JPH10511000A - 発酵ブイヨンから水不溶性化合物を回収する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 水不溶性化合物を発酵ブイヨンから回収する新規な方法であって、興味ある化合物を濃縮し、可溶化しそしてダイアフィルトレーションする順次的工程を含み、しかもこれらの工程すべてが単一閉鎖再循環系を通じて行われて更なる下流の精製のために該化合物が回収される上記方法。

Description

【発明の詳細な説明】 発酵ブイヨンから水不溶性化合物を回収する方法 技術分野 本発明は、発酵ブイヨンから水不溶性化合物を回収する新規な方法を関する。 一層特に本発明は、発酵ブイヨンからシクロスポリンおよび他の価値ある商業用 生成物を回収する方法に関する。本発明の背景 発酵ブイヨンから価値ある水不溶性商用化合物を単離するために、種々の方法 が過去に用いられてきた。かかる化合物を単離するための伝統的技術は、水不溶 性活性成分を単離するための固液分離（例えば、濾過、遠心分離等）および活性 物質を回収するための引き続く固液抽出を用いる。例えば、ヘリの米国特許第４ ，１１７，１１８号および第４，２１５，１９９号は、発酵ブイヨンからシクロ スポリンＡおよびＢを単離する方法であって、遠心分離、均質化および相当する 回数の蒸発（即ち、濃縮）を伴う多段抽出（メタノール、エチレンクロライドお よび他の水非混和性有機溶媒を用いて）の工程を含む該方法を記載する。その後 、最終抽出物は、シリカゲルおよびセファデッ クス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）（登録商標）ＬＨ２０充填物を用いるクロマトグラフ ィー精製に付される。同様な処理操作が、ロバスタチン（抗高コレステロール血 症剤）およびタクロリムス（ＦＫ−５０６，免疫抑制剤）のような他のタイプの 水不溶性化合物を単離するために用いられる。これらの方法論は現在工業的規模 の発酵のために用いられているけれども、それらは典型的には、高エネルギー要 件を有する費用のかかる固液分離装置および溶媒抽出装置／蒸発装置／凝縮装置 を必要とする。加えて、かかる方法からの生成物回収収率は、多段操作に因り低 い。かくして、資本投下およびその後の生産コストは高い。 別の例として、ルダト等の特許（米国特許第５，２５６，５４７号）は、シク ロスポリンＡの生成および単離のための方法であって、懸濁液を形成するよう再 結晶化石膏またはカルサイトの粗粉のような濾過助剤と培養物を混合しそしてこ の混合物を濾過して湿潤バイオマスを得ることを含む該方法を記載する。該バイ オマスは次いで乾燥され、そして２〜３回低級カルボン酸エステルでまたはその 代わりに二酸化炭素のような超臨界ガスで抽出される。この抽出物は次いで脱脂 され、そしてシリカゲルまたはアルミナ酸化物を用いる調製用ＨＰＬＣによりク ロ マトグラフィーにかけられる。この方法は先行特許に開示されているものに対し て限られた利点しか呈さず、何故ならそれは依然複数の複雑で費用のかかる操作 の難点があるからである。 水性発酵ブイヨンを清澄化／濾過するための精密濾過（マイクロフィルトレー ション）（ＭＦ）または限外濾過（ＵＦ）のいずれかの使用が文献において確立 されているけれども、有機溶媒での抽出が、活性生成物を回収するための二次的 精製工程として遂行される。上記に記載したように、慣用の精製処理操作は、２ つの異なる単位操作即ち分離および抽出／蒸発を含む。一般に、水不溶性生成物 について、当該化合物が最初に大容量の水性発酵ブイヨンから単離され、そして 次いで反復的に該化合物を溶媒で抽出しそして該溶媒を蒸発させることにより精 製され、その結果該化合物は更に異なる溶媒で抽出されそして濃縮が達成される まで蒸発され得、しかして該濃縮から究極的精製が行われ得る。しかしながら、 反復的な抽出および蒸発は、この方法を大規模製造にとって非常にコストのかか るものにする。 本発明の格別の特徴は、最初の遠心分離および／または濾過工程後別々の抽出 および蒸発の工程の必要性を省く連続的処理 系を有することにある。この技術は、設計の簡単性、低減される資本および製造 コスト並びに増大される回収収率を含めて、先行技術の方法に対して多くの利点 を呈する。更に、伝統的方法とは異なり、本発明の全体的方法がオートメーショ ン化可能でかつ完全に収容され、しかしてこのことにより人員および環境の両方 共当該化合物への暴露は低減される。このことは、免疫抑制剤および他の効力の ある治療用化合物は高度に毒性であり得る点で重要な考慮事項である。本発明の要約 それ故、本発明の目的は、発酵ブイヨン由来の水不溶性化合物の回収方法を提 供することである。 本発明の別の目的は、シクロスポリンおよび他の薬物をそれらを含有する発酵 ブイヨンから回収する方法を提供することである。 本発明の別の目的は、発酵ブイヨンからのシクロスポリンおよび他の薬物の大 規模回収のための、コストの少ない方法を提供することである。 本発明の他の目的は、ここにおける開示から当業者に明らかであろう。 簡単に言うと、本発明は、原料発酵ブイヨンから水不溶性化合物を回収する方 法であって、次の工程即ち ａ．溶媒適合性の多孔性濾過膜を横切る接線濾過により該発酵ブイヨンを濃縮し て、該膜を横切る透過物と濃縮ブイヨンからなる滞留物とを生成させ、しかして 該水不溶性化合物は該滞留物中に保留され、しかも該滞留物を循環路に沿って連 続的に循環させて滞留物流を形成させかつ該原料ブイヨンのすべてが濃縮される まで該原料ブイヨンを該滞留物流中に供給し、 ｂ．該濃縮ブイヨンに溶媒を添加することにより該滞留物の該水不溶性化合物を 可溶化して、該化合物の溶液を生成させ、そして ｃ．該溶液を工程（ａ）の多孔質膜を通じて濾過またはダイアフィルトレーショ ンして、該多孔質膜を横切る溶媒透過物を生成させ、しかして該溶媒透過物は可 溶化された該化合物を含むことからなる上記方法に関する。 随意に、溶媒透過物は、更に、逆浸透または限外濾過膜を用いて濃縮されそし て当業者に知られたいずれかの方法により精製され得る。図面の簡単な記載 図１は、本発明の具体的態様の概略図を示す。本発明の詳細な記載 本発明の方法は、大規模発酵により生成される水不溶性化合物を回収すること に向けられる。ここにおいて用いられている“回収”は、興味ある化合物から非 化合物物質を除去する方法に言及し、そして過剰の流体を除去する（例えば、発 酵ブイヨンの除去による濃縮）および／または溶存もしくは不溶性不純物を除去 することを包含する。興味ある化合物から流体および不純物を除去することは該 化合物のいくらかの精製をもたらすことになるけれども、“回収する”はいかな る特定の精製度を達成することを要求しないということが留意されねばならない 。即ち、回収は、規定精製基準（国民薬品集、米国薬局方または欧州薬局方の規 格のような）を満たす化合物をもたらすことに必ずしもならない。むしろ、流体 および不純物の除去それ自体で、回収を達成するのに十分である。 本発明の使用に対する一つの条件は、当該化合物それ自体が発酵の停止時に発 酵ブイヨン中に不溶であるということである。ここにおいて用いられている“不 溶性化合物”は、液体もしく は気体中に分散された固体化合物またはかかる化合物のエマルジョンのいずれか に言及する。該化合物の不溶性は、該化合物それ自体の固有の性質からまたは溶 液のｐＨもしくはイオンの条件を調整する結果として生じ得る。例えば、シクロ スポリンのような免疫抑制剤は、典型的には、発酵条件下で不溶性生成物として 生成される。しかしながら、エリスロマイシンのような或る抗生物質化合物は、 典型的には、生成用有機体を培養するために用いられる増殖培地中に可溶である が、しかし発酵過程の終わりにブイヨンのｐＨをおおよそ８．７〜１１．０に増 大することにより不溶性にされ得る。しかしながら、化合物の不溶性が化合物そ れ自体にとって固有であろうがまたは特定の溶液条件から生じようが、当業者は 、本発明の方法が懸濁してまたはエマルジョンとして存在するいずれの水不溶性 化合物にも適用可能であることを容易に理解しよう。水不溶性化合物の例は、抗 生物質（エリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤのような）、免疫抑制剤（シクロ スポリンＡ、ＢおよびＧ、ラパマイシン、アスコマイシンまたはタクロリムスの ような）、成長ホルモン、抗高コレステロール血症剤（ロバスタチン、プラバス タチンまたはシンバスタチンのような）並びにそれらの全ての 中間体および／または誘導体も含むが、しかしそれらに制限されない。 発酵が遂行される様式は、発酵のいずれの公知の条件も利用され得る点で本発 明にとって重要でない。たいていの状況下で特に大規模工業的発酵について、培 養培地および発酵条件（有機体の菌株、接種物のタイプ、発酵時間、発酵温度等 ）は、所望化合物の最大収率をもたらすよう最適化される。シクロスポリンＡお よびＢの生成のための適当な発酵パラメーターの例は米国特許第４，１１７，１ １８号および第４，２１５，１９９号（ヘリ等）並びに第５，２５６，５４７号 （ルダト等）に記載されており、抗高コレステロール血症剤であるロバスタチン 、シンバスタチン、プラバスタチン等の生成のための適当な発酵パラメーターの 例は米国特許第４，２３１，９３８号（モナガン等）、第４，４４４，７８４号 （ホフマン等）および第４，３４６，２２７号（テラハラ等）に記載されており 、そして免疫抑制剤であるタクロリムス（ＦＫ−５０６）の生成のための適当な 発酵パラメーターの例は米国特許第４，８９４，３６６号（オクハラ等）に記載 されており、しかしてこれらのすべては参照によりここに組み込まれる。本発明 の目的にとって、発 酵過程それ自体は、大きさが１０リットルないし１００，０００リットルの範囲 にあるいずれの小規模または大規模の発酵装置においても遂行され得る。 発酵の停止時に、所望化合物を含有する発酵ブイヨンは、溶媒適合性（compat ible）の濾過膜と接触されそして接線濾過により濾過される。ここにおいて用い られている“接線濾過”（tangential filtration）は、液の大部分が濾過膜を 横切るように懸濁液（発酵ブイヨンのような）を実質的に連続な流れにてかつ加 圧下で多孔質濾過表面を横切って通過させる過程に言及する。濾過膜を横切る懸 濁液の部分は“透過物”(permeate)または“濾液”と称され、該膜を横切らない 懸濁液の部分は“滞留物”（retentate）または“濃縮物”と呼ばれる。興味あ る水不溶性化合物は、滞留物中に残存する。濾過過程は不溶性化合物からのすべ ての水性培地の完全な除去を要求しないこと、即ち滞留物はいくらかの残留発酵 ブイヨンも含み得ることが、留意されねばならない。しかしながら、残存水性培 地は、希釈効果の故、引き続く工程（下記に記載される。）において溶媒の可溶 化効率を低減し得る。このことは次いで、濃縮効率の同じ度合いを達成するため に一層多い溶媒の使用を必要とし得る。 濾過膜は、発酵過程の終わり時に存在する特定の溶液条件即ち高いもしくは低 い酸性度、高いもしくは低いアルカリ性度、高いもしくは低い温度、高圧等に耐 える（即ち、該条件下で劣化しない）ことの可能ないずれの物質からも作られ得 る。更に、同じ濾過膜が引き続く濾過工程（後記参照）において用いられるとき 、それは“溶媒適合性”でなければならず、即ち、濾過膜は、興味ある化合物を 可溶化する（下記に論じられるように）ために用いられるべき特定の溶媒と接触 される時分解に抵抗しなければならない。いずれの商業的に入手できる濾過膜も 接線濾過のために用いられ得るけれども、表面型または非深膜が好ましい。“表 面型”(surface-type)または“非深”(non-depth)膜は、膜の構造マトリックス 上でまたは内で微粒子を吸収または捕獲するよりむしろそれらの表面上で微粒子 を保持する膜である。適当な濾過膜は、セルロース、ポリスチレン、ポリスルホ ンまたはポリアミド製の有機溶媒適合性のポリマー構造体を含む。好ましい精密 濾過膜は、有機溶媒適合性のデュラポア(ＤＵＲＡＰＯＲＥ）（登録商標）ＨＶ ＰＰ膜（ベッドフォード，マサチューセッツ州０１７３０のミリポア・コーポレ ーション社により製造されている。）またはアルミナから成るセラミッ ク構造体である。最も好ましい精密濾過膜は、セラミックアルミナである。メン ブラロックス（ＭＥＭＢＲＡＬＯＸ）（登録商標）のようなセラミックアルミナ フィルターは、Ｕ．Ｓ．フィルター・コーポレーション社（１８１トーンヒルロ ード，ウァレンダーレ，ペンシルバニア州１５０８６−７５２７）から購入され 得る。適当な溶媒適合性の限外濾過膜は、やはりミリポア・コーポレーション社 から入手できるＰＺＨＫ膜（２００，０００分子量等級）を含む。 第１濾過膜の孔サイズは、発酵過程の終わりに発酵ブイヨン中に含有される所 望の不溶性化合物の微粒子サイズに従って選択される。疎水性の特質に因り、水 不溶性化合物は、自己凝集して水溶液中の微粒子を形成するかまたはそれらのそ れぞれの生成用有機体の構造物（例えば、細胞壁成分、菌糸体等）と一緒になっ て凝集構造体を形成する。かくして、本発明における膜の孔サイズは、所望の不 溶性微粒子を保持しかつ他のより小さいサイズの不溶性物質（存在するとき）並 びに可溶性化合物が水性透過物として通過するのを可能にするよう選択される。 ここにおいて用いられている“微粒子”は、自己凝集形態の所望不溶性化合物、 または不所望な不溶性の物質もしくは粒子と 物理的におよび／もしくは化学的に一緒になっている所望化合物に言及する。例 えば、シクロスポリンは、発酵過程の終わりに菌糸体と物理的に一緒になってい る。同様な現象が、免疫抑制剤タクロリムス（ＦＫ−５０６）について起こる。 かくして、これらの化合物について、孔サイズは、特定の化合物それ自体よりむ しろ菌糸体／化合物の微粒子を保持するよう選択される。 種々の孔サイズの濾過膜が、興味ある微粒子物質のサイズに依存して第１濾過 工程において用いられ得る。好ましい精密濾過膜（特に、シクロスポリン菌糸を 保持するために）は約０．０２〜５．０μｍの範囲の孔サイズを有し、一方有用 な限外濾過膜は約０．００１〜約０．０５μｍの範囲の孔サイズを有する。しか しながら、当業者はいずれの既知サイズの所望微粒子についても適当な膜を容易 に選択し得る、ということが理解される。更に、効率のために、不溶性微粒子を 依然保持する最大孔サイズを用いることが一般に好ましい（他の条件が等しいと すると、孔サイズが大きければ大きいほど、流束速度は一層速い故）。かくして 、精密濾過膜および限外濾過膜に加えて、より大きい孔の濾過膜が本発明内に意 図されており、但しそれらが興味ある化合物を保持しかつ接線濾過に適している ことを条 件とする。 随意に、他の濾過条件が、当該化合物を処理する効率を高めるようおよび処理 コストを最小にするよう最適化され得る（濾過膜が一旦選択されると）。例えば 、特定の孔サイズを有する膜が選択されると、膜横断圧、交差流速度および温度 のような他の濾過変数は、経験的に透過物流束速度と相関するだろう。透過速度 としても知られている透過物流束速度は、所与の膜表面積にわたっておよび所与 の時間にわたって濾過により生成された透過物の容量に言及する。この速度は、 典型的には、リットル／平方メートル／時（Ｌ／ｍ²／ｈｒ）の単位で表される 。濾過変数を調整することにより、透過物流束速度は、必要とされる膜の量を低 減するよう最適化され得る。例えば、発酵ブイヨンは、１０Ｌ／ｍ²／ｈｒの非 最適化透過物流束速度を有し得る。かくして、１０時間の期間にて１０００リッ トルのブイヨンの濾過（１００Ｌ／ｈｒ）は、１０ｍ²の膜を必要とするもので ある（１００Ｌ／１０ｍ²／ｈｒ＝１０Ｌ／ｍ²／ｈｒであるので）。しかしなが ら、透過物流束速度を１００Ｌ／ｍ²／ｈｒに最適化することにより、同じ結果 （即ち、１０時間の期間にて１０００リットルのブイヨンの濾過）を達成するた め にわずか１ｍ²の膜しか必要とされないものである。膜それ自体のコストは大容 量のブイヨンを処理する全体的コストに有意的に寄与し得るので、膜の表面積を 低減することは、スケールアップされる操作にとって特に重要な考慮事項である 。 最初の濾過後、滞留物は、随意に、更に水溶性不純物を除去するためにおおよ そ２〜４容量部の水（滞留物に関して）と共にダイアフィルトレーションされ得 る。ここにおいて用いられている“ダイアフィルトレーション”または“ダイア フィルトレーションする”は、接線濾過の特殊な場合即ち滞留物が接線濾過中全 般的に一定の容量に維持されるように透過速度におおよそ等しい速度にて液体を 滞留物に添加する過程に言及する。“ダイアフィルトレーションされた物”は透 過物に類似の用語であり、そしてダイアフィルトレーションの過程中膜を横切る 懸濁液の部分に言及する。ダイアフィルトレーション中、滞留物中の残留発酵ブ イヨンは連続的に希釈され、従ってダイアフィルトレーションはブイヨン中に残 存する残留可溶性汚染物から所望不溶性化合物を更に精製する。更に、固体含有 率に依存して、濃縮の程度およびダイアフィルトレーションされた物の容量は両 方共、膜の閉塞の可能性を最小にするよう、プロセス 時間を低減するようおよび生成物の生成量を最大にするよう変動され得る。 本発明の方法の第２工程において、滞留物は、興味ある化合物を可溶化するこ との可能な溶媒と混合されて溶媒スラリーを形成する。溶媒およびその容量は、 興味ある化合物を優先的に可溶化しおよび他の不溶性化合物の可溶化を最小にす るよう並びに滞留物中に存在する可溶性不純物の抽出を最小にするよう選択され る。本発明において有用な溶媒は、アルコール、低級エステル、低級エーテル、 低級ケトン並びにクロロホルムおよびメチルクロライドのような或る種の塩素化 炭化水素を含む。好ましい溶媒は低級のアルコール、エステル、エーテルおよび ケトンを含み、しかして“低級”は１〜６個の炭素の線状または分枝状炭化水素 に言及する。低級アルコールの例はメタノール、エタノール、プロパノール、ブ タノールおよびペンタノールであり、低級エステルの例はメチルアセテート、エ チルアセテートおよびメチルブタノエートであり、低級エーテルの例はメチルエ チルエーテル、ジエチルエーテルおよび２−メトキシペンタンであり、そして低 級ケトンの例はプロパノン、２−ブタノンおよび３−ペンタノンである。シクロ スポリンについて の好ましい溶媒は、低級第１級または第２級のアルコールおよびプロパノンを含 む。当業者は、興味ある化合物の化学的および物理的性質を知っているので適当 な溶媒を容易に選択し得る。 用いられる溶媒の量は、一般に、第１濾過の終わりに残存する滞留物の量に少 なくとも等しく、しかしこれを大きく越え得る。典型的には、２〜６倍容量が用 いられる。可溶化の効率は溶媒の容量に依存し、即ち、用いられる溶媒が多けれ ば多いほど、滞留物から回収される生成物は一層多くなる。しかしながら、更な る下流工程（下記に論じられているような）において濃縮される必要があり得る 透過物の容量を最小にするためにできる限り少ない容量の溶媒を用いることも好 ましい。 溶媒は、興味ある水不溶性化合物の大部分を可溶化するのに十分な期間滞留物 と混合される。この期間は０〜２４時間の範囲にあり得るけれども、典型的な期 間は約２時間ないし約６時間の範囲にある。しかしながら、最適な混合時間は存 在する滞留物の量、興味ある化合物、溶媒中におけるその溶解度および用いられ る溶媒の容量に依存して変動され得る、ということが理解される。 本方法の第３工程において、溶媒スラリーは、溶媒適合性の 多孔質濾過膜を通じて接線濾過により濾過される。濾過膜は好ましくは該方法の 第１工程において用いられたものと同じ濾過膜であるが、しかし新鮮なまたは異 なる濾過膜（但し、それが溶媒適合性であることを条件とする。）もまた用いら れ得る。所望化合物は今や溶媒中に溶解されているので、滞留物ではなく溶媒透 過物が濾過過程中集められる。スラリーは究極的には捨てられるけれども、透過 後にはスラリーは随意に、追加的溶媒と共にダイアフィルトレーションされ得る 。上記に記載された水性ダイアフィルトレーションと同様な様式にて、溶媒ダイ アフィルトレーションが、透過速度におおよそ等しい速度にて溶媒を残留スラリ ーに添加することにより達成される。この状況において、追加的溶媒は、スラリ ー中に残存する残留未可溶化化合物を更に抽出するよう働く。得られた後続的な 溶媒でダイアフィルトレーションされた物は溶媒透過物と一緒にされて、貯留溶 媒透過物を構成する。 貯留溶媒透過物の更なる濃縮が、随意に、前に用いられたものとは異なる孔サ イズを有する溶媒適合性膜に通じて接線濾過することにより達成され得る。この 工程において用いられる保持膜は、所望化合物をその微粒子（不溶性凝集物）サ イズより むしろ該化合物の可溶化サイズ（即ち、分子量）に基づいて保持するようかつ溶 媒が透過物（これは捨てられる。）として該膜を通過するのを可能にするよう選 択される。特定の分子量遮断（ＭＷＣＯ）を有する限外濾過（ＵＦ）膜、ナノフ ィルトレーション（ＮＦ）膜または逆浸透（ＲＯ）膜が、この目的のために用い られる。集められた透過物を濃縮するために適当なＵＦ／ＭＷＣＯ膜は、枠板型 （frame and plate type）またはスパイラル型の再生酢酸セルロース膜（ミリポ ア・コーポレーション社から商業的に入手できる。）を含む。適当なＮＦまたは ＲＯ／ＭＷＣＯ膜は、メンブラン・プロダクツ・キルヤット・ワイズマン・リミ テッド社（Ｐ．Ｏ．ボックス１３８，７６１０１レホヴォット，イスラエル国） により開発されそしてＬＣＩコーポレーション社（Ｐ．Ｏ．ボックス１６３４８ シャーロット，ノースカロライナ州２８２９７）により米国において販売されて いるＭＰＳシリーズのセルロ（ＳｅｌＲＯ）（商標）カートリッジを含み、また やはりミリポア・コーポレーション社から入手できるナノマックス（ＮＡＮＯＭ ＡＸ）（商標）シリーズの酢酸セルロースのスパイラル巻きカートリッジも含む 。 かかる膜での濃縮後、生成物は、随意に、更に結晶化または クロマトグラフィーにより処理され得る。クロマトグラフィーによる精製の場合 、溶液は、該溶液中に含有されている興味ある化合物を選択的に保持するクロマ トグラフィー媒質と接触され得る。典型的には、かかるクロマトグラフィー媒質 は、微孔質マトリックス（スチレンおよびジビニルベンゼンの共重合から製造さ れる。）または多孔質のシリカゲルもしくはアルミナ酸化物である。該マトリッ クスは、生成物供給物の所望成分を結合するのに十分大きい表面積を有すべきで ある。本発明において有用なクロマトグラフィー媒質は、ポリマーの充填物、支 持体または樹脂を含む。かかるクロマトグラフィー媒質の例は、セファロース（ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）（登録商標）、セファデックス（ＳＥＰＨＡＤＥＸ）（登 録商標）およびセファクリル（ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ）（登録商標）（８００セン テニアルアベニュー，Ｐ．Ｏ．ボックス１３２７，ピスキャタウェイ，ニュージ ャージー州０８８５５−１３２７のファーマシア・バイオテク・インコーポレー テッド社から入手できる。）、ドウェックス（ＤＯＷＥＸ）（登録商標）シリー ズの媒質（ミシガン州ミッドランドのダウ・ケミカルズ社から入手できる。）、 バイオ−レックス（ＢＩＯ−ＲＥＸ）（登録商標）、マクロプレ プ（ＭＡＣＲＯＰＲＥＰ）（登録商標）およびバイオ−ゲル（ＢＩＯ−ＧＥＬ） （登録商標）シリーズの媒質（８５Ａマークスドライブ，メルビル，ニューヨー ク州１１７４７のバイオラッド・ラボラトリーズ社から入手できる。）並びにテ ンタクル（Ｔｅｎｔａｃｌｅ）シリーズの充填物（３５０コロンビアストリート ，Ｐ．Ｏ．ボックス３５２，ウェイクフィールド，ロードアイランド州０２８８ ０のＥＭ・セパレーションズ・テクノロジー社から入手できる。）を含む。非官 能性ポリマー充填物の例は、トソハース社（インデペンデンス・モールウエスト ，フィラデルフィア，ペンシルバニア州１９１０５）から購入され得るアンバー クロム（ＡＭＢＥＲＣＨＲＯＭ）（商標）ＣＧ１６１−ｍである。 別の随意的工程として、濃縮化合物は、２回目にシリカゲルまたは逆相Ｃ８も しくはＣ１８充填物のような適当なクロマトグラフィー媒質でもって精製され得 る。かかる精製のために適当なクロマトグラフィー媒質は、当業者に周知である 。本方法の最終の随意的工程において、当該化合物は、別の有機溶媒中に抽出さ れ、濃縮されそして結晶化され得る。これらの結晶は次いで濾過または遠心分離 のいずれかにより分離されそして真 空下で乾燥されて、最終精製生成物が得られる。 好ましい具体的態様において特に大規模発酵について、所望水不溶性化合物の 単離は、図１において示されているような閉鎖循環系において成し遂げられる。 発酵ブイヨン（Ａ）は、第１入口（１）を経て、受槽（２）、受槽（２）の出口 （３）から濾過モジュール（７）の入口（６）まで延伸する第１連結パイプ（４ ）、発酵ブイヨン（原料または濃縮されたもの）を第１連結パイプ（４）を通じ てポンプ輸送するためのポンプ（５）、濾過モジュール（７）、濾過モジュール （７）内に収容された濾過膜（８）および濾過モジュール（７）の出口（９）か ら受槽（２）の第２入口（１１）まで延伸する第２パイプ（１０）からなる系中 に導入される。 操作中、原料発酵ブイヨン（Ａ）は最初に入口（１）を通じて受槽（２）に入 り、ポンプ（５）により発生された圧力下で第１連結パイプ（４）中にそしてそ れを通じて濾過モジュール（７）に流れる。濾過モジュール（７）内で、該ブイ ヨンは濾過膜（８）に接触する。このブイヨンは濾過膜（８）を横切って通って 接線濾過により濾過されて、出口（１２）を通じて捨てられる透過物（Ｂ）と滞 留物（Ｃ）とが生成される。滞留物 （Ｃ）は次いで、濾過モジュール（７）の出口（９）から受槽（２）の第２入口 （１１）まで延伸する第２連結パイプ（１０）に入る。濃縮ブイヨン（Ｃ）は受 槽（２）に入り、流入する未濃縮発酵ブイヨン（Ａ）と混合される。かくして、 循環するブイヨンは、一方向にてこの閉鎖系を流れる滞留物流を形成する。好ま しい具体的態様において、該系は、おおよそ３〜５０ｐｓｉの膜横断圧（ＴＭＰ ）下でおおよそ３０〜６０℃の制御温度にて発酵ブイヨンを循環するよう設計さ れる。該ブイヨンは、出発ブイヨン容積のおおよそ４分の１ないし２分の１が滞 留物として残存するまで閉鎖系を通じて循環される。 膜の閉塞（これはブイヨンの濃縮から生じる。）の問題を最小にするために、 系は、随意に、周期的に透過物を濾過要素を通じて逆方向に押しやるよう働く背 脈動機構を組み込むよう設計され得る。背脈動の結果として、汚染性層は、膜か ら持ち上げられそして滞留物の交差流中に運び去られる。背脈動機構の代わりに またはそれに加えて、系の設計には、当該技術において公知のいずれの供給およ びブリードの構成も組み込まれ得る。かかる構成は、膜上における滞留物の局部 的過度濃縮を防止するのを助ける。かくして、当業者は、いずれかの公知の方法 に より膜の閉塞を防止するよう系を容易に適合し得る。 記載された操作系はブイヨンの大容量を収容するようおよび処理コストを最小 にするよう設計変更および／または有意的に拡大され得る、ということも留意さ れるべきである。例えば、操作系は、数多くの濾過モジュール（並列にてまたは 直列にて）、複数のポンプ、導管および受槽でもって設計され得る。大きな操作 系は、部分的にまたは完全にオートメーション化され得る。更に、大きな操作系 には、全体の回収／精製機構の一部として更なる下流の精製工程が組み込まれ得 る。かくして、化学工学技術において通常の技能を有する各人は、利用できる資 源（即ち、装置および空間）に合致するようおよび製造コストを収めるよう操作 系を容易にスケールアップまたは適合し得る。 本方法の第２工程において、膜濾過モジュール（７）の透過物用出口（１２） は閉じられる。次いで、適当な溶媒が、原料発酵ブイヨンと同じ入口（１）を通 じて受槽（２）中の滞留物に添加される。該溶媒は、興味ある化合物と該化合物 のほとんどが溶解されるまで２〜６時間混合される。 次工程において、出口は再び開かれ、そして溶媒スラリーは閉鎖系全体を通じ て再循環されて第１工程の濾過膜に接触しそ してそれを通じて濾過される。水性透過物が当該化合物をほとんど含有していな い第１工程とは異なり、溶媒透過物は、該化合物のほとんどを溶存生成物として 含有する。それ故、それは、更なる下流処理のための貯槽中に連続的に集められ る。好ましい具体的態様において、滞留物流が再始動されると、一定のスラリー 容量を維持するよう新鮮な溶媒が受槽中に連続的に添加される。換言すると、溶 媒スラリーは新鮮な溶媒と共にダイアフィルトレーションされて、残留生成物は 液相中に連続的に抽出される。溶媒ダイアフィルトレーションされた物は、次い で別個の貯槽中の溶媒透過物と一緒にされる。 溶媒ダイアフィルトレーション工程の終わりに、新鮮な溶媒の添加は停止され 、そして溶媒スラリーは更に濾過のみにより濃縮される。この工程は、製造者が 使用済みスラリーを廃棄物として捨てる前にスラリーから生成物の最大量を回収 するのを可能にする。必要なら、嫌気性廃棄物処理にとって望ましくない残留溶 媒（有機溶媒の存在は通常ＢＯＤ（生物学的または生化学的酸素要求量）を増大 するので）を回収するために水が使用済みスラリー濃縮物に添加され得るように 、第４工程が設計され得る。また、この洗浄工程から回収された溶媒は、環境的 影響を最小にするために再循環または再使用のために蒸留され得る。その場合に は、これにより、下記の第１表に要約されている３サイクルの膜操作が完了され る。 貯留溶媒透過物（即ち、溶媒透過物プラス溶媒ダイアフィルトレーション物） は、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ナノマックス（ＮＡＮＯＭＡＸ）（商標） シリーズのスパイラル巻きＲＯカートリッジを用いて引き続いて濃縮される。そ の後で、この濃縮物は、再結晶またはクロマトグラフィーにより更に精製され得 る。典型的な例において、アンバークロム（ＡＭＢＥＲＣＨＲＯＭ）（商標）Ｃ Ｇ１６１−ｍカラムはある量の粗製シクロスポリン濃縮物を装填され、そしてそ の床はエタノール−水勾配（２０〜６０％）で溶離される。個々の画分は高性能 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ） により分析されて、化合物活性を含有する画分が決定される。クロマトグラフィ ーにかけられた溶液および／またはそれからの溶離剤のすべての貯留画分は、次 いで限外濾過または逆浸透のいずれかにより濃縮されそして更に当業者に知られ たいずれかの方法により更に精製され得る。濃縮溶液はまた、適当な溶媒で抽出 されて最終精製に備えられ得る。 本発明は今、例により更に記載される。これらの例は単に本発明の例示となる ものであり、決して本発明を限定するようには意図されていない。 実施例１ セラミック精密濾過およびメタノール抽出によるシクロスポリンの回収 ５．１％乾燥固体および１０％懸濁湿潤固体を含有する実験ランＮｏ．ＣＤ− ２６３からのシクロスポリン発酵ブイヨンお およそ１６０リットルを、受槽中に供給した。膜ユニットは２枚の０．２μｍロ ミコン（ＲＯＭＩＣＯＮ）（登録商標）（８５０メインストリート，ウィルミン グトン，マサチューセッツ州０１８８７のコッホ・メンブラン・システムズ・イ ンク社）セラミック精密濾過（ＣＭＦ）膜要素（直列にて）から成り、しかして 各々０．２ｍ²の表面積を有していた。入口圧を６０ｐｓｉに設定し、そして該 ブイヨンを系を通じて再循環させる一方、水溶性不純物を含有する水性透過物を 除去した。９０分後（この時間中、平均透過物流束速度は１８３Ｌ／ｍ²／ｈｒ であった。）、容量はおおよそ５０リットルに濃縮された。次いで、新鮮な水を 透過速度と同じ速度にて受槽に添加して、水および関連不純物の除去を続行した 。透過物流束速度は、おおよそ１５０Ｌ／ｍ²／ｈｒであると測定された。おお よそ１５５リットルの透過物およびダイアフィルトレーションされた物を、集め そしてＨＰＬＣによりサンプリングした。このサンプルにおいて、シクロスポリ ン活性はほとんど検出されなかった。 第２工程として、５０リットルの濃縮ブイヨン（ダイアフィルトレーションさ れたもの）を含有する受槽に１００リットルのメタノールを添加し、膜に対する 弁を閉じ、そしてスラリー を２時間混合した。ＣＭＦユニットを再始動させ、そして溶存生成物を膜により 分離し（即ち、透過物として）そして生成物槽中に集めた。透過物流束速度は６ ０ｐｓｉ（入口）および３２ｐｓｉ（出口）の圧力下で１０５Ｌ／ｍ²／ｈｒに て始まり、そしてゆっくりと３６Ｌ／ｍ²／ｈｒまで下がった。圧力を次いでお およそ８０ｐｓｉ（入口）および５５ｐｓｉ（出口）に増大する一方、温度を２ ８〜３０℃に維持した。スラリーを１００リットルに濃縮した後、２０リットル の洗浄用メタノールを添加した（シクロスポリンの収率を増大させるために）。 ＨＰＬＣにより決定して、約２７グラム（６４％）のシクロスポリンが回収され 、一方１５グラム（３６％）がメタノール洗浄後滞留物中に依然存在していた。 実施例２ セラミック精密濾過およびメタノール／エチルアセテート抽出によるシクロスポ リンの回収 ４．６％乾燥固体を含有する実験ランＮｏ．ＣＤ−２６５からのシクロスポリ ン発酵ブイヨンおおよそ８リットルを、受槽中に供給した。膜ユニットは、０． １２ｍ²の表面積を有する１枚の０．２μｍミリポア（Ｍｉｌｌｐｏｒｅ）セラ フロ（Ｃ ＥＲＡＦＬＯ）（登録商標）セラミック精密濾過（ＣＭＦ）膜要素から成ってい た。出口圧を２０〜３０ｐｓｉにそして入口圧を５０〜５５ｐｓｉに設定した。 該ブイヨンを系を通じて再循環させる一方、水溶性不純物を含有する水性透過物 を除去した。膜を横切る初期透過物流束速度は４５０Ｌ／ｍ²／ｈｒであり、そ してゆっくりと３０分の濾過後１００Ｌ／ｍ²／ｈｒに低減していた。容量はお およそ２リットルに濃縮され、そして追加の８リットルの新鮮なブイヨンを添加 しそして更におおよそ２リットルに濃縮した。透過物流束速度は、約５０Ｌ／ｍ² ／ｈｒに低減した。次いで、総量１２リットルの蒸留水を２リットルのアリコ ートにて透過速度と同じ速度で槽に添加して（ダイアフィルトレーション）、水 および関連不純物の除去を続行した。流束速度は、おおよそ５０〜６５Ｌ／ｍ² ／ｈｒであると測定された。 第２工程として、膜に対する弁を閉じそして２リットルのメタノールを受槽に 添加し、次いでスラリーを２時間混合した。追加の２リットルのメタノール／エ チルアセテート（５０／５０ｖ／ｖ）を添加した後、ＣＭＦユニットを再始動さ せた。メタノール／エチルアセテート溶媒中に溶解されたシクロスポリ ン生成物を膜を通じてダイアフィルトレーションし、そして生成物槽中に集めた 。流束速度は４８ｐｓｉ（入口）および２６ｐｓｉ（出口）の圧力下で７５Ｌ／ ｍ²／ｈｒにて始まり、そしてゆっくりと総量１６リットルのメタノール／エチ ルアセテートでもってのダイアフィルトレーション時に１５５Ｌ／ｍ²／ｈｒま で増大した。溶媒ダイアフィルトレーション中温度は制御せず、そして２８〜３ ６℃の間で変動した。 実施例３ ニロ（Ｎｉｒｏ）（登録商標）０．０５μｍセラミック膜を用いるシクロスポリ ンＡのメタノール抽出 １１．３％乾燥固体および２６％懸濁湿潤固体を含有する実験ランＮｏ．ＣＤ −２６８からのシクロスポリン発酵ブイヨンおおよそ１４０リットルを、受槽中 に供給した。膜ユニットは、０．３ｍ²の表面積および６ミリメートル（ｍｍ） 直径の流路を有する１の０．０５μｍニロ（Ｎｉｒｏ）（登録商標）セラミック 精密濾過（ＣＭＦ）膜要素から成っていた。入口圧を６０ｐｓｉに設定し、そし て該ブイヨンを系を通じて再循環させる一方、水溶性不純物を含有する水性透過 物を除去した。膜を横切る初期透過物流束速度は２４６Ｌ／ｍ²／ｈｒであり、 そしてゆっく りと９０分後４８Ｌ／ｍ²／ｈｒまで下がっていた。ブイヨンの容量はおおよそ ５８リットルに濃縮され、次いで７２リットルの蒸留水を受槽に添加して水およ び関連不純物の除去を続行した。透過物流束速度は、希釈効果に因りおおよそ２ ２０〜２８０Ｌ／ｍ²／ｈｒに増大した。希釈ブイヨンを４０リットルに濃縮し た後、追加の９０リットルの蒸留水を添加してブイヨンの洗浄を続行した。集め られた透過物は、ＨＰＬＣにより分析されそしてほとんど活性を示さなかった（ おおよそ０．００２グラム／ＬのシクロスポリンＡ）。ブイヨン（滞留物）が３ ８リットルに濃縮された時、セラミックユニットを停止し、そして９２リットル のメタノールを添加しそしておおよそ１４時間混合してシクロスポリンをアルコ ール相中に溶解させた。 ＣＭＦユニットを再始動させ、そしてメタノール透過物中の溶存生成物を膜に より分離しそして生成物槽中に集めた。溶媒透過物流束速度は６８〜７０ｐｓｉ （入口）および３８〜４０ｐｓｉ（出口）の圧力下で５０Ｌ／ｍ²／ｈｒにて始 まり、そしてゆっくりと１４Ｌ／ｍ²／ｈｒまで下がった。温度は３５℃にて始 まり、そして再循環により発生された熱のためにゆっくりと約５０℃まで増大し た。生成物を含有する総量７０リット ルのメタノールを、更なる処理のために集めた。 実施例４ ニロ（Ｎｉｒｏ）（登録商標）０．０５ｍセラミック膜を用いるシクロスポリン Ａのエタノール抽出 実験ランＮｏ．１０２からの発酵ブイヨンおおよそ３０，５００Ｌを受槽中ポ ンプ輸送し、しかして該受槽は直列のニロ（Ｎｉｒｏ）（登録商標）セラミック 精密濾過（ＣＭＦ）モジュール（この系のために、総計６０ｍ²の表面積を有す る０．０５μｍ膜が収容されている。）に供給した（各々４枚を含有する４つの 再循環ループ）。膜横断圧をおおよそ５〜１５ｐｓｉに制御し、そして供給物温 度を３５℃ないし４５℃に制御した。透過物流束速度は、２３Ｌ／ｍ²／ｈｒな いし６２Ｌ／ｍ²／ｈｒの範囲にあった。物質は９，０００Ｌに濃縮され、そし ておおよそ２４，０００Ｌの水を伴った。透過物流束速度は、４４Ｌ／ｍ²／ｈ ｒなし７０Ｌ／ｍ²／ｈｒの範囲にあった。物質を８，１００Ｌの最終容量に濃 縮した。次いでおおよそ１０，９００Ｌの特別変性３Ａ等級エチルアルコールを 濃縮物に添加し、そして３５℃ないし４０℃に２時間加熱した。溶媒スラリーを 追加の１９，０００Ｌの特別変性３Ａ等級エチルアルコー ルと共にダイアフィルトレーションした。スラリーはおおよそ６，５００Ｌの最 終容量に濃縮され、そしてＨＰＬＣにより決定して５％未満の原料ブイヨン活性 を含有していた。おおよそ３５，０００Ｌの溶媒透過物が集められ、そして引き 続いて以下の実施例５に記載されているように逆浸透により濃縮された。 実施例５ ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）ナノマックス（ＮＡＮＯＭＡＸ）（商標）−５ ０逆浸透膜を用いるシクロスポリンＡの濃縮 実験ランＮｏ．１０２からのシクロスポリン富化エタノール溶液おおよそ３５ ，０００Ｌが、１８０ｍ²の総表面積のナノマックス（ＮＡＮＯＭＡＸ）（商標 ）−５０膜を含むミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）逆浸透ユニットに供給された 。該膜は７０％までのエタノール（重量により）に適合性であるので、供給物流 を、逆浸透ユニットに供給するに先立って水で部分的に希釈しそして濾過により 清澄化した。物質を供給物槽から高圧多段ポンプにポンプ輸送した。生成物を１ ２０〜１７０Ｌ／ｍｉｎの交差流速度にて膜を横切ってポンプ輸送し、そして滞 留物を供給物槽に戻した。膜横断圧を典型的には５００ｐｓｉに制御すると共に 、温度を３９〜４７℃に制御した。透過物流 束速度は、３．３〜１５．３Ｌ／ｍ²／ｈｒの範囲にあった。逆浸透からの透過 物は残余のシクロスポリン活性しか含有しておらず、捨てられた。 実施例６ ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）１０００ＭＷＣＯ ＰＬＡＣシリーズ限外濾過 膜を用いるシクロスポリンＡの更なる濃縮 発酵ブイヨン（実験ランＮｏ．ＣＤ−２７３）のセラミック精密濾過からのシ クロスポリンＡ含有メタノール透過物おおよそ２０リットルを、ミリポア（Ｍｉ ｌｌｉｐｏｒｅ）プロスタック（ＰＲＯＳＴＡＫ）（商標）限外濾過系の供給物 槽中に入れた。約１，０００のＭＷＣＯを有する０．９３ｍ²のＰＬＡＣ再生セ ルロース膜１枚を、接線流用の板枠型モジュールにおいて用いた。流れ温度を、 冷却水を備えた熱交換器を用いて２８〜３０℃に維持した。入口圧および出口圧 をそれぞれおおよそ８０ｐｓｉおよび６８ｐｓｉに制御し、そして膜横断圧（Ｔ ＭＰ）を約５５ｐｓｉに制御した。透過物流束速度は１１．６Ｌ／ｍ²／ｈｒに て始まり、そして５倍の濃縮後（即ち、４リットルの最終滞留物）８．４Ｌ／ｍ² ／ｈｒにて終わった。生 成物は滞留物中に保持され、そしてメタノールは透過物中に除去された。この膜 濃縮工程についての生成物の典型的な収率は約９４％であって、６％の生成物が 透過物中に損失した。その後、系を新鮮なメタノールでおよび次いで蒸留水でフ ラッシュおよび清浄にして、初期流束速度が回復された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 1/34 Ｃ０７Ｋ 1/34 7/64 7/64 Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｐ 17/02 17/06 17/06 21/00 21/00 Ａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 原料発酵ブイヨンから水不溶性化合物を回収する方法であって、 ａ．溶媒適合性の多孔性濾過膜を横切る接線濾過により該発酵ブイヨンを濃縮し て、該膜を横切る透過物と該濃縮ブイヨンからなる滞留物とを生成させ、しかし て該水不溶性化合物は該滞留物中に保留され、しかも該滞留物を循環路に沿って 連続的に循環させて滞留物流を形成させかつ該原料ブイヨンのすべてが濃縮され るまで該原料ブイヨンを該滞留物流中に供給し、 ｂ．該濃縮ブイヨンに溶媒を添加することにより該滞留物の該水不溶性化合物を 可溶化して、該化合物の溶液を生成させ、そして ｃ．該溶液を工程（ａ）の該濾過膜を通じて濾過またはダイアフィルトレーショ ンして、該濾過膜を横切る溶媒透過物を生成させ、しかして該溶媒透過物は該可 溶化化合物を含む 工程からなる上記方法。 ２． 該化合物が、免疫抑制剤、マクロライド系抗生物質、抗高コレステロー ル血症剤、シクロスポリン並びにそれらの誘 導体および中間体から成る群から選択される、請求の範囲第１項の方法。 ３． 該化合物が、シクロスポリンＡ、シクロスポリンＢ、シクロスポリンＧ 、ラパマイシン、アスコマイシンおよびタクロリムスから選択された免疫抑制剤 である、請求の範囲第２項の方法。 ４． 該免疫抑制剤がシクロスポリンＡである、請求の範囲第３項の方法。 ５． 該化合物が、ロバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチンおよびフ ルバスタチンから選択された抗高コレステロール血症剤である、請求の範囲第２ 項の方法。 ６． 該化合物が、エリスロマイシンＡ、Ｂ、ＣおよびＤから選択されたマク ロライド系抗生物質である、請求の範囲第２項の方法。 ７． 該濾過膜が約０．００１μｍないし約５．０μｍの孔サイズを有する、 請求の範囲第１項の方法。 ８． 該濾過膜が約０．００１μｍないし約０．０５μｍの孔サイズを有する 、請求の範囲第１項の方法。 ９． 該濾過膜が、セルロース、ポリスチレン、ポリスルホ ンおよびポリアミドから成る群から選択される、請求の範囲第１項の方法。 １０． 該濾過膜がセラミックアルミナである、請求の範囲第１項の方法。 １１． 該濾過膜が約０．０５μｍないし約５．０μｍの孔サイズを有する、 請求の範囲第１０項の方法。 １２． 工程ｂの該溶媒が、低級アルコール、低級エステル、低級エーテルお よび低級ケトンから成る群から選択される、請求の範囲第１項の方法。 １３． 該溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノール から選択されたアルコールである、請求の範囲第１２項の方法。 １４． 工程（ｂ）において該化合物を可溶化するに先立って、該濃縮ブイヨ ンを工程（ａ）の該濾過膜を介してダイアフィルトレーションする工程を更に含 む、請求の範囲第１項の方法。 １５． 該溶媒透過物を逆浸透または限外濾過膜にて濃縮する工程を更に含む 、請求の範囲第１項の方法。