KR20090038426A - 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치 - Google Patents
반응 혼합물로부터 수지 분리 장치 Download PDFInfo
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Abstract
반응 혼합물로부터 수지의 분리를 위한 장치가 제공된다. 상기 장치는 측면 포트, 2개의 입구/출구 포트 및 2개의 플랜지가 끼워진 컬럼을 구비한다. 각 플랜지에는 지지 격자에 의해 지지되는 다층의 네트 스크린이 끼워진다. 컬럼 자체는 지지 구조체에 부착된다. 이 장치를 이용하여 반응 혼합물로부터 수지를 제거하는 방법이 제공되는데, 상기 반응 혼합물은 장치에 추가되고 수지가 여과되어 폐기물이 배출될 때에 컬럼 내에 남아 있는다. 이어서, 나머지 수지를 세척하고 용리하여 정제된 생성물을 제공한다.
Description
본 발명은 반응 혼합물, 특히 발효 배지(fermentation broth)로부터 수지를 분리하는 장치, 및 이 장치를 이용하여 반응 혼합물로부터 수지를 분리하는 방법에 관한 것이다.
반응 혼합물로부터 생성물의 분리는 때때로 매우 복잡하고 지루하여 생성물의 수율을 낮추고 때로는 순도가 낮아지는 원인이 될 수 있다. 이 문제는, 예컨대 고형물로부터 생성물의 분리를 복잡하게 하는 상이한 물성을 갖는 반응 혼합물에 고형물이 존재하는 경우에 증명되었다. 다른 예로는 발효 공정이 있는데, 생물학적 작용제, 예컨대 미생물이 유기 또는 무기 물질에서 성장하고, 그러한 성장 중에 또는 그 후에 생물학적 작용제는 특히 관심 대상인 유기 물질을 발생시킨다. 통상, 결과적인 발효 배지는 생물학적 배출 질량(즉, 미생물 세포)을 제거하도록 여과되고, 그 결과로 생긴 깨끗한 여과액을 관심 대상인 특별한 생성물과 결합한 수지를 이용하여 배치(batch) 또는 크로마토그래피 컬럼에서 처리한다. 이어서, 수지를 세척하여 원치않는 불순물을 제거하고, 원하는 생성물을 적절한 용제 혼합물로 용리시킨다. 합성 수지 및 천연 수지는 하류의 공정 중에 발효 생성물의 회수 및 정제에 광범위하게 사용된다.
최근, 상기 방안은 Journal Ind. Microbiol. 5:283-288과, Journal of Industrial Microbiology 1996, 16, 305-308과, J. Antibiot. 55:141-146과, Biotechnology and Bioengineering, 78(3):280-288, (2002)와, Letters in Applied Microbiology 2003, 37, 196-200과, 미국 특허 출원 제US 2005/0170475 A1호와, J. Nat. Prod. 2002, 65, 570-572에 기술된 바와 같이, 발효 중에 또는 여과 전에 수확 배지 내로 수지의 첨가에 의해 구현되었다.
이 방안은, 예컨대 발효의 생산성을 증가시키고/증가시키거나 생성물 안정성을 향상시키고/향상시키거나, 추출 수율을 증가시킨다.
그러한 공정에서는, 특히 공정이 산업적 규모로 수행될 때에 심각한 기술적 문제를 내포하고 있는, 반응 혼합물, 예컨대 전체적인 발효 배지로부터 수지를 분리하는 것에 관심을 갖고 있다.
반응 혼합물로부터 수지를 분리하는 공지된 장치는 현재는 GE Healthcare 그룹의 일부인 Amersham Biosciences에 의해 공급되는 "유동상 흡착(Expanded Bed Adsorption)"이고, 이 유닛의 작동은 생원료로부터 직접 단백질을 회수하기 위한 STREAMLINE™ 흡착제와 컬럼을 이용한다. 그러나, 유동상 흡착("EBA") 기법은 주로 단백질의 일차 포획에 사용된다.
J. Antibiot. 55:141-146, (2002)에서는 생성물을 포획하기 위하여 8.9×33 cm의 컬럼을 이용하였다.
Biotechnology and Bioengineering, 78(3):280-288, (2002)에서는, 전체 배 지가 아니라 발효 배지 중 작은 시료만을 처리하였다. 이들 시료에서, 수지는 중력에 의해 침전되고, 세포를 함유하는 배양 배지가 이동된다.
Letters in Applied Microbiology 2003, 37, 196-200에서는, 균사와 수지를 함유하는 배양 시료를 10 min 동안 1670 g에서 원심 분리에 의해 분리하고, 배양 상청액을 폐기하였다.
미국 특허 출원 제US 2005/0170475 A1호는 6 시간 동안 10 그램의 XAD16 비드와 교반하여 1 리터의 발효 배지를 처리하는 것을 개시하고 있다. 이어서, 혼합물을 원심 분리하고 상청액을 제거하였다.
J. Nat. Prod. 2002, 65,570-572는 와이어 메시 필터 바스켓을 이용하여 1000 L 발효 배지로부터 20 리터의 XAD16 수지를 수집하는 것을 개시하고 있다.
당업계에는 반응 혼합물, 특히 전체 발효 배지로부터 수지를 분리하는 보다 우수한 장치에 대한 요구가 있다.
일실시예에서, 본 발명은 반응 혼합물로부터 수지를 분리하는 장치를 제공하는데, 상기 장치는 측면 포트와, 지지 격자에 의해 지지되는 다층의 네트 스크린이 각각 끼워지는 2개의 플랜지(컬럼의 한 단부에 하나씩)를 구비하는 회전 가능한 원통형 컬럼이다.
다른 실시예에서, 본 발명은 반응 혼합물로부터 수지를 분리하는 방법으로서, 컬럼에 반응 혼합물을 로딩하는 단계와, 반응 혼합물로부터 수지를 여과하는 단계와, 수지를 세척하는 단계와, 수지로부터 생성물을 용리시키는 단계를 포함하고, 상기 수지는 전체 공정 중에 컬럼 내에 유지되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법을 제공한다.
도 1은 수직 위치에서 본 발명의 장치의 일실시예의 측면도의 개략도.
도 2는 반응 혼합물로부터 수지의 여과 중에 수평 위치에서 본 발명의 장치의 일실시예의 측면도의 개략도.
도 3은 수지의 세척 중에 수직 위치에서 본 발명의 장치의 일실시예의 측면도의 개략도.
도 4는 수지로부터 생성물의 용리 중에 수직 위치에서 본 발명의 장치의 일실시예의 측면도의 개략도.
본 발명의 장치는 수지와 작업자의 물질적인 접촉, 즉 반응 혼합물로부터 수지의 수동 제거를 피하면서 반응 혼합물로부터 수지의 분리를 가능하게 한다. 또한, 이 장치는 수지를 필터로부터 수동으로 제거하지 않으면서 수지로부터 생성물의 용리를 수행하고, 용리 단계 동안 컬럼 내에 위치시키게 한다. 따라서, 이 장치는 반응을 대규모로 수행할 때에 바람직하다. 더욱이, 이 장치는 생성물이 효능이 있는 경우에 특히 유리하여, 작업자의 관점에서 또한 희망되는 인자인 환경과 생성물의 접촉을 피한다.
본 발명은 반응 혼합물로부터 수지의 분리를 위한 장치를 제공하고, 상기 장치는 측면 포트와, 지지 격자에 의해 지지되는 다층 네트 스크린이 각각 끼워진 2 개의 플랜지(하나의 플랜지는 컬럼의 어느 한 단부에 있음)를 구비하는 회전식 원통형 컬럼이다. 바람직하게는, 반응 혼합물은 발효 배지 또는 고형상 화학물 합성으로부터의 혼합물이다. 수지는 폴리머 흡착 수지인 것이 바람직하다. 수지는 폴리스티렌/디비닐벤젠 흡착 수지(예컨대, Amberlite XAD16, Amberlite XAD4, Diaion HP20, Amberlite XAD1600, Amberlite XAD1180, Diaion HP21, Sepabeads SP825, Sepabeads SP850, Sepabeads SP70, Sepabeads SP700 또는 Sepabeads SP207) 또는 폴리아크릴 흡착 수지(예컨대, Amberlite XAD7 또는 Diaion HP2MG)인 것이 가장 바람직하다. Amberlite XAD는 Rohm and Haas Co.,의 상표명이고 Diaion 수지와 Sepabeads 수지는 Mitsubishi Chemical에 의해 공급된다. 또한, 이들 유형의 수지의 다른 공급자들이 존재한다. 이와 달리, 상이한 흡착 상호 작용(예컨대, 이온 교환, 친화력, 금속 친화력, 소수성 상호 작용 등)을 행하는 수지가 사용될 수도 있다.
이하, 도 1을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 설명하기로 한다. 이하의 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없고, 당업자라면 본 발명의 범위 내에서 다른 실시예들이 있다는 것을 알 것이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 장치는 지지 구조체(2)에 부착된 원통형 컬럼(1)을 구비하여, 이 원통형 컬럼(1)은 지지 구조체(20)에 대한 적어도 하나의 부착점(10)에 의해 그 수평(즉, 반경 방향) 축선 주위를 회전할 수 있다. 컬럼(1)은 빈 크로마토그래피 컬럼인 것이 바람직하다. 지지 구조체(20)는 임의의 형태 또는 크기일 수 있고, 고정되거나 이동될 수 있으며(예컨대, 바퀴 위에 장착될 수 있으 며), 컬럼(1)이 회전되게 하는 것을 제공한다. 적어도 하나의 부착점(10)은 컬럼(1)의 회전이 그 반경 방향 축선 주위에서 가능하게 하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 본 발명에 일치하여 컬럼(1)은 적어도 하나의 부착점(10)에 의해 지지 구조체(2)에 장착될 수 있지만, 2개의 부착점(10)[하나의 부착점이 컬럼(1)의 어느 한쪽 측면에 있음]이 존재하는 것이 바람직하고, 이들 부착점(10)은 컬럼(1)의 중간에 배치되는 것이 바람직하며, 직경 방향으로 서로 반대측에 위치하는 것이 바람직하다. 2개의 부착점(10)은 각각 컬럼(1)에 수직하게 컬럼(1)의 외측벽의 중간에 용접되는 샤프트를 포함하고, 부착점(10)은 컬럼(10)의 반대측에 있다. 샤프트는 베어링 시스템을 통해 지지 구조체(2)와 접촉하여, 컬럼(1)의 회전을 가능하게 하고, 하나의 샤프트는 공기 구동식 모터에 연결되어 회전을 용이하게 한다. 원통형 컬럼(1)은 측면 포트(3)와, 상부 플랜지(4) 및 하부 플랜지(5)로서 지칭할 수 있는 2개의 플랜지(4, 5)를 포함하고, 상부 플랜지(4)는 컬럼(1)이 수직 위치에 있을 때에 하부 플랜지(5)보다 높은 수직 위치에 배치된다. 플랜지(4, 5)에는 각각 네트 스크린(6)이 끼워지고, 이 네트 스크린은 바람직하게는 다층상이고 지지 격자(7)에 의해 지지된다. 측면 포트(3)는 바람직하게는 대략 실린더의 종방향 부분의 중앙에 배치되고 바람직하게는 실린더의 내측 부분과 연통한다. 또한, 원통형 컬럼(1)의 단부는 컬럼의 각 측면에서 입구/출구 포트(8, 9)에 연결된다. 컬럼(1)의 크기는 여과될 수지의 양과 분리의 어려움에 따라 변경될 수 있고, 당업자라면 적절한 컬럼 크기를 결정할 수 있을 것이다.
선택적으로, 컬럼(1)은 요구되는 작동 온도가 주위 환경 온도와 상이한 경우 에 피복될 수 있다.
바람직하게는, 네트 스크린(6)의 메시 크기는 수지 및 부착된 생성물은 컬럼(1) 내측에 보유되지만, 반응 혼합물의 나머지(예컨대, 발효 반응의 경우에, 미생물 세포, 반응 혼합물의 불용성 성분 및/또는 사용하지 않은 성분을 비롯한 불용성 폐기물)가 여과하여 제거되도록 정해진다. 바람직하게는, 처리 유체의 유동을 가능하게 하고 기구류, 예컨대 압력계 및/또는 온도계의 설치를 위해 플랜지(4, 5)의 어느 한쪽 또는 양쪽에 도면에 도시하지 않은 추가적인 포트 및 연결부가 존재한다.
바람직하게는, 도 1에 도시된 장치의 부품들(1-5 및 7-10)은 금속 합금, 플라스틱, 유리 및 법랑 코팅된(glass-lined) 물질로 이루어지는 군에서 선택된 재료로 제조되고, 상기 재료는 세척 및 용리 공정에 사용된 용제에 따라 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 재료는 금속 합금이고, 가장 바람직하게는 스테인레스강이다. 바람직하게는, 네트 스크린(6)은 금속 합금이나 플라스틱으로 제조된다. 바람직하게는, 임의의 가스켓 또는 O링은 사용되는 용제와 양립할 수 있는 재료로 제조된다. 재료는 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)가 바람직하다.
플랜지(4, 5)는 시스템을 안정화시키도록 사용된다. 따라서, 플랜지는 컬럼(1)이 지지되는 한 임의의 원하는 형태를 가질 수 있다.
본 발명은 컬럼에 반응 혼합물을 로딩하는 단계와, 수지 및 부착된 생성물을 반응 혼합물로부터 여과하는 단계와, 수지 및 부착된 생성물을 세척하는 단계와, 생성물을 수지로부터 용리시키는 단계를 포함하는, 반응 혼합물로부터 수지를 분리 시키는 방법을 제공하고, 상기 수지는 전체 공정 중에(즉, 여과, 세척 및 용리 단계들 중에) 컬럼 내에 유지된다.
이하, 본 발명의 공정의 바람직한 실시예(특히, 발효 배지로부터 반응 혼합물에 적용될 때에 공정의 바람직한 실시예)를 도 2 내지 도 4를 참조하여 설명한다. 이하의 실시예들은 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없으며, 당업자라면 본 발명의 범위 내에서 다른 실시예들이 존재한다는 것을 알 것이다.
도 2 내지 도 4에 나타낸 바와 같이, 컬럼(1)에 반응 혼합물을 로딩하는 단계와, 수지를 반응 혼합물로부터 여과하는 단계와, 수지를 세척하는 단계와, 수지로부터 생성물을 용리시키는 단계를 포함하고, 상기 수지는 전체 공정 중에 컬럼(1) 내에 유지되는, 반응 혼합물로부터 수지를 분리하는 공정이 제공된다. 생성물은 흡수, 흡착, 이온 상호 작용, 친화력 상호 작용 및 소수성 상호 작용을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 메카니즘에 의해 수지에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 생성물은 마크로라이드(macrolide)[특히, 폴리케타이드 마크롤락톤(poliketide macrolactone)], 폴리펩타이드(polypeptide), 글리코펩타이드(glycopeptide), 뉴클레오타이드(nucleotide) 및 안트라사이클라인(anthracycline)으로 이루어지는 군에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 생성물은 에포싸일론(특히, 에포싸일론 D), 마이토마이신, 사이클로스포린, 블레오마이신, 다우노루비신 및 플루다라빈으로 이루어지는 군에서 선택된다. 생성물은 에포싸일론 D가 가장 바람직하다.
바람직하게는, 도 2에 나타낸 바와 같이, 반응 혼합물은 컬럼(1)을 수평 위 치에 유지시키는 동안에 컬럼(1)의 측면 포트(3)를 통해 로딩된다. 이어서, 바람직하게는, 컬럼(1) 내에 남아 있게 함으로써 컬럼(1)을 여전히 수평 위치에 유지하고 반응 혼합물의 폐기물을 입구/출구 포트(8, 9) 중 적어도 하나를 통해 컬럼 밖으로 압박하면서 수지가 여과된다. 바람직하게는 폐기물은 중력에 의해 밖으로 압박되지만, 압력, 진공 또는 이들 중 임의의 조합을 물론 사용할 수 있다. 압력 및/또는 진공은 펌프 또는 다른 압력 유도 장비를 입구/출구 포트(8, 9) 중 어느 한쪽 또는 양쪽 및/또는 측면 포트(3)에 부착함으로써 컬럼에 가해질 수 있다. 이와 달리, 압력 및/또는 진공은 플랜지(4, 5)의 어느 한쪽 또는 양쪽에 추가의 포트 또는 연결부를 통해 컬럼(1)에 가해질 수도 있다.
폐기물은 바이오매스 또는 원하지 않는 임의의 성분일 수 있고 여과 공정에 의해 방출될 수 있다. 바이오매스는 미생물 세포, 불용성 및/또는 사용하지 않은 발효 매체(예컨대, 곡분, 녹말, 탄화칼슘 등)의 성분을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 폐기물은 입구/출구 포트(8, 9) 중 하나를 통해 컬럼(1)으로부터 배출된다. 선택적으로, 입구/출구 포트(8, 9) 양자는 폐기물을 제거하도록 사용될 수 있어, 여과 표면이 2배로 된다. 선택적으로, 압력 또는 진공이 여과를 빠르게 하도록 사용될 수 있다. 바람직하게는, 네트 스크린(6)은 도 2에 도시된 바와 같이 폐색된 경우에 폐기물 반응 혼합물을 이용하거나 새로운 용제를 이용하여 반대 방향 분출에 의해 세척될 수 있다. 반대 방향 분출에 사용되는 용제는 세척에 사용된 용제와 동일한 것이 바람직하다.
수지 및 부착된 생성물을 세척하는 것은 컬럼(1)에 용제를 첨가함으로써 행 해진다. 용제는 어느 한 측면 포트(3) 또는 입구/출구 포트(8, 9) 중 어느 하나를 통해 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 세척은 용제를 컬럼(1)에 첨가하기 전에 도 3에 도시된 바와 같이 컬럼(1)을 수직 위치로 이동시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 용제는 물, 산성수(예컨대, 염산과 황산 등의 수성 무기산, 또는 포름산 또는 아세트산 등의 수성 유기산 등), 염기수(예컨대, 수산화나트륨과 수산화칼륨 등의 수성 수산화물 염기, 또는 탄화나트륨 또는 탄화탈륨 등의 수성 탄화물 염기 등)와, 완충 용액과, 물에 또는 완충 용액에 용해되거나 부분적으로 용해되는 유기 용제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 바람직하게는, 유기 용제로는 아세톤, 메타놀, 에타놀, 이소프로페놀, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 디메틸포마미드, 디메틸설폭사이드 및/또는 에틸 아세테이트를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 유기 용제는 메타놀이 바람직하다. 용제는 물이 바람직하다. 생성물의 안정성 및 용해성과 양립할 수 있는 임의의 완충제를 사용할 수 있다. 완충제로는 아세테이트, 카보네이트, 바이카보네이트, 포스페이트 및 암모늄 화합물(예컨대, 아세트산나트륨 또는 아세트산)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 바람직하게는, 용제는 도 3에 나타낸 바와 같이 압력을 이용하여 최상측 입구/출구 포트(8)로부터 또는 최하측 입구/출구 포트(9)로부터 첨가된다. 바람직하게는, 세척 중에 수지로부터 최소량의 생성물이 분리되거나 생성물이 전혀 분리되지 않는다.
세척은 폐기물의 이탈을 보증하도록 반복되는 것이 바람직하다. 컬럼(1)은 전후로, 즉 수평과 수직간 그리고 그 반대로 회전될 수 있다. 바닥으로부터의 세 척은 수지의 현탁액을 가능하게 한다.
바람직하게는, 도 4에 나타낸 바와 같이, 컬럼(1)을 수직 위치에 위치 결정하고, 상부 입구/출구 포트(8)를 통해 적절한 용제를 첨가함으로써 생성물의 용리가 행해진다. 바람직하게는, 용리에 채용된 용제가 세척에 채용된 용제와 조성 및 비율면에서 동일하지 않는다면, 용제는 (전술한) 세척 단계에 채용될 수 있는 것과 동일한 용제와, 물과 혼합되지 않는 유기 용제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택된다. 예컨대, 세척 단계에서 사용되는 물과 유기 용제의 혼합물이 또한 용리에 사용되는 경우에, 물 대 유기 용제의 비율은 세척 단계보다 용리 단계에서 적어서, 생성물은 세척 단계가 아니라 용리 단계 중에 용리된다. 요구되는 특정한 비율은 사용되는 생성물과 수지에 따라 정해지고, 당업자에 의해 개발된 공정 중에 일상의 경험을 통해 쉽게 결정될 수 있다. 물과 혼합되지 않는 유기 용제로는 톨루엔과 디클로로메탄을 포함하지만 이들로 제한되지는 않는다. 생성물을 함유하는 용출액이 하부 입구/출구 포트(9)로부터 수집된다.
각 단계(여과, 세척, 용리)의 다양한 공정 파라미터(온도, 압력, 시간 등)에 대한 제한은 장치에 사용된 재료의 안정성 뿐만 아니라 수지 및 부착된 생성물의 안정성을 기초로 한다. 그러한 제한은 당업자에게 쉽게 명백할 것이다.
특정한 바람직한 실시예를 참조하여 본 발명을 설명하였지만, 명세서를 고찰하면 다른 실시예가 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명의 공정 및 조성을 상세히 설명하는 이하의 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 한정한다. 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 재료 및 방법 양자에 대해 많은 수정이 실시될 수 있다는 것은 당업 자에게 명백할 것이다.
실시예
실시예 1: 에포싸일론을 함유한 반응 혼합물로부터 수지의 분리
Lau J, Frykman S, Regentin R, Ou S, Tsuruta H, Licari P, 마이소코쿠스 산투스에서 에포싸일론 D의 이종 제조의 최적화(Optimizing the Heterologous Production of Epothilone D in Myxococcus xanthus), Biotechnology and Bioengineering, 78(3):281-288, (2002)(본 명세서에 그 전체가 참조로서 합체됨)에 설명된 바와 같이 흡착 수지의 면전에서 마이소코쿠스 산투스 균주를 발효시킴으로써 에포싸일론 D의 제조를 수행하였다. 발효 공정의 말미에, 이하의 방식으로 전술한 장비를 이용하여 세포로부터 수지를 분리하였다.
233.6 g의 에포싸일론 D와 180 L의 XAD16(Rohm & Haas Co.로부터 입수 가능한 스티렌/디비닐벤젠 폴리머 흡착 수지)을 함유하는 8300 L의 발효 배지를 높이가 100 cm이고 내부 직경이 60 cm이며 수평 위치에 있는 컬럼(1)에 측면 포트(3)를 통해 로딩하였다. 여과를 2 시간 수행하였다. 컬럼(1)을 수직 위치로 이동시키고 혼탁도가 관찰되지 않을 때까지 수지를 800 L의 정제수를 이용하여 600 L/h의 유속으로 세척하였다. 소비된 배지에서 활성 물질이 검출되지 않았다.
이어서, 2300 L의 84:16(v/v) 메탄/물 혼합물을 이용하여 수지로부터 생성물인 에포싸일론 D를 용리하고, 96.1 %의 수율로 224.5 g의 EPO D 활성 물질을 복구하였다. 얻은 용액을 Arslanian RL, Parker CD, Wang PK, McIntire JR, Lau J, Starks C, Licari PJ, 마이소코쿠스 산투스 배양균으로부터 에포싸일론 D의 대규모 분리 및 결정화, J. Nat. Products, 65:570-572(2002)(본 명세서에 그 전체가 참조로서 합체됨)에서 보고된 바와 같이 다음 단계인 정제 공정으로 제공하였다.
실시예 2: 마이토마이신을 함유하는 반응 혼합물로부터 수지의 분리
8100 L의 수확 배지를 2000 L의 메타놀 및 200 L의 XAD4 수지와 혼합하고 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 이어서, 현탁액을 수평 위치의 컬럼(1)에 측면 포트(3)를 통해 로딩하고 수지를 여과하였다. 컬럼(1)을 수직 위치로 이동시키고 1000 L의 정제수를 이용하여 반대 반향 분출로 세척하였다. 이어서, 생성물인 마미토마이신을 메카놀로 용리하고 수확 배지에 함유된 원래 활성 물질의 약 95%를 복구하였다. 계획된 복구는 용출액에서 생성물의 예상량을 수확 배지의 생성물(원래 활성 물질)의 양으로 나눈 양을 기초로 한다. 이하의 실시예들의 예상 수율도 유사하게 결정된다.
실시예 3: 마이토마이신을 함유하는 반응 혼합물로부터 수지의 분리
7800 L의 수확 배지를 2000 L의 메타놀 및 180 L의 XAD16 수지와 혼합하고 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 이어서, 현탁액을 수평 위치의 컬럼(1)에 측면 포트(3)를 통해 로딩하고 수지를 여과하였다. 컬럼(1)을 수직 위치로 이동시키고 1000 L의 정제수를 이용하여 반대 반향 분출로 세척하였다. 이어서, 생성물인 마미토마이신을 메카놀로 용리하였고, 수확 배지에 함유된 원래 활성 물질의 약 92%가 복구되었다.
실시예 4: 마이토마이신을 함유하는 반응 혼합물로부터 수지의 분리
2%(w/v)의 XAD7 수지에 직면하여 마이토마이신의 발효를 수행하였다. 발효 공정의 말미에, 배지를 수평 위치의 컬럼(1)에 측면 포트(3)를 통해 로딩하였다. 수지를 정제수로 세척하면서 소비된 배지를 제거하였다. 6개 컬럼 용적의 에틸 아세테이트를 이용하여 85%의 추출 수율로 생성물인 마이토마이신을 복구하였다.
실시예 5: 사이클로스포린을 함유하는 반응 혼합물로부터 수지의 분리
2850 L의 사이클로스포린 발효 배지를 350 L의 메타놀 및 200 L의 XAD16 수지와 혼합하고 실온에서 16 시간 동안 교반하였다. 이어서, 현탁액을 수평 위치의 컬럼(1)에 측면 포트(3)를 통해 로딩하고 수지를 여과하였다. 컬럼(1)을 수직 위치로 이동시키고 1000 L의 정제수를 이용하여 반대 반향 분출로 세척하였다. 이어서, 생성물인 사이클로스포린을 메카놀로 용리하였고, 수확 배지에 함유된 원래 활성 물질의 약 85%가 복구되었다.
실시예 6: 다우노루비신을 함유하는 반응 혼합물로부터 수지의 분리
발효 공정의 말미에서, 8500 L의 다우노루비신 수확 배지를 산성 상태로 30℃에서 20 시간 동안 교반 처리하였다. NaOH 용액에 의해 pH가 6이되었고, 200 L의 HP20 수지를 첨가하고 현탁액을 실온에서 추가적인 16 시간 동안 교반하였다. 이어서, 현탁액을 수평 위치의 컬럼(1)에 측면 포트(3)를 통해 로딩하여 여과하였다. 컬럼(1)을 수직 위치로 이동시키고 1000 L의 정제수를 이용하여 세척하였다. 이어서, 생성물인 다우노루비신을 아세톤으로 용리하였고, 수확 배지에 함유된 원래 활성 물질의 약 70%가 복구되었다.
실시예 7: 블레오마이신을 함유하는 반응 혼합물로부터 수지의 분리
10000 L의 발효 탱크에서 3%(w/v)의 HP20 수지에 직면하여 블레오마이신의 발효를 수행하였다. 발효 공정의 말미에, 배지를 수평 위치의 컬럼(1)에 측면 포트(3)를 통해 로딩하였다. 수지를 정제수로 세척하면서 소비된 배지를 제거하였다. 7개 컬럼 용적의 80:20(v/v)의 정제수/아세톤 혼합물을 이용하여 90%의 추출 수율로 생성물인 블레오마이신을 복구하였다.
실시예 8: 플루다라빈을 함유하는 반응 혼합물로부터 수지의 분리
1000 L의 스테인레스강 반응 장치에서, 2400 g의 2 플루오로아데닌을 400 L의 포스페이트 완충제/디메틸포마미드의 80:20(v/v) 혼합물에 7의 pH로 현탁하였다. 6000 g의 아라비노실 우라실(ARA-U)과 8400 g의 E.Coli NP25 세포 페이스트를 100 L의 XAD16 수지와 함께 첨가하였다. 이어서, 현탁액을 60℃에서 24 시간 동안 교반하고 수평 위치의 컬럼(1)을 이용하여 여과하여 소모된 박테리아 세균과 해방된 부산물을 제거하였다. 컬럼(1)을 수직 위치로 이동시키고 400 L의 정제수로 세척하였다. 이어서, 생성물인 플루다라빈을 90:10(v/v)의 디메틸포르마미드/정제수 혼합물로 용리시키고 추출물에 추가적인 물을 첨가하여 석출하였다.
Claims (43)
- 반응 혼합물로부터 수지를 분리하는 장치로서,회전 가능한 원통형 컬럼을 구비하고, 상기 원통형 컬럼의 각 단부에는 네트 스크린이 마련되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제1항에 있어서, 상기 원통형 컬럼의 각 단부에 있는 네트 스크린은 지지 격자에 끼워지는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제2항에 있어서, 각 지지 격자에는 플랜지가 마련되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 네트 스크린은 다수의 층을 포함하는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬럼은 반경 방향 축선을 중심으로 회전될 수 있는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제5항에 있어서, 상기 컬럼은 하나 이상의 부착점에 의해 지지 구조체에 장착되고, 상기 부착점은 반경 방향 축선 주위에서 컬럼의 회전을 가능하게 하는 것 인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제6항에 있어서, 상기 컬럼은 2개의 부착점에 의해 지지 구조체에 장착되고, 상기 부착점은 서로 직경 방향으로 반대측에 위치하여 반경 방향 축선 주위에서 컬럼의 회전을 가능하게 하는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제7항에 있어서, 상기 2개의 부착점은 컬럼의 외표면 상에 용접된 샤프트에 의해 각각 연결되고, 각 샤프트는 지지 구조체에 끼워지는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제8항에 있어서, 각 샤프트는 베어링 시스템을 통해 지지 구조체와 접촉되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제8항 또는 제9항에 있어서, 하나 이상의 샤프트는 모터에 연결되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 원통형 컬럼에는 실린더의 내측 부분과 연통하는 측면 포트가 마련되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제11항에 있어서, 상기 측면 포트는 실린더의 종방향 부분에 위치하는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제12항에 있어서, 상기 측면 포트는 대략 실린더의 종방향 부분의 중앙에 위치하는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 각 플랜지에는 실린더의 내측 부분과 연통하는 하나 이상의 입구/출구 포트가 마련되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 네트 스크린 또는 네트 스크린의 다수의 층은 흡착된 생성물과 함께 수지가 컬럼 내측에 유지되게 하고 반응 혼합물의 나머지가 통과되게 하는 메시 크기를 형성하는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 플랜지들 중 하나 또는 양자에는 처리 유체의 유동을 가능하게 하고 및/또는 기구류의 설치를 위한 추가 포트가 마련되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬럼에는 절연층이 마련되 는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제17항에 있어서, 상기 절연층은 재킷인 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬럼, 지지 구조체, 측면 포트, 입구/출구 포트, 플랜지 및 지지 격자는 금속 합금, 플라스틱, 법랑 코팅된(glass-lined) 물질 및 유리로 이루어지는 군에서 선택된 재료로 제조되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 컬럼, 지지 구조체, 측면 포트, 입구/출구 포트, 플랜지 및 지지 격자는 금속 합금으로 제조되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제20항에 있어서, 상기 금속 합금은 스테인레스강인 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 장치는 도 1 내지 도 4에 도시된 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 장치.
- 반응 혼합물로부터 수지를 분리하는 방법으로서,컬럼에 반응 혼합물을 로딩하는 단계와, 반응 혼합물로부터 수지를 여과하는 단계와, 수지를 세척하는 단계와, 수지로부터 생성물을 용리시키는 단계를 포함하고, 상기 수지는 전체 공정 중에 컬럼 내에 유지되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제23항에 있어서, (a)제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 장치의 원통형 컬럼에 생성물이 부착된 수지를 함유하는 반응 혼합물을 로딩하는 단계와,(b)부착된 생성물과 함께 수지를 여과하여 나머지 반응 혼합물을 폐기물로서 컬럼으로부터 제거하는 단계와,(c)부착된 생성물과 함께 수지를 제1 용제로 세척하는 단계와,(d)부착된 생성물을 수지로부터 제2 용제로 용리시키는 단계를 포함하고, 상기 수지는 단계 (b) 내지 (d) 동안에 컬럼 내에 유지되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 컬럼이 수평 위치에 있는 동안에 측면 포트를 통해 로딩되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여과는 수평 위치의 컬럼에 의해 수행되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폐기물은 하나 이상의 입구/출구 포트로부터 제거되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 폐기물은 2개의 입구/출구 포트로부터 제거되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 여과 단계 중에, 폐기물을 제거하도록 압력 또는 진공이 컬럼에 인가되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세척 단계(c)는 컬럼이 수직 위치에 있는 동안에 제1 용제를 최상측 입구/출구 포트를 통해 첨가함으로써 수행되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제24항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 용제는 선택된 임의의 유기 용제가 물 또는 선택된 임의의 완충 용액에 용해되거나 부분적으로 용해된다면, 물, 산성수, 염기수, 완충 용액, 유기 용제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 유기 용제는 아세톤, 메타놀, 에타놀, 이소프로페놀, 테트라하이드로푸란, 아세토니트릴, 디메틸포마미드, 디메틸설폭사이드, 에틸 아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제32항에 있어서, 상기 유기 용제는 메타놀인 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 제1 용제는 물인 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충 용액은 아세테이트, 카보네이트, 바이카보네이트, 포스페이트 및 암모늄에서 선택된 완충제를 포함하는 용액인 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제24항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용리 단계(d)는 컬럼이 수직 위치에 있는 동안에 최상측 입구/출구 포트를 통해 제2 용제를 첨가함으로써 수행되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제24항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 용제는 제1 용제, 물 과 혼합되지 않는 유기 용제 및 이들의 혼합물 중 어느 하나로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제37항에 있어서, 상기 물과 혼합되지 않는 유기 용제는 톨루엔 및 디클로로메탄으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부착된 생성물은 마크로라이드(macrolide), 폴리펩타이드(polypeptide), 글리코펩타이드(glycopeptide), 뉴클레오타이드(nucleotide) 및 안트라사이클라인(anthracycline)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 제24항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 부착된 생성물은 에포싸일론, 마이토마이신, 사이클로스포린, 다우노루비신, 블레오마이신 및 플루다라빈으로 이루어지는 군에서 선택되는 것인 반응 혼합물로부터 수지 분리 방법.
- 반응 혼합물로부터 수지를 분리하기 위한 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 장치의 용도.
- 제41항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 마크로라이드, 폴리펩타이드, 글리코펩타이드, 뉴클레오타이드 및 안트라사이클라인으로 이루어지는 군에서 선택되는 생성물을 포함하는 것인 용도.
- 제41항에 있어서, 상기 생성물은 에포싸일론, 마이토마이신, 사이클로스포린, 다우노루비신, 블레오마이신 및 플루다라빈으로부터 선택되는 것인 용도.
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