JP4818561B2 - クロスフロー精密濾過による封入体の精製 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、高度に濃厚化された粒状物（粒子）含有溶液中の封入体(inclusion body)（屈折性物体）を濃縮及び／又は精製する方法であって、封入体を含有する液体（溶液及び懸濁液を含む）を、１又はそれ以上の半透膜（semi-permeable membranes）に対して接線方向に案内し、封入体は膜の後方に留めさせ、相対的により小さな分子量の物質には膜を通過させ及び／又は膜に吸着させて、濃縮（濃厚化）された及び／又は精製された封入体液（溶液及び懸濁液を含む）を得る方法に関する。同様にして、封入体懸濁液から細胞壁粒状物が除かれる。本発明は更に、懸濁液中の封入体を濃縮及び／又は精製するため、並びに封入体製剤から細胞壁粒状物を除くためにクロスフロー精密濾過装置(crossflow microfiltration unit)を使用することにも関する。
【０００２】
本発明は、高度に濃厚化された粒状物含有液（溶液及び懸濁液を含む）中の封入体を濃縮及び／又は精製する方法、封入体含有液から細胞壁粒状物を除去する方法、並びに、封入体含有液中の封入体を濃縮及び／又は精製するため、並びに封入体製剤から細胞壁粒状物を除くためにクロスフロー精密濾過装置を使用することに関する。
【０００３】
用語の定義
「封入体（屈折性物体）」は、Escherichia coli中の異種又は同種タンパク質を高度に圧出する場合にしばしば形成され、リボソーム及びタンパク質生合成の酵素、核酸、高度に集合したタンパク質からなる。封入体は電子密度の高い非晶質の粒状物であって、細胞質とは区別される境界を有している（Schoemaker JM et al.(1985)：EMBO J4：775-780）。封入体が形成される際、種々の相互作用によって、その他の種々の汚染物質、例えば、エンドトキシン(endotoxin)、細胞崩壊物(debris)及び脂質を二次的に吸着させ（又は吸収する）可能性がある（Marston FAO(1986)：Biochem.J.240：1-12）。
【０００４】
「バイオマス(biomass)」とは、本発明に関して、細胞溶解産物(lysate)中に生じる種々の高分子量及び低分子量成分の総和を示す。特に、細胞崩壊物（細胞壁粒状物）と封入体との割合によって、更に核酸、エンドトキシン、可溶性タンパク質及び低分子量成分などの成分も含めて、濾過すべき物質の物理化学的特性が決定される。バイオマス濃厚物(concentrations)（又は濃縮物）の情報は、細胞溶解前における湿潤状態の細胞重量の濃度に常に基づく。これをバイオマス当量と称する。
【０００５】
「膜間差圧(transmembrane pressure)」（ＴＭＰ）は、
【数１】
ＴＭＰ＝(入口圧力＋出口圧力)／２−透過圧力 ［バール］
で表される。「入口圧力」は、保持液入口（カセットの入口開口部）における圧力である。「出口圧力」は、保持液出口（カセットの出口開口部）における圧力である。「透過圧力」は、透過液（濾液）出口の圧力である。
【０００６】
「透過率、トランスミッション(transmission)」は、本発明に関して、膜を通して透過液中へ可溶性成分を取り出すことを意味する。このために、濾過の間の種々の時間（Ｘ）にて保持液(retentate)及び透過液(permeate)からサンプルを採取し、遠心処理（１４０００×ｇ、１５分）して、可溶性の上澄みを、適度に希釈した後、２８０ｎｍにて光度測定（２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ)の測定)を行う。各時間Ｘにおける透過液のＯＤ２８０データ（ＯＤ２８０(透過液(Ｘ))）を、以下の式：
【数２】
透過率＝ＯＤ２８０(透過液(Ｘ))／ＯＤ２８０(保持液(Ｘ))×１００
に基づいて、各時間Ｘにおける保持液のＯＤ２８０データ（ＯＤ２８０(保持液(Ｘ)))に関連付ける。透過率は、一般に、ダイアフィルトレーション(diafiltration)の間で変化する。最初は、膜には吸着成分が付着しておらず、被覆層も形成されていない。従って、濾過を開始した時点での透過率は、定義により１００％である。しかし、濾過の間で、徐々に被覆層が形成され、これは可溶性成分が膜を通って透過物の中へ移動するのを妨害するので、透過率は一般に低下する。従って、透過率は全体での平均として（平均透過率）表現することができる。
【０００７】
「除去率(removal)」は、本発明に関して、保持液から可溶性成分を除くことを意味する。この事項に関して、ダイアフィルトレーションの間の種々の時間（Ｘ）にて保持液から試料を取り出し、適切な希釈を行った後、遠心処理（１４０００×ｇ、１５分）された可溶性の上澄み(supernatant)を、２８０ｎｍにて光度的測定（２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ)の測定)を行う。ＯＤ２８０データ（ＯＤ２８０(透過液(Ｘ))）を、保持液中に最初から存在していた値である可溶性上澄みのＯＤ２８０値に、式：
【数３】
除去率＝１００−(ＯＤ２８０(保持液(Ｘ))／ＯＤ２８０(保持液(０))×１００）
によって関連付ける。除去率は、一般に、ダイアフィルトレーションの最後まで最大値に近づく。従って、このデータは、可溶性成分の達成した最大除去率を表す。
【０００８】
従来の技術
タンパク質の化学において、封入体の精製方法は経験的なものであった。従来技術における既知の実験室的方法において、得られる生物学的物質（例えば、E.coli細菌細胞）は、例えば、溶解(lysis)(一般に、リゾチーム(lysozyme)による酵素的溶解、超音波処理又は高圧均質化が用いられる）の後で遠心処理され、得られる沈殿物（一般に、封入体及び非溶解細胞、例えば細胞外被及び細胞壁フラグメントを含む）は、沈殿作用を利用する緩衝液により洗浄されるか、又はその代わりとしてのクロスフロー精密濾過に付される。沈殿プロセスは、一般に、封入体を細胞から放出させた後の精製に用いられている（例えば、Schoner RGら(1985年)：Biotechnology 3：151-154頁；Sharma SKら(1986年)：J.Biotechnol.4：119〜124頁）が、この方法はラージスケールでは問題を生じるおそれがある（Forman SMら(1994年)：J.Membr.Sci.48：263〜279頁）。封入体は、所望する純度までクロスフロー精密濾過を利用して洗浄することができる（Meagher MMら(1994年)：Biotechnol. Bioeng.43：969〜977頁；Forman SMら(1990年)：J.Membr.Sci.48：263〜279頁）。
【０００９】
封入体の平均粒子寸法は、発現される(expressed)特定のターゲットタンパク質、使用される培地、発現システム(expressed system)、宿主種(host strain)などに依存し、ヒト成長ホルモン(human growth hormone)についての０.０７μｍ（Blum Pら(1992年)：Bio/Technology 10：301〜304頁）から、β−ラクタマーゼ(lactamase)についての１.５μｍ（Bowden GAら(1991年)：Bio/Technology 9：725〜730頁）までの範囲をとり得る。文献からのその他の例には、１.２６μｍ（±１.２μｍ）の粒子直径のプロキモシン(prochymosin)封入体、及び０.８１μｍ（±０.４μｍ）の粒子直径のインターフェロン（Taylor Gら(1986年)：Bio/Technology 4：553〜557頁）がある。しかしながら、細胞壁崩壊物は、溶解プロセスに応じて、０.０５μｍ〜１μｍの範囲の粒子寸法を有する（Bailey SM及びMeagher MM(1997年)：Biotechnol. Bioeng. 56(3)：304-310頁）。更に、溶解の程度も粗ホモジェネート(crude homogenate)中の粒子寸法分布に影響を及ぼす。従って、多くの粗ホモジェネートは、封入体、細胞壁崩壊物及び非溶解細胞とオーバーラップする粒子寸法分布を有している。
【００１０】
Formanらは、濾過しようとする生成物溶液中の増加するバイオマス濃度と透過流束（又は透過液フラックス(permeate flux))との間の対数的関係を規定している。即ち、濾過しようとする生成物溶液中の初期バイオマス濃度が増大すると、透過流束は急速に低下するのである。Formanらは、０.４５μｍの排除限界を有するDurapore膜(Millipore)について、２５ｇ／ｌ（２．５％）バイオマス当量にて１４ｌ／ｈｍ２、５０ｇ／ｌ（５％）バイオマス当量にて１２ｌ／ｈｍ２、並びに１００ｇ／ｌ（１０％）バイオマス当量にて８ｌ／ｈｍ２以下という最大透過流束を規定している。これらの実験における膜のバイオマス負荷(load)は、約１．４ｋｇの湿潤細胞塊当量(wet cell mass equivalent)／ｍ２であった。生成物溶液中における所定のバイオマス濃度で、透過流束をＴＭＰの急激な上昇を生じさせる特定の限度まで増大させると、膜の細孔に詰まり(fouling)が生じる。逆に言えば、所定のＴＭＰにおける透過流束は濾過時間を通して降下する。
【００１１】
他の研究グループ（Bailey SM及びMeagher MM（1997年))：J.Membr.Sci.131：29-38頁）は、ポリスルホン中空繊維モジュール又はポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）カセット・モジュールの場合、４〜６％（４０〜６０ｇ／ｌ）のバイオマス負荷であっても、時間の経過に従って透過率及び透過流束は低下すること、及びこれはカオトロピック剤(chaotropic agent)、例えばグアニジンヒドロクロリドを添加することによってより顕著になることを述べている。
【００１２】
Maegher及び共同研究者（Maegher MMら(1994年)：Biotechnol. Bioeng. 43：969-977頁）は、Durapore膜（ポリエーテルスルホン、０.１μｍ）で、ＩＬ−２封入体を精製することについて同様の結果を報告している。保持液中の７％（７０ｇ／ｌ）湿潤細胞塊当量のバイオマス濃度にて、タンパク質透過率及び透過流束（２０〜１０ｌ／ｈｍ２）の両者が濾過時間を通して顕著に低下し、これは膜被覆層の生成及び圧縮のためであるとされていた。膜へのタンパク質の吸着は、タンパク質溶液及び膜自体の両者の物理化学的特性に依存する。
【００１３】
このように、従来技術においては、一定の操作パラメーター（圧力、透過流束、保持液流れ）及び非常に高いバイオマス濃度にて封入体溶液を濾過することができる既知の方法はなかったのである。多くの濾過サイクルにわたって特徴的な濾過パラメーターの再現性に関する直接的な情報を、文献には見出すことができない。封入体を含む懸濁液を高度に精製するためにクロスフロー精密濾過プロセスを工業的規模に適用することはこれまでは妨げられていた。
【００１４】
発明の主題
本発明の目的は、クロスフロー精密濾過に基づく精製及び濃縮方法であって、簡単な手法にて、１つ及び多くの濾過サイクルの間に、一定の操作パラメーターにより工業的に妥当な量の封入体を精製する方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、特に変性したターゲットタンパク質の再フォールディング(refolding)及びクロマトグラフィー的最終精製によって、その後の工程にて、工業的に妥当な収率での再現性が達成されるように、細胞壁粒状物及び他の低分子量成分の濃度を低下させることである。
【００１５】
第１の要旨において、本発明は、溶液中の封入体を精製及び／又は濃縮する方法であって、タンパク質封入体含有液を１又はそれ以上の半透膜に対して接線方向に導き、膜は封入体を留め、比較的小さな分子量若しくは粒子直径を有する成分若しくは物質には膜を通過させて、濃縮された及び／又は精製された封入体溶液を得ることを特徴とする方法に関する。
【００１６】
もう１つの要旨において、本発明は、封入体含有製剤から細胞壁粒子を除去する方法であって、封入体含有製剤を１又はそれ以上の半透膜に対して接線方向に導き、封入体は膜に留めさせ、比較的小さな分子量若しくは粒子直径を有する成分若しくは物質には膜を通過及び／又は吸着させて、粒状物が本質的に除かれた封入体溶液を得ることを特徴とする方法に関する。
【００１７】
本発明の方法によって、クロスフロー精密濾過装置を用いて封入体を精製及び濃縮することができることが見出された。この点に関して、驚くべき新しい事項は、
出発製剤中の可溶性及び粒状物成分（バイオマス）が高負荷である場合であっても、被覆層を形成して濾過能力を低減させたり及び／又は膜を閉塞させたりすることなく、安定な操作ポイントにて封入体を濾過することができるということである。今日まで、保持液中で達成し得るバイオマス濃度は低かった。しかしながら、高いバイオマス濃度の場合には、保持液チャンネルの閉塞は、濾過サイクル中又は複数の操作サイクルでの操作ポイントの変化が増大する原因となり、保持液フロー及び透過流束が着実に低下する原因となっていた。複数のサイクルの後で、達成され得る透過流束は、経済的に魅力がある操作をもたらすことができない。このように閉塞される膜の清浄化は、複雑であって、通常は完全なものではないということが見出されている。
【００１８】
一方で、膜のバイオマス負荷が低い場合には、膜の閉塞を比較的生じにくいが、特に工業的に妥当な規模において、極端に大きな濾過面積が必要とされ、このことはクロスフロー精密濾過工程の経済性に負の効果（マイナス要因）となっている。
【００１９】
従って、クロスフロー精密濾過はこれまで、工業的に妥当な規模で及び高いバイオマス濃度にて、封入体製剤の精製及び濃縮に用いられていなかった。
【００２０】
しかしながら、本発明に用いられる変性セルロースハイドレート膜カセットによれば、驚くべきことに、出発製剤中の可溶性及び粒状物成分（バイオマス）の高負荷であっても、被覆層が生成することによって膜を閉塞したり及び／又は濾過能力を低下させることなく、安定な操作ポイントにて封入体の濾過を容易に行うことができる。安定な操作ポイントは、驚くべきことに、多くの濾過サイクルにわたって保たれる。
【００２１】
本発明の方法は、５０ｇ／ｌから２５００ｇ／ｌの範囲、好ましくは５００ｇ／ｌから１５００ｇ／ｌの範囲の高いバイオマス濃度にて、封入体を精製及び／又は濃縮する。膜のカットオフ(cut-off)の選択は、封入体の粒子寸法分布及び平均粒子直径に依存する。本発明において用いられる変性された親水性セルロースハイドレート膜について、カットオフは０．１〜０．６５μｍ、好ましくは０．４５μｍである。
【００２２】
種々の体積を処理することができ、好ましくは１〜１０００００ｌの体積、特に好ましくは１〜２０００ｌの体積を有する溶液を処理することができる。好適な圧力条件下で、封入体を含有する溶液を膜に案内し、オーバーフロー圧を膜間差圧（ＴＭＰ(transmembrane pressure)、又は膜間差圧）よりも大きくすることが好ましい。操作圧力は、好ましくは０．０５〜３バールのＴＭＰ、特に好ましくは０．１〜０．５バールのＴＭＰ、最も好ましくは０．２〜０．４バールのＴＭＰであって、オーバーフロー圧は膜間差圧よりも大きい。保持液フローは広い範囲で変動してよく、乱流（レイノルズ数３０以上、Meyeroltmanns F(1991年)：BioTech 5:918-921）が達成されるように選択されるべきである。乱流が達成される際の最小保持液フローを小さくするため、本発明に用いられる膜モジュールの中にスクリーンが形成される。そのようなスクリーンの形状及び幾何学的配置は、本願と同日に出願された「Crossflow filter cassettes in the form of improved wide-gap modules」という発明の名称の別の特許出願の中で説明されている。
【００２３】
バイオマス負荷について、保持液中のバイオマス濃度（ｇ／ｌ単位）と、面積−比バイオマス負荷（ｋｇ／ｍ２）との間での区別をする必要がある。保持液中のバイオマス濃度は、非常に高い場合には、保持液チャンネルの閉塞をもたらし得るが、一方、面積−比バイオマス負荷は、非常に高い場合には、膜への被覆層の生成（詰まり(fouling))をもたらす。
【００２４】
本発明に用いられる変性セルロースハイドレートモジュールの保持液バイオマス濃度は１５００ｇ／ｌまでであり得るが、面積−比バイオマス負荷は３０ｋｇ／ｍ２まで上昇し得る。
【００２５】
本発明の方法は、温度を変化させて実施することもできる。４℃〜４０℃の温度範囲が好ましい。
【００２６】
本発明のもう１つの要旨では、本発明によって調製される封入体製剤は、出発物質と対比して、著しく低いエンドトキシン汚染を示す。
【００２７】
実施例
ここに記載する実験では、種々の方法で変性され、変性セルロースハイドレートで形成されたヒドロザルト(Hydrosart)（登録商標）膜（Sartorius AG、ドイツ）を有するスクリーン・チャンネル・モジュールを用いた。各モジュールは、マトリックスの幾何学的形態に実質的な差異がある。ヒドロザルト（登録商標）膜は、０．１μｍ、０．２μｍ、０．４５μｍ及び０．６５μｍの排除限界のものが市販されている。
【００２８】
【表１】
使用したヒドロザルト・モジュールの特性データ
【００２９】
１．出発溶液の調製
従来技術における発酵技術（Riesenbergら、1990年：Appl.Microbiol.Biotechnol.34：77-82頁）によって、封入体の形態（例えば、インターロイキン−4 R121D Y124D）で、ターゲットタンパク質を含有するE. Coli W3110細胞塊を調製した。酵素的溶解（リゾチーム(lysozyme)１ｍｇ／ｇ乾燥細胞塊）の後、標準的ホモジナイザー（Bran&Luebbe、ドイツ）を用いて３０〜４０％の湿潤バイオマス濃度にて細胞を粉砕した。使用した緩衝液は、５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）であった。５００バールで３つの均質化サイクルにて機械的細胞溶解を達成した。溶解の程度は、画像解析(image analysis)を用いて測定して、約８０〜９０％であった。得られた粗ホモジェネートは、分離装置（Westfalia、ドイツ）を用いて引き続いて濃縮し、乾燥物質全体をスラッジで集めた。続いて、流動性の沈殿を液体窒素中で冷凍ペレット化(cryopelleted)し、更なる濾過実験に用いるまで−７０℃にて貯蔵した。
上述の方法を用いて、粗ホモジェネートの３つの独立したバッチを調製し、更に使用するまで−７０℃にて冷凍ペレットとして貯蔵した。
【００３０】
２．クロスフロー精密濾過後のエンドトキシン除去の測定
European Pharmacopoeia（Pharm. Eur.）によるリムルス（カブトガニ）変形細胞分解産物（limulus amoebocyte lysate）プロセスを用いて、封入体含有溶液（ダイアフィルトレーション前の保持液、ダイアフィルトレーション後の保持液）及び透過液全体の試料を分析した。エンドトキシンの試験は、エンドトキシン含有溶液をリムルス変形細胞分解産物溶液（ＬＡＬ溶液）に添加することによって混合物をゲル化する「solid gel」プロセスに基づいて行った。ゲルの生成は数段階でカスケード式に進行する凝固に基づいて行われる。
【００３１】
３．標準ヒドロザルト（登録商標）モジュールを有するクロスフロー精密濾過
装置の構成：
クロスフロー精密濾過装置は一般に、図１０に示す要素を有して構成される。水の値(water value)の測定：
水の値を測定するためには、脱イオン水を用いて装置を運転し、フロー・リストリクタ弁（４及び５）を用いて以下の圧力を設定する。
Ｒ（入）：２バール ＴＭＰ：１バール
Ｒ（出）：１バール
Ｐ：０．５バール
【００３２】
いずれの場合にも、フローは保持液出口及び透過液出口にて測定する。測定は、最初に使用する前及び各生成物サイクルの前若しくは後でカセットの状態を調べるためのものである。
その後、洗浄緩衝液（０．０５Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７、５ｍＭ（エチレンジアミン四酢酸）Ｎａ４、０．１％両性イオン化剤(zwittergent)３−１４）を用いて、装置全体の適度な濯ぎを行う。透過液出口(５)のフロー・リストリクタ弁を閉じ、ポンプを停止する。保持液溜めを空にし、その後封入体懸濁液を導入する。
【００３３】
粗ホモジェネート内での濯ぎ及び装置の始動
冷凍ペレット化(cryopelleted)した粗ホモジェネートの一部（例えば最初の湿潤細胞塊(wet cell mass)の３００ｇに相当）を解凍し、独立の保持液溜めへ導入する。洗浄緩衝液（０．０５Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７、５ｍＭ（エチレンジアミン四酢酸）Ｎａ４、０．１％両性イオン化剤(zwittergent)３−１４(Fluka)）を、懸濁液に対して上述の全保持液体積引く死体積(dead volume)まで添加し、保持液溜めをポンプ入口へ接続する。装置の死体積(dead volume)は０．５５ｌである。透過液フロー・リストリクタ弁(５)を閉じてポンプを始動させ、保持液を約５分間循環させる。ポンプ出口（Ｒ(入)）を調節して、又はフロー・リストリクタ弁を用いて以下の圧力を設定する：
Ｒ（入）：１バール ＴＭＰ：０．３５バール
Ｒ（出）：０．５バール
Ｐ：０．４バール
【００３４】
これに関して、膜上に存在し得る被覆層を圧縮することを防止するために、透過バルブを特に注意深く開く。上述の設定から、０．３５バールの膜間差圧（ＴＭＰ(transmembrane pressure))が計算され、その圧力は予め行われていた操作ポイント測定において最適であることが見出された。
【００３５】
ダイアフィルトレーション
その後に続くダイアフィルトレーションの間、保持液体積(retentate volume)は５回まで交換される。水緩衝液を連続的に添加することによって、保持液体積を一定のレベルに保持する。
それぞれ０．５ｌの透過液体積の場合の後で、圧力設定をチェックし、記録し（０．３５バールの一定ＴＭＰ）、保持液及び透過液からサンプルを採取する。更に、保持液フロー及び透過液フローを測定する。
【００３６】
濃縮
ダイアフィルトレーションの後で、場合により、水緩衝液の供給を中断することによって、保持液を元の体積の約５０％まで濃縮することもできる。
【００３７】
保持液の除去
保持液を除去するため、透過液フロー・リストリクタ弁(５)をゆっくりと閉じ、保持液を循環させてポンプ送りする。その後、装置内に０．５〜１ｌの洗浄緩衝液（＝死体積の１〜２倍）を導入し、保持液溜めの中に保持液をあける。
【００３８】
装置の清浄化
透過液フロー・リストリクタ弁(５)を閉じたままにして、装置を最初に２リットルの０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて濯ぐ。ポンプ出力を保持液装置入口（Ｒ(入))の圧力を３バールになるように設定する。Ｒ(出)(７ｂ)のフロー・リストリクタ弁を完全に開く。それから、更に２リットルの０．９％ＮａＣｌ溶液を保持液循環部において約１０分間ポンプ送りする。
その後、２．５リットルの２％強度のクエン酸溶液を用いて装置を濯ぐ。圧力設定は同じ状態に保つ。装置から１番目の０．５リットルを排出し、その後、約１０分間で保持液循環部で溶液の運転を行う。
【００３９】
約２０リットルの脱イオン水を用いてクエン酸洗浄溶液を濯ぎ出す。その後、約４０℃に加熱した２．５リットルの１％強度ウルトラシル(Ultrasil)-62溶液（Henkel AG、ドイツ）を入れて濯ぐ。圧力設定は同じ状態の保持する。最初の０．５リットルを装置から排出し、その後、約１０分間保持液循環部で溶液の運転を行う。約２０リットルの脱イオン水を用いてUltrasil清浄化溶液を再び濯ぎ出す。
【００４０】
最終的に、４０℃に加熱された２．５リットルの１Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて、装置を濯ぐ。圧力設定は同じ状態の保持する。最初の０．５リットルを装置から排出し、その後、約１０分間保持液循環部で溶液の運転を行う。それから、透過液出口(５)におけるフロー・リストリクタ弁を完全に開く。続いて、約２０リットルの脱イオン水を用いて濯ぐことによって、装置から水酸化ナトリウム溶液を除去する。
最後に、（上述のようにして）水の値を再度測定する。
【００４１】
カセットの貯蔵
短期間の間（７日まで）、組込み式カセットを含む装置全体を脱イオン水中で保存する。それより長い期間（７日以上）の不使用には、組込み式カセットを含む装置全体を２０％水性エタノール中で保存する。
【００４２】
イン−プロセス(in-process)モニタリング
試料を遠心処理（１４０００×ｇ、１５分間）し、洗浄緩衝液(wash buiffer)を用いて適度に希釈する。続いて、２８０ｎｍにて、市販の分光光度計において対象キュベット（洗浄緩衝液）に対する光学濃度（ＯＤ))を測定する。
記載した実験プロトコルを用い、粗ホモジェネート（実施例１参照）の均一な部分から出発して、複数の濾過サイクルを実施した。
【００４３】
結果
インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）の第１のダイアフィルトレーション・サイクル（新しいヒドロザルト・スライス膜（０．１ｍ２、０．４５μｍ))の結果を、図１に示す。除去時間と共に、保持液からの可溶性成分の除去率は向上し、５５％のプラトーでの３．３体積交換の後で終了する。（完全に自由な膜に対応する）１００％から出発し、３．３体積交換の後で、透過率は９％の最終値へ向かって徐々に降下する。保持液フローは４６〜４８ｌ／ｈで実質的に一定である。透過流束は、３．３体積交換の後で、８２ｌ／ｈｍ２から２７ｌ／ｈｍ２へ徐々に低下している。
【００４４】
生成物ランの前に、新しい膜モジュールの水の値を３７．２ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１９６８ｌ／ｈｍ２（透過流束）として測定した。生成物ラン及びモジュールの清浄化（上記参照）の後、２２．８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１８００ｌ／ｈｍ２（透過流束）が測定された。
【００４５】
直ぐに続く生成物サイクルにおいて、正確に同じ出発条件を形成し、同じ出発生成物を用いた。最初の水の値は２２．８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１８４８ｌ／ｈｍ２（透過流束）であった。粗ホモジェネート中での濯ぎの後、１．５ｌ透過液体積後に、保持液フローは２．５ｌ／ｈに、透過流束は２ｌ／ｈｍ２に低下した。その結果、生成物ランを打ち切り、上記プロトコルに基づいて装置を初期状態へリセットした。装置を洗浄した後の水の値は、１９．４ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１７０４ｌ／ｈｍ２であった。
【００４６】
直後に続く生成物サイクルにおいて、正確に同じ出発条件を形成し（上記参照）、同じ出発生成物を用いた。生成物ランの前の水の値は、１９．６ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１６８０ｌ／ｈｍ２（透過流束）であった。このサイクルでは、装置の中へ粗ホモジェネート懸濁液を濯ぎ込むことはできなかった。保持液チャンネルは直ぐに閉塞した。その結果、生成物ランを打ち切り、上記プロトコルに基づいて装置を初期状態へリセットした。上述した標準的な清浄化プロトコルに基づいてカセットを清浄化することはできなかった。
【００４７】
結論
保持液フロー及び透過流束について説明した水の値に基づいて、並びに生成物ランについて上述した保持液フロー及び透過流束に基づいて、２３０ｇの湿潤細胞塊(wet cell mass)当量／リットルにて、粒状物付着によって保持液チャンネルが閉塞したことは明らかである。膜自体は、３回のサイクルでの３００ｇの湿潤細胞塊(wet cell mass)／ｍ２の膜のバイオマス負荷にて、被覆層の生成により著しい閉塞を生じた。
【００４８】
４．変性ヒドロザルト（登録商標）モジュールによるクロスフロー精密濾過
実験の構成、手順及び清浄化プロトコルは実施例１に示すように選択した。出発物質の調製（実施例１参照）、並びに膜のバイオマス負荷（３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２）及びバイオマス濃度（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）は、実施例２に示す条件と同様とした。
種々の型のスクリーン及びチャンネル構成を有する３種の変性ヒドロザルト（登録商標）モジュールについて試験した（実施例の部の一般的項目を参照）。膜自体は変えなかった（０．４５μｍの排除限界を有するヒドロザルト）。
【００４９】
４．１ タイプ＃１モジュールの結果
図２は、一例として、インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）の第１のダイアフィルトレーション・サイクル（新しいヒドロザルト・スライスモジュール・タイプ＃１（０．１ｍ２、０．４５μｍ））を示している。保持液からの可溶性成分の除去率は濾過時間に伴って上昇し、３．３体積交換の後で、６１％のプラトーにて終了している。（完全に自由な膜に対応する）１００％から出発し、３．３体積交換の後で、透過率は９％の最終値へ向かって徐々に降下する。保持液フローは８１〜８６ｌ／ｈで実質的に一定である。透過流束は、３．３体積交換の後で、８２ｌ／ｈｍ２から２１ｌ／ｈｍ２へ徐々に低下している。
【００５０】
生成物ランの前に、新たに購入した変性膜モジュールの水の値を５２．８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び２１３６ｌ／ｈｍ２（透過流束）として測定した。生成物ラン及びモジュールの清浄化（上記参照）の後、４６．８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１９６８ｌ／ｈｍ２（透過流束）が測定された。
【００５１】
７回の生成物ランが続く生成物ランにおける保持液フロー及び透過流束を図３ａに示している。生成物サイクルにおける保持液フローは、最初のサイクルの８６ｌ／ｈから、８回目のサイクルの１９ｌ／ｈへ低下している。第１と第２のサイクルの間で、生成物ランにおける最も大きい保持液フローの低下が観察された。平均透過流束は、１５ｌ／ｈｍ２〜３５ｌ／ｈｍ２の間で変動している。
すべての生成物ランにおいて、保持液からの可溶性成分の除去率は６０％〜８０％である。平均透過率は４０％〜８０％である。
【００５２】
ヒドロザルトタイプ＃１モジュールの清浄化からの結果、従って、生成物ランの前及び後での保持液フロー及び透過流束についての水の値を、図３ｂに示している。保持液の水の値はサイクルを通して着実に低下しており、５回目のサイクルにおいて急激に低下していることが明らかに観察される。標準的なヒドロザルトカセットの場合のように、これは保持液入口での閉塞の問題を示している。
８回のサイクルの間で、透過流束についての水の値は、２１３６ｌ／ｈｍ２から１３４４ｌ／ｈｍ２へ、即ち３７％低下している。個々の清浄化工程の効率は、８７％（最も低い工程効率）から１００％（最良の工程効率）の間である。
【００５３】
結論
変性ヒドロザルトカセットタイプ＃１は、向上した性能のデータを既に明らかに示しており、それを８回の生成物ランにわたって用いることができた。しかし、標準的ヒドロザルトカセットタイプ＃１は、同じ条件で、わずかに３回の生成物ランの後で不可逆的な閉塞を生じた。
複数のサイクルにわたる保持液チャンネルの閉塞の問題点は、タイプ＃１に用いたスクリーンの構成及びチャンネルの幾何形状に表れている。生成物サイクルの間及び複数のサイクルにわたる連続的な変化のために、タイプ＃１モジュールについて一定の操作ポイントを維持することも困難である。
【００５４】
４．２ タイプ＃２モジュールの結果
図４は、一例として、インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）の第１のダイアフィルトレーション・サイクル（新しいヒドロザルト・スライスモジュール・タイプ＃２（０．０５ｍ２、０．４５μｍ））を示している。保持液からの可溶性成分の除去率は濾過時間に伴って上昇し、３．８体積交換の後で、７５％のプラトーにて終了している。（完全に自由な膜に対応する）１００％から出発し、３．８体積交換の後で、透過率は２５％の最終値へ向かって徐々に降下する。平均透過率は５３％である。保持液フローは１９０ｌ／ｈで実質的に一定である。透過流束は、１５６ｌ／ｈｍ２の初期値から出発して、定常的に低下し、３８ｌ／ｈｍ２の値で終了している。生成物ランの前に、新たに購入した変性膜モジュールの水の値を６４８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び３７４４ｌ／ｈｍ２（透過流束）として測定した。生成物ラン及びモジュールの清浄化（上記参照）の後、７０８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び３７２０ｌ／ｈｍ２（透過流束）が測定された。
【００５５】
６回の生成物ランが続く生成物ランにおける保持液フロー及び透過流束を図５ａに示している。生成物ランにおける保持液フローは、実質的に一定であって、１８５ｌ／ｈ付近で変動している。生成物ランにおいて保持液フローの急激な低下は観察されない。平均透過流束は５０ｌ／ｈｍ２付近で変動している。
すべての生成物ランにおいて、保持液からの可溶性成分の除去率は６０％〜８０％である。平均透過率は４５％〜７５％である。
ヒドロザルトタイプ＃２モジュールの清浄化からの結果、従って、生成物ランの前及び後での保持液フロー及び透過流束についての水の値を、図５ｂに示している。保持液フローの水の値は最初のサイクルでの６５０〜７００ｌ／ｈと、最後のサイクルでの５８０ｌ／ｈとの間でわずかに変動している。このことは、標準的なヒドロザルトカセット及び変性ヒドロザルトタイプ＃１モジュールと対比して、保持液入口での閉塞の問題が明らかに低下したことを示している。
７回のサイクルの間で、透過流束についての水の値は、３７４４ｌ／ｈｍ２から３４０８ｌ／ｈｍ２へ、即ちわずかに９％低下している。個々の清浄化工程の効率は、９２％（最も低い工程効率）から１０５％（最良の工程効率）の間である。
【００５６】
結論
変性ヒドロザルトカセットタイプ＃２は、標準的ヒドロザルトモジュールと比較して、及びヒドロザルトタイプ＃１モジュールと比較して、明らかに向上した性能のデータを示しており、それを７回の生成物ランにわたって用いることができた。しかし、標準的なヒドロザルトカセットは、同じ条件で、わずかに３回の生成物ランの後で不可逆的な閉塞を生じた。
ヒドロザルトタイプ＃２モジュールに用いたスクリーンの構成及びチャンネルの幾何形状について、複数のサイクルにわたる保持液チャンネルの閉塞の問題点は著しく低下している。１回の生成物ラン及び複数のサイクルで一定の条件であるため、バイオマス負荷が３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）であっても、ヒドロザルトタイプ＃２モジュールの場合には安定した操作ポイントを保つことができる。
【００５７】
４．３ タイプ＃３モジュールの結果
図６は、一例として、インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃２）の第１のダイアフィルトレーション・サイクル（新しいヒドロザルト・スライスモジュール・タイプ＃３（０．１ｍ２、０．４５μｍ））を示している。これらの実験では、保持液体積は３．１ｌ（０．５５ｌ死体積）に低下している。保持液からの可溶性成分の除去率は濾過時間に伴って上昇し、３．８体積交換の後で、７７％のプラトーにて終了している。（完全に自由な膜に対応する）１００％から出発し、３．８体積交換の後で、透過率は２５％の最終値へ向かって着実に降下している。保持液フローは１２９〜１３２ｌ／ｈで実質的に一定である。透過流束は、３１．７ｌ／ｈｍ２（±２．９５）の平均値で実質的に一定である。
【００５８】
生成物ランの前に、新たに購入した変性膜モジュールの水の値を１０５．６ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１３２０ｌ／ｈｍ２（透過流束）として測定した。生成物ラン及びモジュールの清浄化（上記参照）の後、１１０．４ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１３４４ｌ／ｈｍ２（透過流束）が測定された。
【００５９】
Durapore Ｖ−スクリーン・カセット（排除限界０．４５μｍ、濾過面積０．１ｍ２、親水性化されたポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、オープンチャンネルモジュール）を用いて、同じ条件下で平行実験を行った。実施例２に記載したものと同じ実験の構成を採用したが、カセットホルダーはDurapore膜用の対応するホルダーに交換した。この実験において、バイオマス負荷（粗ホモジェネート部分＃２）は３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２又は２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットルであった。保持液体積は１．３ｌであり、３．８体積交換を行った（５ｌ透過液体積）。保持液フローは９０ｌ／ｈであった。初期ＴＭＰは０．３バールに固定した。この実験では、他の実験のように、ＴＭＰを一定に保つことはせず、透過流束を３８ｌ／ｈｍ２の値に固定した。ＴＭＰの上昇は、他の実験において透過流束の低下を示したのと同様に、膜細孔の閉塞が同程度であることを示している。
３．８体積の交換の後、７０％の除去率が得られた。透過率は１００％から１０％へ低下した。濾過の間にＴＭＰは０．３バールから０．６５バールへ上昇した。この実験では、保持液フローを追跡しなかった。
【００６０】
結論
ヒドロザルトタイプ＃３は、同じ条件下で、Durapore Ｖ−スクリーンモジュールと比較して、より良好な性能データを示している。ヒドロザルトタイプ＃３モジュールは保持液から約８０％の可溶性タンパク質含量を除去しているが、Durapore Ｖ−スクリーンモジュールは約７０％の除去率を達成している。２つの場合における透過率の変化は対応している。しかしながら、特に、透過流束（及びＴＭＰ）はヒドロザルトタイプ＃３モジュールについてはほぼ定常的であり、一方、Durapore Ｖ−スクリーンモジュールの場合には、試験した他のタイプのものについて観察されたのと同様に、ＴＭＰは明らかに上昇（及び透過流束は低下）している。
【００６１】
４．３．１ 膜のバイオマス負荷の段階的増加
ヒドロザルトタイプ＃３モジュールを用いる場合には、保持液フロー及び透過流束は濾過期間にわたって実際に一定に保たれ、以下の一連の実験において、保持液のバイオマス濃度及び膜のバイオマス負荷は５のファクターまで段階的に上昇した。第２の部分の粗ホモジェネート（＃２）を用いた。
【００６２】
膜のバイオマス負荷を増大させながら、４回の生成物ランが続く生成物ランにおける保持液フロー及び透過流束を図７ａに示している。生成物ランにおける保持液フローは、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２の第１のサイクルでの１３０ｌ／ｈから、１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２の第４のサイクルでの１００ｌ／ｈへ低下している。従って、バイオマス負荷の５００％の増加について、保持液フローは２３％だけ低下している。平均透過流束は、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２の第１のサイクルでの３０ｌ／ｈｍ２から、１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２の第４のサイクルでの１０ｌ／ｈｍ２へ低下している。従って、バイオマス負荷の５００％の増加について、透過流束は５０％だけ低下している。
【００６３】
保持液からの可溶性成分の除去率は、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２での７５％から、バイオマス負荷を５、１０及び１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２へ増加させると、約６０％変動している。平均透過率は３０％から４０％の間である。ヒドロザルトタイプ＃３モジュールの清浄化からの結果、従って、生成物ランの前及び後での保持液フロー及び透過流束についての水の値を、図７ｂに示している。保持液フロー及び透過流束の両者についての水の値は実質的に一定であるが、膜のバイオマス負荷は５００％増大した。このことは、保持液入口における閉塞の問題及び膜細孔における閉塞の問題点は、モジュールへの構造的変化によって著しく低下したことを示している。
各清浄化工程の効率は、９３％（最も低い工程効率）から１００％（最良の工程効率）の間である。
【００６４】
もう１つの実験によって、ヒドロザルトタイプ＃３モジュールの可能なバイオマス負荷の正確な限界を調べた。このために、ダイアフィルトレーションの開始のために用いた１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２から出発し、保持液中の封入体の濃度を特定の時間で上昇させた。この実験の結果を図８（Ａ）に示す。保持液中のバイオマス濃度を１１５３ｇの湿潤細胞塊当量／ｌから１７３３ｇ／ｌへ５０％上昇させると、保持液フローは１０８ｌ／ｈから７２ｌ／ｈへ、従って３３％低下している。１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２から２６ｋｇ／ｍ２へ膜のバイオマス負荷が７０％上昇すると、透過流束は約１６ｌ／ｈｍ２から約７ｌ／ｈｍ２へ、従って５６％低下している。従って、膜のバイオマス負荷についての上限は、約２２ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２である。この限度以上では、まず透過流束が１０ｌ／ｈｍ２以下に低下し、次いで、保持液フローは明らかに更に低下する。
【００６５】
以下のサイクルにおいて、可能なバイオマス負荷を３０ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２に更に上昇させることは、これは２３０７ｇの湿潤細胞塊当量／ｌに対応するが、できず、濯ぎ工程の間で保持液入口の閉塞をもたらした。しかしながら、モジュールはまだ十分に清浄化可能であって、標準的清浄化プロトコル（実施例２参照）を行った後、１２２ｌ／ｈの保持液水値及び１３２０ｌ／ｈｍ２の透過液水値を示した。
【００６６】
標準的ヒドロザルトモジュール（０．１ｍ２、スライスフォーマット、ロット番号(Lot No.)９６１０８７４１／Ｎｏ．００８）を用いる比較実験において、第３の部分の粗ホモジェネート（＃３）を用いて、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）から出発すると、保持液のバイオマス濃度を１０ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２へ段階的に上昇させた（図８（Ｂ))。生成物ランにおける保持液フロー及び透過流束は、１つのバイオマス濃縮工程であっても、著しく低下している。１０ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（７６９ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）で、透過流束は既にわずかに１２〜１３ｌ／ｈｍ２であるが、わずかな透過液体積をダイアフィルトレーションに付した。
【００６７】
結論
変性ヒドロザルトカセットタイプ＃３は、著しく向上した性能のデータを示しており、バイオマス負荷を５００％増大させて、それを５回の生成物ランにわたって用いることができた。標準的なヒドロザルトカセットは、同じ実験条件で、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２のバイオマス負荷で、３回の生成物ランの後、既に不可逆的な閉塞を生じていた。
【００６８】
タイプ＃３に用いたスクリーンの構成及びチャンネルの幾何形状について、複数のサイクルにわたる保持液チャンネルの閉塞の問題はもはや明らかである。１回の生成物サイクル及び複数のサイクルにわたって、一定の条件であるために、２２ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（１４６６ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）までのバイオマス負荷であっても、ヒドロザルトタイプ＃３を用いて安定な操作ポイントを維持することができる。
直接の比較では、標準的ヒドロザルトモジュールは、著しく低下したバイオマス負荷にて、明らかにより低い性能を示している。
【００６９】
４．３．２ 種々の粗ホモジェネート部分の効果
一連の実験において、異なるバッチの粗ホモジェネートによって生じる効果を同様に記録するため、１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２のバイオマス負荷にて、異なる粗ホモジェネートの部分（＃３）と共にヒドロザルトタイプ＃３モジュールを用いた。
新しい粗ホモジェネート部分＃３についての生成物ランの保持液フローは、３サイクルで３５ｌ／ｈと一定であった。３サイクルで透過流束は１０〜１５ｌ／ｈｍ２の範囲で一定であった。除去率は４０％〜５０％であり、平均透過率は２０％〜３０％である。
標準的な清浄化プロトコルを行った後、水の値は、透過液水値が１３００ｌ／ｈｍ２及び保持液水値が１００ｌ／ｈであった。
【００７０】
結論
異なるバッチの粗ホモジェネート（＃３）に替えても、粗ホモジェネート（＃１）の第１のバッチを用いた前の実験において得られたものと対比し得る透過流束が得られている。保持液フラックスは、前の実験のように明らかに低い。ヒドロザルトタイプ＃３モジュールの清浄化性は一定の高いレベルに保たれた。
【００７１】
４．３．３ ヒドロザルトタイプ＃３モジュールの操作ポイント測定
図９ａ／９ｂは、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（２３０ｇ／リットルに対応）のバイオマス負荷にてヒドロザルトタイプ＃３モジュールの操作ポイント測定を示している。図９ａにおけるグラフ表示は、２５ｇの湿潤細胞塊当量／ｌから１００ｇの湿潤細胞塊当量／ｌでのDurapore膜（０．４５μｍ）についての操作ポイント測定について記載したFormanらによって選択されたものに対応している。これらの文献のデータを、変性ヒドロザルトタイプ＃３モジュールについての図９ａに示されたデータと比較すると、以下の特徴が注目に値する：
変性ヒドロザルトタイプ＃３モジュールについての最適ＴＭＰは０．３５バールであること。この最適値を越えて増大すると透過流束が低下すること、及びこのことは膜の被覆層の肥厚化によって説明できること。
【００７２】
ヒドロザルトタイプ＃３モジュールを用いるこの実験において得られた透過流束は約２０ｌ／ｈｍ２である。１００ｇの湿潤細胞塊当量のバイオマス濃度にてDuraporeモジュールにより得られた最大透過流束は、８ｌ／ｈｍ２以下である。Durapore膜についての最適ＴＭＰは、約０．１バールである。
図９ｂは、３次元表示での同じ操作ポイント測定を示している。全体的な最適値は、０．３５のＴＭＰ及び１００ｌ／ｈのフィルターに存在している。更に、７０ｌ／ｈ及び１５０ｌ／ｈであって、やはり０．３５バールのＴＭＰに、局部的な最適値が観察された。最適な操作ポイントの一覧を表２にまとめる。
【００７３】
【表２】
ヒドロザルトタイプ＃３モジュールについての全体的及び部分的操作ポイント最適値。全体的最適値は太字で示している。２つの他の操作ポイントは、満足できる透過液フラックスが得られる部分的最適値を示している。バイオマス負荷：３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２。バイオマス濃度：２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル 保持液。
【００７４】
０．３５バールの膜間差圧は、標準的ヒドロザルトモジュールについても最適であることが既に見出されている（データは特に示さない）。
【００７５】
４．３．４ クロスフロー精密濾過によるエンドトキシン除去
濾過面積の１５ｋｇ又は４５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２のバイオマス負荷で、ヒドロザルトタイプ＃３モジュール（フィルター面積０．１ｍ２）を用いる別の実験において、以下の結果及びエンドトキシン除去が得られた。
【００７６】
【表３】
全エンドトキシンの回収率はおよそ９０％である。保持液から透過液へのエンドトキシンの除去率は約５０％であって、０．３対数単位に対応する。
【００７７】
４．３．５ ０．６ｍ２モジュールフォーマットへのスケールアップ
表４（原表３）は、スケールアップ十ヶの結果を示している。これらの実験では、モジュールあたりのフィルター面積（Sartocon ２／３フォーマット）が０．６ｍ２であるヒドロザルトタイプ３モジュールを用いた。使用した装置は、基本的に、実施例２に説明したものと同様の構成を有している。しかしながら、スライスカセットホルダーはSartocon３カセットホルダーに交換しており、ポンプを適度な大きさ（４ｍ３／ｈ）で、二重面シール（Johnson）を有する回転ピストンポンプに交換した。保持液溜め体積は５リットルへ拡大し、装置の死体積は２．５リットルであった。他の体積（例えば、清浄化用及び洗浄緩衝液体積）はそれに応じて調節した。
【００７８】
【表４】
（原表３）E.Coli粗ホモジェネート精密濾過のスケール・アップについての実験結果のまとめ。例として、インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を使用した。
データは、同じ標準的条件（濾過及び清浄化条件、実施例２を参照）にて行った３つの実験からのそれぞれの場合の平均を示している。
【００７９】
結果
表４（原表３）に適合するデータは、Sartocon３モジュールフォーマットを用いて、Sliceモジュールフォーマットのデータに従って変更して、ヒドロザルトタイプ３モジュールについて均等目盛を用いてことができることを示している。６の係数でスケール・アップすることによって、生成物ランにおける保持液フローのほぼ正確な６倍への上昇が得られた。これに対応して、保持液水値は６倍で上昇した。他の性能データ、例えば生成物ランの透過流束、透過液水値、除去率及び塗料は、特定の測定の精度限界の中で同程度に保たれた。
【００８０】
引用文献
Apeler H, Wehlmann H (1998): Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and Interleukin-4 muteins. Europeran Patent application EP00100129.6, 2000年1月7日出願。
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Sharma SK(1986):J.Biotechnol. 4:119-124
Taylor G(1986):Bio/Technology 4:553-557
【図面の簡単な説明】
【図１】 インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入したヒドロザルト Slice標準モジュール（０．１ｍ２）3051860601 Ｗ-ＳＧ、Lot No.96108741/13を用いた１番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積２．５５ｌ（１１７ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図２】 インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃１（０．１ｍ２）Lot No.98025101を用いた１番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積２．５５ｌ（１１７ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図３ａ】 サイクル数の関数としての生成物ランの保持液フロー（ｌ／ｈ）及び平均透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃１（０．１ｍ２）Lot No.98025101を用いた１番目〜９番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積２．５５ｌ（１１７ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図３ｂ】 生成物ランの前後における水値。サイクル数の関数としての保持液フロー（ｌ／ｈ）及び透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃１（０．１ｍ２）Lot No.98025101を用いた１番目〜９番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積２．５５ｌ（１１７ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図４】 インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃２（０．０５ｍ２）Lot No.98055101を用いた１番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積1 ．3ｌ（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図５ａ】 サイクル数の関数としての生成物ランの保持液フロー（ｌ／ｈ）及び平均透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃２（０．０５ｍ２）Lot No.98055101を用いた１番目〜７番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積１．３ｌ（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図５ｂ】 生成物ランの前後における水値。サイクル数の関数としての保持液フロー（ｌ／ｈ）及び透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃２（０．０５ｍ２）Lot No.98055101を用いた１番目〜７番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積１．３ｌ（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図６】 インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃２）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃３（０．１ｍ２）Lot No.98015111を用いた１番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積１．３ｌ（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図７ａ】 膜のバイオマス負荷の増大についてのサイクル数の関数としての生成物ランの保持液フロー（ｌ／ｈ）及び平均透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃２）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃３（０．１ｍ２）Lot No.99015111を用いた１番目〜５番目の生成物サイクル。２３０ｇ湿潤細胞塊当量／ｌ、３８４ｇ／ｌ、７７０ｇ／ｌ、１１５３ｇ／ｌにそれぞれ対応する、３ｋｇ／ｍ２、５ｋｇ／ｍ２、１０ｋｇ／ｍ２、１５ｋｇ／ｍ２の湿潤細胞塊当量。
【図７ｂ】 生成物ランの前後における水値。サイクル数の関数としての保持液フロー（ｌ／ｈ）及び透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃２）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃３（０．１ｍ２）Lot No.99015111を用いた１番目〜５番目の生成物サイクル。２３０ｇ湿潤細胞塊当量／ｌ、３８４ｇ／ｌ、７７０ｇ／ｌ、１１５３ｇ／ｌにそれぞれ対応する、３ｋｇ／ｍ２、５ｋｇ／ｍ２、１０ｋｇ／ｍ２、１５ｋｇ／ｍ２の湿潤細胞塊当量。
【図８】 バイオマス負荷の段階的増大
Ａ．変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃３（０．１ｍ２）Lot No.98015111を用いたインターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃２）のダイアフィルトレーション。開始条件：１５００ｇの湿潤細胞塊当量（１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２）。保持体積１．３ｌ（１１５３ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。ダイアフィルトレーションを続ける間、グラフに示す時間で、膜のバイオマス負荷を２０、２２、２４、そして最終的には２６ｋｇ／ｍ２へ段階的に増大させる。保持液の体積変化のため、この結果は１１７６ｇの湿潤細胞塊当量／ｌ、１４６６ｇ／ｌ、１６００ｇ／ｌ、そして最終的には１７３３ｇ／ｌに対応する。
Ｂ．標準的ヒドロザルト Sliceモジュール（０．１ｍ２）Lot No.96108741/008を用いたインターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃３）のダイアフィルトレーション。開始条件：３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２）。保持体積１．３ｌ（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。ダイアフィルトレーションを続ける間、グラフに示す時間で、膜のバイオマス負荷を５ｋｇ／ｍ２へ、そして最終的には１０ｋｇ／ｍ２へ段階的に増大させる。低い透過流束のため、実験を打ち切った。保持液体積を１．３Ｌで一定に保持した。この結果は、３８４ｇ及び７６９ｇの湿潤細胞塊当量／ｌに対応する。
【図９ａ】 変性ヒドロザルト タイプ＃３モジュールの操作ポイントの測定 バイオマス負荷３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）、粗ホモジェネート（部分＃２）。膜間差圧（ＴＭＰ）の関数として、透過流束をプロットしている。保持液フロー（Ｆｒ）は約１１０ｌ／ｈ及び約１４０ｌ／ｈに固定した。実験は、全体積フローを完全にリサイクルして行った。
【図９ｂ】 変性ヒドロザルト タイプ＃３モジュールの操作ポイントの測定 バイオマス負荷３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）、粗ホモジェネート（部分＃２）。膜間差圧（ＴＭＰ）及びフィード（＝保持液フロー＋透過液フロー）の関数として、透過流束をプロットしている。実験は、全体積フローを完全にリサイクルして行った。
【図１０】 クロスフロー精密濾過装置の実験的構成(setup)の模式図である。使用したシステムの死体積は０．５５Ｌである。
【符号の説明】
１：レベルインジケータを有する（撹拌式の）保持液溜め（洗浄緩衝液ポンプ(９)で制御）
２：ロータリーピストンポンプ
３：ヒドロザルト Sliceカセット（０．１ｍ２濾過面積）を備えたカセットホルダ（Sartocon Slice フォーマット、Sartorius AG、ドイツ）
４：フロー・リストリクタ弁保持液側出口
５：フロー・リストリクタ弁透過液側出口
６：透過液受器
７：圧力ゲージ Ｒ(入)＝７ａ、Ｒ(出)＝７ｂ、Ｐ＝７ｃ
８：洗浄緩衝液ポンプ
９：洗浄緩衝液溜め
本発明は、高度に濃厚化された粒状物（粒子）含有溶液中の封入体(inclusion body)（屈折性物体）を濃縮及び／又は精製する方法であって、封入体を含有する液体（溶液及び懸濁液を含む）を、１又はそれ以上の半透膜（semi-permeable membranes）に対して接線方向に案内し、封入体は膜の後方に留めさせ、相対的により小さな分子量の物質には膜を通過させ及び／又は膜に吸着させて、濃縮（濃厚化）された及び／又は精製された封入体液（溶液及び懸濁液を含む）を得る方法に関する。同様にして、封入体懸濁液から細胞壁粒状物が除かれる。本発明は更に、懸濁液中の封入体を濃縮及び／又は精製するため、並びに封入体製剤から細胞壁粒状物を除くためにクロスフロー精密濾過装置(crossflow microfiltration unit)を使用することにも関する。
【０００２】
本発明は、高度に濃厚化された粒状物含有液（溶液及び懸濁液を含む）中の封入体を濃縮及び／又は精製する方法、封入体含有液から細胞壁粒状物を除去する方法、並びに、封入体含有液中の封入体を濃縮及び／又は精製するため、並びに封入体製剤から細胞壁粒状物を除くためにクロスフロー精密濾過装置を使用することに関する。
【０００３】
用語の定義
「封入体（屈折性物体）」は、Escherichia coli中の異種又は同種タンパク質を高度に圧出する場合にしばしば形成され、リボソーム及びタンパク質生合成の酵素、核酸、高度に集合したタンパク質からなる。封入体は電子密度の高い非晶質の粒状物であって、細胞質とは区別される境界を有している（Schoemaker JM et al.(1985)：EMBO J4：775-780）。封入体が形成される際、種々の相互作用によって、その他の種々の汚染物質、例えば、エンドトキシン(endotoxin)、細胞崩壊物(debris)及び脂質を二次的に吸着させ（又は吸収する）可能性がある（Marston FAO(1986)：Biochem.J.240：1-12）。
【０００４】
「バイオマス(biomass)」とは、本発明に関して、細胞溶解産物(lysate)中に生じる種々の高分子量及び低分子量成分の総和を示す。特に、細胞崩壊物（細胞壁粒状物）と封入体との割合によって、更に核酸、エンドトキシン、可溶性タンパク質及び低分子量成分などの成分も含めて、濾過すべき物質の物理化学的特性が決定される。バイオマス濃厚物(concentrations)（又は濃縮物）の情報は、細胞溶解前における湿潤状態の細胞重量の濃度に常に基づく。これをバイオマス当量と称する。
【０００５】
「膜間差圧(transmembrane pressure)」（ＴＭＰ）は、
【数１】
ＴＭＰ＝(入口圧力＋出口圧力)／２−透過圧力 ［バール］
で表される。「入口圧力」は、保持液入口（カセットの入口開口部）における圧力である。「出口圧力」は、保持液出口（カセットの出口開口部）における圧力である。「透過圧力」は、透過液（濾液）出口の圧力である。
【０００６】
「透過率、トランスミッション(transmission)」は、本発明に関して、膜を通して透過液中へ可溶性成分を取り出すことを意味する。このために、濾過の間の種々の時間（Ｘ）にて保持液(retentate)及び透過液(permeate)からサンプルを採取し、遠心処理（１４０００×ｇ、１５分）して、可溶性の上澄みを、適度に希釈した後、２８０ｎｍにて光度測定（２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ)の測定)を行う。各時間Ｘにおける透過液のＯＤ２８０データ（ＯＤ２８０(透過液(Ｘ))）を、以下の式：
【数２】
透過率＝ＯＤ２８０(透過液(Ｘ))／ＯＤ２８０(保持液(Ｘ))×１００
に基づいて、各時間Ｘにおける保持液のＯＤ２８０データ（ＯＤ２８０(保持液(Ｘ)))に関連付ける。透過率は、一般に、ダイアフィルトレーション(diafiltration)の間で変化する。最初は、膜には吸着成分が付着しておらず、被覆層も形成されていない。従って、濾過を開始した時点での透過率は、定義により１００％である。しかし、濾過の間で、徐々に被覆層が形成され、これは可溶性成分が膜を通って透過物の中へ移動するのを妨害するので、透過率は一般に低下する。従って、透過率は全体での平均として（平均透過率）表現することができる。
【０００７】
「除去率(removal)」は、本発明に関して、保持液から可溶性成分を除くことを意味する。この事項に関して、ダイアフィルトレーションの間の種々の時間（Ｘ）にて保持液から試料を取り出し、適切な希釈を行った後、遠心処理（１４０００×ｇ、１５分）された可溶性の上澄み(supernatant)を、２８０ｎｍにて光度的測定（２８０ｎｍにおける光学濃度（ＯＤ)の測定)を行う。ＯＤ２８０データ（ＯＤ２８０(透過液(Ｘ))）を、保持液中に最初から存在していた値である可溶性上澄みのＯＤ２８０値に、式：
【数３】
除去率＝１００−(ＯＤ２８０(保持液(Ｘ))／ＯＤ２８０(保持液(０))×１００）
によって関連付ける。除去率は、一般に、ダイアフィルトレーションの最後まで最大値に近づく。従って、このデータは、可溶性成分の達成した最大除去率を表す。
【０００８】
従来の技術
タンパク質の化学において、封入体の精製方法は経験的なものであった。従来技術における既知の実験室的方法において、得られる生物学的物質（例えば、E.coli細菌細胞）は、例えば、溶解(lysis)(一般に、リゾチーム(lysozyme)による酵素的溶解、超音波処理又は高圧均質化が用いられる）の後で遠心処理され、得られる沈殿物（一般に、封入体及び非溶解細胞、例えば細胞外被及び細胞壁フラグメントを含む）は、沈殿作用を利用する緩衝液により洗浄されるか、又はその代わりとしてのクロスフロー精密濾過に付される。沈殿プロセスは、一般に、封入体を細胞から放出させた後の精製に用いられている（例えば、Schoner RGら(1985年)：Biotechnology 3：151-154頁；Sharma SKら(1986年)：J.Biotechnol.4：119〜124頁）が、この方法はラージスケールでは問題を生じるおそれがある（Forman SMら(1994年)：J.Membr.Sci.48：263〜279頁）。封入体は、所望する純度までクロスフロー精密濾過を利用して洗浄することができる（Meagher MMら(1994年)：Biotechnol. Bioeng.43：969〜977頁；Forman SMら(1990年)：J.Membr.Sci.48：263〜279頁）。
【０００９】
封入体の平均粒子寸法は、発現される(expressed)特定のターゲットタンパク質、使用される培地、発現システム(expressed system)、宿主種(host strain)などに依存し、ヒト成長ホルモン(human growth hormone)についての０.０７μｍ（Blum Pら(1992年)：Bio/Technology 10：301〜304頁）から、β−ラクタマーゼ(lactamase)についての１.５μｍ（Bowden GAら(1991年)：Bio/Technology 9：725〜730頁）までの範囲をとり得る。文献からのその他の例には、１.２６μｍ（±１.２μｍ）の粒子直径のプロキモシン(prochymosin)封入体、及び０.８１μｍ（±０.４μｍ）の粒子直径のインターフェロン（Taylor Gら(1986年)：Bio/Technology 4：553〜557頁）がある。しかしながら、細胞壁崩壊物は、溶解プロセスに応じて、０.０５μｍ〜１μｍの範囲の粒子寸法を有する（Bailey SM及びMeagher MM(1997年)：Biotechnol. Bioeng. 56(3)：304-310頁）。更に、溶解の程度も粗ホモジェネート(crude homogenate)中の粒子寸法分布に影響を及ぼす。従って、多くの粗ホモジェネートは、封入体、細胞壁崩壊物及び非溶解細胞とオーバーラップする粒子寸法分布を有している。
【００１０】
Formanらは、濾過しようとする生成物溶液中の増加するバイオマス濃度と透過流束（又は透過液フラックス(permeate flux))との間の対数的関係を規定している。即ち、濾過しようとする生成物溶液中の初期バイオマス濃度が増大すると、透過流束は急速に低下するのである。Formanらは、０.４５μｍの排除限界を有するDurapore膜(Millipore)について、２５ｇ／ｌ（２．５％）バイオマス当量にて１４ｌ／ｈｍ２、５０ｇ／ｌ（５％）バイオマス当量にて１２ｌ／ｈｍ２、並びに１００ｇ／ｌ（１０％）バイオマス当量にて８ｌ／ｈｍ２以下という最大透過流束を規定している。これらの実験における膜のバイオマス負荷(load)は、約１．４ｋｇの湿潤細胞塊当量(wet cell mass equivalent)／ｍ２であった。生成物溶液中における所定のバイオマス濃度で、透過流束をＴＭＰの急激な上昇を生じさせる特定の限度まで増大させると、膜の細孔に詰まり(fouling)が生じる。逆に言えば、所定のＴＭＰにおける透過流束は濾過時間を通して降下する。
【００１１】
他の研究グループ（Bailey SM及びMeagher MM（1997年))：J.Membr.Sci.131：29-38頁）は、ポリスルホン中空繊維モジュール又はポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）カセット・モジュールの場合、４〜６％（４０〜６０ｇ／ｌ）のバイオマス負荷であっても、時間の経過に従って透過率及び透過流束は低下すること、及びこれはカオトロピック剤(chaotropic agent)、例えばグアニジンヒドロクロリドを添加することによってより顕著になることを述べている。
【００１２】
Maegher及び共同研究者（Maegher MMら(1994年)：Biotechnol. Bioeng. 43：969-977頁）は、Durapore膜（ポリエーテルスルホン、０.１μｍ）で、ＩＬ−２封入体を精製することについて同様の結果を報告している。保持液中の７％（７０ｇ／ｌ）湿潤細胞塊当量のバイオマス濃度にて、タンパク質透過率及び透過流束（２０〜１０ｌ／ｈｍ２）の両者が濾過時間を通して顕著に低下し、これは膜被覆層の生成及び圧縮のためであるとされていた。膜へのタンパク質の吸着は、タンパク質溶液及び膜自体の両者の物理化学的特性に依存する。
【００１３】
このように、従来技術においては、一定の操作パラメーター（圧力、透過流束、保持液流れ）及び非常に高いバイオマス濃度にて封入体溶液を濾過することができる既知の方法はなかったのである。多くの濾過サイクルにわたって特徴的な濾過パラメーターの再現性に関する直接的な情報を、文献には見出すことができない。封入体を含む懸濁液を高度に精製するためにクロスフロー精密濾過プロセスを工業的規模に適用することはこれまでは妨げられていた。
【００１４】
発明の主題
本発明の目的は、クロスフロー精密濾過に基づく精製及び濃縮方法であって、簡単な手法にて、１つ及び多くの濾過サイクルの間に、一定の操作パラメーターにより工業的に妥当な量の封入体を精製する方法を提供することである。本発明のもう１つの目的は、特に変性したターゲットタンパク質の再フォールディング(refolding)及びクロマトグラフィー的最終精製によって、その後の工程にて、工業的に妥当な収率での再現性が達成されるように、細胞壁粒状物及び他の低分子量成分の濃度を低下させることである。
【００１５】
第１の要旨において、本発明は、溶液中の封入体を精製及び／又は濃縮する方法であって、タンパク質封入体含有液を１又はそれ以上の半透膜に対して接線方向に導き、膜は封入体を留め、比較的小さな分子量若しくは粒子直径を有する成分若しくは物質には膜を通過させて、濃縮された及び／又は精製された封入体溶液を得ることを特徴とする方法に関する。
【００１６】
もう１つの要旨において、本発明は、封入体含有製剤から細胞壁粒子を除去する方法であって、封入体含有製剤を１又はそれ以上の半透膜に対して接線方向に導き、封入体は膜に留めさせ、比較的小さな分子量若しくは粒子直径を有する成分若しくは物質には膜を通過及び／又は吸着させて、粒状物が本質的に除かれた封入体溶液を得ることを特徴とする方法に関する。
【００１７】
本発明の方法によって、クロスフロー精密濾過装置を用いて封入体を精製及び濃縮することができることが見出された。この点に関して、驚くべき新しい事項は、
出発製剤中の可溶性及び粒状物成分（バイオマス）が高負荷である場合であっても、被覆層を形成して濾過能力を低減させたり及び／又は膜を閉塞させたりすることなく、安定な操作ポイントにて封入体を濾過することができるということである。今日まで、保持液中で達成し得るバイオマス濃度は低かった。しかしながら、高いバイオマス濃度の場合には、保持液チャンネルの閉塞は、濾過サイクル中又は複数の操作サイクルでの操作ポイントの変化が増大する原因となり、保持液フロー及び透過流束が着実に低下する原因となっていた。複数のサイクルの後で、達成され得る透過流束は、経済的に魅力がある操作をもたらすことができない。このように閉塞される膜の清浄化は、複雑であって、通常は完全なものではないということが見出されている。
【００１８】
一方で、膜のバイオマス負荷が低い場合には、膜の閉塞を比較的生じにくいが、特に工業的に妥当な規模において、極端に大きな濾過面積が必要とされ、このことはクロスフロー精密濾過工程の経済性に負の効果（マイナス要因）となっている。
【００１９】
従って、クロスフロー精密濾過はこれまで、工業的に妥当な規模で及び高いバイオマス濃度にて、封入体製剤の精製及び濃縮に用いられていなかった。
【００２０】
しかしながら、本発明に用いられる変性セルロースハイドレート膜カセットによれば、驚くべきことに、出発製剤中の可溶性及び粒状物成分（バイオマス）の高負荷であっても、被覆層が生成することによって膜を閉塞したり及び／又は濾過能力を低下させることなく、安定な操作ポイントにて封入体の濾過を容易に行うことができる。安定な操作ポイントは、驚くべきことに、多くの濾過サイクルにわたって保たれる。
【００２１】
本発明の方法は、５０ｇ／ｌから２５００ｇ／ｌの範囲、好ましくは５００ｇ／ｌから１５００ｇ／ｌの範囲の高いバイオマス濃度にて、封入体を精製及び／又は濃縮する。膜のカットオフ(cut-off)の選択は、封入体の粒子寸法分布及び平均粒子直径に依存する。本発明において用いられる変性された親水性セルロースハイドレート膜について、カットオフは０．１〜０．６５μｍ、好ましくは０．４５μｍである。
【００２２】
種々の体積を処理することができ、好ましくは１〜１０００００ｌの体積、特に好ましくは１〜２０００ｌの体積を有する溶液を処理することができる。好適な圧力条件下で、封入体を含有する溶液を膜に案内し、オーバーフロー圧を膜間差圧（ＴＭＰ(transmembrane pressure)、又は膜間差圧）よりも大きくすることが好ましい。操作圧力は、好ましくは０．０５〜３バールのＴＭＰ、特に好ましくは０．１〜０．５バールのＴＭＰ、最も好ましくは０．２〜０．４バールのＴＭＰであって、オーバーフロー圧は膜間差圧よりも大きい。保持液フローは広い範囲で変動してよく、乱流（レイノルズ数３０以上、Meyeroltmanns F(1991年)：BioTech 5:918-921）が達成されるように選択されるべきである。乱流が達成される際の最小保持液フローを小さくするため、本発明に用いられる膜モジュールの中にスクリーンが形成される。そのようなスクリーンの形状及び幾何学的配置は、本願と同日に出願された「Crossflow filter cassettes in the form of improved wide-gap modules」という発明の名称の別の特許出願の中で説明されている。
【００２３】
バイオマス負荷について、保持液中のバイオマス濃度（ｇ／ｌ単位）と、面積−比バイオマス負荷（ｋｇ／ｍ２）との間での区別をする必要がある。保持液中のバイオマス濃度は、非常に高い場合には、保持液チャンネルの閉塞をもたらし得るが、一方、面積−比バイオマス負荷は、非常に高い場合には、膜への被覆層の生成（詰まり(fouling))をもたらす。
【００２４】
本発明に用いられる変性セルロースハイドレートモジュールの保持液バイオマス濃度は１５００ｇ／ｌまでであり得るが、面積−比バイオマス負荷は３０ｋｇ／ｍ２まで上昇し得る。
【００２５】
本発明の方法は、温度を変化させて実施することもできる。４℃〜４０℃の温度範囲が好ましい。
【００２６】
本発明のもう１つの要旨では、本発明によって調製される封入体製剤は、出発物質と対比して、著しく低いエンドトキシン汚染を示す。
【００２７】
実施例
ここに記載する実験では、種々の方法で変性され、変性セルロースハイドレートで形成されたヒドロザルト(Hydrosart)（登録商標）膜（Sartorius AG、ドイツ）を有するスクリーン・チャンネル・モジュールを用いた。各モジュールは、マトリックスの幾何学的形態に実質的な差異がある。ヒドロザルト（登録商標）膜は、０．１μｍ、０．２μｍ、０．４５μｍ及び０．６５μｍの排除限界のものが市販されている。
【００２８】
【表１】
使用したヒドロザルト・モジュールの特性データ
１．出発溶液の調製
従来技術における発酵技術（Riesenbergら、1990年：Appl.Microbiol.Biotechnol.34：77-82頁）によって、封入体の形態（例えば、インターロイキン−4 R121D Y124D）で、ターゲットタンパク質を含有するE. Coli W3110細胞塊を調製した。酵素的溶解（リゾチーム(lysozyme)１ｍｇ／ｇ乾燥細胞塊）の後、標準的ホモジナイザー（Bran&Luebbe、ドイツ）を用いて３０〜４０％の湿潤バイオマス濃度にて細胞を粉砕した。使用した緩衝液は、５ｍＭ エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含む１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８）であった。５００バールで３つの均質化サイクルにて機械的細胞溶解を達成した。溶解の程度は、画像解析(image analysis)を用いて測定して、約８０〜９０％であった。得られた粗ホモジェネートは、分離装置（Westfalia、ドイツ）を用いて引き続いて濃縮し、乾燥物質全体をスラッジで集めた。続いて、流動性の沈殿を液体窒素中で冷凍ペレット化(cryopelleted)し、更なる濾過実験に用いるまで−７０℃にて貯蔵した。
上述の方法を用いて、粗ホモジェネートの３つの独立したバッチを調製し、更に使用するまで−７０℃にて冷凍ペレットとして貯蔵した。
【００３０】
２．クロスフロー精密濾過後のエンドトキシン除去の測定
European Pharmacopoeia（Pharm. Eur.）によるリムルス（カブトガニ）変形細胞分解産物（limulus amoebocyte lysate）プロセスを用いて、封入体含有溶液（ダイアフィルトレーション前の保持液、ダイアフィルトレーション後の保持液）及び透過液全体の試料を分析した。エンドトキシンの試験は、エンドトキシン含有溶液をリムルス変形細胞分解産物溶液（ＬＡＬ溶液）に添加することによって混合物をゲル化する「solid gel」プロセスに基づいて行った。ゲルの生成は数段階でカスケード式に進行する凝固に基づいて行われる。
【００３１】
３．標準ヒドロザルト（登録商標）モジュールを有するクロスフロー精密濾過
装置の構成：
クロスフロー精密濾過装置は一般に、図１０に示す要素を有して構成される。水の値(water value)の測定：
水の値を測定するためには、脱イオン水を用いて装置を運転し、フロー・リストリクタ弁（４及び５）を用いて以下の圧力を設定する。
Ｒ（入）：２バール ＴＭＰ：１バール
Ｒ（出）：１バール
Ｐ：０．５バール
【００３２】
いずれの場合にも、フローは保持液出口及び透過液出口にて測定する。測定は、最初に使用する前及び各生成物サイクルの前若しくは後でカセットの状態を調べるためのものである。
その後、洗浄緩衝液（０．０５Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７、５ｍＭ（エチレンジアミン四酢酸）Ｎａ４、０．１％両性イオン化剤(zwittergent)３−１４）を用いて、装置全体の適度な濯ぎを行う。透過液出口(５)のフロー・リストリクタ弁を閉じ、ポンプを停止する。保持液溜めを空にし、その後封入体懸濁液を導入する。
【００３３】
粗ホモジェネート内での濯ぎ及び装置の始動
冷凍ペレット化(cryopelleted)した粗ホモジェネートの一部（例えば最初の湿潤細胞塊(wet cell mass)の３００ｇに相当）を解凍し、独立の保持液溜めへ導入する。洗浄緩衝液（０．０５Ｍ トリス−ＨＣｌ ｐＨ７、５ｍＭ（エチレンジアミン四酢酸）Ｎａ４、０．１％両性イオン化剤(zwittergent)３−１４(Fluka)）を、懸濁液に対して上述の全保持液体積引く死体積(dead volume)まで添加し、保持液溜めをポンプ入口へ接続する。装置の死体積(dead volume)は０．５５ｌである。透過液フロー・リストリクタ弁(５)を閉じてポンプを始動させ、保持液を約５分間循環させる。ポンプ出口（Ｒ(入)）を調節して、又はフロー・リストリクタ弁を用いて以下の圧力を設定する：
Ｒ（入）：１バール ＴＭＰ：０．３５バール
Ｒ（出）：０．５バール
Ｐ：０．４バール
【００３４】
これに関して、膜上に存在し得る被覆層を圧縮することを防止するために、透過バルブを特に注意深く開く。上述の設定から、０．３５バールの膜間差圧（ＴＭＰ(transmembrane pressure))が計算され、その圧力は予め行われていた操作ポイント測定において最適であることが見出された。
【００３５】
ダイアフィルトレーション
その後に続くダイアフィルトレーションの間、保持液体積(retentate volume)は５回まで交換される。水緩衝液を連続的に添加することによって、保持液体積を一定のレベルに保持する。
それぞれ０．５ｌの透過液体積の場合の後で、圧力設定をチェックし、記録し（０．３５バールの一定ＴＭＰ）、保持液及び透過液からサンプルを採取する。更に、保持液フロー及び透過液フローを測定する。
【００３６】
濃縮
ダイアフィルトレーションの後で、場合により、水緩衝液の供給を中断することによって、保持液を元の体積の約５０％まで濃縮することもできる。
【００３７】
保持液の除去
保持液を除去するため、透過液フロー・リストリクタ弁(５)をゆっくりと閉じ、保持液を循環させてポンプ送りする。その後、装置内に０．５〜１ｌの洗浄緩衝液（＝死体積の１〜２倍）を導入し、保持液溜めの中に保持液をあける。
【００３８】
装置の清浄化
透過液フロー・リストリクタ弁(５)を閉じたままにして、装置を最初に２リットルの０．９％ＮａＣｌ溶液を用いて濯ぐ。ポンプ出力を保持液装置入口（Ｒ(入))の圧力を３バールになるように設定する。Ｒ(出)(７ｂ)のフロー・リストリクタ弁を完全に開く。それから、更に２リットルの０．９％ＮａＣｌ溶液を保持液循環部において約１０分間ポンプ送りする。
その後、２．５リットルの２％強度のクエン酸溶液を用いて装置を濯ぐ。圧力設定は同じ状態に保つ。装置から１番目の０．５リットルを排出し、その後、約１０分間で保持液循環部で溶液の運転を行う。
【００３９】
約２０リットルの脱イオン水を用いてクエン酸洗浄溶液を濯ぎ出す。その後、約４０℃に加熱した２．５リットルの１％強度ウルトラシル(Ultrasil)-62溶液（Henkel AG、ドイツ）を入れて濯ぐ。圧力設定は同じ状態の保持する。最初の０．５リットルを装置から排出し、その後、約１０分間保持液循環部で溶液の運転を行う。約２０リットルの脱イオン水を用いてUltrasil清浄化溶液を再び濯ぎ出す。
【００４０】
最終的に、４０℃に加熱された２．５リットルの１Ｎ ＮａＯＨ溶液を用いて、装置を濯ぐ。圧力設定は同じ状態の保持する。最初の０．５リットルを装置から排出し、その後、約１０分間保持液循環部で溶液の運転を行う。それから、透過液出口(５)におけるフロー・リストリクタ弁を完全に開く。続いて、約２０リットルの脱イオン水を用いて濯ぐことによって、装置から水酸化ナトリウム溶液を除去する。
最後に、（上述のようにして）水の値を再度測定する。
【００４１】
カセットの貯蔵
短期間の間（７日まで）、組込み式カセットを含む装置全体を脱イオン水中で保存する。それより長い期間（７日以上）の不使用には、組込み式カセットを含む装置全体を２０％水性エタノール中で保存する。
【００４２】
イン−プロセス(in-process)モニタリング
試料を遠心処理（１４０００×ｇ、１５分間）し、洗浄緩衝液(wash buiffer)を用いて適度に希釈する。続いて、２８０ｎｍにて、市販の分光光度計において対象キュベット（洗浄緩衝液）に対する光学濃度（ＯＤ))を測定する。
記載した実験プロトコルを用い、粗ホモジェネート（実施例１参照）の均一な部分から出発して、複数の濾過サイクルを実施した。
【００４３】
結果
インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）の第１のダイアフィルトレーション・サイクル（新しいヒドロザルト・スライス膜（０．１ｍ２、０．４５μｍ))の結果を、図１に示す。除去時間と共に、保持液からの可溶性成分の除去率は向上し、５５％のプラトーでの３．３体積交換の後で終了する。（完全に自由な膜に対応する）１００％から出発し、３．３体積交換の後で、透過率は９％の最終値へ向かって徐々に降下する。保持液フローは４６〜４８ｌ／ｈで実質的に一定である。透過流束は、３．３体積交換の後で、８２ｌ／ｈｍ２から２７ｌ／ｈｍ２へ徐々に低下している。
【００４４】
生成物ランの前に、新しい膜モジュールの水の値を３７．２ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１９６８ｌ／ｈｍ２（透過流束）として測定した。生成物ラン及びモジュールの清浄化（上記参照）の後、２２．８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１８００ｌ／ｈｍ２（透過流束）が測定された。
【００４５】
直ぐに続く生成物サイクルにおいて、正確に同じ出発条件を形成し、同じ出発生成物を用いた。最初の水の値は２２．８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１８４８ｌ／ｈｍ２（透過流束）であった。粗ホモジェネート中での濯ぎの後、１．５ｌ透過液体積後に、保持液フローは２．５ｌ／ｈに、透過流束は２ｌ／ｈｍ２に低下した。その結果、生成物ランを打ち切り、上記プロトコルに基づいて装置を初期状態へリセットした。装置を洗浄した後の水の値は、１９．４ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１７０４ｌ／ｈｍ２であった。
【００４６】
直後に続く生成物サイクルにおいて、正確に同じ出発条件を形成し（上記参照）、同じ出発生成物を用いた。生成物ランの前の水の値は、１９．６ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１６８０ｌ／ｈｍ２（透過流束）であった。このサイクルでは、装置の中へ粗ホモジェネート懸濁液を濯ぎ込むことはできなかった。保持液チャンネルは直ぐに閉塞した。その結果、生成物ランを打ち切り、上記プロトコルに基づいて装置を初期状態へリセットした。上述した標準的な清浄化プロトコルに基づいてカセットを清浄化することはできなかった。
【００４７】
結論
保持液フロー及び透過流束について説明した水の値に基づいて、並びに生成物ランについて上述した保持液フロー及び透過流束に基づいて、２３０ｇの湿潤細胞塊(wet cell mass)当量／リットルにて、粒状物付着によって保持液チャンネルが閉塞したことは明らかである。膜自体は、３回のサイクルでの３００ｇの湿潤細胞塊(wet cell mass)／ｍ２の膜のバイオマス負荷にて、被覆層の生成により著しい閉塞を生じた。
【００４８】
４．変性ヒドロザルト（登録商標）モジュールによるクロスフロー精密濾過
実験の構成、手順及び清浄化プロトコルは実施例１に示すように選択した。出発物質の調製（実施例１参照）、並びに膜のバイオマス負荷（３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２）及びバイオマス濃度（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）は、実施例２に示す条件と同様とした。
種々の型のスクリーン及びチャンネル構成を有する３種の変性ヒドロザルト（登録商標）モジュールについて試験した（実施例の部の一般的項目を参照）。膜自体は変えなかった（０．４５μｍの排除限界を有するヒドロザルト）。
【００４９】
４．１ タイプ＃１モジュールの結果
図２は、一例として、インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）の第１のダイアフィルトレーション・サイクル（新しいヒドロザルト・スライスモジュール・タイプ＃１（０．１ｍ２、０．４５μｍ））を示している。保持液からの可溶性成分の除去率は濾過時間に伴って上昇し、３．３体積交換の後で、６１％のプラトーにて終了している。（完全に自由な膜に対応する）１００％から出発し、３．３体積交換の後で、透過率は９％の最終値へ向かって徐々に降下する。保持液フローは８１〜８６ｌ／ｈで実質的に一定である。透過流束は、３．３体積交換の後で、８２ｌ／ｈｍ２から２１ｌ／ｈｍ２へ徐々に低下している。
【００５０】
生成物ランの前に、新たに購入した変性膜モジュールの水の値を５２．８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び２１３６ｌ／ｈｍ２（透過流束）として測定した。生成物ラン及びモジュールの清浄化（上記参照）の後、４６．８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１９６８ｌ／ｈｍ２（透過流束）が測定された。
【００５１】
７回の生成物ランが続く生成物ランにおける保持液フロー及び透過流束を図３ａに示している。生成物サイクルにおける保持液フローは、最初のサイクルの８６ｌ／ｈから、８回目のサイクルの１９ｌ／ｈへ低下している。第１と第２のサイクルの間で、生成物ランにおける最も大きい保持液フローの低下が観察された。平均透過流束は、１５ｌ／ｈｍ２〜３５ｌ／ｈｍ２の間で変動している。
すべての生成物ランにおいて、保持液からの可溶性成分の除去率は６０％〜８０％である。平均透過率は４０％〜８０％である。
【００５２】
ヒドロザルトタイプ＃１モジュールの清浄化からの結果、従って、生成物ランの前及び後での保持液フロー及び透過流束についての水の値を、図３ｂに示している。保持液の水の値はサイクルを通して着実に低下しており、５回目のサイクルにおいて急激に低下していることが明らかに観察される。標準的なヒドロザルトカセットの場合のように、これは保持液入口での閉塞の問題を示している。
８回のサイクルの間で、透過流束についての水の値は、２１３６ｌ／ｈｍ２から１３４４ｌ／ｈｍ２へ、即ち３７％低下している。個々の清浄化工程の効率は、８７％（最も低い工程効率）から１００％（最良の工程効率）の間である。
【００５３】
結論
変性ヒドロザルトカセットタイプ＃１は、向上した性能のデータを既に明らかに示しており、それを８回の生成物ランにわたって用いることができた。しかし、標準的ヒドロザルトカセットタイプ＃１は、同じ条件で、わずかに３回の生成物ランの後で不可逆的な閉塞を生じた。
複数のサイクルにわたる保持液チャンネルの閉塞の問題点は、タイプ＃１に用いたスクリーンの構成及びチャンネルの幾何形状に表れている。生成物サイクルの間及び複数のサイクルにわたる連続的な変化のために、タイプ＃１モジュールについて一定の操作ポイントを維持することも困難である。
【００５４】
４．２ タイプ＃２モジュールの結果
図４は、一例として、インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）の第１のダイアフィルトレーション・サイクル（新しいヒドロザルト・スライスモジュール・タイプ＃２（０．０５ｍ２、０．４５μｍ））を示している。保持液からの可溶性成分の除去率は濾過時間に伴って上昇し、３．８体積交換の後で、７５％のプラトーにて終了している。（完全に自由な膜に対応する）１００％から出発し、３．８体積交換の後で、透過率は２５％の最終値へ向かって徐々に降下する。平均透過率は５３％である。保持液フローは１９０ｌ／ｈで実質的に一定である。透過流束は、１５６ｌ／ｈｍ２の初期値から出発して、定常的に低下し、３８ｌ／ｈｍ２の値で終了している。生成物ランの前に、新たに購入した変性膜モジュールの水の値を６４８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び３７４４ｌ／ｈｍ２（透過流束）として測定した。生成物ラン及びモジュールの清浄化（上記参照）の後、７０８ｌ／ｈ（保持液フロー）及び３７２０ｌ／ｈｍ２（透過流束）が測定された。
【００５５】
６回の生成物ランが続く生成物ランにおける保持液フロー及び透過流束を図５ａに示している。生成物ランにおける保持液フローは、実質的に一定であって、１８５ｌ／ｈ付近で変動している。生成物ランにおいて保持液フローの急激な低下は観察されない。平均透過流束は５０ｌ／ｈｍ２付近で変動している。
すべての生成物ランにおいて、保持液からの可溶性成分の除去率は６０％〜８０％である。平均透過率は４５％〜７５％である。
ヒドロザルトタイプ＃２モジュールの清浄化からの結果、従って、生成物ランの前及び後での保持液フロー及び透過流束についての水の値を、図５ｂに示している。保持液フローの水の値は最初のサイクルでの６５０〜７００ｌ／ｈと、最後のサイクルでの５８０ｌ／ｈとの間でわずかに変動している。このことは、標準的なヒドロザルトカセット及び変性ヒドロザルトタイプ＃１モジュールと対比して、保持液入口での閉塞の問題が明らかに低下したことを示している。
７回のサイクルの間で、透過流束についての水の値は、３７４４ｌ／ｈｍ２から３４０８ｌ／ｈｍ２へ、即ちわずかに９％低下している。個々の清浄化工程の効率は、９２％（最も低い工程効率）から１０５％（最良の工程効率）の間である。
【００５６】
結論
変性ヒドロザルトカセットタイプ＃２は、標準的ヒドロザルトモジュールと比較して、及びヒドロザルトタイプ＃１モジュールと比較して、明らかに向上した性能のデータを示しており、それを７回の生成物ランにわたって用いることができた。しかし、標準的なヒドロザルトカセットは、同じ条件で、わずかに３回の生成物ランの後で不可逆的な閉塞を生じた。
ヒドロザルトタイプ＃２モジュールに用いたスクリーンの構成及びチャンネルの幾何形状について、複数のサイクルにわたる保持液チャンネルの閉塞の問題点は著しく低下している。１回の生成物ラン及び複数のサイクルで一定の条件であるため、バイオマス負荷が３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）であっても、ヒドロザルトタイプ＃２モジュールの場合には安定した操作ポイントを保つことができる。
【００５７】
４．３ タイプ＃３モジュールの結果
図６は、一例として、インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃２）の第１のダイアフィルトレーション・サイクル（新しいヒドロザルト・スライスモジュール・タイプ＃３（０．１ｍ２、０．４５μｍ））を示している。これらの実験では、保持液体積は３．１ｌ（０．５５ｌ死体積）に低下している。保持液からの可溶性成分の除去率は濾過時間に伴って上昇し、３．８体積交換の後で、７７％のプラトーにて終了している。（完全に自由な膜に対応する）１００％から出発し、３．８体積交換の後で、透過率は２５％の最終値へ向かって着実に降下している。保持液フローは１２９〜１３２ｌ／ｈで実質的に一定である。透過流束は、３１．７ｌ／ｈｍ２（±２．９５）の平均値で実質的に一定である。
【００５８】
生成物ランの前に、新たに購入した変性膜モジュールの水の値を１０５．６ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１３２０ｌ／ｈｍ２（透過流束）として測定した。生成物ラン及びモジュールの清浄化（上記参照）の後、１１０．４ｌ／ｈ（保持液フロー）及び１３４４ｌ／ｈｍ２（透過流束）が測定された。
【００５９】
Durapore Ｖ−スクリーン・カセット（排除限界０．４５μｍ、濾過面積０．１ｍ２、親水性化されたポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、オープンチャンネルモジュール）を用いて、同じ条件下で平行実験を行った。実施例２に記載したものと同じ実験の構成を採用したが、カセットホルダーはDurapore膜用の対応するホルダーに交換した。この実験において、バイオマス負荷（粗ホモジェネート部分＃２）は３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２又は２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットルであった。保持液体積は１．３ｌであり、３．８体積交換を行った（５ｌ透過液体積）。保持液フローは９０ｌ／ｈであった。初期ＴＭＰは０．３バールに固定した。この実験では、他の実験のように、ＴＭＰを一定に保つことはせず、透過流束を３８ｌ／ｈｍ２の値に固定した。ＴＭＰの上昇は、他の実験において透過流束の低下を示したのと同様に、膜細孔の閉塞が同程度であることを示している。
３．８体積の交換の後、７０％の除去率が得られた。透過率は１００％から１０％へ低下した。濾過の間にＴＭＰは０．３バールから０．６５バールへ上昇した。この実験では、保持液フローを追跡しなかった。
【００６０】
結論
ヒドロザルトタイプ＃３は、同じ条件下で、Durapore Ｖ−スクリーンモジュールと比較して、より良好な性能データを示している。ヒドロザルトタイプ＃３モジュールは保持液から約８０％の可溶性タンパク質含量を除去しているが、Durapore Ｖ−スクリーンモジュールは約７０％の除去率を達成している。２つの場合における透過率の変化は対応している。しかしながら、特に、透過流束（及びＴＭＰ）はヒドロザルトタイプ＃３モジュールについてはほぼ定常的であり、一方、Durapore Ｖ−スクリーンモジュールの場合には、試験した他のタイプのものについて観察されたのと同様に、ＴＭＰは明らかに上昇（及び透過流束は低下）している。
【００６１】
４．３．１ 膜のバイオマス負荷の段階的増加
ヒドロザルトタイプ＃３モジュールを用いる場合には、保持液フロー及び透過流束は濾過期間にわたって実際に一定に保たれ、以下の一連の実験において、保持液のバイオマス濃度及び膜のバイオマス負荷は５のファクターまで段階的に上昇した。第２の部分の粗ホモジェネート（＃２）を用いた。
【００６２】
膜のバイオマス負荷を増大させながら、４回の生成物ランが続く生成物ランにおける保持液フロー及び透過流束を図７ａに示している。生成物ランにおける保持液フローは、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２の第１のサイクルでの１３０ｌ／ｈから、１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２の第４のサイクルでの１００ｌ／ｈへ低下している。従って、バイオマス負荷の５００％の増加について、保持液フローは２３％だけ低下している。平均透過流束は、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２の第１のサイクルでの３０ｌ／ｈｍ２から、１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２の第４のサイクルでの１０ｌ／ｈｍ２へ低下している。従って、バイオマス負荷の５００％の増加について、透過流束は５０％だけ低下している。
【００６３】
保持液からの可溶性成分の除去率は、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２での７５％から、バイオマス負荷を５、１０及び１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２へ増加させると、約６０％変動している。平均透過率は３０％から４０％の間である。ヒドロザルトタイプ＃３モジュールの清浄化からの結果、従って、生成物ランの前及び後での保持液フロー及び透過流束についての水の値を、図７ｂに示している。保持液フロー及び透過流束の両者についての水の値は実質的に一定であるが、膜のバイオマス負荷は５００％増大した。このことは、保持液入口における閉塞の問題及び膜細孔における閉塞の問題点は、モジュールへの構造的変化によって著しく低下したことを示している。
各清浄化工程の効率は、９３％（最も低い工程効率）から１００％（最良の工程効率）の間である。
【００６４】
もう１つの実験によって、ヒドロザルトタイプ＃３モジュールの可能なバイオマス負荷の正確な限界を調べた。このために、ダイアフィルトレーションの開始のために用いた１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２から出発し、保持液中の封入体の濃度を特定の時間で上昇させた。この実験の結果を図８（Ａ）に示す。保持液中のバイオマス濃度を１１５３ｇの湿潤細胞塊当量／ｌから１７３３ｇ／ｌへ５０％上昇させると、保持液フローは１０８ｌ／ｈから７２ｌ／ｈへ、従って３３％低下している。１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２から２６ｋｇ／ｍ２へ膜のバイオマス負荷が７０％上昇すると、透過流束は約１６ｌ／ｈｍ２から約７ｌ／ｈｍ２へ、従って５６％低下している。従って、膜のバイオマス負荷についての上限は、約２２ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２である。この限度以上では、まず透過流束が１０ｌ／ｈｍ２以下に低下し、次いで、保持液フローは明らかに更に低下する。
【００６５】
以下のサイクルにおいて、可能なバイオマス負荷を３０ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２に更に上昇させることは、これは２３０７ｇの湿潤細胞塊当量／ｌに対応するが、できず、濯ぎ工程の間で保持液入口の閉塞をもたらした。しかしながら、モジュールはまだ十分に清浄化可能であって、標準的清浄化プロトコル（実施例２参照）を行った後、１２２ｌ／ｈの保持液水値及び１３２０ｌ／ｈｍ２の透過液水値を示した。
【００６６】
標準的ヒドロザルトモジュール（０．１ｍ２、スライスフォーマット、ロット番号(Lot No.)９６１０８７４１／Ｎｏ．００８）を用いる比較実験において、第３の部分の粗ホモジェネート（＃３）を用いて、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）から出発すると、保持液のバイオマス濃度を１０ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２へ段階的に上昇させた（図８（Ｂ))。生成物ランにおける保持液フロー及び透過流束は、１つのバイオマス濃縮工程であっても、著しく低下している。１０ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（７６９ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）で、透過流束は既にわずかに１２〜１３ｌ／ｈｍ２であるが、わずかな透過液体積をダイアフィルトレーションに付した。
【００６７】
結論
変性ヒドロザルトカセットタイプ＃３は、著しく向上した性能のデータを示しており、バイオマス負荷を５００％増大させて、それを５回の生成物ランにわたって用いることができた。標準的なヒドロザルトカセットは、同じ実験条件で、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２のバイオマス負荷で、３回の生成物ランの後、既に不可逆的な閉塞を生じていた。
【００６８】
タイプ＃３に用いたスクリーンの構成及びチャンネルの幾何形状について、複数のサイクルにわたる保持液チャンネルの閉塞の問題はもはや明らかである。１回の生成物サイクル及び複数のサイクルにわたって、一定の条件であるために、２２ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（１４６６ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）までのバイオマス負荷であっても、ヒドロザルトタイプ＃３を用いて安定な操作ポイントを維持することができる。
直接の比較では、標準的ヒドロザルトモジュールは、著しく低下したバイオマス負荷にて、明らかにより低い性能を示している。
【００６９】
４．３．２ 種々の粗ホモジェネート部分の効果
一連の実験において、異なるバッチの粗ホモジェネートによって生じる効果を同様に記録するため、１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２のバイオマス負荷にて、異なる粗ホモジェネートの部分（＃３）と共にヒドロザルトタイプ＃３モジュールを用いた。
新しい粗ホモジェネート部分＃３についての生成物ランの保持液フローは、３サイクルで３５ｌ／ｈと一定であった。３サイクルで透過流束は１０〜１５ｌ／ｈｍ２の範囲で一定であった。除去率は４０％〜５０％であり、平均透過率は２０％〜３０％である。
標準的な清浄化プロトコルを行った後、水の値は、透過液水値が１３００ｌ／ｈｍ２及び保持液水値が１００ｌ／ｈであった。
【００７０】
結論
異なるバッチの粗ホモジェネート（＃３）に替えても、粗ホモジェネート（＃１）の第１のバッチを用いた前の実験において得られたものと対比し得る透過流束が得られている。保持液フラックスは、前の実験のように明らかに低い。ヒドロザルトタイプ＃３モジュールの清浄化性は一定の高いレベルに保たれた。
【００７１】
４．３．３ ヒドロザルトタイプ＃３モジュールの操作ポイント測定
図９ａ／９ｂは、３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（２３０ｇ／リットルに対応）のバイオマス負荷にてヒドロザルトタイプ＃３モジュールの操作ポイント測定を示している。図９ａにおけるグラフ表示は、２５ｇの湿潤細胞塊当量／ｌから１００ｇの湿潤細胞塊当量／ｌでのDurapore膜（０．４５μｍ）についての操作ポイント測定について記載したFormanらによって選択されたものに対応している。これらの文献のデータを、変性ヒドロザルトタイプ＃３モジュールについての図９ａに示されたデータと比較すると、以下の特徴が注目に値する：
変性ヒドロザルトタイプ＃３モジュールについての最適ＴＭＰは０．３５バールであること。この最適値を越えて増大すると透過流束が低下すること、及びこのことは膜の被覆層の肥厚化によって説明できること。
【００７２】
ヒドロザルトタイプ＃３モジュールを用いるこの実験において得られた透過流束は約２０ｌ／ｈｍ２である。１００ｇの湿潤細胞塊当量のバイオマス濃度にてDuraporeモジュールにより得られた最大透過流束は、８ｌ／ｈｍ２以下である。Durapore膜についての最適ＴＭＰは、約０．１バールである。
図９ｂは、３次元表示での同じ操作ポイント測定を示している。全体的な最適値は、０．３５のＴＭＰ及び１００ｌ／ｈのフィルターに存在している。更に、７０ｌ／ｈ及び１５０ｌ／ｈであって、やはり０．３５バールのＴＭＰに、局部的な最適値が観察された。最適な操作ポイントの一覧を表２にまとめる。
【００７３】
【表２】
【００７４】
０．３５バールの膜間差圧は、標準的ヒドロザルトモジュールについても最適であることが既に見出されている（データは特に示さない）。
【００７５】
４．３．４ クロスフロー精密濾過によるエンドトキシン除去
濾過面積の１５ｋｇ又は４５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２のバイオマス負荷で、ヒドロザルトタイプ＃３モジュール（フィルター面積０．１ｍ２）を用いる別の実験において、以下の結果及びエンドトキシン除去が得られた。
【００７６】
【表３】
【００７７】
４．３．５ ０．６ｍ２モジュールフォーマットへのスケールアップ
表４（原表３）は、スケールアップ十ヶの結果を示している。これらの実験では、モジュールあたりのフィルター面積（Sartocon ２／３フォーマット）が０．６ｍ２であるヒドロザルトタイプ３モジュールを用いた。使用した装置は、基本的に、実施例２に説明したものと同様の構成を有している。しかしながら、スライスカセットホルダーはSartocon３カセットホルダーに交換しており、ポンプを適度な大きさ（４ｍ３／ｈ）で、二重面シール（Johnson）を有する回転ピストンポンプに交換した。保持液溜め体積は５リットルへ拡大し、装置の死体積は２．５リットルであった。他の体積（例えば、清浄化用及び洗浄緩衝液体積）はそれに応じて調節した。
【００７８】
【表４】
（原表３）E.Coli粗ホモジェネート精密濾過のスケール・アップについての実験結果のまとめ。例として、インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を使用した。
【００７９】
結果
表４（原表３）に適合するデータは、Sartocon３モジュールフォーマットを用いて、Sliceモジュールフォーマットのデータに従って変更して、ヒドロザルトタイプ３モジュールについて均等目盛を用いてことができることを示している。６の係数でスケール・アップすることによって、生成物ランにおける保持液フローのほぼ正確な６倍への上昇が得られた。これに対応して、保持液水値は６倍で上昇した。他の性能データ、例えば生成物ランの透過流束、透過液水値、除去率及び塗料は、特定の測定の精度限界の中で同程度に保たれた。
【００８０】
引用文献
Apeler H, Wehlmann H (1998): Plasmids, their construction and their use in the manufacture of interleukin-4 and Interleukin-4 muteins. Europeran Patent application EP00100129.6, 2000年1月7日出願。
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Sharma SK(1986):J.Biotechnol. 4:119-124
Taylor G(1986):Bio/Technology 4:553-557
【図面の簡単な説明】
【図１】 インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入したヒドロザルト Slice標準モジュール（０．１ｍ２）3051860601 Ｗ-ＳＧ、Lot No.96108741/13を用いた１番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積２．５５ｌ（１１７ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図２】 インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃１（０．１ｍ２）Lot No.98025101を用いた１番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積２．５５ｌ（１１７ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図３ａ】 サイクル数の関数としての生成物ランの保持液フロー（ｌ／ｈ）及び平均透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃１（０．１ｍ２）Lot No.98025101を用いた１番目〜９番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積２．５５ｌ（１１７ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図３ｂ】 生成物ランの前後における水値。サイクル数の関数としての保持液フロー（ｌ／ｈ）及び透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃１（０．１ｍ２）Lot No.98025101を用いた１番目〜９番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積２．５５ｌ（１１７ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図４】 インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃２（０．０５ｍ２）Lot No.98055101を用いた１番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積1 ．3ｌ（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図５ａ】 サイクル数の関数としての生成物ランの保持液フロー（ｌ／ｈ）及び平均透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃２（０．０５ｍ２）Lot No.98055101を用いた１番目〜７番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積１．３ｌ（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図５ｂ】 生成物ランの前後における水値。サイクル数の関数としての保持液フロー（ｌ／ｈ）及び透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃１）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃２（０．０５ｍ２）Lot No.98055101を用いた１番目〜７番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積１．３ｌ（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図６】 インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃２）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃３（０．１ｍ２）Lot No.98015111を用いた１番目の生成物サイクル。３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇ湿潤細胞塊当量／ｍ２）。全保持液体積１．３ｌ（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。
【図７ａ】 膜のバイオマス負荷の増大についてのサイクル数の関数としての生成物ランの保持液フロー（ｌ／ｈ）及び平均透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃２）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃３（０．１ｍ２）Lot No.99015111を用いた１番目〜５番目の生成物サイクル。２３０ｇ湿潤細胞塊当量／ｌ、３８４ｇ／ｌ、７７０ｇ／ｌ、１１５３ｇ／ｌにそれぞれ対応する、３ｋｇ／ｍ２、５ｋｇ／ｍ２、１０ｋｇ／ｍ２、１５ｋｇ／ｍ２の湿潤細胞塊当量。
【図７ｂ】 生成物ランの前後における水値。サイクル数の関数としての保持液フロー（ｌ／ｈ）及び透過流束（ｌ／ｈｍ２）。インターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃２）のダイアフィルトレーション。新たに購入した変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃３（０．１ｍ２）Lot No.99015111を用いた１番目〜５番目の生成物サイクル。２３０ｇ湿潤細胞塊当量／ｌ、３８４ｇ／ｌ、７７０ｇ／ｌ、１１５３ｇ／ｌにそれぞれ対応する、３ｋｇ／ｍ２、５ｋｇ／ｍ２、１０ｋｇ／ｍ２、１５ｋｇ／ｍ２の湿潤細胞塊当量。
【図８】 バイオマス負荷の段階的増大
Ａ．変性ヒドロザルト Sliceモジュールタイプ＃３（０．１ｍ２）Lot No.98015111を用いたインターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃２）のダイアフィルトレーション。開始条件：１５００ｇの湿潤細胞塊当量（１５ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２）。保持体積１．３ｌ（１１５３ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。ダイアフィルトレーションを続ける間、グラフに示す時間で、膜のバイオマス負荷を２０、２２、２４、そして最終的には２６ｋｇ／ｍ２へ段階的に増大させる。保持液の体積変化のため、この結果は１１７６ｇの湿潤細胞塊当量／ｌ、１４６６ｇ／ｌ、１６００ｇ／ｌ、そして最終的には１７３３ｇ／ｌに対応する。
Ｂ．標準的ヒドロザルト Sliceモジュール（０．１ｍ２）Lot No.96108741/008を用いたインターロイキン−4 R121D Y124Dの封入体を有するE.Coli粗ホモジェネート（部分＃３）のダイアフィルトレーション。開始条件：３００ｇの湿潤細胞塊当量（３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２）。保持体積１．３ｌ（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）。ダイアフィルトレーションを続ける間、グラフに示す時間で、膜のバイオマス負荷を５ｋｇ／ｍ２へ、そして最終的には１０ｋｇ／ｍ２へ段階的に増大させる。低い透過流束のため、実験を打ち切った。保持液体積を１．３Ｌで一定に保持した。この結果は、３８４ｇ及び７６９ｇの湿潤細胞塊当量／ｌに対応する。
【図９ａ】 変性ヒドロザルト タイプ＃３モジュールの操作ポイントの測定 バイオマス負荷３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）、粗ホモジェネート（部分＃２）。膜間差圧（ＴＭＰ）の関数として、透過流束をプロットしている。保持液フロー（Ｆｒ）は約１１０ｌ／ｈ及び約１４０ｌ／ｈに固定した。実験は、全体積フローを完全にリサイクルして行った。
【図９ｂ】 変性ヒドロザルト タイプ＃３モジュールの操作ポイントの測定 バイオマス負荷３ｋｇの湿潤細胞塊当量／ｍ２（２３０ｇの湿潤細胞塊当量／リットル）、粗ホモジェネート（部分＃２）。膜間差圧（ＴＭＰ）及びフィード（＝保持液フロー＋透過液フロー）の関数として、透過流束をプロットしている。実験は、全体積フローを完全にリサイクルして行った。
【図１０】 クロスフロー精密濾過装置の実験的構成(setup)の模式図である。使用したシステムの死体積は０．５５Ｌである。
【符号の説明】
１：レベルインジケータを有する（撹拌式の）保持液溜め（洗浄緩衝液ポンプ(９)で制御）
２：ロータリーピストンポンプ
３：ヒドロザルト Sliceカセット（０．１ｍ２濾過面積）を備えたカセットホルダ（Sartocon Slice フォーマット、Sartorius AG、ドイツ）
４：フロー・リストリクタ弁保持液側出口
５：フロー・リストリクタ弁透過液側出口
６：透過液受器
７：圧力ゲージ Ｒ(入)＝７ａ、Ｒ(出)＝７ｂ、Ｐ＝７ｃ
８：洗浄緩衝液ポンプ
９：洗浄緩衝液溜め
Claims (3)
- ３０ｋｇまでの湿潤細胞塊当量／ｍ ２ のバイオマス負荷を有する溶液中の封入体を濃縮及び／又は精製する方法であって、封入体を含有する溶液を１又はそれ以上の半透膜に対して接線方向に導き、膜は封入体を留めて、０．１〜０．６５μｍの範囲の粒子直径を有する成分若しくは物質には膜を通過させて、濃縮された及び／又は精製された封入体（溶）液を得ること、並びに、半透膜上に縦方向フィラメントと横方向フィラメントとを交差させて形成されるメッシュのマトリックスが配されており、前記マトリックスにおいて隣接する縦方向フィラメント及び横方向フィラメントの相互の間隔は、それぞれ１５０〜６００μｍの範囲のフィラメント厚みよりも５〜１５倍大きい間隔であることを特徴とする方法。
- 膜のバイオマス負荷は、６５ｇ以上の湿潤細胞塊当量／ｍ２であることを特徴とする請求項１記載の方法。
- 膜のバイオマス負荷は、６５０ｇ以上の湿潤細胞塊当量／ｍ２であることを特徴とする請求項１記載の方法。
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