KR20090082702A - 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화하는 유전자와 작동가능하게 연결되고, 개량된 프로모터 활성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이러한 형질전환체를 사용하여 L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.
라이신, 코리네박테리움 글루타미쿰, 프로모터, 아스파르테이트 키나제, 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제

Description

개량된 프로모터 및 이를 이용한 Ｌ-라이신의 생산 방법 {Enhanced promoter and method for producing L-lysine using the same}
본 발명은 개량된 프로모터 및 이를 이용한 L-라이신의 생산 방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화하는 유전자와 작동가능하게 연결되고, 프로모터 활성을 갖는, 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터, 이러한 벡터로 형질전환된 형질전환체 및 이러한 형질전환체를 사용하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.
코리네형 세균은 전통적으로 아미노산과 핵산관련물질의 생산에 가장 널리 이용되는 산업용 미생물로서, 주로 L-라이신(lysine), L-트레오닌(threonine), L-아르기닌(arginine), L-쓰레오닌, 및 글루탐산 등의 아미노산 및 각종 핵산을 포함한 사료, 의약품 및 식품 등의 분야에서 다양한 용도를 갖는 화학물질을 생산하는데 이용되는 그람양성세균이며, 생육에 비오틴을 요구한다. 세포분열시 직각으로 굽어지는 특징(snapping)을 가지고 있으며, 생성된 대사물질에 대한 분해활성이 낮은 것도 이 균이 가지는 장점 중 하나이다. 대표적인 균종으로는 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)을 포함한 코리네박테리움 속, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)을 포함한 브레비박테리움 속, 아쓰로박터 종(Athrobacter sp.), 및 마이크로박테리움 종 (Microbacterium sp.) 등이 있다.
L-라이신은 L-아미노산의 하나로서, 기타 아미노산의 흡수를 증가시킴으로써 사료의 질을 향상시킬 수 있는 능력으로 인해 동물 사료 보충물로서 상업적으로 사용되고 있고, 인체 의학에서는 특히 주입용 용액제의 성분으로서 사용되며, 제약 산업에도 사용되고 있다. 그러므로, 라이신을 산업적으로 생산하는 것은 경제적으로 중요한 산업 공정이 되어 왔다.
라이신의 생산 효율을 개선시키기 위한 방법으로 라이신 생합성 경로 상의 유전자를 증폭시키거나 유전자의 프로모터를 변형시켜, 생합성 경로 상의 효소활성을 증대시키는 방법이 이용되어 왔다. 종래 라이신 생합성 관련 유전자가 강화된 코리네박테리움 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제6,746,855호에는 lysE 유전자 (라이신 배출 캐리어 유전자)가 강화되고, dapA 유전자, lysC 유전자, pyc 유전자 및 dapB 유전자로 구성되는 군으로부터 선택된 유전자가 추가적으로 도입된 코리네박테리아를 배양하여 L-라이신을 생산하는 방법이 개시되어 있다. 또한, 미국특허 제6,221,636호에는 L-라이신 및 L-쓰레오닌에 의하여 피드백 저해에 실질적으로 탈감작화된 (insensitive) 아스파토 키나제를 코딩하는 DNA 서열 및 디아미노피멜레이트 디카르복실라제를 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA로 형질전환된 코리네박테리아가 개시되어 있다.
이러한 코리네형 세균을 유전공학적 또는 대사공학적 기술을 이용하여 목적 물질들을 고역가로 생산할 수 있는 균주로 개발하기 위해서는, 균주 내에서 여러 가지 대사과정에 관련된 유전자의 발현을 선택적으로 조절할 수 있어야 한다. 이러한 조절을 위해서는, 조절 유전자의 하나로서 DNA 분자 상에 RNA 합성 효소가 결합하여 전사(transcription)를 시작하는 부위인 프로모터의 활성을 조절하는 것이 중요하다.
그러나, 현재까지 라이신 생합성 경로 중 가장 핵심적인 역할을 담당하는 것으로 여겨지는 유전자인 lysC-asd 오페론의 프로모터를 개량하여 발현율을 높인 코리네형 세균에 대해서는 개시된 바가 없다.
이에, 본 발명자는 코리네박테리움 염색체 상의 lysC-asd 오페론 프로모터를 염기치환을 통해 개량시키고, 개량된 프로모터를 도입시켜 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제 효소의 활성이 내재적 활성보다 증가되어 있는 코리네박테리움 속 미생물을 제공할 수 있게 되어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 개량된 프로모터 활성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 핵산 분자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기한 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 라이신의 생산 방법을 제공하는 것이다.
하나의 양태로서, 본 발명은 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화하는 유전자와 작동가능하게 연결되고, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는, 개량된 프로모터 활성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 핵산 분자에 관한 것이다.
본 발명에서 용어 "프로모터"란 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산서열, 즉, 폴리머라제가 결합하여 유전자의 전사를 개시하도록 하는 DNA 영역을 말하며, mRNA 전사 개시부위의 5' 부위에 위치한다.
본 발명의 프로모터 활성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 핵산 분자는 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화하는 유전자와 작동 가능하게 연결된다. 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화하는 유전자는 각각 lysC 및 asd 유전자로서, 코리네박테리움 속 세균에서 라이신을 생산하는 생합성 경로 상의 주요한 유전자들이다. 코리네형 세균에서 lysC 부위는 두 개의 중첩되는 유전자, lysC 알파 및 lysC 베타를 포함하고, 3번째 ORF(open-reading frame)는 lysC 부위에 인접하여 있으며, asd 유전자의 시작 코돈은 lysC ORF 끝에서 24bp 하위에 있는 것으로, lysC 오페론의 부분으로서 발현되는 것으로 알려져 있다. 상기 용어 "오페론"이란 작동유전자·조절유전자 및 구조유전자 등에 의하여 통일적으로 조절되어 있는 서로 이웃한 유전자군을 일컫는 것으로, 즉, 본 발명에서 lysC 및 asd 유전자는 lysC-asd 오페론으로서 동일한 프로모터에 의해 활성이 조절될 수 있음을 의미한다.
또한, 상기 용어 "작동 가능하게 연결"이란 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화하는 유전자의 전사를 개시 및 매개하도록, 상기 유전자 서열과 프로모터 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다. 이는 본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열이 lysC-asd 오페론 유전자와 작동가능하게 연결되어, 상기 오페론 유전자의 전사 활성을 조절할 수 있음을 의미하는 것이다.
본 발명의 프로모터 활성을 갖는 핵산 서열은 코리네박테리움 글루타미쿰에 서 lysC-asd 오페론의 프로모터를 개량시킨 것으로서, 천연형(wild type) 프로모터보다 높은 프로모터 활성을 가지도록 한 것이 특징으로 한다. 즉, 효소의 내재적 활성보다 증가된 효소활성을 나타내도록 한 것이다. 여기서 내재적 활성이란 코리네박테리아속 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 효소의 활성상태를 의미한다. 더 높은 프로모터 활성을 가지도록 개량시키는 방법은 당업계에 알려진 방법에 의해 용이하게 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰 lysC-asd 오페론의 프로모터 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 개량시킨다.
본 발명의 프로모터 핵산 분자는 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 분리 또는 제조할 수 있다. 예를 들어, 적절한 프라이머 서열을 이용하여 PCR을 통해 분리할 수 있다. 또한, 자동화된 DNA 합성기를 이용하는 표준 합성 기술을 이용하여 제조할 수도 있다. 구체적인 일 실시예에서 본 발명자는 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)을 근거로 하여 lysC-asd 유전자 (NCBI 등록번호 NCgl0247)의 프로모터 부위를 포함하는 염기서열을 확보하고(서열번호 1), 이에 근거하여 네 개의 프라이머 (서열번호 3 ~ 6)를 합성한 후, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머들을 이용하여 PCR을 수행하여, 주요부위에 변형된 서열을 가지는 프로모터를 포함하는 본 발명에 따른 핵산 분자를 (서열번호 2) 확보하였다.
본 발명의 코리네박테리움 글루타미쿰 프로모터 활성을 가지는 핵산 분자는 바람직하게는 원핵세포, 특히 대장균 또는 코리네형 세균에서의 유전자 발현을 위한 프로모터로 유용하다. 본 발명에서 용어 "코리네형 세균"은 코리네박테리움(Corynebacterium) 또는 브레비박테리움(Brevibacterium) 속의 미생물을 포함하는 개념이다. 이러한 코리네형 세균은 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 써모아미노게네스 (thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (lactofermentum) ATCC 13869 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11001을 포함하며, 바람직하게 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 10881이지만, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 개량된 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 예컨대 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있으며, 바람직하게는 pACYC177 (New England Biolab, GenBank accetion # X06402)을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 벡터는 숙주 세포 내로 도입시켜 벡터 내의 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자 서열이 숙주 세포 게놈 상의 내생적(endogeneous) lysC-asd 오페론 유전자의 프로모터 부위의 서열과 상동 재조합을 일으키며, 염색체 내로 삽입될 수 있다. 그러므로 본 발명의 벡터는 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection market)를 추가로 포함할 수 있는데, 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 목적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 바람직하게는 lacZ 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시 양태에서, 본 발명자는 상동 재조합을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysC-asd 오페론 유전자의 프로모터 부위를 프로모터 활성이 증진되도록 변이된 프로모터 서열로 대체시킬 수 있는 벡터를 제조하였다. 먼저, 대장균 클로닝용 벡터 pACYC177를 제한 효소 처리하여 평활말단화 한 후, lacZ 유전자를 삽입시키기 위해, 대장균K12W3110 게놈 DNA로부터 PCR을 통해 자체 프로 모터를 포함하도록 lacZ 유전자를 증폭한 후, 다수 개의 제한효소 인식 부위를 포함하는 아답터 서열을 삽입하여, 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 제조하였다(도 1). 이후, 상기에서 기술한 바와 같이 높은 프로모터 활성을 가지도록 제조된, lysC-asd 오페론의 프로모터 주요부위에 변형된 서열을 가지는 프로모터를 포함하는 핵산 분자를 상기 pDZ 벡터의 아답터 부위에 삽입시켜, 서열번호 2의 핵산 서열을 포함하는 벡터 pDZ-lysCP1(도 2)을 제조하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명의 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명의 형질전환체는 벡터가 숙주 세포 내로 형질전환된 후, 벡터 내의 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자 서열이 숙주 세포 게놈 상의 내생적(endogeneous) lysC-asd 오페론 유전자의 프로모터 부위의 서열과 상동 재조합을 일으키며 염색체 내로 삽입되거나, 플라스미드 형태로 보유할 수 있다.
본 발명의 벡터를 형질전환시키는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글 리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있다.
상기 숙주 세포로는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주를 사용하는 것이 좋은데, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물을 사용 가능하며, 바람직하게는 대장균이나 코리네형 세균, 더욱 바람직하게는 코리네박테리움 클루타미쿰 KFCC10881을 사용할 수 있다.
본 발명의 벡터로 형질전환된 형질전환체는 상동 재조합을 통해 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysC-asd 오페론 유전자의 프로모터 부위를 프로모터 활성이 증진되도록 변이된 프로모터 서열로 대체됨으로써, lysC-asd 오페론 유전자는 개량된 프로모터를 가지게 되며, 이를 통해 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제의 효소 활성이 천연형보다 증가되는 특징을 가진다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 본 발명에 따른 서열번호 2로 구성되는 프로모터 활성을 가진 핵산 분자를 포함하는 벡터 pDZ-lysCP1을 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 형질전환시켜 lysC-asd 프로모터 활성이 증진된 형질전환체를 제조하였다. 본 발명에서는 pDZ-lysCP1을 형질전환시켜 얻은 형질전환체 (KFCC10881-lysCP1)를 CA01-0135로 명명하고, 2008년 1월 18일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture center of Microorganisms, 이하, "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM10919P로 기탁하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기한 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하 는 라이신의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 형질전환체는 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제의 효소 활성이 천연형보다 증가되어 있다. 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제는 라이신의 생합성 경로 상의 가장 핵심적인 효소들이므로, 본 발명의 형질전환체를 배양시켜 라이신의 생산 효율을 높일 수 있다.
본 발명에서 형질전환체의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 및 Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]에 상세히 기술되어 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되며, 바람직하게는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정 (fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루 코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.
배양물의 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절히 사용하여 조절할 수 있다. 발포는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 거포제를 사용하여 조절할 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들어 공기를 배양물 중으로 도입시켜 호기성 조건을 유지시킬 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한 다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 세포 중에 포함되어 있을 수 있다.
한편, 본 발명의 상기한 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 라이신의 생산 방법은 상기 배양하는 단계에서 생성되는 라이신을 회수하는 방법을 추가로 포함할 수 있다. L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법으로 세포 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 분리해낼 수 있다. L-라이신 회수 방법의 예로서, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등의 방법이 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.
이하, 하기 실시예에 의해 본 발명을 좀더 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 lysC-asd 유전자와 작동가능하게 연결되고, 개량된 프로모터 활성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 핵산 분자는, 천연형에 비해 높은 프로모터 활성을 나타내어 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제의 효소활성을 증가시켜 라이신의 생산 효율을 높일 수 있다.
본 실시예에서는 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰의 lysC-asd 오페론 유전자의 프로모터를 상동 재조합을 통해 개량된 프로모터로 치환시키기 위한 재조합 벡터를 제작하고, 상기 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 균주에 형질전환시켜 염색체 상의 프로모터가 개량된 균주를 얻음으로써, 라이신 생산 효율이 높아진 균주를 제조하였다.
본 발명에서 이용하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC13032)를 모균주로 하여 인공 변이법을 통해 제작된 S- (2-아미노에틸) 시스테인 (S-(2-aminoethyl) cysteine, 이하 AEC)에 대한 내성 및 호모세린 유출 (homoserine leaky)의 특징을 갖는 균주이다(한국 등록특허 0159812호, 한국 등록특허 0397322호 참고).
실시예 1: 프로모터 개량용 재조합 벡터의 제작
(1) 염색체 삽입용 벡터( pDZ )의 제작
본 실시예에서는 대장균 클로닝용 벡터 pACYC177 (New England Biolab, GenBank accetion # X06402)를 기본 벡터로 사용하여, 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 제작하였다.
pACYC177 벡터를 AcuI 및 BanI 제한 효소로 처리한 후, 클레나우 효소처리를 통하여 평활말단화하였다. 선별 마커로 사용될 대장균 유래의 lacZ 유전자는 대장균 K12 W3110의 게놈 DNA로부터 PCR을 통하여 자체 프로모터를 포함하도록 증폭한 후, T4 DNA 폴리머라제 및 폴리뉴클레오티드 키나제 처리를 통하여 5' 말단 인산화 및 평활화함으로써 준비하였다. 이상과 같이 준비한 2종의 DNA 단편을 접합하였으며, 접합된 환상 DNA 분자의 제한효소 BamHI 부위로 인위적으로 합성한 다수의 제한효소 인식 부위를 포함하고 있는 아답터 (adaptor) 서열을 삽입하여, 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 완성하였다. 도 1은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 나타내는 도면이다.
(2) lysC - asd 오페론 유전자의 프로모터를 개량하기 위한 재조합 벡터 제작
본 실시예에서는 라이신을 생산하는 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 lysC-asd 오페론 유전자의 프로모터를 개량하기 위한 재조합 벡터를 제작하였다.
먼저, 미국 국립 보건원의 유전자은행 (NIH GenBank)을 근거로 하여 lysC-asd 유전자 (NCBI 등록번호 NCgl0247)의 프로모터 부위를 포함하는 염기서열(서열번호 1)을 확보하였으며, 주요부위에 변형된 서열을 가지는 프로모터를 포함하는 DNA 조각(서열번호 2)을 확보하였다. 변형 프로모터 서열은 일반적으로 미생물에서 알려진 프로모터 컨센서스(consensus) 서열을 기반으로 고안하였다.
또한, 상기 변형된 프로모터 서열을 제조하기 위한 프라이머는 상기 염기서열에 근거하여 네 개의 프라이머 (표 1, 서열번호 3 ~ 6)를 합성하였다.
프라이머 염기서열 서열번호
lysC/PF CCG GGG ATC CTC TAG ACC ATC TTT TGG GGT GCG GAG C 3
lysC/PR GCA GGT CGA CTC TAG ACT CAA TAG CCA TGG CGA CGA G　 4
lysC/P1F AGT TTA TTG TGG TAG AGT TG 5
lysC/P1R CAA CTC TAC CAC AAT AAA CT 6
lysC/P1mut GAC ACA GTT TAT TGT 7
코리네박테리움 글루타미쿰 유래 lysC-asd 오페론 유전자의 프로모터 서열을 얻기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 표 1에 표기된 올리고뉴클레오티드 쌍을 프라이머로 하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 53℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초를 30회 반복하였다. 그 결과, 치환부위를 한쪽 말단에 포함하고 있는 300 bp DNA 단편을 얻었다. lysCP1-1는 서열번호 3과 6을 프라이머로 사용하여 증폭된 것이며, lysCP1-2는 서열번호 4와 5를 프라이머로 사용하여 증폭된 것이다. 상기 증폭 산물을 미리 XbaI 제한효소로 절단하여 준비한 pDZ 벡터와 혼합하여 In-fusion Cloning Kit (TAKARA)를 이용, 클로닝하여 pDZ-lysCP1벡터를 얻었다.
도 2는 서열번호 2에 해당하는 lysCP1을 포함하고 있는 코리네박테리움 염색체 치환용 벡터 pDZ-lysCP1을 나타내는 도면이다.
실시예2 : 재조합 벡터의 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 내로의 삽입
본 실시예에서는 코리네박테리움의 염색체상 lysC-asd 오페론 프로모터를 개량하기 위해, 상기에서 제작한 재조합 벡터를 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 형질전환시켜, 균주 염색체의 프로모터 서열과 상기한 벡터 상의 프로모터 서열을 상동 재조합을 통해 치환시킴으로써, 염색체 내로 상기한 개량 프로모터 서열을 삽입시켰다.
상기 실시예 1에서 제조한 재조합 벡터들 개량 프로모터 서열을 가지는 DNA 단편을 포함하고 있는 상기한 재조합 벡터인 코리네박테리움 염색체 치환용 벡터 pDZ-lysCP1을 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 전기펄스법으로 형질전환한 후 (Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질전환법 이용), 카나마이신 (kanamycin) 25 mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 동 유전자와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다.
벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타내는가 여부를 확인함으로써 가능하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10-4으로부터 10-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차 (crossover)에 의해 lysC-asd 오페론의 프로모터의 주요부위에 염기서열이 치환된 균주를 선별하였다. 이상과 같이 선별된 균주는 PCR을 통한 염기치환 여부 확인 및 해당 지역에 대한 염기서열 확인 과정을 거쳐 최종 선정되었다. pDZ-lysCP1 벡터로 형질전환된 균주의 프로모터 염기치환 여부는 서열번호 4와 7을 프라이머로 사용하여 PCR을 수행함으로써, 목적 부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.
이를 통해 최종적으로, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체상에서 lysC-asd 유전자의 프로모터 주요부위에 치환된 염기를 포함하고 있는 라이신 생산주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-lysCP1을 얻었다.
실시예 3: lysC - asd 프로모터 개량 균주에서의 아스파르테이트 키나제 효소 활성의 측정
모균주로 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 균주 및 실시예 2에서 최종적으로 제작된 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-lysCP1 균주의 아스파르테이트 기나제 효소 활성을 측정하기 위해 하기와 같은 방법으로 배양하고, 배양액으로부터 단백질을 분리하여 아스파르테이트 기나제 효소 활성을 측정하였다.
대수기까지 배양한 배양액을 OD600 값이 0.3이 되도록 하기의 종 배지 50 ml 에 접종한 후, OD600 값이 약 15에 이를 때까지 배양하였다. 배양액으로부터 원심분리(5,000 rpm, 15분)를 통하여 균체를 수거하여, 0.1% Tris.HCl (pH8.0) 완충용액으로 2회 세척한 후, 동 완충용액으로 610 nm의 탁도가 160 가량이 되도록 현탁하였다. 현탁액 1.5 ml당 1.25 g의 글래스 비드(glass bead)를 첨가한 후, 비드 비터(bead beater)를 이용, 6분간 균체를 파쇄하였다. 원심분리 (15,000 rpm, 20분)를 통하여 상층액을 수거, 브레드포드 방법(Bradford, M.M 1976. Anal. Biochem. 72:248-254)에 의한 단백질 농도를 정량한 후, 아스파르테이트 키나제 효소 활성 측정을 위한 조단백질 용액으로 사용하였다.
아스파르테이트 키나제 효소활성의 측정은 0.1 M Tris.HCl(pH8.0), 0.01 M MgCl2, 0.6 M Hydroxylamine.HCl (pH7.0), 4 mM ATP, 0.2 M Aspartate를 포함하고 있는 반응액에 0.05 ml의 조단백질용액을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 30℃에서 30분간 반응 후, Stop 용액 (10% FeCl2, 3.3% TCA, 0.7N HCl)을 첨가, 반응을 종료하였으며, 원심분리를 통해 상층액을 수거, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 아스파테르이트 키나제 효소 활성 단위 (U)는 1분간 1 mg의 단백질이 생성한 아스파르테이트 하이드록사메이트 nmole로 정의하였다.
코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-lysCP1 균주는 모균주 KFCC10881에 비해 5.08배 증가된 아스파르테이트 키나제 활성을 나타냄을 확인하였다(표 2).
균주 아스파르테이트 키나제 활성 (mU) Folds
KFCC10881 13.5 1.00
KFCC10881-lysCP1 68.6 5.08
* 종 배지 ( pH 7.0)
원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
실시예 4: lysC - asd 프로모터 개량 균주에서의 라이신 생산
모균주로 이용한 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 균주 및 실시예 2에서 최종적으로 제작된 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881-lysCP1 균주를 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.
하기의 종 배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 코리네박테리움 글루타미쿰 모균주 KFCC10881 및 KFCC10881-lysCP1을 접종하고 30 ℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 120 시간 동안 (200 rpm)으로 진탕 배양하였다.
배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 및 KFCC10881-lysCP1에 대한 배양액 중의 L-라이신 함량에 대한 결과는 아래 표 3과 같았다.
균주 라이신(g/l)
뱃치 1 뱃치 2 뱃치 3
KFCC10881 43 42.5 42.7
KFCC10881-lysCP1 45.3 45.2 45.7
* 종 배지 ( pH 7.0)
원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
* 생산 배지 ( pH 7.0)
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4 7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
상기의 표 3에서 나타낸 바와 같이, 아스파르테이트 키나제 활성이 5배 이상 강화된 KFCC10881-lysCP1 균주는 모균주 KFCC10881에 비해 라이신 생산 효율이 5% 이상 증가 되었음을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 개량된 프로모터 활성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 핵산 분자는, 천연형에 비해 높은 프로모터 활성을 나타내어 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제의 효소 활성을 증가시켜 라이신의 생합성 효율을 증가시킬 수 있으며, 이를 통해, 산업에 유용한 L-아미노산의 일종인 L-라이신을 고수율로 생산해낼 수 있다.
도 1은 코리네박테리움 염색체 삽입용 벡터 pDZ를 나타내는 도면이다.
도 2는 코리네박테리움 염기치환용 벡터 pDZ-lysCP1을 나타내는 도면이다.
<110> CJ corporation <120> Enhanced promoter and method for producing L-lysine using the same <130> PA070766/KR <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 611 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(611) <223> lysC promoter and some portion of lysC-asd gene <400> 1 ccatcttttg gggtgcggag cgcgatccgg tgtctgacca cggtgcccca tgcgattgtt 60 aatgccgatg ctagggcgaa aagcacggcg agcagattgc tttgcacttg attcagggta 120 gttgactaaa gagttgctcg cgaagtagca cctgtcactt ttgtctcaaa tattaaatcg 180 aatatcaata tatggtctgt ttattggaac gcgtcccagt ggctgagacg catccgctaa 240 agccccagga accctgtgca gaaagaaaac actcctctgg ctaggtagac acagtttata 300 aaggtagagt tgagcgggta actgtcagca cgtagatcga aaggtgcaca aaggtggccc 360 tggtcgtaca gaaatatggc ggttcctcgc ttgagagtgc ggaacgcatt agaaacgtcg 420 ctgaacggat cgttgccacc aagaaggctg gaaatgatgt cgtggttgtc tgctccgcaa 480 tgggagacac cacggatgaa cttctagaac ttgcagcggc agtgaatccc gttccgccag 540 ctcgtgaaat ggatatgctc ctgactgctg gtgagcgtat ttctaacgct ctcgtcgcca 600 tggctattga g 611 <210> 2 <211> 611 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> gene <222> (1)..(611) <223> lysCP1 promoter and some portion of lysC-asd gene <400> 2 ccatcttttg gggtgcggag cgcgatccgg tgtctgacca cggtgcccca tgcgattgtt 60 aatgccgatg ctagggcgaa aagcacggcg agcagattgc tttgcacttg attcagggta 120 gttgactaaa gagttgctcg cgaagtagca cctgtcactt ttgtctcaaa tattaaatcg 180 aatatcaata tatggtctgt ttattggaac gcgtcccagt ggctgagacg catccgctaa 240 agccccagga accctgtgca gaaagaaaac actcctctgg ctaggtagac acagtttatt 300 gtggtagagt tgagcgggta actgtcagca cgtagatcga aaggtgcaca aaggtggccc 360 tggtcgtaca gaaatatggc ggttcctcgc ttgagagtgc ggaacgcatt agaaacgtcg 420 ctgaacggat cgttgccacc aagaaggctg gaaatgatgt cgtggttgtc tgctccgcaa 480 tgggagacac cacggatgaa cttctagaac ttgcagcggc agtgaatccc gttccgccag 540 ctcgtgaaat ggatatgctc ctgactgctg gtgagcgtat ttctaacgct ctcgtcgcca 600 tggctattga g 611 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysC/PF <400> 3 ccggggatcc tctagaccat cttttggggt gcggagc 37 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysC/PR <400> 4 gcaggtcgac tctagactca atagccatgg cgacgag 37 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysC/P1F <400> 5 agtttattgt ggtagagttg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysC/P1R <400> 6 caactctacc acaataaact 20 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysC/P1mut <400> 7 gacacagttt attgt 15

Claims (10)

  1. 아스파르테이트 키나제 및 아스파르테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화하는 유전자와 작동가능하게 연결되고, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 가지는, 개량된 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자.
  2. 제1항의 개량된 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  3. 제2항에 있어서, 상기 벡터는 도 2에 나타낸 pDZ-lysCP1인 벡터.
  4. 제2항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 형질전환체는 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속인 형질전환체.
  6. 제4항에 있어서. CA01-0135로 명명된 수탁번호 KCCM10919P인 형질전환체.
  7. 제4항에 있어서, 제1항의 개량된 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자가 염색체 내에 상동 재조합으로 삽입되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  8. 제4항에 있어서, 제1항의 개량된 프로모터 활성을 갖는 핵산 분자를 플라스미드 형태로 보유하고 있는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  9. 제4항의 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는 라이신의 생산 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배양하는 단계에서 생성되는 라이신을 회수하는 방법을 추가로 포함하는 라이신의 생산 방법.
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