종류 / 양 프로게스테론(mg) 분해시액 봉입률(%)
7E / 0.25g 60 10M NaOH 4ml 90.9 ± 2.1
7E / 0.25g 100 10M NaOH 4ml 89.9 ± 1.2
7E / 0.25g 160 10M NaOH 4ml 93.0 ± 1.2
7E / 0.25g 200 10M NaOH 4ml 91.9 ± 1.2
7E / 0.25g 250 10M NaOH 4ml 93.0 ± 1.3
7E / 0.25g 60 10M HCl 2ml 83.5 ± 0.9
7E / 0.25g 250 10M HCl 2ml 95.3 ± 0.9
PLGA 종류 / 양 프로게스테론(mg) 분해시액 봉입률(%)
7E / 0.25g 60 10M NaOH 4ml 94.6 ± 2.4
7E / 0.25g 100 10M NaOH 4ml 92.4 ± 2.0
7E / 0.25g 160 10M NaOH 4ml 95.4 ± 0.9
7E / 0.25g 200 10M NaOH 4ml 96.1 ± 0.9
7E / 0.25g 250 10M NaOH 4ml 97.5 ± 2.5
7E / 0.25g 60 10M HCl 2ml 83.0 ± 2.1
7E / 0.25g 250 10M HCl 2ml 92.0 ± 2.6
<7-5> 미립자에 존재하는 유기용매 잔류량 측정
미립자에 존재하는 유기용매의 잔류량을 측정하기 위하여 상기 실시예 <7-3>에서 이소프로필 포르메이트를 유기용매로 사용하여 제조한 미립자를 진공상태에서 3일간 보관한 다음 미립자에 존재하는 이소프로필 포르메이트의 잔류량을 측정하였다.
미립자 검체 일정량 (약 30 mg 내외)을 정확히 칭량하고 2 ml의 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)에 완전히 녹였다. 이를 부탄올을 사용하여 5배 희석하고 침전된 PLGA를 여과, 제거하였다. 여액에 포함된 이소프로필 포르메이트의 농도를 상기 실시예 4에 기재한 방법에 따라 GC 분석으로 측정하였다.
그 결과, 하기 표 5에서 보듯이, 본 발명에서 제조한 미립자는 매우 낮은 수준의 이소프로필 포르메이트 잔류량을 보였다. 이러한 결과로부터 본 미립자 제조방법은 유제방울로부터 수상으로 전이된 이소프로필 포르메이트를 효과적으로 분해시켜 제거함으로써 유제방울로부터 수상으로 이소프로필 포르메이트가 계속적으로 전이되어 제거되도록 하여, 유기용매 제거에 탁월한 효능이 있음을 보여준다. 또한 잔류 용매의 양은 미립자에 봉입되는 프로게스테론의 약물 (사용)량에 반비례함을 알 수 있었다.
PLGA 종류 / 양 프로게스테론(mg) 분해시액 잔류량(%)
7E / 0.25g 0 10M NaOH 5ml 3.15 ± 0.66
7E / 0.25g 60 10M NaOH 5ml 1.57 ± 0.46
7E / 0.25g 160 10M NaOH 5ml 1.04 ± 0.16
7E / 0.25g 250 10M NaOH 5ml 0.62 ± 0.07
<7-6> 미립자의 열질량분석
미립자의 열질량을 분석하기 위하여, 상기 실시예 <7-3>에서 제조한 미립자(이소프로필 포르메이트, 0.25 g 7E, 250 mg의 프로게스테론을 사용) 및 프로게스테론을 함유하지 않는 미립자를 검체로 하여 열질량분석기(TGA 2050)를 이용하여 분석하였다. 이 때 퍼지 가스(purge gas)로서 질소가스를 사용하였으며, 온도를 분당 10℃씩 증가시키면서 미립자의 무게변화를 자동적으로 기록하였다.
그 결과, 도 23에서 보듯이, 프로게스테론과 약물이 분해되기 이전까지의 온도로서 간주할 수 있는 150℃까지에서 프로게스테론을 함유하고 있지 않은 미립자 검체의 무게 손실은 3.74%이었다. 이에 반하여 250 mg의 프로게스테론을 포함하는 미립자는 150℃까지 무게 소실 정도는 0.75%에 불과하였다. 이러한 결과는 앞서 언급한 GC를 활용한 미립자 내의 이소프로필 포르메이트 잔류량 데이터와 유사한 경향을 보여주고 있었다. 결론적으로 본 제조공정을 통하여 미립자를 제조하였을 때 유제방울로부터 사용한 유기용매가 효과적으로 제거되며, 미립자에 잔류하는 유기용매의 양이 미미함을 알 수 있었다.
<실시예 8>
아나스트라졸을 봉입한 미립자 제조
<8-1> 에틸 아세테이트 또는 에틸 포르메이트를 사용한 아나스트라졸을 봉입한 미립자의 제조
7E, 4A 및 2A 고분자를 에틸 아세테이트 4ml을 넣고 각각 녹였다. 여기에 아나스트라졸(anastrazole) 60mg을 녹여 분산상을 만들었다. 이 용액을 0.5% 폴리비닐 알코올(PVA) 수용액 40ml에 넣어 교반시켰다. 본 o/w(oil-in-water) 유제에 10 M-NaOH 5ml을 넣어 반응시키고 증류수 40ml을 넣고 교반시킨 후 여과시켜 미립자를 회수하였다. 본 미립자를 0.5% PVA 수용액 16ml에 재분산시키고 증류수로 총 80ml로 맞춘 후 교반시켰다. 여과 후 미립자를 진공건조기에서 밤새 건조시켰다.
아울러, 에틸 아세테이트 대신에 에틸 포르메이트를 사용한 것 및 10M NaOH 첨가량을 6ml로 한 것을 제외하고는 상기 방법과 동일하게 하여 에틸 포르메이트를 이용한 미립자를 제조하였다.
그 결과, 도 24 및 도 25에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 구형의 미립자가 잘 제조됨을 알 수 있었다.
<8-2> 아나스트라졸 봉입률 측정
상기 <8-1>에서 제조한 미립자에 대해서 봉입률을 다음과 같이 측정하였다. 상기 실시예 <8-1>에서 제조한 미립자 일부를 정확하게 칭량한 후 4 ml의 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofuran)에 완전히 녹였다. 50% 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하여 6배 희석시킨 후 0.45 ㎛ 주사기 필터를 사용하여 PLGA 침전물을 제거하였다. 여액 일부 (20 μl)를 HPLC (Shimadzu LC-20AD)에 주입하여 아나스트라졸 농도를 측정하였다. 이 때, 분석칼럼으로서는 Luna 5 m C18(2)를 사용하였다. 약물의 봉입률(%)은 상기 실시예 <7-2>에서의 식으로 산출하였다.
그 결과, 하기 표 6에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 미립자는 아나스트라졸에 대해서 높은 수준의 봉입률을 보였으며, 배치별로 유사한 봉입률을 관찰할 수 있어서 배치 재현성을 확인할 수 있었다. 또한 아나스트라졸의 경우 봉입률 측면에서는 에틸 포르메이트를 사용하였을 때 에틸 아세테이트를 사용하였을 때보다 약간 낮은 봉입률을 보여주었다.
PLGA 종류 / 양 유기용매 봉입률(%)
배치 1 배치 2 배치 3
7E / 0.15g + 4A / 0.1g 에틸 아세테이트 75.3 73.8 74.7
4A / 0.25g 에틸 아세테이트 78.1 74.9 77.6
2A / 0.25g 에틸 아세테이트 78.5 75.2 73.7
7E / 0.15g + 4A 0.1g 에틸 포르메이트 60.8 65.1 65.5
<8-3> 아나스트라졸 HPLC 크로마토그램 분석
상기 실시예 <8-1>에서 에틸 아세테이트/PLGA75:25/NaOH를 사용하여 미립자를 제조하였을 때, 미립자 제조공정 도중 아나스트라졸 분해산물이나 변형물이 생성되는지를 간접적으로 판단하기 위하여 여러 가지의 시료(기본 제조방법은 실시예 <8-1> 참조)를 만들고 그들의 크로마토그램을 분석하였다.
그 결과, 도 26에서 보듯이, 아나스트라졸을 미립자에 봉입시킨 후 다시 회수하였을 때 표준품과 동일한 아나스트라졸을 회수할 수 있었으며, 아나스트라졸 분해산물이나 변형물이 생성되지 않았음을 확인할 수 있었다.
<실시예 9>
올란자핀을 봉입한 미립자 제조
<9-1> 에틸 아세테이트를 사용한 올란자핀을 봉입한 미립자의 제조
0.15 g의 7E 및 0.1 g의 4A 또는 2A를 에틸 아세테이트 4 ml을 넣고 녹였다. 여기에 올란자핀(olanzapine) 60mg을 녹여 분산상을 만들었다. 이 용액을 0.5% 폴리비닐 알코올(PVA) 수용액 40ml에 넣어 교반시켰다. 본 o/w(oil-in-water) 유제에 10 M NaOH 5 ml을 넣어 30분 동안 반응시키고 증류수 40 ml을 넣고 더 교반시킨후 여과시켜 미립자를 회수하였다. 본 미립자를 0.5% PVA 용액 16 ml에 재분산시키고 증류수로 총 80 ml로 맞춘 후 교반시켰다. 여과후 미립자를 진공건조기에서 밤새 건조시켰다.
그 결과, 도 27에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 구형의 미립자가 잘 제조됨을 알 수 있었다.
<9-2> 올란자핀 봉입률 측정
올란자핀을 함유하고 있는 미립자 일부를 정확하게 칭량한 후 4 ml의 테트라하이드로퓨란에 완전히 녹였다. 에탄올을 사용하여 6배 희석시킨 후 0.45 ㎛ 주사기 필터를 사용하여 PLGA 침전물을 제거하였다. 여액 20 μl를 HPLC (Shimadzu LC-20AD)에 주입하여 올란자핀 농도를 측정하였다. 본 실험을 위해 분석칼럼으로서는 Luna 5 m C18(2) 칼럼을 사용하였다. 약물의 봉입률(%)은 상기 실시예 <7-2>에서의 식으로 산출하였다.
그 결과, 표 7에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 미립자는 올란자핀에 대해서 높은 수준의 봉입률을 보였으며, 배치별로 유사한 봉입률을 관찰할 수 있어서 배치 재현성을 확인할 수 있었다. 각 총 4배치로부터 산출한 봉입률은 7E/4A 포물레이션 경우 83.5 ± 4.4%이었으며 7E/2A 조합인 경우에는 79.8 ± 2.7%이었다.
PLGA 종류 / 양 유기용매 봉입률(%)
배치 1 배치 2 배치 3 배치 4
7E / 0.15g + 4A / 0.1g 에틸 아세테이트 84.3 82.8 78.1 88.8
7E / 0.15g + 2A / 0.1g 에틸 아세테이트 81.0 81.1 75.8 81.3
<실시예 10>
리스페리돈을 봉입한 미립자 제조
<10-1> 에틸 포르메이트를 사용한 리스페리돈을 봉입한 미립자의 제조
0.25 g의 4A 를 에틸 포르메이트 4 ml에 넣고 녹였다. 여기에 리스페리돈(risperidone) 60 mg을 녹여 분산상을 만들었다. 이 용액을 0.5% 폴리비닐 알코올(PVA) 수용액 40 ml에 넣어 교반시켰다. 본 o/w(oil-in-water) 유제에 8 M NaOH 5 ml을 넣어 30분 동안 반응시키고 증류수 40 ml을 넣고 더 교반시킨후 여과시켜 미립자를 회수하였다. 본 미립자를 0.5% PVA 용액 16ml에 재분산시키고 증류수로 총 80 ml로 맞춘 후 교반시켰다. 여과후 미립자를 진공건조기에서 밤새 건조시켰다.
그 결과, 도 28에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 구형의 미립자가 잘 제조됨을 알 수 있었다.
<10-2> 리스페리돈 봉입률 측정
리스페리돈을 함유하고 있는 미립자 일부를 정확하게 칭량한 후 4 ml의 테트라하이드로퓨란에 완전히 녹였다. 에탄올을 사용하여 6배 희석시킨 후 여과하여 PLGA 침전물을 제거하였다. 여액 20 μl를 HPLC (Shimadzu LC-20AD)에 주입하여 리스페리돈 농도를 측정하였다. 약물의 봉입률(%)은 상기 실시예 <7-2>에서의 식으로 산출하였다.
그 결과, 표 8에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 미립자는 리스페리돈에 대해서 높은 수준의 봉입률을 보였으며, 배치별로 유사한 봉입률을 관찰할 수 있어서 배치 재현성을 확인할 수 있었다. 총 3배치로부터 산출한 봉입률은 75.0 ± 1.4%이었다.
PLGA 종류 / 양 유기용매 봉입률(%)
배치 1 배치 2 배치 3
4A / 0.25g 에틸 포르메이트 75.2 73.6 76.3
<실시예 11>
아리피프라졸을 봉입한 미립자 제조
<11-1> 에틸 포르메이트를 사용한 아리피프라졸을 봉입한 미립자의 제조
0.25 g의 4A 를 에틸 포르메이트 4 ml에 넣고 녹였다. 여기에 아리피프라졸(aripiprazole) 40 mg을 녹여 분산상을 만들었다. 이 용액을 0.5% 폴리비닐 알코올(PVA) 수용액 40 ml에 넣어 교반시켰다. 본 o/w(oil-in-water) 유제에 8 M NaOH 5 ml을 넣어 30분 동안 반응시키고 증류수 40 ml을 넣고 더 교반시킨후 여과시켜 미립자를 회수하였다. 본 미립자를 0.5% PVA 용액 16 ml에 재분산시키고 증류수로 총 80 ml로 맞춘 후 교반시켰다. 여과후 미립자를 진공건조기에서 밤새 건조시켰다.
그 결과, 도 29에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 구형의 미립자가 잘 제조됨을 알 수 있었다.
<11-2> 아리피프라졸 봉입률 측정
아리피프라졸을 함유하고 있는 미립자 일부를 정확하게 칭량한 후 4 ml의 테트라하이드로퓨란에 완전히 녹였다. 에탄올을 사용하여 6배 희석시킨 후 여과하여 PLGA 침전물을 제거하였다. 여액 20 μl를 HPLC (Shimadzu LC-20AD)에 주입하여 아리피프라졸 농도를 측정하였다. 약물의 봉입률(%)은 상기 실시예 <7-2>에서의 식으로 산출하였다.
그 결과, 표 9에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 미립자는 아리피프라졸에 대해서 높은 수준의 봉입률을 보였으며, 배치별로 유사한 봉입률을 관찰할 수 있어서 배치 재현성을 확인할 수 있었다. 총 3배치로부터 산출한 봉입률은 72.3 ± 2.0%이었다.
PLGA 종류 / 양 유기용매 봉입률(%)
배치 1 배치 2 배치 3
4A / 0.25g 에틸 포르메이트 72.2 74.3 70.3
<실시예 12>
도세탁셀, 피록시캄, 리바스티그민, 톨테로딘을 봉입한 미립자 제조
<12-1> 도세탁셀, 피록시캄, 리바스티그민, 톨테로딘을 봉입한 미립자의 제조
도세탁셀 50 mg을 에틸 아세테이트 4 ml 에, 피록시캄 50 mg 을 에틸 포르메이트에 4 ml 에, 리바스티그민 40 ㎕를 에틸 아세테이트 4 ml 에, 톨테로딘 40 mg 을 에틸 포르메이트 4 ml 에 각각 녹였다. 여기에 0.25 g의 7E 를 녹여 분산상을 만들었다. 이 용액을 0.5% 폴리비닐 알코올(PVA) 수용액 40 ml에 넣어 교반시켰다. 본 o/w(oil-in-water) 유제에 7 M NaOH 5 ml을 넣어 30분 동안 반응시키고 증류수 40 ml을 넣고 더 교반시킨후 여과시켜 미립자를 회수하였다. 본 미립자를 0.5% PVA 용액 16 ml에 재분산시키고 증류수로 총 80 ml로 맞춘 후 교반시켰다. 여과 후 미립자를 진공건조기에서 밤새 건조시켰다.
<12-2> 도세탁셀, 피록시캄, 리바스티그민, 톨테로딘 봉입률 측정
각각 도세탁셀, 피록시캄, 리바스티그민, 톨테로딘을 함유하여 제조된 미립자 일부를 정확하게 칭량한 후 4 ml의 테트라하이드로퓨란에 완전히 녹였다. 에탄올을 사용하여 6배 희석시킨 후 여과하여 PLGA 침전물을 제거하였다. 여액 20 μl를 HPLC (Shimadzu LC-20AD)에 주입하여 각 약물의 농도를 측정하였다. 약물의 봉입률(%)은 상기 실시예 <7-2>에서의 식으로 산출하였다.
그 결과, 표 10에서 보듯이, 본 발명의 방법에 따라 제조된 미립자는 각각의 약물에 대해서 높은 수준의 봉입률을 보였다.
약물종류 유기용매 봉입률(%)
배치 1 배치 2 배치 3
도세탁셀 에틸 아세테이트 83.2 80.2 84.7
피록시캄 에틸 포르메이트 76.2 81.2 79.2
리바스티그민 에틸 아세테이트 74.2 79.7 78.1
톨테로딘 에틸 포르메이트 70.3 77.3 73.2
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 수불용성 유기용매를 염기 또는 산을 이 용하여 유제에서 제거하는 단계를 포함하는 새로운 고분자 미립구의 제조방법, 상기 제조방법에 따라 제조된 고분자 미립구 및 상기 고분자 미립구를 포함하는 약물 전달용 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 기존의 용매증발 또는 용매추출 공정을 필요로 하지 않고, 적은 양의 물을 사용하여 폐수 발생을 최소화하면서 빠른 시간 내에 간편하게 목적하는 약물 함유 고분자 미립구를 제조하는 데에 사용할 수 있다.
도 1은 에틸 아세테이트/수상(aqueous phase) 시스템을 서서히 교반시킨 후 시간 경과에 따른 수상 시료에 대한 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC)의 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 시간의 경과에 따른 수상의 에탄올과 에틸 아세테이트 농도의 변화를 나타낸다.
도 3은 에틸 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨 후 시간별에 따른 수상 시료에 대한 GC 크로마토그램을 나타낸다.
도 4는 에틸 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨후 시간별에 따른 수상 시료의 GC 크로마토그램을 나타낸다.
도 5는 시간의 경과에 따른 수상의 에탄올 농도의 변화를 나타낸다.
도 6은 프로필 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨 후 각 시간 별로 취한 수상 시료의 GC 크로마토그램을 나타낸다.
도 7은 시간의 경과에 따른 수상의 프로판올/프로필 포르메이트 농도의 변화를 나타낸다.
도 8은 프로필 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨 후 각 시간 별로 취한 수상 시료의 GC 크로마토그램을 나타낸다.
도 9는 시간의 경과에 따른 수상의 프로판올/프로필 포르메이트 농도의 변화를 나타낸다.
도 10은 이소프로필 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨 후 시간 별 로 취한 수상 시료의 GC 크로마토그램을 나타낸다.
도 11은 시간의 경과에 따른 수상의 이소프로판올/이소프로필 포르메이트 농도의 변화를 나타낸다.
도 12는 이소프로필 포르메이트/수상 시스템을 서서히 교반시킨후 시간 별로 취한 수상 시료의 GC 크로마토그램을 나타낸다.
도 13은 시간 경과에 따른 수상의 이소프로판올 농도 변화를 나타낸다.
도 14는 프로피오닉 안하이드라이드/수상 시스템을 (A) 산이나 염기를 가하지 아니하고 그냥 교반하였을 때, (B) 진한 염산 2ml을 가하고 교반하였을 때, (C) 10M-NaOH 3ml을 가하고 교반하였을 때 시간 경과에 따른 유제의 변화 결과 사진이다.
도 15는 아이소프로필 포르메이트를 유기용매로 사용하고 분해시액으로 NaOH를 용량별로 사용하여 제조한 7E 미립자의 광학현미경 사진을 나타낸다. 도 15A는 NaOH를 0ml 첨가한 것이며, 도 15B부터 도 15F까지는 10M의 NaOH를 1ml부터 5ml까지 각각 첨가하여 제조한 7E의 사진이다.
도 16은 에틸 아세테이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 7E 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 17은 에틸 포르메이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 7E 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 18은 4A 0.25 g과 에틸 아세테이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 19는 4A 0.25 g과 에틸 포르메이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 20은 이소프로필 포르메이트 분해시액으로 10 M NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 외부형상을 보여주는 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 21은 이소프로필 포르메이트 분해시액으로 10 M NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 내부형상을 보여주는 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 22는 프로필 포르메이트를 유기용매로 사용하고 분해시액으로 2 ml의 HCl을 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 23은 미립자 샘플의 열질량분석결과를 나타낸다.
도 24는 아나스트라졸 60 mg/7E 0.15 g/4A 0.1 g을 사용하고, 에틸 아세테이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 25는 아나스트라졸 60 mg/7E 0.15 g/4A 0.1 g을 사용하고, 에틸 포르메이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 26은 아나스트라졸 봉입률 분석 조건 하에서 관측된 다양한 시료들의 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.
도 27은 올란자핀 60 mg/7E 0.15 g/4A 0.1 g을 사용하고, 에틸 아세테이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 28은 리스페리돈 60mg/4A 0.25g을 사용하고, 에틸 포르메이트 분해시액으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.
도 29은 아리피프라졸 40mg/4A 0.25g을 사용하고, 에틸 포르메이트 분해시액 으로 NaOH를 사용하여 제조한 미립자의 전자현미경 사진을 나타낸다.

Claims (10)

  1. (a) 고분자 화합물, 약물, 수불용성 유기용매 및 분산용매를 포함하는 O/W(oil-in-water)형, O/O(oil-in-oil)형 또는 W/O/W(water-in oil-in-water)형 유제를 제조하는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계에서 제조한 유제에 염기 또는 산 용액을 첨가하여 유제에서 수불용성 유기용매를 제거하는 단계를 포함하는 고분자 미립구의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 고분자 화합물이 폴리락트산, 폴리락타이드, 폴리락틱-코-글리콜산, 폴리락타이드-코-글리콜라이드(PLGA), 폴리포스파진, 폴리이미노카보네이트, 폴리포스포에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 락트산과 카프로락톤의 공중합체, 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시발레이트, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리아미노산, 락트산과 아미노산의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 하는 고분자 미립구의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 약물은 프로게스테론(progesterone) 할로페리돌(haloperidol), 티오틱센(thiothixene), 올란자핀(olanzapine), 클로자핀(clozapine), 브롬페리돌(bromperidol), 피모자이드(pimozide), 리스페리 돈(risperidone), 지프라시돈(ziprasidone), 디아제프마(diazepma), 에틸 로플라제페이트(ethyl loflazepate), 알프라졸람(alprazolam), 네모나프라이드(nemonapride), 플루옥세틴(fluoxetine), 세르트랄린(sertraline), 베늘라팍신(venlafaxine), 도네페질(donepezil), 타크린(tacrine), 갈란타민(galantamine), 리바스티그민(rivastigmine), 셀레길린(selegiline), 로피니롤(ropinirole), 페르골리드(pergolide), 트리헥시페니딜(trihexyphenidyl), 브로모크립틴(bromocriptine), 벤즈트로핀(benztropine), 콜치킨(colchicine), 노르다제팜(nordazepam), 에티졸람(etizolam), 브로마제팜(bromazepam), 클로티아제팜(clotiazepam), 멕사졸룸(mexazolum), 부스피론(buspirone), 고세렐린 아세테이트(goserelin acetate), 소마토트로핀(somatotropin), 루프롤리드 아세테이트(leuprolide acetate), 옥트레오티드(octreotide), 세트로렐릭스(cetrorelix), 산도스타틴 아세테이트(sandostatin acetate), 고나도트로핀(gonadotropin), 플루코나졸(fluconazole), 이트라코나졸(itraconazole), 미조리빈(mizoribine), 사이클로스포린(cyclosporin), 타크롤리무스(tacrolimus), 날록손(naloxone), 날트렉손(naltrexone), 클라드리빈(cladribine), 클람부실(chlorambucil), 트레티노인(tretinoin), 카르무시틴(carmusitne), 아나그렐리드(anagrelide), 독소루비신(doxorubicin), 아나스트로졸(anastrozole), 이다루비신(idarubicin), 시스플라틴(cisplatin), 닥티노마이신(dactinomycin), 도세탁셀(docetaxel), 파클리탁셀(paclitaxel), 랄티트렉세드(raltitrexed), 에피루비신(epirubicin), 레트로졸(letrozole), 메플로퀸(mefloquine), 프리마퀸(primaquine), 옥시부티 닌(oxybutynin), 톨테로딘(tolterodine), 알릴에스트레놀(allylestrenol), 로보스타틴(lovostatin), 심바스타틴(simvastatin), 프로바스타틴(provastatin), 아트로바스타틴(atrovastatin), 알렌드로네이트(alendronate), 살카토닌(salcatonin), 랄록시펜(raloxifene), 옥사드롤론(oxadrolone), 콘쥬게이티드 에스트로겐(conjugated estrogen), 에스트라디올(estradiol), 에스트라디올 발러레이트(estradiol valerate), 에스트라디올 벤조에이트(estradiol benzoate), 에티닐 에스트라디올(ethinylestradiol), 에토노게스트렐(etonogestrel), 레보노르게스트렐(levonorgestrel), 티볼론(tibolone), 피록시캄(piroxicam) 및 노르에티스테론(norethisterone)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘이상인 것을 특징으로 하는 고분자 미립구의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 수불용성 유기용매는 할로겐산(acid halogen), 안하이드라이드(anhydride), 포스포릭 안하이드라이드(phosphoric anhydride), 에스테르(ester), 카르복실 에스테르(carboxylic esters), 포스포릭 에스테르(phosphoric esters), 황산 에스테르, 질산 에스테르, 붕산 에스테르, 아미드(amide) 및 카르복실 아미드(carboxylic amides) 로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 구조를 가지는 수불용성 유기용매임을 특징으로 하는 고분자 미립구의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 수불용성 유기용매는 메틸 아세테이트(methyl acetate), 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 프로필 아세테이트(propyl acetate), 이소프로필 아세테이트(isopropyl acetate), 부틸 아세테이트(butyl acetate), 메틸 포르메이트(methyl formate), 에틸 포르메이트(ethyl formate), 이소프로필 포르메이트(isopropyl formate), 프로필 포르메이트(propyl formate), 부틸 포르메이트(butyl formate), 메틸 다이클로로아세테이트(methyl dichloroacetate), 메틸 클로로아세테이트(methyl chloroacetate), 에틸 클로로아세테이트(ethyl chloroacetate), 에틸 다이클로로아세테이트(ethyl dichloroacetate), 메틸 플루로아세테이트(methyl fluoroacetate), 메틸 다이플루로아세테이트(methyl difluoroacetate), 에틸 플루로아세테이트(ethyl fluoroacetate), 에틸 다이플루로아세테이트(ethyl difluoroacetate), 말레익 안하이드라이드(maleic anhydride), 아세트 안하이드라이드(acetic anhydride), 프로피오닉 안하이드라이드(propionic anhydride), 포스포릭 안하이드라이드(phosphoric anhydride), 아세트아마이드(acetamide), 프로피온아마이드(propionamide), 부틸아마이드(butylamide) 및 카르복실 아마이드(carboxyl amide)로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 고분자 미립구의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 분산용매가 폴리비닐 알콜 수용액, 폴리소베이트 계열 수용액 또는 이의 공용매인 수성 분산용매이거나, 또는 글리세린지방산에스 터(Glycerin Esters of Fatty Acids), 레시틴(lecithin)과 같은 유화제를 함유하는 실리콘 오일, 야채 기름, 톨루엔 및 자일렌으로 이루어진 군으로부터 선택된 비수성 분산용매임을 특징으로 하는 고분자 미립구의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 염기는 수산화나트륨(NaOH), 수산화리튬(LiOH), 수산화칼륨(KOH), 수산화암모늄(NH4OH), 수산화구리(Cu(OH)2), 및 수산화철(Fe(OH)3)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 고분자 미립구의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 산은 염산(HCl), 질산(HNO3), 황산(H2SO4), 아세트산(CH3COOH), 붕산(H3BO3) 및 탄산(H2CO3) 으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 고분자 미립구의 제조방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 고분자 미립구.
  10. 제9항의 고분자 미립구를 유효성분으로 포함하는 약물 전달용 조성물.
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