JP2002262855A - ベクター精製用装置及び方法 - Google Patents
ベクター精製用装置及び方法Info
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1017—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by filtration, e.g. using filters, frits, membranes
Abstract
(57)【要約】
【課題】 閉鎖系で連続して、培養液の濃縮操作等が実
施でき、かつ、高純度のベクターが得られるベクター精
製用装置及び方法を提供する。 【解決手段】 ベクター精製装置１において、ベクター
を含む菌を培養槽１０中の培養液で培養し、この培養液
を第１のＴＦＦ濾過膜１２で濾過して濃縮し、バッファ
ー槽１６からバッファー液を供給しながら、培養液とバ
ッファー液の混合液をＴＦＦ濾過膜１２で濾過して培養
液をバッファー液に交換する。アルカリ槽１８からアル
カリ液を供給して溶菌した菌を、第２のＴＦＦ濾過膜２
８に通して不要物を除去する。濃縮等のために遠心分離
機を使用しないで、ＴＦＦ濾過膜１２，２８を使用する
ので、一連の操作を閉鎖系で連続して実施できる。ま
た、界面活性剤で粗精製液を処理してベクターＤＮＡと
エンドトキシンを別々の層に分離してエンドトキシンを
除去する。
施でき、かつ、高純度のベクターが得られるベクター精
製用装置及び方法を提供する。 【解決手段】 ベクター精製装置１において、ベクター
を含む菌を培養槽１０中の培養液で培養し、この培養液
を第１のＴＦＦ濾過膜１２で濾過して濃縮し、バッファ
ー槽１６からバッファー液を供給しながら、培養液とバ
ッファー液の混合液をＴＦＦ濾過膜１２で濾過して培養
液をバッファー液に交換する。アルカリ槽１８からアル
カリ液を供給して溶菌した菌を、第２のＴＦＦ濾過膜２
８に通して不要物を除去する。濃縮等のために遠心分離
機を使用しないで、ＴＦＦ濾過膜１２，２８を使用する
ので、一連の操作を閉鎖系で連続して実施できる。ま
た、界面活性剤で粗精製液を処理してベクターＤＮＡと
エンドトキシンを別々の層に分離してエンドトキシンを
除去する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ベクターの精製に
用いる装置及び方法に関し、特に、宿主及び／又はベク
ターを含む液の濃縮、交換及び不要物除去する装置及び
方法に関する。
用いる装置及び方法に関し、特に、宿主及び／又はベク
ターを含む液の濃縮、交換及び不要物除去する装置及び
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の遺伝子工学業界の急速な発展に伴
い、高純度なベクターを大規模で操作する必要性が増加
している。しかし、高純度で大量のベクターを得るため
には、複雑な装置を使用して精製するため、時間がかか
った。また、操作が繁雑で、技術的な熟練が要求され
た。
い、高純度なベクターを大規模で操作する必要性が増加
している。しかし、高純度で大量のベクターを得るため
には、複雑な装置を使用して精製するため、時間がかか
った。また、操作が繁雑で、技術的な熟練が要求され
た。
【０００３】特に、従来、ベクターの精製過程で、ベク
ターを含む宿主を培養した液を濃縮するのに遠心分離機
を用いていた。このため、この培養液を閉鎖系で濃縮で
きず、また、濃縮のスケールアップが困難である等の問
題があった。例えば、「実験医学別冊、遺伝子工学ハン
ドブック」（羊土社出版、１９９１年３月２０日発行）
の２１頁〜２３頁には「ベクターＤＮＡの大量調製」に
ついて記載されていて、遠心分離を繰り返して実施する
ことが記載されている。さらに、従来は、ベクターＤＮ
Ａに含まれる、小タンパク質、小ＤＮＡ等の不要物を除
去するためにも、遠心分離機を用いていたため、同様の
問題があった。また、エンドトキシンは遠心分離機やイ
オン交換カラムでは除去できず、疎水性カラム等の特別
のカラムを用いて処理しなければならなかった。
ターを含む宿主を培養した液を濃縮するのに遠心分離機
を用いていた。このため、この培養液を閉鎖系で濃縮で
きず、また、濃縮のスケールアップが困難である等の問
題があった。例えば、「実験医学別冊、遺伝子工学ハン
ドブック」（羊土社出版、１９９１年３月２０日発行）
の２１頁〜２３頁には「ベクターＤＮＡの大量調製」に
ついて記載されていて、遠心分離を繰り返して実施する
ことが記載されている。さらに、従来は、ベクターＤＮ
Ａに含まれる、小タンパク質、小ＤＮＡ等の不要物を除
去するためにも、遠心分離機を用いていたため、同様の
問題があった。また、エンドトキシンは遠心分離機やイ
オン交換カラムでは除去できず、疎水性カラム等の特別
のカラムを用いて処理しなければならなかった。
【０００４】従って、閉鎖系で、宿主及び／又はベクタ
ーを含む液を濃縮、交換及び不要物除去できる装置又は
方法が求められていた。また、効果的にエンドトキシン
を除去できる装置又は方法が求められていた。さらに、
閉鎖系で、容易に、高純度のベクターを大量に得られる
装置又は方法が求められていた。
ーを含む液を濃縮、交換及び不要物除去できる装置又は
方法が求められていた。また、効果的にエンドトキシン
を除去できる装置又は方法が求められていた。さらに、
閉鎖系で、容易に、高純度のベクターを大量に得られる
装置又は方法が求められていた。
【０００５】一方、濾過膜の一種としてＴＦＦ（Tangen
tial Flow Filtration）濾過膜が知られていた。しか
し、ＴＦＦ濾過膜を、遺伝子工学の分野において、宿主
及び／又はベクターを含む液の濃縮又は不要物の除去等
に用いることは知られていなかった。
tial Flow Filtration）濾過膜が知られていた。しか
し、ＴＦＦ濾過膜を、遺伝子工学の分野において、宿主
及び／又はベクターを含む液の濃縮又は不要物の除去等
に用いることは知られていなかった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、閉鎖系で、宿主及び／又はベクターを含む液を濃
縮、交換及び不要物除去できる装置又は方法を提供する
ことである。
は、閉鎖系で、宿主及び／又はベクターを含む液を濃
縮、交換及び不要物除去できる装置又は方法を提供する
ことである。
【０００７】また、本発明の他の目的は、効果的にエン
ドトキシンを除去できる装置又は方法を提供することで
ある。
ドトキシンを除去できる装置又は方法を提供することで
ある。
【０００８】さらに、本発明の他の目的は、閉鎖系で、
容易に、高純度のベクターを大量に得られる装置又は方
法を提供することである。
容易に、高純度のベクターを大量に得られる装置又は方
法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは鋭
意検討した結果、ＴＦＦ濾過膜又は界面活性剤を、宿主
及び／又はベクターを含む液の濃縮、交換又は不要物の
除去に用いれば、これらの操作を容易にできることを見
出し、本発明を完成させた。しかも、本発明を用いたベ
クターの精製においては、得られるベクターが高純度で
あることを見出した。特に、本発明は、従来遺伝子操作
に使用されたことの無かったＴＦＦ濾過膜を初めて遺伝
子操作に効果的に使用するものである。
意検討した結果、ＴＦＦ濾過膜又は界面活性剤を、宿主
及び／又はベクターを含む液の濃縮、交換又は不要物の
除去に用いれば、これらの操作を容易にできることを見
出し、本発明を完成させた。しかも、本発明を用いたベ
クターの精製においては、得られるベクターが高純度で
あることを見出した。特に、本発明は、従来遺伝子操作
に使用されたことの無かったＴＦＦ濾過膜を初めて遺伝
子操作に効果的に使用するものである。
【００１０】本発明の第１の態様によれば、宿主及び／
又はベクターを含む液を濾過して、液を濃縮するＴＦＦ
濾過膜を備えることを特徴とする濃縮装置が提供され
る。
又はベクターを含む液を濾過して、液を濃縮するＴＦＦ
濾過膜を備えることを特徴とする濃縮装置が提供され
る。
【００１１】本発明の第２の態様によれば、第２の液を
供給しながら、宿主及び／又はベクターを含む第１の液
と第２の液の混合液を濾過することにより、第１の液を
第２の液に交換するＴＦＦ濾過膜を備えることを特徴と
する交換装置が提供される。
供給しながら、宿主及び／又はベクターを含む第１の液
と第２の液の混合液を濾過することにより、第１の液を
第２の液に交換するＴＦＦ濾過膜を備えることを特徴と
する交換装置が提供される。
【００１２】本発明の第３の態様によれば、宿主及び／
又はベクターを含む液から、不要物を除去するＴＦＦ濾
過膜を備えることを特徴とする不要物除去装置が提供さ
れる。
又はベクターを含む液から、不要物を除去するＴＦＦ濾
過膜を備えることを特徴とする不要物除去装置が提供さ
れる。
【００１３】本発明の第４の態様によれば、界面活性剤
を供給する界面活性剤供給部と、エンドトキシンを含む
ベクター粗精製液を収容し、界面活性剤と混合させて、
主にベクターＤＮＡを含む水層と、エンドトキシンを含
む界面活性剤層とに分離させる混合容器と、界面活性剤
層を排出する排出部とを備えることを特徴とするエンド
トキシン除去装置が提供される。
を供給する界面活性剤供給部と、エンドトキシンを含む
ベクター粗精製液を収容し、界面活性剤と混合させて、
主にベクターＤＮＡを含む水層と、エンドトキシンを含
む界面活性剤層とに分離させる混合容器と、界面活性剤
層を排出する排出部とを備えることを特徴とするエンド
トキシン除去装置が提供される。
【００１４】本発明の第５の態様によれば、ＴＦＦ濾過
膜を用いて、宿主及び／又はベクターを含む液を濾過し
て、液を濃縮することを特徴とする濃縮方法が提供され
る。
膜を用いて、宿主及び／又はベクターを含む液を濾過し
て、液を濃縮することを特徴とする濃縮方法が提供され
る。
【００１５】本発明の第６の態様によれば、ＴＦＦ濾過
膜を用いて、第２の液を供給しながら、宿主及び／又は
ベクターを含む第１の液と第２の液の混合液を濾過し
て、第１の液を第２の液に交換することを特徴とする交
換方法が提供される。
膜を用いて、第２の液を供給しながら、宿主及び／又は
ベクターを含む第１の液と第２の液の混合液を濾過し
て、第１の液を第２の液に交換することを特徴とする交
換方法が提供される。
【００１６】本発明の第７の態様によれば、ＴＦＦ濾過
膜を用いて、宿主及び／又はベクターを含む液から不要
物を除去することを特徴とする不要物除去方法が提供さ
れる。
膜を用いて、宿主及び／又はベクターを含む液から不要
物を除去することを特徴とする不要物除去方法が提供さ
れる。
【００１７】本発明の第８の態様によれば、界面活性剤
と、エンドトキシンを含むベクター粗精製液とを混合
し、主にベクターＤＮＡを含む水層と、エンドトキシン
を含む界面活性剤層とに分離させ、界面活性剤層を排出
する工程を含むことを特徴とするエンドトキシン除去方
法が提供される。
と、エンドトキシンを含むベクター粗精製液とを混合
し、主にベクターＤＮＡを含む水層と、エンドトキシン
を含む界面活性剤層とに分離させ、界面活性剤層を排出
する工程を含むことを特徴とするエンドトキシン除去方
法が提供される。
【００１８】本発明に使用するＴＦＦ濾過膜は、濾過膜
の一種で、膜に多数の孔を有する。この膜を用いるＴＦ
Ｆ濾過は、クロスフロー濾過ともいわれる。その作用機
構を図３に示す。図３に示すように、膜面に平行（図中
の左から右へ矢印Ａに示す方向）に液を流しながら、一
部の液又は特定物質を含む液を孔から透過させる（濾過
させる）（図中の下へ矢印Ｂに示す方向）。孔径によ
り、透過する物質又は透過しない物質の大きさが決ま
る。本発明において、孔径は使用目的に応じて適宜決め
ることができる。通常は、液を流す方向と、物質を孔か
ら透過させる方向は垂直であるが、本発明の場合、特に
この角度に限定されない。また、本発明に使用する宿主
は、特に限定されないが、その例として、遺伝子工学に
一般に良く使用される大腸菌、枯草等の菌、酵母を挙げ
られる。さらに、本発明に使用するベクターは、特に限
定されないが、その例として、遺伝子工学に一般に良く
使用されるプラスミド、ファージ、コスミドを挙げられ
る。
の一種で、膜に多数の孔を有する。この膜を用いるＴＦ
Ｆ濾過は、クロスフロー濾過ともいわれる。その作用機
構を図３に示す。図３に示すように、膜面に平行（図中
の左から右へ矢印Ａに示す方向）に液を流しながら、一
部の液又は特定物質を含む液を孔から透過させる（濾過
させる）（図中の下へ矢印Ｂに示す方向）。孔径によ
り、透過する物質又は透過しない物質の大きさが決ま
る。本発明において、孔径は使用目的に応じて適宜決め
ることができる。通常は、液を流す方向と、物質を孔か
ら透過させる方向は垂直であるが、本発明の場合、特に
この角度に限定されない。また、本発明に使用する宿主
は、特に限定されないが、その例として、遺伝子工学に
一般に良く使用される大腸菌、枯草等の菌、酵母を挙げ
られる。さらに、本発明に使用するベクターは、特に限
定されないが、その例として、遺伝子工学に一般に良く
使用されるプラスミド、ファージ、コスミドを挙げられ
る。
【００１９】本発明による濃縮装置及び方法は、例え
ば、ベクターを有する宿主を含む培養液、ベクター精製
過程における様々な処理液等の濃縮に使用できる。ま
た、宿主体中に目的とする内在物を有する宿主を含む液
の濃縮に使用できる。
ば、ベクターを有する宿主を含む培養液、ベクター精製
過程における様々な処理液等の濃縮に使用できる。ま
た、宿主体中に目的とする内在物を有する宿主を含む液
の濃縮に使用できる。
【００２０】さらに、本発明の交換装置及び方法では、
第１の液を所望の第２の液と交換できる。即ち、第１の
液に第２の液を供給しながらＴＦＦ濾過膜で濾過する
と、第１の液が第２の液と置き換わる。この交換装置及
び方法は、例えば、バッファー交換に使用できる。この
交換操作は、上記の濃縮操作と連続して又は同時に実施
できる。ベクターの精製の場合、宿主が培養液中に存在
するままでは、その後のベクター抽出処理に支障をきた
すので、培養液を通常中性域にあるバッファー液に変え
る必要がある。従って、本発明の濃縮及び交換装置及び
方法を使用すれば、培養液を濃縮した後連続してバッフ
ァー液と交換できる。
第１の液を所望の第２の液と交換できる。即ち、第１の
液に第２の液を供給しながらＴＦＦ濾過膜で濾過する
と、第１の液が第２の液と置き換わる。この交換装置及
び方法は、例えば、バッファー交換に使用できる。この
交換操作は、上記の濃縮操作と連続して又は同時に実施
できる。ベクターの精製の場合、宿主が培養液中に存在
するままでは、その後のベクター抽出処理に支障をきた
すので、培養液を通常中性域にあるバッファー液に変え
る必要がある。従って、本発明の濃縮及び交換装置及び
方法を使用すれば、培養液を濃縮した後連続してバッフ
ァー液と交換できる。
【００２１】本発明による不要物除去装置及び方法は、
例えば、デブリス、宿主由来のタンパク質、ＲＮＡ、ク
ロモソームＤＮＡ断片等の小タンパク質又は小ＤＮＡ、
エンドトキシン等の不要物の除去に使用できる。この不
要物除去操作は、上記の交換又は濃縮操作と連続して又
は同時に実施できる。
例えば、デブリス、宿主由来のタンパク質、ＲＮＡ、ク
ロモソームＤＮＡ断片等の小タンパク質又は小ＤＮＡ、
エンドトキシン等の不要物の除去に使用できる。この不
要物除去操作は、上記の交換又は濃縮操作と連続して又
は同時に実施できる。
【００２２】ベクターを精製するとき、従来は、遠心分
離機及びイオン交換カラムを用いてもエンドトキシンを
除去することはできず、疎水性カラム等の特別のカラム
で処理しなければならなかった。しかし、ＴＦＦ濾過膜
を用いれば、特別のカラムを使用しなくても、ベクター
粗精製物からエンドトキシンを除去できる。このとき、
エンドトキシンをベクターから解離させるために、ベク
ター粗精製物を非イオン性界面活性剤等の界面活性剤で
処理できる。
離機及びイオン交換カラムを用いてもエンドトキシンを
除去することはできず、疎水性カラム等の特別のカラム
で処理しなければならなかった。しかし、ＴＦＦ濾過膜
を用いれば、特別のカラムを使用しなくても、ベクター
粗精製物からエンドトキシンを除去できる。このとき、
エンドトキシンをベクターから解離させるために、ベク
ター粗精製物を非イオン性界面活性剤等の界面活性剤で
処理できる。
【００２３】本発明によるエンドトキシン除去装置及び
方法に使用する界面活性剤は、ベクター粗精製液と混ざ
って、水層と界面活性剤層の二層に分離する界面活性剤
である。主に、ベクターＤＮＡは水層に含まれ、エンド
トキシンは界面活性剤層に含まれる。界面活性剤層を除
くことにより、エンドトキシンを除くことができる。例
えば、本発明に使用する界面活性剤は、低温では、ベク
ター粗精製液と混ざって一層になり、高温では、水層と
界面活性剤層の二層に分離する界面活性剤である。この
ような界面活性剤の例として、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商
標）Ｘ１１４等の温度制御により二層化する非イオン性
界面活性剤が挙げられる。ＴｒｉｔｏｎＸ１１４の場
合、約４℃で粗精製液と混ざって一層になり、約６０℃
で二層化する。
方法に使用する界面活性剤は、ベクター粗精製液と混ざ
って、水層と界面活性剤層の二層に分離する界面活性剤
である。主に、ベクターＤＮＡは水層に含まれ、エンド
トキシンは界面活性剤層に含まれる。界面活性剤層を除
くことにより、エンドトキシンを除くことができる。例
えば、本発明に使用する界面活性剤は、低温では、ベク
ター粗精製液と混ざって一層になり、高温では、水層と
界面活性剤層の二層に分離する界面活性剤である。この
ような界面活性剤の例として、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商
標）Ｘ１１４等の温度制御により二層化する非イオン性
界面活性剤が挙げられる。ＴｒｉｔｏｎＸ１１４の場
合、約４℃で粗精製液と混ざって一層になり、約６０℃
で二層化する。
【００２４】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施の一形態を説
明するが、本発明の範囲はこの実施の形態に限定される
ものではない。 実施の形態１ 図１は、本発明によるプラスミド精製装置を示す図であ
る。この図において、１は菌体からプラスミドを精製し
て得るプラスミド精製装置、１０は培養液を含んでその
培養液中で菌を培養する培養槽、１２は培養液（第１の
液）を濃縮し、バッファー液（第２の液）に交換し、又
は不要物を除去する第１のＴＦＦ濾過膜（濃縮装置、交
換装置、不要物除去装置）、１１，１４，２２，２５，
３０は流路の開閉を行うバルブ、１６はバッファー液を
供給する第１のバッファー槽、１８はアルカリ液を供給
するアルカリ槽、２０は中和液を供給する中和槽、２４
はプラスミド粗精製液を収容するタンク、２６はカラム
用バッファー液を供給する第２のバッファー槽、２８は
粗精製液（第１の液）から不要物を除去し、カラム用バ
ッファー液（第２の液）に交換し、又は濃縮する第２の
ＴＦＦ濾過膜（濃縮装置、交換装置、不要物除去装
置）、２９は界面活性剤を供給する界面活性剤槽、３２
は粗精製プラスミドを精製するイオン交換カラム、３４
は精製プラスミドを滅菌する滅菌フィルター、３６はプ
ラスミドを収容するボトルである。
明するが、本発明の範囲はこの実施の形態に限定される
ものではない。 実施の形態１ 図１は、本発明によるプラスミド精製装置を示す図であ
る。この図において、１は菌体からプラスミドを精製し
て得るプラスミド精製装置、１０は培養液を含んでその
培養液中で菌を培養する培養槽、１２は培養液（第１の
液）を濃縮し、バッファー液（第２の液）に交換し、又
は不要物を除去する第１のＴＦＦ濾過膜（濃縮装置、交
換装置、不要物除去装置）、１１，１４，２２，２５，
３０は流路の開閉を行うバルブ、１６はバッファー液を
供給する第１のバッファー槽、１８はアルカリ液を供給
するアルカリ槽、２０は中和液を供給する中和槽、２４
はプラスミド粗精製液を収容するタンク、２６はカラム
用バッファー液を供給する第２のバッファー槽、２８は
粗精製液（第１の液）から不要物を除去し、カラム用バ
ッファー液（第２の液）に交換し、又は濃縮する第２の
ＴＦＦ濾過膜（濃縮装置、交換装置、不要物除去装
置）、２９は界面活性剤を供給する界面活性剤槽、３２
は粗精製プラスミドを精製するイオン交換カラム、３４
は精製プラスミドを滅菌する滅菌フィルター、３６はプ
ラスミドを収容するボトルである。
【００２５】ここで、培養槽は、宿主を生育させるため
に様々な条件を作り出すための装備を備えた容器であ
る。また、使用するバッファー液は、操作の目的を果た
すものであれば、特に限定されない。
に様々な条件を作り出すための装備を備えた容器であ
る。また、使用するバッファー液は、操作の目的を果た
すものであれば、特に限定されない。
【００２６】第１のＴＦＦ濾過膜１２の孔径は、限定は
されないが、好ましくは約２μｍ以下であり、より好ま
しくは約０．１μｍである。第１のＴＦＦ濾過膜１２
は、限定はされないが、好ましくは、親水性であり、タ
ンパク吸着が少なく、ｐＨ域が２〜１４である。また、
第２のＴＦＦ濾過膜２８の孔径は、限定はされないが、
好ましくは約１０ｎｍ〜約４ｎｍであり、より好ましく
は約５ｎｍである。第２のＴＦＦ濾過膜２８は、限定は
されないが、好ましくは、親水性であり、タンパク吸着
が少なく、ＤＮＡ非吸着である。
されないが、好ましくは約２μｍ以下であり、より好ま
しくは約０．１μｍである。第１のＴＦＦ濾過膜１２
は、限定はされないが、好ましくは、親水性であり、タ
ンパク吸着が少なく、ｐＨ域が２〜１４である。また、
第２のＴＦＦ濾過膜２８の孔径は、限定はされないが、
好ましくは約１０ｎｍ〜約４ｎｍであり、より好ましく
は約５ｎｍである。第２のＴＦＦ濾過膜２８は、限定は
されないが、好ましくは、親水性であり、タンパク吸着
が少なく、ＤＮＡ非吸着である。
【００２７】次に、動作について図２に示すフローチャ
ートを用いて説明する。まず、大腸菌を培養槽１０で大
量培養する（ステップ１）。次に、バルブ１１を開いて
大腸菌の菌体を含む培養液を第１のＴＦＦ濾過膜１２に
通す。図３はＴＦＦ濾過膜の作用機構を模式的に示す。
図３において、培養液は、左から右へ矢印Ａの方向へ流
れる。培養液中の菌体はＴＦＦ濾過膜１２を透過しない
で、一部の培養液だけが下へ矢印Ｂの方向へ透過する。
透過した培養液はバルブ１４を開いて廃棄する。このよ
うにして、培養液はＴＦＦ濾過膜１２を通ることにより
濃縮される（ステップ２）。
ートを用いて説明する。まず、大腸菌を培養槽１０で大
量培養する（ステップ１）。次に、バルブ１１を開いて
大腸菌の菌体を含む培養液を第１のＴＦＦ濾過膜１２に
通す。図３はＴＦＦ濾過膜の作用機構を模式的に示す。
図３において、培養液は、左から右へ矢印Ａの方向へ流
れる。培養液中の菌体はＴＦＦ濾過膜１２を透過しない
で、一部の培養液だけが下へ矢印Ｂの方向へ透過する。
透過した培養液はバルブ１４を開いて廃棄する。このよ
うにして、培養液はＴＦＦ濾過膜１２を通ることにより
濃縮される（ステップ２）。
【００２８】上記の濃縮工程により、培養液が濃縮され
たら、第１のバッファー槽１６からバッファー液が培養
槽１０に供給される。次に、バッファー液と濃縮培養液
の混合液を、第１のＴＦＦ濾過膜１２に通す。再度図３
を参照すると、混合液が矢印Ａの方向へ流れる間に、一
部の混合液がＴＦＦ濾過膜１２を矢印Ｂの方向へ透過す
る。バッファー液を供給しながら、ＴＦＦ濾過膜１２に
通すことにより、培養液からバッファー液に交換できる
（ステップ３）。さらに、バッファー液を第１のＴＦＦ
濾過膜１２を用いて濃縮する（ステップ４）。
たら、第１のバッファー槽１６からバッファー液が培養
槽１０に供給される。次に、バッファー液と濃縮培養液
の混合液を、第１のＴＦＦ濾過膜１２に通す。再度図３
を参照すると、混合液が矢印Ａの方向へ流れる間に、一
部の混合液がＴＦＦ濾過膜１２を矢印Ｂの方向へ透過す
る。バッファー液を供給しながら、ＴＦＦ濾過膜１２に
通すことにより、培養液からバッファー液に交換できる
（ステップ３）。さらに、バッファー液を第１のＴＦＦ
濾過膜１２を用いて濃縮する（ステップ４）。
【００２９】次に、アルカリ槽１８からアルカリ液を培
養槽１０に供給して、培養槽１０内にある大腸菌体を溶
菌する（ステップ５）。溶菌剤として、アルカリ液の他
にリポゾーム等を使用できる。アルカリ液は、ＳＤＳ、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉ
ｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１
４、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０を含むことがで
きる。
養槽１０に供給して、培養槽１０内にある大腸菌体を溶
菌する（ステップ５）。溶菌剤として、アルカリ液の他
にリポゾーム等を使用できる。アルカリ液は、ＳＤＳ、
Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、Ｔｗｅｅｎ８０、Ｔｒｉ
ｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１
４、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ４０を含むことがで
きる。
【００３０】次に、中和槽２０から酸性液を培養槽１０
に供給して、対象溶液を中和する（ステップ６）。さら
に、ＴＦＦ濾過膜１２に通してデブリスを除き、プラス
ミドの粗精製液を得る。
に供給して、対象溶液を中和する（ステップ６）。さら
に、ＴＦＦ濾過膜１２に通してデブリスを除き、プラス
ミドの粗精製液を得る。
【００３１】次に、バルブ２２を開いて、粗精製液をタ
ンク２４に流す。タンク２４から、粗精製液を、第２の
ＴＦＦ濾過膜２８に通過させる。再度図３を参照する
と、粗精製液が矢印Ａの方向へ流れる間に、菌体由来タ
ンパク質等の小タンパクや小サイズのＤＮＡ等の不要物
が第２のＴＦＦ濾過膜２８を矢印Ｂの方向へ透過する。
この不要物を含む濾液は廃棄する。その結果、不要物が
除去された、粗精製液が得られる（ステップ７）。さら
に、この粗精製液を第２のＴＦＦ濾過膜２８を用いて濃
縮する（ステップ８）。
ンク２４に流す。タンク２４から、粗精製液を、第２の
ＴＦＦ濾過膜２８に通過させる。再度図３を参照する
と、粗精製液が矢印Ａの方向へ流れる間に、菌体由来タ
ンパク質等の小タンパクや小サイズのＤＮＡ等の不要物
が第２のＴＦＦ濾過膜２８を矢印Ｂの方向へ透過する。
この不要物を含む濾液は廃棄する。その結果、不要物が
除去された、粗精製液が得られる（ステップ７）。さら
に、この粗精製液を第２のＴＦＦ濾過膜２８を用いて濃
縮する（ステップ８）。
【００３２】次に、温度制御機（図示せず）を用いてタ
ンク２４内を約４℃に保ちながら、界面活性剤槽２９か
ら非イオン性界面活性剤を、タンク２４内に供給して、
粗精製液と混合撹拌する。次に、温度制御機を用いてタ
ンク２４内の温度を約６０℃に上昇させて、上層のプラ
スミドＤＮＡを含む水層と、下層のエンドトキシンを含
む下層に分離させる。バルブ２５を開いて、下層の界面
活性剤層をタンク２４の下から排出してエンドトキシン
を除去する（ステップ９）。このとき、水層と界面活性
剤層の透過率が異なるため、バルブ２５に透過率を検知
するセンサーを付ければ、廃液の透過率の変化により、
バルブを自動的に開閉できる。
ンク２４内を約４℃に保ちながら、界面活性剤槽２９か
ら非イオン性界面活性剤を、タンク２４内に供給して、
粗精製液と混合撹拌する。次に、温度制御機を用いてタ
ンク２４内の温度を約６０℃に上昇させて、上層のプラ
スミドＤＮＡを含む水層と、下層のエンドトキシンを含
む下層に分離させる。バルブ２５を開いて、下層の界面
活性剤層をタンク２４の下から排出してエンドトキシン
を除去する（ステップ９）。このとき、水層と界面活性
剤層の透過率が異なるため、バルブ２５に透過率を検知
するセンサーを付ければ、廃液の透過率の変化により、
バルブを自動的に開閉できる。
【００３３】次に、タンク２４内に第２のバッファー槽
２６からカラムワーク用バッファー液を供給して、バッ
ファー液と粗精製液の混合液を、第２のＴＦＦ濾過膜２
８に通す。再度図３を参照すると、混合液が矢印Ａの方
向へ流れる間に、一部の混合液がＴＦＦ濾過膜２８を矢
印Ｂの方向へ透過する。カラムワーク用バッファー液を
供給しながら、ＴＦＦ濾過膜２８を通すことにより、粗
精製液を、カラムワーク用バッファー液に交換する（ス
テップ１０）。さらに、必要に応じて濃縮する。
２６からカラムワーク用バッファー液を供給して、バッ
ファー液と粗精製液の混合液を、第２のＴＦＦ濾過膜２
８に通す。再度図３を参照すると、混合液が矢印Ａの方
向へ流れる間に、一部の混合液がＴＦＦ濾過膜２８を矢
印Ｂの方向へ透過する。カラムワーク用バッファー液を
供給しながら、ＴＦＦ濾過膜２８を通すことにより、粗
精製液を、カラムワーク用バッファー液に交換する（ス
テップ１０）。さらに、必要に応じて濃縮する。
【００３４】次に、バルブ３０を開けて、粗精製液をイ
オン交換カラム３２に流して、プラスミドＤＮＡを精製
する（ステップ１１）。最後に、プラスミドＤＮＡを滅
菌フィルター３４に通して、ボトル３６に収容する。
オン交換カラム３２に流して、プラスミドＤＮＡを精製
する（ステップ１１）。最後に、プラスミドＤＮＡを滅
菌フィルター３４に通して、ボトル３６に収容する。
【００３５】このプラスミド精製装置１では、ＴＦＦ濾
過膜１２，２８を用いることにより、培養液の濃縮、バ
ッファー液の交換及びプラスミドＤＮＡの精製を、閉鎖
系で連続して短時間で実施できる。また、プラスミド精
製規模を容易に拡大することも縮小することもできる。
さらに、ＴＦＦ濾過膜１２，２８は、遠心分離機等に比
べるとコンパクトで安価であるので、装置全体の小型化
又はコストダウンが可能となる。また、１つのＴＦＦ濾
過膜で、培養液又は粗精製液の、濃縮、バッファー交換
又は不要物処理の複数の操作を実施できるので、一層、
装置の小型化又はコストダウンが可能となる。また、培
養液の濃縮等に従来使用していた遠心分離機を使用しな
いので、一連の操作を連続して完全閉鎖系で実施でき
る。
過膜１２，２８を用いることにより、培養液の濃縮、バ
ッファー液の交換及びプラスミドＤＮＡの精製を、閉鎖
系で連続して短時間で実施できる。また、プラスミド精
製規模を容易に拡大することも縮小することもできる。
さらに、ＴＦＦ濾過膜１２，２８は、遠心分離機等に比
べるとコンパクトで安価であるので、装置全体の小型化
又はコストダウンが可能となる。また、１つのＴＦＦ濾
過膜で、培養液又は粗精製液の、濃縮、バッファー交換
又は不要物処理の複数の操作を実施できるので、一層、
装置の小型化又はコストダウンが可能となる。また、培
養液の濃縮等に従来使用していた遠心分離機を使用しな
いので、一連の操作を連続して完全閉鎖系で実施でき
る。
【００３６】
【実施例】次に実施例により本発明をさらに詳細に説明
する。 実施例１ まず、プラスミド（ベータギャルプラスミドベクター）
を含む大腸菌を、１０ＬのＬＢ培地を含む培養槽で一晩
（１４時間）培養した。次に、この大腸菌の菌体を含む
培養液をＴＦＦ濾過膜（プロスタック、デュラポアＰＶ
ＤＦ０．１μｍ、ミリポア社）に通して、１Ｌに濃縮し
た。
する。 実施例１ まず、プラスミド（ベータギャルプラスミドベクター）
を含む大腸菌を、１０ＬのＬＢ培地を含む培養槽で一晩
（１４時間）培養した。次に、この大腸菌の菌体を含む
培養液をＴＦＦ濾過膜（プロスタック、デュラポアＰＶ
ＤＦ０．１μｍ、ミリポア社）に通して、１Ｌに濃縮し
た。
【００３７】次に、濃縮した培養液に１０Ｌのバッファ
ー液（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ２５ｍＭ、ｐｈ８．０、ＥＤＴＡ
１０ｍＭ）（以下、ＴＥという）を供給しながら、ＴＦ
Ｆ濾過膜を通して、培養液からバッファー液に交換し
た。さらに、このバッファー液を上記のＴＦＦ濾過膜
（プロスタック）を用いて１Ｌまで濃縮した。
ー液（Ｔｒｉｓ−Ｃｌ２５ｍＭ、ｐｈ８．０、ＥＤＴＡ
１０ｍＭ）（以下、ＴＥという）を供給しながら、ＴＦ
Ｆ濾過膜を通して、培養液からバッファー液に交換し
た。さらに、このバッファー液を上記のＴＦＦ濾過膜
（プロスタック）を用いて１Ｌまで濃縮した。
【００３８】次に、１Ｌの２００ｍＭＮａＯＨ溶液（１
％ＳＤＳ含有）を大腸菌体に添加して、大腸菌体を溶菌
した。その後、１Ｌの３．０Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．
５）を添加して中和した。
％ＳＤＳ含有）を大腸菌体に添加して、大腸菌体を溶菌
した。その後、１Ｌの３．０Ｍ酢酸カリウム（ｐＨ５．
５）を添加して中和した。
【００３９】中和した液を上記のＴＦＦ濾過膜（プロス
タック）に通して、デブリスを除き、３Ｌの濾過透過液
を回収した。回収した濾過透過液を、ＴＦＦ濾過膜（ペ
リコン２ＰＬＣＨＫ（１００ＫＤ再生セルロース）、ミ
リポア社）に通して、低分子タンパク質等を除去し、
０．５Ｌまで濃縮した。
タック）に通して、デブリスを除き、３Ｌの濾過透過液
を回収した。回収した濾過透過液を、ＴＦＦ濾過膜（ペ
リコン２ＰＬＣＨＫ（１００ＫＤ再生セルロース）、ミ
リポア社）に通して、低分子タンパク質等を除去し、
０．５Ｌまで濃縮した。
【００４０】次に、この濃縮液に、５％非イオン界面活
性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４）を含むＴＥ１０Ｌを供
給して、約４℃で撹拌し、その後、約６０℃まで温度を
上昇させ３０分以上静置して二層に分離した。下層のエ
ンドトキシンを含む界面活性剤層を廃棄してエンドトキ
シンを除去した。さらに、１０ＬのＴＥを供給しなが
ら、上記のＴＦＦ濾過膜（ペリコン２）に通してバッフ
ァー交換し、その後、０．５Ｌまで濃縮した。
性剤（ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４）を含むＴＥ１０Ｌを供
給して、約４℃で撹拌し、その後、約６０℃まで温度を
上昇させ３０分以上静置して二層に分離した。下層のエ
ンドトキシンを含む界面活性剤層を廃棄してエンドトキ
シンを除去した。さらに、１０ＬのＴＥを供給しなが
ら、上記のＴＦＦ濾過膜（ペリコン２）に通してバッフ
ァー交換し、その後、０．５Ｌまで濃縮した。
【００４１】次に、この粗精製液をイオン交換カラムに
流し、さらに、滅菌フィルターに通した。
流し、さらに、滅菌フィルターに通した。
【００４２】実施例２ 図１における第１のＴＦＦ濾過膜１２の孔のサイズにつ
いて検討した。大腸菌の菌体培養液を用いて、ＴＦＦ濾
過膜の０．４μｍ，０．２２μｍ，０．１μｍの３サイ
ズについて検討した。濃縮及びバッファー交換操作にお
いて３サイズ間で膜圧、濾過効率等に顕著な差は認めら
れず、３サイズ全てで菌体を濃縮することができた。溶
菌後のデブリスを除く処理では、ＴＦＦ濾過膜の３サイ
ズ間で膜圧、濾過効率等に顕著な差は認められなかった
が、０．１μｍサイズ濾過膜では、残留タンパクが他の
２サイズに比較して少なかった。
いて検討した。大腸菌の菌体培養液を用いて、ＴＦＦ濾
過膜の０．４μｍ，０．２２μｍ，０．１μｍの３サイ
ズについて検討した。濃縮及びバッファー交換操作にお
いて３サイズ間で膜圧、濾過効率等に顕著な差は認めら
れず、３サイズ全てで菌体を濃縮することができた。溶
菌後のデブリスを除く処理では、ＴＦＦ濾過膜の３サイ
ズ間で膜圧、濾過効率等に顕著な差は認められなかった
が、０．１μｍサイズ濾過膜では、残留タンパクが他の
２サイズに比較して少なかった。
【００４３】実施例３ 図１における第２のＴＦＦ濾過膜２８の孔のサイズにつ
いて検討した。１０００ＫＤａｌ，３００ＫＤａｌ，１
００ＫＤａｌ，５０ＫＤａｌ，１０ＫＤａｌの５サイズ
について検討した。０．１μｍサイズの第１のＴＦＦ濾
過膜で粗精製した溶液を、上記の５サイズの膜について
比較した。その結果、１０００ＫＤａｌ，３００ＫＤａ
ｌの膜による濃縮では、濾過透過液中にプラスミドＤＮ
Ａが認められ、１００ＫＤａｌ以下の膜ではプラスミド
ＤＮＡが認められなかった。従って、１００ＫＤａｌ以
下の膜の濃縮効率がより優れていることが確認された。
いて検討した。１０００ＫＤａｌ，３００ＫＤａｌ，１
００ＫＤａｌ，５０ＫＤａｌ，１０ＫＤａｌの５サイズ
について検討した。０．１μｍサイズの第１のＴＦＦ濾
過膜で粗精製した溶液を、上記の５サイズの膜について
比較した。その結果、１０００ＫＤａｌ，３００ＫＤａ
ｌの膜による濃縮では、濾過透過液中にプラスミドＤＮ
Ａが認められ、１００ＫＤａｌ以下の膜ではプラスミド
ＤＮＡが認められなかった。従って、１００ＫＤａｌ以
下の膜の濃縮効率がより優れていることが確認された。
【００４４】実施例４ 大腸菌培養液量を２Ｌ又は１８Ｌにしてスケールを変え
た以外は、実施例１と同様に精製を実施した。その結
果、実施例１と同様な効率でプラスミドＤＮＡを精製で
きた。従って、異なるスケールでも、効率的に精製でき
ることが確認できた。
た以外は、実施例１と同様に精製を実施した。その結
果、実施例１と同様な効率でプラスミドＤＮＡを精製で
きた。従って、異なるスケールでも、効率的に精製でき
ることが確認できた。
【００４５】試験例１ 検定モデルとして、ベータギャルプラスミドベクターを
使用して、実施例１と同様に、プラスミドＤＮＡを精製
した。このプラスミドＤＮＡをキャピラリーオートシー
クエンサーを用いてダイレクトシークエンス法にて元と
なるプラスミドＤＮＡと塩基配列に違いがないことを確
認した。
使用して、実施例１と同様に、プラスミドＤＮＡを精製
した。このプラスミドＤＮＡをキャピラリーオートシー
クエンサーを用いてダイレクトシークエンス法にて元と
なるプラスミドＤＮＡと塩基配列に違いがないことを確
認した。
【００４６】試験例２ 検定モデルとして、ベータギャルプラスミドベクターを
使用して、実施例１と同様に、プラスミドＤＮＡを精製
した。このプラスミドＤＮＡ中のエンドトキシン濃度を
ＬＡＬ比色定量キット（エンドポイント法）を使用して
吸光度測定し濃度測定した。エンドトキシン濃度は、Ｄ
ＮＡ１ｍｇ中に１０数ＥＵ単位であった。
使用して、実施例１と同様に、プラスミドＤＮＡを精製
した。このプラスミドＤＮＡ中のエンドトキシン濃度を
ＬＡＬ比色定量キット（エンドポイント法）を使用して
吸光度測定し濃度測定した。エンドトキシン濃度は、Ｄ
ＮＡ１ｍｇ中に１０数ＥＵ単位であった。
【００４７】試験例３ 検定モデルとして、ベータギャルプラスミドベクターを
使用して、実施例１と同様に、プラスミドＤＮＡを精製
した。このプラスミドＤＮＡを哺乳動物細胞（ＮＩＨ３
Ｔ３）へリポフェクチンにより遺伝子導入して発現の効
率を測定した。比較として、塩化セシウム超遠心法にて
精製したプラスミドＤＮＡを用いたが、本発明により精
製したプラスミドＤＮＡが遺伝子導入効率が約５０％程
度高いことが確認された。
使用して、実施例１と同様に、プラスミドＤＮＡを精製
した。このプラスミドＤＮＡを哺乳動物細胞（ＮＩＨ３
Ｔ３）へリポフェクチンにより遺伝子導入して発現の効
率を測定した。比較として、塩化セシウム超遠心法にて
精製したプラスミドＤＮＡを用いたが、本発明により精
製したプラスミドＤＮＡが遺伝子導入効率が約５０％程
度高いことが確認された。
【００４８】
【発明の効果】本発明の濃縮、交換及び不要物除去装置
及び方法によれば、宿主及び／又はベクターを含む液を
閉鎖系で容易に濃縮、交換及び不要物除去できる。ま
た、スケール変更が容易である。
及び方法によれば、宿主及び／又はベクターを含む液を
閉鎖系で容易に濃縮、交換及び不要物除去できる。ま
た、スケール変更が容易である。
【００４９】本発明のエンドトキシン除去装置及び方法
によれば、効果的にエンドトキシンを除去できる。
によれば、効果的にエンドトキシンを除去できる。
【００５０】本発明の上記の装置及び方法を組み合わせ
てベクターを精製すれば、閉鎖系で連続操作により、高
純度のベクターを大量に得られる。また、スケール変更
が容易である。
てベクターを精製すれば、閉鎖系で連続操作により、高
純度のベクターを大量に得られる。また、スケール変更
が容易である。
【図１】本発明の一実施形態によるプラスミド精製用装
置を示す図である。
置を示す図である。
【図２】本発明の一実施形態によるプラスミド精製用方
法を示すフローチャートである。
法を示すフローチャートである。
【図３】本発明に使用するＴＦＦ濾過膜の作用機構を模
式的に示す図である。
式的に示す図である。
１ プラスミド精製装置 １０ 培養槽 １２ 第１のＴＦＦ濾過膜（濃縮装置、交換装置、不要
物除去装置） ２９ 界面活性剤槽（界面活性剤供給部） ２５ バルブ（排出部） ２８ 第２のＴＦＦ濾過膜（濃縮装置、交換装置、不要
物除去装置） ２９ タンク（混合容器）
物除去装置） ２９ 界面活性剤槽（界面活性剤供給部） ２５ バルブ（排出部） ２８ 第２のＴＦＦ濾過膜（濃縮装置、交換装置、不要
物除去装置） ２９ タンク（混合容器）
フロントページの続き (71)出願人 301014085 株式会社先端医学生物科学研究所 沖縄県島尻郡大里村字大里2013 (72)発明者 新垣 榮 沖縄県中頭郡北中城村字屋宜原793番地 屋宜原テラスＹ−10 (72)発明者 長嶺 勝 沖縄県那覇市首里末吉町１丁目108番地９ 号 (72)発明者 喜久川 政直 沖縄県浦添市港川１丁目24番地10号 Ｆターム(参考） 4B024 AA19 CA01 DA06 EA04 GA30 4B029 AA23 AA27 BB01 BB20 CC01
Claims (8)
- 【請求項１】 宿主及び／又はベクターを含む液を濾過
して、前記液を濃縮するＴＦＦ濾過膜を備えることを特
徴とする濃縮装置。 - 【請求項２】 第２の液を供給しながら、宿主及び／又
はベクターを含む第１の液と前記第２の液の混合液を濾
過することにより、前記第１の液を前記第２の液に交換
するＴＦＦ濾過膜を備えることを特徴とする交換装置。 - 【請求項３】 宿主及び／又はベクターを含む液から、
不要物を除去するＴＦＦ濾過膜を備えることを特徴とす
る不要物除去装置。 - 【請求項４】 界面活性剤を供給する界面活性剤供給部
と、エンドトキシンを含むベクター粗精製液を収容し、
前記界面活性剤と混合させて、主にベクターＤＮＡを含
む水層と、エンドトキシンを含む界面活性剤層とに分離
させる混合容器と、 前記界面活性剤層を排出する排出部とを備えることを特
徴とするエンドトキシン除去装置。 - 【請求項５】 ＴＦＦ濾過膜を用いて、宿主及び／又は
ベクターを含む液を濾過して、前記液を濃縮することを
特徴とする濃縮方法。 - 【請求項６】 ＴＦＦ濾過膜を用いて、第２の液を供給
しながら、宿主及び／又はベクターを含む第１の液と前
記第２の液の混合液を濾過して、前記第１の液を前記第
２の液に交換することを特徴とする交換方法。 - 【請求項７】 ＴＦＦ濾過膜を用いて、宿主及び／又は
ベクターを含む液から不要物を除去することを特徴とす
る不要物除去方法。 - 【請求項８】 界面活性剤と、エンドトキシンを含むベ
クター粗精製液とを混合し、主にベクターＤＮＡを含む
水層と、エンドトキシンを含む界面活性剤層とに分離さ
せ、 前記界面活性剤層を排出する工程を含むことを特徴とす
るエンドトキシン除去方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001062404A JP3547715B2 (ja) | 2001-03-06 | 2001-03-06 | ベクター精製用装置及び方法 |
| US09/964,377 US6773913B2 (en) | 2001-03-06 | 2001-09-28 | Device and process for purifying vectors |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001062404A JP3547715B2 (ja) | 2001-03-06 | 2001-03-06 | ベクター精製用装置及び方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002262855A true JP2002262855A (ja) | 2002-09-17 |
| JP3547715B2 JP3547715B2 (ja) | 2004-07-28 |
Family
ID=18921546
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001062404A Expired - Lifetime JP3547715B2 (ja) | 2001-03-06 | 2001-03-06 | ベクター精製用装置及び方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6773913B2 (ja) |
| JP (1) | JP3547715B2 (ja) |
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| JP2012165764A (ja) * | 2006-07-14 | 2012-09-06 | Dsm Ip Assets Bv | 細胞を培養する改善された方法 |
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| EP2813220A3 (en) | 2010-04-09 | 2015-06-17 | Pacira Pharmaceuticals, Inc. | Method for formulating large diameter synthetic membrane vesicles |
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-
2001
- 2001-03-06 JP JP2001062404A patent/JP3547715B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-09-28 US US09/964,377 patent/US6773913B2/en not_active Expired - Fee Related
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