KR20080080137A - 댕기 바이러스의 네 혈청형 및 그외 플라비바이러스의 예방및/또는 치료를 위한 방법 및 단백질 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 약학 산업 분야에 관한 것이며, 댕기 바이러스 혈청형 1-4 및 그외 플라비바이러스에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에 사용될 광범위 항바이러스 분자의 개발에 사용될 수 있는 E 단백질의 표면 상의 보존 영역을 기술한다. 본 발명은 또한 4가지 혈청형의 댕기 바이러스 및 그외 플라비바이러스에 대한 백신으로서 또는 예방 또는 치료적 처리로서 사용될 키메릭 단백질도 기술한다.
댕기 바이러스, 플라비바이러스, 외피 단백질, 비리온

Description

댕기 바이러스의 네 혈청형 및 그외 플라비바이러스의 예방 및/또는 치료를 위한 방법 및 단백질{METHODS AND PROTEINS FOR THE PROPHYLACTIC AND/OR THERAPEUTIC TREATMENT OF THE FOUR SEROTYPES OF DENGUE VIRUS AND OTHER FLAVIVIRUSES}
본 발명은 약학 산업 분야에 관한 것이며, 댕기 바이러스 혈청형 1-4 및 그외 플라비바이러스에 의한 감염의 예방 및 치료에 사용될 광범위 항바이러스 분자의 개선에 사용될 수 있는 E 단백질의 표면에서의 보존 영역을 기술한다. 본 발명은 댕기 바이러스 및 그외에 다른 플라비바이러스의 예방 및/또는 치료적 처리에 유용한 방법 및 단백질을 기술한다.
댕기 바이러스(DV) 복합체는 플라비리대(Flaviviridae ) 과에 속하며, 유전학적으로 및 항원적으로 관련된 4개의 다른 바이러스 또는 혈청형(DV1-DV4)으로 구성되어 있다. DV는 모기, 주로 열대숲모기(Aedes aegypti)를 통해 사람에게 전파된다. 감염은 미분화 발열 에피소드와 같은 무증후성 및 양성 발현으로부터 댕기출혈열(Dengue Hemorrhagic Fever ; DHF) 및 치명적인 댕기 쇼크 신드롬(Dengue Shock Syndrome ; DSS)과 같은 심각한 발현까지의 범위의 다양한 임상 증상을 생성한다. 더 심각한 임상 증상은 일반적으로 두 개의 다른 혈청형으로의 순차적인 감염에 관 련되어 있으며( Halstead ,S.B. Neutralization and antibody - dependent enhancement of dengue viruses . Adv . Virus Res . 60:421-67., 421-467, 2003. Hammon WMc . New haemorragic fever in children in the Philippines and Thailand . Trans Assoc Physicians 1960; 73: 140-155), 이 발견은 여러 유전병학적 연구에 의해 보강되었다( Kouri GP , Guzman MG , Bravo JR . Why dengue hemorrhagic fever in Cuba ? 2. An integral analysis . Trans Roy Soc Trop Med Hyg 1987; 72: 821-823). 이러한 현상은 항체-의존 향상(antibody-dependant enhancement ; ADE)의 이론에 의해 설명되며, 이는 이러한 경우에서 세포에 존재하는 Fc 수용체에 의해 매개되는 표적(단핵구)으로의 바이러스-항체 복합체의 혼입의 증가로 인한 바이러스 감염성의 증가를 주장한다( Halstead SB . Pathogenesis of dengue: challenges to molecular biology . Science 1988; 239: 476-481).
외피 당단백질(E-protein)은 바이러스 외피의 가장 큰 구조 단백질이다. DEN2 및 DEN3 바이러스로부터의 E-단백질의 엑토도메인(ectodomain)의 단편의 삼차원 구조가 최근에 x-선 회절 기술에 의해 해석되었으며( Modis ,Y., Ogata , S., Clements , D. & Harrison , S.C. A ligand - binding pocket in the dengue virus envelope glycoprotein. Proc . Natl . Acad . Sci . U. S. A 100, 6986-6991,2003. Modis , Y., Ogata, S., Clements , D., and Harrison , S.C. Variable Surface Epitopes in the Crystal Structure of Dengue Virus Type 3 Envelope Glycoprotein. J. Virol . 79, 1223-1231, 2005), 이는 진드기-매개 뇌염 바이러스의 결정 구조에 대해 높은 정도의 구조적 유사성을 가짐을 나타낸다( Rey ,F.A., Heinz ,F.X., Mandl ,C., Kunz ,C. & Harrison ,S.C. The envelope glycoprotein from tick - borne encephalitis virus at 2 A resolution . Nature 375, 291-298 ,1995). 이러한 구조 유사성은 이들의 서열 상동성, 6개의 디설피드 결합의 보존 및 항원성 결정의 일부 또는 감쇠 또는 탈출(escape) 돌연변이에 포함되는 바와 같은 기능적 역할이 다른 플라비바이러스에서 기인되는 잔기 위치의 보존과 일치한다.
E 단백질은 3가지의 구조 도메인으로 형성된다: 서열의 N-말단에 위치하지만 3D 구조에서 중심 도메인을 형성하는 도메인; 플라비바이러스에 걸쳐 고도로 보존되는 융합 단백질을 포함하는, 이합체화 도메인으로도 알려진 도메인 II; 및 세포성 수용체와의 상호작용에 관련된 면역글로불린-유사 폴드(fold)를 갖는 도메인 III.
E 단백질은 바이러스 생존 주기의 여러 단계에서 중심 역할을 수행하는 다기능성 당단백질이다. 이러한 단백질은 바이러스-중화 항체에 대한 주요 표적이며, 세포 수용체와의 상호작용을 매개하고 바이러스 및 세포 막 사이의 융합을 작동시키는 엔진이다( Heinz , F. X., and S. L. Allison . 2003. Flavivirus structure and membrane fusion . Adv . Virus Res . 59:63-97. Modis , Y., S. Ogata , D. Clements , and S. C. Harrison . 2004. Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion . Nature 427:313-319. Rey 2004. Chen , Y., T. Maguire , R. E. Hileman , J. R. Fromm , J. D. Esko , R. J. Linhardt , and R. M. Marks . 1997. Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate . Nat . Med . 3:866-871. Navarro - Sanchez , E., R. Altmeyer , A. Amara, O. Schwartz , F. Fieschi , J. L. Virelizier , F. Arenzana - Seisdedos , and P. Despres . 2003. Dendritic - cell - specific ICAM3 - grabbing non - integrin is essential for the productive infection of human dendritic cells by mosquito -cell-derived dengue viruses . EMBO Rep . 4:1-6. Tassaneetrithep , B., T. H. Burgess, A. Granelli - Piperno , C. Trumpfheller , J. Finke , W. Sun , M. A. Eller , K. Pattanapanyasat , S. Sarasombath , D. L. Birx , R. M. Steinman , S. Schlesinger, and M. A. Marovich . 2003. DC - SIGN ( CD209 ) mediates dengue virus infection of human dendritic cells . J. Exp . Med . 197:823-829).
이 단백질은 바이러스 막에 부착되어 있으며 이의 기능은 삼차 및 사차 구조 둘 다에서 큰 조직적 변화에 관련되어 있다. 바이러스 형성의 세포내 단계 동안에, E는 프리엠(preM) 단백질과 함께 이형질량체로서 발견되었다( Allison , S. L., K. Stadler, C. W. Mandl , C. Kunz , and F. X. Heinz . 1995. Synthesis and secretion of recombinant tick - borne encephalitis virus protein E in soluble and particulate form . J. Virol . 69:5816-5820. Rice , C. M. 1996. Flaviviridae : the viruses and their replication , p. 931-959. In B. N. Fields , D. N. Knipe , P. M. Howley, R. M. Chanock , J. L. Melnick , T. P. Monath , B. Roizman , and S. E. Straus (ed.), Virology , 3 rd ed . Lippincott - Raven , Philadelphia , Pa .). 이 단계 동안에 비리온은 미성숙하며 성숙한 세포외 비리온과 비교했을 때 생체외에서 극적으로 낮은 감염성이 증명된 바와 같이 막 융합을 매개하는데 불완전하다(Guirakhoo , F., Heinz, F. X., Mandl , C. W., Holzmann , H. & Kunz , C. Fusion activity of flaviviruses: comparison of mature and immature ( prM containing ) tick-borne encephalitis virions . J. Gen . Virol . 72, 1323-1329,1991. Guirakhoo , F., Bolin , R. A. & Roehrig , J. T. The Murray Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters the expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein . Virology 191, 921-931,1992). 이의 산성 pH에 기인하여 막 융합 과정을 촉발할 수 있는 세포내 구획을 통한 비리온의 수송 동안에 이형질량체의 역할은 막으로의 E 단백질의 결합을 예방하기 위한 것임이 주장되었다. 게다가, 프리엠 단백질은 E 단백질의 폴딩 및 조립에 대한 샤페론(chaperone)으로서 작용하는 것이 가능하다( Lorenz , I. C., Allison , S. L., Heinz , F. X. & Helenius, A. Folding and dimerization of tick - borne encephalitis virus envelope proteins prM and E in the endoplasmic reticulum. J. Virol . 76, 5480-5491, 2002). 세포 외부로 비리온이 분비되는 동안에, 프리엠은 숙주 프로테아제(푸린; furins)에 의해 효소학적으로 처리되며, 동형이량체로서 결합하기 위해 E를 자유롭게 떨어지게 하여 성숙한 비리온으로 종결되는 바이러스 외피의 인식을 촉발한다( Stadler , K., Allison , S. L., Schalich , J. & Heinz , F. X. Proteolytic activation of tick - borne encephalitis virus by furin. J. Virol . 71, 8475-8481, 1997. Elshuber , S., Allison , S. L., Heinz , F. X. & Mandl , C. W. Cleavage of protein prM is necessary for infection of BHK -21 cells by tick - borne encephalitis virus . J. Gen . Virol . 84, 183-191, 2003). 성숙한 비리온의 구조는 9.5 Å의 분해능에서( Zhang W, Chipman PR , Corver J, Johnson PR , Zhang Y, Mukhopadhyay S, Baker TS , Strauss JH , Rossmann MG , Kuhn RJ. Visualization of membrane protein domains by cryo - electron microscopy of dengue virus . Nat Struct Biol . 2003, 10: 907-12. Kuhn , R. J. et al . Structure of dengue virus : implications for flavivirus organization , maturation , and fusion. Cell 108, 717-725, 2002), 미성숙 비리온의 구조는 12.5 Å에서( Zhang , Y. et al . Structures of immature flavivirus particles . EMBO J. 22, 2604-2613 , 2003) 전자 저온현미경(electronic cryomicroscopy)에 의해 결정되었다. 이러한 비리온들은 T=3 정이십면체 대칭을 갖는다. 성숙한 비리온에서 E 단백질 이량체는 바이러스 막에 평행하여 평면상에 놓여있으며 이의 표면을 거의 완전히 덮는다. 성숙한 비리온은 완전한 감염성이며 이는 바이러스가 숙주에 의해 유도되는 항체 및 세포성 수용체와 상호작용하는 구조에 의한 것이다. 바이러스가 세포성 수용체에 관여하게 되면, 수용체-매개 세포내이입을 통해 습득되며 결국 엔도솜에 이르게 되는데, 약한 산성 pH는 막 융합 과정을 시작하는 E 단백질에서의 구조적 변화를 촉발한다( Allison , S. L. et al . Oligomeric rearrangement of tick - borne encephalitis virus envelope proteins induced by an acidic pH . J. Virol . 69, 695-700, 1995). 이 과정에서 단백질은 이량체에서 삼량체까지 인식한다. E 단백질의 친-융합성 구조는 최근에 결정되었으며( Modis , Y., Ogata , S., Clements , D. & Harrison , S. C. Structure of the dengue virus envelope protein after membrane fusion . Nature 427, 313-319 (2004). Bressanelli , S. et al . Structure of a flavivirus envelope glycoprotein in its low - pH - induced membrane fusion conformation . EMBO J. 23, 728-738 (2004), 이는 삼량체 형성이 융합 펩티드를 갖는 도메인 II의 끝부분이 막과 상호작용하는 동안 평행으로 결합되는 단량체를 갖는 삼차 구조에서 중요한 재배열을 포함함을 나타낸다. 결정 구조 및 해결된 비리온 구조를 함께 분석함에 의해 바이러스 생존 주기를 통해 E 단백질이 비리온 자체 뿐만 아니라 이의 삼차 및 사차 구조가 극적으로 변화되는 재배열을 겪게 됨이 명백해졌다.
E 단백질은 바이러스 감염 동안에 생성되는 중화 항체의 주요 표적이다. 단일 혈청형에 의한 감염은 동질성 혈청형의 바이러스에 대항하는 수명이 긴 항체를 유도한다. 감염 후 첫달 동안에 이러한 항체들은 이질성 혈청형도 중화할 수 있으나, 이의 활성은 이들이 사라질 때까지 감염 후 약 9달 정도 느리게 감소한다(Halstead S.B. Neutralization and antibody - dependent enhancement of dengue viruses . Adv Virus Res . 2003;60: 421-67. Sabin , A. B. 1952. Research on dengue during World War II . Am . J. Trop . Med . Hyg .1: 30-50.).
하나의 혈청형에 대하여 생성되는 항체는 일반적으로 다른 혈청형의 바이러스와 상호작용할 때 감소된 친화성을 나타낸다; 현상은 DV 혈청형 중 E 단백질의 아미노산 서열에서의 변이에 의해 분자 수준에서 설명된다. 충분히 낮은 친화성의 상호작용은 중화하는 것을 실패하는 항체를 야기할 수 있으나, 여전히 Fc 수용체를 수반하는 세포 내로 바이러스의 내재화를 촉진하기에 충분한 양으로 바이러스 표면에 결합한다( Halstead , S. B., and E. J. O'Rourke . 1977. Dengue viruses and mononuclear phagocytes . I. Infection enhancement by non - neutralizing antibody. J. Exp . Med . 146:201-217. Littaua , R., I. Kurane , and F. A. Ennis . 1990. Human IgG Fc receptor II mediates antibody - dependent enhancement of dengue virus infection . J. Immunol . 144:3183-3186).
게다가, 이차 감염 동안 저-친화성 항체 집단의 역가는 유입 DV 혈청형에 의해 생산되는 고-친화성 항체의 역가보다 크며, 이는 천연 B-세포에 비해 이미 존재하는 B-세포 및 혈장 세포의 더 빠른 활성화에 의한 것이다. 이차 감염으로부터의 회복기 동안의 항체 프로필은 일차 DV 감염의 혈청형에 의해 크게 영향받으며, 이는 "항원성 원죄(original antigenic sin)"로 알려진 현상의 단순한 징후라는 사실이다( Halstead , S.B., Rojanasuphot , S., and Sangkawibha , N. 1983. Original antigenic sin in dengue . Am . J. Trop . Med . Hyg . 32 :154-156).
반면에, 높은 효능의 중화 모노클로날 항체(mAbs)는 높은 희석에서 면역증폭(immunoamplification)을 촉발할 수 있다( Brandt , W. E., J. M. McCown , M. K. Gentry, and P. K. Russell . 1982. Infection enhancement of dengue type 2 virus in the U-937 human monocyte cell line by antibodies to flavivirus cross -reactive determinants . Infect . Immun . 36:1036-1041. Halstead , S. B., C. N. Venkateshan, M. K. Gentry , and L. K. Larsen . 1984. Heterogeneity of infection enhancement of dengue 2 strains by monoclonal antibodies . J. Immunol . 132:1529-1532. Morens , D. M., S. B. Halstead , and N. J. Marchette . 1987. Profiles of antibody - dependent enhancement of dengue virus type 2 infection . Microb. Pathog . 3:231-237).
플라비바이러스 E 단백질의 항원성 구조는 경쟁 검정, 디설피드 다리의 감소 및 SDS로의 처리와 같은 과정으로의 상호작용의 감수성, 단백질분해 단편 및 합성 펩티드으로의 결합에 대한 검정, 바이러스 중화 또는 적혈구응집의 저해, 탈출 돌연변이의 생성에 대한 검정, 혈청학적 테스트 등을 포함하는 생화학 및 생물학적 분석의 그룹 및 마우스 mAb 패널을 사용하여 열정적으로 연구되었 ( Heinz . T. Roehrig, J.T., Bolin , R.A. and Kelly , R.G. Monoclonal Antibody Mapping of the Envelope Glycoprotein of the Dengue 2 Virus , Jamaica , VIROLOGY 246, 317-328, 1998. Heinz , F. X., and Roehrig , J. T. (1990). Flaviviruses . In "Immunochemistry of Viruses . II . The Basis for Serodiagnosis and Vaccines " (M.H.V. Van Regenmortel and A.R. Neurath , Eds .), pp . 289-305. Elsevier , Amsterdam. Mandl , C. W., Guirakhoo , F. G., Holzmann , H., Heinz , F. X., and Kunz, C. (1989). Antigenic structure of the flavivirus envelope protein E at the molecular level , using tick - borne encephalitis virus as a model . J. Virol. 63, 564-571. I. L. Serafin and J. G. Aaskov . Identification of epitopes on the envelope (E) protein of dengue 2 and dengue 3 viruses using monoclonal antibodies . Arch Virol (2001) 146: 2469-2479. 세 항원성 도메인 A, B 및 C은 각각 세 구조 도메인 II, III 및 I에 상응하는 것으로 정의되었다. 특정 에피토프를 인식하는 항체는 일반적으로 매우 유사한 기능적 특성을 보인다. 도메인 A(구조 도메인 II과 동일함)으로부터의 에피토프의 인식은 디설피드 다리의 감소에 의해 파괴되며 이러한 에피토프를 인식하는 mAb는 적혈구응집을 저해하고 바 이러스 감염을 중화하며 바잉러스-매개 막 융합을 중화한다. 특히, 댕기 바이러스에 의해 결정된 에피토프 A1은 그룹-유형 특이성을 갖는 mAb에 의해 인식된다. 즉, 이들은 다른 플라비바이러스 중에서 높은 교차-반응성을 갖는다. mAbs 4G2(항-DV2) 및 6B6C(항-JEV)는 이 에피토프를 인식한다. 에피토프로의 결합은 미성숙 비리온에서 여러 순서의 크기에 의해 감소되었으며 성숙한 비리온의 산성 pH 처리에 의해 증가되지 않는다( Guirakhoo , F., R. A. Bolin , and J. T. Roehrig . 1992. The Murray Valley encephalitis virus prM protein confers acid resistance to virus particles and alters the expression of epitopes within the R2 domain of E glycoprotein. Virology 191:921-931).
백신 개선
DV 및 이의 가장 심한 증상에 대한 특이 치료는 현재까지는 없다. 모기 조절은 비용이 많이 들고 매우 효과적이지 못하다. DHF에 의해 야기되는 혈액량감소를 고치기 위해 체액의 적절한 관리에 기초한 임상 치료가 이의 사망률을 감소시키지만, 이러한 치료는 많은 후진국에서 여전히 문제가 많다. 연간 30,000명의 사망은 DHF에 의한 것이며 이러한 질환의 이동성 및 관련된 비용이 소요되는 공중 보건의 첫 우선 표적에 기여하는 다른 질환에 비교할 수 있음이 평가되었다( Shepard DS , Suaya JA , Halstead SB , Nathan MB , Gubler DJ , Mahoney RT , Wang DN , Meltzer MI.Cost-effectiveness of a pediatric dengue vaccine . Vaccine . 2004, 22(9-10):1275-80).
댕기 바이러스에 대한 여러 백신 후보가 현재 개선의 여러 단계에 있 다(Barrett , A.D. 2001. Current status of flavivirus vaccines . Ann . N. Y. Acad. Sci . 951:262-271. Chang GJ , Kuno G, Purdy DE , Davis BS . 2004 Recent advancement in flavivirus vaccine development . Expert Rev Vaccines . 2004 3(2):199-220 ). 지금까지 시도되었던 전략들은 약화된 생 백신, 키메릭 바이러스, 플라스미드 DNA 및 서브유닛 백신을 포함한다. 4가지 혈청형으로부터의 약화된 균주는 개 및 원숭이의 일차 신장 세포에서의 바이러스 번식에 대한 표준 방법을 사용하여 개선하였다( Bhamarapravati , N., and Sutee , Y. 2000. Live attenuated tetravalent dengue vaccine . Vaccine . 18:44-47. Eckels , K.H., et al . 2003. Modification of dengue virus strains by passage in primary dog kidney cells : preparation of candidate vaccines and immunization of monkeys . Am . J. Trop . Med. Hyg . 69:12-16. Innis , B.L., and Eckels , K.H. 2003. Progress in development of a live - attenuated , tetravalent dengue virus vaccine by the United States Army Medical Research and Materiel Command . Am . J. Trop . Med . Hyg. 69:1-4). 이러한 전략의 개선은 동물 모델의 부족 및 인간에 대한 약화의 생체외 마커에 의해 제한되었다. 이러한 같은 연구 수단에서, cDNA 클론을 4가지의 혈청형으로부터 수득한 후 이론적으로 유해한 표현형으로의 전환의 가능성이 매우 감소된 약화 돌연변이 및 변이를 유도하기 위해 처리하는 작업이 있다( Blaney , J.E., Jr ., Manipon , G.G., Murphy , B.R., and Whitehead , S.S. 2003. Temperature sensitive mutations in the genes encoding the NS1 , NS2A , NS3 , and NS5 nonstructural proteins of dengue virus type 4 restrict replication in the brains of mice . Arch . Virol . 148:999-1006. Durbin , A.P., et al . 2001. Attenuation and immunogenicity in humans of a live dengue virus type -4 vaccine candidate with a 30 nucleotide deletion in its 3'- untranslated region. Am . J. Trop . Med . Hyg . 65:405-413. Patent : Zeng L, Markoff L, WO0014245, 1999).
다른 전략은 코어 및 그외 비-구조 단백질에 기여하는 황열 바이러스(Yellow Fever Virus; YFV), 댕기 또는 그외 바이러스의 약화된 배경으로 하나의 댕기 혈청형으로부터의 프리엠 및 E 구조 단백질을 유입시키는, 4가지의 혈청형에 대한 키메릭 플라비바이러스 변이의 생성에 관한 것이다( Guirkhoo F, Arroyo J, Pugachev KV et al. Construction , safety , and immunogenicity in non - human primates of a chimeric yellow fever - dengue virus tetravalent vaccine . J Virol 2001; 75: 7290-304. Huang CY , Butrapet S, Pierro DJ et al . Chimeric dengue type 2 (vaccine strain PDK -53)/ dengue type 1 virus as a potential candidate dengue type 1 virus vaccine . J Virol 2000; 74: 3020-28. Markoff L, Pang X, Houng HS , et al . Derivation and characterization of a dengue 1 host - range restricted mutant virus that is attenuated and highly immunogenic in monkeys . J Virol 2002; 76: 3318-28. Patent : Stockmair and schwan Hauesser , WO9813500 , 1998. Patent: Clark and Elbing : WO9837911 , 1998. Patent : Lai CJ , US6184024 , 1994.).
일반적으로, 유해한 표현형으로의 전환, 바이러스성 간섭 및 게놈내 재조합(intergenomic recombination)과 같은 현상의 발생 가능성을 주는, 약화된 생 백 신의 가능한 이익에 대하여 다수의 문제가 주장되었다( Seligman SJ , Gould EA 2004 Live flavivirus vaccines : reasons for caution . Lancet . 363(9426):2073-5). 재조합 단백질을 발현하는 플라스미드 DNA를 기초로 하는 백신은 재조합체 항원에 기초로 하는 백신과 마찬가지로 여전히 개선의 초기 단계에 있다( Chang , G.J., Davis, B.S., Hunt , A.R., Holmes , D.A., and Kuno , G. 2001. Flavivirus DNA vaccines: current status and potential . Ann . N. Y. Acad . Sci . 951:272-285. Simmons, M., Murphy , G.S., Kochel , T., Raviprakash , K., and Hayes , C.G. 2001. Characterization of antibody responses to combinations of a dengue -2 DNA and dengue-2 recombinant subunit vaccine . Am . J. Trop . Med . Hyg . 65:420-426. Patent: Hawaii Biotech Group , Inc ; WO9906068 1998. Feighny , R., Borrous , J. and Putnak R. Dengue type -2 virus envelope protein made using recombinant baculovirus protects mice against virus challenge . Am . J. Trop . Med . Hyg . 1994. 50(3). 322-328; Deubel , V., Staropoli , I., Megret , F., et al . Affinity -purified dengue -2 virus envelope glycoprotein induces neutralising antibodies and protective immunity in mice . Vaccine . 1997. 15, 1946-1954).
상기 기재된 전략에 기초한 여러 백신 후보들은 동물 모델에서의 예방을 나타내며 몇몇은 임상 실험의 초기 단계 동안에 안전함 및 면역원성을 나타냄이 발견되었다.
그러나, 백신 개선에 대한 주요 장애물은 4가지의 혈청형에 대한 동일한 효과적인 보호를 이루기 위한 요구이다. 하나의 댕기 혈청형으로의 감염은 인간에서 의 동일한 혈청형에 대한 장수 면역성을 유도함과 일치한다. 그러나, 단지 하나의 혈청형에 대한 면역은 2 내지 9달까지의 범위의 시간 의 단기간 동안에만 다른 혈청형(이형 면역성)에 대한 보호를 이루었다( Sabin , A. B. 1952. Research on dengue during World War II . Am . J. Trop . Med . Hyg . 1:30-50). 게다가, 특정 혈청형에 대한 보호의 차선 수준은 백신에 민감할 것이며 이 혈청형으로의 마지막 감염에 따라, 병리학적 성질의 이형성 면역 반응에 관련된 중한 증상이 나타날 위험을 증가시킬 것이다( Rothman AL 2004 Dengue : defining protective versus pathologic immunity J. Clin . Invest . 113:946-951). 그러나, 허용가능한 약화된 생 백신 또는 재조합체 서브유닛 백신의 효과적인 4가 제형의 개선이 복잡한 다중-투여량 면역화 스케줄의 사용이 요구되는, 어려운 도전이 됨이 드러났다.
항체: 수동 면역화
댕기 간염의 예방을 위한 백신의 사용의 하나의 대안은 수동 면역화에서의 중화 항체의 사용이다. 5H2를 포함하고 댕기 4를 중화시키는 인간화된 침팬지 항체를 이러한 목적을 위해 수득하였으며( Men , R., T. Yamashiro , A. P. Goncalvez , C. Wernly, D. J. Schofield , S. U. Emerson , R. H. Purcell , and C. J. Lai . 2004. Identification of chimpanzee Fab fragments by repertoire cloning and production of a full - length humanized immunoglobulin G1 antibody that is highly efficient for neutralization of dengue type 4 virus . J. Virol . 78:4665-4674), 1A5를 포함하는 4가지 혈청형에 대해 교차-중화시키는 인간화된 침팬지 항체를 수득하였다( Goncalvez , A.P., R. Men , C. Wernly , R. H. Purcell , and C.J. Lai . 2004. Chimpanzee Fab fragments and a derived humanized immunoglobulin G1 antibody that efficiently cross - neutralize dengue type 1 and type 2 viruses . J. Virol . 78: 12910-12918).
수동 면역화의 사용은 바이러스혈증의 수준이 질환의 심각성에 대한 중요한 예보자임을 고려하는, 예방 및 치료 수단 둘 다에 유용할 것이다( Wang , W. K. D. Y. Chao , C. L. Kao , H. C. Wu , Y. C. Liu , C. M. Li , S. C. Lin , J. H. Huang , and C. C. King . 2003. High levels of plasma dengue viral load during defervescence in patients with dengue haemorrhagic fever : implications for pathogenesis. Virology 305:330-338. Vaughn ,D.W., Green , S., Kalayanarooj , S., Innis, B.L., Nimmannitya , S., Suntayakorn , S., Endy , T.P., Raengsakulrach , B., Rothman , A.L., Ennis , F.A. and Nisalak , A. Dengue Viremia Titer , Antibody Response Pattern , and Virus Serotype Correlate with Disease Severity. J. Infect . Dis . 2000;181:2-9). 그러나, 항체의 투여는 잠재적인 위험성이 없지는 않다. 항체-의존 개선(ADE) 이론에 따라, 중화 항체의 농도가 아중화(subneutralizing) 수준으로 감소된다면, 바이러스-항체 면역복합체가 Fc 수용체를 생성하여 바이러스 복제 수준을 증가시키는 세포로 바이러스 유입을 증가시킬 수 있다. 그러므로, 높은 항체 수준이 질환의 좀더 심각한 발현에 대해 환자를 위태롭게 하는 것을 피하기 위해 요구될 것이다.
하나의 가능한 해결책은 이의 수용체와의 상호작용이 상당히 감소되는 방식과 같이 변이된 Fc를 갖는 항체 분자의 획득이다. 이러한 의미에서, 특히 매력적인 전략은 FCγR-I, FCγR-II 및 FCγR-III와의 상호작용에 직접적으로 영향을 미치나 FCRn와의 상호작용에는 영향을 미치지 않는 Fc에서의 잔기의 돌연변이인데, 이는 FCRn와의 상호작용은 항체 재생에 관련된 것이므로 생체내의 반감기를 결정하는 중추이기 때문이다.
다른 대안은 ADE를 매개하는 것이 불가능한 중화 항체의 확인이다. 적어도 하나의 항체는 이러한 특성이 기재되어 있으며( Patent : Bavarian Nordic Res . Inst . WO9915692, 1998), 이는 생체외 모델에서 ADE를 매개하지 않고 DV2를 중화시킨다. 그러나, 다른 혈청형에 대한 유사한 항체의 기재가 없었으며 생체내 모델에서 항체의 이러한 유형의 특성화에서의 가능한 데이터가 나타나 있지 않다. 추가적인 장애물은 가능한 동물 모델이 인간에서의 감염의 진행 및 특성을 정확하게 재생하지 못한다는 사실이다.
항체의 사용에 관련된 다른 전략은 항-댕기 및 항-적혈구 보체 수용체 1 항체 사이의 이특이성 복합체의 획득이다. 이러한 이형중합체는 적혈구로 바이러스를 결합시켜 혈액에서 조직으로 바이러스 청소율을 상당히 증가시킨다( Hahn CS , French OG , Foley P, Martin EN , Taylor RP . 2001. Bispecific monoclonal antibodies mediate binding of dengue virus to erythrocytes in a monkey model of passive viremia . J Immunol . 2001 166:1057-65.).
본 발명은 분자에 대한 표적으로서 플라비바이러스에 높게 보존되는 E-단백질(외피 "Envelope"의 'E')의 표면 상의 에피토프를 사용함에 의해, 댕기 바이러스의 4가지 혈청형 및 다른 플리비바이러스에 대한 예방 및/또는 치료 처리에 효과적인 분자를 수득하기 위해 기재되었다. 백신 설계에 사용되었을 때, 본 발명은 E-단백질의 이러한 영역으로의 항체 반응을 제한시켜 이러한 단백질의 좀더 많은 가변 영역에 대한 반응을 제거함에 의해 모든 4가지의 댕기 바이러스 혈청형에 대해 유사한 정도인 중화 및 예방 효과의 생성을 가능하게 하며, 이는 다른 혈청형으로의 후기 감염 동안에 면역증폭에 이르게 할 수 있는 혈청형- 또는 부분복합체-특이 중화 항체를 유도할 수 있다. E-단백질의 기술된 영역이 위상학적 에피토프이기 때문에, 본 발명은 전술한 에피토프를 포함하는 E-단백질 서브도메인의 정확한 폴딩 및 분비를 보증하기 위한 돌연변이의 설계 및 결합의 안정화를 포함한다. 예방 또는 치료적 목적으로 수동 면역화용 제제의 개선에 사용되었을 때, 본 발명은 또한 성숙한 플라비바이러스 비리온의 표면상의 이러한 에피토프의 2, 3 또는 다중 대칭 복사체에 결합을 가능하게 하는 재조합 분자를 정의하며, 중화 및 예방 특성을 갖는 상기 재조합 분자는 바이러스 복제 주기의 초기 단계 동안에 비리온에 의해 이뤄지는 구조 변화를 방해하는 높은 열망 및 높은 가능성에 기인하여 천연 항체 및/또는 이의 FAb 단편의 중화 및 예방 특성보다 우수하다.
첫 번째 실시형태에서, 본 발명은 상기 언급된 E-단백질의 항원성 및 구조적 특성을 재생하는 재조합 단백질의 설계를 기술한다. 기술된 재조합 단백질 중 하나는 다른 플라비바이러스도 인지하는 댕기 바이러스의 모든 4가지 혈청형을 중화시킬 수 있는 마우스 모노클로날 항체에 의해 인지된다. 이러한 키메릭 재조합 단백질로의 면역화는 4가지의 댕기 바이러스 혈청형뿐만 아니라 다른 플라비바이러스에 대해 중화하고 방어하는 항체 반응을 유도한다. 본 발명은 일반 플라비바이러스 중화 에피토프를 포함하는 E-단백질 도메인이 정확하게 접히는 방식으로 키메릭 재조합 단백질을 설계하는 방법을 기술한다. 이러한 에피토프는 자연에서 위상학적이므로, 이의 면역원성은 분자의 3D 구조에 따른다. 본 발명에서 수득된 분자를 댕기 바이러스 및 그외 플라비바이러스에 대한 백신 제제의 획득뿐만 아니라 이러한 단백질을 포함하는 진단 시스템의 설계를 위한 약학 산업에서 사용할 수 있다.
본 발명의 두 번째 실시형태는 댕기 바이러스의 4가지 혈청형 및 그외 플라비바이러스에 대한 잠재적 중화 프로필을 갖는 그외 재조합 단백질의 설계를 기술한다. 이러한 단백질의 아미노산 서열은 결합 도메인, 스페이서 세그먼트 및 다중화 도메인을 포함한다. 결합 도메인은 상기 기재된 본 발명의 첫 번째 목표에 기재된 단백질에 포함되는, 모든 플라비바이러스에 걸쳐 고도로 보존된 E 단백질의 에피토프에 결합할 수 있다. 이 실시형태의 변이에서, 결합 도메인은 보존된 에피토프를 인지하는 단일-사슬 항체 단편이다. 스페이서 세그먼트는 20-30 아미노산 길이의 서열이며 바람직하게는 소수성, 극성이고 작은 곁사슬을 갖는 잔기에 풍부하므로 스페이서에 높은 정도의 이동성을 부여한다. 이러한 스페이서는 결합 및 다중화 도메인의 폴딩을 방해하지 않아야 하며 추가적으로 혈청 프로테아제에 의한 절단에 저항성이 있어야 한다.
본 발명에서 기재된 다중화 도메인은 바람직하게는 이량체 또는 삼량체로서의 천연 상태에서 결합하는 단백질 또는 단백질 도메인이나, 결합의 더 높은 순서의 4차 구조는 폐기되었다. 이러한 도메인은 자가항체의 도입을 피하지 않도록, 인간 혈청 또는 세포외 단백질 중에서 선택되었다. 본 발명에서 고려된 다중화 도메인의 본질적인 특성은 댕기 바이러스 감염의 면역증폭의 항체-매개 과정에 관련된, Fc 수용체와의 모든 상호작용의 부재이다. 다중화 도메인의 4차 구조는 공유 또는 비-공유 상호작용에 따라 결정될 것이다.
변이체 중 하나에서, 다중화 도메인은 이량체 구조를 안정화시키는 사슬내 디설피드 다리의 형성을 매개하므로 힌지 영역을 포함하는, 인간 항체로부터의 Fc 단편에 기초한 것이다. 이러한 Fc 단편은 화학적 또는 효소적 탈글리코실화를 통해, 또는 박테리아 E. coli(Escherichia coli)와 같은 단백질을 글리코실화하지 않는 숙주에서의 이의 생성을 통해 탄수화물 사슬이 결여되었다. 비-글리코실화 Fc 도메인은 또한 NXT/S 모티프를 제거하기 위해 이들의 서열이 변형된 경우, 더 높은 진핵생물로부터의 세포에서 수득될 수 있다. 비-글리코실화 Fc 도메인은 생체외에서 면역증폭의 매개제인, FcγR 수용체에 더 이상 결합할 수 없다. 그러나, 이들은 생체내 긴 반감기를 수득하기 위한 적절한 특성인, FcRn 수용체와의 상호작용에 대해 완전한 항체반응 능력을 유지한다.
다른 변이물에서, 다중화 도메인은 인간 매트릴린(matrilin)의 나선형, 삼량체-형성 단편이다.
탄성 스페이서를 통한 결합 및 다중화 도메인의 결합은 플라비바이러스 성숙 비리온의 20면체 구조에서의 다중의 근접한 E-단백질 단량체로의 키메릭 단백질의 동시 결합을 허용한다. 이러한 방식으로, 이량체 단백질을 산출하는 [결합 도메인]-[스페이서]-[다중화 도메인]의 서열 변이체는 동시에 두 E-단백질 단량체에 결합할 수 있을 것이다. 유사하게, 변이체가 삼량체 단백질을 산출한다면, 세 단량체가 동시에 결합될 것이다.
본 발명의 두 번째 실시형태에서 기재된 키메릭 단백질의 중화 역가는 FAb 단편 및 더 완전한 항체에 의해 이루어진 것보다 더 높다. 이러한 재조합 단백질은 더 높은 결합성을 갖는 비리온에 결합하며 여러 E 단량체의 동시 이행이 막 융합 과정 동안에 4차 구조에서 필수적인 변화로 방해한다. 본 발명의 실행으로 수득된 분자를 댕기 바이러스 및 그외 플라비바이러스에 대한 예방 및/또는 치료 제제의 획득뿐만 아니라 상기 분자를 포함하는 진단 시스템의 개선을 위한 약학 산업에서 사용할 수 있다.
백신 목적의 키메릭 단백질의 설계
최근에 용인되는 관점은 효과적인 댕기 백신이 4가지의 댕기 혈청형에 대한 중화 항체 반응을 유도할 수 있다는 것이다. 그러나, 바이러스 외피 E-당단백질은 혈청형 사이에서 변이된다. 이러한 서열 가변성은 단백질에 대한 광범위한 항체 반응 동질성 혈청형에 대해서는 중화시키나 이형성 혈청형에 대해서는 중화시키지 않음을 나타내며 이러한 방식은 감염 면역-증강 항체가 나타나는 가능성을 증가시킨다.
본 발명은 네 혈청형에 대해 일정하게 중화하고 방어하는 면역 반응을 유도하는, 댕기 바이러스에 대한 서브유닛 백신을 설계하는 것을 목표로 하는 방법에 대해 기술한다. 처음에, 설계는 단백질의 표면에서 드러나는 패치 또는 에피토프의 확인을 기초로 하며, 보존은 혈청형 중에서 모두 또는 매우 높으며 또한 성숙한 비리온의 표면에 드러난다. 단백질 상의 잔기 보존 분석을 실행하여, 드러나고 보존된 잔기`의 클러스터를 확인하는 것이 가능하다(도 1 및 도 2, 표 1). 클러스터의 총 표면 영역은 417 Å 이며, 25개 잔기를 포함한다. 이 영역은 단백질-항체 상호작용에 관련된 결합 표면에 상응하는 일반적인 수치에 비교된다. 에피토프는 위상학적이며, 단백질의 일차 구조와 떨어져서 위치하지만 삼차원 구조에는 근접하여 위치한 잔기를 포함한다.
둘째로, 본 발명은 면역계로 나타나는 보존/가변 잔기들 사이의 비율을 최대화하고 총 E-단백질의 배경으로 나타나는 것과 유사한 방식으로 에피토프의 삼차원 구조의 안정화를 이루는, 보존 에피토프를 포함하는 재조합 키메릭 단백질의 설계를 기술한다. 가능한 두 위상학은 다음과 같다:
B-L-C 및 C-L-B,
여기에서 B는 세그먼트 Leu237-Val252이고 C는 댕기 2로부터의 E-당단백질 또는 다른 혈청형이나 플라비바이러스로부터의 동질성 세그먼트 또는 상기 언급된 것에 대하여 80% 이상의 서열 동일성을 나타내는 유사 단백질 서열의 세그먼트 Lys64-Thr120이다. 플라비바이러스 서열에 상응하는 동종 세그먼트 B 및 C는 BLAST, FASTA 및 CLUSTAL과 같은 서열의 쌍 또는 다중 서열을 정렬하는, 서열 정렬 컴퓨터 프로그램을 사용하여 정의된었다(Altschul , S.F., Gish , W., Miller , W., Myers , E.W. & Lipman , D.J. 1990, Basic local alignment search tool . J. Mol . Biol . 215: 403-410. Pearson WR , Lipman DJ . Improved tools for biological sequence comparison. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988;85:2444-8. Higgins D., Thompson J., Gibson T. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J. 1994; CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting , position - specific gap penalties and weight matrix choice . Nucleic Acids Res . 22:4673-4680). 이러한 서열 정렬은 또한 댕기 2로부터의 서열의 특정한 경우에 대한 실시예 1의 표 1에서 확인되는 고도로 보존된 잔기에 상응하는, 플라비바이러스의 서열에서 동종 잔기(또한 동등한 또는 상응하는 잔기로도 언급됨)를 정의하는 것을 가능하게 한다.
기술된 두 위상학에 있어서, L은 일반적으로 1 및 10개의 잔기 크기를 갖는 링커 서열이며, 키메릭 단백질의 폴딩에 관한 안정화 방법에서 세그먼트 B 및 C를 접촉시켜 총 E-단백질의 배경에서 나타난 구조와 유사한 에피토프의 3D 구조를 만드는 역할을 한다. 키메릭 단백질의 위상학적 변이체 둘 다에서, 보존된 에피토프는 좀 더 가변성인 나머지 E-단백질을 제외하고는 모두 포함된다. 키메릭 단백질은 외피 당단백질의 구조적 도메인 II의 서브-도메인을 나타낸다. 이 서브-도메인은 도메인 II의 끝에 위치하며 두 개의 항-평행 베타 시트에 의해 구조적으로 형성되고 서로에 대해 뭉쳐있다. 주요 베타 시트는 3개의 베타 가닥(C 세그먼트)에 의해 구성되며 소수의 베타 시트는 베타 헤어핀 루프(B 세그먼트)이다.
서브-도메인은 두 디설피드 다리를 포함하며 이는 보존된 에피토프의 위상학적 성질과 일치하는, 네 점을 통해 E-당단백질의 나머지에 접촉하였다. 그러나, 서브-도메인 및 나머지 단백질 사이의 접촉 표면은 184 Å2이며, 이는 서브-도메인의 용매가 접근가능한 표면의 단지 12%를 나타낸다. 이러한 사실은 두 위상학적 변이체에 대해 상기에 기재된 바와 같은 안정화 접촉 또는 링커를 설계함에 의해 서브-도메인의 올바른 폴딩을 이루는 실행가능성과 일관된 것이다. 본 발명은 비리온 표멘으로 접근하지 못해 항체와의 상호작용을 포함하지 못하는 잔기에서의 돌연변이에 의해 키메릭 단백질의 열역학적 안정성을 증가시키는 가능성을 포함한다.
본 발명의 필수적인 신규성은 4가지의 댕기 혈청형에 대해 효과적인, 유일한 단백질 사슬을 기초로 한 서브유닛 백신을 개발하는 것이 가능하다는 생각이다. 재조합 단백질 후보제에 기초한 최근의 접근은 백신 제형과 조합되는, 각 혈청형 당 하나인, 4가지의 재조합 외피 단백질의 사용으로 구성된다(Patente : Hawaii Biotech Group, Inc ; WO9906068 1998). E-단백질 단편은 또한 가능한 후보제로서 평가되었지만, 현재까지 노력은 담체 단백질을 갖는 융합 단백질로서 발현되는, 도메인 III에 맞춰져 왔다( Patente : Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia ; WO/2003/008571. Simmons M, Murphy GS , Hayes CG . Short report : Antibody responses of mice immunized with a tetravalent dengue recombinant protein subunit vaccine . Am J Trop Med Hyg . 2001;65:159-61. Hermida L, Rodriguez R, Lazo L, Silva R, Zulueta A, Chinea G, Lopez C, Guzman MG , Guillen G. A dengue-2 Envelope fragment inserted within the structure of the P64k meningococcal protein carrier enables a functional immune response against the virus in mice . J Virol Methods . 2004 Jan ;115(1):41-9). 도메인 III는 중화 항체 반응을 유도할 수 있지만 이 반응은 혈청형 특이적이므로 백신 후보는 네 혈청형으로부터의 서열을 포함해야 한다.
본 발명의 실시예 1의 키메릭 단백질 PMEC1은 위상학 B-L-C에 상응하며, 댕기 2로부터의 B 및 C 단편의 서열 및 두 잔기 Gly-Gly 링커 서열을 갖는다. 이는 또한 키메릭 단백질 PMEC1를 코드하는 유전자를 기재하였다. 플라스미드 pET-sPMEC1-His6은 시그널 펩티드 pelB로의 N-말단에서 및 6개 히스티딘을 코드하는 서열로의 C-말단에서 융합된 단백질 PMEC1을 코드한다(서열 번호 12).
키메릭 단백질 PMEC1은 박테리아 E. coli의 주변세포질에서 용해가능하게 수득되었다. 쉽게 평가할 수 있는 정제 과정이 추가 연구를 위해 적합한 순수 단백질 제제를 수득할 수 있게 하는, 금속 킬레이트 크로마토그래피(metal chelates chromatography; IMAC)를 기초로 하여 개선되었다. 정제된 단백질을 질량 분석법으로 분석하였으며 수득된 질량/z 시그널은 두 디설피드 다리의 형성을 추정하는, PMEC1의 아미노산 서열로부터 계산된 이론상 수치에 상응한다.
단백질 PMEC1은 4가지 댕기 바이러스 혈청형에 대해 수득된 과-면역 복수액에 의해 및 mAb 4G2에 의해 강하게 인지됨을 보여준다. 이러한 인지는 디설피드 다리의 정확한 형성에 의한 것이며, 이는 단백질 PMEC1이 천연 E-단백질의 상응하는 영역에 의해 채택된 것과 유사한 구성을 가짐을 제안한다.
키메릭 단백질 PMEC1으로 마우스를 면역화시켜, 4개의 댕기 혈청형에 대한 높은 역가를 특징으로 하는 중화 및 보호 반응을 수득하였다.
IHA 검정을 또한 실행하였으며 양성 역가를 네 혈청형에 대하여 수득하였다. 네 혈청형에 대한 1:1280의 역가를 생체외 중화 실험에서 수득하였다. 마지막으로, 보호 검정을 마우스에서 실행하였으며 네 혈청형에 대하여 80-90%의 동물에서 보호를 나타냈다.
mAb 4 G2 및 E-단백질에 의해 형성된 복합체의 모델링
실시예 8은 mAb 4G2 및 E-단백질에 의해 형성된 복합체의 구조의 모델링을 보여준다. 이 항체는 4가지 댕기 혈청형 및 그외 플라비바이러스를 인식하고 중화시킨다.
모델을 CLUSPRO 단백질-단백질 도킹 방법을 사용하여 수득하였다(http://structure.bu.edu/Projects/PPDocking/cluspro.html). 연구에서, FAb 4G2의 결정학적 구조 (PDB 파일 1uyw) 및 댕기 2로부터의 E-단백질의 이량체 구조에 상응하는 PDB 파일 1oan 및 1oam을 인풋 파일로서 사용하였다. 표 8은 E-단백질-Fab 인터페이스의 특징적인 표면 파라미터에 상응하는 수치를 나타내며, 모델 복합체에 대해 계산된 수치는 결정학적 구조가 해결된 단백질-항체 복합체에 대하여 수득된 일반적 수치와 유사하다(표 9).
수득된 모델은 에피토프가 mAb 4G2에 의해 인지됨을 나타내며, 본 발명에서 확인된 고도로 보존된 영역을 포함한다. 표 1은 예상된 구조적 에피토프에 따른 잔기(항체와 접촉하게 하는 잔기) 및 고도로 보존된 표면 패치에 속하는 이러한 잔기들의 세트를 나타낸다. 모델에 따르면, 예상된 구조적 에피토프로부터의 잔기의 71%가 고도로 보존된 영역에 속한다.
나중에, 성숙한 비리온의 배경에서 복합체의 모델을 댕기 2 바이러스의 동결-전자 현미경(cryo-electron microscopy) 구조상에서 미리 예측된 모델을 도킹하여 수득하였다. 이러한 방식으로, 비리온 표면 상에서 mAb 4G2에 의해 인식되는 모든 에피토프(180 카피)가 FAb 사슬에 의해 차지되어 모델을 수득하였다.
E-단백질 이량체에 결합하는 FAb에 상응하는 중쇄의 C-말단 사이의 원자-내 거리는 100 Å 이량체로서 결합되지 않는, 비대칭 유닛의 단량체에 결합하는 FAbs에 대해 계산된 동일한 거리는 120 및 80Å이다.
이러한 거리는 IgG 분자의 서열 및 구조와 스테레오-화학적으로 양립할 수 없으며, 이는 mAb 4G2가 1가 방법으로 바이러스에 결합함을 제시한다.
이러한 예측은 FAb 및 mAb 4G2가 매우 유사한 중화 역가를 가짐을 나타내는, 실시예 12에서 보여지는 결과에 의해 뒷받침된다. 이러한 발견은 2가 결합이 2-3 등급의 규모의 중화 능력에서의 증가를 야기한다는 다른 항바이러스 항체에 대해 수득된 데이터와 상반된다 ( Drew PD , Moss MT , Pasieka TJ , Grose C, Harris WJ , Porter AJ . Multimeric humanized varicella - zoster virus antibody fragments to gH neutralize virus while monomeric fragments do not . J Gen Virol . 2001; 82:1959-63. Lantto J, Fletcher JM , Ohlin M. A divalent antibody format is required for neutralization of human cytomegalovirus via antigenic domain 2 on glycoprotein B. J Gen Virol . 2002; 83: 2001-5).
mAb 4G2의 이러한 특성은 E-단백질의 A 도메인에서도 위치하는 에피토프를 인식하는, 침팬지 항체 1A5에 대한 경우에서와 같이, 다양한 항플라비바이러스 항체와 공통된 것일 수 있다(Goncalvez AP , Men R, Wernly C, Purcell RH , Lai CJ . Chimpanzee Fab fragments and a derived humanized immunoglobulin G1 antibody that efficiently cross - neutralize dengue type 1 and type 2 viruses . J Virol . 2004; 78: 12910-8). 일반적으로, mAb 및 이의 FAb의 중화 능력 사이의 균형은 에피토프, 항체의 확인 및 복합체의 스테레오-화학적 상세에 의존한다. 따라서, B 도메인에 위치하는 에피토프를 인식하는 mAb 4E11은 이의 상응하는 FAb보다 50배 더 중화시킨다(Thullier , P., P. Lafaye , F. Megret , V. Deubel , A. Jouan , and J. C. Mazie. 1999. A recombinant Fab neutralizes dengue virus in vitro . J. Biotechnol. 69:183-190).
다가 중화 분자의 설계
본 발명은 비리온 표면 상의 고도로 보존된 에피토프의 2 또는 3개의 카피에 동시에 결합할 수 있는 분자의 설계 및 개선을 기술한다. 비리온은 본 발명에서 기술된 보존 에피토프의 180개 카피 모두를 나타낸다. 이들은 E-단백질 이량체에 상응하는 90쌍의 에피토프 또는 비리온의 비대칭 유닛에 존재하는 E-단백질의 세 카피에 매치되는 60개 트리플렛(triplet)으로서 그룹지을 수 있다. 본원에 기재된 분자는 이가 또는 삼가 결합이 가능하며 비리온에 대한 개선된 결합 친화성 및 본 발명에 기재된 보존 에피토프를 인지하는 중화 항체에 비해 더 유효한 다양한 순서인 중화 능력을 나타낸다. 기재된 분자는 댕기 바이러스 혈청형 및 그외 플라비바이러스를 중화시키므로 댕기 및 대안적으로 그외 플라비바이러스의 예방 및/또는 치료 처리에 유용하다.
본 발명의 이가 또는 삼가 단백질 분자의 서열은 다음과 같은 식으로 기재된다:
[S]-[L]-[D] 또는 [S]-[L]-[T],
여기에서 [S]는 본 발명의 보존 에피토프를 인식하는, 단일 사슬 항체(single chain antibody fragment; scFv)의 서열이고, [L]은 일반적으로 3-20개 사이의 크기의 아미노산의 링커 서열이며, [D]는 이량체를 형성하는 단백질 또는 이의 단편의 서열이며, [T]는 삼량체를 형성하는 단백질 또는 이의 단편이다. 세그먼트 [D] 및 [T]는 바이러스 감염의 면역-증강을 매개할 수 있는 FC 수용체와 상호작용하지 않는 단백질 또는 단백질 도메인이다. 이러한 방식으로, 본 발명의 이가 또는 삼가 분자의 아-중화 농도에서 FC 수용체를 갖는 세포의 바이러스 감염의 증가를 예방하는 것이 가능하다. 그러므로, 기술된 분자는 ADE 유사 효과를 매개하는 이들의 불능성에 관한 항체에 비해 우수하다. 게다가, 이러한 분자들은 scFvs에 비해 더 큰 크기를 가지므로 생체내 수명의 더 긴 반감기를 나타낸다.
서열 [D] 및 [T]는 바람직하게는 혈청으로부터의 세포외 인간 단백질에 상응한다. 이러한 방식으로 세포내 및/또는 외부 단백질에 대하여 나타나는 자가항체 반응의 유도를 예방하는 것이 가능하다.
일반적으로, 도메인 [D] 및 [T]는 적절한 링커 서열이 발생할 다가 결합을 허용하는 것으로 선별되었을 경우 더 큰 올리고머를 형성할 수 있는 다중화 도메인에 의해 치환될 수 있다.
설계된 다중화(이량체화 및 삼량체화 포함)는 단편의 화합력을 증가시키고 중화의 이들 고유의 능력을 개선시키는 것을 가능하게 한다. 다중점에서의 바이러스 결합은 막 융합 과정에 관련된 4차 구조에서 변화를 방해하는, 성숙한 비리온의 구조를 추가로 안정화시킨다. 게다가, 분자 크기의 증가는 생체내 반감기의 증가를 야기한다. 항체 Fv 단편을 포함하는 이러한 재조합 단백질은 유전병 발병의 제어를 위한 효과적인 치료제 및/또는 예방제일 수 있다.
본 발명은 TB4G2로 명명된 키메릭 단백질을 코드하는 유전자를 기술한다. 플라스미드 pET-TB4G2-LH는 N-말단에서 시그널 펩티드 pelB에 융합되고 C-말단에서 6개 히스티딘을 코드하는 서열에 융합된 단백질 TB4G2를 코드한다(서열 번호 16).
키메릭 단백질 TB4G2은 N-말단으로부터 C-말단까지 다음의 요소를 포함한다: (a) mAb 4G2의 경쇄의 가변 도메인 (서열 번호 25), (b) 연성 스페이서 서열 (서열 번호 26), (c) mAb 4G2의 중쇄의 가변 도메인 (서열 번호 27), (d) 15개 잔기의 연성 스페이서 서열 (서열 번호 28), (e) 용액 내에서 분자가 삼량체화하도록 하는 인간 마트리닌의 단편 (서열 번호 51).
키메릭 단백질 TB4G2는 위상학적 변이체 [S]-[L]-[T]에 상응하며, 여기에서 [S]는 mAb 4G2의 scFv 단편이고, [L]은 GLY 및 SER 잔기에 의해 구성되는 15개 잔기의 스페이서 서열이며, [T]는 평형 배좌로 정렬된 알파 헬릭스를 갖는 나선형 코일-코일 삼량체 구조를 형성하는 인간 매트릴린의 삼량체화 도메인이다( Dames SA , Kammerer RA , Wiltscheck R, Engel J, Alexandrescu AT . NMR structure of a parallel homotrimeric coiled coil . Nat Struct Biol . 1998; 5: 687-91).
이러한 매트릴린 단편은 헬릭스의 N-말단에 위치한 시스테인 사이에 형성된 디설피드 다리에 의해 안정화되는 공유 삼량체를 형성한다. 시그널 펩티드 pelB는 결합 도메인 및 삼량체화 도메인의 정확한 형성을 포함하는, 단백질 TB4G2의 주변세포질 위치 및 이에 따른 이의 생체내 정확한 폴딩을 가능하게 한다.
비리온 및 Fv 4G2 사이에 형성된 복합체의 모델에 따라, 비대칭 유닛의 세 E-단백질 단량체에 결합하는 Fv 단편에 상응하는 Fv 중쇄의 C-말단 사이에서 측정된 거리는 36, 58 및 70 Å이다. 이러한 세 C-말단 원자는 스페이서 세그먼트 [L]이 이러한 거리와 양립하는 구조를 채택해야 함을 나타내는, 35 Å의 반지름을 갖는 구형으로 제한된다.
이론적으로, 연장된 구조를 채택하는 15개 잔기의 세그먼트는 N-말단으로부터 C-말단까지 52 Å의 면적을 갖는다. 그러나, 이러한 구성은 반드시 가장 안정하지 않으며 일반적으로 펩티드 구조적 특성이 이들의 서열에 의해 결정되었다. GLY 및 SER에 풍부한 펩티드는 본질적으로 연성이며 용액 내에서 다중 구조를 채택할 수 있다. 실시예 9에 나타난 바와 같이, PRELUDE ( Rooman MJ , Kocher JP, Wodak SJ . Prediction of protein backbone conformation based on seven structure assignments. Influence of local interactions .J Mol Biol . 1991; 221:961-79) 를 사용하는 펩티드 구성의 예측은 가장 유리한 구성이 약 35 Å의 N-말단 및 C-말단 사이의 거리에 상응하는 서열 [L](서열 번호 28)에 대해 예측됨을 나타낸다. 이러한 발견은 키메릭 단백질 TB4G2의 설계는 비리온의 비대칭 유닛에 존재하는 E-단백질 단량체로의 동시 결합을 이루는 능력에 구조적으로 양립됨을 나타낸다.
키메릭 단백질 TB4G2은 박테리아 E. coli의 주변세포질에서 수용성 형태로 수득되었다. 쉽게 규모화할 수 있는 정제 과정은 순수한 단백질 제형을 수득하게 하는, 금속 킬레이트 크로마토그래피(IMAC) 상에 기초하여 발달되었다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 전기영동에 의해 분석되었다. 환원성 조건 하에서 미리 처리한 단백질 TB4G2는 비환원 조건 하에서 처리되었을 때 단량체의 질량 및 삼량체에 상응하는 밴드로 이동한다.
최종적으로, mAb 4G2 및 이의 단편 FAb 및 (FAb')2에 관한 단백질 TB4G2의 중화 능력과 비교하기 위해 중화 BHK-21 세포에서 4가지 댕기 바이러스 혈청형에 대하여 실행하였다. 단백질 TB4G2는 항체 및 이의 단편에 비해 더 효과적인 2-3개의 정렬인, 4가지 혈청형에 대한 유사한 중화 역가를 보인다.
본 발명은 MA4G2로 명명된 키메릭 단백질을 코드하는, 유전자(서열 번호 17)을 기술한다. 키메릭 단백질 MA4G2 (서열 번호 56)는 N-말단으로부터 C-말단까지 다음의 요소를 포함한다: (a) mAb 4G2의 경쇄의 가변 도메인 (서열 번호 25), (b) 연성 스페이서 서열 (서열 번호 26), (c) mAb 4G2의 중쇄의 가변 도메인 (서열 번호 27), (d) 3개 잔기(Gly-Gly-Gly)의 연성 스페이서 서열, (e) 힌지(hinge) 세그먼트, 인간 IgG1 면역글로불린 분자의 CH2 및 CH3 도메인. 인간 IgG1의 CH2 도메인에서, 단백질은 위치 ASN297->GLN에서 돌연변이되었다.
키메릭 단백질 MA4G2는 본 발명에서 규정된 위상학적 변이체 [S]-[L]-[D]에 상응하며, 여기에서 [S]는 mAb 4G2의 단일 사슬 scFv 단편이고, [L]은 서열 GLY-GLY-GLY의 세 잔기 스페이서 세그먼트이며 [D]는 인간 IgG1 면역글로불린 분자의 CH2 및 CH3 도메인인, 힌지 세그먼트를 포함하는 세그먼트이다. 힌지 세그먼트는 안정한 이량체 구조를 야기하는, 동일한 두 단백질 사슬 사이의 분자내 디설피드 다리의 형성을 매개한다. 인간 IgG1의 CH2 도메인에서의 돌연변이 ASN297->GLN은 진핵생물에서 단백질의 글리코실화를 예방하고 FcγR I-III로의 결합이 일어나지 않게 한다. 이러한 수용체는 생체외에서 ADE 현상을 매개한다. 이러한 방식으로, mAb 4G2와는 다르게, 설계된 키메릭 단백질은 아-중화 농도에서 ADE에 관련된 위험이 적다. 그러나, 키메릭 단백질은 항체 분자와 유사한 방식으로, 생체내 수명의 반감기에 이르는 유효한 특성인 FcRn 수용체와의 상호작용하는 능력을 유지한다.
플라스미드 pET-MA4G2-LH (서열 번호 20)는 N-말단에서는 시그널 펩티드 pelB (Sequence No 24)와 융합되고 C-말단에서는 6개 히스티딘 꼬리와 융합된 단백질 MA4G2를 코드한다. 시그널 펩티드 pelB는 분자내 디설피드 다리(결합 도메인, CH2 및 CH3)의 정확한 형성 및 힌지-세그먼트(세포내 다리) 사이의 정확한 형성이 일어나는, 주변세포질에서 단백질 MA4G2의 배치를 가능하게 한다. 히스티딘 꼬리는 메탈 킬레이트 크로마토그래피에 의해 단백질의 정제를 허용한다.
단백질 MA4G2 및 E-단백질 이량체에 의해 형성된 복합체의 3D 모델(실시예 9) 뿐만 아니라 중화 실험의 결과(실시예 12)는 키메릭 단백질 MA4G2가 성숙한 비리온의 구조에서 이량체로서 결합되는 단량체로의 동시 결합에 스테레오-화학적으로 양립할 수 있음을 나타낸다. 이러한 방식으로, 이가물은 단백질의 생물학적 활성의 상당한 증가를 야기한다.
본 발명의 본질적인 양상은 E-단백질의 본원에 기술된 고도로 보존된 표면 패치에 결합할 수 있는 분자가 이 단백질의 생물학적 기능을 방해하고 이러한 분자는 플라비바이러스에 대한 광범위의 항바이러스 제제의 유효한 후보을 구성한다는 발견으로 이루어진다. 실시예 12에서 나타난 바와 같이, scFv를 포함하는 mAb 4G2의 단편은 총 mAb 4G2와 유사한 중화 활성을 나타내며, 이는 이가물이 항바이러스 활성에 요구되지 않음을 나타내는 것이다. 이러한 결과는 또한 단편의 항바이러스 활성이 E-단백질의 생물학적 활성으로의 방해에 의존하며 이러한 방해는 단백질의 기재된 고도로 보존된 영역으로의 결합에 의해 매개됨을 보여준다. 게다가, 관찰된 항바이러스 활성은 플라비바이러스에 대해 광범위하다. 그러므로, 이러한 특성을 갖는 항바이러스 분자의 확인을 위한 흥미로운 방법은 기술된 고도로 보존된 표면 영역에 결합하는 단백질, 펩티드 및 약물-유사 분자를 확인하도록 하는 것이다. 이러한 방법은 mAb 4G2, 이의 상응하는 FAb 및 (Fab')2 단편 또는 본 발명에 기재된 키메릭 단백질과 같은, 고도로 보존된 표면 영역을 인지하는 이러한 항체의 E-단백질에 결합을 차단하는 것을 기초로 한다. 이러한 방법들은 면역-효소 검정, 방사-면역 검정, 형광 색소를 갖는 검정을 기초로 할 수 있으며 이러한 검정들은 기술된 고도로 보존된 표면 영역을 나타내는 E-단백질, 비리온 또는 본원에 기재된 키메릭 단백질로의 결합을 정량한다.
이러한 검정들은 조합 화학의 방법에 의해 생성된 것을 포함하는 화학적 화합물의 라이브러리의 생체외 스크리닝에 의해, 광범위의 플라비바이러스에 대한 효과적인 항바이러스 분자를 확인하는데 유용할 수 있다.
후보 분자의 확인은 컴퓨터 원조 가상 스크리닝 방법을 사용하여 실행할 수 있다. 이러한 방법은 화학적 화합물의 분자 도킹과 같은 컴퓨터 방법에 기초한다. 이러한 방법을 사용하여, 단백질로의 화학적 화합물의 결합을 모델링하고 상호작용 강도 또는 결합 에너지를 정량하는 것이 가능하며, 이는 스코어링 기능에 의해 모델링된 복합체 좌표로부터 예상되거나 계산되었다.
분자 도킹의 이러한 컴퓨터 방법의 예는 프로그램 GOLD ( Jones , G. y cols ., 1997. Development and validation of a genetic algorithm for flexible docking . J. Mol. Biol . 267, 727-748), DOCK ( Kuntz , I.D. y cols ., 1982 A geometric approach to macromolecule - ligand interactions . J. Mol . Biol . 161, 269-288) 및 FLEXX ( Olender , R. and Rosenfeld , R., 2001. A fast algorithm for searching for molecules containing a pharmacophore in very large virtual combinatorial libraries. J. Chem . Inf . Comput . Sci . 41, 731-738)이다. 이러한 방법은 분자가 수용체 단백질 상에서 선택된 활성 부위에 결합하는 것이 예상되는지를 스크리닝하고 결정하기 위해 ZINC 데이타베이스 ( Irwing , J.J. and Scoichet , B.K., 2005. Zinc - A free Database of commercially available compounds for virtual screening. J. Chem . Inf . Model . 45, 177-182) 와 같은 분자의 대규모 가상 라이브러리를 허용한다. 본 발명에 대하여, 결합 부위는 이미 기재된 고도로 보존된 표면 역역이다. PDB 데이터베이스에서 입수가능한 E-단백질의 결정학적 구조를 원자 좌표를 위한 소스로서 사용할 수 있으며, 또는 동질성에 의한 단백질 모델링과 같은 방법에 의해 수득되는 대안적인 컴퓨터 모델을 사용할 수 있다.
도 1은 플라비바이러스 E-단백질의 표면 잔기에 상응하는 보존 프로필을 그림으로 나타낸 것이다. 보존은 그레이스케일 바탕으로 나타냈으며 플라비바이러스 서열 중에서 더 많은 보존을 보이는 잔기를 어둡게 하였다. 도메인 II의 고도로 보존된 표면 패치는 둘러쌓여 있다. 보존 수치를 SWISSPROT 데이터베이스에서 입수가능한 이러한 플라비바이러스의 다중 서열을 고려하는, 프로그램 CONSURF를 사용하여 계산하였다. 보존 수치를 피몰(Pymol)을 사용하여 단백질 표면 상에 맵핑하였다.
도 2는 댕기 바이러스로부터의 E-단백질의 표면 잔기에 상응하는 보존 프로필을 도면으로 나타낸 것이다. 보존은 그레이스케일 바탕으로 나타냈으며 플라비바이러스 서열 중에서 더 많은 보존을 보이는 잔기를 어둡게 하였다. 도메인 II의 고도로 보존된 표면 패치는 둘러쌓여 있다. 보존 수치를 SWISSPROT 데이터베이스에서 입수가능한 4가지 댕기 바이러스 혈청형의 다중 서열을 고려하는, 프로그램 CONSURF를 사용하여 계산하였다. 보존 수치를 피몰(Pymol)을 사용하여 단백질 표면 상에 맵핑하였다.
도 3은 키메릭 단백질 PMEC1의 3차 구조의 모델을 나타낸 것이다. B는 세그먼트 Leu237-Val252이고 C는 세그먼트 댕기 2 바이러스의 E-단백질의 Lys64-Thr120이다. L은 두 잔기로 구성된 링커 세그먼트이다. 단백질의 3D 모델은 WHATIF 프로그램 패키지를 사용하여 수득하였으며 도면은 피몰(Pymol)을 사용하여 작성하였다.
도 4는 플라스미드 pET-sPMEC1을 나타낸 것이다.
도 5는 플라스미드 pET-scFv 4G2 LH를 나타낸 것이다.
도 6A는 플라스미드pET-TB4G2 LH를 나타낸 것이다.
도 6B는 플라스미드 pET-MA4G2 LH를 나타낸 것이다.
도 7은 키메릭 단백질 PMEC1-His6의 물리화학적 특성화를 나타낸 것이다. A: 고정화 메탈 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되고(1 레인) 환원되고 카르브이미도메틸화된(2 레인) 단백질의 SDS-PAGE 전기영동. B: 단백질의 RP-C4 역상 크로마토그래피 분석, 화살표는 주요 피크의 위치를 나타낸다. C: 역상 크로마토그래피에 의해 조절된 주요 피크에 상응하는 질량 스펙트럼.
도 8은 mAB 4G2의 Fv 단편 및 댕기 2의 E-단백질에 의해 형성된 복합체의 구조를 예측하기 위해 수행된 분자 도킹(CLUSPRO 프로그램 사용)의 13개 컴퓨터 시뮬레이션에서 수득된 결과의 도식을 나타낸 것이다. 컬럼은 각 시뮬레이션에서 수득된 처음 30개의 해결책(클러스터)의 구조적 특성을 그레이 스케일 베이시스로 보여준다. 해결책은 3가지 특성에 의해 나타난다. 첫 번째 특성은 각각 도메인 II, I 및 III에 상응하는 밝은 회색으로부터 어두운 회색까지, 결합에 관계된 E-단백질 도메인을 보인다. 두 가지 색깔은 두 도메인에 동시에 결합함을 의미한다. L 및 T는 에피토프가 각각 링커 접촉 도메인 I 및 II 또는 융합 펩티드(도메인 II의 끝부분)을 포함함을 의미한다. 두 번째 특성은 세가지 색깔에 의해 나타내지는데, 백색은 비리온 내부 표면에 결합함을 의미하고 회색은 측면 결합이며 검정색은 비리온의 외부 표면에 결합함을 의미한다. 세 번째 경우는 항체 결합이 비리온 구조의 주요 구조적 변화에 의존하지 않음을 생물학적으로 적절하게 가정한 것이다. 세 번째 특성은 항체 파라토프에 상응하며, 회색은 결합이 항체 CDRs을 포함함을 의미하며(적절한 해결책) 백색은 결합이 CDRs을 포함하지 않음을 나타낸다(부적절한 해결책). 입수가능한 실험 데이터와 양립할 수 있는 해결책은 화살표를 사용하여 나타 냈다. 이들의 특성은 밝은 회색-검은색-회색의 색에 상응한다. 그림의 윗 부분에 위치한 처음 두 줄은 시뮬레이션에서 사용된 리간드 및 수용체의 정의을 나타내며 시뮬레이션에서 사용된 E-단백질 결정 구조에 상응하는 PDB 파일 식별자를 포함한다. 각 시뮬레이션에 사용된 단백질-단백질 도킹 프로그램(dot 또는 zdock)은 모든 컬럼 아래에 나타냈다.
도 9는 댕기 2 바일스로부터의 성숙한 비리온 및 Fab 4G2의 180개 카피 사이에 형서된 복합체의 모델링을 나타낸 것이다. 모델을 동결 전자 현미경에 의해 수득된 성숙한 비리온 구조 내로 FAb4G2-E-단백질 복합체의 미리 예측된 구조를 도킹함에 의해 수득되었다(1THD). 비대칭 유닛에서 발견되는 E-단백질의 세 단량체에 결합하는 FAb의 중쇄의 C-말단 사이의 거리를 계산하였다.
도 10은 키메릭 단백질 MA4G2 및 E-단백질 이량체에 의해 형성된 복합체의 컴퓨터 모델을 나타낸 것이다. 도면은 프로그램 피몰을 사용하여 수득하였다.
도 11은 펩티드 서열 (GGGS)3GGG에 상응하는 이형태체 안정화의 예상을 나타낸 것이다. 이형태체의 에너지는 N- 및 C-말단 사이의 거리의 기능으로서 나타냈다. 프로그램 PRELUDE을 사용하여 예상하였다.
실시예 1-키메릭 단백질 PMEC 의 설계.
E-단백질의 표면 상의 보존된 패치(patches)를 확인하기 위한 목적으로, CUNSURF 방법을 사용하여 보존 분석을 실시하였다(ConSurf : identification of functional regions in proteins by surface - mapping of phylogenetic information. Glaser , F., Pupko , T., Paz , I., Bell , R.E., Bechor - Shental , D., Martz, E. and Ben - Tal , N.; 2003; Bioinformatics 19: 163-164). 고도로 보존된 표면 패치는 댕기 바이러스 혈청형 및 나머지 플라비바이러스 중에서 보존된 도메인 II의 끝 부분에서 관찰되었다(도 1 및 도 2).
고도로 보존된 표면 패치는 삼차 구조에는 근접해 있지만 E-단백질의 서열에서는 떨어져 위치한 잔기에 의해 순응되는, 국소해부적 에피토프를 규정한다. 이러한 표면 영역은 도메인 II의 맨 끝에 위치한 구조적 서브-도메인 상에 포함되며 이는 E-단백질의 두 선형 세그먼트, Leu237-Val252 (세그먼트 B) 및 Lys64-Thr120 (세그먼트 C)로 구성된다. 표 1은 비리온의 외부 표면 상에 위치하여 항체와의 상호작용이 쉬운, 서브-도메인의 잔기를 열거한 것이다. 고도로 보존된 잔기는 본 발명에 의해 확인된 영역 또는 에피토프를 규정한다.
E-단백질의 도메인 II의 구조의 정밀검사는 서브-도메인이 구조적으로 의존적인 도메인 유사 특성을 나타냄을 보여준다. 나머지 단백질로의 접촉 표면은 184 Å2이며, 이는 서브-도메인의 용매가 접근가능한 총 표면 영역의 12%만을 나타내는 것이다. 게다가, 구조의 이러한 비율은 CATH 데이터베이스에서 구조적 도메인으로서 정의된다(CATH 도메인 1svb03, http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath/cath.html).
E-단백질의 도메인 II의 맨 끝에 위치하고 비리온 표면에 나타나는, 본 발명의 관련된 잔기의 정의.
AA No. E DEN -2 No. PMEC1 ACC (Å2) CONS 에피토프
HIS 244 8 40.8 -1.074/-0.792
LYS 246 10 43 -0.539/-0.792 X
LYS 247 11 41.2 -0.667/-0.334 X
GLN 248 12 4 -0.702/-0.792 X
ASP 249 13 19.5 0.366/-0.298 X
VAL 251 15 13.8 0.726/0.835 X
VAL 252 16 11.7 -0.724/-0.792 X
LYS 64 19 26.5 0.426/0.271 X
LEU 65 20 9.3 -0.335/-0.383 X
THR 66 21 11.7 0.210/-0.152 X
ASN* 67 22 30.2 0.417/-0.792 X
THR 68 23 22.3 0.952/1.062 X
THR 69 24 14.6 -0.745/-0.792 X
THR 70 25 23.7 -0.781/-0.792 X
GLU 71 26 13.3 2.146/2.661 X
SER 72 27 12.4 -0.431/-0.492 X
ARG 73 28 21.5 -0.284/-0.792 X
CYS 74 29 12.7 -1.074/-0.792 X
LEU 82 37 6.2 -0.811/-0.792 X
ASN 83 38 39.4 4.302/2.327 X
GLU 84 39 11.2 -0.677/-0.792 X
GLU 85 40 17 -0.861/-0.792
ASP 87 42 11.7 -0.486/-0.792
ARG 89 44 30.8 2.051/0.179
PHE 90 45 6.4 2.777/4.283 X
VAL 97 52 1.7 -0.766/-0.792 X
ARG 99 54 10.5 -0.898/-0.792 X
GLY 100 55 1.3 -0.796/-0.792 X
TRP 101 56 15.4 -1.074/-0.792 X
GLY 102 57 14.8 -1.074/-0.792 X
ASN 103 58 21.7 -1.074/-0.792 X
GLY 104 59 18 -0.775/-0.792 X
CYS 105 60 1.8 -1.074/-0.792 X
GLY 106 61 16.3 -1.074/-0.792 X
MET 118 73 13.6 -0.877/-0.349 X
AA: 아미노산, No . E DEN2: 댕기 2로부터의 E-단백질의 서열에서의 잔기의 수, No . PMCE1: 키메릭 단백질 PMEC1의 서열에서의 잔기의 수, ACC: WHATIF로 계산된 용매가 접근가능한 표면 영역 (Vriend G. WHAT IF: a molecular modeling and drug design program . J Mol Graph . 1990; 8: 52-6, 29). 계산은 성숙한 비리온(PDB file 1THD)의 구조 상의 구조적 도메인 I, II 및 III(PDB file 1oan)의 3D 구조에 독립적으로 도킹함에 의해 수득되는, E-단백질의 원자 모델 상에서 실행되었다. CONS: 두 서열 정렬을 사용하고, 플라비바이러스 서열 및 4가지 댕기 바이러스 혈청형을 각각 고려한, CONSURF로 계산된 보존 스코어. 음성 수치는 높은 보존을 나타내는 것이며 굵은 글씨체의 수치는 고도로 보존된 것으로 정의된 잔기에 상응하는 수치이다, epitope: 실시예 8에서의 분자 도킹에 의해 수득된 3D 모델에 따른 FAb 4G2로의 접촉을 만드는 잔기. 이러한 잔기들은 반 데르 발스 구체가 DEN2 바이러스에서 글리코실화된 *ASN22인 FAb 4G2의 원자의 반 데르발스 구체로부터의 3 A보다 적게 분리되는 적어도 하나의 원자를 갖는다고 여겨진다.
독립적으로 접히는 서브-도메인을 수득하기 위해, 유일한 폴리펩티드 사슬에서의 두 세그먼트를 접촉하기 위한 1차 장소가 필수적이다. 두 가능한 접촉 또는 국소해부학은 다음과 같은 것이 가능하다:
B-L-C 및 C-L-B
여기에서 L은 링커 또는 스페이서 세그먼트이다. 링커는 서브-도메인의 3차 구조와 스테레오-화학적으로 양립할 수 있는 것이 요구되며 최상의 경우에서 키메릭 단백질의 열역학적 안정성을 안정화시키는 효과를 제공한다. 잔기 Val252 및 Lys64의 알파 탄소 사이의 거리는 6.6 Å이므로 위상학 B-L-C는 하나 또는 그 이상의 잔기의 링커의 사용에 의해 수득될 수 있다. 가능한 접촉의 구조적 분석은 PDB 데이터 베이스를 작동시키며 앵커(anchor) 세그먼트의 구조와 양립할 수 있는 변화의 검색(WHATIF 프로그램 패키지의 DGLOOP 메뉴에서의 DGINS 명령)은 두 개의 잔기의 접촉이 하나의 잔기의 접촉보다 좀더 일반적임을 나타낸다. 위상학 C-L-B의 경우에서, 잔기 Thr120 및 Leu237 사이의 알파 탄소 사이의 거리는 11.1 Å이며 이는 3-4개의 잔기 또는 그 이상의 접촉과 일치한다.
본 발명의 키메릭 단백질PMEC1 (서열 14)은 댕기 2로부터의 서열 및 두 잔기 Gly-Gly 링커 서열에 상응하는 단편 B 및 C를 갖는, 위상학 B-L-C에 상응한다.
B 및 C 세그먼트 서열로서 DEN2 바이러스에 상응하는 서열 뿐만 아니라 DEN1, DEN3, DEN4, 일본 뇌염 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 랑가트바이러스, 황열 바이러스, 포와산 바이러스(서열 29-41)를 포함하나 이에 한정되지 않는 그외 플라비바이러스로부터의 동질성 서열을 선택할 수 있다.
게다가, 상기 기재된 방법에 따라 설계된 키메릭 단백질은 단백질의 열역학적 안정성 또는 폴딩 과정의 효율을 증가시키기 위한 목적을 갖는, 하나 또는 다중 잔기에서 돌연변이될 수 있다. 비리온 표면으로의 접근 및 항체와의 상호작용이 가능한 표 1에 기재된 이러한 잔기들이 돌연변이될 수 있다. 돌연변이될 수 있는 잔기는 단백질의 3D 구조 상에 숨어있고/숨어있거나 성숙한 비리온에 존재하는 E-단백질의 3D/4D 구조의 측면 또는 내부 표면에 위치한 잔기들이다.
돌연변이된 단백질은 섬유상 파아지 라이브러리와 같은 실험적 조합 방법에 의해 수득할 수 있다. 단백질은 또한 FOLDX, POPMUSIC 및 Rosseta와 같은 이론적 방법을 사용하여 설계할 수 있다.
서열 43-50은 다중 위치에서 돌연변이된 키메릭 단백질 PMEC1의 유사체에 상응한다. 이러한 단백질의 삼차원 모델은 좋은 패키지 및 질을 보인다. 단백질의 드러나는 표면에서의 돌연변이는 또한 특히 이러한 돌연변이가 E-단백질의 서브-도메인을 인지하는 방어 및 중화 항체와의 상호작용에 영향을 미치지 않는 조건으로, 댕기 바이러스 혈청형 및 그외 플라비바이러스 중에서 완전히 보존되지 않은 잔기에서 가능하다.
실시예 2-플라스미드 pET - sPMEC1 의 구성
단백질 PMEC1 (서열 번호 1)을 코드하는 재조합 유전자를 수득하기 위해, 플라스미드 p30-VD2에 존재하는 DEN2 바이러스(서열 번호 2), 균주 1409, 유전형 자메이카(Jamaica)로부터의 E 단백질을 코드하는 유전자를 사용하였다( Deubel V., Kinney R.M., Trent D.W.; " Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of the structural proteins of dengue type 2 virus , Jamaica genotype ", Virology 155(2):365-377, 1986). 이 유전자는 서열 번호 3에서 보여지는 단백질을 코드한다. Agarwal 등의 방법( Agarwal KL , Buchi H, Caruthers MH , Gupta N, Khorana HG , Kumas A, Ohtsuka E, Rajbhandary UL , van de Sande JH , Sgaramella V, Weber H, Yamada T, Total synthesis of the Gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast , 1970, Nature 227, 27-34) 을 사용하고 포스포아미디트(phosphoramidite) 화학에 의해 고형상에서 합성된 올리고누클레오티드로부터 시작하여( Beaucage SL , Caruthers MH , Deoxynucleoside phosphoramidites - A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis ., Tetrahedron Letters , 1981, 22, 1859), PMEC1 단백질을 코드하는 이중가닥 DNA 분자를 수득하였다(서열 번호 4). 이 DNA 분자의 서열은 다음의 요소들을 갖는다: 1) 아미노산 메티오닌(M)을 코드하는 시작 코돈 뒤에 아미노산 알라닌(A)을 코드하는 코돈을 포함하는 Nco I 제한 효소에 대한 인식 부위(서열 번호 5); 2) 차례로 서열 번호 3의 위치 237 내지 252에 상응하는, 서열 번호 7에 나타난 펩티드 서열을 코드하는 바이러스 댕기 2 균주 자메이카 1409의 E 단백질에 대한 유전자(서열 번호 6)의, 위치 709로부터 위치 756까지의, 서열에 상응하는 단편; 3) 연속하는 두 글리신을 코드하는 링커 세그먼트(서열 번호 8); 4) 서열 번호 9(서열 번호 3의 위치 64-120에 상응함)에서의 펩티드 서열을 코드하는 서열 번호 2의 위치 190 내지 360에 의해 생성된 서열에 상응하는 단편, 여기에서 침묵 돌연변이가 상기 서열의 위치 284-289에서 존재하는 Nco I 제한 부위를 제거하도록 도입되었다 (서열 번호 10); 및 5) 각각 아미노산 루신(L) 및 글루탐산(E)을 코드하는 두 코돈을 포함하는 Xho I 제한 효소 인식 부위(서열 번호 11). 이러한 합성 분자는 제조업자에 의해 특정된 조건에서 Nco I 및 Xho I 제한 효소(Promega Benelux b.v., The Netherlands)에 의해 절단되고 제조업자에 의해 특정된 조건에서 T4 DNA 리가제(Promega Benelux, b.v., The Netherlands)를 사용하여 미리 동일하게 절단된 플라스미드 pET22b (Novagen, Inc., USA)에 연결시켰다. Sambrook 등의 문헌( Sambrook J, Fritsch EF , Maniatis T. Molecular cloning : A laboratory manual . New York , USA : Cold Spring Harbor Laboratory Press ; 1989)에 따라 작용은 E. coli 균주 XL-1Blue 내로 형질전환되었으며( Bullock WO , Fernandez JM , Short JM . XL -1 Blue : A high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli K12 strain with beta - galactosidase selection . Biotechniques 1987;5:376-8), 선별 배지에서 생존한 콜로니에 존재하는 플라스미드를 제한 분석에 의해 스크리닝하였다. 결과적으로 생성된 재조합 플라스미드 중 하나를 pET-sPMEC1로 명명하였으며(도 4), 이의 서열(서열 번호 12)은 자동 생거 서열결정(automatic Sanger sequencing)을 통해 확인되었다.
플라스미드 pET-sPMEC1은 N-말단에서 pelB 리더 펩티드에 융합되고 C-말단에서 6개 히스티딘을 코드하는 서열에 융합되는 단백질 PMEC1을 코드한다(서열 번호 13). 한편으로, 이러한 배열은 우세한 산화 조건이 정확한 폴딩 및 PMEC1의 디설피드 다리의 형성을 촉진하는, 리더 펩티드의 절단 및 E. coli 주변세포질로의 분비를 통해 이 단백질의 프로세싱을 가능하게 하며, 다른 한편으로는, 또한 고정화 금속 친화 크로마토그래피(immobilized metal affinity chromatography; IMAC)를 통해 이 단백질의 정제를 간단하게 할 수 있게 한다( Sulkowski , E. (1985) Purification of proteins by IMAC . Trends Biotechnol . 3, 1-7). 프로세싱 및 주변세포질로의 분비 후의 PMEC1-His6로 명명된 단백질의 최종 서열은 서열 번호 14에 나타나 있다.
실시예 3 - P MEC1 - His6 의 발현 및 정제
플라스미드 pET-sPMEC1을 E. coli 균주 BL21(DE3) ( Studier , F. W. and B. A. Moffatt . "U se of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high -level expression of cloned genes ." J. Mol . Biol . 189.1 (1986): 113-30) 내로 형질전환시키고( Sambrook J, Fritsch EF , Maniatis T. Molecular cloning : A laboratory manual . New York , USA : Cold Spring Harbor Laboratory Press ; 1989), 50 ㎍/mL에서 암피실린을 보충한 50 mL의 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 배지의 배양(LBA)을 단일 접종하고 콜로니를 분리하여 350 r.p.m, 30 ℃에서 12시간 동안 성장시켰다. 이 배양으로, 1 L의 LBA 배지를 0.05의 620nm(OD620)에서 시작 광학 밀도로 접종한 후 후기 급격한 증가 상이 나타날 때까지 28 ℃ 에서 8시간 동안 성장시켰다. 그런 다음 이 배양을 이소프로필티오갈락토사이드 (isopropylthiogalactoside; IPTG)를 첨가하여 유도하고 5시간의 추가 기간 동안 동일한 조건에서 성장시켰다.
상기 기재된 바와 같이 수득된 배양을 4 ℃에서 30분간 5000 x g로 원심분리하고 주변세포질 분획을 Ausubel 등의 문헌( Ausubel , F.M., Brent , R., Kingston , R.E., Moore , D.D., Seidman , J.G., Smith , J.A. and Struhl , K (1989) in Current Protocols in Molecular Biology . John Wiley & Sons , New York ) 의 방법을 사용하여 결과적으로 생성된 바이오매스로부터 추출하였다. 이 분획을 1000Da 컷-오프를 갖는 막을 사용하여 50 mM 포스페이트 완충용액 pH 7 / 20 mM 이미다졸에 대하여 투석하고 단백질 PMEC1-His6을 제조업자의 지침에 따라 Ni-NTA 아가로스(Qiagen Benelux B.V., The Netherlands)를 사용하는 고정화 금속 친화성 크로마토그래피에 의해 투석물로부터 수득하였다( Sulkowski , E. 1985, Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol . 3, 1-7).
실시예 4 - 키메릭 단백질 PMEC1 - His6 의 물리 및 화학적 특성화
IMAC에 의해 정제된 PMEC1-His6의 제형은 이 단잭질에 대해 예상되는 것(대략 9500 Da)에 상응하는 명백한 질량으로 이동하는 SDS-PAGE (도 7A) 상에서 주요 밴드를 보이며, 이는 제형의 높은 정도의 순도를 증명하는 것이다. 동일한 그림은 감소되고 카르브아미도메틸화된 PMEC1-His6 (2 레인, 도 7A)에 상응하는 밴드가 비-감소 시료(1 레인, 도 7A)와 비교했을 때 약간 감소된 전기영동 이동을 가짐을 나타낸다. 이는 단백질이 분자내 디설피드 다리에 관련된 시스테인들을 갖는 적절히 폴딩되었음을 나타낸다.
PMEC1-His6의 80 ㎍의 분취량을 C4 4.6x250 mm (J.T.Baker, USA) 역상 HPLC 컬럼에서 분석하였다. 크로마토그래피를 두 펌프 및 콘트롤러가 설치된 고압 크로마토그래피 시스템을 사용하여 37 ℃에서 실행하였다. 단백질의 용출이 0.8 mL/분의 유속에서 및 226 nm에서 검출 필터 세트를 갖추어, 0.1%(v/v)의 트리플루오로아세트산 내의 10 내지 60%(v/v) 선형 아세토니트릴 기울기에 의해 이루어졌다. 크로마토그램은 제형의 높은 동질성을 확인하는 단일 피크를 산출한다(도 7B).
RP-HPLC로부터의 피크를 높은 정확도를 갖는 단백질의 분자량을 측정하고 디설피드 다리의 산화 상태를 확인하기 위한 목적으로 질량분석법으로 분석하였다. Z-스프레이 전기분무(electronebulization) 이온화 소스를 수반하는, 팔각형 형상의 QTOF-2TM (Micromass, UK)을 갖는 혼성 질량분석기에서 스펙트럼을 획득하였다. 획득한 스펙트럼을 MassLynx 버전 3.5 (Micromass, UK) 소프트웨어 어플리케이션을 사용하여 처리하였다. The mass spectrum of the major species of the PMEC1-His6 제형의 주요 종의 질량 스펙트럼은 9219.51 Da의 분자량을 가지며(도 7C), 이 수치는 유전자의 서열에 따라 예상된 수치보다 0.05 Da만이 차이가 난다. 이 분석은 분자 상의 시스테인 잔기들이 디설피드 다리에 기여함을 확인하였으며 감수성 아미노산의 N- 또는 C-말단 분해 또는 변이와 같은 바람직하지 않은 번역후 변이를 없앤다
실시예 5 - PMEC1 의 항원성 특성화
정제된 PMEC1 단백질을 댕기 반응성 인간 혈청 뿐만 아니라 모노클로날 및 폴리클로날 마우스 항체를 사용하는 점 블롯(dot blotting)으로 특성화하였다(표 2 및 3). 음성 대조로서 6개 히스티딘 표지와 융합된 Den-2(유전형 자메이카)의 E 단백질의 도메인 III 상에 구성되는 재조합 단백질 DIIIe2를 사용하였다. PMEC1와의 차이는, DIIIe2가 E 단백질 상에서 더 높은 서열 가변성의 영역에 상응한다는 것이다. 재조합체 도메인 III은 동질성 혈청형에 대한 마크된 특이성을 나타내고 이 도메인의 디설피드 결합의 감소에 대한 반응성 대부분을 없애는 항-Den 과면역 복수액(HIAF)에 의해 강하게 인지된다. 도메인 III를 향한 항체의 반응성에서 이러한 혈청형 특이성은 또한 인간 항체 반응에서도 발견되었다. Mab 3H5는 또한 검정에서 대조로서 포함되었다. Mab 4G2와의 차이는, 3H5는 Den-2의 도메인 III 내의 혈청형 특이 에피토프를 인식한다. 이러한 두 Mab의 반응성은 환원제로의 처리에 의해 영향을 받는다( Roehrig JT , Volpe KE , Squires J, Hunt AR , Davis BS , Chang GJ . Contribution of disulfide bridging to epitope expression of the dengue type 2 virus envelope glycoprotein . J Virol . 2004; 78: 2648-52).
점 블롯팅에서 PMEC1 단백질을 향한 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 반응성
Abs ** 특이성*** PMEC1 * PMCE1 - RC * DIIIe2 DIIIe2 _ RC
HIAF DEN-1 +++ - + -
HIAF DEN-2 +++ - +++ +
HIAF DEN-3 +++ - + -
HIAF DEN-4 +++ - + -
HIAF TBE ++ - - -
HIAF YFV ++ - - -
HIAF SLV +++ - - -
Mab 4G2 GF +++ - - -
Mab 3H5 DEN-2 - - +++ -
* 정제된 PMEC1 및 DIIIe2 단백질 10 마이크로그램을 니트로셀룰로스 막에 부하하였다. RC: 환원되고 카르브아미도메틸화된 단백질. 시그널 강도는 + 내지 +++의 규모로 평가되었다.
** HIAFs 는 1:100 희석에서 사용되었다. 3H5 및 4G2 Mabs는 10 ㎍/mL에서 사용되었다.
*** TBE: 진드기 매개 바이러스, YFV: 황열 바이러스, SLV, 세인트루이스 바이러스, GF: 플라비 세로그룹으로의 교차-반응.
PMEC1은 Mab 4G2에 대해서와 같이 Den의 네 혈청형에 대해 수득된 HIAF에 의해 인지된다. 평가된 다른 플라비바이러스에 대한 나머지 HIAF 중에서, 항-SLE은 항-Den HIAF에 대해 수득된 것과 유사한 시그널 강도를 갖는 PMEC1을 향한 가장 높은 반응성을 나타낸다. 항-TBE 및 항-YF HIAF은 또한 낮은 강도임에도 PMEC1를 인지한다. 다른 HIAF의 반응성은 단백질이 바이러스의 E 단백질의 천연 구조로서 유사한 구성으로 정확하게 폴딩됨을 나타내는 PMEC1의 디설피드 결합의 존재에 많이 의존한다.
PMEC1 단백질은 또한 다른 역학적 상황에서 Den에 감염된 사람으로부터의 인간 혈청과의 반응성을 통해 점 블롯팅으로 특성화되었다. 이러한 검정에서 4가지 바이러스 혈청형(즉 Den1, Den2, Den3 및 Den4)의 일차 감염의 회복기환자로부터의 혈청을 포함한다. Den2 또는 Den3로 이차 감염된 개체로부터의 혈청 또한 사용하였다. 인간 항체를 동일한 유행성 및 실험된 유사한 임상 증상 및 유사한 혈청학 결과를 갖는 감염된 세 개체로부터의 혈청 풀로서 사용하였다. 각 혈청을 바이러스 항원 및 PMEC1 단백질에 대한 IgM 항체의 존재에 대하여 평가하였다.
점 블롯팅에서 PMEC1 단백질을 향한 인간 항체의 반응성.
PI * SI ** Mab 4G2 Mab 3 H5
DEN-1 DEN-2 DEN-3 DEN-4 DEN-2 DEN-3
PMEC1 *** ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ -
PMCE1 - RC - - - - - - - -
DIIIe2 - ++ - - ++ ++ - +++
DIIIe2 - RC - - - - - - - -
DEN Ag +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++
Neg Ctrl - - - - - - - -
* DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4에 대한 일차 감염(PI)의 회복기환자로부터의 혈청 풀.
** DEN-2 및 DEN-3에 대한 이차 감염(SI)의 회복기환자로부터의 혈청 풀.
*** 10밀리그램의 정제된 PMEC1 및 DIIIe2 단백질을 니트로셀룰로스 막에 부하하였다. RC: 환원되고 카르브아미도메틸화된 단백질. 시그널 강도를 + 내지 +++의 규모로 평가하였다.
DEN Ag: 네 혈청형의 바이러스 항원의 풀. 바이러스 항원을 감염된 베로 세포의 상청액으로부터 수득하였다.
Neg Ctrl: 비-감염 베로 세포의 상청액으로 구성된 대조 제형.
인간 혈청을 1:400 희석에서 사용하였다. 3H5 및 4G2 Mab을 10 ㎍/mL에서 사용하였다.
다른 바이러스 혈청형에 감염된 개체로부터의 인간 혈청은 유사한 강도로 PMEC1을 인식한다. 가장 강한 시그널을 마찬가지로 ELISA에 의한 더 높은 항-바이러스 역가에 상응하는 이차 감염된 개체로부터의 혈청으로 수득하였다.
실시예 6 - PMEC1 단백질로의 면역화에 의해 수득된 항체 반응의 특성화.
80마리의 Balb/c 마우스의 그룹에게 프로인트 아쥬반트로 에멀젼화된 20 mg의 정제 PMEC1를 복강내(i.p) 주입하였다. 4차 투여 후에 10마리 마우스로부터 채혈하고 혈청을 추가 혈청학 분석을 위해 수집하였다. ELISA에 의해 측정된 항-Den 항체는 바이러스의 혈청형에서와 유사하게 높다(표 4). 동시에, 유도된 Abs의 기능성을 적혈구응집의 저해(inhibition of hemaglutination; IHA) 및 플라크 감소 중화(plaque reduction neutralization; PRNT) 실험에 의해 측정하였다. IHA 검정에서 항-PMEC1 항체는 4개의 Den 혈청형에 대한 양성 역가를 산출한다(표 5). 또한 1/1280의 중화 역가를 네 바이러스에 대하여 수득하였다(표6).
PMEC1 단백질로의 면역화에 의해 수득된 혈청의 항-Den 항체 역가.
ELISA 에 의해 결정된 항체 역가 *
마우스 항- DEN -1 항- DEN -2 항- DEN -3 항- DEN -4
1 1: 128 000 >1: 128 000 1: 64000 1: 128 000
2 >1: 128 000 >1: 128 000 >1: 128 000 >1: 128 000
3 1: 64000 >1: 128 000 1: 128 000 1: 128 000
4 >1: 128 000 >1: 128 000 >1: 128 000 >1: 128 000
5 1: 128 000 1: 128 000 1: 128 000 1: 32000
6 1: 64000 1: 64000 >1: 128 000 1: 64000
7 >1: 128 000 >1: 128 000 >1: 128 000 >1: 128 000
8 1: 128 000 1: 64000 1: 128 000 1: 128 000
9 >1: 128 000 >1: 128 000 >1: 64 000 >1: 128 000
10 >1: 128 000 >1: 128 000 >1: 64 000 >1: 128 000
* 항체 역가는 종말점 희석에 의해 결정되었다.각 혈청을 기재된 바와 같은 각 바이러스 혈청형에 감염된 미숙한 마우스 뇌로부터 수득된 바이러스 항원 제제와 동시에 평가되었다(Clarke , D. M., Casals , J. Techniques for hemaglutination and hemaglutination-inhibition with arthropode - borne viruses . American Journal of Tropical Medicine and Hygiene 1958. 7:561-573). 비-접종 마우스의 뇌로부터 수득된 유사한 제제를 음성 대조로서 사용하였다.
PMEC1 단백질로 면역화됨에 의해 생성된 항체의 IHA 역가.
IHA 의 역가 *
마우스 항- DEN -1 항- DEN -2 항- DEN -3 항- DEN -4
1 1:640 1:320 1:640 1:640
2 1:640 1:640 1:640 1:320
3 1:320 1:320 1:320 1:320
4 1:10 1:5 1:10 1:10
5 1:640 1:640 1:640 1:640
6 1:640 1:320 1:640 1:640
7 1:640 1:640 1:640 1:640
8 1:1280 1:640 1:1280 1:1280
9 1:320 1:320 1:320 1:640
10 1:10 1:5 1:10 1:10
* IHA 역가는 8개의 적혈구응집 바이러스 유닛에 의해 유발된 거위 적혈구 응집을 저해하는 최대 희석으로서 정의되었다.
PMEC1 단백질로 면역화된 동물로부터의 혈청을 사용한 바이러스 중화 검정
바이러스 중화 역가 *
마우스 항- DEN -1 항- DEN -2 항- DEN -3 항- DEN -4
1 1: 1280 1: 1280 1: 1280 1: 1280
2 1: 1280 1: 1280 1: 1280 1: 640
3 1: 640 1: 160 1: 320 1: 320
4 1: 80 <1: 40 <1: 40 <1: 40
5 1: 1280 1: 1280 1: 1280 1: 1280
6 1: 640 1: 1280 1: 1280 1: 1280
7 1: 320 1: 640 1: 640 1: 640
8 1: 1280 1: 1280 1: 1280 1: 1280
9 1: 1280 1: 320 1: 1280 1: 640
10 <1: 40 1: 320 1: 320 1: 320
* 중화 역가는 BHK-21 세포에서의 바이러스 플라크의 50% 감소를 산출하는 희석으로서 정의하였다.
실시예 7 - 보호 검정
채혈 후에 남아 있는 PMEC1로 면역화시킨 동물을 그룹으로 나누어 항원투여 연구를 수행하기 위해 사용하였다. 15마리 동물의 네 그룹에 바이러스의 네 혈청형 중 하나의 생 신경적응(neuroadapt) 균주 100 LD50 으로 i.c 주입하여 접종하고 21일간 관찰하였다. 10마리 동물의 다섯 번째 그룹은 바이러스 항원투여를받지 않았다. 양성 대조는 바이러스(즉 Den1, Den2, Den3 및 Den4)의 동질성 혈청형으로 면역화되고 순차적으로 항원투여된 15마리 동물 그룹으로 구성되었다. 15마리 마우스의 다른 네 그룹 각각을 실험의 음성 대조로서 사용하였다; 이러한 동물에게 PBS를 주입하였으며 다른 바이러스 혈청형으로 항원투여하였다. PMEC1으로 면역화된 동물의 그룹은 80% 내지 90% 사이의 동물 생존율을 나타내는 반면, PBS로 면역화된 마우스는 바이러스 접종 후 7-11일 사이에 뇌염 증상을 나타내고 21일 전에 사망한다(표 7). 바이러스-면역화 그룹의 동물은 100% 예방되었다.
치명적 Den 바이러스로의 항원투여에 대한 단백질 변이체로 면역화된 마우스에서의 생존율.
면역원 바이러스 혈청형 생존율*
PBS DEN-1 0
PBS DEN-2 0
PBS DEN-3 0
PBS DEN-4 0
DEN-1 DEN-1 100
DEN-2 DEN-2 100
DEN-3 DEN-3 100
DEN-4 DEN-4 100
PMEC1 DEN-1 86
PMEC1 DEN-2 80
PMEC1 DEN-3 90
PMEC1 DEN-4 86
* 다음과 같이 계산되었다: (생존 마우스의 수)/(총 마우스 수) 생존 마우스 데이터는 항원투여후 21일에 수집되었다.
실시예 8. mAb 4 G2 및 E-단백질에 의해 형성된 복합체의 구조적 예측.
항원-항체 복합체의 구조를 모델링하기 위해, 분자 도킹 연구를 mAb 4G2의 FAb 단편의 결정학적 구조(1uyw) 및 댕기 2 바이러스의 외피 E-단백질의 두 결정학적 구조(PDB 파일 1oan 및 1oam)를 사용하여 실행하였다. CLUSPRO 방법을 예측에 사용하였으며(http://nrc.bu.edu/cluster/, S.R. Comeau , D.W. Gatchell , S. Vajda , C.J. Camacho. ClusPro : an automated docking and discrimination method for the prediction of protein complexes . (2004) Bioinformatics , 20, 45-50), 이는 잠재적 복합체의 구조의 생성에 대한 두개의 다른 프로그램을 포함한다: DOT 및 ZDOCK ( Mandell JG , Roberts VA , Pique ME, Kotlovyi V, Mitchell JC , Nelson E, Tsigelny I, Ten Eyck LF . (2001) Protein docking using continuum electrostatics and geometric fit . Protein Eng 14:105-13. Chen R, Li L, Weng Z (2003) ZDOCK : An Initial-stage Protein - Docking Algorithm . Proteins 52:80-87).
전체로, 13개 분자 도킹 시뮬레이션이 다음의 파라미터를 변화시켜 실행되었다: 도킹 프로그램(DOT 또는 ZDOCK), 리간드 및 수용체의 정의(Fv 단편 또는 E-단백질), E-단백질의 결정학적 구조 (1oan 또는 1oam), E-단백질의 사차 구조 (단량체 또는 이량체), E-단백질의 Fv 단편 또는 N-말단 세그먼트(잔기 1-120)의 결합 부위를 포함하는 여과물 용액의 억제 용도 (DOT에서의 주목되는 의견). 도 7은 시뮬레이션의 결과를 요약한 도식을 보여준다. 이러한 복합체들은 E-단백질의 도메인 II에 위치한 에피토프를 예측하는, 잠재적 해결책으로 여겨지며 이 에피토프는 비리온의 구조에 따라 항체와의 상호작용에 영향을 받기 쉬우며 파라토프는 항체의 과-가변 영역이다. 도메인 II 내의 에피토프 A1(mAb 4G2에 의해 인지되는 에피토프)의 위치는 실험 데이터에 의해 뒷받침되며 이는 또한 동일한 에피토프에 직접적으로 대항하는 관련된 항체가 E-단백질의 아미노산 1-120으로 구성된 보호 단편을 인지함을 측정하였다( Roehrig , J.T., Bolin , R.A. and Kelly , R.G. Monoclonal Antibody Mapping of the Envelope Glycoprotein of the Dengue 2 Virus , Jamaica . 1998, Virology 246: 317-328).
구조적으로 매우 유사한, 6개의 잠재적 해결책을 수득하였다. 표 8은 예측된 E-단백질-Fv 복합체의 접점 파라미터에 상응하는 수치를 보여주며 예측된 복합체에 대해 계산된 수치는 결정학적 구조가 실험적으로 미리 결정된, 단백질-항체 복합체에 대해 계산된 수치와 유사하다(표 9).
항체와 접촉하는 E-단백질의 표면 패치는 단백질 서열의 4개 세그먼트를 포함한다. 이러한 발견은 인지가 단백질의 정확한 폴딩에 의존하는, 에피토프이 위상학적 성질과 일관된 것이며 디설피드 다리의 감소에 쉽게 영향을 받는다. 삼차 모델에 의해 규정된 구조 에피토프는 이러한 항체의 다양한 교차-반응성 및 실시예 5에 기재된 키메릭 단백질 PMEC1의 인지와 일관된, 플라비바이러스의 고도로 보존된 영역을 포함한다. 모델은 또한 이 항체의 중화 메커니즘이 막으로의 E-단백질 결합 및/또는 융합 과정에 관련된 삼량체화를 포함함을 제안한다.
게다가, 항체에 의해 인지되는 에피토프는 미성숙 비리온의 동결-전자 현미경 연구에서의 프리엠에 상응하는 전자 밀도로부터 추측된 바와 같이, E-단백질 및 프리-엠(pre-M) 사이의 상호작용에 관련된 영역과 일치한다. 상호작용 표면의 보존에 관련된 진화론적 압력은 E-단백질 상의 이 에피트포의 고도의 보존을 설명할 수 있다. 게다가, 이러한 표면 패치에서의 탈출 돌연변이의 등장은 이러한 돌연변이가 프리-엠의 표면에서 동시 돌연변이를 안정화하여 보완되기 때문에 가능성이 적다. 사실, 이 항체에 대해 수득된 탈출 돌연변이는 도메인 I 및 II 사이의 힌지 영역에 위치하며 돌연변이 바이러스는 융합 막으로의 이의 능력을 매우 약화시키거나 없앤다. 이는 플라비바이러스에 대한 재조합 백신 후보와 같은 본 발명의 PMEC 키메릭 단백질의 유리한 특성을 구성한다.
그 후에, 성숙한 비리온의 구조 맥락에서 FAb 4G2 및 E-단백질 사이의 상호작용을 모델링하였다. 이러한 목적으로, 성숙한 비리온의 동결-전자 현미경적 구조 내로 미리 모델링된 복합체를 도킹하였다. 모델을 수득하기 위해 다음을 사용하였다: 1) 동결-전자 현미경에 의해 수득된 비리온의 구조에 상응하는 PDB 파일 1THD, 2) 분자 도킹에 의해 미리 모델링된, FAb 4G2 및 E-단백질의 단량체에 의해 형성된 복합체의 배위, 3) 파일 1THD에 상응하는 20면체 대칭 연산을 분자 도킹에 의해 미리 모델링된 복합체에 적용하였다.
이러한 방식으로, 모델을 FAb에 의해 차지되는 비리온 상에 존재하는 mAb 4G2 (180)에 의해 인지되는 에피토프의 모든 카피로 수득되었다 (도 9).
mAb 4G2 및 E-단백질에 의해 형성된 복합체에 상응하는 모델의 접점 특성.
접점 파라미터* Fv 에 대한 수치 E에 대한 수치
접점 표면 접근가능성 1070.14 1034.10
접점 표면 접근가능성의 % 10.60 5.20
평면도(Planarity) 2.46 2.50
길이 및 너비 32.62 & 24.75 39.74 & 26.44
길이/너비 비율 0.67 0.55
접점 세그먼트 7 4
접점 극성 원자 % 51.78 46.49
접점 무극성 원자 % 48.20 53.50
이차 구조 Beta Beta
수소 결합 16 16
염다리 0 0
디설피드 다리 0 0
분리 부피 4618.96 4618.96
분리 부피의 인덱스 2.20 2.20
* 단백질-단백질 접점 파라미터를 다음의 웹서버 http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/PP/server/ 를 사용하여 계산하였다.
FAb 단편의 중쇄의 C-말단 잔기 사이의 거리의 정밀조사는 항체 이가 결합이 비리온의 구조에 주요 변화 없이는 가능하지 않음을 나타낸다. 이러한 관찰은 FAb 및 mAb의 등몰량이 매우 유사한 중화 역가를 나타냄을 보이는, 실시예 12에서 수득된 결과와 일치한다. 이러한 발견은 이가 결합 모드에 대해 예상되는 규모의 2-3개의 정렬의 증가와 대비된다
단백질-항체 복합체의 특성화 접점 특성*.
접점 파라미터 단백질-항체
실시예 없음 6
접점 ASA (Å 2 ) 평균 777
Sd 135
평면성 평균 2.2
Sd 0.4
원형성 평균 0.8
Sd 0.1
세그먼트화 평균 4
Sd 1.83
100(Å 2 ) 당 수소 결합 평균 1.1
Sd 0.5
분리 인덱스 평균 3.0
sd 0.8
*Jones, S. and Thornton, J.M. (1996). Principles of Protein - Protein Interactions Derived From Structural Studies PNAS. Vol. 93 p.13-20. http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/PP/server/
실시예 9. 키메릭 단백질 MA4G2 (이가) 및 TB4G2 (삼가)의 설계.
이 실시예에서 성숙한 비리온에서 나타나는 E-단백질 단량체의 2 또는 3개의 카피에 동시에 결합할 수 있는, mAb 4G2 결합 부위에 관련된 키메릭 단백질의 설계를 나타낸다. 실시예 8의 모델링은 비리온의 비대칭 유닛에 위치한 E-단백질 단량체에 결합하는 FAb의 중쇄의 C-말단 잔기를 분리하는 거리가 각각 80, 100 및 120 Å 임을 나타낸다. 이러한 수치는 비리온으로의 항체 이가 결합을 허용하기에는 너무 크다 (도 9). 다른 비대칭 유닛으로부터의 E-단백질 단량체에 결합하는 Fab에 상응하는 C-말단 잔기 사이에서 계산된 거리는 여전히 크다. 그러나, 비대칭 유닛에 결합하는 Fv 단편의 중쇄의 C-말단 잔기 사이에서 계산된 거리는 각각 36, 58 및 70 Å이다. 이러한 세 원자들은 반지름이 35 Å의 원으로 한정되며, 이는 삼가 결합이 10-15개 잔기의 링커 세그먼트를 통해 삼량체화 도메인으로 융합됨에 의해 가능함을 나타낸다.
유사하게, E-단백질 이량체에 결합하는 Fv 단편의 중쇄의 C-말단 사이의 상응하는 거리는 36 Å이며, 이는 5-10개의 잔기의 작은 링커 세그먼트를 갖는 이량체화 도메인으로 융합됨에 의해 가능함을 나타낸다.
미니항체( miniantibody ) 유형 분자(이가 결합)의 설계
이가 결합 분자의 예로서 키메릭 단백질 MA4G2를 설계하였다. 이의 서열은 N-말단으로부터 C-말단까지 다음의 세그먼트를 함유한다:
1- scFv, 유형 VL-링커-VH (서열 번호 25, 26 및 27)의 mAb 4G2의 단쇄 Fv 단편, VL은 of mAb 4G2의 경쇄의 가변 영역이며 VH는 같은 항체의 중쇄의 가변 영역이다.
2- GGG, 세 글리신 잔기 링커 세그먼트
3- 힌지-CH2-CH3은 힌지 세그먼트 및 인간 IgG1 분자의 불변 도메인 2 및 3에 상응하며 글리코실화 부위 N297은 글리신으로 돌연변이되었다(서열 번호 52)
단백질 MA4G2는 진핵생물 및 원핵생물에서 발현될 수 있으며 힌지 영역에 위치하는 시스테인 잔기 사이의 세포내 디설피드의 형성에 기인하는 이량체로서 결합하고 이러한 방식으로 분자의C-말단 부분에서 인간 FC 도메인을 나타낸다. 힌지 영역은 적절한 간격 및 연성을 나타내므로 세개의 잔기 링커(GGG)는 scFv 도메인 및 힌지-FC 세그먼트 사이의 연결자로서 충분하다. 도 10은 키메릭 단백질 MA4G2 및 E-단백질 이량체에 의해 형성된 복합체의 3D 구조의 모델을 도시한 것이며, 이는 비리온으로의 이가 결합의 실행가능성을 나타낸다.
글리코실화 부위에서의 돌연변이의 존재는 진핵생물에서 비-글리코실화 FC 수반 분자를 수득하도록 한다. 비글리코실화 FC 도메인은 생체외에서 감염 면역-증강을 매개할 수 있는, 수용체 FcγR I-III에 결합하지 않는다( Lund , J., Takahashi, N., Pound , J. D., Goodall , M., and Jefferis , R. 1996, J. Immunol. 157, 4963-4969. Lund , J., Takahashi , N., Pound , J. D., Goodall , M., Nakagawa , H., and Jefferis, R. 1995, FASEB . J. 9, 115-119). 이러한 방식으로, 원조 항체 분자와 같지 않은, 설계된 단백질은 아-중화 농도에서 ADE의 매개 위험이 없다. 게다가, 키메릭 단백질은 중화 항체와 유사한, 생체내 수명의 긴 반감기를 나타내는 것이 바람직한 FcRn 수용체 결합 특성을 유지한다.
키메릭 삼가 단백질 TB4G2
삼가 결합 분자의 예로서, 다음의 구조를 갖는 서열의 키메릭 단백질 TB4G2를 설계하였다:
scFv-링커-T
여기에서,
1- scFv, 유형 VL-링커-VH (서열 번호 25, 26 및 27)의 mAb 4G2의 단쇄 Fv 단편, VL은 mAb 4G2의 경쇄의 가변 영역이고 VH는 같은 항체의 중쇄의 가변 영역이다
2- 서열(GGGS)3GGG 의 링커 세그먼트인 링커(서열 번호 28)
3- T는 나선형 삼량체 도메인 인간 매트릴린이다(서열 번호 51)
매트릴린의 삼량체 도메인은 평행한 코일-코일 구조로서 삼량체화된 알파 헬릭스이다. 삼량체는 각 단량체의 N-말단에 근접하여 위치한 두 시스테인 잔기 사이의 여섯 개의 세포내 디설피드 다리를 포함한다. 이러한 삼량체 나선형 구조는 50 ℃에서 매우 안정한 dG = 7kcal/몰이다( Wiltscheck R, Kammerer RA , Dames SA , Schulthess T, Blommers MJ , Engel J, Alexandrescu AT . Heteronuclear NMR assignments and secondary structure of the coiled coil trimerization domain from cartilage matrix protein in oxidized and reduced forms . Protein Sci . 1997; 6: 1734-45). 디설피드 다리는 비-공유 상호작용에만 기초한 삼량체와 유리하게 비교되는, 매우 낮은 농도에서 공유 링크된 삼량체 사차 구조를 확보한다.
링커 세그먼트는 아미노산 Gly 및 Ser에 의해 구성되며 이는 매우 연성이다. 유사한 조성의 아미노산 서열은 단백질 공학에서 링커 서열로서 매우 자주 사용된다. 10개 잔기의 세그먼트가 비리온으로의 삼가 결합에 필수적인 35 Å의 간격을 제공할 수 있지만, 이는 세그먼트가 완전히 연장된 구성을 채택할 경우에만 사실이다. 해결책에서, 링커 세그먼트는 열역학적 평형상태에서 다중 구조를 나타내며 유일한 연장된 구조를 채택하는 것은 상당한 엔트로피 에너지 손실을 의미할 것이다. 링커 세그먼트의 구조 특성을 나타내기 위해, 프로그램 전조를 사용하여 15개 잔기 (GGGS)3GGG 서열의 구조 예측을 실시하였다. 이 방법은 T국소 상호작용을 나타내는 통계학적 잠재성에 기초하며 펩티드 구조 예측에 이미 사용되었다. 도 11은 예상되는 더 유효한 구성에 대한 N-말단 및 C-말단 사이의 거리 대 에너지 수치의 플롯을 보여준다. 최소 에너지는 35 Å의 크기에 상응하며 가장 연장된 구성(40 Å이상)은 매우 분리하다. 그러므로, 평가 결과는 링커 세그먼트로서 선택된 서열이 삼가 결합 분자의 설계에 적합함을 나타낸다.
실시예 10 - 단쇄 항체 단편( scFv 4 G2 ), 삼가 분자( TB4G2 ), 및 항체 4 G2 로부터의 가변 영역을 갖는 단쇄 미니항체( MA4G2 )를 코드하는 플라스미드의 획득.
단쇄 항체 단편, 다량체 단백질 및 모노클로날 항체 4G2로부터의 가변 영역을 갖는 단쇄 미니항체(MA4G2)를 수득하기 위해, Agarwal 등의 문헌 ( Agarwal KL , Buchi H, Caruthers MH , Gupta N, Khorana HG , Kumas A, Ohtsuka E, Rajbhandary UL , van de Sande JH , Sgaramella V, Weber H, Yamada T, Total synthesis of the Gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast , (1970), Nature 227, 27-34) 의 방법을 포스포아미디트 화학을 통해 고형상에서 합성한 올리고누클레오티드, 이중가닥 DNA 분자(서열 번호 15, 서열 번호 16 및 서열 번호 17)로부터 시작하는, 합성에서 사용하였으며( Beaucage SL , Caruthers MH , Deoxynucleoside phosphoramidites- A new class of key intermediates for deoxypolynucleotide synthesis., Tetrahedron Letters , (1981), 22, 1859), 제조업자에 의해 명시된 조건 하에서 제한 효소 Nco I 및 Xho I (Promega Benelux b.v., The Netherlands)에 의해 각각 절단된다. 그런 다음 각 절단된 분자를 제조업자에 의해 명시된 조건 하에서 같은 효소로 미리 절단한 플라스미드 pET22b (Novagen, Inc., USA)에 T4 DNA 리가제(Promega Benelux, b.v., The Netherlands)를 사용하여 연결시켰다. 결합물을 Sambrook 등의 문헌( Sambrook J, Fritsch EF , Maniatis T. Molecular cloning : A laboratory manual . New York , USA : Cold Spring Harbor Laboratory Press ; 1989)에 기재된 조건에 따라 E. coli 균주 XL-1Blue 내로 형질전환시켰으며( Bullock WO , Fernandez JM , Short JM . XL -1 Blue : A high efficiency plasmid transforming recA Escherichia coli K12 strain with beta - galactosidase selection. Biotechniques 1987;5:376-8), 선별 배지에서 성장한 결과적 콜로니에 존재하는 플라스미드를 제한 분석을 사용하여 스크리닝하였다. 각 형질전환체로부터의 여러 재조합 플라스미드의 서열은 자동 생거 서열결정에 의해 확인되었으며 각 반응에서 대표적 분자를 서열이 예상 서열에 매치되는 것으로 선택된다. 이러한 플라스미드는 단쇄 항체 단편의 발현에 대하여 pET-scFv 4G2 LH (도 5, 서열 번호 18)로 명명되고, 다량체화 서열의 발현에 대하여 pET-TB4G2 LH (도 6A, 서열 번호 19)로 명명되며 항체 4G2로부터의 가변 영역을 수반하는 단쇄 미니 항체의 발현에 대하여 pET-MA4G2 LH (도 6B, 서열 번호 20)로 명명되었다.
이러한 플라스미드는 상기 언급된 합성 밴드에 의해 코드되는 단백질의 T7 프로모터 하에서 및 이소프로필티오갈락토사이드 (isopropylthiogalactoside; IPTG)의 도입을 통해(서열 번호 16 및 서열 번호 17) E. coli에서의 발현을 위해 사용할 수 있으며, 이들의 반응성 미성숙의 프로세스화되지 않은 형태(서열 번호 21, 서열 번호 22 및 서열 번호 23)에서 N-말단 내지 C-말단 방향으로 다음의 요소를 포함한다: 프로세스되지 않은 단백질scFv 4G2 LH에서, pelB 시그널 펩티드(서열 번호 24), b) Nco I 부위의 성질에 의해 도입되는, 아미노산 M (메티오닌) 및 A (알라닌), c) 모노클로날 항체 4G2의 경쇄의 가변 영역 (서열 번호 25), d) 연성 스페이서 (링커) (서열 번호 26), e) 모노클로날 항체 4G2의 중쇄의 가변 영역 (서열 번호 27), f) 클로닝 전략에 의해 도입된, 아미노산 L (루신) 및 E (글루탐산) 및 g) 6개 히스티딘의 C-말단 세그먼트; 프로세스되지 않은 단백질 TB4G2 LH에 대하여: a) pelB 시그널 펩티드 (서열 번호 24), b) Nco I 부위의 성질에 의해 도입되는, 아미노산 M (메티오닌) 및 A (알라닌), c 모노클로날 항체 4G2의 경쇄의 가변 영역 (서열 번호 25,d) d) 연성 스페이서(링커) (서열 번호 26), e) 모노클로날 항체 4G2의 중쇄의 가변 영역 (서열 번호 27), f) 연성 스페이서(링커) (서열 번호 28), g) 용액에서 삼량체화할 수 있는 특성을 분자에 부여하는 인간 매트릴린으로부터의 단편 (서열 번호 51), h) 클로닝 전략에 의해 도입된, 아미노산 L (루신) 및 E (글루탐산) 및 e) 6개 히스티딘의 C-말단 세그먼트; 프로세스되지 않은 MA4G2 LH 단백질에 대하여: a) pelB 시그널 펩티드 (서열 번호 24), b) Nco I 부위의 성질에 의해 도입되는, 아미노산 M (메티오닌) 및 A (알라닌), c) 모노클로날 항체 4G2의 경쇄의 가변 영역 (서열 번호 25), d) 연성 스페이서(링커) (서열 번호 26), e) 모노클로날 항체 4G2의 중쇄의 가변 영역 (서열 번호 27), f) 연속된 세 글리신(G)으로 구성된 연성 스페이서(링커), g) 힌지 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 인간 면역글로불린의 불변 영역의 단편, 여기에서 힌지의 아미노산 C (시스테인)는 S(세린)으로 돌연변이유발되어 변이되며 CH2 도메인의 잠재적인 글리코실화 부위는 N (아스파라긴)에서 Q (글루타민)으로 돌연변이되어 제거된다 (서열 번호 52), h) 클로닝 전략에 의해 도입된, 아미노산 L (루신) 및 E (글루탐산) 및 e) 6개 히스티딘의 C-말단 세그먼트.
이러한 요소들은 리더 펩티드 절단 및 E. coli 주변세포질로의 이의 분비를 통해 세 단백질(scFv 4G2, TB4G2 및 MA4G2)이 프로세싱되도록 하며, 우세한 산화 조건은 이들의 정확한 폴딩 및 이들의 디설피드 다리의 형성을 허용하며 또한 고정화 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)를 사용하여 이들의 정제를 촉진하였다 (Sulkowski, E. (1985) Purification of proteins by IMAC. Trends Biotechnol. 3, 1-7). 번역후 프로세싱 및 분비 후에 scFv 4G2, TB4G2 및 MA4G2의 최종 서열은 서열 번호 53, 서열 번호 54 및 서열 번호 55에 나타나 있다.
실시예 11 - scFv 4 G2 , TB4G2 및 MA4G2 의 발현 및 정제
각각 플라스미드 pET-scFv4G2 LH, pET-TB4G2 LH 및 pET-MA4G2로부터의 scFv 4G2, TB4G2 및 MA4G2의 정제는 다음과 같이 기재된 방법을 사용한다: Sambrook 등의 문헌( Sambrook J, Fritsch EF , Maniatis T. Molecular cloning : A laboratory manual. New York , USA : Cold Spring Harbor Laboratory Press ; 1989) 에 따라 BL21(DE3) E. coli 균주 내로 상응하는 플라스미드를 형질전환시키고( Studier , F. W. and B. A. Moffatt . " Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high - level expression of cloned genes ." J. Mol . Biol . 189.1 (1986): 113-30), 분리된 콜로니를 50 ㎍/mL (LBA)에서 암피실린이 보충된 루리아-베르타니 배지의 50 mL 배양을 접종하는데 사용하고, 이를 350 r.p.m.에서 30 ℃ 에서 12시간 동안 성장시켰다. 이러한 배양으로, 1 L의 LBA 배지를 0.05의 620 nm(OD620)에서 시작 광학 밀도로 접종한 후 후기의 급격한 증가 상이 나타날 때까지 28 ℃에서 8시간 동인 성장시켰다. 그런 다음 이 배양을 이소프로필갈락토사이드(IPTG)를 첨가하여 유도하였으며 추가 5시간 동인 같은 조건에서 성장시켰다.
상기 기재된 바와 같이 수득된 배양을 4 ℃ 에서 30분간 at 5000 x g 로 원심분리하고 주변세포질 분획을 결과적으로 생성된 바이오매스로부터 Ausubel 등의 문헌( Ausubel , F.M., Brent , R., Kingston , R.E., Moore , D.D., Seidman , J.G., Smith, J.A. and Struhl , K (1989) in Current Protocols in Molecular Biology . John Wiley & Sons , New York )의 방법을 사용하여 추출하였다. 이 분획을 1000 Da 컷-오프를 갖는 막을 사용하여 50 mM 포스페이트 완충용액 pH 7 / 20 mM 이미다졸에 대하여 투석하고, 단백질 PMEC1-His6을 Ni-NTA 아가로스(Qiagen Benelux B.V., The Netherlands)를 제조업자의 지침에 따라 사용하는 고정화 메탈 친화성 크로마토그래피로에 의해 투석물로부터 수득하였다( Sulkowski , E. 1985, Purification of proteins by IMAC . Trends Biotechnol . 3, 1-7).
실시예 12. MAG4G2 및 TB4G2 단백질에 의한 바이러스 감염의 중화.
MA4G2 및 TB4G2 키메릭 단백질의 생물학적 활성의 특성화를 BHK-21 세포에서 플라크 감소 중화 검정을 사용하여 실시하였다 (표 10). 이러한 동일한 검정을 Mab 4G2, 이의 Fab 및 Fab2 단편 및 scFv4G2를 갖는 키메릭 단백질의 생물학적 활성을 비교하기 위해 사용하였다 (표 10).
Fab 및 Fab2 단편을 Mab 4G2의 파파인 및 펩신으로의 절단으로 수득하였다. 프로테아제 절단 후 Fab 및 Fab2를 고정화 단백질 A를 갖는 친화성 크로마토그래피에 의해Fc 단편으로부터 분리하였다. Fab 및 Fab2 동형을 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 추가로 정제하였다. 중화 역가를 바이러스 플라크 수의 50% 감소를 산출하는 분자의 희석으로서 규정하였다. 다른 분자의 희석은 검정에서의 등몰 농도를 수득하기 위해 조정되었다.
MA4G2, TB4G2, Mab4G2 및 Mab4G2 Fab, Fab2 및 scFv4G2 단편의 바이러스 중화 검정.
바이러스 중화 역가 *
분자 항- DEN -1 항- DEN -2 항- DEN -3 항- DEN -4
Mab 4G2 1: 1280 1: 1280 1: 320 1: 128
Fab 4G2 1: 1280 1: 1280 1: 320 1: 128
Fab2 4G2 1: 1280 1: 1280 1: 320 1: 128
scFv4G2 1: 1280 1: 1280 1: 320 1: 128
TB4G2 1: 128000 1: 128000 1: 64000 1: 32000
MA4G2 1:128000 1:128000 1: 64000 1: 32000
Mab Hep1 <1: 40 <1: 40 <1: 40 <1: 40
* 중화 역가는 BHK-21 세포에서 바이러스 플라크의 50% 감소를 산출하는 희석으로서 정의되었다.
SEQUENCE LISTING <110> Centro de Ingenieria Genetica y Biotecnologia <120> METHODS AND PROTEINS FOR THE PROPHYLACTIC AND/OR THERAPEUTIC TREATMENT OF FOUR SEROTYPES OF DENGUE VIRUS AND OTHER FLAVIVIRUSES <130> <140> <141> <160> 56 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Polypeptide Sequence PMEC1 <400> 1 Val Thr Lys Asn His Ala Lys Lys Asp Val Val Val Gly Gly Lys Thr 1 5 10 15 Asn Thr Thr Thr Ser Arg Cys Thr Gly Ser Asn Asp Lys Arg Cys Lys 20 25 30 His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Gly Lys Gly 35 40 45 Gly Val Thr Cys Ala Met Thr 50 55 <210> 2 <211> 1485 <212> DNA <213> Dengue virus type 2 <220> <221> gene <222> (1)..(1485) <223> Gene of the envelope E-glycoprotein of DEN2 virus strain Jamaica 1409 This gene is contained in the plasmid p30-VD2 <400> 2 atgcgttgca taggaatatc aaatagagac tttgtagaag gggtttcagg aggaagctgg 60 gttgacatag tcttagaaca tggaagttgt gtgacgacga tggcaaaaaa taaaccaaca 120 ttggattttg aactgataaa aacagaagcc aaacaacctg ccactctaag gaagtactgt 180 atagaagcaa agctgaccaa tacaacaaca gaatctcgtt gcccaacaca aggggaaccc 240 agtctaaatg aagagcagga caaaaggttc ctctgcaaac actccatggt agacagagga 300 tggggaaatg gatgtggatt atttggaaag ggaggcattg tgacctgtgc tatgtttaca 360 tgcaaaaaga acatggaagg aaaagtcgtg ctgccagaaa atttggaata caccatcgtg 420 ataacacctc actcaggaga agagcacgct gtaggtaatg acacaggaaa acatggcaag 480 gaaatcaaaa taacaccaca gagttccatc acagaagcag aactgacagg ctatggcact 540 gtcacgatgg agtgctctcc gagaacgggc ctcgacttca atgagatggt gctgctgcag 600 atggaagaca aagcttggct ggtgcacagg caatggttcc tagacctgcc gttaccatgg 660 ctacccggag cggacacaca aggatcaaat tggatacaga aagagacatt ggtcactttc 720 aaaaatcccc acgcgaagaa acaagatgtc gttgttttag gatctcaaga aggggccatg 780 cacacggcac tcacaggggc cacagaaatc cagatgtcat caggaaactt actgttcaca 840 ggacatctca agtgcaggct gagaatggac aaactacagc tcaaaggaat gtcatactct 900 atgtgtacag gaaagtttaa aattgtgaag gaaatagcag aaacacaaca tggaacaata 960 gttatcagag tacaatatga aggggacggc tctccatgta agatcccttt tgagataatg 1020 gatttggaaa aaagacacgt cttaggtcgc ctgattacag ttaacccgat cgtaacagaa 1080 aaagatagcc cagtcaacat agaagcagaa cctccattcg gagacagcta catcatcata 1140 ggagtagagc cgggacaatt gaaactcaac tggtttaaga aaggaagttc catcggccaa 1200 atgtttgaga caacaatgag aggagcgaag agaatggcca ttttaggtga cacagcctgg 1260 gattttggat ccctgggagg agtgtttaca tctataggaa aggctctcca ccaagttttc 1320 ggagcaatct atggggctgc ttttagtggg gtctcatgga ctatgaaaat cctcatagga 1380 gtcatcatca catggatagg aatgaattca cgtagcacct cactgtctgt gtcactagta 1440 ttggtgggag tcgtgacact gtacctggga gctatggtgc aggct 1485 <210> 3 <211> 495 <212> PRT <213> Dengue virus type 2 <220> <223> Polypeptide. Envelope E-glycoprotein of DEN2 virus strain Jamaica 1409 translation of the gene E of plasmid p30-VD2 <400> 3 Met Arg Cys Ile Gly Ile Ser Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Ser 1 5 10 15 Gly Gly Ser Trp Val Asp Ile Val Leu Glu His Gly Ser Cys Val Thr 20 25 30 Thr Met Ala Lys Asn Lys Pro Thr Leu Asp Phe Glu Leu Ile Lys Thr 35 40 45 Glu Ala Lys Gln Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Cys Ile Glu Ala Lys 50 55 60 Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro 65 70 75 80 Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Leu Cys Lys His Ser Met 85 90 95 Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly 100 105 110 Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Cys Lys Lys Asn Met Glu Gly Lys 115 120 125 Val Val Leu Pro Glu Asn Leu Glu Tyr Thr Ile Val Ile Thr Pro His 130 135 140 Ser Gly Glu Glu His Ala Val Gly Asn Asp Thr Gly Lys His Gly Lys 145 150 155 160 Glu Ile Lys Ile Thr Pro Gln Ser Ser Ile Thr Glu Ala Glu Leu Thr 165 170 175 Gly Tyr Gly Thr Val Thr Met Glu Cys Ser Pro Arg Thr Gly Leu Asp 180 185 190 Phe Asn Glu Met Val Leu Leu Gln Met Glu Asp Lys Ala Trp Leu Val 195 200 205 His Arg Gln Trp Phe Leu Asp Leu Pro Leu Pro Trp Leu Pro Gly Ala 210 215 220 Asp Thr Gln Gly Ser Asn Trp Ile Gln Lys Glu Thr Leu Val Thr Phe 225 230 235 240 Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Leu Gly Ser Gln 245 250 255 Glu Gly Ala Met His Thr Ala Leu Thr Gly Ala Thr Glu Ile Gln Met 260 265 270 Ser Ser Gly Asn Leu Leu Phe Thr Gly His Leu Lys Cys Arg Leu Arg 275 280 285 Met Asp Lys Leu Gln Leu Lys Gly Met Ser Tyr Ser Met Cys Thr Gly 290 295 300 Lys Phe Lys Ile Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile 305 310 315 320 Val Ile Arg Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro 325 330 335 Phe Glu Ile Met Asp Leu Glu Lys Arg His Val Leu Gly Arg Leu Ile 340 345 350 Thr Val Asn Pro Ile Val Thr Glu Lys Asp Ser Pro Val Asn Ile Glu 355 360 365 Ala Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Tyr Ile Ile Ile Gly Val Glu Pro 370 375 380 Gly Gln Leu Lys Leu Asn Trp Phe Lys Lys Gly Ser Ser Ile Gly Gln 385 390 395 400 Met Phe Glu Thr Thr Met Arg Gly Ala Lys Arg Met Ala Ile Leu Gly 405 410 415 Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Leu Gly Gly Val Phe Thr Ser Ile 420 425 430 Gly Lys Ala Leu His Gln Val Phe Gly Ala Ile Tyr Gly Ala Ala Phe 435 440 445 Ser Gly Val Ser Trp Thr Met Lys Ile Leu Ile Gly Val Ile Ile Thr 450 455 460 Trp Ile Gly Met Asn Ser Arg Ser Thr Ser Leu Ser Val Ser Leu Val 465 470 475 480 Leu Val Gly Val Val Thr Leu Tyr Leu Gly Ala Met Val Gln Ala 485 490 495 <210> 4 <211> 242 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Codifies for the protein PMEC1, contains restriction sites for cloning in DNA vectors, contains a silence mutation distroying the internal Nco I site <220> <223> Synthetic Double stranded DNA <400> 4 ccatggcatt ggtcactttc aaaaatcccc acgcgaagaa acaagatgtc gttgttggag 60 gtggaaagct gaccaataca acaacagaat ctcgttgccc aacacaaggg gaacccagtc 120 taaatgaaga gcaggacaaa aggttcctct gcaaacactc tatggtagac agaggatggg 180 gaaatggatg tggattattt ggaaagggag gcattgtgac ctgtgctatg tttacactcg 240 ag 242 <210> 5 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Contains a Nco I restriction site, an ATG codon codifing for methionine and a GCA codon for alanine <220> <223> Oligonucleotide fragment <400> 5 catggca 7 <210> 6 <211> 48 <212> DNA <213> Dengue virus type 2 <220> <223> Oligonucleotide fragment <220> <223> Contains the sequence 709-756 of the gene codifying for the E-protein of DEN2 virus strain Jamaica 1409 <400> 6 ttggtcactt tcaaaaatcc ccacgcgaag aaacaagatg tcgttgtt 48 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Dengue virus type 2 <220> <223> Peptide fragment. Corresponds to the fragment 237-252 of the E-protein of DEN2 virus strain Jamaica 1409 <400> 7 Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val 1 5 10 15 <210> 8 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Contains 3 codons codifying for 3 consecutive glycines <220> <223> Oligonucleotide fragment <400> 8 ggaggtgga 9 <210> 9 <211> 57 <212> PRT <213> Dengue virus type 2 <220> <223> Peptide fragment. Corresponds to the fragment 64-120 of the E-protein of DEN2 virus strain Jamaica 1409 <400> 9 Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu 1 5 10 15 Pro Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Leu Cys Lys His Ser 20 25 30 Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly 35 40 45 Gly Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr 50 55 <210> 10 <211> 171 <212> DNA <213> Dengue virus type 2 <220> <223> Oligonucleotide fragment. Contains the sequence 190-360 of the gene codifying for the E-protein of DEN2 virus strain Jamaica 1409. <400> 10 aagctgacca atacaacaac agaatctcgt tgcccaacac aaggggaacc cagtctaaat 60 gaagagcagg acaaaaggtt cctctgcaaa cactccatgg tagacagagg atggggaaat 120 ggatgtggat tatttggaaa gggaggcatt gtgacctgtg ctatgtttac a 171 <210> 11 <211> 6 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence:Contains a Xho I restriction site which contains a CTC codon codifying for leucine and a GAG codon codifying for a glutamic acid <220> <223> Oligonucleotide fragment. <400> 11 ctcgag 6 <210> 12 <211> 5664 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence :Codifies for the expression of the protein sPMEC1-His6 under the T7 promoter <220> <223> Plasmid. <400> 12 taatacgact cactataggg gaattgtgag cggataacaa ttcccctcta gaaataattt 60 tgtttaactt taagaaggag atatacatat gaaatacctg ctgccgaccg ctgctgctgg 120 tctgctgctc ctcgctgccc agccggcgat ggccatggca ttggtcactt tcaaaaatcc 180 ccacgcgaag aaacaagatg tcgttgttgg aggtaagctg accaatacaa caacagaatc 240 tcgttgccca acacaagggg aacccagtct aaatgaagag caggacaaaa ggttcctctg 300 caaacactct atggtagaca gaggatgggg aaatggatgt ggattatttg gaaagggagg 360 cattgtgacc tgtgctatgt ttacactcga gcaccaccac caccaccact gagatccggc 420 tgctaacaaa gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc 480 ataacccctt ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat 540 atccggattg gcgaatggga cgcgccctgt agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg 600 gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc 660 ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc 720 cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt 780 gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag 840 tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa caacactcaa ccctatctcg 900 gtctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag 960 ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat taacgtttac aatttcaggt 1020 ggcacttttc ggggaaatgt gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca 1080 aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg 1140 aagagtatga gtattcaaca tttccgtgtc gcccttattc ccttttttgc ggcattttgc 1200 cttcctgttt ttgctcaccc agaaacgctg gtgaaagtaa aagatgctga agatcagttg 1260 ggtgcacgag tgggttacat cgaactggat ctcaacagcg gtaagatcct tgagagtttt 1320 cgccccgaag aacgttttcc aatgatgagc acttttaaag ttctgctatg tggcgcggta 1380 ttatcccgta ttgacgccgg gcaagagcaa ctcggtcgcc gcatacacta ttctcagaat 1440 gacttggttg agtactcacc agtcacagaa aagcatctta cggatggcat gacagtaaga 1500 gaattatgca gtgctgccat aaccatgagt gataacactg cggccaactt acttctgaca 1560 acgatcggag gaccgaagga gctaaccgct tttttgcaca acatggggga tcatgtaact 1620 cgccttgatc gttgggaacc ggagctgaat gaagccatac caaacgacga gcgtgacacc 1680 acgatgcctg cagcaatggc aacaacgttg cgcaaactat taactggcga actacttact 1740 ctagcttccc ggcaacaatt aatagactgg atggaggcgg ataaagttgc aggaccactt 1800 ctgcgctcgg cccttccggc tggctggttt attgctgata aatctggagc cggtgagcgt 1860 gggtctcgcg gtatcattgc agcactgggg ccagatggta agccctcccg tatcgtagtt 1920 atctacacga cggggagtca ggcaactatg gatgaacgaa atagacagat cgctgagata 1980 ggtgcctcac tgattaagca ttggtaactg tcagaccaag tttactcata tatactttag 2040 attgatttaa aacttcattt ttaatttaaa aggatctagg tgaagatcct ttttgataat 2100 ctcatgacca aaatccctta acgtgagttt tcgttccact gagcgtcaga ccccgtagaa 2160 aagatcaaag gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca 2220 aaaaaaccac cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt 2280 ccgaaggtaa ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg 2340 tagttaggcc accacttcaa gaactctgta gcaccgccta catacctcgc tctgctaatc 2400 ctgttaccag tggctgctgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt ggactcaaga 2460 cgatagttac cggataaggc gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg cacacagccc 2520 agcttggagc gaacgaccta caccgaactg agatacctac agcgtgagct atgagaaagc 2580 gccacgcttc ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca 2640 ggagagcgca cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg 2700 tttcgccacc tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta 2760 tggaaaaacg ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct 2820 cacatgttct ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag 2880 tgagctgata ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt gagcgaggaa 2940 gcggaagagc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 3000 atatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagtatacac 3060 tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa cacccgctga 3120 cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg tgaccgtctc 3180 cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga ggcagctgcg 3240 gtaaagctca tcagcgtggt cgtgaagcga ttcacagatg tctgcctgtt catccgcgtc 3300 cagctcgttg agtttctcca gaagcgttaa tgtctggctt ctgataaagc gggccatgtt 3360 aagggcggtt ttttcctgtt tggtcactga tgcctccgtg taagggggat ttctgttcat 3420 gggggtaatg ataccgatga aacgagagag gatgctcacg atacgggtta ctgatgatga 3480 acatgcccgg ttactggaac gttgtgaggg taaacaactg gcggtatgga tgcggcggga 3540 ccagagaaaa atcactcagg gtcaatgcca gcgcttcgtt aatacagatg taggtgttcc 3600 acagggtagc cagcagcatc ctgcgatgca gatccggaac ataatggtgc agggcgctga 3660 cttccgcgtt tccagacttt acgaaacacg gaaaccgaag accattcatg ttgttgctca 3720 ggtcgcagac gttttgcagc agcagtcgct tcacgttcgc tcgcgtatcg gtgattcatt 3780 ctgctaacca gtaaggcaac cccgccagcc tagccgggtc ctcaacgaca ggagcacgat 3840 catgcgcacc cgtggggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc cgaaacgttt 3900 ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag 3960 cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa tgacccagag 4020 cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa gtgcggcgac 4080 gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat 4140 cggtcgagat cccggtgcct aatgagtgag ctaacttaca ttaattgcgt tgcgctcact 4200 gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 4260 ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcca gggtggtttt tcttttcacc agtgagacgg 4320 gcaacagctg attgcccttc accgcctggc cctgagagag ttgcagcaag cggtccacgc 4380 tggtttgccc cagcaggcga aaatcctgtt tgatggtggt taacggcggg atataacatg 4440 agctgtcttc ggtatcgtcg tatcccacta ccgagatatc cgcaccaacg cgcagcccgg 4500 actcggtaat ggcgcgcatt gcgcccagcg ccatctgatc gttggcaacc agcatcgcag 4560 tgggaacgat gccctcattc agcatttgca tggtttgttg aaaaccggac atggcactcc 4620 agtcgccttc ccgttccgct atcggctgaa tttgattgcg agtgagatat ttatgccagc 4680 cagccagacg cagacgcgcc gagacagaac ttaatgggcc cgctaacagc gcgatttgct 4740 ggtgacccaa tgcgaccaga tgctccacgc ccagtcgcgt accgtcttca tgggagaaaa 4800 taatactgtt gatgggtgtc tggtcagaga catcaagaaa taacgccgga acattagtgc 4860 aggcagcttc cacagcaatg gcatcctggt catccagcgg atagttaatg atcagcccac 4920 tgacgcgttg cgcgagaaga ttgtgcaccg ccgctttaca ggcttcgacg ccgcttcgtt 4980 ctaccatcga caccaccacg ctggcaccca gttgatcggc gcgagattta atcgccgcga 5040 caatttgcga cggcgcgtgc agggccagac tggaggtggc aacgccaatc agcaacgact 5100 gtttgcccgc cagttgttgt gccacgcggt tgggaatgta attcagctcc gccatcgccg 5160 cttccacttt ttcccgcgtt ttcgcagaaa cgtggctggc ctggttcacc acgcgggaaa 5220 cggtctgata agagacaccg gcatactctg cgacatcgta taacgttact ggtttcacat 5280 tcaccaccct gaattgactc tcttccgggc gctatcatgc cataccgcga aaggttttgc 5340 gccattcgat ggtgtccggg atctcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaag 5400 cagcccagta gtaggttgag gccgttgagc accgccgccg caaggaatgg tgcatgcaag 5460 gagatggcgc ccaacagtcc cccggccacg gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa 5520 gcgctcatga gcccgaagtg gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag 5580 gcgccagcaa ccgcacctgt ggcgccggtg atgccggcca cgatgcgtcc ggcgtagagg 5640 atcgagatct cgatcccgcg aaat 5664 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Immature protein sPMEC1-His6 of plasmid pET-PMEC1, before secretion to the periplasm <220> <223> Protein. <400> 13 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His 20 25 30 Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val Gly Gly Gly Lys Leu Thr Asn Thr 35 40 45 Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln Gly Glu Pro Ser Leu Asn Glu 50 55 60 Glu Gln Asp Lys Arg Phe Leu Cys Lys His Ser Met Val Asp Arg Gly 65 70 75 80 Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys 85 90 95 Ala Met Phe Thr Leu Glu His His His His His His 100 105 <210> 14 <211> 83 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence :This is the mature protein codifyied by the plasmid pET-PMEC1, after secreted to the periplasm the signal peptide is removed <220> <223> Protein. <400> 14 Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val 1 5 10 15 Gly Gly Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln 20 25 30 Gly Glu Pro Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Leu Cys Lys 35 40 45 His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr Leu Glu His His His 65 70 75 80 His His His <210> 15 <211> 734 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : Contains a gene codifying for a single chain antibody fragment displaying the variable regions of mAb 4G2 <220> <223> Double stranded synthetic DNA. <400> 15 ccatggcaaa cattgtgatg acccaatctc ccaaatccat gtccatgtca gtaggagaga 60 gggtcacctt gacctgcaag gccagtgaga atgtggttac ttatgtttcc tggtatcaac 120 agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc atccaaccgg tacactgggg 180 tccccgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg 240 tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat ccgtacacgt 300 tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaag agggtaaatc ctcaggatca ggctccgaat 360 ccaaagtcga cgaggtccag ctgcaacaat ctggacctga gctggtgaag cctgggactt 420 cagtgaagat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaatatacc atacactggg 480 tgaagcagag ccacggaaag agccttgcgt ggattggagg tattgatcct aacagtggtg 540 gtactaacta cagcccgaac ttcaagggca aggccacatt gactgttgac aagtcctcca 600 gcacagccta catggacctc cgcagcctgt catctgagga ttctgcagtc tacttctgtg 660 caaggatcta tcattacgac ggatacttcg atgtctgggg cgcagggacc gccgtcaccg 720 tctcctcact cgag 734 <210> 16 <211> 905 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence :Contains a gene codifying for a protein displaying the variable regions of mAb 4G2 and a trimeric domain of matrilin <220> <223> Polinucleotido sintetico. <400> 16 ccatggcaaa cattgtgatg acccaatctc ccaaatccat gtccatgtca gtaggagaga 60 gggtcacctt gacctgcaag gccagtgaga atgtggttac ttatgtttcc tggtatcaac 120 agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc atccaaccgg tacactgggg 180 tccccgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg 240 tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat ccgtacacgt 300 tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaag agggtaaatc ctcaggatca ggctccgaat 360 ccaaagtcga cgaggtccag ctgcaacaat ctggacctga gctggtgaag cctgggactt 420 cagtgaagat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaatatacc atacactggg 480 tgaagcagag ccacggaaag agccttgcgt ggattggagg tattgatcct aacagtggtg 540 gtactaacta cagcccgaac ttcaagggca aggccacatt gactgttgac aagtcctcca 600 gcacagccta catggacctc cgcagcctgt catctgagga ttctgcagtc tacttctgtg 660 caaggatcta tcattacgac ggatacttcg atgtctgggg cgcagggacc gccgtcaccg 720 tctcctcagg tggtggttcc ggtggtggtt ccggtggtgg ttccggtggt ggtgaagacc 780 cgtgcgcttg cgaatccctg gttaaattcc aggctaaagt tgaaggtctg ctgcaggctc 840 tgacccgtaa actggaagct gtttccaaac gtctggctat cctggaaaac accgttgttc 900 tcgag 905 <210> 17 <211> 1439 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : Contains a gene codifying for the synthesis of a single chain miniantibody displaying the variable regions of mAb 4G2 <220> <223> Double stranded synthetic DNA. <400> 17 ccatggcaaa cattgtgatg acccaatctc ccaaatccat gtccatgtca gtaggagaga 60 gggtcacctt gacctgcaag gccagtgaga atgtggttac ttatgtttcc tggtatcaac 120 agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc atccaaccgg tacactgggg 180 tccccgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg 240 tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat ccgtacacgt 300 tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaag agggtaaatc ctcaggatca ggctccgaat 360 ccaaagtcga cgaggtccag ctgcaacaat ctggacctga gctggtgaag cctgggactt 420 cagtgaagat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaatatacc atacactggg 480 tgaagcagag ccacggaaag agccttgcgt ggattggagg tattgatcct aacagtggtg 540 gtactaacta cagcccgaac ttcaagggca aggccacatt gactgttgac aagtcctcca 600 gcacagccta catggacctc cgcagcctgt catctgagga ttctgcagtc tacttctgtg 660 caaggatcta tcattacgac ggatacttcg atgtctgggg cgcagggacc gccgtcaccg 720 tctcctcagg cggtggcgag cccaaatctt ctgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc 780 cagcacctga actcctgggg ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca 840 ccctcatgat ctcccggacc cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag 900 accctgaggt caagttcaac tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa 960 agccgcggga ggagcagtac cagagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc 1020 accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag 1080 cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca 1140 ccctgccccc atcccgggag gagatgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca 1200 aaggcttcta tcccagcgac atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca 1260 actacaagac cacgcctccc gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc 1320 tcaccgtgga caagagcagg tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg 1380 aggctctgca caaccactac acgcagaaga gcctctccct gtccccgggt aaactcgag 1439 <210> 18 <211> 6159 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence :Expression plasmid under the T7 promoter corresponding to a single chain antibody fragment displaying the variables regions of mAb 4G2 <220> <223> Plasmidio. <400> 18 ccatggcaaa cattgtgatg acccaatctc ccaaatccat gtccatgtca gtaggagaga 60 gggtcacctt gacctgcaag gccagtgaga atgtggttac ttatgtttcc tggtatcaac 120 agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc atccaaccgg tacactgggg 180 tccccgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg 240 tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat ccgtacacgt 300 tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaag agggtaaatc ctcaggatca ggctccgaat 360 ccaaagtcga cgaggtccag ctgcaacaat ctggacctga gctggtgaag cctgggactt 420 cagtgaagat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaatatacc atacactggg 480 tgaagcagag ccacggaaag agccttgcgt ggattggagg tattgatcct aacagtggtg 540 gtactaacta cagcccgaac ttcaagggca aggccacatt gactgttgac aagtcctcca 600 gcacagccta catggacctc cgcagcctgt catctgagga ttctgcagtc tacttctgtg 660 caaggatcta tcattacgac ggatacttcg atgtctgggg cgcagggacc gccgtcaccg 720 tctcctcact cgagcaccac caccaccacc actgagatcc ggctgctaac aaagcccgaa 780 aggaagctga gttggctgct gccaccgctg agcaataact agcataaccc cttggggcct 840 ctaaacgggt cttgaggggt tttttgctga aaggaggaac tatatccgga ttggcgaatg 900 ggacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 960 cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct ttcttccctt cctttctcgc 1020 cacgttcgcc ggctttcccc gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt 1080 tagtgcttta cggcacctcg accccaaaaa acttgattag ggtgatggtt cacgtagtgg 1140 gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg gagtccacgt tctttaatag 1200 tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 1260 ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat gagctgattt aacaaaaatt 1320 taacgcgaat tttaacaaaa tattaacgtt tacaatttca ggtggcactt ttcggggaaa 1380 tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 1440 gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 1500 acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 1560 cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 1620 catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 1680 tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 1740 cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 1800 accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 1860 cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 1920 ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 1980 accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgcagcaat 2040 ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 2100 attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 2160 ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 2220 tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 2280 tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 2340 gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 2400 tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 2460 ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 2520 ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 2580 agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 2640 cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 2700 caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 2760 tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 2820 ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 2880 ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 2940 gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 3000 gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 3060 tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 3120 cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 3180 gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 3240 ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcctgat 3300 gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac cgcatatatg gtgcactctc 3360 agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg 3420 actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt 3480 gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc 3540 agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt 3600 ggtcgtgaag cgattcacag atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct 3660 ccagaagcgt taatgtctgg cttctgataa agcgggccat gttaagggcg gttttttcct 3720 gtttggtcac tgatgcctcc gtgtaagggg gatttctgtt catgggggta atgataccga 3780 tgaaacgaga gaggatgctc acgatacggg ttactgatga tgaacatgcc cggttactgg 3840 aacgttgtga gggtaaacaa ctggcggtat ggatgcggcg ggaccagaga aaaatcactc 3900 agggtcaatg ccagcgcttc gttaatacag atgtaggtgt tccacagggt agccagcagc 3960 atcctgcgat gcagatccgg aacataatgg tgcagggcgc tgacttccgc gtttccagac 4020 tttacgaaac acggaaaccg aagaccattc atgttgttgc tcaggtcgca gacgttttgc 4080 agcagcagtc gcttcacgtt cgctcgcgta tcggtgattc attctgctaa ccagtaaggc 4140 aaccccgcca gcctagccgg gtcctcaacg acaggagcac gatcatgcgc acccgtgggg 4200 ccgccatgcc ggcgataatg gcctgcttct cgccgaaacg tttggtggcg ggaccagtga 4260 cgaaggcttg agcgagggcg tgcaagattc cgaataccgc aagcgacagg ccgatcatcg 4320 tcgcgctcca gcgaaagcgg tcctcgccga aaatgaccca gagcgctgcc ggcacctgtc 4380 ctacgagttg catgataaag aagacagtca taagtgcggc gacgatagtc atgccccgcg 4440 cccaccggaa ggagctgact gggttgaagg ctctcaaggg catcggtcga gatcccggtg 4500 cctaatgagt gagctaactt acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 4560 gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 4620 gtattgggcg ccagggtggt ttttcttttc accagtgaga cgggcaacag ctgattgccc 4680 ttcaccgcct ggccctgaga gagttgcagc aagcggtcca cgctggtttg ccccagcagg 4740 cgaaaatcct gtttgatggt ggttaacggc gggatataac atgagctgtc ttcggtatcg 4800 tcgtatccca ctaccgagat atccgcacca acgcgcagcc cggactcggt aatggcgcgc 4860 attgcgccca gcgccatctg atcgttggca accagcatcg cagtgggaac gatgccctca 4920 ttcagcattt gcatggtttg ttgaaaaccg gacatggcac tccagtcgcc ttcccgttcc 4980 gctatcggct gaatttgatt gcgagtgaga tatttatgcc agccagccag acgcagacgc 5040 gccgagacag aacttaatgg gcccgctaac agcgcgattt gctggtgacc caatgcgacc 5100 agatgctcca cgcccagtcg cgtaccgtct tcatgggaga aaataatact gttgatgggt 5160 gtctggtcag agacatcaag aaataacgcc ggaacattag tgcaggcagc ttccacagca 5220 atggcatcct ggtcatccag cggatagtta atgatcagcc cactgacgcg ttgcgcgaga 5280 agattgtgca ccgccgcttt acaggcttcg acgccgcttc gttctaccat cgacaccacc 5340 acgctggcac ccagttgatc ggcgcgagat ttaatcgccg cgacaatttg cgacggcgcg 5400 tgcagggcca gactggaggt ggcaacgcca atcagcaacg actgtttgcc cgccagttgt 5460 tgtgccacgc ggttgggaat gtaattcagc tccgccatcg ccgcttccac tttttcccgc 5520 gttttcgcag aaacgtggct ggcctggttc accacgcggg aaacggtctg ataagagaca 5580 ccggcatact ctgcgacatc gtataacgtt actggtttca cattcaccac cctgaattga 5640 ctctcttccg ggcgctatca tgccataccg cgaaaggttt tgcgccattc gatggtgtcc 5700 gggatctcga cgctctccct tatgcgactc ctgcattagg aagcagccca gtagtaggtt 5760 gaggccgttg agcaccgccg ccgcaaggaa tggtgcatgc aaggagatgg cgcccaacag 5820 tcccccggcc acggggcctg ccaccatacc cacgccgaaa caagcgctca tgagcccgaa 5880 gtggcgagcc cgatcttccc catcggtgat gtcggcgata taggcgccag caaccgcacc 5940 tgtggcgccg gtgatgccgg ccacgatgcg tccggcgtag aggatcgaga tctcgatccc 6000 gcgaaattaa tacgactcac tataggggaa ttgtgagcgg ataacaattc ccctctagaa 6060 ataattttgt ttaactttaa gaaggagata tacatatgaa atacctgctg ccgaccgctg 6120 ctgctggtct gctgctcctc gctgcccagc cggcgatgg 6159 <210> 19 <211> 6330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence :Expression plasmid under the T7 promoter corresponding to a protein displaying variables regions of mAb 4G2 and a trimeric domain of matrilin <220> <223> Plasmid. <400> 19 ccatggcaaa cattgtgatg acccaatctc ccaaatccat gtccatgtca gtaggagaga 60 gggtcacctt gacctgcaag gccagtgaga atgtggttac ttatgtttcc tggtatcaac 120 agaaaccaga gcagtctcct aaactgctga tatacggggc atccaaccgg tacactgggg 180 tccccgatcg cttcacaggc agtggatctg caacagattt cactctgacc atcagcagtg 240 tgcaggctga agaccttgca gattatcact gtggacaggg ttacagctat ccgtacacgt 300 tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaag agggtaaatc ctcaggatca ggctccgaat 360 ccaaagtcga cgaggtccag ctgcaacaat ctggacctga gctggtgaag cctgggactt 420 cagtgaagat atcctgcaag acttctggat acacattcac tgaatatacc atacactggg 480 tgaagcagag ccacggaaag agccttgcgt ggattggagg tattgatcct aacagtggtg 540 gtactaacta cagcccgaac ttcaagggca aggccacatt gactgttgac aagtcctcca 600 gcacagccta catggacctc cgcagcctgt catctgagga ttctgcagtc tacttctgtg 660 caaggatcta tcattacgac ggatacttcg atgtctgggg cgcagggacc gccgtcaccg 720 tctcctcagg tggtggttcc ggtggtggtt ccggtggtgg ttccggtggt ggtgaagacc 780 cgtgcgcttg cgaatccctg gttaaattcc aggctaaagt tgaaggtctg ctgcaggctc 840 tgacccgtaa actggaagct gtttccaaac gtctggctat cctggaaaac accgttgttc 900 tcgagcacca ccaccaccac cactgagatc cggctgctaa caaagcccga aaggaagctg 960 agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc ccttggggcc tctaaacggg 1020 tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg attggcgaat gggacgcgcc 1080 ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact 1140 tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc 1200 cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt 1260 acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc 1320 ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt 1380 gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat 1440 tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa 1500 ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg 1560 aacccctatt tgtttatttt tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 1620 accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 1680 tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 1740 gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 1800 ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 1860 gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 1920 gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 1980 agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 2040 gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 2100 cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 2160 gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgcagcaa tggcaacaac 2220 gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 2280 ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 2340 gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 2400 ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 2460 tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 2520 actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 2580 taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 2640 gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 2700 tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 2760 ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 2820 gcagatacca aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 2880 tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 2940 cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 3000 gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 3060 actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 3120 ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 3180 gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 3240 atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 3300 tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 3360 tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg 3420 aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcctga tgcggtattt 3480 tctccttacg catctgtgcg gtatttcaca ccgcatatat ggtgcactct cagtacaatc 3540 tgctctgatg ccgcatagtt aagccagtat acactccgct atcgctacgt gactgggtca 3600 tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc 3660 cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt 3720 caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc tgcggtaaag ctcatcagcg tggtcgtgaa 3780 gcgattcaca gatgtctgcc tgttcatccg cgtccagctc gttgagtttc tccagaagcg 3840 ttaatgtctg gcttctgata aagcgggcca tgttaagggc ggttttttcc tgtttggtca 3900 ctgatgcctc cgtgtaaggg ggatttctgt tcatgggggt aatgataccg atgaaacgag 3960 agaggatgct cacgatacgg gttactgatg atgaacatgc ccggttactg gaacgttgtg 4020 agggtaaaca actggcggta tggatgcggc gggaccagag aaaaatcact cagggtcaat 4080 gccagcgctt cgttaataca gatgtaggtg ttccacaggg tagccagcag catcctgcga 4140 tgcagatccg gaacataatg gtgcagggcg ctgacttccg cgtttccaga ctttacgaaa 4200 cacggaaacc gaagaccatt catgttgttg ctcaggtcgc agacgttttg cagcagcagt 4260 cgcttcacgt tcgctcgcgt atcggtgatt cattctgcta accagtaagg caaccccgcc 4320 agcctagccg ggtcctcaac gacaggagca cgatcatgcg cacccgtggg gccgccatgc 4380 cggcgataat ggcctgcttc tcgccgaaac gtttggtggc gggaccagtg acgaaggctt 4440 gagcgagggc gtgcaagatt ccgaataccg caagcgacag gccgatcatc gtcgcgctcc 4500 agcgaaagcg gtcctcgccg aaaatgaccc agagcgctgc cggcacctgt cctacgagtt 4560 gcatgataaa gaagacagtc ataagtgcgg cgacgatagt catgccccgc gcccaccgga 4620 aggagctgac tgggttgaag gctctcaagg gcatcggtcg agatcccggt gcctaatgag 4680 tgagctaact tacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt 4740 cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc 4800 gccagggtgg tttttctttt caccagtgag acgggcaaca gctgattgcc cttcaccgcc 4860 tggccctgag agagttgcag caagcggtcc acgctggttt gccccagcag gcgaaaatcc 4920 tgtttgatgg tggttaacgg cgggatataa catgagctgt cttcggtatc gtcgtatccc 4980 actaccgaga tatccgcacc aacgcgcagc ccggactcgg taatggcgcg cattgcgccc 5040 agcgccatct gatcgttggc aaccagcatc gcagtgggaa cgatgccctc attcagcatt 5100 tgcatggttt gttgaaaacc ggacatggca ctccagtcgc cttcccgttc cgctatcggc 5160 tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc cagccagcca gacgcagacg cgccgagaca 5220 gaacttaatg ggcccgctaa cagcgcgatt tgctggtgac ccaatgcgac cagatgctcc 5280 acgcccagtc gcgtaccgtc ttcatgggag aaaataatac tgttgatggg tgtctggtca 5340 gagacatcaa gaaataacgc cggaacatta gtgcaggcag cttccacagc aatggcatcc 5400 tggtcatcca gcggatagtt aatgatcagc ccactgacgc gttgcgcgag aagattgtgc 5460 accgccgctt tacaggcttc gacgccgctt cgttctacca tcgacaccac cacgctggca 5520 cccagttgat cggcgcgaga tttaatcgcc gcgacaattt gcgacggcgc gtgcagggcc 5580 agactggagg tggcaacgcc aatcagcaac gactgtttgc ccgccagttg ttgtgccacg 5640 cggttgggaa tgtaattcag ctccgccatc gccgcttcca ctttttcccg cgttttcgca 5700 gaaacgtggc tggcctggtt caccacgcgg gaaacggtct gataagagac accggcatac 5760 tctgcgacat cgtataacgt tactggtttc acattcacca ccctgaattg actctcttcc 5820 gggcgctatc atgccatacc gcgaaaggtt ttgcgccatt cgatggtgtc cgggatctcg 5880 acgctctccc ttatgcgact cctgcattag gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt 5940 gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcatg caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc 6000 cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc 6060 ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc 6120 ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta gaggatcgag atctcgatcc cgcgaaatta 6180 atacgactca ctatagggga attgtgagcg gataacaatt cccctctaga aataattttg 6240 tttaacttta agaaggagat atacatatga aatacctgct gccgaccgct gctgctggtc 6300 tgctgctcct cgctgcccag ccggcgatgg 6330 <210> 20 <211> 6864 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : Expression plasmid under the T7 promoter corresponding to a single chain antibody fragment displaying the variables regions of mAb 4G2 <220> <223> Plasmid. <400> 20 catggcaaac attgtgatga cccaatctcc caaatccatg tccatgtcag taggagagag 60 ggtcaccttg acctgcaagg ccagtgagaa tgtggttact tatgtttcct ggtatcaaca 120 gaaaccagag cagtctccta aactgctgat atacggggca tccaaccggt acactggggt 180 ccccgatcgc ttcacaggca gtggatctgc aacagatttc actctgacca tcagcagtgt 240 gcaggctgaa gaccttgcag attatcactg tggacagggt tacagctatc cgtacacgtt 300 cggagggggg accaagctgg aaataaaaga gggtaaatcc tcaggatcag gctccgaatc 360 caaagtcgac gaggtccagc tgcaacaatc tggacctgag ctggtgaagc ctgggacttc 420 agtgaagata tcctgcaaga cttctggata cacattcact gaatatacca tacactgggt 480 gaagcagagc cacggaaaga gccttgcgtg gattggaggt attgatccta acagtggtgg 540 tactaactac agcccgaact tcaagggcaa ggccacattg actgttgaca agtcctccag 600 cacagcctac atggacctcc gcagcctgtc atctgaggat tctgcagtct acttctgtgc 660 aaggatctat cattacgacg gatacttcga tgtctggggc gcagggaccg ccgtcaccgt 720 ctcctcaggc ggtggcgagc ccaaatcttc tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc 780 agcacctgaa ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac 840 cctcatgatc tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga 900 ccctgaggtc aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa 960 gccgcgggag gagcagtacc agagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca 1020 ccaggactgg ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc 1080 ccccatcgag aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac 1140 cctgccccca tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa 1200 aggcttctat cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa 1260 ctacaagacc acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct 1320 caccgtggac aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga 1380 ggctctgcac aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggta aactcgagca 1440 ccaccaccac caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc 1500 tgctgccacc gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag 1560 gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc cggattggcg aatgggacgc gccctgtagc 1620 ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc 1680 gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt 1740 ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac 1800 ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag 1860 acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa 1920 actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg 1980 atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac 2040 aaaatattaa cgtttacaat ttcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 2100 atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 2160 taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 2220 cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 2280 aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 2340 aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 2400 tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 2460 ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 2520 catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 2580 aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 2640 ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 2700 gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgcag caatggcaac aacgttgcgc 2760 aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 2820 gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 2880 gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 2940 gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 3000 gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 3060 gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 3120 atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 3180 ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 3240 ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 3300 ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 3360 ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 3420 ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 3480 tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 3540 tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 3600 tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 3660 tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 3720 gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 3780 tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 3840 ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 3900 gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 3960 gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc tgatgcggta ttttctcctt 4020 acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 4080 atgccgcata gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc 4140 gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc 4200 cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc 4260 atcaccgaaa cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc 4320 acagatgtct gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt 4380 ctggcttctg ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcactgatgc 4440 ctccgtgtaa gggggatttc tgttcatggg ggtaatgata ccgatgaaac gagagaggat 4500 gctcacgata cgggttactg atgatgaaca tgcccggtta ctggaacgtt gtgagggtaa 4560 acaactggcg gtatggatgc ggcgggacca gagaaaaatc actcagggtc aatgccagcg 4620 cttcgttaat acagatgtag gtgttccaca gggtagccag cagcatcctg cgatgcagat 4680 ccggaacata atggtgcagg gcgctgactt ccgcgtttcc agactttacg aaacacggaa 4740 accgaagacc attcatgttg ttgctcaggt cgcagacgtt ttgcagcagc agtcgcttca 4800 cgttcgctcg cgtatcggtg attcattctg ctaaccagta aggcaacccc gccagcctag 4860 ccgggtcctc aacgacagga gcacgatcat gcgcacccgt ggggccgcca tgccggcgat 4920 aatggcctgc ttctcgccga aacgtttggt ggcgggacca gtgacgaagg cttgagcgag 4980 ggcgtgcaag attccgaata ccgcaagcga caggccgatc atcgtcgcgc tccagcgaaa 5040 gcggtcctcg ccgaaaatga cccagagcgc tgccggcacc tgtcctacga gttgcatgat 5100 aaagaagaca gtcataagtg cggcgacgat agtcatgccc cgcgcccacc ggaaggagct 5160 gactgggttg aaggctctca agggcatcgg tcgagatccc ggtgcctaat gagtgagcta 5220 acttacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 5280 gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgccaggg 5340 tggtttttct tttcaccagt gagacgggca acagctgatt gcccttcacc gcctggccct 5400 gagagagttg cagcaagcgg tccacgctgg tttgccccag caggcgaaaa tcctgtttga 5460 tggtggttaa cggcgggata taacatgagc tgtcttcggt atcgtcgtat cccactaccg 5520 agatatccgc accaacgcgc agcccggact cggtaatggc gcgcattgcg cccagcgcca 5580 tctgatcgtt ggcaaccagc atcgcagtgg gaacgatgcc ctcattcagc atttgcatgg 5640 tttgttgaaa accggacatg gcactccagt cgccttcccg ttccgctatc ggctgaattt 5700 gattgcgagt gagatattta tgccagccag ccagacgcag acgcgccgag acagaactta 5760 atgggcccgc taacagcgcg atttgctggt gacccaatgc gaccagatgc tccacgccca 5820 gtcgcgtacc gtcttcatgg gagaaaataa tactgttgat gggtgtctgg tcagagacat 5880 caagaaataa cgccggaaca ttagtgcagg cagcttccac agcaatggca tcctggtcat 5940 ccagcggata gttaatgatc agcccactga cgcgttgcgc gagaagattg tgcaccgccg 6000 ctttacaggc ttcgacgccg cttcgttcta ccatcgacac caccacgctg gcacccagtt 6060 gatcggcgcg agatttaatc gccgcgacaa tttgcgacgg cgcgtgcagg gccagactgg 6120 aggtggcaac gccaatcagc aacgactgtt tgcccgccag ttgttgtgcc acgcggttgg 6180 gaatgtaatt cagctccgcc atcgccgctt ccactttttc ccgcgttttc gcagaaacgt 6240 ggctggcctg gttcaccacg cgggaaacgg tctgataaga gacaccggca tactctgcga 6300 catcgtataa cgttactggt ttcacattca ccaccctgaa ttgactctct tccgggcgct 6360 atcatgccat accgcgaaag gttttgcgcc attcgatggt gtccgggatc tcgacgctct 6420 cccttatgcg actcctgcat taggaagcag cccagtagta ggttgaggcc gttgagcacc 6480 gccgccgcaa ggaatggtgc atgcaaggag atggcgccca acagtccccc ggccacgggg 6540 cctgccacca tacccacgcc gaaacaagcg ctcatgagcc cgaagtggcg agcccgatct 6600 tccccatcgg tgatgtcggc gatataggcg ccagcaaccg cacctgtggc gccggtgatg 6660 ccggccacga tgcgtccggc gtagaggatc gagatctcga tcccgcgaaa ttaatacgac 6720 tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct agaaataatt ttgtttaact 6780 ttaagaagga gatatacata tgaaatacct gctgccgacc gctgctgctg gtctgctgct 6840 cctcgctgcc cagccggcga tggc 6864 <210> 21 <211> 272 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Single chain antibody fragment displaying the variable regions of the mAb 4G2 <220> <223> Protein. <400> 21 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 20 25 30 Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys 100 105 110 Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val 130 135 140 Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 145 150 155 160 Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu 165 170 175 Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp 180 185 190 Ile Gly Gly Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn 195 200 205 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 210 215 220 Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 225 230 235 240 Cys Ala Arg Ile Tyr His Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 245 250 255 Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Leu Glu His His His His His His 260 265 270 <210> 22 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : Protein displaying the variable regions of the mAb 4G2 and a trimeric domain of matrilin <220> <223> Protein. <400> 22 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 20 25 30 Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys 100 105 110 Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val 130 135 140 Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 145 150 155 160 Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu 165 170 175 Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp 180 185 190 Ile Gly Gly Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn 195 200 205 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 210 215 220 Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 225 230 235 240 Cys Ala Arg Ile Tyr His Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 245 250 255 Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 260 265 270 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu 275 280 285 Val Lys Phe Gln Ala Lys Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg 290 295 300 Lys Leu Glu Ala Val Ser Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val 305 310 315 320 Val Leu Glu His His His His His His 325 <210> 23 <211> 507 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: single chain miniantibody displaying the variable regions of mAb 4G2 <220> <223> Protein. <400> 23 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 20 25 30 Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys 35 40 45 Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro 50 55 60 Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 65 70 75 80 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr 85 90 95 Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys 100 105 110 Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu 115 120 125 Glu Ile Lys Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val 130 135 140 Asp Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly 145 150 155 160 Thr Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu 165 170 175 Tyr Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp 180 185 190 Ile Gly Gly Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn 195 200 205 Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 210 215 220 Tyr Met Asp Leu Arg Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe 225 230 235 240 Cys Ala Arg Ile Tyr His Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala 245 250 255 Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Glu Pro Lys Ser Ser 260 265 270 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 275 280 285 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 290 295 300 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 305 310 315 320 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 325 330 335 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr 340 345 350 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 355 360 365 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 370 375 380 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 385 390 395 400 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser 405 410 415 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 420 425 430 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 435 440 445 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 450 455 460 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 465 470 475 480 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 485 490 495 Pro Gly Lys Leu Glu His His His His His His 500 505 <210> 24 <211> 22 <212> PRT <213> Erwinia carotovora <220> <223> Signal peptide. <220> <223> pelB signal peptide <400> 24 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Polypeptide. <220> <223> Sequence of the variable region of the light chain of mAb 4G2. <400> 25 Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val Thr Tyr 20 25 30 Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence :Sequence of the linker connecting the variable regions of the scFv fragment <220> <223> Peptido. <400> 26 Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp 1 5 10 <210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Polypeptide. <220> <223> Sequence of the variable region of the heavy chain of mAb 4G2. <400> 27 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Asp Leu Arg Ser Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ile Tyr His Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110 Thr Ala Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence :Sequence of the linker segment connecting the matrilin domain to the variable domain of heavy of the mAb 4G2 <220> <223> Peptide fragment. <400> 28 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 1 5 10 15 <210> 29 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence :This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from dengue2 virus <220> <223> Protein. <400> 29 Leu Val Thr Phe Lys Asn Pro His Ala Lys Lys Gln Asp Val Val Val 1 5 10 15 Gly Gly Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Thr Gln 20 25 30 Gly Glu Pro Ser Leu Asn Glu Glu Gln Asp Lys Arg Phe Leu Cys Lys 35 40 45 His Ser Met Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Gly Ile Val Thr Cys Ala Met Phe Thr 65 70 75 <210> 30 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from dengue1 virus <220> <223> Protein. <400> 30 Leu Val Thr Phe Lys Thr Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val 1 5 10 15 Gly Gly Lys Ile Ser Asn Thr Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln 20 25 30 Gly Glu Ala Thr Leu Val Glu Glu Gln Asp Thr Asn Phe Val Cys Arg 35 40 45 Arg Thr Phe Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Leu Ile Thr Cys Ala Lys Phe Lys 65 70 75 <210> 31 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from dengue3 virus <220> <223> Protein. <400> 31 Leu Val Thr Phe Lys Asn Ala His Ala Lys Lys Gln Glu Val Val Val 1 5 10 15 Gly Gly Lys Ile Thr Asn Ile Thr Thr Asp Ser Arg Cys Pro Thr Gln 20 25 30 Gly Glu Ala Ile Leu Pro Glu Glu Gln Asp Gln Asn Tyr Val Cys Lys 35 40 45 His Thr Tyr Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Leu Val Thr Cys Ala Lys Phe Gln 65 70 75 <210> 32 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from dengue4 virus <220> <223> Protein. <400> 32 Met Val Thr Phe Lys Val Pro His Ala Lys Arg Gln Asp Val Thr Val 1 5 10 15 Gly Gly Ser Ile Ser Asn Ile Thr Thr Ala Thr Arg Cys Pro Thr Gln 20 25 30 Gly Glu Pro Tyr Leu Lys Glu Glu Gln Asp Gln Gln Tyr Ile Cys Arg 35 40 45 Arg Asp Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Gly Val Val Thr Cys Ala Lys Phe Ser 65 70 75 <210> 33 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from West Nile virus <220> <223> Protein. <400> 33 Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Val Ser Asp Leu Ser Thr Arg Ala Ala Cys Pro Thr Met 20 25 30 Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Pro Ala Phe Val Cys Lys 35 40 45 Gln Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala 65 70 75 <210> 34 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from Japanese Encephalitis virus <220> <223> Protein. <400> 34 Leu Met Glu Phe Glu Gly Ala His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala 1 5 10 15 Gly Gly Ser Val Thr Asp Ile Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr 20 25 30 Gly Glu Ala His Asn Glu Lys Arg Ala Asp Ser Ser Tyr Val Cys Lys 35 40 45 Gln Gly Phe Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ser 65 70 75 <210> 35 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from Murray Valley Encephalitis virus <220> <223> Protein. <400> 35 Leu Val Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Ser Asp Val Ser Thr Val Ser Asn Cys Pro Thr Thr 20 25 30 Gly Glu Ser His Asn Thr Lys Arg Ala Asp His Asn Tyr Leu Cys Lys 35 40 45 Arg Gly Val Thr Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Thr 65 70 75 <210> 36 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from kunjin virus <220> <223> Protein. <400> 36 Leu Met Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Ser Val Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gly Thr Val Ser Glu Leu Ser Thr Lys Ala Ala Cys Pro Thr Met 20 25 30 Gly Glu Ala His Asn Asp Lys Arg Ala Asp Pro Ser Phe Val Cys Lys 35 40 45 Gln Gly Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Ala 65 70 75 <210> 37 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from St Louis Encephalitis virus <220> <223> Protein. <400> 37 Leu Val Glu Phe Glu Glu Pro His Ala Thr Lys Gln Thr Val Val Ala 1 5 10 15 Gly Gly Thr Leu Asp Thr Leu Ser Thr Val Ala Arg Cys Pro Thr Thr 20 25 30 Gly Glu Ala His Asn Thr Lys Arg Ser Asp Pro Thr Phe Val Cys Lys 35 40 45 Arg Asp Val Val Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Asp Thr Cys Ala Lys Phe Thr 65 70 75 <210> 38 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from Yellow Fever virus <220> <223> Protein. <400> 38 Leu Val Glu Phe Glu Pro Pro His Ala Ala Thr Ile Arg Val Leu Ala 1 5 10 15 Gly Gly Val Leu Thr His Val Lys Ile Asn Asp Lys Cys Pro Ser Thr 20 25 30 Gly Glu Ala His Leu Ala Glu Glu Asn Glu Gly Asp Asn Ala Cys Lys 35 40 45 Arg Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Val Ala Cys Ala Lys Phe Thr 65 70 75 <210> 39 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from Tick-born Encephalitis virus <220> <223> Protein. <400> 39 Leu Val Glu Phe Gly Ala Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Tyr Asn 1 5 10 15 Gly Gly Lys Leu Ser Asp Thr Lys Val Ala Ala Arg Cys Pro Thr Met 20 25 30 Gly Pro Ala Thr Leu Ala Glu Glu His Gln Ser Gly Thr Val Cys Lys 35 40 45 Arg Asp Gln Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn His Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Val Thr Cys Val Lys Ala Ser 65 70 75 <210> 40 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from LANGAT virus <220> <223> Protein. <400> 40 Leu Val Glu Phe Gly Thr Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Phe Asn 1 5 10 15 Gly Gly Lys Leu Thr Gly Thr Lys Val Ala Ala Arg Cys Pro Thr Met 20 25 30 Gly Pro Ala Thr Leu Pro Glu Glu His Gln Ser Gly Thr Val Cys Lys 35 40 45 Arg Asp Gln Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn His Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Val Thr Cys Val Lys Phe Thr 65 70 75 <210> 41 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from Looping ill virus <220> <223> Protein. <400> 41 Leu Val Glu Phe Gly Ala Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Tyr Asn 1 5 10 15 Gly Gly Lys Leu Ser Glu Thr Lys Val Ala Ala Arg Cys Pro Thr Met 20 25 30 Gly Pro Ala Ala Leu Ala Glu Glu Arg Gln Ile Gly Thr Val Cys Lys 35 40 45 Arg Asp Gln Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn His Cys Gly Leu Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Val Ala Cys Val Lys Ala Ala 65 70 75 <210> 42 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is the mature protein PMEC displaying segments B and C from POWASSAN virus <220> <223> Protein. <400> 42 Leu Val Glu Phe Gly Pro Pro His Ala Val Lys Met Asp Val Phe Asn 1 5 10 15 Gly Gly Lys Leu Thr Asn Thr Lys Val Glu Ala Arg Cys Pro Thr Thr 20 25 30 Gly Pro Ala Thr Leu Pro Glu Glu His Gln Ala Asn Met Val Cys Lys 35 40 45 Arg Asp Gln Ser Asp Arg Gly Trp Gly Asn His Cys Gly Phe Phe Gly 50 55 60 Lys Gly Ser Ile Val Ala Cys Ala Lys Phe Glu 65 70 75 <210> 43 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is a sequence corresponding to the mature PMEC protein mutated at amino acid positions inaccessible to interaction with antibodies <220> <223> Protein. <400> 43 Asp Thr Val Tyr Arg Asn Glu His Asn Lys Lys His Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Ala Ser Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Thr Gly Gln 20 25 30 Gly Val Ala Thr Leu Asn Glu Asp Glu Asp Lys Arg Phe Asn Cys Tyr 35 40 45 Leu Asp Leu Val Tyr Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Asp Arg Gly 50 55 60 Leu Gly Phe Ile Lys Gln Cys Ser Met Lys Val 65 70 75 <210> 44 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : This is a sequence corresponding to the mature PMEC protein mutated at amino acid positions inaccessible to interaction with antibodies <220> <223> Protein. <400> 44 Asp Thr Glu Ile Tyr Asn Glu His Gly Lys Lys Thr Asp Val Val Thr 1 5 10 15 Thr Ala Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Gly Gln 20 25 30 Gly Glu Gln Thr Leu Asn Glu Asp Ala Asp Gln Arg Phe Phe Cys Val 35 40 45 Lys Asp Leu Val Tyr Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Val Arg Gly 50 55 60 Trp Gly Thr Ile Gln Gln Cys Val Met Lys Val 65 70 75 <210> 45 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : This is a sequence corresponding to the mature PMEC protein mutated at amino acid positions inaccessible to interaction with antibodies <220> <223> Protein. <400> 45 Asp Thr Val Val Arg Thr Glu His Lys Lys Lys Ile Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Ser Thr Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Gly Gln 20 25 30 Gly Glu Ser Thr Leu Asn Glu Glu Glu Asp Glu Arg Phe Asp Cys Gln 35 40 45 Gln Asp Gln Val Leu Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Val Pro Gly 50 55 60 Trp Gly Asn Ile Lys Lys Cys Ala Met Lys Glu 65 70 75 <210> 46 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence : This is a sequence corresponding to the mature PMEC protein mutated at amino acid positions inaccessible to interaction with antibodies <220> <223> Protein. <400> 46 Glu Ser Val Ser Val Asn Glu His Lys Lys Lys Asn Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Asp Thr Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Gly Gln 20 25 30 Gly Glu Pro Thr Leu Asn Glu Glu Glu Asp Glu Arg Phe Asp Cys Gln 35 40 45 Lys Asp Leu Val Tyr Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Val Arg Gly 50 55 60 Trp Gly Trp Ile Lys Lys Cys Ala Met Lys Val 65 70 75 <210> 47 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is a sequence corresponding to the mature PMEC protein mutated at amino acid positions inaccessible to interaction with antibodies <220> <223> Protein. <400> 47 Lys Val Val Ser Arg Asn Glu His Arg Lys Lys Asn Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Glu Thr Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Asn Gln 20 25 30 Gly Glu Ala Thr Leu Asn Glu Asp Glu Asp Glu Arg Phe Glu Cys Val 35 40 45 Lys Asp Val Val Tyr Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Glu Arg Gly 50 55 60 Leu Gly Thr Ile Gln Gln Cys Trp Met Asn Glu 65 70 75 <210> 48 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is a sequence corresponding to the mature PMEC protein mutated at amino acid positions inaccessible to interaction with antibodies <220> <223> Protein. <400> 48 Asp Asp Glu Tyr Tyr Leu Glu His Tyr Lys Lys Leu Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Arg Thr Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Gly Gln 20 25 30 Gly Gln Ala Thr Leu Asn Glu Glu Glu Asp Glu Arg Phe Gln Cys Phe 35 40 45 Val Ala Leu Val Ile Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Val Val Gly 50 55 60 Trp Gly Ser Ile Val Val Cys Lys Met Lys Ile 65 70 75 <210> 49 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is a sequence corresponding to the mature PMEC protein mutated at amino acid positions inaccessible to interaction with antibodies <220> <223> Protein. <400> 49 Asp Thr Val Val Val Asn Glu His Asn Lys Lys Ile Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Thr Ser Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Gly Gln 20 25 30 Gly Pro Ala Thr Leu Asn Glu Ala Glu Asp Glu Arg Phe Asp Cys Gln 35 40 45 Phe Ser Tyr Val Tyr Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Lys Arg Gly 50 55 60 Leu Gly Pro Ile Leu Val Cys Ala Met Lys Val 65 70 75 <210> 50 <211> 75 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: This is a sequence corresponding to the mature PMEC protein mutated at amino acid positions inaccessible to interaction with antibodies <220> <223> Protein. <400> 50 Asp Asn Val Val Val Asn Glu His Tyr Lys Lys Thr Asp Val Val Ser 1 5 10 15 Ser Thr Lys Leu Thr Asn Thr Thr Thr Glu Ser Arg Cys Pro Gly Gln 20 25 30 Gly Tyr Pro Thr Leu Asn Glu Gln Ser Asp Glu Arg Phe Val Cys Phe 35 40 45 Val Asp Tyr Val Ile Arg Gly Trp Gly Asn Gly Cys Gly Val Asp Gly 50 55 60 Trp Gly Pro Ile Val Val Cys Lys Met Lys Ile 65 70 75 <210> 51 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Peptide fragment. <220> <223> Sequence of the trimerization domain of matrilin. <400> 51 Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu Val Lys Phe Gln Ala Lys Val 1 5 10 15 Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser Lys 20 25 30 Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val Val 35 40 <210> 52 <211> 232 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Polypeptide. <220> <223> Sequence of the FC fragment of human IgG1 molecule hinge domain, CH2 y CH3. <400> 52 Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 85 90 95 Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala 100 105 110 Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro 115 120 125 Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr 130 135 140 Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 145 150 155 160 Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 165 170 175 Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 180 185 190 Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe 195 200 205 Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 210 215 220 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 53 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Single chain antibody fragment displaying the variable regions of the mAb 4G2, after secreted to the periplasm <220> <223> Protein. <400> 53 Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser 1 5 10 15 Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val 20 25 30 Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr 85 90 95 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gly Lys 100 105 110 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp Glu Val Gln Leu Gln 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser 130 135 140 Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val 145 150 155 160 Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro 165 170 175 Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Tyr His 210 215 220 Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Leu Glu His His His His His His 245 250 <210> 54 <211> 307 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Sequence of the multivalent protein displaying the variable regions of mAb 4G2 and the trimeric matrilin domain after secreted to the periplasm <220> <223> Protein. <400> 54 Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser 1 5 10 15 Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val 20 25 30 Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr 85 90 95 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gly Lys 100 105 110 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp Glu Val Gln Leu Gln 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser 130 135 140 Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val 145 150 155 160 Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro 165 170 175 Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Tyr His 210 215 220 Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Glu Asp Pro Cys Ala Cys Glu Ser Leu Val Lys Phe Gln Ala Lys 260 265 270 Val Glu Gly Leu Leu Gln Ala Leu Thr Arg Lys Leu Glu Ala Val Ser 275 280 285 Lys Arg Leu Ala Ile Leu Glu Asn Thr Val Val Leu Glu His His His 290 295 300 His His His 305 <210> 55 <211> 485 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Sequence of the single chain miniantibody displaying the variable regions of mAb 4G2 <220> <223> Protein. <400> 55 Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser 1 5 10 15 Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val 20 25 30 Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr 85 90 95 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gly Lys 100 105 110 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp Glu Val Gln Leu Gln 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser 130 135 140 Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val 145 150 155 160 Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro 165 170 175 Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Tyr His 210 215 220 Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Gly Gly Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Glu His 465 470 475 480 His His His His His 485 <210> 56 <211> 479 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of the Artificial Sequence: Sequence the single chain miniantibody MA4G2 displaying the variable regions of mAb 4G2 <220> <223> Protein. <400> 56 Met Ala Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Lys Ser Met Ser Met Ser 1 5 10 15 Val Gly Glu Arg Val Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Val 20 25 30 Thr Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Glu Gln Ser Pro Lys Leu 35 40 45 Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Thr Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Leu Ala Asp Tyr His Cys Gly Gln Gly Tyr Ser Tyr 85 90 95 Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Gly Lys 100 105 110 Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp Glu Val Gln Leu Gln 115 120 125 Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Ile Ser 130 135 140 Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Ile His Trp Val 145 150 155 160 Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Ala Trp Ile Gly Gly Ile Asp Pro 165 170 175 Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ser Pro Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Asp Leu Arg Ser 195 200 205 Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Ile Tyr His 210 215 220 Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val 225 230 235 240 Ser Ser Gly Gly Gly Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 245 250 255 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 260 265 270 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 275 280 285 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 290 295 300 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 305 310 315 320 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 325 330 335 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 340 345 350 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 355 360 365 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 370 375 380 Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 385 390 395 400 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 405 410 415 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 420 425 430 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 435 440 445 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 450 455 460 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Leu Glu 465 470 475

Claims (40)

  1. 댕기 바이러스 1-4 및 다른 플라비바이러스에 의한 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 광범위 분자의 개발에 사용될 수 있는, 성숙한 비리온에서 나타나며 플라비바이러스 중에서 공유되는 에피토프를 나타냄을 특징으로 하는 위상학적이고 고도로 보존된 영역.
  2. 제1항에 있어서, 이 영역은 댕기 바이러스 2로부터의 E 단백질의 다음의 잔기들에 의해 규정되는 플라비바이러스의 외피로부터의 E 단백질의 에피토프이거나 다른 플라비바이러스로부터의 상응하는 에피토프인 위상학적이고 고도로 보존된 영역: ASN67, THR69, THR70, SER72, ARG73, CYS74, LEU82, GLU84, GLU85, ASP87, VAL97, ARG99, GLY100, TRP101, GLY102, ASN103, GLY104, CYS105, GLY106, MET118, HIS244, LYS246, LYS247, GLN248, VAL252.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 다음의 플라비바이러스의 E 단백질의 표면 상에 나타남을 특징으로 하는 위상학적이고 고도로 보존된 영역: 웨스트 나일 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 댕기1, 댕기2, 댕기3, 댕기4, 일본 뇌염 바이러스, 쿤진 바이러스, 키아사나 삼림병 바이러스(Kyasanur Forest Disease Virus), 진드기-매개 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 바이러스(Murray Valley Virus), 랑가트 바이러스(LANGAT virus), 루핑 Ill 바이러스 및 포와산 바이러스.
  4. 분자로 면역화된 개체에서 댕기 바이러스의 네 혈청형 및 다른 플라비바이러스와 교차-반응하는 중화 항체의 반응을 유도하는 능력을 특징으로 하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 위상학적 영역을 기초로 하는, 댕기 바이러스 1-4 및 다른 플라비바이러스에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에 유용한 제1항에 따른 분자.
  5. 제4항에 있어서, 상기 분자는 서열 번호 14 및 29 내지 50을 갖는 재조합 단백질 또는 키메릭 펩티드인 분자.
  6. 제4항에 있어서, 일차 구조가 서열 A-B-L-C에 의해 규정되며, A는 0 내지 30개의 아미노산의 펩티드 서열이고 B는 댕기 바이러스 2로부터의 E 단백질의 단편 Leu237-Val252의 서열 또는 댕기 바이러스 1, 3, 4 또는 다른 어떤 플라비바이러스로부터의 동질성 서열이고 L은 안정화 링커로서 작용하는 3 내지 10개의 아미노산의 서열이며 C는 댕기 바이러스 2로부터의 E 단백질의 단편 Lys64-Thr120의 서열 또는 댕기 바이러스 1, 3, 4 또는 다른 어떤 플라비바이러스로부터의 동질성 서열인 단백질 분자.
  7. 제4항에 있어서, 일차 구조가 서열 A-C-L-B에 의해 규정되며, A는 0 내지 30개의 아미노산의 펩티드 서열이고 B는 댕기 바이러스 2로부터의 E 단백질의 단편 Leu237-Val252의 서열 또는 댕기 바이러스 1, 3, 4 또는 다른 어떤 플라비바이러스 로부터의 동질성 서열이고 L은 안정화 링커로서 작용하는 3 내지 10개의 아미노산의 서열이며 C는 댕기 바이러스 2로부터의 E 단백질의 단편 Lys64-Thr120의 서열 또는 댕기 바이러스 1, 3, 4 또는 다른 어떤 플라비바이러스로부터의 동질성 서열인 단백질 분자.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, A가 박테리아 시그널 펩티드인 단백질.
  9. 제6항 또는 제7항에 있어서, A가 효모 또는 포유동물 시그널 펩티드인 단백질.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항의 분자에 의해 형성되며 예방이나 치료 효과를 증가시키거나/증가시키고 이의 정제 및/또는 검출을 촉진하는 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 단백질로 N- 또는 C-말단 융합됨을 특징으로 하는 합성 또는 재조합 융합 단백질.
  11. 제10항에 있어서, N- 또는 C-말단 융합 파트너가 T-세포 에피토프를 포함하는 하나 또는 그 이상의 펩티드 또는 단백질 단편인 합성 또는 재조합 융합 단백질.
  12. 제10항에 있어서, N- 또는 C-말단 융합 파트너가 히스티딘 표지인 합성 또는 재조합 융합 단백질.
  13. 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단백질을 코드하는 핵산.
  14. 제13항의 핵산을 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주.
  15. 댕기 바이러스 1-4와 교차-반응하는 중화 및 보호 항체의 면역 반응을 수용 생물에게 유도할 수 있는, 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 다른 플라비바이러스와 교차-반응하는 중화 및 보호 항체의 면역 반응을 수용 생물에게 유도할 수 있는, 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제4항 내지 제12항 중 어느 한 항의 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 생 벡터 또는 나출 DNA의 사용을 기초로 하는, 댕기 바이러스 1-4 및 다른 플라비바이러스와 교차-반응하는 중화 및 보호 항체의 면역 반응을 수용 생물에게 유도할 수 있음을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 항-플라비바이러스 항체의 검출 을 위한 진단 시약으로서 유용한 합성 또는 재조합 단백질 또는 펩티드 분자.
  19. 제1항에 있어서, 상기 위상학적 영역과의 상호작용에 의해 바이러스 감염을 예방 또는 약화시키는 능력을 특징으로 하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 위상학적 영역을 기초로 하는 댕기 바이러스 1-4 및 그외 플라비바이러스에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에 유용한 분자.
  20. 제19항에 있어서, 상기 분자는 인간 항체 또는 다른 종에서 생성되는 항체인 분자.
  21. 제20항에 있어서, 상기 항체가 다른 플라비바이러스와 교차-반응하고 바이러스 감염을 중화시키는 항체.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분자가 항체의 재조합체 또는 단백질분해 단편인, 댕기 바이러스 1-4 또는 그외 플라비바이러스에 의한 감염의 예방 및/또는 치료에 사용되는 분자.
  23. 제22항에 있어서, 상기 분자가 항체의 재조합체 단일-사슬 Fv 단편(scFv)인 분자.
  24. 제23항에 있어서, 성숙한 비리온으로의 다가 결합을 갖는 분자로서 조립할 수 있는 능력을 상기 분자에게 부여하는 단백질 서열에 스페이서가 있거나 없는 상태로 결합됨을 특징으로 하는 분자.
  25. 제24항에 있어서, 상기 분자에 결합된 단백질 서열은 스페이서 및 힌지(hinge), 서열 번호 55 및 56을 갖는 인간 면역글로불린의 CH2 및 CH3 영역을 포함하는 분자.
  26. 제24항에 있어서, 상기 분자에 결합된 단백질 서열은 스페이서 및 서열 번호 54에서 명기된 서열을 갖는 삼량체화 도메인을 포함하는 분자.
  27. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 단백질을 코드하는 핵산.
  28. 제27항의 핵산을 포함하는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포.
  29. 댕기 바이러스 1-4에 의한 감염을 예방하거나 중화시킬 수 있는, 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  30. 그외 플라비바이러스에 의한 감염을 예방하거나 중화시킬 수 있는, 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항의 하나 또는 그 이상의 단백질을 포함함을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  31. 제18항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 플라비바이러스의 검출을 위한 진단 시약으로서 유용한 합성 또는 재조합체 단백질 또는 펩티드 분자.
  32. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 E 단백질의 영역 또는 보존된 에피토프와 분자가 접촉함을 포함하는 방법으로 확인되는 플라비바이러스에 대한 광범위 치료 후보로서 유용한 분자에 있어서, 이러한 접촉 또는 결합은 상기 분자가 광범위 치료 후보임을 나타내는 분자.
  33. 제32항에 있어서, 상기 분자는 단백질, 펩티드, 펩티드유사체 및 소분자 중에서 선택한 분자.
  34. 분자가 화합물의 라이브러리에 포함되는 제32항에 따른 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 화합물의 라이브러리는 조합 방법에 의해 생성된 방법.
  36. 제34항에 있어서, 상기 접촉은 생체외 검정에 의해 측정되는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 검정이 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 보존된 영역으로 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항의 분자가 결합하는 것을 차단하는 것에 의해 수행되는 방법.
  38. 제36항에 있어서, 상기 방법이 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 단백질 분자에 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항의 분자가 결합하는 것을 차단함에 의해 수행되는 방법.
  39. 상기 유니온이 생체내 검정에 의해 측정되는, 제32항에 따른 방법.
  40. 다음을 포함하는 컴퓨터-원조 방법인 제32항에 따른 방법:
    1) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 E 단백질의 고도로 보존된 영역을 형성하는 잔기에 해당하는 원자 좌표, 상기 원자 좌표는 단백질 구조 상에서 이용가능하거나 컴퓨터 수단에 의해 설계되거나 실험적으로 결정된 것임,
    2) 실험적으로 결정되거나 컴퓨터 수단에 의해 설계된, 분자의 원자 좌표, 및
    3) 분자가 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 고도로 보존된 영역과 접촉하게 할 수 있는지 여부의 결정을 하는 분자 도킹(molecular docking)의 컴퓨터 과정.
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Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007139037A1 (ja) * 2006-05-26 2007-12-06 Kyoto University ケミカルゲノム情報に基づく、タンパク質－化合物相互作用の予測と化合物ライブラリーの合理的設計
CU20080028A6 (es) 2008-02-29 2011-02-24 Ct Ingenieria Genetica Biotech Compuestos químicos obtenidos in silico para la preparación de composiciones farmacéuticas para atenuar o inhibir la infección por virus dengue y otros flavivirus
AU2009305113B2 (en) * 2008-10-13 2015-07-16 Institute For Research In Biomedicine Dengue virus neutralizing antibodies and uses thereof
CN101921310B (zh) * 2009-06-15 2014-03-12 温州医学院 登革病毒特异性hla-a2限制性表位肽及应用
BRPI0904020B8 (pt) * 2009-10-01 2021-05-25 Fundacao Oswaldo Cruz composição vacinal contra o vírus da dengue, e, kit
WO2011100055A2 (en) * 2010-02-12 2011-08-18 Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University Methods for preventing or treating viral infection
EP2571990A4 (en) 2010-05-21 2013-11-20 Univ Pittsburgh UNIVERSAL DENGUE VIRUS SEQUENCES AND METHOD FOR THEIR USE
CN102168058B (zh) * 2010-11-30 2013-01-16 湖南师范大学 一种抗肿瘤靶向工程菌和菌剂及其制备方法
CN102824633A (zh) * 2011-06-16 2012-12-19 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种四价登革病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用
MX357202B (es) 2012-02-16 2018-06-28 Vlp Therapeutics Llc Composicion de particula tipo virus.
WO2013151764A1 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for dengue virus epitopes
SG11201500439RA (en) * 2012-07-24 2015-02-27 Sanofi Pasteur Vaccine compositions for prevention against dengue virus infection
WO2014025546A2 (en) 2012-08-07 2014-02-13 Massachusetts Institute Of Technology Anti-dengue virus antibodies and uses thereof
CU24188B1 (es) * 2012-12-27 2016-07-29 Ct De Ingeniería Genética Y Biotecnología Composición vacunal contra el virus dengue
CN103116022A (zh) * 2013-01-23 2013-05-22 广西壮族自治区兽医研究所 快速检测猪乙型脑炎抗体试纸条及其制备方法
CN105377893A (zh) * 2013-05-07 2016-03-02 豪夫迈·罗氏有限公司 三聚体抗原结合分子
CN105473603B (zh) * 2013-06-26 2019-10-25 北卡罗来纳-查佩尔山大学 用于登革病毒疫苗的方法与组合物
TWI676636B (zh) 2013-07-12 2019-11-11 Ｖｌｐ醫療股份有限公司 包含ｐｄ－１抗原或ｐｄ－１配體抗原的類病毒粒子
EP4047015A1 (en) 2014-02-11 2022-08-24 Visterra, Inc. Antibody molecules to dengue virus and uses thereof
MX2016009991A (es) 2014-02-11 2016-10-07 Massachusetts Inst Technology Nuevo anticuerpo anti-dengue de espectro completo.
CU20140026A7 (es) * 2014-03-03 2015-11-27 Ct De Ingeniería Genética Y Biotecnología Biocubafarma Péptidos horquilla beta con propiedades antivirales contra el virus dengue
US10385101B2 (en) 2014-08-08 2019-08-20 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle comprising modified envelope protein E3
WO2016021209A1 (en) 2014-08-08 2016-02-11 Vlp Therapeutics, Llc Virus like particle comprising modified envelope protein e3
TW201620546A (zh) 2014-09-02 2016-06-16 賽諾菲巴斯德公司 疫苗組合物
CA2960102C (en) 2014-09-11 2023-10-24 Vlp Therapeutics, Llc Flavivirus virus like particle
JP6602875B2 (ja) 2015-01-26 2019-11-06 マクロジェニクス，インコーポレーテッド Ｄｒ５結合ドメインを含む多価分子
SG11201706342PA (en) * 2015-02-09 2017-09-28 Academia Sinica An epitope-substituted vaccine for use in improving safety and immunogenicity against dengue viruses
US10857222B2 (en) 2015-07-03 2020-12-08 Sanofi Pasteur Concomitant dengue and yellow fever vaccination
WO2017165736A1 (en) 2016-03-25 2017-09-28 Visterra, Inc. Formulation of antibody molecules to dengue virus
GB201610162D0 (en) 2016-06-10 2016-07-27 Imp Innovations Ltd And Inst Pasteur Methods
SG10201607778XA (en) * 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
JP7313345B2 (ja) 2017-10-05 2023-07-24 サノフィ・パスツール デング熱に対するブースターワクチン接種のための組成物
CA3091047A1 (en) * 2018-02-14 2019-08-22 Yale University Compositions for modulation of a trem or treml protein and methods of use
KR102301130B1 (ko) * 2018-12-27 2021-09-15 주식회사 이뮨메드 뎅기출혈열 진단 키트
CN110007067A (zh) * 2019-03-11 2019-07-12 江苏理工学院 一种蛋白质分子对接检测装置
CN110568190A (zh) * 2019-08-30 2019-12-13 深圳国际旅行卫生保健中心 登革热病毒抗原、检测试剂、检测试纸、检测试剂盒及其使用方法

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6184024B1 (en) 1988-07-14 2001-02-06 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Chimeric and/or growth-restricted flaviviruses
US6869793B2 (en) 1996-09-24 2005-03-22 Bavarian Nordic Research Institute Recombinant MVA virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
CU22666A1 (es) * 1996-11-25 2001-04-27 Inst De Medicina Tropical Pedro Kouri Procedimiento para la expresión de genes de los virus del dengue en la levadura pichia pastoris, adns recombinantes y microorganismos transformados
CZ300172B6 (cs) 1997-02-28 2009-03-04 Acambis Inc. Chimerický živý, infekcní, oslabený virus, lécivopro prevenci nebo lécbu flavivirových infekcí s jeho obsahem a molekula nukleové kyseliny jej kódující
ATE321567T1 (de) 1997-07-31 2006-04-15 Hawaii Biotech Inc Rekombinante dimerische hüllproteine als impfstoff gegen eine flavivirale infektion
ID24941A (id) 1997-09-23 2000-08-31 Bavarin Nordic Res Inst A S Cs Antigen virus dengue dan pengobatan demam dengue
CA2341354C (en) 1998-09-02 2009-10-20 The Government Of The United States Of America Dengue viruses that are replication defective in mosquitos for use as vaccines
CU23245A1 (es) * 2001-07-16 2007-10-17 Inst De Medicina Tropical Pedr CADENAS QUIMéRICAS CODIFICANTES PARA PROTEINAS INDUCTORAS DE EFECTOS CONTRA VIRUS. PREPARADOS UTILIZANDO PROTEINAS QUIMéRICAS
WO2003101397A2 (en) * 2002-05-31 2003-12-11 Acambis, Inc. Tetravalent dengue vaccines
AU2003300831A1 (en) * 2002-12-11 2004-06-30 Hawaii Biotech, Inc. Recombinant vaccine against flavivirus infection
WO2005002501A2 (en) * 2003-04-22 2005-01-13 Children's Medical Center Corporation Novel druggable regions in the dengue virus envelope glycoprotein and methods of using the same
CN101238209B (zh) * 2005-06-17 2013-02-13 赛诺菲巴斯德有限公司 登革血清型2减毒株

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Publication number Publication date
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