CN103298930A - 改进的启动子和用其产生l-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有改进的启动子活性的被可操作地连接到编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶操纵子的谷氨酸棒杆菌来源的核酸分子，包含该核酸分子的载体，转化有该载体的转化体，和利用该转化体产生L-赖氨酸的方法。

Description

改进的启动子和用其产生L-赖氨酸的方法
技术领域
本发明涉及改进的启动子和用其产生L-赖氨酸的方法。更具体的是，本发明涉及谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)来源的显示改良启动子活性的被可操作地连接到编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的操纵子上的核酸分子；含有所述核酸分子的载体；所述载体被引入其中的转化体；和利用所述转化体产生L-赖氨酸的方法。
背景技术
棒状细菌是传统工业微生物，其最广泛用于各种在动物饲料、药物和食品工业中有用的化学物质的产生，包括氨基酸，如L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-苏氨酸和谷氨酸，以及核酸相关物质。这些微生物是革兰氏阳性的且其生长需要生物素。它们通过劈裂(snapping)分裂，它们对其产生的代谢物的弱降解力可被有益利用。棒状细菌的代表性实例包括如谷氨酸棒杆菌的棒状杆菌属、如黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)的短杆菌属、节杆菌某些种(Athrobacter spp.)和微杆菌某些种(Microbacterium spp.)等。
L-赖氨酸是商业上重要的L-氨基酸，由于其帮助机体吸收其它氨基酸的能力从而提高饲料质量而被用作动物营养的饲料添加剂。对于机体，L-赖氨酸用作注射液成分，并且也发现在药物领域中的应用。因此，L-赖氨酸的工业生产是经济上重要的工业方法。
赖氨酸的产率与生物合成途径中的酶活性有关，该活性一般通过扩增赖氨酸生物合成途径中一个或多个基因或通过应用基因的修饰的启动子来增强。在其中赖氨酸生物合成相关基因被增强的棒状杆菌菌株和利用其进行L-赖氨酸生产是熟知的。例如，美国专利号6,746,855公开了通过发酵具有增强的lysE基因(赖氨酸输出载体基因)的产L-赖氨酸棒状杆菌来产生L-赖氨酸的方法，其中另外地选自dapA基因、lysC基因、pyc基因和dapB基因的基因被增强。美国专利号6,221,636公开了用包含编码天冬氨酸激酶的核苷酸序列和编码二氨基庚二酸脱羧酶的核苷酸序列的重组DNA转化的棒状杆菌，在编码天冬氨酸激酶的核苷酸序列中，L-赖氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制实质上敏感性降低(desentitized)。
为了将棒状细菌发展为能够高滴度产生目标产物的变体，需要可选择性控制涉及代谢的基因或代谢工程技术。为此，重要的是修饰启动子的活性——为RNA聚合酶提供可靠的初始结合位点以控制被调节的基因转录的调节性DNA区域。
但是，迄今没有公开过带有增强启动子的棒状细菌，该棒状细菌在lysC-asd操纵子活性上得到改良，该操纵子在赖氨酸生物合成途径中发挥重要作用。
发明内容
技术问题
本发明对L-赖氨酸的产生进行透彻而深入的研究，发现当在棒状杆菌基因组中转化有在特定碱基处修饰的lysC-asd操纵子启动子时，棒状杆菌属微生物显示比内源活性改进的天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶活性。
技术方案
本发明的目的之一是提供源于谷氨酸棒杆菌的核酸分子，其显示改进的启动子活性。
本发明的另一目的是提供含有核酸分子的载体，该核酸分子显示改进的启动子活性。
本发明另一个目的是提供在其中锚定有(anchored)载体的转化体。
本发明还另一个目的是提供通过发酵转化体产生L-赖氨酸的方法。
有利效果
当源于棒状杆菌的表现改良的启动子活性的核酸分子被可操作地连接到lysC-asd基因时，根据本发明的谷氨酸棒状杆菌比野生型启动子显示更高的启动子活性，并因此可提高天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的水平。因此，用核酸分子转化的赖氨酸产生菌株可高产率产生赖氨酸。
附图说明
图1是显示整合到棒状杆菌基因组的载体pDZ遗传图谱的示意图。
图2是显示启动子载体pDZ-lysCP1遗传图谱的示意图。
最佳实施方式
根据其一方面，本发明涉及具有SEQ ID NO.2核苷酸序列的谷氨酸棒杆菌来源的核酸分子，其可操作地连接到编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的操纵子，并显示改进的启动子活性。
术语“启动子”如本文所用，指含有RNA聚合酶初始结合位点并促进其下游特定基因转录的DNA区域。即，启动子是非翻译核苷酸序列，编码区域的上游，RNA聚合酶结合于此从而起始基因转录，并通常位于其调节的基因附近，在同一条链上游(接近正义链的5’区域)。
来源于谷氨酸棒杆菌的具有启动子活性的本发明核酸分子可操作地连接到编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的操纵子。lysC和asd基因分别编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶，在棒状杆菌属某些种的赖氨酸生物合成途径中具有重要作用。
在棒状细菌中，lysC基因由两个重叠基因组成，即lysCα和lysCβ，其与负责asd的第三开放阅读框(ORF3)相邻，第三开放阅读框已知被表达为lysC操纵子的一部分，其具有asd起始密码子，起始于lysCORF末端下游24bp位置。术语“操纵子”，如本文所用，指在单一调节信号控制下相邻基因的功能群，由操纵基因、启动子和结构基因组成。在本发明中，lysC和asd基因属于lysC-asd操纵子且在同一启动子的控制下。
术语“可操作地连接”，如本文所用，意指具有根据本发明所述启动子活性的核苷酸序列与启动子序列之间的连接，以这样的功能关系启动子可进行分别编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的基因转录的起始和调节。即，当被可操作地连接到lysC-asd操纵子基因时，具有根据本发明所述启动子活性的核苷酸序列可以控制操纵子基因的转录活性。
具有根据本发明所述启动子活性的核苷酸序列，其来源于谷氨酸棒杆菌lysC-asd操纵子的野生型启动子，经修饰以确保优于内源活性的酶活性。内源活性意思是野生型棒状细菌中的酶活性。确保更高启动子活性的修饰可利用本领域公知的技术实现，优选地通过删除、插入、非保守或保守置换或其组合来诱导lysC-asd操纵子的启动子的核苷酸序列突变。
具有根据本发明所述启动子活性的核酸分子可利用标准生物技术分离或制备。例如，可在适当引物存在下进行PCR来分离。可选地，可利用标准生物技术使用自动DNA合成仪合成。在一个实施方式中，基于核苷酸序列(SEQ ID NO.1)——其含有获自NIH GenBank数据的lysC-asd基因(NCBI基因ID：NCg10247)的启动子区域，合成了4个引物(SEQ ID NOS.3～6)。在引物存在下，以谷氨酸棒杆菌KFCC10881的基因组DNA用作模板进行PCR以提供含有启动子的核酸分子，该核酸分子在特定碱基位置具有修饰(SEQ ID NO.2)。
优选地，具有根据本发明所述谷氨酸棒杆菌启动子活性的核酸分子可用作原核生物尤其是大肠杆菌(E.coli)或棒状细菌基因表达的启动子。如本文所用，术语“棒状细菌”是指属于棒状杆菌属或短杆菌属的微生物。可用于本发明的棒状细菌的实例包括但不限于：谷氨酸棒杆菌ATCC13032、热产氨棒状杆菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)FERM BP-1539、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、乳糖发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)ATCC13869和产L-氨基酸的突变体或源自其中的菌株，如谷氨酸棒杆菌KFCC10881和谷氨酸棒杆菌KFCC11001，优选的是谷氨酸棒杆菌KFCC 10881。
根据其另一方面，本发明涉及载体，其中定位了具有改进的启动子活性的核酸分子。
如本文所用，术语“载体”指DNA构建物，其中感兴趣基因可操作地连接到调节元件以致于该基因可在适当的其中锚定有载体的宿主中表达。调节元件包括起始转录的启动子、控制转录的操纵基因、编码mRNA核糖体结合位点的序列和控制转录和翻译终止的序列。
只要可在宿主内复制，本领域所知的任何载体均可用于本发明而没有特别限制。例如，可用于本发明的载体可以是质粒、噬菌体颗粒或简单地是可能的基因组插入物，但不因此限制本发明。优选载体是pACYC 177(New England Biolab，GenBank登录号X06402)。转化至合适的宿主后，载体可复制或与宿主基因组无关地发挥其功能或本身整合进基因组。
更具体地，当根据本发明所述的载体被引入宿主细胞时，载体中具有启动子活性的核酸分子可与宿主基因组上lysC-asd操纵子内源启动子的启动子区域进行同源重组，引起载体整合至宿主细胞染色体中。因此，根据本发明所述的载体可进一步包括选择标记以指示载体在宿主染色体中的插入。适于指示用载体转化的细胞，即感兴趣基因是否插入宿主细胞基因组，选择标记可使细胞具有如下能力：药物抗性、细胞毒性剂抗性、营养缺陷型或如表面蛋白表达的可选择的表型表达。在选择性试剂存在下，转化细胞可被选择，因为只有表达选择标记的细胞存活或显示另一表型。优选地，载体可包括lacZ基因作为选择标记。
在本发明的实施方式中，构建载体以含有活性改进的修饰的ddh启动子，其可通过同源重组取代谷氨酸棒杆菌的内源ddh启动子。为此，首先，将用于大肠杆菌克隆的载体pACYC177用限制酶消化并用Klenow片段平端化。分别地，包括lacZ基因及其启动子的核苷酸序列通过PCR从大肠杆菌K12W3110的基因组DNA扩增。由此获得的这两个DNA片段相互连接得到环状核酸分子，接着将其内包含多个限制酶位点的连接序列插入环状核酸分子中，以提供载体pDZ(图1)，用于插入棒状杆菌染色体。其后，在特定碱基处修饰以表现高活性的ddh基因启动子被插入至pDZ载体的连接序列，以提供包括核苷酸序列SEQ ID NO.2的载体pDZ-lysCP1(图2)。
根据其中另一方面，本发明涉及其中锚定有载体的转化体。
术语“转化”，如本文所用，指外源DNA物质引入宿主细胞，其中外源DNA物质可作为独立于宿主基因组或整合到宿主基因组中的元件复制。由于载体转化至宿主细胞，转化体以质粒的形式锚定有载体，或在具有启动子活性的核苷酸序列与宿主细胞基因组上lysC-asd操纵子的内源启动子进行同源重组后，载体整合进宿主细胞染色体。
只要用于将本发明所述的载体引入宿主细胞，任何技术可用于本发明。取决于宿主细胞，可选择适当的标准技术，例如电穿孔、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、显微注射、聚乙二醇(PEG)技术、DEAE-葡聚糖技术、阳离子脂质体技术和醋酸锂-DMSO技术。
使用高效摄取和表达外源DNA物质的细胞是有用的，其可适用于包括原核生物和真核生物在内的所有微生物。优选地，可使用大肠杆菌或棒状细菌，更优选地是谷氨酸棒杆菌KFCC 10881。
在用本发明所述的载体转化的细胞中，lysC-asd操纵子具有改良活性的修饰的启动子通过同源重组取代了内源启动子，加强了lysC-asd操纵子基因的mRNA水平。因此，转化体比野生型具有更高的天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶活性。
在本发明的一个实施方式中，载体pDZ-lysCP1——其中包含具有本发明所述的核苷酸序列SEQ ID NO.2的启动子——被转化至谷氨酸棒杆菌KFCC10881以得到转化体(KFCC10881-lysCP1)，命名为CA01-0135，其显示改进的天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶活性，然后该转化体于2008年1月18日以编号KCCM10919P被保藏于韩国微生物保藏中心(the Korean Culture Center of Microorganisms)(下文称“KCCM”)。
根据其另一方面，本发明涉及包括转化体发酵的赖氨酸产生方法。
与野生型相比，根据本发明所述的转化体在天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶活性上有所改良。因为天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶是赖氨酸生物合成途径中最重要的酶，所以转化体的发酵引起赖氨酸较高产率的产生。
在本发明中，可利用公知方法进行转化体的发酵，并可适当地控制发酵条件，包括温度、时间、pH等。以下文件提供了发酵的详细描述[Chmiel；Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)，以及Storhas；Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig /Wiesbaden，1994)]。发酵可通过分批培养、连续培养或补料分批培养实现。优选地，补料分批或重复补料分批方法用于发酵的连续方式，但本发明不限于此。
用于发酵，培养基必须满足所用菌株的需要。适用于培养各种微生物的培养基是本领域公知的(如，来自American Society forBacteriology(Washington D.C.，USA，1981)的“Manual of Methods forGeneral Bacteriology”)。培养基可包含如碳源糖(saccharides)和碳水化合物(carbohydrates)(如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉和纤维素)，脂质和脂肪(如豆油、葵花籽油、花生油和椰子油)，脂肪酸(如棕榈酸、硬脂酸、蓖麻酸(rinoleic acid))，醇(如甘油和乙醇)和有机酸(如醋酸)。这些物质可分别使用或组合使用。作为氮源，含氮有机化合物(如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽汁、玉米浆、豆粕和尿素)或含氮无机化合物(如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵)可分别使用或组合使用。用于培养基的磷源的实例包括磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和相应的钠盐。
另外，培养基可包含细胞生长必需的金属盐(如硫酸镁或硫酸铁)，并可补充必需营养物如氨基酸和维生素以刺激生长。此外，可向培养基添加适当的前体。可一次一起或在发酵过程中分别添加营养物和添加剂。
培养基的pH可用碱性化合物(如氢氧化钠、氢氧化钾或氨水)或酸性化合物(如磷酸或硫酸)调节。培养基中泡沫的生成可用消泡剂如聚乙二醇脂肪酸酯抑制。可通过在其中引入氧气或含氧气体混合物将培养基保持在有氧条件下。对于培养温度，通常在20℃到45℃之间，优选地在25℃到40℃之间。发酵连续进行直到产生L-氨基酸的最大量。在这方面，可在10到160小时内完成。L-赖氨酸产生后，L-赖氨酸可输出至培养基或可保持在细胞内。
可选地，本发明所述赖氨酸的产生方法可进一步包括收集产生的赖氨酸。可利用公知方法从培养基或细胞分离L-赖氨酸。用于本发明的收集方法的实例包括过滤、阴离子交换层析、结晶和HPLC，但不限于此。
通过以下描述的实例可获得对本发明更好的理解，但其意图不是限制本发明。
发明方式
在以下实施例中，构建了重组载体以包含谷氨酸棒杆菌lysC-asd操纵子的启动子，其经修饰而具有改进的活性。重组载体被转化至谷氨酸棒杆菌KFCC10881，其中修饰的启动子随即通过与内源启动子的同源重组整合至细胞基因组，产生能高产率产生赖氨酸的新菌株。
从谷氨酸棒杆菌野生型菌株(ATCC13032)经人工诱变，用于本发明的谷氨酸棒杆菌KFCC10881对S-(2-氨乙基)半胱氨酸(下文称“AEC”)和高丝氨酸渗漏具有抗性(韩国专利号0159812和0397322)。
实施例1：包含改良启动子的重组载体的构建
(1)用于整合到基因组的载体构建(pDZ)
在该实施例中，pDZ——要整合到棒状杆菌基因组的载体——在用于大肠杆菌的载体pACYC177(New England Biolab，GenBankaccession#X06402)的基础上构建。
经AcuI和BanI处理后，用Klenow片段将pACYC177载体平端化。用作选择标记，源自大肠杆菌的lacZ基因的制备是通过PCR扩增包括该基因及其启动子的大肠杆菌K12W3110的基因组DNA，接着分别用T4DNA聚合酶和多核苷酸激酶处理PCR产物以在5’端磷酸化并使其相对端平端化而进行的。由此获得的这两个DNA片段相互连接得到环状核酸分子，然后插入包含多个限制酶位点的人工合成的连接序列以提供用于插入棒状杆菌染色体的载体pDZ。在图1中，用于整合到棒状杆菌染色体中的pDZ载体被示意性说明。
(2)包含lysC-asd操纵子改良启动子的载体的构建
在该实施例中，构建了重组载体以包含产赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌lysC-asd操纵子的改良启动子。
在NIH GenBank数据的基础上，首先获得包括lysC-asd基因启动子区域(NCBI ID No.NCg10247)的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)。由此核苷酸序列制备在特定碱基位置突变的DNA片段。各个修饰的启动子序列基于微生物中发现的常见共有启动子序列来设计。
用于修饰启动子序列的制备，基于碱基序列合成了四条引物(SEQID NOS.3～6，表1)。
表1
Figure BPA00001186612600091
通过PCR，利用表1所示的引物组，在PfuUltraTM高保真性DNA聚合酶(Stratagene)存在下，以谷氨酸棒杆菌KFCC10881的基因组DNA作为模板制备谷氨酸棒杆菌lysC-asd操纵子的启动子序列。以在96℃变性30秒，在53℃退火30秒和在72℃延伸30秒的30个循环进行PCR。由此，PCR产物为300bp长的DNA片段，置换部分位于一个末端区域。用一组引物SEQ ID NOS.3和6扩增lysCP1-1，用一组引物SEQ ID NOS.4和5扩增lysCP1-2。用XbaI消化PCR产物并用In-fusion Cloning Kit(TAKARA)将其克隆至pDZ以获得重组载体pDZ-lysCP 1。
图2是包含整合到棒状杆菌基因组中的启动子序列SEQ ID NO.2的载体pDZ-lysCP1的图谱。
实施例2：重组载体在谷氨酸棒杆菌菌株中的引入
在该实施例中，将上述制备的重组载体引入至产赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌KFCC-10881，以使载体上修饰的ddh启动子序列通过与基因组上lysC-asd操纵子的内源启动子同源重组被整合到细胞基因组中。
为此，利用电穿孔方法(基于Appl.Microbiol.Biotechnol.(1999)52：541-545)将包含与修饰启动子序列相应的DNA片段的重组载体pDZ-lysCP1转化到谷氨酸棒杆菌KFCC10881中，接着在含有25mg/L量的卡那霉素的选择培养基上选择转化体，其中修饰的启动子通过与内源启动子同源重组整合到基因组中。
通过在含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-半乳糖苷)平板上蓝色的出现鉴定载体成功插入基因组。载体整合到基因组中的单交换体在营养肉汤中搅拌培养(30℃，8小时)，然后在涂布于含有X-gal的平板之前，将培养物稀释到浓度10-4到10-10。当生长在平板上的大多数克隆呈现蓝色时，只有少部分克隆体保持白色。选择白色的克隆体为双交换型克隆体，其锚定有在特定碱基位置处突变的lysC-asd操纵子的启动子。为了确证，通过PCR和碱基测序来检测所选择菌株的碱基置换。利用一组引物SEQ ID NOS.4和7，通过PCR和碱基测序对pDZ-lysCP1转化的菌株进行启动子碱基置换检测。
最终，通过双交换体确定产赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881-lysCP1，其中在特定碱基位突变的lysC-asd操纵子的启动子整合到基因组中。
实施例3：lysC-asd启动子-改良菌株的天冬氨酸激酶活性检测
培养母菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881和实施例2中最终制备的产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881-lysCP1，从培养物中分离蛋白质并如下检测天冬氨酸激酶活性。
将生长到对数期的各个培养物接种到50mL的如下种子培养基，达到OD600值为0.3，然后培养直到在600nm的光密度达到约15。离心收集后(5,000rpm，15分钟)，用0.1％Tris HCl(pH 8.0)洗涤细胞2次，悬浮于相同的缓冲液中以使在610nm的光吸收达到浊度160。在以1.25g/1.5ml悬浮液添加玻璃珠的玻璃搅拌器中破碎细胞6分钟。离心后(15,000rpm，20分钟)，通过Bradford法(Bradford，M.M 1976.Anal.Biochem.72：248-254)定量测定上清液的蛋白质含量，并将上清液用作测定天冬氨酸激酶活性的粗蛋白质溶液。
为了量化天冬氨酸激酶活性，将约0.05mL的粗蛋白质溶液与含有0.1M Tris HCl(pH 8.0)、0.01M MgCl2、0.6M盐酸羟胺(pH 7.0)、4mMATP和0.2M天冬氨酸的反应液混合，并使其在30℃反应30分钟，接着加入终止液(10％FeCl2、3.3％TCA、0.7N HCl)终止反应。离心后，在540nm测定由此得到的上清液的吸光度。天冬氨酸激酶活性定义为1mg蛋白质每分钟产生的天冬氨酸氧肟酸盐的纳摩尔数(nmoles)并以单位(U)表示。
观察到谷氨酸棒杆菌KFCC10881-lysCP1具有高于母菌株KFCC108815.08倍的天冬氨酸激酶活性(表2)。
表2
  菌株  天冬氨酸激酶(U)   倍数
  KFCC10881  13.5   1.00
  KFCC10881-lysCP1  68.6   5.08
*种子培养基(pH 7.0)
原糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO44g、K2HPO48g、MgSO47H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺1000μg、泛酸钙2000μg、烟碱酰胺2000μg(每升蒸馏水)
实施例4：lysC-asd启动子-改良菌株的赖氨酸的产生
将母菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881和实施例2中制备的产L-赖氨酸的菌株谷氨酸棒杆菌KFCC10881-lysCP1发酵以产生L-赖氨酸，如下。
将母菌株谷氨酸棒杆菌KFCC 10881和KFCC 10881-lysCP 1接种至250mL弯头-挡板瓶中，各瓶包含25mL如下的种子培养基，在30℃以200rpm振荡培养20小时。向250mL弯头-挡板瓶中的24mL如下的产生培养基中加入1mL种子培养物，接着在30℃振荡(200rpm)培养120小时。
培养完成后，进行HPLC分析以确定菌株产生的L-赖氨酸的量。谷氨酸棒杆菌KFCC10881和KFCC10881-lysCP1的培养物中L-赖氨酸的浓度总结在表3中，如下。
表3
Figure BPA00001186612600121
*种子培养基(pH 7.0)
原糖20g、蛋白胨10g、酵母提取物5g、尿素1.5g、KH2PO44g、K2HPO48g、MgSO47H2O 0.5g、生物素100μg、盐酸硫胺1000μg、泛酸钙2000μg、烟碱酰胺2000μg(每升蒸馏水)
*产生培养基(pH 7.0)
葡萄糖100g、(NH4)2SO440g、大豆蛋白质2.5g、玉米浆固体5g、尿素3g、KH2PO41g、MgSO47H2O 0.5g、生物素100μg、氯化硫胺1000μg、泛酸钙2000μg、烟碱酰胺3000μg、CaCO330g(每升蒸馏水)
如表3所示，发现天冬氨酸激酶活性约5倍提高的谷氨酸棒杆菌KFCC-lysCP1与母菌株KFCC10881相比赖氨酸产率增加约5％。
【工业应用性】
如上所述，根据本发明的谷氨酸棒杆菌来源的具有比野生型更高启动子活性的核酸分子可提高天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的活性，从而增加赖氨酸的生物合成效率。因此，锚定有改良启动子的菌株可高产率生成工业上重要的氨基酸——L-赖氨酸。
Figure IPA00001186612100011
Figure IPA00001186612100021

Claims (10)

1.一种核酸分子，其具有SEQ ID NO.2的核苷酸序列，其被可操作地连接到编码天冬氨酸激酶和天冬氨酸半醛脱氢酶的操纵子，并具有改进的用于表达的启动子活性。
2.一种载体，其包括权利要求1所述的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的载体，其是具有图2遗传图谱的pDZ-lysCP1。
4.一种转化体，其具有权利要求2所述的载体。
5.根据权利要求4所述的转化体，其属于棒状杆菌属或短杆菌属。
6.根据权利要求4所述的转化体，其被称为CA01-0136，具有登录号KCCM10919P。
7.根据权利要求4所述的转化体，其中具有改进的启动子活性的权利要求1所述的核酸分子通过同源重组整合到转化体的基因组中。
8.根据权利要求4所述的转化体，其具有权利要求1所述的分子，所述分子具有改进的启动子活性，如质粒。
9.一种产生赖氨酸的方法，其包括发酵权利要求4所述的转化体。
10.根据权利要求9所述的方法，其进一步包括收集所述发酵过程中产生的所述赖氨酸。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106318964A (zh) * 2016-09-01 2017-01-11 宁夏伊品生物科技股份有限公司 棒杆菌发酵生产l‑赖氨酸的方法及其启动子改造
CN107810269A (zh) * 2015-04-02 2018-03-16 Cj第制糖株式会社 新颖的启动子及其用途
CN110951662A (zh) * 2019-12-26 2020-04-03 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用
US11242545B2 (en) 2016-09-01 2022-02-08 Ningxia Eppen Biotech Co., Ltd Corynebacterium for producing L-lysine by fermentation
CN115261246A (zh) * 2021-04-30 2022-11-01 大象株式会社 L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101226384B1 (ko) * 2010-03-05 2013-01-25 씨제이제일제당 (주) 개량된 프로모터 및 이를 이용한 ｌ-라이신의 생산 방법
KR101348461B1 (ko) 2010-12-08 2014-01-08 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용하여 퓨트레신을 생산하는 방법
KR101294935B1 (ko) 2011-04-01 2013-08-08 씨제이제일제당 (주) 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법
KR101335853B1 (ko) * 2011-12-01 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법
RU2588665C2 (ru) 2011-12-21 2016-07-10 СиДжей ЧеилДжеданг Корпорейшн Способ получения l-лизина с использованием микроорганизмов, обладающих способностью продуцировать l-лизин
KR101607741B1 (ko) 2013-03-20 2016-03-31 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 생산 재조합 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR101498630B1 (ko) 2013-10-28 2015-03-04 씨제이제일제당 주식회사 Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신 생산방법
KR101601404B1 (ko) 2014-04-09 2016-03-09 씨제이제일제당 (주) Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
CN106687579B (zh) 2014-04-25 2020-10-27 Cj第一制糖株式会社 产生二胺的微生物和使用该微生物产生二胺的方法
KR101735178B1 (ko) 2014-04-25 2017-05-15 씨제이제일제당 (주) 다이아민 생산 미생물 및 이를 이용한 다이아민 생산방법
KR101835935B1 (ko) 2014-10-13 2018-03-12 씨제이제일제당 (주) L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌의 제조 방법
KR101632642B1 (ko) * 2015-01-29 2016-06-22 씨제이제일제당 주식회사 신규한 프로모터 및 그의 용도
KR101813759B1 (ko) 2015-06-24 2018-01-02 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 또는 오르니틴 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 또는 오르니틴 생산방법
KR101735935B1 (ko) 2015-07-20 2017-05-16 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신 또는 오르니틴 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 또는 오르니틴 생산방법
KR101871037B1 (ko) 2016-03-15 2018-06-26 씨제이제일제당 (주) 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산 방법
JP6679803B2 (ja) * 2016-08-31 2020-04-15 シージェイ チェイルジェダン コーポレーション 新規プロモーター及びその用途
KR101863456B1 (ko) 2016-11-15 2018-06-01 씨제이제일제당 (주) L-라이신을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-라이신의 생산방법
KR101941775B1 (ko) 2017-06-14 2019-01-24 씨제이제일제당 (주) 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법
KR101937569B1 (ko) 2017-06-14 2019-01-11 씨제이제일제당 (주) 신규 폴리펩타이드 및 이를 이용한 오르니틴계 산물 생산방법
US10982245B2 (en) 2017-06-30 2021-04-20 Cj Cheiljedang Corporation O-succinyl homoserine transferase mutant and method for producing O-succinyl homoserine using same
CN111315877B (zh) 2017-06-30 2023-08-08 Cj第一制糖株式会社 新型o-琥珀酰高丝氨酸转移酶变体及使用其生产o-琥珀酰高丝氨酸的方法
KR102011394B1 (ko) 2017-07-19 2019-10-22 씨제이제일제당 주식회사 퓨트레신을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
KR101911186B1 (ko) 2017-08-16 2018-10-25 씨제이제일제당 (주) 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법
CN110079488A (zh) * 2018-01-25 2019-08-02 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种生产阿洛酮糖的工程菌株，其构建方法及应用
KR102003911B1 (ko) 2018-02-23 2019-07-25 씨제이제일제당 주식회사 마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법
KR102175112B1 (ko) 2019-04-22 2020-11-06 씨제이제일제당 주식회사 L-쓰레오닌 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 쓰레오닌 생산방법
KR102204917B1 (ko) 2019-04-22 2021-01-20 씨제이제일제당 주식회사 L-히스티딘 생산능이 강화된 미생물 및 이를 이용한 히스티딘 생산방법
KR102221040B1 (ko) 2019-05-09 2021-03-03 씨제이제일제당 주식회사 L-아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 l-아미노산을 생산하는 방법
KR102472559B1 (ko) 2019-06-28 2022-12-01 씨제이제일제당 주식회사 황 함유 아미노산 또는 그 유도체의 제조방법
KR102472558B1 (ko) 2019-06-28 2022-12-01 씨제이제일제당 주식회사 황 함유 아미노산 또는 그 유도체 제조방법
EP4083064A4 (en) * 2019-12-23 2024-06-05 CJ CheilJedang Corporation MICROORGANISM FOR PRODUCING L-AMINO ACID HAVING INCREASED CYTOCHROME C ACTIVITY, AND METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACID USING SAME
KR102246288B1 (ko) 2020-08-13 2021-04-29 씨제이제일제당 주식회사 퓨트레신 생산 미생물 및 이를 이용한 퓨트레신 생산방법
JP2024509290A (ja) * 2021-03-09 2024-02-29 デサン・コーポレイション Ｌ－リジン生産能が向上したコリネバクテリウム・グルタミカム変異株およびこれを用いたｌ－リジンの生産方法
KR102339271B1 (ko) * 2021-05-07 2021-12-14 씨제이제일제당 주식회사 신규 프로모터 및 이의 용도
KR102339264B1 (ko) * 2021-05-07 2021-12-14 씨제이제일제당 주식회사 신규 프로모터 및 이의 용도

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR0159812B1 (ko) 1995-12-20 1998-11-16 손경식 코리네박테리움 글루타미컴 씨에이치 77 및 이 균주를 이용한 l-라이신의 제조 방법
JP4075087B2 (ja) 1996-12-05 2008-04-16 味の素株式会社 Ｌ−リジンの製造法
US20020086371A1 (en) 1999-07-07 2002-07-04 Degussa-Huls Aktiengesellschaft L-lysine-producing corynebacteria and process for the preparation of L-lysine
KR100397322B1 (ko) 2000-12-30 2003-09-06 씨제이 주식회사 엘-라이신의 제조방법
KR100653742B1 (ko) * 2004-12-30 2006-12-05 씨제이 주식회사 신규한 ｌ-라이신-유도성 프로모터
DE102006026328A1 (de) * 2006-06-02 2008-01-03 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung eines L-Lysin enthaltenden Futtermitteladditivs
DE102006032634A1 (de) * 2006-07-13 2008-01-17 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren
KR100924065B1 (ko) * 2006-09-15 2009-10-27 씨제이제일제당 (주) Ｌ－라이신 생산능이 향상된 코리네박테리아 및 그를 이용한 ｌ－라이신 생산 방법

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107810269A (zh) * 2015-04-02 2018-03-16 Cj第制糖株式会社 新颖的启动子及其用途
CN107810269B (zh) * 2015-04-02 2021-06-01 Cj第一制糖株式会社 新颖的启动子及其用途
CN106318964A (zh) * 2016-09-01 2017-01-11 宁夏伊品生物科技股份有限公司 棒杆菌发酵生产l‑赖氨酸的方法及其启动子改造
US11242545B2 (en) 2016-09-01 2022-02-08 Ningxia Eppen Biotech Co., Ltd Corynebacterium for producing L-lysine by fermentation
CN110951662A (zh) * 2019-12-26 2020-04-03 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用
CN110951662B (zh) * 2019-12-26 2024-03-12 新疆梅花氨基酸有限责任公司 一种高产赖氨酸的棒状细菌及其构建方法与应用
CN115261246A (zh) * 2021-04-30 2022-11-01 大象株式会社 L-赖氨酸生产能力得到提高的谷氨酸棒状杆菌突变株及利用其的l-赖氨酸的生产方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP2246415A2 (en) 2010-11-03
JP5396403B2 (ja) 2014-01-22
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US20100317067A1 (en) 2010-12-16
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KR100930203B1 (ko) 2009-12-07
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CN103298930B (zh) 2015-01-14
EP2246415A4 (en) 2011-06-01
US8426577B2 (en) 2013-04-23
BRPI0906752B1 (pt) 2021-10-13

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