KR20100014572A - 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법 - Google Patents

Abstract

활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법, 그 제조방법에 의해 수득되는 추출물, 그 추출물을 포함하는 음식품, 의약, 구강용 조성물, 사료, 및 뼈 유래의 오스테오칼신 함유 육성 증강제가 개시된다.

Description

오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법{PROCESS FOR PRODUCING OSTEOCALCIN-CONTAINING EXTRACT}

본 발명은 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법, 그 제조방법에 의해 수득되는 추출물, 그 추출물을 포함하는 음식품, 의약, 구강용 조성물, 사료, 및 뼈 유래 오스테오칼신 함유 육성 증강제에 관한 것이다.

활성형 오스테오칼신은 뼈중 Gla 잔기 함유 단백질(BGP) 이라고도 불리고, 뼈 형성 세포인 조골세포에 의해 합성되는 세포외 매트릭스에 존재하는 특징적인 비콜라겐성 단백질이다. 활성형 오스테오칼신은 뼈에 있는 비콜라겐성 단백질의 10 내지 20%를 차지하는 것으로 알려져 있다.

인간의 오스테오칼신은 분자 중에 49개의 아미노산을 함유하고, 비타민K 의존성의 번역 후 변형에 의해서 분자 중의 글루탐산 잔기가 γ-카르복시글루탐산(Gla) 잔기로 변환된다. γ-카르복실화 오스테오칼신은 분자 중에 3 잔기의 Gla 잔기(17, 21 및 24번 위치)를 함유하고 있다. 또, 조골세포에 있어서 오스테오칼신의 생합성은 활성형 비타민D에 의해 증대된다. γ-카르복실화 오스테오칼신은 Gla 잔기를 통해서 칼슘과 결합할 수 있고, 이 작용에 의해서 뼈의 석회화에 관여하고 있는 것으로 알려져 있기 때문에, 활성형 오스테오칼신이라고 불리고 있다. 오스테 오칼신 분자의 일부는 혈중에 분비된다는 점에서, 그 혈청 중 농도는 뼈 형성이나 뼈 대사 질병의 지표로도 되어 있다.

인간에 있어서 미네랄 섭취량이 소요량을 하회하는 것은 건강을 유지하는데 있어서 바람직하지 않다. 특히, 칼슘 부족은 골다공증과 같은 뼈 질환의 위험을 상승시킬 뿐만 아니라, 근육이나 신경조직의 기능에도 영향을 미치고 있음이 알려져 있다. 칼슘을 비롯한 미네랄 흡수를 촉진하기 위해서 칼슘 결합능을 가지는 Gla를 미네랄 흡수촉진제로서 사용하는 것이 검토되고 있으며, Gla를 함유하는 오스테오칼신도 그 소재로서 사용할 수 있는 것으로 알려져 있다(특허문헌 1).

생물 유래 원료로부터 활성형 오스테오칼신을 제조하는 방법에 관한 보고는 적다. 닭의 뼈로부터 오스테오칼신, 오스테오폰틴을 선택적으로 가용화하는 방법이 보고되어 있다(비특허문헌 1). 그 문헌에 개시된 방법은 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)을 포함하는 용매를 사용하는 추출 방법이다.

뼈로부터의 오스테오칼신의 추출 방법으로서는 상기 EDTA를 포함하는 용매를 사용하는 방법 이외에 산을 사용하는 추출 방법이 알려져 있지만, 그 추출 효율은 충분하지 않다(비특허문헌 2).

한편, 축산 동물의 뼈는 그 엑스가 열수에 의해 추출되어 식품용 스프나 천연 조미료의 소재로서 이용되고 있지만, 엑스의 추출 잔사에는 유효한 이용방법이 없고, 재이용된다고 하여도 비료로서 이용되고 있는 정도이어서, 더 유용한 이용방법이 요구되고 있었다.

특허문헌 1: 일본 공개특허공보 H06-70719호

비특허문헌 1: Calcif Tissue Int., 제55권, 제230-235쪽(1994)

비특허문헌 2: Methods Enzymol., 제107권, 제516-544쪽(1984).

발명이 해결하려고 하는 과제

상기한 바와 같이, 뼈의 유용한 이용방법의 개발이 요구되고 있다. 종래 알려져 있었던 뼈로부터의 오스테오칼신의 추출 방법은 원료로서 생뼈를 사용하고, EDTA를 포함하는 용매 또는 산성 용매를 사용해서 추출하는 방법이었다. 그렇지만 EDTA는 식품에 사용할 경우, 그 용도나 사용량이 제한되고 있고, 식품 소재의 제조에 있어서 EDTA의 사용은 적합하지 않다. 가령 이 문제를 회피하기 위해서 EDTA를 제거하는 공정을 도입하였다고 해도, 완전하게 EDTA를 제거하는 것이 곤란한 동시에, EDTA를 제거하는 공정의 도입에 의해 제조 원가가 상승하게 된다. 또, 산을 사용하는 방법에서는 EDTA를 사용하는 방법에 비해서 충분한 추출 효율을 얻을 수 없다. 거기에다 원료로서 사용되고 있는 생뼈는 그 엑스가 식품 소재로서 이미 유효하게 이용되고 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 뼈로부터 활성형 오스테오칼신을 효율적으로 추출하고, 활성형 오스테오칼신을 풍부히 포함하는, 식품 소재에 적합한 추출물을 제공하는 것이다.

과제를 해결하기 위한 수단

열수 추출처리 등의 가열 처리가 가해진 뼈에, 오스테오칼신과 같은 유용 단백질이 활성형으로 존재하고 있다는 것은 알려지지 않았다. 본 발명자들은 가열 처리된 뼈를 사용해서 식품 가공기술을 구사하고, 식품 첨가제를 사용해서 여러 가지 추출처리를 실시한 바, 놀랍게도, 활성형의 오스테오칼신이 고농도이고, 효율적으로 추출할 수 있으며, 활성형 오스테오칼신을 풍부하게 포함하는 안전성이 우수한 추출물을 제조할 수 있음을 발견하였다. 또 가열 처리를 가하지 않은 생뼈로부터의 추출 방법도 확립하여 본 발명을 완성하고, 뼈로부터 채취한 활성형 오스테오칼신의 용도를 개발하였다.

본 발명의 제1발명은 가열 처리된 뼈로부터 용매 추출을 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 제1발명의 형태에 있어서, 가열 처리는 습식 가열 처리이고, 추출에 사용하는 용매는 산성 수용액 또는 알칼리성 수용액이다. 가열 처리된 뼈로서는 돼지뼈로부터 스프를 채취한 후에 남는 삶은 뼈 등을 들 수 있다.

본 발명의 제2발명은 가열 처리하지 않은 뼈로부터 알칼리성 수용액으로 용매 추출을 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 제1발명, 제2발명의 형태에 있어서, 알칼리성 수용액으로서는 pH 8 내지 12의 알칼리 수용액, 탄산염 및/또는 중탄산염의 수용액을 사용할 수 있다. 또, 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 탈염 공정을 포함할 수도 있다.

본 발명의 제3발명은 본 발명의 제1 또는 제2발명의 제조방법에 의해 제조되는 활성형 오스테오칼신 함유 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 제4발명은 본 발명의 제3발명의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 음식품에 관한 것이다. 제4발명의 음식품으로서는 육성(育成) 증강, 뼈 강화 및/또는 골다공증용의 음식품이 예시된다. 제4발명의 음식품에 있어서는 그 용기, 포장 및/또는 팸플릿에 육성 증강, 뼈 강화 및/또는 골다공증 예방 혹은 치료에 사용된다는 취지의 표시가 부착될 수 있다.

또, 본 발명에 의해 활성형 오스테오칼신을 함유하는 것을 특징으로 하는 육성 증강, 뼈 강화 및/또는 골다공증용의 음식품도 제공된다.

또, 음식품의 제조방법으로써, 본 발명의 제1 또는 제2발명의 제조방법에 의해 활성형 오스테오칼신 함유 추출물을 제조하는 공정, 및 육성 증강용, 뼈 강화용 및/또는 골다공증 예방 혹은 치료에 사용된다는 취지의 표시를 실시하는 공정을 포함하는 방법도 본 발명에 의해 제공된다.

또, 육성 증강용, 뼈 강화용 및/또는 골다공증 예방 혹은 치료용 음식품의 제조에 있어서의 제3발명의 추출물의 사용도 본 발명의 1형태이다

또, 본 발명에 의해, 제3발명의 추출물을 포함하는 γ-카르복시글루탐산(Gla) 보급제가 제공된다. 그 γ-카르복시글루탐산(Gla) 보급제로서는 음식품의 형태로 사용되는 것이 예시된다.

본 발명의 제5발명은 본 발명의 제3발명의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 의약에 관한 것이다.

또, 본 발명에 의해, 활성형 오스테오칼신을 함유하는 것을 특징으로 하는 육성 증강용, 뼈 강화용 및/또는 골다공증의 예방 혹은 치료용의 의약도 제공된다.

또한, 육성 증강방법, 뼈 강화방법, 또는 골다공증의 예방 혹은 치료방법으로써, 본 발명의 제3발명의 추출물을 투여하는 공정을 포함하는 방법도 본 발명에 의해 제공된다.

게다가, 육성 증강방법, 뼈 강화방법, 또는 골다공증의 예방 혹은 치료방법으로써, 활성형 오스테오칼신을 투여하는 공정을 포함하는 방법도 본 발명에 의해 제공된다.

본 발명의 제6발명은 본 발명의 제3발명의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제7발명은 본 발명의 제3발명의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 사료에 관한 것이다.

본 발명의 제8발명은 뼈로부터 채취된 활성형 오스테오칼신을 유효성분으로 하는 육성 증강제에 관한 것이다.

또 본 발명에 의해 본 발명의 제3발명의 추출물 및/또는 해당 추출물로부터 정제된 활성형 오스테오칼신을 유효성분으로 사용하는 화장품도 제공된다.

발명의 효과

본 발명에 의해 활성형 오스테오칼신을 풍부하게 포함하는 추출물의 제조방법이 제공된다. 그 제조방법에 의해 유용한 이용방법이 요망되고 있었던 뼈의 엑스 추출 잔사를 원료로서 사용할 수가 있다. 또한 그 제조방법에 의해 제조에 EDTA를 사용하지 않고, 음식품에 적합한 추출물을 제조할 수 있다. 게다가, 종래의 제조방법에 비교해서 제조 원가를 절감시킬 수 있다. 또 본 발명에 의해 활성형 오스테오칼신을 풍부하게 포함하는 추출물이 제공된다. 그 추출물은 이상한 맛, 이상한 냄새를 가지지 않고, 지방 성분이 제거된 수용성의 추출물로서, 여러 가지 제품 형태에로의 적용이 가능한 음식품에 적합한 추출물이다. 또 본 발명에 의해 그 추출물을 함유하는 음식품, 의약, 구강용 조성물 및 사료 등이 제공된다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에 있어서 원료로서 사용되는 뼈는 활성형 오스테오칼신을 포함하는 것이라면 특별하게 한정되지 않지만, 소, 돼지, 닭 등의 육식용 동물이나, 그 밖의 포유류, 조류, 어류 등의 척추동물의 뼈를 사용할 수 있고, 돼지의 뼈를 바람직하게 사용할 수 있다. 뼈는 부착된 살을 제거한 뼈(이하, '생뼈' 라고 기재하는 경우가 있다)를 사용할 수 있다.

또, 본 발명자들은 놀랍게도, 열수 처리나 가압 열수 처리 후의 뼈로부터도, 활성형 오스테오칼신을 포함하는 추출물을 제조할 수 있다는 것을 발견하였다. 즉, 본 발명에 의해 원료로서 가열 처리된 뼈를 사용하는 것을 특징으로 하는 활성형 오스테오칼신 함유 추출물이 제공된다. 가열 처리된 뼈는 생뼈보다도 여분의 지방분이 적어, 활성형 오스테오칼신을 추출하는 원료로서 매우 바람직하다. 본 발명에 있어서 원료로서 사용되는 가열 처리된 뼈로서는, 가열 처리, 예를 들면 습식 가열 처리, 예를 들면 열수 처리, 가압 열수 처리 및/또는 가압 수증기 처리를 실시한 뼈가 예시된다. 이와 같은 가열 처리를 실시한 뼈로서는 뼈로부터 엑스를 추출한 잔사(이하, '뼈의 엑스 추출 잔사' 라고 기재하는 경우가 있다)가 예시된다. 예를 들면 생뼈로부터 수증기로 엑스를 추출한 잔사(이하, '뼈의 수증기 추출 잔사' 라고 기재하는 경우가 있다)나, 생뼈로부터 열수로 엑스를 추출한 후의 잔사(이하, '뼈의 열수 추출 잔사' 라고 기재하는 경우가 있다)를 들 수 있다. 또, 본원 명세서에 있어서는 뼈의 엑스 추출 잔사를 삶은 뼈라고 기재하는 경우가 있다. 본 발명의 원료로서 가열 처리된 뼈를 사용하는 경우, 가열 처리, 예를 들면 습식 가열 처리의 온도로서는 특별하게 한정되지 않지만, 80 ℃ 내지 150 ℃, 바람직하게는 85 ℃ 내지 140 ℃, 더 바람직하게는 110 ℃ 내지 130 ℃가 예시된다. 또, 가열 처리, 예를 들면 습식 가열 처리 시간으로서는 특별하게 한정되지 않지만, 15 분 내지 24시간, 바람직하게는 30분 내지 10시간, 더 바람직하게는 1 내지 8시간의 조건으로 가열 처리된 뼈를 사용할 수 있다. 또, 원료로서 사용되는 뼈는, 추출 효율을 높이는 관점에서 생뼈 또는 가열 처리된 뼈, 예를 들면 삶은 뼈를 파쇄 또는 분쇄한 것이 바람직하다.

본 발명의 가열 처리된 뼈로부터의 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법에 있어서는 추출 용매에 특별하게 한정은 없지만, 수성 용매가 추출 용매로서 적합하게 사용된다. 예를 들면 각종 알칼리성 수용액, 물, 염산 수용액, 아세트산 수용액, 인산 수용액, 락트산 수용액, 시트르산 수용액, 포름산 수용액, 아스코르브산 수용액이 예시된다. 더 바람직하게는 알칼리성 수용액이 사용된다. 또한 가열 처리가 되어 있지 않은 뼈로부터의 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법에 있어서는 후기하는 바와 같이 알칼리성 수용액의 사용이 바람직하다. 또 산성 용매, 알칼리성 용매 원료로서는 식품첨가물의 사용이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 알칼리성 수용액으로서는 탄산염 및/또는 중탄산염의 수용액, 붕산 칼륨, 붕산나트륨 등의 붕산염의 수용액, 글리신-수산화나트륨 완충액, 및 아세트산에탄올아민 완충액이 예시된다.

본 발명에 사용되는 탄산염으로서는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산마그네슘, 탄산암모늄, 탄산칼슘 및 탄산바륨이 예시되고, 중탄산염으로서는 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨 및 탄산수소칼슘이 예시된다.

본 발명에 있어서 사용되는 바람직한 알칼리성 수용액의 pH는, pH 7 초과 내지 14이고, 더 바람직하게는 pH 8 내지 13이고, 더욱 바람직하게는 pH 9 내지 pH 11이다. 또 알칼리성 수용액 중의 염농도는 0.001M 이상이 바람직하고, 더 바람직하게는 0.1 내지 3M, 더욱 바람직하게는 0.2 내지 1M이다. 본 발명의 알칼리성 수용액을 소망의 pH로 조정하는 방법은 특별하게 한정되지 않지만, 예를 들면 탄산염과 중탄산염을 임의의 비율로 배합하는 것에 의해 적당하게 조정할 수 있다.

또, 본 발명의 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법의 다른 형태로서, 가열 처리가 되어 있지 않은 뼈를 원료로 하고, 알칼리성 수용액을 추출 용매로 사용하는 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법이 제공된다. 본 발명자들은 알칼리성 수용액을 추출 용매로서 사용하는 것에 의해, EDTA를 사용하지 않고, 가열 처리가 되어 있지 않은 뼈로부터 효율적으로 활성형 오스테오칼신을 추출할 수 있음을 발견하였다. 여기에서 사용할 수 있는 알칼리성 수용액으로서는 상술한 것을 사용할 수 있다. 또, 원료로서 사용되는 뼈는 육식 가공시에 생산되는 여러 가지의 생뼈를 사용할 수 있다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 뼈로부터 활성형 오스테오칼신을 추출할 때의 추출 시간은 특별하게 한정은 없지만, 바람직하게는 1시간 이상, 더 바람직하게는 6 내지 48시간, 더욱 바람직하게는 12 내지 24시간이다. 또, 추출 온도는 특별하게 한정은 없지만, 바람직하게는 0 내지 130 ℃의 범위, 더 바람직하게는 80 ℃ 이하, 더욱 바람직하게는 40 ℃ 이하이다.

본 발명의 제조방법의 추출 용매에 알칼리성 수용액을 사용하는 경우에는, 상기 제조방법에 의해 수득된 추출물 중의 알칼리 성분을 산으로 중화하는 공정을 추가로 포함하는 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법도 본 발명의 추출물의 제조방법에 포함된다. 추출물을 음식품에 사용하는 경우에는 중화에 사용하는 산으로서는 식품가공에 인정되는 것이라면 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 염산, 황산, 질산 등의 무기산, 아디프산, 시트르산, 글루콘산, 숙신산, 포름산, 아세트산, 타르타르산, 락트산, 말릭산, 아스코르브산 등의 유기산, 또 양이온 교환수지, 양이온 교환섬유, 양이온 교환막 등의 고체산이 사용 가능하다. 그 가운데서 시트르산이 가장 바람직하다.

또, 본 발명의 제조방법의 추출 용매로 산성 수용액을 사용하는 경우에는, 상기 제조방법에 의해 수득된 추출물 중의 산 성분을 알칼리 성분에 의해 중화하는 공정을 추가로 포함하는 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법도 본 발명의 추출물의 제조방법에 포함된다. 추출물을 음식품에 사용하는 경우에는 중화에 사용되는 알칼리 성분으로서는 식품 가공에 인정되는 것이라면 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 무기 염기(예를 들면 알칼리 토금속의 수산화물; 탄산나트륨, 탄산칼륨 등의 알칼리금속의 탄산염; 탄산마그네슘, 탄산바륨 등의 알칼리 토금속의 탄산염; 탄산수소나트륨, 탄산수소칼륨 등의 알칼리금속의 탄산수소염; 탄산암모늄; 암모니아 등)을 포함하는 알칼리성 수용액, 유기 염기(예를 들면 아세트산나트륨, 프로피온산 칼륨 등의 알칼리금속의 유기산염; 포름산마그네슘, 아세트산마그네슘 등의 알칼리 토금속의 유기산염; 아민류; 질소 함유 헤테로사이클 화합물 등)을 포함하는 알칼리성 수용액, 및 음이온 교환수지를 포함하는 알칼리성의 현탁액을 사용할 수 있고, 그 가운데서 탄산나트륨 수용액, 또는 음이온 교환수지 현탁액을 바람직하게 사용할 수 있다.

또, 상기 제조방법에 의해 수득된 추출물을 추가로 탈염하는 공정을 포함하는 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법도 본 발명의 추출물의 제조방법에 포함된다. 탈염 공정에서는 추출물로부터 완전하게 염을 제거할 필요는 없고, 본 발명의 추출물을 음식품 등에 사용하는데 적합한 농도까지 염을 제거할 수 있다. 본 발명에 사용할 수 있는 탈염 방법으로는 특별하게 한정은 없지만, 한외여과, 전기투석, 겔여과, 이온교환 수지를 사용할 수 있다.

본 발명의 추출물의 제조방법에 의해, 활성형 오스테오칼신을 효율적으로 추출할 수 있다. 또, 본 발명의 제조방법에 있어서의 활성형 오스테오칼신의 추출 효율에 대해서는 원료로서 사용되는 뼈의 형태나 뼈 중의 활성형 오스테오칼신 함량에 의해 변동하기 때문에, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 돼지의 삶은 뼈 1 g(습중량) 당, 80 ㎍ 이상의 활성형 오스테오칼신을 얻을 수도 있다. 또, 뼈에 견고하게 결합한 활성형 오스테오칼신은 이것을 섭취하였다고 하여도 체내에로의 흡수는 기대할 수 없지만, 본 발명의 제조방법에 의해 수득되는 추출물 중의 활성형 오스테오칼신은 물에 가용이고, 더군다나 용액 중의 미네랄과의 결합이 가능하기 때문에 섭취에 의해 칼슘을 비롯한 미네랄의 흡수촉진을 기대할 수 있다.

본 발명에 있어서 추출물이란 추출 용매를 사용해서 추출 조작을 실시하는 공정에 의해 수득되는 물질을 말한다. 또, 그 물질에 추가로 여과, 원심분리, 농축, 정밀여과, 한외여과, 분자체 및/또는 중화 등의 처리를 실시해서 수득되는 물질도 본 발명의 추출물에 포함된다. 또 상기 물질을 공지 방법으로 분획하는 것에 의해서 수득되는 분획이나, 분획 조작을 수회 반복하는 것에 의해서 수득되는 분획도, 본 발명의 추출물에 포함된다. 상기의 분획 수단으로서는 추출, 분별침전, 칼럼크로마토그래피 등을 들 수 있다. 더구나, 상기 물질에 효소 처리를 실시한 것도 본 발명의 추출물에 포함된다. 해당 효소 처리에 사용하는 효소로서는 펩신, 판크레아틴, 트립신, 파파인, 아미노펩티다아제, 카르복시펩티다아제 등의 프로테아제나 펩티다아제가 예시된다.

본 발명의 추출물은 활성형 오스테오칼신을 풍부히 포함하는 것을 특징으로 하고, 본 발명에 의해, 예를 들면 건고물 환산으로 0.01 중량% 이상의 활성형 오스테오칼신을 포함하는 추출물, 더 구체적으로는 건고물 환산으로 0.03 내지 3.0 중량%의 활성형 오스테오칼신을 포함하는 추출물의 제공이 가능하게 된다. 또, 이 추출물에 의해 활성형 오스테오칼신 고농도 함유물의 조제가 가능하게 된다. 또, 본 발명의 추출물 중에는 불활성형의 오스테오칼신이 포함될 수도 있다. 또, 콜라겐이나 그 밖의 뼈 유래 단백질이 포함될 수도 있다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 추출물의 형상은 특별하게 한정은 없지만, 분말 상태, 고형상, 액상의 임의 형상일 수 있다. 분말 상태로 하는 경우, 분무 건조법이나 동결 건조법 등 공지의 방법을 사용하면 되고, 특별하게 한정은 없지만, 예를 들면 추출 용매로 원료로부터 활성형 오스테오칼신을 추출하는 것에 의해 수득된 추출물을 농축하고, 추가로 덱스트린, 자당 지방산 에스테르, 락토오스 등의 부형제를 첨가하고, 건조, 분쇄하는 것에 의해 분말 상태의 추출물을 얻을 수 있다. 또한 해당 추출물을 공지의 방법으로 과립해서 얻은 입상의 고형물을 본 발명의 추출물로서 사용할 수도 있다. 과립방법으로서는 특별하게 한정은 없지만, 회전 과립, 교반 과립, 유동층 과립, 기류 과립, 압출 과립, 압축성형 과립, 분해 과립, 분사 과립 또는 분무 과립 등이 예시된다. 또한 액상의 추출물로서는 상기 추출물의 제조방법에 의해 수득된 액체 바로 그 자체, 그 농축물이나 희석물 이외에, 상기의 분말상태의 추출물을 액체, 예를 들면 물이나 알코올 등에 용해해서 액상으로 한 것이 예시된다.

본 발명의 음식품은 상기의 추출물을 함유한다. 본 발명의 음식품은 활성형 오스테오칼신을 풍부히 포함하기 때문에, 치아나 뼈의 증강 효과나 칼슘 등의 미네랄 흡수 촉진에 유용하다. 해당 음식품에는 칼슘 등의 미네랄을 배합할 수도 있다. 해당 음식품으로서는 상기의 효능을 기대하는 기능성 음식품이 예시된다. 예를 들면 치아나 뼈의 증강 작용이나, 칼슘 등의 미네랄 흡수 촉진에 의한 소망하는 효과의 발현을 위해서 사용된다는 취지의 표시를 부착한 건강식품(특정 보건용 식품)으로 할 수도 있다. 또 해당 음식품은 후술하는 본 발명의 의약에 감수성을 나타내는 각종 질병에 대한 치료 및 예방효과를 얻을 수 있다. 또한 상기의 추출물에 콜라겐이나 그 밖의 뼈 유래 단백질을 많이 포함하는 경우, 피부에로의 미용효과가 우수한 음식품이 된다. 또, 해당 기능성 음식품은 치아나 뼈의 증강 효과나 칼슘 등의 미네랄 흡수촉진 작용 등에 관한 기타 성분을 배합할 수도 있다. 이러한 성분으로서는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 소장 상부에서의 칼슘의 능동수송에 의한 흡수에 관여하는 비타민D가 예시된다.

본 발명의 음식품의 제조법에 특별하게 한정은 없다. 예를 들면 본 발명의 추출물의 배합, 조리, 가공 등은 일반 음식품의 것에 따르면 된다. 그들의 제조법에 의해 제조할 수 있고, 수득된 음식품에 본 발명에 따른 상기 추출물이 함유될 수도 있다. 또한 본 발명의 추출물 바로 그 자체를 음식품으로 한 것일 수도 있다.

또, 본 발명의 음식품에 있어서 단순하게 「함유」라고 할 때는, 본 발명의 추출물의 함유, 첨가 및/또는 희석을 의미한다. 여기에서, 「함유」란 음식품 중에 본 발명의 추출물이 포함된 형태를 말하고, 「첨가」란 음식품의 원료에 본 발명의 추출물을 첨가한 형태를 말하며, 「희석」이란 본 발명의 추출물에 음식품의 원료를 첨가한 형태를 말하는 것이다.

본 발명의 음식품은 상기 추출물이 함유되는 것이라면 특별히 그 형상에 한정은 없고, 태블릿상, 과립상, 캡슐상 등의 경구적으로 섭취 가능한 형상의 음식품도 포함한다. 또 상기 추출물에 글리세린 등을 첨가해서 건강식품으로 할 수도 있다. 또 본원 명세서에 있어서 음식품이란 음료도 포함하는 것으로, 본 발명의 추출물을 그대로, 혹은 물이나 공지의 음료에 함유시켜서, 본 발명의 음료라고 할 수도 있다. 또, 본 발명의 음식품으로서는 칼슘을 고함유하는 점에서 우유나 요구르트 등의 유제품이 예시된다.

음식품 중의 본 발명의 추출물의 함유량은 특별하게 한정은 없고, 예를 들면 음식품 중에 있어서의 본 발명의 추출물의 건조 중량으로, 0.01 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 80 중량%, 더 바람직하게는 0.5 내지 50 중량%이다.

또, 본 발명의 추출물은 활성형 오스테오칼신을 고함유하는 점에서, 본 발명의 다른 형태로서, 본 발명의 추출물을 함유하는 γ-카르복시글루탐산(Gla) 보급제도 제공된다. 당해 제제는 γ-카르복시글루탐산을 체내로 보급하기 위해서 사용되는 제제로서, 그 바람직한 형태는 음식품이다.

본 발명의 의약은 상기의 추출물을 함유한다. 본 발명의 의약은 활성형 오스테오칼신을 포함하기 때문에, 치아나 뼈의 증강 효과(예를 들면 골밀도나 뼈 강도의 증강 효과)나 칼슘 등의 미네랄 흡수촉진에 유용하다. 또 체중 증가 등의 육성 증강 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 의약에 감수성을 나타내는 질병으로서는 골다공증(예를 들면, 만성골다공증, 폐경 후의 호르몬 밸런스 이상으로 발생하는 골다공증, 당뇨병이나 스테로이드제 등의 부작용에 따른 속발성 골다공증 등), 골절, 재골절, 뼈결손, 뼈형성 부전증, 뼈연화증, 뼈 파제트병, 경직성 척수염, 만성관절류머티즘, 변형성 관절염, 변형성 관절증, 성장 장애, 치주병, 치주 질환에 있어서의 치주조직 결손, 치근ㆍ치조결손이 예시된다.

또, 해당 의약은 치아나 뼈의 증강 효과나 칼슘 등의 미네랄 흡수촉진 작용 등에 관한 기타 성분을 배합할 수도 있다.

본 발명의 의약은 통상, 상기 추출물을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합하는 것에 의해 제조되고, 필요에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제 등을 첨가하고, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상 액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 할 수 있다. 또, 사용 전에 적당한 담체의 첨가에 의해 액상으로 수 있는 건조품이나, 기타, 외용제로 할 수 있다.

의약용 담체는 본 발명의 의약의 투여 형태 및 제형에 따라 선택할 수 있다. 고체 조성물로 이루어지는 경구제로 하는 경우에는, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 세립제, 과립제 등으로 할 수 있다. 예를 들면 전분, 락토오스, 백당, 만니톨, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염 등이 담체로서 사용된다. 또 경구제의 조제에 즈음에서 추가로 결합제, 붕해제, 계면활성제, 윤택제, 유동성 촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다. 예를 들면, 정제 또는 환제로 하는 경우에는, 필요에 따라서 자당, 젤라틴, 하이드록시프로필셀룰로오스 등의 당의 또는 위용성 혹은 장용성 물질의 필름으로 피복할 수 있다. 액체 조성물로 이루어지는 경구제로 하는 경우에는, 약리학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제 등으로 할 수 있고, 예를 들면 정제수, 에탄올 등이 담체로서 사용된다. 또, 추가로 필요에 따라서 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방부제 등을 첨가할 수 있다. 또, 본 발명의 추출물은 경구투여에 의해도 충분한 효과를 발휘하기 때문에, 그 투여의 간편성의 관점으로부터 경구 투여용 의약으로 하는 것이 바람직한 형태이다.

한편, 비경구제로 하는 경우에는 통상의 방법에 따라서 본 발명의 상기 추출물을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수 오일, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등에 용해 또는 현탁시키고, 필요에 따라서, 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 첨가하는 것에 의해 조제할 수 있다. 또한 고체 조성물을 제조하고, 사용 전에 무균수 또는 무균의 주사용 용매에 용해해서 사용할 수도 있다.

외용제로서는 경피 투여용 또는 경점막(구강 내, 비강 내) 투여용의 고체, 반고체상 또는 액상의 제제가 포함된다. 또한 좌제 등도 포함된다. 예를 들면, 유제, 로션제 등의 유탁제, 외용 팅크제, 경점막 투여용 액제 등의 액상 제제, 유성연고, 친수성 연고 등의 연고제, 필름제, 테이프제, 패취제 등의 경피 투여용 또는 경점막 투여용의 첩부제 등으로 할 수 있다.

이상의 각종 제제는 각각 공지의 의약용 담체 등을 사용하여, 통상의 방법에 의해 적당히 제조할 수 있다. 또 이러한 제제에 있어서의 추출물의 함유량은 그 투여 형태, 투여 방법 등을 고려하고, 바람직하게는 후기하는 투여량 범위로 당해 추출물을 투여할 수 있는 것과 같은 양이라면 특별히 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 제제 중의 추출물의 함유량으로서는 건조 중량으로 0.1 내지 100 중량% 정도이다.

본 발명의 의약의 투여량은 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 해당 의약의 투여 대상인 환자의 연령, 체중, 증상에 따라서 적당하게 설정되기 때문에 일정하지 않다. 일반적으로는, 제제 중에 함유되는 상기 추출물량을 건조 중량으로 나타냈을 경우의 투여량으로, 예를 들면 성인 1일당, 0.1 ㎍ 내지 10 g/kg(체중), 바람직하게는 1 ㎍ 내지 1 g/kg(체중), 더욱 바람직하게는 10 ㎍ 내지 0.1 g/kg(체중)이다. 물론, 투여량은 여러 조건에 의해 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분할 경우도 있고, 혹은 범위를 넘어서 필요한 경우도 있다. 투여는 소망한 투여량의 범위내에 있어서, 1일 1회 또는 수차례로 나누어서 수행할 수도 있다. 투여기간도 임의이다. 또, 본 발명의 의약은 그대로 경구 투여하는 것 이외에, 임의의 음식품에 첨가해서 일상적으로 섭취시킬 수도 있다.

본 발명의 구강용 조성물은 상기의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 구강 조성물은 활성형 오스테오칼신을 포함하기 때문에, 치아의 석회화 촉진을 기대할 수 있다. 본 발명의 구강 조성물은 액상, 페이스트상, 연고 또는 분체로 할 수 있고, 플로스 등의 섬유 담체에 피복, 혹은 배합할 수 있고, 치약, 액체 치약, 검, 구강 세척제, 구강 스프레이, 칫솔, 치실, 또는 치간 청소기구 등의 형태일 수도 있다. 본 발명에 있어서의 구강 조성물 중의 본 발명의 추출물의 함유량은 특별하게 한정은 없다. 예를 들면 구강 조성물 중에 있어서의 본 발명의 추출물의 건조 중량으로 0.1 내지 100 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 80 중량%, 더 바람직하게는 1 내지 50 중량%이다.

본 발명의 사료는 상기의 추출물을 함유하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 사료는 활성형 오스테오칼신을 포함하기 때문에, 본 발명의 사료를 가축, 실험동물, 가금, 어류, 애완동물 등에 급식하는 것에 의해, 이들 생물의 성장을 촉진시키거나, 뼈를 강화시키거나 할 수 있다. 또한, 본 발명의 사료에 의하면, 본 발명에 사용되는 오스테오칼신의 생리작용에 의거하여, 상기의 본 발명의 의약과 동일한 효과의 발현을 기대할 수 있다.

본 발명의 사료가 제공되는 생물로서는 특별하게 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 말, 소, 돼지, 양, 염소, 낙타, 야마 등의 가축, 마우스, 랫트, 모르모트, 토끼 등의 실험동물, 닭, 집오리, 칠면조, 타조 등의 가금, 참돔, 돌돔, 넙치, 가자미, 방어, (양식) 방어, 부시리, 다랑어, 발구지, 은어, 연어ㆍ송어류, 자지복, 뱀장어, 미꾸라지, 메기 등의 어류, 참새우, 블랙타이거, 대하, 가자미 등의 갑각류 등, 전복, 소라, 가리비, 굴 등의 조개류, 개, 고양이 등의 애완동물을 들 수 있다.

본 발명에 사용되는 사료는 상기 추출물량을 건조 중량으로 나타냈을 경우의 급식량으로, 통상, 대상 생물 1일당, 0.0001 ㎎ 내지 2000 ㎎/kg(체중), 바람직하게는 0.001 ㎎ 내지 1000 ㎎/kg(체중), 더 바람직하게는 0.01 ㎎ 내지 100 ㎎/kg(체중) 급식된다. 물론 급식량은 여러 조건에 의해서도 변동되기 때문에, 상기 급식량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 혹은 범위를 넘어서 필요한 경우도 있다. 급식은 예를 들면 본 발명의 추출물을 대상 생물에 제공하는 인공 배합사료의 원료 중에 첨가, 혼합해 두거나, 인공 배합사료의 분말원료와 혼합한 후, 다른 원료에 추가로 첨가, 혼합하는 것으로 실시할 수 있다.

상기의 인공 배합사료의 원료로서는 어분, 카세인, 육분, 오징어 밀 등의 동물성 원료, 대두상, 소맥분, 전분, 콘 글루텐 밀, 사료용 효모 등의 식물성 원료, 대구 간유, 오징어 간유 등의 동물성 유지, 대두유, 채종유 등의 식물성 유지, 비타민류, 미네랄류, 아미노산, 항산화제 등이 예시된다. 상기 사료 원료를 혼합해서 제조된 인공 배합사료에 본 발명의 유효성분을 배합해서 본 발명의 사료로 할 수도 있다.

본 발명의 추출물의 사료 중의 함유량은 특별히 한정되는 것은 아니다. 사료 100 중량% 중, 0.0001 중량% 이상, 바람직하게는 0.001 내지 100 중량%, 더 바람직하게는 0.01 내지 100 중량% 이다. 즉, 본 발명의 유효성분을 단독으로 사료로 할 수도 있다.

또, 어류용의 인공 배합사료로 하는 경우에는, 어류에로의 병원미생물 감염을 방지하는 관점에서, 본 발명의 추출물에 첨가해서 항바이러스 작용을 가지는 조성물을 인공 사료에 배합할 수도 있다. 항바이러스 작용을 가지는 조성물로서는 사이클로펜테논 유도체를 포함하는 조성물, 예를 들면 DHCP(4,5-디하이드록시-2-사이클로펜텐-1 온)을 풍부하게 포함하는 다시마 처리물이 예시된다.

또, 본 발명의 사료는 음료로서 대상 생물에 급식할 수 있다. 음료로서 급식하는 경우의 본 발명의 유효성분의 농도는 특별하게 한정은 없고, 목적에 따라서 사용할 수 있지만, 0.0001 내지 1 w/w%의 비율이 적당하다.

본 발명의 육성 증강제는 뼈로부터 채취된 활성형 오스테오칼신을 유효성분으로 하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 육성 증강제는 동물, 예를 들면 인간, 가축, 양식 어류 등의 육성을 촉진하는 작용을 갖는다. 본 발명의 육성 증강제의 작용에 의해, 예를 들면 동물의 체장이나 체중을 증가시키는 효과를 기대할 수 있다. 육성 증강제는 상기의 유효성분을 함유시키는 것 이외는 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다. 해당 증강제를 함유하는 식품도 본 발명의 형태이다. 해당 식품은 「육성 증강작용을 가지는 식품」, 「육성 증강용 식품」으로서, 예를 들면 육성 증강작용을 가지는 것이나 육성 증강용인 것 등을 표시해서 사용할 수 있다.

본 발명에 의해 수득되는 활성형 오스테오칼신은 랫트에로의 경구 투여에 있어서 2000 ㎎/kg을 1회 투여하여도 사망예는 확인되지 않았다.

본 발명에 의해, 활성형 오스테오칼신의 효율이 좋은 추출 방법이 제공되고, 해당 추출물을 유효성분으로 하는 안정성이 높은 의약 및 음식품용 첨가물이 제공된다.

본 발명의 추출물은 활성형 오스테오칼신 뿐만 아니라 원료의 뼈 유래 콜라겐을 주성분으로 하는 단백질군을 풍부하게 포함하고 있고, 뼈의 건강을 비롯해서, 미용에 도움이 되는 건강식품으로서, 기능성 식품 소재로서도 대량 생산이 가능하여 시장에로의 공급이 가능하다.

예를 들면, 돼지의 살 부분을 취한 후의 돼지뼈 부분으로부터 엑스가 추출되어, 라면의 스프 등으로서 상품화 되어 있다. 일본의 축산현의 대표인 가고시마현에서는 년간 7만톤 정도의 돼지뼈가 생산되고, 엑스가 추출된 잔사, 즉 삶은 뼈도 대량으로 생산되고 있다. 활성형 오스테오칼신은 뼈에 견고하게 결합하고 있기 때문에, 지금까지 기능성 식품 소재로서 사용되는 경우가 없었지만, 본 발명자들은 뼈 형성에 필수적인 단백질, 활성형 오스테오칼신의 추출을 여러 가지로 검토하고, 본 발명자들이 보유하는 식품가공 기술을 사용하는 것에 의해, 예를 들면 30 kg의 돼지 삶은 뼈 분쇄물로부터 2.1 g의 활성형 오스테오칼신을 함유하는 700 g의 추출물을 제조하는 것이 가능하게 되었다.

본 발명에 의해 안정성이 높은 활성형 오스테오칼신 고함유 추출물의 제공이 비로서 가능하게 되었다. 오스테오칼신은 조골세포에 의해 생산되는 단백질로서, 활성형만이 칼슘을 뼈에 축적하는 기능이 있다. 본 발명의 추출물에는 이 활성형 오스테오칼신이 포함되기 때문에, 뼈 분해와 뼈 형성의 밸런스를 뼈 형성을 향하게 하는데 유용하다. 또 본 발명의 형태로서 이상한 맛, 이상한 냄새를 가지지 않고, 지방 성분도 제거된 수용성의 추출물이 제공되어, 해당 활성형 오스테오칼신 고함유 추출물은 여러 가지 제품 형태에로의 적용이 가능하다.

이하, 본 발명에 대해서 실시예를 들어 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 조금도 한정되지 않는다.

실시예 1

돼지뼈로부터 활성형 오스테오칼신의 추출에 있어서 용매의 검토(1)

이하에 기재하는 방법으로 각 추출 용매의 조제를 실시하였다. 0.2M 탄산완충액(pH 9.5): 탄산나트륨(나카라이테스크사 제품) 0.275 g, 탄산수소나트륨(나카라이테스크사 제품) 0.62 g을 증류수에 용해하여 50 ㎖로 하였다. 염산(나카라이테스크사 제품) 4.3 ㎖에 1M 염산: 증류수 45.7 ㎖를 첨가하고 혼합하였다. 1M 인산완충액(pH 6.7): 인산수소이나트륨(나카라이테스크사 제품) 7.1 g을 증류수에 용해하여 50 ㎖로 한 것과, 인산이수소일칼륨(나카라이테스크사 제품) 6.8 g을 증류수에 용해하여 50 ㎖로 한 것을 혼합하고, pH 6.7로 조정하였다. 다음에 생돼지뼈로부터 엑스를 가압 열수 추출한 잔사(삶은 뼈)를 믹서로 분쇄한 것 3 g(습중량)에 대해서, 각 용액 10 ㎖을 첨가하고, 교반하면서 4 ℃에서 24시간 추출을 실시하였다. 추출액과 잔사를 분리한 후, 추출액을 중화하고, 투석(SPECTRUM사 제품, 분획 분자량 3500)에 의해 탈염을 실시하였다. 다음에 투석 내 액중의 활성형 오스테오칼신의 양을 ELISA법(다카라 바이오사 제품)에 의해 측정하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다. 표 1에 나타나 있는 바와 같이, 탄산완충액에서 특히 활성형 오스테오칼신의 추출 효율이 높은 것으로 나타나 있다.

추출 용매	원료 1 g으로부터 추출된 활성형 오스테오칼신의 양(㎍)
0.2M 탄산완충액(pH 9.5)	292.2
1M 염산	76.8
1M 인산완충액(pH 6.7)	57.3

실시예 2

돼지뼈로부터 활성형 오스테오칼신의 추출에 있어서 원료의 검토

생돼지뼈를 열수(90 ℃)로 30분간 가열 후, 가열 추출액 1을 얻고, 추가로 꺼낸 돼지뼈는 조분쇄를 실시하였다. 또, 조분쇄된 돼지뼈를 재차 열수(90 ℃)로 30분간 가열하고, 가열 추출액 2와 열수 처리 돼지뼈를 얻었다. 계속해서, 생돼지뼈를 가압하 열수(120 ℃)로 5시간 가열하고, 가열 추출액 3과 가압 열수 처리 돼지뼈를 얻었다. 다음에 원료의 뼈로서 열수 처리 돼지뼈 20 g(습중량), 또는 가압 열수 처리 돼지뼈를 믹서로 분쇄한 것 20 g(습중량)을 사용하는 점, 및 추출 용매로서 0.5M 탄산완충액(pH 9.5) 60 ㎖을 사용하는 점 이외는 실시예 1과 동일한 방법으로 추출물을 제조하고, 그 추출물 중의 활성형 오스테오칼신의 양을 측정하였다. 그 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2에 나타나 있는 바와 같이, 열수 처리 돼지뼈 및 가압 열수 처리 돼지뼈로부터 탄산완충액 중에 활성형 오스테오칼신이 추출된 것으로 나타나 있다. 또 가열 추출액 1 내지 3으로부터는 활성형 오스테오칼신이 거의 검출되지 않았다.

원료	원료 1g으로부터 추출된 활성형 오스테오칼신의 양(㎍)
열수 처리 돼지뼈	33.9
가압 열수 처리 돼지뼈	90.9

실시예 3

돼지뼈로부터 활성형 오스테오칼신의 추출에 있어서 추출 용매의 염 농도 검토

이하에 나타내는 방법으로, 여러 농도의 탄산완충액을 제조하였다. 1M 탄산완충액(pH 9.5): 탄산나트륨 1.375 g, 탄산수소나트륨 3.1 g을 증류수에 용해해서 50 ㎖로 하였다. 이것을 증류수로 희석해서 0.05 내지 0.5M의 탄산완충액(pH 9.5)을 제조하였다. 다음에 실시예 1과 동일한 방법으로, 탄산완충액(pH 9.5)의 농도와 활성형 오스테오칼신의 추출 효율의 관계를 검토하였다. 그 결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에 나타내는 바와 같이, 어느 쪽의 농도에 있어서도 활성형 오스테오칼신을 추출할 수 있었지만, 0.1 내지 1M의 탄산완충액(pH 9.5)에서 특히 활성형 오스테오칼신의 추출 효율이 높은 것으로 나타나 있다.

농도(M)	원료 1g으로부터 추출된 활성형 오스테오칼신의 양(㎍)
0.05	58.0
0.1	147.2
0.2	205.2
0.5	410.2
1.0	395.3

실시예 4

돼지뼈로부터 활성형 오스테오칼신의 추출에 있어서 추출 온도의 검토

추출 용매에 0.2M 탄산완충액(pH 9.5)을 사용하고, 추출 온도가 4 ℃와 30 ℃인 점 이외는 실시예 1과 동일한 방법으로, 0.2M 탄산완충액(pH 9.5)을 사용한 활성형 오스테오칼신의 추출에 있어서의 추출 온도를 검토하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다. 표 4에 나타내는 바와 같이, 30 ℃에서의 추출 쪽이 활성형 오스테오칼신의 추출 효율이 더 높은 것으로 나타나 있다.

온도( ℃)	원료 1g으로부터 추출된 활성형 오스테오칼신의 양(㎍)
4	205.2
30	351.7

실시예 5

돼지뼈로부터 활성형 오스테오칼신의 추출에 있어서 추출 용매의 pH 검토

이하에 나타내는 방법으로, 탄산염 수용액, 및 중탄산염 수용액을 조제하였다. 0.5M 중탄산염 수용액(pH 8.0): 탄산수소나트륨 2.1 g을 증류수에 용해하여 50 ㎖로 하였다. 0.5M 탄산염수용액(pH 12.0): 탄산나트륨 2.65 g을 증류수에 용해하여 50 ㎖로 하였다. 다음에, 실시예 1과 동일한 방법으로 0.5M 탄산염 수용액, 0.5M 중탄산염 수용액을 사용한 활성형 오스테오칼신의 추출에 있어서의 추출 용매의 pH를 검토하였다. 그 결과를 표 5에 나타낸다. 표 5에 나타내는 바와 같이, pH 8 내지 12의 범위의 탄산염 및/또는 중탄산염의 수용액에서 활성형 오스테오칼신을 효율 좋게 추출할 수 있는 것으로 나타나 있다.

pH	원료 1g으로부터 추출된 활성형 오스테오칼신의 양(㎍)
8.0	164.0
12.0	228.5

실시예 6

돼지뼈로부터 활성형 오스테오칼신의 추출에 있어서 용매의 검토(2)

증류수, 0.5M 아세트산, 26.2% 락트산, 0.25M 및 0.5M 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 9.5), 0.5M 중탄산나트륨 수용액(pH 8.0), 0.5M 탄산완충액(pH 9.5), 또는 0.5M 탄산나트륨 수용액(pH 12.0)을 추출 용매로서 사용하는 점 이외는 실시예 2와 동일한 방법으로 가압 열수 처리 돼지뼈를 믹서로 분쇄한 것으로부터 추출물을 제조하고, 여러 추출 용매를 사용했을 경우의 활성형 오스테오칼신의 추출 효율에 대해서 평가하였다. 그 결과를 표 6에 나타낸다. 표 6에 나타내는 바와 같이, 증류수나 0.5M 아세트산, 26.2% 락트산에 비해서, 0.25M 및 0.5M 글리신-수산화 나트륨 완충액(pH 9.5), 0.5M중탄산나트륨 수용액(pH 8.0), 0.5M 탄산완충액(pH 9.5), 0.5M 탄산나트륨 수용액(pH 12.0)이 활성형 오스테오칼신의 추출 효율이 높은 것으로 나타나 있다.

추출 용매	원료 1g으로부터 추출된 활성형 오스테오칼신의 양(㎍)
증류수	9.1
0.5M 아세트산	6.3
26.2% 락트산	23.7
0.25M 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 9.5)	90.9
0.5M 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 9.5)	83.3
0.5M 중탄산나트륨 수용액(pH 8.0)	48.2
0.5M 탄산 완충액(pH 9.5)	92.7
0.5M 탄산나트륨 수용액(pH 12.0)	67.3

실시예 7

돼지뼈로부터 활성형 오스테오칼신의 추출에 있어서 용매의 검토(3)

1M 염산, 0.5M 글리신-수산화 나트륨 완충액(pH 9.5 및 pH 10.5), 0.5M 탄산완충액(pH 9.5), 0.5M 붕산칼륨 완충액(pH 9.1), 0.5M 붕산나트륨 완충액(pH 9.1), 또는 0.5M 아세트산에탄올아민 완충액(pH 9.6)을 추출 용매로서 사용하는 점 이외에는 실시예 6과 동일한 방법으로, 활성형 오스테오칼신의 추출 효율에 대해서 평가하였다. 그 결과를 표 7에 나타낸다. 표 7에 나타내는 바와 같이, 1M 염산에 비해서, 0.5M 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 9.5 및 pH 105), 0.5M 탄산 완충액(pH 9.5), 0.5M 붕산칼륨 완충액(pH 9.1), 0.5M 붕산나트륨 완충액(pH 9.1), 0.5M 아세트산에탄올아민 완충액(pH 9.6)이 활성형 오스테오칼신의 추출 효율이 높은 것으로 나타나 있다.

추출 용매	원료 1g으로부터 추출된 활성형 오스테오칼신의 양(㎍)
1M 염산	15.7
0.5M 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 9.5)	77.9
0.5M 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 10.5)	104.2
0.5M 탄산 완충액(pH 9.5)	149.8
0.5M 붕산칼륨 완충액(pH 9.1)	127.1
0.5M 붕산나트륨 완충액(pH 9.1)	84.0
0.5M 아세트산에탄올아민 완충액(pH 9.6)	109.8

실시예 8

생돼지뼈로부터 엑스를 가압 열수 추출한 잔사(삶은 뼈)를 믹서로 분쇄한 것30 kg(습중량)에 대해서, 0.5M 탄산완충액(pH 9.5) 150 ℓ를 첨가하고, 교반하면서 실온에서 22시간 추출을 실시하였다. 추출액과 잔사를 분리한 후, 세라믹막 여과, 규조토 여과, 무균 여과, 한외 여과, 무균 여과를 차례로 실시하고, 무균 여과액 36ℓ을 얻었다. 다음에 이 여과액을 동결건조하고 활성형 오스테오칼신을 1.7 g 함유하는 동결 건조물 410 g을 제조하였다.

실시예 9

녹차잎 10 g, 비타민C 0.2 g 및 이온 교환수 1000 ㎖을 사용하여, 통상의 방법에 따라서 녹차를 제조하였다. 본 발명품 1은 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을 제품 100 ㎖당 활성형 오스테오칼신의 양이 30 ㎎이 되도록 첨가하였다. 대조는 무첨가의 것으로 하였다. 본 발명품 1은 대조와 동일한 풍미를 나타내고, 동물 냄새 등은 느껴지지 않았다.

실시예 10

보통 우유의 균질 우유(수분 88.6 w/v%, 단백질 2.8 w/v%, 지방 3.5 w/v%, 락토오스 4.5 w/v%, 회분 0.8 w/v%)을 사용하고, 본 발명품 2는 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을 제품 100 ㎖당 활성형 오스테오칼신의 양이 30 ㎎이 되도록 첨가하였다. 대조는 무첨가의 것을 사용하였다. 본 발명품 2는 대조와 동일한 풍미를 나타내고, 동물 냄새의 증가는 느껴지지 않았다.

실시예 11

통상의 방법에 따라서, 대두로부터 두유를 만들고, 응고제로 응고시켜 통상의 단단한 두부를 조제하였다. 본 발명품 3은 두유 중에 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을 제품 100g 당 활성형 오스테오칼신의 양이 40 ㎎이 되도록 첨가하였다. 대조는 무첨가의 것을 사용하였다. 본 발명품 3은 대조와 동일한 풍미를 나타내고, 동물 냄새 등은 느껴지지 않았다.

실시예 12

과자류로서 오렌지 젤리를 소규모로 제조하였다. 오렌지 젤리는 카라기닌 9 g을 굵은 설탕 180 g과 혼합하고, 물 800 ㎖을 첨가하고, 혼합, 가열 용해하여 제조한다. 이것에, 온주밀감 농축과즙 10 g, 시트르산 2 g, 시트르산소다 1.5 g, 오렌지 아로마 2 g, 향료 1 g을 첨가한다. 본 발명품 4는 각각 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을, 제품 100 g 당 활성형 오스테오칼신의 양이 20 ㎎이 되도록 첨가하였다. 대조는 무첨가의 것을 사용하였다. 본 발명품 4는 대조와 동일한 풍미를 나타내고, 동물 냄새 등은 느껴지지 않았다.

실시예 13

가공 식품으로서, 소시지를 소규모로 제조하였다. 소시지는 돼지고기 2 kg, 돼지 지방 700 g을 5 mm로 저미고, 후추 7 g, 세이지 3 g, 메이스 1 g을 혼합하고, 커팅한 후, 지름 2 cm의 돼지장을 사용하여 케이싱하였다. 이것을 15분간 증자하여 소시지를 얻었다. 소시지에는 커팅 전에, 본 발명품 5는 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을 제품 100 g당 활성형 오스테오칼신의 양이 50 ㎎이 되도록 첨가하였다. 대조는 무첨가의 것을 사용하였다. 본 발명품 5는 대조와 동일한 풍미를 나타내고, 동물 냄새의 증가는 느껴지지 않았다.

실시예 14

하기 표 8의 배합으로 타정기를 사용하여, 타정시 압력 3000 kg/㎠으로 통상의 방법에 따라서, 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을 포함하는 정제(200 ㎎/정)을 제조하였다.

성분	㎎/1정
활성형 오스테오칼신 함유 동결 건조물	25
결정 셀룰로오스	96
전분	54
자당 지방산 에스테르	5
탄산칼슘	20
합계	200

실시예 15

하기 표 9의 배합으로 실시예 8에 준해서 조제한 동결 건조물을 포함하는 치약 조성물을 제조하였다.

성분	중량%
인산수소칼슘(2수화물)	40
인산수소칼슘(무수물)	2
글리세린	7.25
소르비트	7.25
카르복시메틸셀룰로오스	1
라우릴황산나트륨	2
사카린나트륨	0.5
향료	1
활성형 오스테오칼신 함유 동결 건조물	10
정제수	잔부
합계	100

실시예 16

하기 표 10의 배합으로 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을 포함하는 추잉검 조성물을 제조하였다.

성분	중량%
검 베이스	64
크실리톨	25
향료	1
활성형 오스테오칼신 함유 동결 건조물	10
합계	100

실시예 17

생돼지뼈로부터 엑스를 가압 열수 추출한 잔사(삶은 뼈)를 믹서로 분쇄한 것 30 kg(습중량)에 대해서, 0.5M 탄산완충액(pH 9.5) 90 ℓ을 첨가하고, 교반하면서 실온에서 24시간 추출을 실시하였다. 추출액과 잔사를 분리해서 수득된 추출액을 0.5M 시트르산 수용액으로 중화한 후, 한외 여과를 실시하고, 여과액 13.3 ℓ을 얻었다. 다음에 이 여과액을 동결건조하고, 활성형 오스테오칼신을 2.1 g 함유하는 동결 건조물 700 g을 조제하였다.

실시예 18

실시예 17에서 조제한 동결 건조물을 0.05%(w/w) 혼합한 먹이를 부화 후 6주째가 된 닭(암컷) 50마리에 제공하여 사육하였다. 또, 대조로서 100마리에게 동결 건조물을 포함하지 않는 먹이를 제공하여 사육하였다. 사육 9주째에 닭의 체중을 측정한 결과, 대조군의 체중은 1185.3±114.7 g, 동결 건조물 투여군에서는 1260.2±101.7 g으로, 본 발명의 추출물에 의한 현저한 닭의 육성증강 작용이 인정되었다.

실시예 19

생돼지뼈로부터 엑스를 가압 열수 추출한 잔사(삶은 뼈)를 믹서로 분쇄한 것600 kg(습중량)에 대해서, 0.5M 탄산완충액(pH 9.5) 3000 ℓ를 첨가하고, 교반하면서 실온에서 22시간 추출을 실시하였다. 추출액과 잔사를 분리한 후, 세라믹막 여과, 규조토 여과, 무균 여과, 한외 여과, 무균 여과를 차례로 실시하고, 무균 여과액 700 ℓ을 얻었다. 수득된 무균 여과액을 증발농축하고, 액량을 85 ℓ로 하였다. 이 농축물에 덱스트린(마츠타니화학사 제품: 파인덱스#1)을 고형분의 80% 비율로 첨가한 후, 분무 건조에 의해, 사료 첨가용 오스테오칼신 함유 조성물을 조제하였다.

실시예 20

오스테오칼신 함유 추출물의 효소 처리물을 이하의 방법에 의해 조제하였다. 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물 10 g을 50 ㎖의 이온 교환수에 용해하고, pH 6.8 하에서 판크레아틴 0.25 g(SIGMA-ALDRICH사, 제품)을 첨가하고 37 ℃에서 1시간 반응하여 오스테오칼신 함유 추출물의 효소 처리물을 얻었다. 또 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을 포함하지 않고, 동일한 반응을 실시한 것을 대조 처리물로 하였다.

다음에, 이하의 방법에 의해 오스테오칼신 함유 추출물의 효소 처리물의 장으로부터의 칼슘 흡수성의 향상작용을 평가하였다.

9주령의 위스타(Wistar)계 수컷 랫트(5마리)을 하룻밤 절식한 후, 소장을 적출하여 회장과 맹장의 접합부(회맹부)로부터 십이지장측으로 3 ㎝씩 장을 절단하여 1마리로부터 6 내지 8개의 표본을 얻었다. 각 표본은 정성스럽게 반전시킨 후, 양단을 봉합해서 반전된 장 색(sack)을 제조하였다.

다음에 각 반전된 장 색 내에 장막측 완충액(50mM Tris, 150mM Nacl, 4mM KCl, 10mM D-글루코스, 1.25mM CaCl₂·2수화물, pH 7.6)을 0.3 ㎖ 주입하고, 37 ℃로 보온한 오스테오칼신 함유 추출물의 효소 처리물 혹은 대조 처리물을 점막측 완충액(50mM Tris, 150mM Nacl, 4mM KCl, 10mM D-글루코스, 10m MCaC1₂·2수화물, pH 7.6)으로 20배 희석한 액중에서 인큐베이트하였다. 인큐베이트 15분 후에, 색 내에 삽입한 캐뉼러로부터 색의 내액을 샘플링해서 칼슘 농도를 칼슘E 테스트 와코(와코쥰야쿠사 제품)로 측정하고, 칼슘 흡수량을 산출하였다. 그 결과를 표 11에 나타낸다.

	칼슘 흡수량(㎍/㎝(색)) (평균값±표준오차)
대조 처리물군	5.9 ± 0.36
오스테오칼신 함유 추출물의 효소 처리물군	7.4 ± 0.81

표 11에 나타내는 바와 같이, 뒤집어진 장 색 모델에 있어서 오스테오칼신 함유 추출물의 효소 처리물이 칼슘의 흡수량을 높이고 있음이 나타나 있다.

실시예 21

4주령의 위스타계 수컷 랫트를 순화한 후, 오스테오칼신 함유 추출물 투여군(n=5)과 대조군(n=5)으로 나누고, 오스테오칼신 함유 추출물 투여군에는 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을 2.5 중량% 포함하는 표준식(CE-2, 일본 구레아사, 제품)을 급식하였다. 한편, 대조군에는 표준식을 급식하였다. 각 군의 랫트로부터, 투여 10일째에 채혈을 실시하고, 혈액중의 칼슘농도를 칼슘E 테스트 와코로 측정하였다. 그 결과를 표 12에 나타낸다.

	혈중 칼슘농도(㎎/dL) (평균값±표준오차)
대조 처리물군	10.0 ± 0.07
오스테오칼신 함유 추출물 투여군	10.4 ± 0.06

표 12에 나타내는 바와 같이, 오스테오칼신 함유 추출물 투여군 쪽이 대조군에 비해서 혈중 칼슘농도가 높은 것으로 나타나 있다.

실시예 22

8주령의 위스타계 암컷 랫트를 난소 적출 수술군(n=13)과 겉보기 수술군(n=6)으로 나누고, 난소 적출술과 겉보기 수술을 각각 실시하였다. 난소 적출 수술군에 대해서는 저칼슘식(칼슘 함량 0.1%, 일본 구레아사 제품)으로 2주간 순화한 후, 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을 2.5 중량% 포함하는 저칼슘식(칼슘 함량 0.1%)을 8주간 급식한 오스테오칼신 함유 추출물 투여군(n=7)과, 순화에 이어서 저칼슘식을 8주간 급식한 대조군(n=6)의 2군으로 추가로 구분하였다. 겉보기 수술군에 대해서는 겉보기 수술 후 10주간 저칼슘식을 제공하였다. 또, 각각의 군의 랫트로부터 수술후 10주째에 채혈을 실시하였다.

계속해서, 랫트를 마취하에 탈혈 치사시킨 후, 대퇴골을 적출해서 골간 단부의 골밀도를 평가하였다. 골밀도는 pQCT법(Practical Guide for Mechanical Testing o fBone, CRC Press, 385-405쪽, 1999년)에 의해 원위성 장판으로부터 3 mm의 부위에서 측정하였다. 그 결과를 표 13에 나타낸다.

	전체 골밀도(㎎/㎤) (평균값±표준오차)
대조군	459.7 ± 3.9
오스테오칼신 함유 추출물 투여군	471.2 ± 4.4
겉보기 수술군	532.6 ± 6.5

표 13에 나타내는 바와 같이, 오스테오칼신 함유 추출물에 의한 대퇴골 골간 단부에 있어서의 골밀도의 상승작용이 나타났다.

또, 수술후 10주째에 채혈한 혈액중의 칼슘농도를 측정하였다. 그 결과를 표 14에 나타낸다.

	혈중 칼슘농도(㎎/dL) (평균값±표준오차)
대조군	9.2 ± 0.15
오스테오칼신 함유 추출물 투여군	9.7 ± 0.15
겉보기 수술군	10.2 ± 0.22

표 14에 나타내는 바와 같이, 오스테오칼신 함유 추출물 투여군 쪽이 대조군에 비해서 혈중 칼슘농도가 높은 것으로 나타나 있다.

실시예 23

4주령의 위스타계 수컷 랫트를 저칼슘식(칼슘 함량 0.1%)으로 순화한 후, 오스테오칼신 함유 추출물 투여군(n=5)과 대조군(n=5)으로 나누고, 오스테오칼신 함유 추출물 투여군에는 실시예 8에 준해서 제조한 동결 건조물을 2.5 중량% 포함하는 저칼슘식(칼슘 함량 0.1%)을 급식하였다. 한편, 대조군에는 저칼슘식(칼슘 함량 0.1%)을 급식하였다. 투여 18일째에 랫트를 마취 하에서 탈혈 치사시킨 후, 대퇴골을 적출해서 골간부의 골밀도를 평가하였다. 골밀도는 pQCT법에 의해 원위성 장판으로부터 12 mm의 부위에서 측정하였다. 그 결과를 표 15에 나타낸다.

	전체 골밀도 (㎎/㎤)	피질 골밀도 (㎎/㎤)	3점 굴곡강도 (㎣)	피질 골두께 (㎜)
대조군	485.4±10.8	1037.3±6.7	1.428±0.048	0.300±0.008
오스테오칼신 함유추출물 투여군	497.8±19.9	1041.8±16.2	1.489±0.033	0.315±0.010
(평균값±표준오차)

표 15에 나타내는 바와 같이, 오스테오칼신 함유 추출물 투여군 쪽이 대조군에 비해서 대퇴골 골간부에 있어서의 골밀도가 높고, 피질골의 두께 및 3점 굴곡 강도가 증가된 것으로 나타나 있다.

본 발명에 의해, 의약이나 음식품에로의 배합에 적합한 활성형 오스테오칼신 함유 추출물을 저비용으로 제조할 수 있다. 또, 식품가공 폐기물에서 고부가가치의 제품을 제조할 수 있다.

Claims (13)

1. 가열 처리된 뼈로부터 용매 추출을 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, 가열 처리가 습식 가열 처리인 제조방법.
3. 제 1 항에 있어서, 추출에 사용하는 용매가 산성 수용액 또는 알칼리성 수용액인 제조방법.
4. 가열 처리되지 않은 뼈로부터 알칼리성 수용액으로 용매 추출을 실시하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는, 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 제조방법.
5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 알칼리성 수용액이 pH 8 내지 12의 알칼리 수용액인 제조방법.
6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서, 알칼리성 수용액이 탄산염 및/또는 중탄산염의 수용액인 제조방법.
7. 제 1 항 또는 제 4 항에 있어서, 활성형 오스테오칼신 함유 추출물의 탈염 공정을 포함하는 제조방법.
8. 제 1 항 또는 제 4 항에 따른 제조방법에 의해 제조된 활성형 오스테오칼신 함유 추출물.
9. 제 8 항에 따른 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 음식품.
10. 제 8 항에 따른 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 의약.
11. 제 8 항에 따른 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 구강용 조성물.
12. 제 8 항에 따른 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 사료.
13. 뼈로부터 채취된 활성형 오스테오칼신을 유효성분으로 함유하는 육성 증강제.