KR20070013269A - 광학활성을 가지는 알콜 또는 카본산의 제조방법 - Google Patents

광학활성을 가지는 알콜 또는 카본산의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20070013269A
KR20070013269A KR1020067018010A KR20067018010A KR20070013269A KR 20070013269 A KR20070013269 A KR 20070013269A KR 1020067018010 A KR1020067018010 A KR 1020067018010A KR 20067018010 A KR20067018010 A KR 20067018010A KR 20070013269 A KR20070013269 A KR 20070013269A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
genus
optically active
general formula
group
pentanol
Prior art date
Application number
KR1020067018010A
Other languages
English (en)
Inventor
야스카타 데키시마
히로시 가와바타
히로토시 히라오카
마코토 우에다
히사토시 우에하라
Original Assignee
가부시키가이샤 에이피아이 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 에이피아이 코포레이션 filed Critical 가부시키가이샤 에이피아이 코포레이션
Publication of KR20070013269A publication Critical patent/KR20070013269A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/04—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group acyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C303/00—Preparation of esters or amides of sulfuric acids; Preparation of sulfonic acids or of their esters, halides, anhydrides or amides
    • C07C303/26—Preparation of esters or amides of sulfuric acids; Preparation of sulfonic acids or of their esters, halides, anhydrides or amides of esters of sulfonic acids
    • C07C303/28—Preparation of esters or amides of sulfuric acids; Preparation of sulfonic acids or of their esters, halides, anhydrides or amides of esters of sulfonic acids by reaction of hydroxy compounds with sulfonic acids or derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/08—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides from nitriles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C51/00—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides
    • C07C51/09—Preparation of carboxylic acids or their salts, halides or anhydrides from carboxylic acid esters or lactones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C67/00—Preparation of carboxylic acid esters
    • C07C67/30—Preparation of carboxylic acid esters by modifying the acid moiety of the ester, such modification not being an introduction of an ester group
    • C07C67/333—Preparation of carboxylic acid esters by modifying the acid moiety of the ester, such modification not being an introduction of an ester group by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton
    • C07C67/343—Preparation of carboxylic acid esters by modifying the acid moiety of the ester, such modification not being an introduction of an ester group by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton by increase in the number of carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/44—Polycarboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Electric Cable Installation (AREA)

Abstract

발명의 목적은 (S)-2-펜탄올, (S)-2-헥산올, 1-메틸알킬말론산 및 3-메틸카본산을 높은 광학순도에서 수득할 수 있는 값이 싸고 효율적인 공업적 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명에 의하면, 어떤 종의 미생물 또는 형질전환체 세포, 전기 미생물 또는 세포처리물, 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 2-펜탄온 또는 2-헥산온에 작용시켜, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 제조하는 방법이 제공된다.
(S)-2-펜탄올, (S)-2-헥산올, 2-펜탄온, 2-헥산온

Description

광학활성을 가지는 알콜 또는 카본산의 제조방법{Process for Producing Optically Active Alcohol and Carboxylic Acid}
본 발명은 2-펜탄온 또는 2-헥산온에 이사첸키아속 등에 속하는 미생물, 전기 미생물 처리물 및/또는 전기 미생물 배양물을 작용시켜, 의약, 농약 등의 중간체 원료로서 산업상 유용한 화합물인 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 제조하는 방법에 관한 것으로, 2-펜탄온 또는 2-헥산온에 상기 미생물로부터 얻어진 카보닐기를 환원시켜 광학활성 알콜을 합성하는 단백질(카보닐 환원효소)을 암호화하는 DNA를 발현시킨 형질전환체 세포, 전기 세포처리물 및/또는 전기 세포배양액을 작용시켜, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-헥산올을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 광학활성 1-메틸알킬말론산 및 그의 제조방법, 및 광학활성 3-메틸카본산의 제조방법에 관한 것이다.
(S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 화학적으로 제조하는 방법으로는, 예를 들면, 2-펜탄온에 대하여 폴리아미드아민과 글루코놀락톤(gluconolactone)으로 구성되는 덴드리머(dendrimer) 존재하에서 환원하는 방법(참조: J. Am. Chem. Soc., Vol. 123, p. 5956-5961, 2001) 또는 2-헥산온에 대하여 광학활성 보론(boron)을 이용하여 환원시키는 방법(특개평 11-240894호 공보) 등이 알려져 있다. 그러나, 이들 생성물의 광학순도는 만족할 만한 것은 아니다.
한편, 미생물의 균체 및/또는 전기 균체처리물을 이용하여 광학활성인 알콜화합물을 생성하는 방법으로는, 라세믹체의 에스테르 화합물에 미생물을 작용시켜 광학선택적으로 에스테르를 가수분해하여 광학활성인 알콜화합물을 생성하는 방법이 알려져 있으나(특개평 10-4998호 공보), 수율이 낮다는 문제 또는 원하는 입체 화학이 아닌 알콜 또는 그의 에스테르를 버리지 않으면 안되는 등의 문제가 있었다. 또한, 케토기를 가지는 화합물을 입체선택적으로 환원하고, 광학활성인 알콜화합물를 생성하는 방법으로는, 2-펜탄온 또는 2-헥산온에 미생물을 작용시켜 제조하는 방법(참조: Tetrahedron: Asymmetry, vol. 14, p. 2659-2681, 2003)이 알려져 있지만 생성물의 광학순도나 생산농도가 만족할 만한 것은 아니고, 균체의 고정화 또는 아세톤 처리 등의 반응에 이용하는 균체의 전처리가 번잡하며, 가해지는 기질의 농도가 낮다는 등의 문제가 있어 실용적이지 않았다.
광학활성 1-메틸알킬말론산은 의농약 중간체로 유용한 화합물임이 알려져 있다. 또한, 광학활성 3-메틸카본산도 마찬가지로 의농약 중간체로 유용한 화합물임이 알려져 있다.
광학활성 1-메틸부틸말론산은, 신경억제작용을 나타내는 바비투르산(barbituric acid) 유도체의 중간체로 유용한 화합물이다(예를 들면, 국제공개 제 00/24358호 팜플렛 참조). 또한, 광학활성 1-메틸알킬말론산으로부터 합성가능 한 광학활성 3-메틸헥산산 또는 광학활성 3-메틸헵탄산은 프로스타글라딘류 등의 의약품 중간체로 이용되고 있다(예를 들면, 특개소 62-265279호 공보 참조).
광학활성인 2-펜탄올을 이용한 (S)-1-메틸부틸말론산의 합성이 보고되어 있다(참조: J. Am. Chem. Soc., 1950, 72, 4695). 그러나, 이 방법으로는 광학활성의 2-펜탄올을 수득하기 위하여, 라세믹체의 2-펜탄올을 프탈산 모노에스테르로 전환하고, 브루신(brucine)으로 분할한 후 가수분해한다는 상당히 번잡한 방법을 이용하고 있고, 분할되기 때문에 반량은 이용할 수 없는 이상, 분할되는 알콜에 비하여 보조기(auxiliary group) 및 분할제(resolving agent)의 분자량이 크기 때문에 비효율적이다.
1-메틸알킬말론산의 탈탄산반응에 의하여 3-메틸카본산을 합성하는 예는 어느 정도 알려져 있다(예를 들면, J. Am. Chem. Soc., 1950, 72, 4695 및 Nouveau Journal de Chime, 1985, 9, 557 참조). 그러나, 모두 반응제어가 어려운 무용매, 일괄첨가방법이고, 고온(180℃)을 필요로 하는 등의 이유로 공업적 실시는 어렵다.
또한, 본 발명과는 다른 기질에 대하여, 첨가제를 이용하여 저온에서 탈탄산(decarboxylation) 하는 방법도 알려져 있다. 그러나, 산화동(cooper oxide)의 존재하에서 아세트니트릴 중에서 환류시키는 방법(예를 들면, J. Am. Chem. Soc., 1993, 115, 801 참조)이나, 황산존재하에서 가열하는 방법(예를 들면, Org. Lett., 2002, 4, 1571 참조)이 본 발명의 기질에 적용가능한지를 검증하였는 바, 어느 쪽도 현저한 반응가속효과는 관측되지 않았다. 이로부터, 첨가제를 이용하여 탈탄산반응을 저온화하는 방법은, 화합물에 의하여 적용할 수 있는 것과 적용할 수 없는 것이 있는 것으로 밝혀졌다.
한편, 용매 중에서 100 내지 150℃ 정도의 온도에서 반응시키는 예도 알려져 있으나(예를 들면, J. Org. Chem., 1983, 48, 2994를 참조), 용매효과에 대하여 검증하고 있는 보고는 없고, 기질에 의하여 탈탄산시에 필요로 하는 반응온도에 차이가 있기 때문에, 용매에 의한 탈탄산반응의 저온화효과에 대하여는 밝혀지지 않았다.
또한, 발생하는 이산화탄소의 제어 등, 안전면에서 고찰되고 있는 것도 아니고, 탈탄산반응의 공업적 실시에 있어서 해결해야 할 과제가 남아 있다.
광학활성 1-메틸부틸말론산의 합성전구체로 여겨지는 광학활성 1-메틸부틸말론산에스테르의 합성법으로는, 시트로넬롤(citronellol)로부터 유도하는 방법(예를 들면, 국제공개 제 00/24358호 팜플렛 참조)이 알려져 있지만, 다단계이고 수율이 낮다는 등의 문제가 있었다. 또한, 광학활성 1-메틸펜틸말론산에스테르의 합성법으로는, 부제(casymmetric) 1, 4-부가반응으로 합성하는 방법(예를 들면, Tetrahedron Asym., 2001, 12, 1151 참조)이 알려져 있으나, 충분한 광학순도가 수득되지 않기 때문에(최대 50%ee) 실용적이지 않다.
한편, 광학활성 1-메틸알킬말론산으로부터 합성할 수 있는 광학활성 3-메틸헥산산 또는 광합활성 3-메틸헵탄산의 합성법으로, 부제보조기(asymmetric auxiliary group)를 가지는 크로톤산(crotonic acid) 유도체에 대한 유기동 시약(organic copper reagent)의 부가반응(예를 들면, Helv. Chim. Acta., 1985, 68, 212 참조)이 알려져 있다. 그러나, 이 방법은 고가의 부제보조기(asymmetric auxiliary group)를 분자내에 도입할 필요가 있고, 폐액처리도 문제가 되는 유기동 시약을 당량(equivalent amount) 이용할 필요가 있는 등 공업적으로 적합한 방법이라고는 할 수 없다. 또한, 라세믹체의 광학분할(예를 들면, 특개소 62-265279호 공보 참조)도 알려져 있으나, 분할로는 목적하는 입체배치를 가진 화합물을 최대로도 50%밖에 수득할 수 없으므로 효율이 낮고, 원하지 않은 반량의 입체배치의 화합물을 폐기하기 위하여 환경부하도 크다. 또한, 시트로넬산(citronellic acid) 등으로부터 유도하는 방법(예를 들면, 미국특허 제 5136020호 및 Tetrahedron, 1977, 33, 289 참조)도 알려져 있으나, 다단계이고 수율이 낮다는 문제가 있었다.
또한, 광학활성 1-메틸부틸말론산을 합성한 예는 있지만(J. Am. Chem. Soc., 1950, 72, 4695 참조), 브로모화와 계속되는 말론산에스테르와의 커플링 시에 광학순도가 대폭 저하되고, 그 후 광학활성 1-메틸부틸말론산으로 유도된 후에 재결정을 반복하여도 70%ee정도밖에 광학순도를 높일 수 없다고 기재되어 있다. 즉, 의농약중간체로서 필요로 되는 높은 광학순도를 가지는 광학활성 1-메틸부틸말론산은 종래의 방법으로는 합성할 수 없고, 그의 조달을 위하여 광학순도를 저하시키지 않는 합성법이 필요로 되었다.
또한, 광학활성 1-메틸헵틸말론산(Nouveau Journal de Chime, 1985, 9, 557참조) 및 방사성 원소로 표지된 광학활성 1-메틸프로필말론산(J. Am. Chem. Soc., 1980, 102, 7344 참조)을 합성한 예가 알려져 있다. 그러나, 말론산에스테르와의 반응시에 장시간(12시간 이상)을 요하는 점, 디카본산으로의 재결정시에 대량의 용매를 필요로 하는 점(50배체 적량), 탈탈산반응에서 고온(180℃)을 필요로 하는 점, 비용이 높고 효과적이지 않는 점 등의 이유로 공업적 실시에 있어서 불리한 점이 많다. 또한, 그들 화합물의 광학순도는 선광도(optical rotation)만이 보고되어 있고, 정확한 광학순도는 불명확하다는 문제도 남아 있다.
본 발명의 목적은 보다 광학순도가 높은 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올, 바람직하게는 광학순도 99.0%e.e. 이상인 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 공업적으로 간편하고 저렴한 가격으로 제조할 수 있는 신규한 제조방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 광학활성 1-메틸알킬말론산 및 광학활성 3-메틸카본산을 높은 광학순도에서 수득할 수 있는, 값이 싸고 효율적인 공업적 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 제조방법에 대하여 예의검토한 결과, 브레타노마이세스(Brettanomyces)속 등에 속하는 어떤 종류의 미생물을 이용하여 2-펜탄온 또는 2-헥산온을 기질로 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 간편히 높은 효율로 생성할 수 있음을 발견하였다. 또한, 상기 미생물의 하나로 이사첸키아(Issatchenkia)속 미생물에서 2-펜탄온 또는 2-헥산온을 환원하고, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 생성하는 카보닐 환원효소 및 전기 효소를 암호화하는 DNA를 단리하여 그 염기서열을 해석하였다. 또한, 전기 DNA를 발현시킨 형질전환체를 작제하고, 전기 형질전환체 세포, 전기 세포처리물 및/또는 전기 세포배양액을 원료로 하는 2-펜탄온 또는 2-헥산온에 작용시켜 높은 광학순도와 고농도로 목적물 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 수득 할 수 있음을 발견하였다.
또한, 본 발명의 발명자들은 광학활성 알콜을 이탈기로 변환한 후, 탄소구핵제(carbon nucleophile)로 처리하여 높은 광학순도를 유지한 채 치환반응을 수행할 수 있고, 수득된 광학활성 화합물을 가수분해한 후 결정화하여 광학활성 1-메틸알킬말론산을 높은 광학순도에서 효율적으로 제조할 수 있음을 발견하였다. 또한, 광학활성 1-메틸알킬말론산을 탈탄산에 의하여 광학활성 3-메틸카본산으로 변환할 시, 고극성 용매 및/또는 탈탄산을 촉진하는 첨가제를 이용하는 것으로, 종래의 방법보다 상당히 온화한 조건으로 반응할 수 있고 이산화탄소의 발생을 억제할 수 있는 공업적으로 간편하고 우수한 제조방법을 확립하였다.
본 발명은 이러한 지견에 근거하여 이루어진 것이다.
즉, 본 발명에 의하면 이하의 발명이 제공되었다.
(1) 미생물 또는 형질전환체 세포, 전기 미생물 또는 세포처리물, 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 2-펜탄온에 작용시켜, (S)-2-펜탄올을 제조하는 방법에 있어서, 전기 미생물 또는 형질전환체 세포가, 용매에 의한 전처리를 하지 않은 생균체를 2-펜탄온에 작용시켰을 때, 95% e.e. 이상의 광학순도를 가지는 (S)-2-펜탄올을 생성할 수 있고, 그 생산성이 1mg (S)-2-펜탄올/g 건조균체중량/시간 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
(2) 미생물 또는 형질전환체 세포, 전기 미생물 또는 세포처리물, 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 2-헥산온에 작용시켜, (S)-2-헥산올을 제조하는 방법에 있어서, 전기 미생물 또는 형질전환체 세포가, 용매에 의한 전처리를 하지 않은 생균체를 2-헥산온에 작용시켰을 때, 95% e.e. 이상의 광학순도를 가지는 (S)-2-헥산올을 생성할 수 있고, 그 생산성이 1mg (S)-2-헥산올/g 건조균체중량/시간 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
(3) 2-펜탄온 또는 2-헥산온에, 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 호르테아(Hortaea)속, 이사첸키아(Issatchenkia)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 피치아(Pichia)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 아트로박터(Arthrobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 크루토박테리움(Crutobacterium)속, 지오바실러스(Geobacillus)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 오크로박트럼(Ochrobactrum)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 로도코커스(Rhodococcus)속으로 구성된 군에서 선택된 미생물, 전기 미생물 처리물, 전기 미생물 배양액 및/또는 전기 미생물로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 작용시켜, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 고광학순도 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 제조방법.
(4) 2-펜탄온 또는 2-헥산온에, 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 호르테아(Hortaea)속, 이사첸키아(Issatchenkia)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 피치아(Pichia)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 아트로박터(Arthrobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 크루토박테리움(Crutobacterium)속, 지오바실러스(Geobacillus)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 오크로박트럼(Ochrobactrum)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 로도코커스(Rhodococcus)속으로 구성된 군에서 선택된 미생물로부터 얻어진 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA를 발현시킨 형질전환체 세포, 전기 세포처리물, 전기 세포배양액 및/또는 전기 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 작용시켜, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 고광학순도 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 제조방법.
(5) 제 3항 또는 제 4항에 있어서,
미생물이 브레타노마이세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis), 브레타노마이세스 아노말러스(Brettanomyces anomalus), 캔디다 파마타(Candida famata), 캔디다 크루세이(Candida krusei), 캔디다 말토사(Candida maltosa), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides), 호르테아 워르네키(Hortaea werneckii), 이사첸키아 스크툴라타(Issatchenkia scutulata), 로데로마이세스 엘롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus), 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 벳세이(Pichia besseyi), 피치아 카토필라(Pichia cactophila), 피치아 세고비엔시스(Pichia segobiensis), 피치아 스파르티나(Pichia spartinae), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta), 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 아트로박터 폴리크로모게네스(Arthrobacter polychromogenes), 아트로박터 속(Arthrobacter sp.), 아트로박터 설퍼로스(Arthrobacter sulfurous), 브레비박테리움 부타니큠(Brevibacterium butanicum), 크루토박테리움 플라큠파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens), 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 마이크로박테리움 케라타놀리티큠(Microbacterium keratanolyticum), 마이크로박테리움 사페르데(Microbacterium saperdae), 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.), 마이크로박테리움 테스타세움(Microbacterium testaceum), 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi), 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis), 파라코커스 디니트리피컨스(Pracoccus denitrificans), 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter) 및 로도코커스 속(Rhodococcus sp.)(코리네박테리움 히드로카보클라스튬(Corynebacterium hydrocarboclastum))로 구성된 군에서 선택된 미생물인 것을 특징으로 하는
제조방법.
(6) 2-펜탄온 또는 2-헥산온에, 하기 (A) 내지 (F) 중 어느 하나의 DNA를 발현시킨 형질전환체 세포, 전기 세포처리물 및/또는 전기 세포배양액을 작용시키고, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-헥산올을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 고광학순도 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 제조방법:
(A) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA;
(B) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1개 내지 여러개의 아미노산이 결실, 부가 또는 치환된 아미노산 서열을 가지고, 카보닐을 환원시켜 광학활성 알콜을 합성하는 단백질을 암호화하는 DNA;
(C) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지고, 카보닐을 환원시켜 광학활성 알콜을 합성하는 단백질을 암호화하는 DNA;
(D) 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 DNA;
(E) 서열번호 2에 기재된 염기서열에 있어서, 1개 내지 여러개의 염기가 결실, 부가 또는 치환된 염기서열을 가지고, 카보닐을 환원시켜 광학활성 알콜을 합성하는 단백질을 암호화하는 염기서열을 가지는 DNA; 및,
(F) 서열번호 2에 기재된 염기서열 또는 그 상보서열과 엄격한 조건하에서 혼성화하는 염기서열을 가지고, 카보닐을 환원시켜 광학활성 알콜을 합성하는 단백질을 암호화하는 염기서열을 가지는 DNA.
(7) 하기 일반식(1)로 표시되는 광학활성을 가지는 (R) 또는 (S)-1-메틸알킬말론산을 고극성 용매 및/또는 탈탄산을 촉진하는 첨가제의 존재하에서 탈탄산시키는 것을 특징으로 하는, 하기 일반식(5)로 표시되는 (R) 또는 (S)-3-메틸카본산의 제조방법:
Figure 112006063947436-PCT00001
Figure 112006063947436-PCT00002
상기 식에서,
R1은 탄소수 3 내지 5의 알킬기이고; 및,
*는 부제탄소이다.
(8) 하기 일반식(2)로 표시되는 광학활성 알콜을 술포닐화제(sulfonylation agent)와 반응시켜, 하기 일반식(3)으로 표시되는 광학활성 화합물을 수득한 후, 염기존재하에서, 하기 일반식(9)로 표시되는 탄소구핵제(carbon nucleophile)와 반응시켜, 하기 일반식(4)로 표시되는 광학활성 화합물로 제조한 후, 가수분해하는 것을 특징으로 하는, 하기 일반식(1)로 표시되는 (R) 또는 (S)-1-메틸알킬말론산의 제조방법:
Figure 112006063947436-PCT00003
Figure 112006063947436-PCT00004
Figure 112006063947436-PCT00005
Figure 112006063947436-PCT00006
Figure 112006063947436-PCT00007
상기 식에서,
R1은 탄소수 3 내지 5의 알킬기이고;
R2 및 R3는 각각 독립적으로, 에스테르기, 카르복실기 또는 시아
노기이며(이 때, R2와 R3는 일체가 되어 환상구조를 형성
하여도 무방하다);
X는 술포닐옥시기이고; 및,
*는 부제탄소이다.
(9) 하기 일반식(1)로 표시되는 광학순도가 90%e.e. 이상인 (R)-1-메틸알킬말론산 또는 (S)-1-메틸알킬말론산:
Figure 112006063947436-PCT00008
상기 식에서,
R1은 탄소수 3 내지 5의 알킬기이고; 및,
*는 부제탄소이다.
(10) 제 9항에 있어서,
R1은 n-프로필기 또는 n-부틸기인 것을 특징으로 하는
(R)-1-메틸알킬말론산 또는 (S)-1-메틸알킬말론산.
(11) 2-펜탄온과 반응하여 (S)-2-펜탄올을 생성하는 활성을 가지는 카보닐 환원효소를 함유하는 미생물 또는 형질전환체 세포로서, 용매에 의한 전처리를 하지 않은 생균체를 2-펜탄온에 작용시켰을 때, 95%e.e. 이상의 광학순도를 가지는 (S)-2-펜탄올을 생성할 수 있고, 그 생산성이 10mg (S)-2-펜탄올/g건조균체중량/시간 이상인 것을 특징으로 하는 상기 미생물 또는 형질전환체 세포, 전기 미생물 또는 세포처리물, 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포처리물 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포에서 수득된 카보닐 환원효소분획의 조정제물 또는 정제물을 2-펜탄온에 작용시켜, (S)-2-펜탄올로 변환하여 얻어진 (S)-2-펜탄올을 술포닐화제와 반응시켜, 하기 일반식 (6)으로 표시되는 광학활성체로 변환시키는 것을 포함하는, 일반식 (6)으로 표시되는 광학활성체의 제조방법:
Figure 112006063947436-PCT00009
상기 식에서,
R4는 n-프로필기이고; 및,
X는 술포닐옥시기이다.
(12) 2-헥산온과 반응하여 (S)-2-헥산올을 생성하는 활성을 가지는 카보닐 환원효소를 함유하는 미생물 또는 형질전환체 세포로서, 용매에 의한 전처리를 하지 않는 생균체를 2-헥산온에 작용시켰을 때, 95%e.e. 이상의 광학순도를 가지는 (S)-2-헥산올을 생성할 수 있고, 그 생산성이 10mg (S)-2-헥산올/g건조균체중량/시간 이상인 것을 특징으로 하는 상기의 미생물 또는 형질전환체 세포, 전기 미생물 또는 세포처리물, 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 2-헥산온에 작용시켜 (S)-2-헥산올로 변환하여 얻어진 (S)-2-헥산올을 술포닐화제와 반응시켜 하기 일반식(6)으로 표시되는 광학활성체로 변환시키는 것을 포함하는, 일반식(6)으로 표시되는 광학활성체의 제조방법:
Figure 112006063947436-PCT00010
상기 식에서,
R4는 n-부틸기이고; 및,
X는 술포닐옥시기이다.
(13) 제 11항 또는 제 12항에 있어서,
수득된 일반식(6)으로 표시되는 광학활성체를 염기존재하에서 하기 일
반식(9)로 표시되는 탄소구핵제와 반응시켜, 하기 일반식(7)로 표시되
는 광학활성 화합물로 변환하는 공정을 추가로 포함하는
방법:
Figure 112006063947436-PCT00011
Figure 112006063947436-PCT00012
상기 식에서,
R2 및 R3는 각각 독립적으로, 에스테르기, 카르복실기 또는 시아
노기이고(이 때, R2와 R3는 일체가 되어 환상구조를 형성
하여도 무방하다); 및,
R4는 n-프로필기 또는 n-부틸기이다.
(14) 제 11항 또는 제 12항에 기재된 방법에 의하여 수득된 일반식(6)으로 표시되는 광학활성체를 염기존재하에서 하기 일반식(9)로 표시되는 탄소구핵제로 반응시켜, 하기 일반식(7)로 표시되는 광학활성 화합물로 변환시키고,
수득된 광학활성 화합물을 가수분해하여, 하기 일반식(8)로 표시되는 (R)-1-메틸펜틸말론산의 제조방법:
Figure 112006063947436-PCT00013
Figure 112006063947436-PCT00014
Figure 112006063947436-PCT00015
상기 식에서,
R2 및 R3는 각각 독립적으로, 에스테르기, 카르복실기 또는 시아
노기이고(이 때, R2와 R3는 일체가 되어 환상구조를 형성하
여도 무방하다); 및,
R4는 n-프로필기 또는 n-부틸기이다.
(15) 제 11항 또는 제 12항에 기재된 방법에 의하여 수득된 일반식(6)으로 표시되는 광학활성체를 염기존재하에서 하기 일반식(9)로 표시되는 탄소구핵제와 반응시켜 하기 일반식(7)로 표시되는 광학활성 화합물로 변환시키고,
수득된 광학활성 화합물을 가수분해하여 하기 일반식(8)로 표시되는 (R)-1-메틸부틸말론산 또는 (R)-1-메틸펜틸말론산으로 변환시키며,
수득된 (R)-1-메틸부틸말론산 또는 (R)-1-메틸펜틸말론산을 탈탄산시키는 것을 특징으로 하는, (R)-3-메틸헥산산 또는 (R)-3-메틸헵탄산의 제조방법:
Figure 112006063947436-PCT00016
Figure 112006063947436-PCT00017
Figure 112006063947436-PCT00018
상기 식에서,
R2 및 R3는 각각 독립적으로, 에스테르기, 카르복실기 또는 시아
노기이고(이 때, R2와 R3는 일체가 되어 환상구조를 형성
하여도 무방하다); 및,
R4는 n-프로필기 또는 n-부틸기이다.
본 발명의 실시의 형태에 대하여 이하에 설명하겠으나, 본 발명의 범위는 이들의 내용에 의하여 한정되지 않는다.
1. 미생물 등을 이용한 광학활성 알콜의 제조방법
본 발명에 의한 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 제조방법은 미생물 또는 형질전환체 세포, 전기 미생물 또는 세포처리물, 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 2-펜탄온(또는 2-헥산온)에 작용시켜, (S)-2-펜탄올(또는(S)-2-헥산올)을 제조하는 방법으로서, 전기 미생물 또는 형질전환체 세포가 용매에 의한 전처리를 하지 않은 생균체를 2-펜탄온(또는 2-헥산온)에 작용시켰을 경우, 95% e.e. 이상의 광학순도를 가지는 (S)-2-펜탄올(또는 (S)-2-헥산올)을 생성할 수 있고, 그 생산성이 1mg (S)-2-펜탄올(또는 (S)-2-헥산올)/g 건조균체중량/시간 이상인 것을 특징으로 하는 방법이다.
또한, 본 명세서에서 언급되는 2-펜탄온 및 2-헥산온이란, 모두 탄소쇄가 직쇄의 2-펜탄온 및 2-헥산온을 의미한다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 방법에서 이용되는 미생물 또는 형질전환체 세포는 용매에 의한 전처리를 하지 않은 생균체를 2-펜탄온(또는 2-헥산온)에 작용시켰을 경우, 95% e.e. 이상의 광학순도를 가지는 (S)-2-펜탄올(또는 (S)-2-헥산올)을 생성할 수 있고, 그 생산성이 1mg (S)-2-펜탄올(또는 (S)-2-헥산올)/g 건조균체중량/시간 이상인 것을 특징으로 한다. 여기에서, 용매의 예로는 아세톤, 톨루엔, 디메틸술폭시드, 2-프로판올을 들 수 있고, 전처리의 예로는 균체를 침지(immersion)하거나 균체를 침지하여 감압조건하에서 건조시키는 등의 방법을 들 수 있다. 이러한 처리를 필요로 하는 미생물 또는 형질전환체 세포를 이용한 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 제조방법은, 전기 처리에 노력과 비용이 들고 재현성이 있는 결과를 얻기 어려우므로, 바람직하지 않다.
생성되는 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 광학순도는 95%e.e. 이상이나, 바람직하게는 98%e.e. 이상이고, 보다 바람직하게는 99%e.e. 이상이다.
또한, (S)-2-펜탄올의 생산성은 1mg (S)-2-펜탄올/g 건조균체중량/시간 이상이면 무방하나, 2mg (S)-2-펜탄올/g 건조균체중량/시간 이상이 바람직하고, 5mg (S)-2-펜탄올/g 건조균체중량/시간 이상이 보다 바람직하며, 10mg (S)-2-펜탄올/g 건조균체중량/시간 이상이 가장 바람직하고, 20mg (S)-2-펜탄올/g 건조균체중량/시간 이상이 특히 바람직하다.
또한, (S)-2-헥산올의 생산성은 1mg (S)-2-헥산올/g 건조균체중량/시간 이상이면 무방하나, 2mg (S)-2-헥산올/g 건조균체중량/시간 이상이 바람직하고, 5mg (S)-2-헥산올/g 건조균체중량/시간 이상이 보다 바람직하며, 10mg (S)-2-헥산올/g 건조균체중량/시간 이상이 더욱 바람직하고, 20mg (S)-2-헥산올/g 건조균체중량/시간 이상이 아주 바람직하며, 50mg (S)-2-헥산올/g 건조균체중량/시간 이상이 가장 바람직하고, 100mg (S)-2-헥산올/g 건조균체중량/시간 이상이 특히 바람직하다.
본 발명의 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올은, 일례로서 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질 또는 전기 아미노산 서열의 상동체이고 카보닐기를 환원하여 광학활성 알콜을 합성하는 능력을 가지는 단백질(이하에서는, 이를 간단히 「카보닐 환원효소」라고 함)을 암호화하는 DNA를 발현시킨 형질전환주를 이용하여 제조할 수 있다.
본 명세서에서 카보닐 환원효소 활성이란, 카보닐기 함유화합물 중 카보닐기를 부제환원(asymmetric reduction)하여 광학활성인 알콜류로 전환시키는 활성을 의미한다. 이와 같은 카보닐 환원효소 활성은 카보닐기 함유화합물을 기질로 함유하고, 추가로 NADPH 또는 NADH를 보효소로 함유하는 반응액에서, 효소로 목적하는 단백질, 전기 단백질을 발현하는 능력을 가지는 형질전환체, 형질전환체 처리물 또는 배양액을 작용시켜, 반응액 중의 NADPH 또는 NADH의 감소초속도(reduced initial rate)를 반응액의 흡광도 변화를 측정하여 산출할 수 있다.
본 발명에 이용되는 카보닐 환원효소는 2-펜탄온 또는 2-헥산온으로부터 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 생성할 수 있는 효소라면 무방하다. 본 발명에 이용되는 카보닐 환원효소의 카보닐 환원효소 활성을 측정할 경우, 카보닐기 함유화합물을 기질로 이용하나, 카보닐기 함유화합물로는 2-펜탄온 또는 2-헥산온에 한정하지 않고, 그 치환체·유도체 등의 구조유사(structurally similar) 화합물도 바람직하게게 이용할 수 있으며, 그 예로는, 1-아세톡시-3-클로로-2-프로판올을 들 수 있다.
카보닐 환원효소는, 본 명세서에 기재된 바에 의하여 그 아미노산 서열 및 전기 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열이 밝혀졌으므로, 후술한 바와 같이 카보닐 환원효소의 아미노산 서열의 일부 또는 전부를 암호화하는 염기서열을 기초로 작제된 프로브를 이용하고, 카보닐 환원효소 활성을 가지는 임의의 미생물로부터 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA를 단리한 후, 그것을 기초로 통상의 유전공학적 방법을 이용하여 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에서, 카보닐 환원효소는 카보닐 환원효소 활성을 가지는 미생물, 즉, 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA를 가지는 미생물, 예를 들면, 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 호르테아(Hortaea)속, 이사첸키아(Issatchenkia)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 피치아(Pichia)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 아트로박터(Arthrobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 크루토박테리움(Crutobacterium)속, 지오바실러스(Geobacillus)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 오크로박트럼(Ochrobactrum)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 로도코커스(Rhodococcus)속으로 구성된 군에서 선택된 미생물, 바람직하게는 이사첸키아(Issatchenkia)속 효모의 배양물에서 정제할 수 있다.
이사첸키아(Issatchenkia)속 효모로는 이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata)가 바람직하게 이용될 수 있고, 예를 들면, 이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata) JCM1828주 유래의 카보닐 환원효소가 본 발명의 카보닐 환원효소로 이용되는 것이 광학활성을 가지는 알콜을 제조할 수 있다는 점에서 특히 우수하다. 본 균주는 이화학연구소 미생물계통 보존시설(Japan Collection of Microorganism(JCM))에서 입수가능하다.
2-펜탄온에 작용시켜 (S)-2-펜탄올을 제조하는 경우의 카보닐 환원효소 또는 전기 효소를 암호화하는 DNA로는, 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 호르테아(Hortaea)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속 또는 피치아(Pichia)속에 속하는 미생물 유래인 것이 바람직하게 이용된다.
보다 바람직하게는, 브레타노마이세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides), 호르테아 워르네키(Hortaea werneckii), 로데로마이세스 엘롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus), 피치아 세고비엔시스(Pichia segobiensis), 피치아 스파르티나(Pichia spartinae), 아트로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 아트로박터 폴리크로모게네스(Arthrobacter polychromogenes), 크루토박테리움 플라큠파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens), 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 마이크로박테리움 테스타세움(Microbacterium testaceum), 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi), 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)), 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter) 유래의 것이 이용된다.
구체적으로는, 브레타노마이세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis) NBRC 0629, 브레타노마이세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis) NBRC 0797, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) NBRC 0006, 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides) CBS 6408, 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides) JCM 1627, 호르테아 워르네키(Hortaea werneckii) NBRC 4875, 로데로마이세스 엘롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus) NBRC 1676, 피치아 세고비엔시스(Pichia segobiensis) JCM 10740, 피치아 스파르티나(Pichia spartinae) JCM 10741, 아트로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis) NBRC 12137, 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans) DSM 20120, 아트로박터 폴리크로모게네스(Arthrobacter polychromogenes) DSM 342, 크루토박테리움 플라큠파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens) ATCC 12813, 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus) NBRC 12550, 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus) IAM 11002, 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus) IAM 11004, 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus) IAM 12043, 마이크로박테리움 테스타세움(Microbacterium testaceum) JCM 1353, 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi) ATCC 49237, 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12950, 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12952, 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12953, 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter) IAM 12048 유래의 것이 특히 바람직하게 이용된다.
또한, 2-헥산온에 작용시켜 (S)-2-헥산올을 제조하는 경우 카보닐 환원효소 또는 전기 효소를 암호화하는 DNA로는, 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 이사첸키아(Issatchenkia)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 피치아(Pichia)속 또는 로도토룰라(Rhodotorula)속에 속하는 미생물 유래인 것이 바람직하게 이용된다.
그 중에서도 브레타노마이세스 아노말라(Brettanomyces anomala), 캔디다 파마타(Candida famata), 캔디다 크루세이(Candida krusei), 캔디다 말토사(Candida maltosa), 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides), 이사첸키아 스크툴라타(Issatchenkia scutulata), 로데로마이세스 엘롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus), 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 카토필라(Pichia cactophila), 피치아 세고비엔시스(Pichia segobiensis), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila) 및 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta) 유래의 것이 특히 바람직하게 이용된다.
구체적으로는, 브레타노마이세스 아노말라(Brettanomyces anomala) NBRC 0627, 캔디다 파마타(Candida famata) ATCC 10539, 캔디다 크루세이(Candida krusei) NBRC 1664, 캔디다 크루세이(Candida krusei) JCM 2284, 캔디다 크루세이(Candida krusei) JCM 2341, 캔디다 말토사(Candida maltosa) NBRC 1977, 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides) CBS 6408, 이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata) JCM 1828, 로데로마이세스 엘롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus) NBRC 1676, 피치아 앙구스타(Pichia angusta) NBRC 1024, 피치아 앙구스타(Pichia angusta) NBRC 1071 피치아 카토필라(Pichia cactophila) JCM 1830, 피치아 세고비엔시스(Pichia segobiensis) JCM 10740, 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila) JCM 3651 및 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta) NBRC 0879, 아트로박터 속(Arthrobacter sp.) DSM 20407, 아트로박터 설퍼로스(Arthrobacter sulfurous)(브레비박테리움 설퍼륨(Brevibacterium sulfureum)) JCM 1338, 브레비박테리움 부타니큠(Brevibacterium butanicum) ATCC 21196, 브레비박테리움 설퍼륨(Brevibacterium sulfureum) JCM 1485, 크루토박테리움 플라큠파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens) ATCC 12813, 마이크로박테리움 케라타놀리티큠(Microbacterium keratanolyticum) NBRC 13309, 마이크로박테리움 사페르데(Microbacterium saperdae) JCM 1352, 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.) NBRC 15615, 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi) ATCC 49237, 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12952, 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12953, 파라코커스 디니트리피컨스(Pracoccus denitrificans) NBRC 12442, 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter) IAM 12048, 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter) IAM 13129, 로도코커스 속(Rhodococcus sp.) ATCC 15960 유래의 것이 바람직하게 이용된다.
미생물의 배양물로부터 카보닐 환원효소를 수득하는 방법으로는, 통상의 효소의 정제방법을 이용할 수 있고, 예를 들면 이하의 방법으로 수행할 수 있다. 상기 미생물을 YM 배지 등의 효소의 배양에 이용되는 일반적인 배지에서 배양하여 충분히 증식시킨 후에 회수하고, DTT(dithiothreitol) 등의 환원제나 페닐메탄술포닐 플루오라이드(phenylmethansulfonyl fluoride; PMSF) 등의 같은 프로테아제 저해제를 가한 완충용액중에서 파쇄하여 무세포추출액으로 변환한다. 무세포추출액으로부터 단백질의 융해도에 의한 분획(유기용매에 의한 침전이나 유안(ammonium sulfate) 등에 의한 염석(salting-out) 등)이나 양이온 교환, 음이온 교환, 겔여과, 소수성(hydrophobic), 히드록시아파타이트 크로마토그래피, 킬레이트, 색소(pigment), 항체(antibody) 등을 이용한 친화성(attinity)크로마토그래피 등을 적절히 조합하여 정제할 수 있다.
예를 들면, 본 명세서의 실시예에서 나타낸 바와 같이, DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences사제)를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피, Butyl Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences사제)를 소수성 상호작용(hydrophobic interaction) 크로마토그래피, MonoQ(Amersham Biosciences사제)를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피, Superdex 200(Amersham Biosciences사제)를 이용한 겔여과 크로마토그래피 등을 통과하여 전기영동으로 거의 단일밴드까지 정제할 수 있다.
이렇게 정제된 이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata) JCM1828주로부터 유래하는 카보닐 환원효소(이하에서는, 이 효소를 「IsADH1」라고 함)는 도데실황산나트륨 폴리아크릴아미드겔 전기영동(이하에서는, SDS-PAGE로 생략)에 의하면 분자량 약 40,000Da의 서브유니트 1종으로 구성되고, Superdex200 HR10/30(Amersham Biosciences사제)를 이용한 겔여과에 결정된 분자량은 약 40,000Da였다. 이상으로부터, IsADH1은 약 40,000Da의 서브유니트 1종으로 구성되는 단량체로 추측된다.
카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA는, 예를 들면 하기와 같은 방법에 의하여 단리할 수 있다.
먼저, 카보닐 환원효소를 상술한 방법으로 정제한 후, N말단 아미노산 서열을 분석하고, 라이실 엔도펩티다제, V8 프로테아제 등의 효소에 의하여 절단하고, 역상액체 크로마토그래피 등에 의하여 펩티드 단편을 정제한 후, 단백질서열결정기(protein sequencer)에 의하여 아미노산 서열을 분석하여 여러개의 아미노산 서열을 결정할 수 있다.
결정된 아미노산 서열에 기초하여 PCR용의 프라이머를 설계하고, 카보닐 환원효소 생산미생물주의 염색체 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, 아미노산 서열로부터 설계된 PCR 프라이머를 이용한 PCR을 수행하여, 본 발명의 DNA 일부를 수득할 수 있다. 또한, 수득된 DNA 단편을 프로브로, 카보닐 환원효소 생산 미생물주의 염색체 DNA의 제한효소 분해물을 파지, 플라스미드 등에 도입하고, 대장균을 형질전환시켜 수득된 라이브러리나 cDNA 라이브러리를 이용하여, 콜로니 하이브리다이제이션, 플라크 하이브리다이제이션 등의 방법으로 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA를 수득할 수 있다.
또한, PCR에 의하여 수득된 DNA 단편의 염기서열을 분석하고, 수득된 서열로부터 공지된 DNA의 외측으로 연장시키기 위한 PCR 프라이머를 설계하고, 카보닐 환원효소생산 미생물주의 cDNA를 이용하여 RACE(Rapid amplification of cDNA ends)법(참조: Molecular Cloning 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 이하, 「Molecular Cloning」이라 함)에 의하여, 본 발명의 DNA를 수득할 수 있다.
이와 같이 이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata) JCM1828주의 염색체 DNA로부터 단리된 카보닐 환원효소 1sADH1을 암호화하는 DNA의 염기서열은, 서열번호 2에 나타낸 바와 같다.
또한, 카보닐 환원효소 IsADH1을 암호화하는 DNA는, 이상과 같은 방법에 의하여 클로닝된 게놈 DNA 또는 cDNA 외에, 본 명세서에 기재된 대로 그 염기서열이 밝혀졌으므로, 서열번호 2에 근거한 화학합성 등에 의하여 수득할 수도 있다.
IsADH1을 암호화하는 DNA의 상동체(homolog)란, 카보닐기 환원효소의 활성을 저해하지 않는 범위 내에서 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 한 개 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지는 것이다. 여기에서 복수개란, 구체적으로는 20개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 5개 이하이다.
또한, IsADH1의 상동체란, 서열번호 1에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 50% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상의 상동성(homology)을 가지는 단백질을 의미한다.
아울러, 상기 단백질의 상동성 검색은, 예를 들면, 일본 DNA 데이터뱅크(DNA Databank of JAPAN(DDBJ)) 등을 대상으로 FASTA나 BLAST 등의 프로그램을 이용할 수 있다. 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 이용하여 DDBJ를 대상으로 BLAST 프로그램을 이용하여 상동성 검색을 한 결과, 공지된 단백질 중에 가장 높은 상동성을 나타낸 것은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 기능이 알려지지 않은 단백질 Ydr541cp protein(서열번호 3: Accession No. AAB64983)이고, 42%의 상동성을 나타내었다.
또한, IsADH1을 암호화하는 DNA는 상기 IsADH1를 암호화하는 DNA 또는 그 상동체이고, 카보닐 환원효소의 활성을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA이다.
상기 단백질을 암호화하는 DNA의 예로는, 서열번호 2로 나타내어지는 염기서열을 포함하는 것을 들 수 있다.
IsADH1을 암호화하는 DNA의 상동체(homolog)란, 카보닐기 환원효소의 활성을 저해하지 않는 범위 내에서 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 한 개 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 DNA를 포함한다. 여기에서 복수개란, 구체적으로는 60개 이하, 바람직하게는 30개 이하, 보다 바람직하게는 10개 이하이다.
당업자라면, 서열번호 2에 기재된 DNA에 부위특이적(site-directed) 변이도입법(참조: Nucleic Acids Res., vol. 10, pp. 6487(1982), Methods in Enzymol., vol. 100, pp. 448(1983), Molecular Cloning, PCR-A Practical Approach, IRL Press, pp. 200(1991)) 등을 이용하여 적절히 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가 변이를 도입하여 IsADH1를 암호화하는 DNA의 상동체를 수득할 수 있다.
또한, IsADH1의 아미노산 서열 또는 그 일부나 IsADH1을 암호화하는 DNA 또는 그 일부를 기초로 하여, 예를 들면 DNA Databank of JAPAN(DDBJ) 등의 데이터베이스에 대하여 상동성 검색을 하고, 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA 상동체의 염기서열 정보를 입수할 수도 있다. 당업자라면, 이 염기서열정보를 기초로 하여 기탁균주로부터의 PCR 등에 의하여 전기 DNA 단편을 입수할 수 있다.
또한, IsADH1을 암호화하는 DNA의 상동체는, IsADH1을 암호화하는 DNA 또는 그 일부를 프로브로 이용하고, 카보닐 환원효소의 활성을 가지는 임의의 미생물로부터 제조한 DNA에 대하여, 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법 또는 서던 블럿(Southern Blot) 하이브리다이제이션법 등에 의하여 엄격한 조건 하에서 혼성화(hybridization)시키고, 혼성화하는 DNA를 수득할 수 있다. 본 발명의 단백질을 암호화하는 DNA의 "일부(a portion)"란, 프로브로 이용하는데 충분한 길이의 DNA이고, 구체적으로는 15bp 이상, 바람직하게는 50bp 이상, 보다 바람직하게는 100bp 이상인 것이다.
각 혼성화하는 Molecular Cloning 등에 기술된 방법에 준하여 수행할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "엄격한 조건하에서 혼성화하는 DNA(DNA that hybridizes under stringent conditions)"란, DNA를 프로브로 이용하고 엄격한 조건하, 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법 또는 서던 블럿 하이브리다이제이션법 등을 이용하여 수득된 DNA 염기서열을 의미하고, 엄격한 조건의 예로는, 콜로니 하이브리다이제이션법 및 플라크 하이브리다이제이션법에서는 콜로니 혹은 플라크 유래의 DNA 또는 전기 DNA의 단편을 고정화한 필터를 이용하여, 0.7 내지 1.0M의 염화나트륨 존재하 65℃에서 혼성화한 후, 0.1 내지 2×SSC용액(1×SSC의 조성은 150mM 염화나트륨, 15mM 구연산나트륨)을 이용하여 65℃ 조건하에서 필터를 세정하는 조건을 들 수가 있다.
상술한 바 같이 단리된 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA를 공지된 발현벡터에 발현가능하게 삽입하여 카보닐 환원효소 발현벡터가 제공된다. 또한, 이 발현벡터로 형질전환한 형질전환체를 배양하여, 카보닐 환원효소를 전기 형질전환체로부터 수득할 수 있다. 아울러, 형질전환체는 공지된 숙주의 염색체 DNA에 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA를 발현가능하도록 조합하여 수득할 수 있다.
형질전환체의 작제방법으로는, 구체적으로는, 미생물 중에서 안정하게 존재하는 플라스미드 벡터나 파지 벡터 중에, 본 발명의 DNA를 도입하고, 구축된 발현벡터를 전기 미생물 중에 도입하던지 직접 숙주게놈 중에 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA를 도입하고, 그 유전정보를 전사·번역시킬 필요가 있다.
이 때, 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA가 숙주미생물 중에서 발현가능한 프로모터를 포함하지 않고 있는 경우, 적당한 프로모터를 본 발명의 DNA고리의 5-'측 상류에, 보다 바람직하게는 터미네이터를 3-'측 하류에 각각 담을 필요가 있다. 이 프로모터 및 터미네이터로는 숙주로 이용하는 미생물 중에서 기능하는 것이 알려져 있는 프로모터 및 터미네이터라면 특별히 한정되지 않고, 이들 각종 미생물로 이용가능한 벡터 프로모터 및 터미네이터 등에 관하여는, 예를 들면 「미생물학 기초강좌 8 유전공학·공립출판」, 특히 효모에 관하여는 Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102(1990), Yeast 8, 423-488(1992) 등에 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 카보닐 환원효소를 발현시키기 위한 형질전환의 대상이 되는 숙주미생물로는, 숙주자체가 본 반응에 악영향을 주지 않는 한 특별히 한정되지 않고, 구체적으로는 후술하는 미생물을 예로 들 수 있다.
에쉐리키아(Escherichia)속, 바실러스(Bacillus)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 세라티아(Serratia)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 락토바실러스(Lactobacillus)속 등에 속하는 숙주벡터계가 확립되어 있는 균주.
로도코커스(Rhodococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속 등에 속하는 숙주벡터계가 확립되어 있는 균주.
사카로마이세스(Saccharomyces)속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속, 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomuces)속, 야로위아(Yarrowia)속, 트리코스포론(Trichosporon)속, 로도스포리디움(Rhodosporidium)속, 한세눌라(Hansenula)속, 피치아(Pichia)속, 캔디다(Candida)속 등에 속하는 숙주벡터계가 확립되어 있는 효모.
뉴로스포라(Neurospora)속, 아스퍼질러스(Aspergillus)속, 세파로스포리움(Cephalosporium)속, 트리코더마(Trichoderma)속 등에 속하는 숙주벡터계가 확립되어 있는 곰팡이.
상기 미생물 중에서 숙주로서 바람직하게는, 에쉐리키아(Escherichia)속, 바실러스(Bacillus)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속이고, 특히 바람직하게는, 에쉐리키아(Escherichia)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속이다.
형질전환체 작제를 위한 순서, 숙주에 적합한 재조합벡터의 구축 및 숙주의 배양방법은 분자생물학, 생물공학 및 유전공학 분야에서 널리 사용되고 있는 기술에 준하여 실시할 수 있다(예를 들면, Molecular Cloning에 개시된 방법).
이하에서 구체적으로 바람직한 숙주미생물, 각 미생물에 있어서 바람직한 형질전환방법, 벡터, 프로모터, 터미네이터 등을 예로 들 수 있지만, 본 발명은 이들의 예에 한정되지 않는다.
에쉐리키아속, 특히 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)에 있어서는, 플라스미드 벡터의 예로는 pBR, pUC계 플라스미드를 들 수 있고, lac(β-갈락토시다제), trp(트립토판 오페론), tac, trc(lac, trp의 융합), λ파지 PL, PR 등으로부터 유래하는 프로모터 등을 들 수 있다. 또한, 터미네이터의 예로는, trpA 유래, 파지 유래, rrnB 리보솜 RNA 유래의 터미네이터 등을 들 수 있다.
바실러스속에 있어서, 벡터의 예로는 pUB110계 플라스미드, pC194계 플라스미드 등을 들 수 있고, 염색체에 통합될 수도 있다. 프로모터 및 터미네이터로는 알칼리 프로테아제, 중성 프로테아제, α-아밀라아제 등의 효소유전자의 프로모터나 터미네이터 등이 이용될 수 있다.
슈도모나스속에 있어서, 벡터의 예로는 슈도모나스 퓨티다(Pseudomonas putida), 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia) 등으로 확립되어 있는 일반적인 숙주벡터계나, 톨루엔 화합물의 분해에 관여하는 플라스미드, TOL 플라스미드를 기본으로 한 광숙주역벡터(euroxenous vector)(RSF1010 등으로부터 유래하는 자율적 복제에 필요한 유전자를 포함한다) pKT240(참조: Gene, 26, 273-82(1983))을 들 수 있다.
브레비박테리움 락토파멘튬(Brevibacterium lactofermentum)에 있어서, 벡터의 예로는 pAJ43(참조: Gene 39, 281(1985)) 등의 플라스미드벡터를 들 수 있다. 프로모터 및 터미네이터로는 대장균으로 이용되고 있는 각종 프로모터 및 터미네이터가 이용가능하다.
코리네박테리움속, 특히 코리네박테리움 글루타미큠(Corynebacterium glutamicum)에 있어서는, 벡터의 예로는 pCS11(참조: 특개소 57-183799호 공보), pCB101(참조: Mol. Gen. Genet. 196, 175(1984)) 등의 플라스미드벡터가 들어진다.
사카로마이세스(Saccharomyses)속, 특히 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyses cerevisiae)에 있어서, 벡터의 예로는, YRp계, YEp계, YCp계, YIp계 플라스미드를 들 수 있다. 또한, 알콜탈수소효소, 글리세르알데히드-3-인산탈수소효소, 산성 포스파타아제, β-갈락토시다제, 포스포글리세레이트 키나제 또는 에놀라아제(enolase)의 각종 효소유전자의 프로모터, 터미네이터가 이용가능하다.
쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)속에 있어서, 벡터의 예로는 Mol. Cell. Biol. 6, 80(1986)에 개시된 쉬조사카로마이세스 폼베 유래의 플라스미드벡터를 들 수 있다. 특히, pAUR224는 다카라주조로부터 시판되고 있어 용이하게 입수할 수 있다.
아스퍼질러스(Aspergillus)속에 있어서는, 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 등이 곰팡이 중에서 가장 잘 연구되어 있고, 플라스미드나 염색체로의 통합(integration)이 가능하고, 균체외 프로테아제나 아밀라아제 유래의 프로모터가 이용가능하다(참조: Trends in Biotechnology 7, 283-287(1989)).
또한, 상기 이외에도 각종 미생물에 대응하는 숙주백터계가 확립되어 있고, 그들을 적절히 이용할 수 있다.
또한, 미생물 이외에도 식물, 동물에서 다양한 숙주·벡터계가 확립되어 있고, 특히 누에를 포함한 곤충 등의 동물(참조: Nature 315, 592-594(1985))이나 유채씨, 옥수수, 감자 등의 식물 중에 대량으로 이종단백질을 발현시키는 계통 및 대장균 무세포 추출액이나 소맥배아 등의 무세포 단백질 합성계통을 이용한 계통이 확립되어 있고, 적절히 이용할 수 있다.
본 발명은 상술한 방법 등으로 수득되는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 염기서열을 가지는 DNA를 벡터에 넣어서 수득된 재조합 DNA를 보유하는 형질전환체 세포 또는 전기 DNA를 염색체 DNA에 넣어 수득된 형질전환체 세포, 전기 형질전환체 세포처리물 및/또는 배양액을 반응기질인 2-펜탄온 또는 2-헥산온에 작용시키고, 전기 화합물의 카보닐기를 부제환원시켜, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열로 구성된 단백질이고, 카보닐기를 환원하여 광학활성 알콜을 합성하는 능력을 가지는 단백질을 암호화하는 염기서열을 가지는 DNA를 벡터에 넣어서 수득된 재조합체 DNA를 보유하는 형질전환체 또는 전기 DNA를 염색체 DNA에 에 넣어 수득된 형질전환체 세포, 전기 형질전환체 세포처리물 및/또는 배양액을 반응기질인 2-펜탄온 또는 2-헥산온에 작용시켜, 전기 화합물의 카보닐기를 부제환원시키고, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 제조할 수 있다.
또한 본 발명은 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 호르테아(Hortaea)속, 이사첸키아(Issatchenkia)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 피치아(Pichia)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 아트로박터(Arthrobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 크루토박테리움(Crutobacterium)속, 지오바실러스(Geobacillus)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 오크로박트럼(Ochrobactrum)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 로도코커스(Rhodococcus)속으로 구성된 군에서 선택된 미생물, 전기 미생물 처리물, 전기 미생물 배양액 및/또는 전기 미생물로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 반응기질인 (S)-2-펜탄온 또는 (S)-2-헥산온에 작용시키고, 전기 화합물의 카보닐기를 부제환원시켜, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 제조할 수 있다.
2-펜탄온에 작용시켜 (S)-2-펜탄올을 제조하는 경우, 바람직하게는 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 호르테아(Hortaea)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속 또는 피치아(Pichia)속에 속하는 미생물이 이용되고, 특히 바람직하게는 브레타노마이세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides), 호르테아 워르네키(Hortaea werneckii), 로데로마이세스 엘롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus), 피치아 세고비엔시스(Pichia segobiensis), 피치아 스파르티나(Pichia spartinae), 아트로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis), 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 아트로박터 폴리크로모게네스(Arthrobacter polychromogenes), 크루토박테리움 플라큠파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens), 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 마이크로박테리움 테스타세움(Microbacterium testaceum), 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi), 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)), 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter)가 이용되고, 구체적으로는 브레타노마이세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis) NBRC 0629, 브레타노마이세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis) NBRC 0797, 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis) NBRC 0006, 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides) CBS 6408, 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides) JCM 1627, 호르테아 워르네키(Hortaea werneckii) NBRC 4875, 로데로마이세스 엘롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus) NBRC 1676, 피치아 세고비엔시스(Pichia segobiensis) JCM 10740, 피치아 스파르티나(Pichia spartinae) JCM 10741, 아트로박터 글로비포미스(Arthrobacter globiformis) NBRC 12137, 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans) DSM 20120, 아트로박터 폴리크로모게네스(Arthrobacter polychromogenes) DSM 342, 크루토박테리움 플라큠파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens) ATCC 12813, 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus) NBRC 12550, 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus) IAM 11002, 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus) IAM 11004, 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus) IAM 12043, 마이크로박테리움 테스타세움(Microbacterium testaceum) JCM 1353, 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi) ATCC 49237, 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12950, 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12952, 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12953, 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter) IAM 12048가 바람직하게 이용된다.
2-헥산온에 작용시켜, (S)-2-헥산올을 제조하는 경우, 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 이사첸키아(Issatchenkia)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 피치아(Pichia)속 또는 로도토룰라(Rhodotorula)속에 속하는 미생물이 바람직하게 이용된다.
그 중에서, 브레타노마이세스 아노말라(Brettanomyces anomala), 캔디다 파마타(Candida famata), 캔디다 크루세이(Candida krusei), 캔디다 말토사(Candida maltosa), 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides), 이사첸키아 스크툴라타(Issatchenkia scutulata), 로데로마이세스 엘롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus), 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 카토필라(Pichia cactophila), 피치아 세고비엔시스(Pichia segobiensis), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila) 및 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta)가 특히 바람직하게 이용된다.
구체적으로는 브레타노마이세스 아노말라(Brettanomyces anomala) NBRC 0627, 캔디다 파마타(Candida famata) ATCC 10539, 캔디다 크루세이(Candida krusei) NBRC 1664, 캔디다 크루세이(Candida krusei) JCM 2284, 캔디다 크루세이(Candida krusei) JCM 2341, 캔디다 말토사(Candida maltosa) NBRC 1977, 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides) CBS 6408, 이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata) JCM 1828, 로데로마이세스 엘롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus) NBRC 1676, 피치아 앙구스타(Pichia angusta) NBRC 1024, 피치아 앙구스타(Pichia angusta) NBRC 1071 피치아 카토필라(Pichia cactophila) JCM 1830, 피치아 세고비엔시스(Pichia segobiensis) JCM 10740, 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila) JCM 3651 및 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta) NBRC 0879, 아트로박터 속(Arthrobacter sp.) DSM 20407, 아트로박터 설퍼로스(Arthrobacter sulfurous)(브레비박테리움 설퍼륨(Brevibacterium sulfureum)) JCM 1338, 브레비박테리움 부타니큠(Brevibacterium butanicum) ATCC 21196, 브레비박테리움 설퍼륨(Brevibacterium sulfureum) JCM 1485, 크루토박테리움 플라큠파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens) ATCC 12813, 마이크로박테리움 케라타놀리티큠(Microbacterium keratanolyticum) NBRC 13309, 마이크로박테리움 사페르데(Microbacterium saperdae) JCM 1352, 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.) NBRC 15615, 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi) ATCC 49237, 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12952, 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)) NBRC 12953, 파라코커스 디니트리피컨스(Pracoccus denitrificans) NBRC 12442, 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter) IAM 12048, 로도코커스 속(Rhodococcus sp.) ATCC 15960가 바람직하게 이용된다.
또한, 반응기질이 되는 2-펜탄온 또는 2-헥산온은 통상 기질농도가 0.01 내지 90%w/v, 바람직하게는 0.1 내지 30%w/v의 범위에서 이용된다. 반응기질은, 반응개시시 일괄하여 첨가하여도 무방하나, 효소의 기질저해가 있었던 경우의 영향을 줄인다는 점이나 생성물의 축적농도를 상승시킨다는 관점으로 본다면, 연속적 또는 간헐적으로 첨가함이 바람직하다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 2-펜탄온 또는 헥산온의 카보닐기 함유 화합물(반응기질)에 상기 형질전환체 세포 또는 카보닐 환원활성을 가지는 미생물을 작용시키는 경우, 전기 형질전환체 세포 또는 미생물 세포를 그대로 이용할 수도 있으나, 전기 세포처리물, 예를 들면 동결건조처리한 것, 물리적 또는 효소적으로 파쇄한 것 등의 세포처리물, 전기 세포 중의 카보닐 환원효소분획을 조정제물 또는 정제물로 추출한 것, 그리고 이것을 폴리아크릴아미드겔, 카라지넌(carragheenan)겔 등으로 대표되는 담체에 고정화한 것 등을 이용할 수 있다. 반응액에 첨가하는 형질전환체 세포 또는 미생물 세포 및/또는 전기 세포처리물의 양은 반응액에 그 세포의 농도가 통상 습윤체중(wet cell mass weight)으로 0.1 내지 50%w/v정도, 바람직하게는 1 내지 20%w/v가 되도록 가한다. 효소 등의 조제물을 이용하는 경우, 효소의 비활성(specific activity)을 구하고, 세포의 농도가 상기 세포농도와 같은 양이 되도록 조제물을 가한다.
또한, 본 발명의 제조방법에 있어서는, 보효소 NADP+ 또는 NADPH 또는 NAD+ 또는 NADH를 가하는 것이 바람직하고, 보효소의 농도로는, 통상 0.001mM 내지 100mM, 바람직하게는 0.01 내지 10mM 가한다.
상기 보효소를 첨가하는 경우, NADPH(NADH)로부터 생성되는 NADP+(NAD+)를 NADPH(NADH)로 재생시키는 것이 생산효율의 향상을 위해 바람직하고, 재생(regeneration)방법으로는 1) 숙주미생물 자체의 NADP+(NAD+) 환원능을 이용하는 방법, 2) NADP+(NAD+)로부터 NADPH(NADH)를 생성하는 능력을 가지는 미생물이나 그 처리물, 또는 글루코스 탈수소효소, 포름산 탈수소효소, 알콜 탈수소효소, 아미노산 탈수소효소, 유기산 탈수소효소(사과산 탈수소효소 등) 등의 NADPH(NADH)의 재생에 이용가능한 효소(재생효소)를 반응계내에 첨가하는 방법, 3) 형질전환체를 제조하는 경우, NADPH(NADH)의 재생에 이용가능한 효소인 상기 재생효소류의 유전자를, 본 발명의 DNA와 동시에 숙주에 도입하여 발현시키는 방법 등이 예로 들어진다.
이 때, 상기 1)의 방법에 있어서는, 반응계에 글루코스나 에탄올, 포름산 등을 첨가하는 편이 바람직하다.
또한, 상기 2)의 방법에 있어서는, 상기 재생효소류를 포함하는 미생물, 전기 미생물균체를 아세톤 처리한 것, 동결건조처리한 것, 물리적 또는 효소적으로 파쇄한 것 등의 균체처리물, 전기 효소분획을 조정제물 또는 정제물로 추출한 것, 그리고 이것을 폴리아크릴아미드겔, 카라지넌(carragheenan)겔 등으로 대표되는 담체에 고정화한 것 등을 이용하여도 무방하고, 시판되는 효소를 이용하여도 무방하다.
이러한 경우, 상기 재생효소의 이용량으로는, 구체적으로는 본 발명의 카보닐 환원효소에 비교하여 효소활성으로 통상 0.01 내지 100배, 바람직하게는 0.5 내지 20배정도가 되도록 가한다.
또한, 상기 재생효소의 기질이 되는 화합물, 예를 들면 글루코스 탈수소효소를 이용하는 경우의 글루코스, 포름산 탈수소효소를 이용하는 포름산, 알콜탈수소효소를 이용하는 에탄올 또는 이소프로판올 등의 첨가도 필요하게 되지만, 그 첨가량으로는 반응원료인 2-펜탄온 또는 2-헥산온에 대하여 통상 0.1 내지 20배 몰당량, 바람직하게는 1 내지 5배 몰당량 첨가한다.
또한, 상기 3)의 방법에 있어서는, 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA와 상기 재생효소류의 DNA를 염색체에 삽입시키는 방법, 하나의 벡터중에 두가지 형태의DNA를 도입하고, 숙주를 형질전환하는 방법 및 두가지 형태의 DNA를 각각 별개로 벡터에 도입한 후에 숙주를 형질전환하는 방법을 이용할 수 있으나, 두가지 형태의 DNA 각각 별개로 벡터에 도입한 후에 숙주를 형질전환하는 방법의 경우, 두가지 형태의 벡터끼리의 불화합성(incompatibility)을 고려하여 벡터를 선택할 필요가 있다.
하나의 벡터에 복수개의 유전자를 도입하는 경우, 프로모터 및 터미네이터 등 발현제어에 관한 영역을 각각의 유전자에 연결하는 방법이나 락토스 오페론 등 복수개의 시스트론(cistron)을 포함하는 오페론으로 발현시키는 것도 가능하다.
본 발명의 제조방법은, 반응기질 및 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA를 발현시킨 형질전환체 세포, 전기 세포처리물, 전기 세포배양액 및/또는 전기 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물 또는 필요에 응하여 첨가된 각종 보효소 및 그 재생 시스템을 함유하는 수성매체(aqueous medium) 중 또는 전기 수성매체와 유기용매의 혼합물 중에서 수행된다.
또한, 본 발명의 제조방법은, 반응기질 및 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 호르테아(Hortaea)속, 이사첸키아(Issatchenkia)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 피치아(Pichia)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 아트로박터(Arthrobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 크루토박테리움(Crutobacterium)속, 지오바실러스(Geobacillus)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 오크로박트럼(Ochrobactrum)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 로도코커스(Rhodococcus)속의 카보닐 환원효소의 활성을 가지는 미생물, 전기 미생물 처리물, 전기 미생물 배양액 및/또는 전기 미생물로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물 또는 필요에 응하여 첨가된 각종 보효소 및 그 재생 시스템을 함유하는 수성매체 중 또는 전기 수성매체와 유기용매의 혼합물 중에서 수행된다.
상기 수성매체로는 물 또는 완충용액이 예로 들어진다. 완충용액의 예로는 인산나트륨과 인산칼륨, 트리스, 초산나트륨, 구연산나트륨 등을 들 수 있고, 유기용매로는 초산에틸, 초산브틸, 톨루엔, 클로로포름, n-헥산, 디메틸술폭시드 등 반응기질의 용해도가 높은 것을 이용할 수 있다.
본 발명의 방법은 통상 4 내지 60℃, 바람직하게는 10 내지 45℃의 반응온도에서, 통상 pH 3 내지 11, 바람직하게는 pH 5 내지 8로 실시된다. 반응시간은 통상, 1 내지 72시간 정도이며, 막리액터(membrane reactor) 등을 이용하여 실시하는 것도 가능하다.
본 발명의 방법에 의하여 생성되는 광학활성 알콜은 반응종료 후, 반응액 중의 항체나 단백질을 원심분리, 막처리 등에 의하여 분리한 후에, 초산에틸, 톨루엔 등의 유기용매에 의한 추출, 증류, 컬럼크로마토그래피, 결정화 등을 적절히 조합하여 정제할 수 있다.
2. 광학활성 3- 메틸카본산의 제조방법
본 발명의 제조방법에 있어서, 하기 일반식 (5)로 표시되는 광학활성 3-메틸카본산은 상기 일반식 (1)로 표시되는 광학활성 1-메틸알킬말론산을 고극성 용매 및/또는 탈탄산을 촉진하는 첨가제의 존재하에서 탈탄산하여 제조된다:
Figure 112006063947436-PCT00019
상기 일반식 1에 있어서, R1은 탄소수 3 내지 5의 n-프로필기, n-부틸기, n-펜틸기, 이소프로필기, 이소부틸기, 이소아밀기, 시클로펜틸기 등의 직쇄상, 분지상 또는 환상의 알킬기이다. 바람직하게는, n-프로필기, n-부틸기, n-펜틸기, 이소프로필기, 이소부틸기이고, 보다 바람직하게는 n-프로필기 또는 n-부틸기이다.
또한, *는 부제탄소를 나타내고, R체 및 S체 중 어느 것이라도 무방하고, 바람직하게는 R체이고, 그 광학순도는 통상 80%ee 이상, 바람직하게는 90%ee 이상이고, 특히 의약원료 또는 중간체로서 이용하는 경우, 높은 광학순도가 요구되므로 보다 바람직하게는 95%ee 이상이고, 특히 바람직하게는 99%ee 이상이다.
상기 탈탄산반응은, 고극성 용매 및/또는 탈탄산을 촉진하는 첨가제의 존재하에서 가열하여도 무방하고, 저극성 용매의 존재하 또는 무용매하에서 고온가열하여도 무방하나, 공업적 실시의 용이함보다 고극성 용매 및/또는 탈탄산을 촉진하는 첨가제의 존재하에서 반응온도를 낮추는 것이 바람직하다. 일반적으로, 탈탄산반응은 150℃에서 200℃의 고온조건을 필요로 하나, 통상의 글라스라이닝 반응기(glass-lining reactor)에서는 이용한계온도에 가깝고, 승온, 냉각에도 시간이 걸리는 이상, 대량의 열량을 필요로 하므로, 반응온도의 저온화에 의한 장점은 상당히 크다 할 것이다. 또한, 일반적으로 광학활성 1-메틸알킬말론산은 상온에서 고체이므로, 무용매에서 반응을 하는 경우, 반응조에 넣은 후 가열융해할 필요가 있다. 그러나, 고체만이 들어간 상태에서 통상의 반응조에서는 교반을 할 수 없고, 교반하지 않고 가열하면 열전도효율이 극단적으로 나빠지며 부분승온(partial temperature rise)에 의한 반응폭주(reaction excursion)의 위험이 있으므로 현실적이지 않다. 따라서, 용매를 이용하여 광학활성 1-메틸알킬말론산을 용액 또는 슬러리 상태에서 취급하는 것은 바람직하다.
한편, 반응에 의하여 다량의 이산화탄소가 발생하므로, 공업적 규모에서 실시할 때는 안전성 확보를 위하여 이산화탄소의 발생속도를 제어하는 것이 중요하다.
이산화탄소의 발생속도를 제어하는 관점에서, 광학활성 1-메틸알킬말론산을 용해한 용액 또는 가열융해한 광학활성 1-메틸알킬말론산을 연속적으로 한방울씩 가하여 반응하는 것이 바람직하다. 적하법(dropping method)은 반응제어가 용이하고, 통상의 반응장치를 이용할 수 있다. 또한, 반응으로 생성하는 광학활성 3-메틸카본산을 용매로 이용할 수도 있고, 이 경우 반응 후에 제거가 필요하게 되는 용매 등을 포함하지 않으므로, 정제부하(purification load)가 적어 바람직하다.
또한, 생성되는 광학활성 3-메틸카본산보다 고비점의 용매를 이용할 수도 있다. 반응용매로 생성물보다도 고비점의 용매를 이용하여, 반응액을 증류할시 광학활성 3-메틸카본산이 제 1유출성분으로 유출되므로 경비점(light boiling point) 용매를 이용한 경우에 문제가 되는 경비성분(lightly boiling component)의 혼입을 피할 수 있고, 고비점 용매를 고비희석제(high boiling point diluent)로 증류용기에 남김으로써 목적물을 보다 많이 유출시켜 증류효율을 높일 수 있다.
감압하에서 광학활성 1-메틸알킬말론산 용액을 반응용기에 한방울씩 가하면서 반응시켜 생성된 광학활성 3-메틸카본산을 연속적으로 제거하는 반응증류(reaction distillation)도 가능하다. 반응증류법으로는 제어가 용이하고 가열시간이 단시간에 종료되므로, 장시간 가열에 의하여 생기는 불순물의 생성을 억제할 수 있어 바람직하다.
광학활성 1-메틸알킬말론산 용액을 가열한 반응장치 중을 흐르는 유통법(flow method)에 의하여 광학활성 3-메틸카본산으로 변환시킬 수도 있다. 유통법에서는, 반응장치에의 용액의 공급을 제어하여, 이산화탄소의 발생속도를 제어할 수 있다. 또한, 가열시간이 단시간에 종료되므로, 장시간 가열에 의하여 생기는 불순물의 생성을 억제할 수 있으므로 바람직하다. 유통반응의 반응장치로는 관상반응기, 박막증류기(thin-film distillatory) 또는 다단식 조형유통반응기(multistage tank flow reactor)를 이용하는 것이 바람직하다. 박막증류기의 경우, 감압하에서 반응하는 것도 가능하다.
상술한 탈탄산반응에 이용되는 용매의 예로는, 부틸에테르, 테트라히드로푸란, 1, 2-디메톡시에탄, 디옥산, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜디메틸에테르, 폴리테트라히드로푸란 등의 에테르계 용매; 사염화탄소, 디클로로벤젠 등의 할로겐계 용매; 부탄올, 에틸렌글리콜 등의 알콜계 용매; 초산에틸, 프탈산디옥틸, 프탈산디이소노닐(diisononyl phthalate), 프탈산디토리데실(ditridecyl phthalate), 트리메리트산트리옥틸(trioctyl trimellitate) 등의 에스테르계 용매; 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴계 용매; 톨루엔, 크실렌, 테트라데칸, 트리데칸, 유동파라핀(liquid paraffin), 모노메틸나프탈렌, 이소프로필비페닐, 디벤질톨루엔, 수소화트리페닐(hydrogenated triphenyl), 실리콘 오일 등의 탄화수소계 용매; 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등의 아미드계 용매; 포름산, 초산 등의 유기산계 용매; 피리딘, 2, 6-루티딘, 트리에틸아민 등의 염기성 용매; 디메틸술폭시드; 물; 등을 들 수 있다. 이들로부터 선택된 복수의 용매를 임의의 비율로 혼합하여 이용하여도 무방하다. 고극성의 기질이나 첨가제를 용해시키기 위하여 고극성 용매인 아세토니트릴, 테트라히드로푸란, 트리데칸, 폴리에틸렌글리콜디메틸에테르, 폴리테트라히드로푸란, 프탈산디옥틸, 프탈산디이소노닐, 프탈산디토리데실, 트리메리트산트리옥틸, 유동프라핀, 모노메틸나프탈렌, 이소프로필비페닐, 디벤질톨루엔, 수소화트리페닐, 실리콘 오일 등의 고비점 용매는 증류 시 고비희석제(highly-boiling-point diluent)로 이용된다.
또한, 용매의 이용량으로는, 임의의 양의 용매를 이용할 수 있지만, 통상은 원료기질에 대하여 1 내지 20배의 체적량, 바람직하게는 1 내지 5배의 체적량을 이용한다.
반응촉진을 위한 첨가제를 용매로 이용하는 것도 가능하다. 이런 경우, 광학활성 1-메틸알킬말론산을 용해 또는 현탁시키기 위하여, 통상 기질에 대하여 0.5 내지 20배의 체적량이 이용된다. 용매의 제거회수 등의 부하를 줄이기 위하여, 0.5 내지 3배의 체적량이 바람직하다.
상기 탈탄산반응에 이용된 첨가제의 예는, 황산, 염산 등의 광산; 염화나트륨, 염화리튬 등의 무기염; 초산나트륨, 포름산암모늄 등의 유기염; 시안화나트륨, 시안화동(copper cyanide) 등의 시안화물; 염화동(copper chloride), 염화철 등의 중금속염; 산화동, 산화은 등의 중금속산화물; 피리딘, 2, 6-루티딘, 트리에틸아민, 1,8-디아자비싸이클로〔5. 4. 0〕-7-운데센, 1, 4-디아자비싸이클로〔2. 2. 2〕옥탄 등의 유기염기; 수산화나트륨, 수산화칼슘, 탄산칼륨 등의 무기염기; 무수초산, 무수푸말산 등의 산무수물; 등을 들 수 있고, 이들을 임의의 비율로 혼합하여 이용하여도 무방하다. 바람직하게는, 중금속염, 중금속산화물, 유기염기, 산무수물 및 이들의 혼합물이고, 보다 바람직하게는 산화동, 피리딘, 2, 6-루티딘, 무수초산 및 이들의 혼합물이고, 특히 바람직하게는 비교적 저렴한 가격으로 반응가속효과가 크고, 증류로 목적물과 분리가능한 피리딘이다.
이용하는 첨가제의 양은 통상 기질에 대하여 0.01 내지 50wt%이나, 급격한 이산화탄소의 발생을 피하고 정제부하를 줄이기 위하여 필요최저한도로 억제하는 것이 바람직하고, 바람직하게는 0.01 내지 5wt%이다.
반응온도는 통상 30 내지 200℃이고, 첨가제의 유무, 이용하는 첨가제 등의 반응조건에 의하여 필요한 온도는 다르다. 공업적 관점에서 과도한 고온반응은 장치상의 제약을 받아 실시하기 어려움과 동시에, 승온, 냉각에 장시간을 요하므로 바람직하지 않으므로, 30 내지 150℃이 바람직하고, 30 내지 100℃이 보다 바람직하다.
상기 반응으로 수득된 광학활성 3-메틸카본산은, 증류 및/또는 추출 등의 방법으로 정제하는 것이 바람직하다.
3. 광학활성 1- 메틸알킬말론산의 제조방법
본 발명의 광학활성 1-메틸알킬말론산은, 하기의 일반식(2)로 표시되는 광학활성 알콜을 술포닐옥시기로 변환되고, 하기 일반식(3)으로 표시되는 광학활성 화합물을 수득한 후, 하기 일반식(9)로 표시되는 탄소구핵제와 반응시켜 수득되는 하기 일반식(4)로 표시되는 광학활성 화합물을 가수분해하여 제조된다:
Figure 112006063947436-PCT00020
Figure 112006063947436-PCT00021
Figure 112006063947436-PCT00022
Figure 112006063947436-PCT00023
상기 일반식(2), (3) 및 (4)에 있어서, R1은 본 명세서 중에 전기한 바와 같다.
상기 일반식(4) 및 (9)에 있어서, R2및 R3는 각각 독립적으로, 에스테르기, 카복실기 또는 시아노기이고, 바람직하게는 에스테르기이다. 여기에서, R2와 R3가 일체가 되어, 5-(1-메틸알킬)-2, 2-디메틸-1, 3-디옥산-4, 6-디온 등의 환상구조를 형성하여도 무방하다.
전기 에스테르기의 알콜성분으로는 반응에 악영향을 주지 않는 것이라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 메틸알콜, 에틸알콜, n-부틸알콜, 이소프로필알콜, 씨클로헥실알콜 등의 직쇄상, 분지상 또는 환상의 알킬알콜; 페놀, 나프톨 등의 아릴알콜이고, 보다 바람직하게는 메틸알콜 또는 에틸알콜이다.
상기 일반식(3)에 있어서, X는 메탄술포닐옥시기, p-톨루엔술포닐옥시기, 니트로벤젠술포닐옥시기, 클로로메탄술포닐옥시기, 트리플루오로메탄술포닐옥시기 등의 술포닐옥시기이고, 바람직하게는 메탄술포닐옥시기, p-톨루엔술포닐옥시기, 니트로벤젠술포닐옥시기이고, 보다 바람직하게는 메탄술포닐옥시기 또는 p-톨루엔술포닐옥시기이다.
상기 일반식(1) 내지 (5)에 있어서, *는 부제탄소를 나타내고, 그 광학순도는 통상 80%ee 이상, 바람직하게는 90%ee 이상, 보다 바람직하게는 95%ee, 특히 바람직하게는 99%ee 이상이다. 절대입체배치(absolute stereochemistry)는 R체 및 S체 중 어느 것이라도 무방하나, 상기 일반식(2) 및 (3)에 있어서 S체가 바람직하고, 상기 일반식(1), (4) 및 (5)에 있어서 R체가 바람직하다.
원료로 이용하는 광학활성 알콜은 대응하는 케톤의 부제환원, 리파제에 의한 분할 등을 포함하는 부제반응에 의하여 공지된 방법으로 임의로 합성할 수 있으나, 분할법(resolution method)은 원하는 입체가 아닌 알콜 또는 그 에스테르를 버려야만 하는 등의 문제가 있고, 원료를 전부 이용할 수 있는 케톤의 부제환원으로 합성하는 것이 바람직하다. 또한, 구조가 단순한 지방족 케톤에 대하여도 카보닐기를 환원하고 비교적 높은 광학순도로 광학활성 알콜을 합성하는 능력을 가지는 단백질 또는 전기 단백질을 암호화하는 DNA 발현시킨 미생물 또는 형질전환체 세포 등을 작용시키는 합성방법이 보다 바람직하다.
상기 일반식(2)으로 표시되는 광학활성 알콜을 술포닐옥시기로 변환하는 방법으로는, 수산기의 술포닐화를 예로 들 수 있다.
수산기의 술포닐화법의 예로서는, 메탄술포닐클로라이드, 메탄술포닐산무수물 등의 메탄술포닐화제; p-톨루엔술포닐클로라이드, p-톨루엔술포닐산무수물 등의 p-톨루엔술포닐화제; p-톨루엔술포닐플루오로메탄술폰산 무수물 등의 트리플레이트화제(trifluoromethanesulfonylation agent); 등을 이용하는 방법을 들 수 있다.
바람직한 술포닐옥시기의 예로서는, 메탄술포닐기, p-톨루엔술포닐기, 니트로벤젠술포닐기, 클로로메탄술포닐옥시기, 트리플루오로메탄술포닐기를 들 수 있고, 보다 바람직하게는 저렴한 가격에 도입할 수 있는 메탄술포닐기 또는 p-톨루엔술포닐기이다.
상기 반응에 있어서 이용되는 술포닐화제의 양은, 기질에 대하여 1 내지 10당량, 바람직하게는 1 내지 2당량이다.
이용되는 용매의 예로는, 에틸에테르, 프로필에테르, 부틸메틸에테르, 테트라히드로푸란 등의 에테르계 용매; 디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄, 클로로벤젠 등의 할로겐계 용매; 초산에틸, 초산부틸 등의 에스테르계 용매; 헥산, 벤젠, 톨루엔 등의 탄화수소계 용매; 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등의 아미드계 용매; 아세토니트릴 등의 니트릴계 용매; 등을 들 수 있다. 이들로부터 선택된 복수개의 용매를 임의의 비율로 혼합하여 이용하여도 무방하다. 바람직한 용매의 예로서는, 저렴한 가격으로 회수도 용이한 디클로로메탄, 초산에틸, 톨루엔을 들 수 있다.
또한, 용매의 이용량으로는, 임의의 양의 용매를 이용할 수 있으나, 통상은 원료기질에 대하여 2 내지 50배의 체적량, 바람직하게는 3 내지 10배의 체적량을 이용한다.
상기 반응에 있어서, 염기를 공존시키는 것이 바람직하다. 이용되는 염기의 예로는, 트리에틸아민과 피리딘 등의 유기염기; 수산화나트륨, 탄산칼륨, 탄산수소나트륨 등의 무기염기를 들 수 있고, 바람직하게는 유기염기이고, 보다 바람직하게는 트리에틸아민, 피리딘이다.
이용하는 염기의 당량은 통상적으로 부산물로 생성되는 산을 중화하기 위하여 필요한 양이고, 기질에 대하여 1 내지 10당량, 바람직하게는 1 내지 2당량이나, 염기를 용매로 이용하여도 무방하다.
반응온도는 통상 -20 내지 100℃이고, 도입하는 이탈기 및/또는 반응조건에 의하여 최적점은 다르다. 특히 바람직한 메탄술포닐기 또는 p-톨루엔술포닐기의 경우, 바람직하게는 0 내지 40℃이다.
반응시간은 임의로 설정할 수 있으나, 10시간 이내에서 수행하는 것이 제조비용을 낮추는 관점에서도 바람직하다.
상기 반응에 이용된 일반식(9)에서 표시된 탄소구핵제(carbon nucleophile)의 예로는, 말론산에스테르, 말론산, 말로노니트릴, 말론산모노에스테르, 시아노초산(cyanoacetic acid), 시아노초산에스테르, 멜드럼산(meldrum acid)을 들 수 있고, 바람직하게는 말론산에스테르, 말로노니트릴, 시아노초산에스테르이고, 보다 바람직하게는 공업적으로 저렴한 가격 그리고 가수분해가 용이한 말론산에스테르이다.
전기 에스테르의 알콜성분으로는, 반응에 악영향을 주지 않는 기라면 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 메틸알콜, 에틸알콜, 이소프로필알콜, n-부틸알콜, 시클로헥실알콜(cyclohexanol) 등의 직쇄상, 분지상 또는 환상의 알킬알콜; 페놀, 나프톨 등의 아릴알콜이고, 보다 바람직하게는 메틸알콜 또는 에틸알콜이다.
이용되는 탄소구핵제의 양은 통상 기질에 대하여 1 내지 10당량이나, 같은 탄소구핵제에 2분자의 기질이 반응한 디알킬체(dialkyl form)의 생성을 억제하기 위하여, 기질보다 과잉으로 사용하는 것이 바람직하고, 기질에 대하여 1 내지 3당량, 보다 바람직하게는 1.2 내지 2.0당량을 사용한다.
상기 반응에 있어서, 이용되는 염기의 예로는, 수소화 나트륨, 수소화 리튬 등의 수소화 금속화합물; 리튬디이소프로필아미드, 칼륨헥사메틸디실아자이드(potassium hexamethyldisilazide) 등의 유기금속화합물; 나트륨, 칼륨, 리튬 등의 알칼리금속; 칼슘, 마그네슘 등의 알칼리토류금속; 나트륨메톡시드, 나트륨에톡시드, 칼륨t-부톡시드 등의 금속알콕시드; 수산화나트륨, 탄소칼륨 등의 무기염기; 등을 들 수 있고, 바람직하게는 수소화금속화합물, 알칼리금속 및 금속알콕시드이고, 보다 바람직하게는 수소화나트륨, 나트륨 및 나트륨메톡시드이다.
이용하는 염기의 당량은, 기질에 대하여 1 내지 10당량, 바람직하게는 1 내지 3이다.
이용되는 용매의 예로는, 부틸메틸에테르, 테트라히드로푸란 1, 2-디메톡시에탄, 디옥산 등의 에테르계 용매; 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로벤젠 등의 할로겐계 용매; 메탄올, 에탄올, 이소프로판올 등의 알콜계 용매; 헥산, 톨루엔 등의 탄화수소계 용매; 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등의 아미드계 용매; 디메틸술폭시드; 등을 들 수 있다. 이들로부터 선택되는 복수개의 용매를 임의의 비율로 혼합하여 이용하여도 무방하다. 바람직한 용매의 예로서는, 메탄올, 에탄올, 디메틸포름아미드, 테트라히드로푸란, 톨루엔을 들 수 있고, 보다 바람직하게는, 고극성으로 원활히 반응이 진행되고 추출된 때에 수층과 분액가능하고 혼입하여도 다음 공정에서 문제가 되지 않는 테트라히드로푸란을 들 수 있다.
또한, 용매의 이용량은 임의의 양을 이용할 수 있고, 통상은 원료기질에 대하여 0.5 내지 20배의 체적량이나, 원활히 반응이 진행되는 것이라면, 보다 적은 편이 반응속도를 높이므로 바람직하게 1 내지 8배의 체적량, 보다 바람직하게는 2 내지 4배의 체적량을 이용한다.
반응온도는, 통상 0 내지 100℃이고, 이탈기, 탄소구핵제의 종류나 반응조건에 의하여 최적점은 다르다. 라세미화 억제를 위하여, 반응시간이 지나치게 길지 않은 범위에서 낮은 온도가 바람직하고, 특히 바람직한 메탄술포닐기 또는 p-톨루엔술포닐기를 가지는 상기 일반식(3)과 말론산에스테르와의 반응의 경우, 반응온도는 30 내지 100℃가 바람직하고, 50 내지 80℃가 보다 바람직하다.
반응시간은, 이탈기, 탄소구핵제의 종류나 반응조건에 크게 의존하나, 10시간 이내에 실시되는 것이 제조비용을 낮추는 관점에서도 바람직하다. 단, 반응시간을 단축하기 위하여 고온 등의 과격한 반응조건을 이용하면 생성물의 광학순도가 저하되므로, 반응시간, 온도, 용매 등의 적절한 조건을 선택할 필요가 있다.
상기 반응으로 수득된 일반식(4)로 표시되는 광학활성 화합물은 상기 일반식(1)로 표시되는 광학활성 1-메틸알킬말론산으로 변환시키는 경우, 정제하지 않고 반응용액인 채로 이용할 수도 있으나, 증류 및/또는 추출 등의 방법으로 정제하는 것이 보다 고순도의 광학활성 1-메틸알킬말론산을 수득할 수 있으므로 바람직하다.
광학활성 1-메틸알킬말론산으로 변환하는 방법의 예로는 산처리, 알칼리 처리 등으로 에스테르기 및/또는 시아노기를 카복실기로 변환시키는 방법 등을 들 수 있고, 시아노기를 에스테르기로 변환한 후 가수분해를 하는 등의 단계적 방법으로 시행하여도 좋으나, 함수용매(hydrated solvent) 중에서 하나의 단계로 수행하는 것이 공정수를 삭감할 수 있어 바람직하다.
상기 반응으로 이용되는 시약의 예로는, 황산, 염산 등의 광산; 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼륨 등의 무기염기; 1, 8-디아자비시클로〔5. 4. 0〕-7-운데센, 나트륨메톡시드 등의 유기염기; 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 공업적으로 저렴한 가격으로 이용할 수 있는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 황산, 염산이다.
이용되는 용매의 예로는 프로필에테르, 테트라히드로푸란, 1, 2-디메톡시에탄, 디옥산 등의 에테르계 용매; 디클로로메탄, 디클로로에탄, 클로로벤젠 등의 할로겐계 용매; 메탄올, 에탄올, 에틸글리콜 등의 알콜계 용매; 헥산, 톨루엔 등의 탄화수소계 용매; 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등의 아미드계 용매; 포름산, 초산 등의 유기산계 용매; 디메틸술폭시드; 물; 등을 들 수 있다. 이들로부터 선택되는 복수개의 용매를 임의의 비율로 혼합하여 이용하여도 무방하고, 물과 혼화하는 용매의 예로서는, 테트라히드로푸란, 메탄올, 에탄올 초산을 들 수 있고, 보다 바람직하게는 물이다.
또한, 용매의 이용량으로는, 임의의 양의 용매를 이용할 수 있으나, 통상은 원료기질에 대하여 1 내지 20배의 체적량, 바람직하게는 2 내지 8배의 체적량을 이용한다.
상기 일반식(1)로 표시되는 광학활성 1-메틸알킬말론산은 결정성이 좋은 화합물이고, 광학순도가 충분하지 않은 경우에는 결정화(crystallization)에 의하여 광학순도를 높이는 것이 바람직하다. 결정화 후의 광학순도는, 바람직하게는 90%ee 이상이고, 특히 의약원료 또는 중간체로 이용하는 경우, 높은 광학순도가 요구되므로, 보다 바람직하게는 95%ee 이상, 특히 바람직하게는 99%ee 이상이다.
결정화에는 추출액 등의 용액에서 결정을 석출시키는 통상의 결정법 이외에, 농축, 냉각, 용매첨가 등의 조작에 의하여 한번 석출된 결정을 용매첨가, 과열 등에 의하여 용해시키고, 이로부터 결정을 석출시키는 재결정, 생성된 결정을 용매로 세척하는 세척법 등의 방법이 포함된다.
이용된 용매의 예로는, 프로필에테르, 메틸부틸에테르, 테트라히드로푸란, 1, 2-디메톡시에탄, 디옥산 등의 에테르계 용매; 디클로로메탄, 클로로포름, 디클로로에탄, 클로로벤젠 등의 할로겐계 용매; 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 에틸렌글리콜 등의 알콜계 용매; 초산에틸, 초산부틸 등의 에스테르계 용매; 아세토니트릴, 프로피오니트릴 등의 니트릴계 용매; 헥산, 헵탄, 벤젠, 톨루엔, 크실렌 등의 탄화수소계 용매; 디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈 등의 아미드계 용매; 디메틸술폭시드; 물; 등을 들 수 있다. 이들로부터 선택되는 복수개의 용매를 임의의 비율로 혼합하여 이용하여도 무방하다. 바람직하게는, 저렴한 가격의, 결정의 건조도 용이한 프로필에테르, 헥산, 헵탄, 벤젠, 톨루엔, 초산에틸이고, 보다 바람직하게는 인화점(flash point)이 비교적 높고 공업적으로 다루기 쉬운 헵탄, 톨루엔, 크실렌, 초산에틸이고, 특히 바람직하게는 목적물의 용해도가 적당한 범위이고 혼입하는 불순물의 용해도가 비교적 높고 단일용매로 결정을 석출시킬 수 있는 톨루엔이다.
또한, 용매는 임의의 양을 이용할 수 있고, 통상은 원료기질에 대하여 1 내지 20배의 체적량이나, 용매량은 결정화의 스케일이나 용매비용에 관련되므로 결정화의 목적을 달성할 수 있는 범위에서 될 수 있는 한 적은 편이 좋고, 바람직하게는 1 내지 20배의 체적량, 보다 바람직하게는 1 내지 10배의 체적량을 이용한다.
4. 광학활성 1- 메틸알킬말론산
본 발명의 광학활성 1-메틸알킬말론산은 하기 일반식(1)로 표시되는 화합물이다:
Figure 112006063947436-PCT00024
상기 일반식(1)에 있어서, R1은 탄소수 3 내지 5의 n-프로필기, n-부틸기, n-펜틸기, 이소프로필기, 이소부틸기, 이소아밀기, 시클로펜틸기 등의 직쇄상, 분지상 또는 환상의 알킬기이다. 이들 중, n-프로필기, n-부틸기, n-펜틸기, 이소프로필기, 이소부틸기가 바람직하고, n-프로필기 또는 n-부틸기가 보다 바람직하다.
또한, *는 부제탄소를 나타내고, R체 및 S체 중 어느 것이라도 무방하고, 바람직하게는 R체이고, 그 광학순도는 통상 80%ee 이상, 바람직하게는 90%ee 이상이고, 특히 의약원료 또는 중간체로서 이용하는 경우, 높은 광학순도가 요구되므로, 보다 바람직하게는 95%ee 이상, 특히 바람직하게는 99%ee 이상이다.
본 발명을 이하의 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명하겠으나, 본 발명의 범위는 이하의 실시예의 기재에 의하여 한정되지 않는다.
실시예 A: 미생물을 이용한 광학활성을 가지는 알콜의 제조
(1) 2-펜탄온으로부터 (S)-2-펜탄올을 생성하는 미생물 및 2-헥산온으로부터 (S)-2-헥산올을 생성하는 미생물의 단리
효모추출물(Difco사제) 5g/L, 폴리펩톤(일본제약사제) 5g/L, 맥아 엑기스(Difco사제) 3g/L, 글루코스(일본식품가공사제) 20g/L으로 구성된 액체배지 2.5mL에, 표 1에 기재된 각종 균주를 접종하고, 30℃에서 24에서 72시간 호기적으로 배양하였다. 수득된 각 배양액에서 1mL씩 배양액을 수득하여 원심분리에 의하여 균체를 모았다. 이 균체에 트리스염산 완충용액(pH 7.0)을 0.04mL, 탈염수를 0.028mL 가하여, 균체를 충분히 현탁시킨 후, 글루코스 100g/L을 0.05mL, NADP+(오 리엔탈효모사제) 12g/L을 0.02mL 가하고, 추가로 반응기질로 2-펜탄온 또는 2-헥산온을 이소프로판올에 100g/L가 되도록 용해시킨 용액을 0.01mL 가하고, 30℃에서 20시간 반응시켰다.
반응종료 후의 반응액을 초산에틸로 추출하고, 생성된 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 정량하였다. 생성물의 정량은, 초산에틸 추출액을 아래와 같은 조건의 가스크로마토그래피(GC)를 이용하여 측정하였다:
컬럼: β-DEX120(SUPELCO사제, 30m × 0.25mmID, 0.25㎛ film)
캐리어: He 1.5ml/min, split 1/50
컬럼온도: (S)-2-펜탄올의 정량시는 50℃, (S)-2-헥산올의 정량은 65℃
주입온도: 250℃
검출: FID 250℃
GC: 시마쯔 GC-14A
(S)-2-펜탄올의 정량결과를 표 1에, (S)-2-헥산올의 정량결과를 표 2에 각각 나타내었다.
2-펜탄온으로부터 (S)-2-펜탄올을 생성하는 효모
균 주 생성물의 농도 (g/L) 생성물의 광학순도 (% e.e.)
Brettanomyces bruxellensis NBRC 0629 1.07 100 s
Brettanomyces bruxellensis NBRC 0797 1.18 100 s
Candida tropicalis NBRC 0006 1.17 100 s
Candida zeylanoides CBS 6408 1.36 100 s
Candida zeylanoides JCM 1627 1.45 100 s
Hortaea werneckii NBRC 4875 1.34 100 s
Lodderomyces elongisporus NBRC 1676 1.25 100 s
Pichia segobiensis JCM 10740 1.16 100 s
Pichia spartinae JCM 10741 1.48 100 s
2-펜탄온으로부터 (S)-2-펜탄올을 생성하는 세균
균 주 생성물의 농도 (g/L) 생성물의광학순도 (% e.e.)
Arthrobacter globiformis NBRC 12137 1.36 99.1 s
Arthrobacter oxydans DSM 20120 1.25 100 s
Arthrobacter polychromogenes DSM 342 2.36 100 s
Curtobacterium flaccumfaciens ATCC 12813 1.94 99.7 s
Geobacillus stearothermophilus NBRC 12550 1.54 100 s
Geobacillus stearothermophilus IAM 11002 1.39 100 s
Geobacillus stearothermophilus IAM 11004 1.48 100 s
Geobacillus stearothermophilus IAM 12043 1.06 100 s
Microbacterium testaceum JCM 1353 1.2 100 s
Ochrobactrum anthropi ATCC 49237 Ochrobactrum sp. 1.47 100 s
(Pseudomonas ovalis) NBRC 12950 Ochrobactrum sp. 1.02 100 s
(Pseudomonas ovalis) NBRC 12952 Ochrobactrum sp. 1.49 100 s
(Pseudomonas ovalis) NBRC 12953 1.57 100 s
Rhizobium radiobacter IAM 12048 1.1 100 s
2-헥산온으로부터 (S)-2-헥산올을 생성하는 효모
균 주 생성물의 농도 (g/L) 생성물의 광학순도 (% e.e.)
Brettanomyces anomalus NBRC 0627 1.23 100 s
Candida famata ATCC 10539 1.20 93.0 s
Candida krusei JCM 2284 0.68 100 s
Candida krusei JCM 2341 0.88 100 s
Candida krusei NBRC 1664 1.10 100 s
Candida maltosa NBRC 1977 1.48 100 s
Candida zeylanoides CBS 6408 1.51 100 s
Issatchenkia scutulata var.scutulata JCM 1828 1.07 91.8 s
Lodderomyces elongisporus NBRC 1676 1.58 100 s
Pichia angusta NBRC 1024 1.16 100 s
Pichia angusta NBRC 1071 0.94 100 s
Pichia cactophila JCM 1830 1.30 93.9 s
Pichia segobiensis JCM 10740 1.48 100 s
Pichia trehalophila JCM 3651 1.16 100 s
Rhodotorula minuta NBRC 0879 0.92 100 s
2-헥산온으로부터 (S)-2-헥산올을 생성하는 세균
균 주 생성물의 농도 (g/L) 생성물의 광학순도 (% e.e.)
Arthrobacter sp. DSM 20407 1.04 100 s
Arthrobacter sulfurous JCM 1338 Brevibacterium sulfureum 1.26 100 s
Brevibacterium butanicum ATCC 21196 1.12 100 s
Brevibacterium sulfureum JCM 1485 0.5 100 s
Curtobacterium flaccumfaciens ATCC 12813 1.29 100 s
Microbacterium keratanolyticum NBRC 13309 1.16 100 s
Microbacterium saperdae JCM 1352 1.25 100 s
Microbacterium sp. NBRC 15615 0.68 100 s
Ochrobactrum anthropi ATCC 49237 0.91 100 s
Ochrobactrum sp. Pseudomonas ovalis NBRC 12952 1.58 100 s
Ochrobactrum sp. Pseudomonas ovalis NBRC 12953 1.73 100 s
Pracoccus denitrificans NBRC 12442 1.91 100 s
Rhizobium radiobacter IAM 12048 0.91 100 s
Rhizobium radiobacter IAM 13129 0.79 99.3 s
Rhodococcus sp. ATCC 15960 (Corynebacterium hydrocarboclastum) 1.22 100 s
(2) 이사첸키아 스크툴라타 JCM1828주 유래 카보닐 환원효소의 단리
이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata) JCM1828주를 2L의 배지(글루코스 80g, 효모엑기스(Difco사제) 20g, 펩톤(극동제약제) 40g/L)에서 배양하고, 원심분리에 의하여 균체를 수득하였다. 수득된 습윤 균체 150g을 10mM 인산칼륨 완충용액(pH 7), 0.1mM DTT(이하에서는, 간단히 「완충용액」이라고 함)로 현탁하여, 다이노밀 KDL(신마로엔터프라이즈)로 파쇄시킨 후, 원심분리에 의하여 균체잔사(cell mass residue)를 제거하고, 무세포 추출액을 수득하였다. 이 무세포 추출액에 90g/L의 농도가 되도록 PEG6000을 가하여 4℃에서 1시간 정치시킨 후, 원심분리에 의하여 침전물을 제거하였다. 수득한 상등액으로부터, DEAE Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences사제)를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피, Butyl Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences사제)를 이용한 소수성 상호작용 크로마토그래피, MonoQ(Amersham Biosciences사제)를 이용한 음이온 교환 크로마토그래피 및 Superdex 200(Amersham Biosciences사제)를 이용한 겔여과 크로마토그래피 등을 통과시켜, 목적하는 카보닐 환원효소를 전기영동에 의해 단일밴드로 정제하였다.
정제 시, 카보닐 환원효소의 활성은 효소액을 포함하는 반응액(100mM Tris-HC1 pH 7.5, 0.32mM NADPH, 2mM 1-아세톡시-3-클로로-2-프로판올)을 37℃에서 반응시켜, NADPH의 소비량을 340nm의 흡광도의 감소로부터 산출하여 측정하였다. 흡광도의 측정에는 SPECTRAmax 190(Molecular Devices사제)를 이용하였다. 또한, 상기 반응에 있어서 1분간 1nmol의 NADPH를 소비하는 활성을 1U로 하였다.
이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타 JCM1828주 유래 카보닐환원효소의 정제결과를 표 3에 나타내었다.
정 제 단 계 총활성 (U) 총단백질량 (mg) 비활성 (U/mg) 정제배율 수율 (%)
무세포추출액 1360 16800 0.0810 1 100.0
PEG6000상등액 693 4680 0.148 1.83 51.0
DEAE Sepharose FF 857 266.0 3.22 39.8 63.0
Butyl Sepharose 4 FF 488 10.6 46.0 569 35.9
MonoQ 592 3.11 190 2351 43.5
Superdex200 348 1.038 335 4141 25.6
상기 표 3의 정제단계의 Superdex200 활성분획을 폴리아크릴아미드겔 전기영동(이하, 「SDS-PAGE」라 함)에 의하여 분석한 결과, 정제된 단백질은 거의 단일밴드이고, 그 분자량은 약 40,000Da이었다.
(3) IsADH1의 기질특이성
다양한 카보닐화합물에 대하여, 상기 (2)에서 정제한 카보닐 환원효소액을 포함하는 반응액(100mM Tris-HC1 pH 7.5, 0.32mM NADPH, 2mM 기질)을 제조하고, 37℃에서 반응시켰다. 반응액 중의 NADPH의 소비량을 34.nm의 흡광도에 의해 모니터링하여 각각의 화합물에 대한 카보닐 환원효소의 활성을 측정하였다. 흡광도의 측정에는 SPECTRAmax 190(Molecular Device사제)를 이용하였다. 1-아세톡시-3-클로로-2-프로판올에 대한 카보닐 환원효소의 활성을 100으로 하였을 경우, 각 기질화합물에 대한 카보닐 환원효소의 상대활성을 표 4에 나타내었다.
기 질 상대활성
1-아세톡시-3-클로로-2-프로판올 100
4-클로로-3-옥소낙산에틸 212
3-옥소낙산에틸 25.5
아세토인 -
디아세틸 -
2, 3-펜타디온 trace
피루빈산에틸 trace
3-메틸-2-옥소낙산에틸 trace
아세토페논 -
프로피오페논 trace
페녹시아세톤 -
3-프로피오닐피리딘 11.2
2, 2, 2-트리플루오로아세토페논 53.8
페닐피루빈산 12.2
벤조일초산에틸 trace
니코티노일초산에틸 20.7
p-히드록시벤즈알데히드 -
p-클로로벤즈알데히드 58.8
2-노르보나논(2-norbornanone) -
3-퀴누클리디논(3-quinuclidinone) trace
-: 활성이 검출되지 않음
trace: 활성이 조금 있음
(4) IsADH1 아미노산 서열의 분석
전기 (2)에서 수득된 상기 표 3의 정제단계의 Superdex200의 카보닐 환원효소를 포함하는 분획을 탈염, 농축 후, 에드만(Edman)법에 의하여 N말단 아미노산을 분석하여 18잔기의 N말단 아미노산 서열을 결정하고, 그 결과를 서열번호 4에 나타내었다.
또한, 정제한 카보닐 환원효소를, 라이실엔도펩티다제(lysyl endopeptidase)를 이용한 분해법(단백질 실험노트·하, 요도샤)에 의하여 분해하여 수득한 펩티드를 역상 HPLC(아머샴 바이오사이언스사제 μRPC C2/C18 PC3.2/3)를 이용하여, 펩티드를 분리, 수득하였다. 분리하여 수득한 펩티드 피크 1종을 에드만 분해법에 의하여 아미노산 서열을 분석하고, 아미노산 서열을 서열번호 5에 나타내었다.
(5) IsACH1을 암호화하는 DNA의 서열해석 및 형질전환체의 작제
이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata) JCM1828주를 전기 (2)에 개시한 배지에서 배양하고, 균체를 수득하였다.
균체에서 게놈 DNA를 DNeasy tissue kit(Qiagen사제)를 이용하여 추출, 정제하였다. 수득된 게놈 DNA에 기초하여 역전사효소 SuperScript II Reverse Transcriptase(인비트로겐사제)를 이용하여, 효소에 첨부된 프로토콜(protocol)에 따라 cDNA를 합성하였다.
전기 (4)에서 수득한 서열번호 4의 N말단 아미노산 서열에 기초하여 센스 디제너레이트(degenerate) 프라이머 및 서열번호 5 내부 아미노산 서열에 기초하여 안티센스 디제너레이트(degenerate) 프라이머의 합계 2종류를 합성하였다. 각각의 염기서열을 서열번호 6, 7에 나타내었다. 전기 2종의 프라이머를 이용하여, 이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata) JCM1828주의 cDNA에 대하여 디제너레이트(degenerate) PCR을 수행하였는 바, 약 350bp의 증폭단편이 확인되었다.
이 DNA단편을 아가로스겔 전기영동을 수행하여, 약 350bp의 단편밴드를 잘라내어 MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen사제)로 정제하여 회수하였다. 수득된 DNA단편을 pGEM-Teasy Vector(Promega사제)에 연결(ligation)하고, 대장균DH5α주(동양방사제)에 형질전환시켰다. 형질전환주를 암피실린(100μg/mL)을 포함하는 한천배지에서 생육시키고, 몇개의 콜로니를 이용하여 T7프라이머(Promega사제)와 SP6프라이머(Promega사제)를 이용한 콜로니 다이렉트 PCR을 수행하고 삽입단편의 사이즈를 확인하였다. 목적하는 DNA 단편이 삽입되어 있다고 여겨지는 콜로니를 100μg/mL 암피실린을 포함하는 LB배지에서 배양하고, QIAPrep Spin Mini Prep kit(Qiagen사제)로 플라스미드를 정제하였다.
정제한 플라스미드를 이용하여 삽입DNA의 염기서열을 다이 터미네이터법(dye terminator)으로 분석하였고, 결정된 염기서열을 서열번호 8로 나타내었다.
다음으로, 이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata) JCM1828주의 게놈 DNA에 기초하여, Molecular cloning에 기재된 방법에 따라 RACE 반응용의 cDNA를 합성하고, 전기 문헌에 기재된 방법으로 5'- 및 3'-RACE반응을 수행하였다. 반응에는 상기 염기서열에 기초하여 설계된 서열번호 9 및 10으로 나타내는 2종류의 유전자 특이적 프라이머를 이용하였다.
RACE반응에 의한 증폭유전자 단편의 서열을 분석한 결과로서, 본 카보닐 환원효소의 추정 cDNA서열을 서열번호 11에, 전기 DNA가 암호화하는 아미노산 서열을 서열번호 1에 각각 나타내었으며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 염기서열을 서열번호 2에 나타내었다.
이어, 상기 서열번호 11에 기재된 서열에 기초하여, 클로닝용 프라이머로 서열번호 12에 기재된 염기서열 및 서열번호 13에 기재된 염기서열을 합성하고, 상기 프라이머를 각 50pmol, dNTP 각 1000nmol, 이사첸키아 스크툴라타 변종 스크툴라타(Issatchenkia scutulata var. scutulata) JCM1828주의 cDNA 250ng, ExTaq DNA polymerase용 10×완충용액(다카라바이오사제) 10μL, ExTaq DNA polymerase 5U(다카라바이오사제)를 포함하는 100μL의 반응액을 이용하여, 변성(denaturation, 95℃, 1분), 연결(annealing, 58℃, 1분), 신장(extension, 72℃, 1분)을 30사이클을, PTC-200(MJ Research사제)을 이용하여 반복실시하였다. PCR반응액의 일부를 아가로스겔 전기영동에 의하여 분석한 결과, 특이적이라고 여겨지는 밴드를 검출할 수 있었다.
상기 반응액을 MinElute PCR Purification kit(Qiagen사제)로 정제하였다. 정제한 DNA 단편을 제한효소 EcoRI와 XbaI로 분해시키고, 아가로스겔 전기영동으로, 목적하는 밴드의 부분을 잘라내어, Qiagen Gel Extraction kit(Qiagen사제)로 정제 후 회수하였다. 수득된 DNA 단편을, EcoRI 및 XbaI로 분해한 pUC118과 Ligation high(동양방적사제)를 이용하여 연결(ligation)하고, 대장균 JM109주를 형질전환하였다.
형질전환체를 암피실린(50㎍/mL)을 포함하는 LB배지에서 배양하고, QIAPrepSpin Mini Prep kit(Qiagen사제)를 이용하여 플라스미드를 정제하고, 이를 pUCIsADH1라고 명명하였다.
플라스미드에 삽입한 DNA의 염기서열을 다이 터미네이터법으로 분석하였는 바, 삽입된 DNA 단편은 서열번호 2의 염기서열과 일치하였다.
(6) IsADH1을 암호화는 DNA에 의하여 형질전환된 대장균을 이용한 (S)-2-펜탄올의 합성
전기 (5)에서 수득된 형질전환체를 암피실린(50㎍/mL)을 포함하는 Circle Grow배지 100mL(BIO 101사제)에서 10회 연속 계대하여 30℃에서 30시간동안 배양하였다. 수득된 균체를 원심분리에 의하여 집균 후, 후술하는 방법에 의하여 2-펜탄온을 기질로 (S)-2-펜탄올을 합성하였다.
상기 균체 10g에 0.6g/L NADP+(오리엔탈효모사제) 20mg, 1M 트리스염산 완충용액(pH 7.0) 10mL, 100g/L 글루코스 40mL, 글루코스 디히드로게나제(천야제약사제, 76unit/mg) 20mg, 2-펜탄온(동경화성사제, Neat) 1g을 가한 후, 30℃에서 8시간 반응시켰다. 2M 탄산나트륨으로 반응시의 pH를 7.0로 유지시켰다. 반응종료 후의 반응액을 초산에틸 추출하고, 생성된 (S)-2-펜탄올을 정량하였다.
생성물의 정량은, 초산에틸용액을 아래와 같은 조건의 가스크로마토그래피(GC)를 이용하여 측정하였다:
컬럼: β-DEX120(SUPELCO사제, 30m×0.25mmID, 0.25㎛ film)
캐리어: He 1.5ml/min, split 1/50
컬럼온도: 50℃
주입온도: 250℃
검출: FID 250℃
GC: 시마쯔 GC-14A
그 결과, (S)-2-펜탄올의 수득량은 0.99g이고, 광학순도는>99.0%e.e.이었다.
(7) IsADH1을 암호화하는 DNA에 의하여 형질전환된 대장균을 이용한 (S)-2-헥산올의 합성
전기 (6)에서 수득된 형질전환체를 이용하여, 후술하는 방법에 의하여 2-헥산온을 기질로 (S)-2-헥산올을 합성하였다.
상기 균체 10g에 0.6g/L NADP+(오리엔탈효모사제) 20mg, 1M 트리스염산 완충용액(pH 7.0) 10mL, 100g/L 글루코스 40mL, 글루코스 디히드로게나제(천야제약사제, 76unit/mg) 20mg, 2-헥산온(동경화성사제, Neat) 1g을 가한 후 30℃에서 6시간 반응시켰다. 2M 탄산나트륨으로 반응시의 pH를 7.0로 유지시켰다. 반응종료 후의 반응액을 초산에틸 추출하고, 생성된 (S)-2-펜탄올을 정량하였다.
생성물의 정량은, 초산에틸용액을 아래와 같은 조건의 가스크로마토그래피(GC)를 이용하여 측정하였다:
컬럼: β-DEX120(SUPELCO사제, 30m×0.25mmID, 0.25㎛ film)
캐리어: He 1.5ml/min, split 1/50
컬럼온도: 65℃
주입온도: 250℃
검출: FID 250℃
GC: 시마쯔 GC-14A
그 결과, (S)-2-헥산올의 수량은 0.99g이고, 광학순도는>99.0%e.e.이었다.
(8) IsADH1을 암호화하는 DNA에 의하여 형질전환된 대장균을 이용한 (S)-2-펜탄올의 합성(스케일업)
전기 (6)에서 수득된 형질전환체를 이용하여, 후술하는 방법에 의하여 2-펜탄온을 기질로 (S)-2-펜탄올을 합성하였다.
상기 균체 140g(건조균체중량으로 약 42g에 해당)도 NADP+(오리엔탈효모사제) 84mg, 1M 트리스염산 완충용액(pH 7.0) 140mL, 글루코스 118mL, 글루코스 디히드로게나제(천야제약사제, 76unit/mg) 40mg, 2-펜탄온(동경화성사제, Neat) 28g을 첨가한 후, 탈염수(desalted water)를 가하여 반응용량을 1.4L로하고 30℃에서 16시간 반응시켰다. 2M 탄산나트륨으로 반응시의 pH를 7.0로 유지시켰다. 반응종료 후의 반응액을 초산에틸 추출하고, 생성된 (S)-2-펜탄올을 정량하였는 바, (S)-2-펜탄올의 수량은 17.2g이고, 광학순도는>99.0%e.e.였다.
(9) IsADH1을 암호화하는 DNA에 의하여 형질전환된 대장균을 이용한 (S)-2-헥산올의 합성(스케일업)
전기 (6)에서 수득된 형질전환체를 이용하여, 후술하는 방법에 의하여 2-헥산온을 기질로 (S)-2-헥산올을 합성하였다.
상기 균체 50g(건조균체중량으로 약 15g에 해당)도 NADP+(오리엔탈효모사제) 30mg, 1M 트리스염산 완충용액(pH 7.0) 50mL, 글루코스 54mL, 글루코스 디히드로게나제(천야제약사제, 76unit/mg) 20mg, 2-헥산온(동경화성사제, Neat) 15g을 가한 후, 탈염수를 가하여 반응용량을 500mL로 하고 30℃에서 7.5시간 반응시켰다. 2M 탄산나트륨으로 반응시의 pH를 7.0로 유지시켰다. 반응종료 후의 반응액을 초산에틸 추출하고, 생성된 (S)-2-펜탄올을 정량하였는 바, (S)-2-헥산올의 수량은 15.1g이고, 광학순도는>99.0%e.e.였다.
실시예 B: 화학합성에 의한 광학활성 카본산의 제조
실시예 1: (S)-2-메탄술포닐옥시펜탄의 합성
200ml의 삼구(three-neck) 플라스크에 (S)-2-펜탄올 4.14g(47.0mmol, 99.1%ee)와 트리에틸아민 9.8ml(71mmol), 디클로로메탄 41ml를 넣었다. 이 혼합액을 얼음속에서 냉각시키고 메탄술포닐클로라이드 4.36ml(56.4mmol)을 한방울씩 가하였다. 그런 다음, 30분간 교반한 후, 포화 염화암모늄수용액 40ml와 물 20ml를 가하고 반응을 정지시켰다. 혼합물을 디에틸에테르 80ml로 추출하고, 유기층을 포화 염화암모늄수용액 20ml와 포화식염수 20ml로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 제거하고, 조(S)-2-메탄설포닐옥시펜탄 8.5g을 수득하여, 정제하지 않고 이후의 반응에 이용하였다.
1H-NMR(400MHz, CDC13)δ0.95(t,J=7.2Hz, 3H), 1.42(d, J=6.3Hz, 3H), 1.34-1.50(m, 2H), 1.50-1.63(m, 1H), 1.67-1.77(m, 1H), 3.00(s, 3H), 4.77-4.86(m, 1H).
실시예 2: (R)-(1-메틸부틸)말론산디에틸의 합성
실시예 1에서 수득된 조(S)-2-메탄설포닐옥시펜탄 8.5g과 말론산디에틸 14.2g(88mmol), DMF 22ml를 200ml의 가지형 플라스크에 넣었다. 이 혼합액을 얼음속에서 냉각시키고 60% 수소화나트륨(유성) 3.5g(88mmol)을 가하였다. 그런 다음, 60℃에서 5시간, 80℃에서 3시간 반응시킨 후, 실온에서 포화 염화암모늄수용액 40ml를 가하고 반응을 정지시켰다. 혼합물을 초산에틸 100ml로 추출하고, 유기층을 포화 염화암모늄수용액 20ml, 물 20ml, 포화 식염수 20ml로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 제거하고, 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하고, (R)-(1-메틸부틸)말론산디에틸을 7.77g(무색 유상물질(oil), 33.8mmol, 수율 72%)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz, CDC13)δ0.89(t,J=6.9Hz, 3H), 0.98(d, J=6.6Hz, 3H), 1.27(t,J=7.1Hz, 6H), 1.15-1.46(m, 4H), 2.20-2.31(m, 1H), 3.22(d, J=8.1Hz, 1H), 4.19(q, J=7.1Hz, 4H).
실시예 3: (R)-(1-메틸부틸)말론산의 합성
실시예 2에서 수득된 (R)-(1-메틸부틸)말론산디에틸을 7.77g(33.5mmol)과 25% 수산화나트륨수용액 16.1g(100mmol), 에탄올 3.9ml, 물 15.4ml를 200ml의 가지형 플라스크에 넣었다. 이 혼합액을 60℃에서 5시간 반응시킨 후, 실온에서 진한 염산 91ml를 가하여 산성이 되게 하였다. 혼합액에 식염을 가하여 포화시킨 후, 초산에틸 100ml로 추출하였다. 수층을 초산에틸 50ml로 재추출하고 유기층을 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거한 후, 헥산 58ml와 초산에틸 5.8ml로 결정화하고, (R)-(1-메틸부틸)말론산을 4.73g(백색의 판상결정(platy crystal), 27.1mmol, 수율 81%)을 수득하였다. 키랄분석의 결과, 광학순도는 99.3%ee였다(Supelco, β-DEX120, inj. 300℃, FID250℃, Oven 130℃, 인젝션시 탈탄산하여 생기는 3-메틸헥산산을 분석).
1H-NMR(400MHz, CDC13)δ0.91(t,J=6.8Hz, 3H), 1.06(d, J=6.8Hz, 3H), 1.22-1.40(m, 2H), 1.40-1.58(m, 2H), 2.25-2.37(m, 1H), 3.37(d, J=7.6Hz, 1H), 10.67(brs, 2H).
실시예 4: (S)-2-메탄술포닐옥시헥산의 합성
300ml의 삼구(three-neck) 플라스크에 (S)-2-헥산올 6.3g(62mmol, 99.7%ee)와 트리에틸아민 13ml(93mmol), 초산에틸 126ml를 넣었다. 이 혼합액을 얼음속에서 냉각시키고 메탄술포닐클로라이드 5.7ml(74mmol)을 한방울씩 가하였다. 그런 다음, 30분간 교반한 후, 포화 염화암모늄수용액 40ml와 물 20ml를 첨가하고 반응을 정지시켜 수층을 분리하였다. 유기층을 포화 염화암모늄수용액 20ml와 포화식염수 20ml로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 제거하고, 조(S)-2-메탄설포닐옥시헥산 10.8g을 수득하고, 정제하지 않고 이후의 반응에 이용하였다.
1H-NMR(400MHz, CDC13)δ0.92(t,J=7.1Hz, 3H), 1.25-1.45(m, 4H), 1.42(d, J=6.3Hz, 3H), 1.55-1.65(m, 1H), 1.68-1.79(m, 1H), 3.00(s, 3H), 4.75-4.84(m, 1H).
실시예 5: (R)-(1-메틸펜틸)말론산디에틸의 합성
실시예 4에서 수득된 조(S)-2-메탄설포닐옥시헥산 10.8g과 말론산디에틸 19.2g(120mmol), DMF 32ml를 200ml의 가지형 플라스크에 넣었다. 이 혼합액을 얼음속에서 냉각시키고 60% 수소화나트륨(유성) 4.8g(120mmol)을 가하였다. 그런 다음, 60℃에서 1시간, 80℃에서 3시간 반응시킨 후, 실온에서 포화 염화암모늄수용액 50ml와 물 10ml를 가하고 반응을 정지시켰다. 혼합물을 초산에틸 100ml로 추출하고, 유기층을 물 30ml로 2회 그리고 포화식염수 30ml로 세정하고, 황산마그네슘으로 건조시켰다. 용매를 제거한 후, 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하고, (R)-(1-메틸펜틸)말론산디에틸을 12.0g(무색의 유상물질, 49mmol, 수율 82%)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz, CDC13)δ0.89(t,J=6.9Hz, 3H), 0.98(d, J=6.6Hz, 3H), 1.27(t,J=7.1Hz, 6H), 1.15-1.45(m, 6H), 2.17-2.29(m, 1H), 3.22(d, J=8.1Hz, 1H), 4.19(q, J=7.1Hz, 4H).
실시예 6: (R)-(1-메틸펜틸)말론산의 합성
실시예 5에서 수득된 (R)-(1-메틸펜틸)말론산디에틸을 11.7g(48mmol)과 25% 수산화나트륨수용액 23g(144mmol), 에탄올 5.9ml, 물 24ml를 100ml의 가지형 플라스크에 넣었다. 이 혼합액을 60℃에서 2시간 반응시킨 후, 실온에서 진한 염산 13ml를 첨가하여 산성으로 만들어졌다. 혼합액에 식염을 가하여 포화시킨 후, 초산에틸 120ml로 추출하였다. 수층을 초산에틸 40ml로 재추출하고, 유기층을 황산나트륨으로 건조시켰다. 용매를 제거한 후, 헥산 90ml와 초산에틸 18ml로 결정화하고, (R)-(1-메틸펜틸)말론산을 6.5g(백색의 주상결정(columnar crystal), 35mmol, 수율 72%)을 수득하였다.
1H-NMR(400MHz, CDC13)δ0.90(t,J=6.7Hz, 3H), 1.07(d, J=6.8Hz, 3H), 1.21-1.41(m, 5H), 1.46-1.56(m, 1H), 1.22-2.33(m, 1H), 3.39(d, J=7.3Hz, 1H).
실시예 7: (R)-3-메틸헥산산의 합성
실시예 3에서 수득된 (R)-(1-메틸펜틸)말론산 4.56g(26.2mmol)을 50ml의 가지형 플라스크에 넣어 180℃로 승온시켰다. 기체의 발생이 멈추고부터 추가로 10분간 교반하고 실온에서 냉각하였다. 수득된 조생성물을 감압증류하고, (R)-3-메틸헥산산(무색의 유상물질, 비점 77℃/3mmHg, 15.7mmol, 수율 60%)을 수득하였다. 키랄분석의 결과, 광학순도는 99.2%ee였다(Supelco, β-DEX120, inj. 250℃, FID250℃, Det. 250℃, Oven 130℃).
1H-NMR(400MHz, CDC13)δ0.90(t,J=7.1Hz, 3H), 0.96(d, J=6.6Hz, 3H), 1.16-1.44(m, 4H), 1.91-2.05(m, 1H), 2.15(dd, J=14.9, 8.1Hz, 1H), 2.35(dd, J=14.9, 5.8Hz, 1H), 11.00(brs, 1H)
실시예 8: (R)-3-메틸헵탄산의 합성
실시예 6에서 수득된 (R)-(1-메틸펜틸)말론산 3.00g(15.9mmol)을 20ml의 가지형 플라스크에 넣어 180℃로 승온시켰다. 기체의 발생이 멈추고부터 추가로 10분간 교반하고 실온에서 냉각하였다. 수득된 조생성물을 감압증류하고, (R)-3-메틸헵탄산(무색의 유상물질, 비점 86℃/4mmHg, 11.7mmol, 수율 74%)을 수득하였다. 키랄분석의 결과, 광학순도는 99.2%ee였다(Supelco, β-DEX120, inj. 250℃, FID250℃, Det. 250℃, Oven 130℃).
1H-NMR(400MHz, CDC13)δ0.89(t,J=6.8Hz, 3H), 0.97(d, J=6.8Hz, 3H), 1.17-1.39(m, 6H), 1.88-2.03(m, 1H), 2.14(dd, J=14.9, 8.1Hz, 1H), 2.35(dd, J=14.9, 5.9Hz, 1H), 11.36(brs, 1H)
실시예 9: (R)-3-메틸헥산의 합성(피리딘 용매)
질소분위기하에서, (R)-(1-메틸부틸)말론산 1.00g(5.8mmol), 피리딘 2ml를 15ml의 차단(stoppered) 시험관에 넣고 승온시켰다. 90℃에서 반응을 시작하여, 130℃까지 115분에 걸쳐서 승온시키고, 추가로 30분간 교반하고 실온에서 냉각시켰다. HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 100.0%이었다.
실시예 10: (R)-3-메틸헥산의 합성(DMSO 용매)
질소분위기하에서, (R)-(1-메틸부틸)말론산 2.00g(11.5mmol), DMSO 4ml를 15ml의 차단 시험관에 넣고 승온시켰다. 100℃에서부터 반응을 시작하여, 140℃까지 75분에 걸쳐서 승온시키고, 추가로 30분간 교반하고 실온에서 냉각하였다. HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 100.0%이었다.
실시예 11: (R)-3-메틸헥산의 합성(피리딘 첨가)
질소분위기하에서, (R)-(1-메틸부틸)말론산 2.00g(11.5mmol), 피리딘 182mg(2.3mmol)을 15ml의 차단 시험관에 넣고 승온시켰다. 100℃에서부터 반응을 시작하여, 150℃까지 95분에 걸쳐서 승온시키고, 추가로 15분간 교반하고 실온에서 냉각하였다. HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 100.0%이었다.
실시예 12: (R)-3-메틸헥산의 합성(DABCO 첨가)
질소분위기하에서, (R)-(1-메틸부틸)말론산 2.00g(11.5mmol), 1, 4-디아자비시클로〔2. 2. 2〕옥탄(DABCO) 258mg(2.3mmol)을 15ml의 차단 시험관에 넣고 승온시켰다. 100℃에서부터 반응을 시작하여, 140℃까지 95분에 걸쳐서 승온시키고, 추가로 15분간 교반하고 실온에서 냉각하였다. HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 100.0%이었다.
실시예 13: (R)-3-메틸헥산의 합성(DBU 첨가)
질소분위기하에서, (R)-(1-메틸부틸)말론산 2.00g(11.5mmol), 1, 8-디아자비시클로〔5. 4. 0〕-7-운데센(DBU) 350mg(2.3mmol)을 15ml의 차단 시험관에 넣고 승온시켰다. 100℃에서부터 반응을 시작하여, 140℃까지 50분에 걸쳐서 승온시키고, 추가로 20분간 교반하고 실온에서 냉각하였다. HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 100.0%이었다.
실시예 14: (R)-3-메틸헥산의 합성(무수초산촉매·피리딘 용매)
질소분위기하에서, (R)-(1-메틸부틸)말론산 1.00g(5.8mmol), 피리딘 2mg을 15ml을 15ml의 차단 시험관에 넣고, 무수초산 294mg(2.88mmol)을 첨가하였다. 실온에서 2시간, 40℃에서 1시간 교반하고 실온에서 냉각하였다. HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 99.8%이었다.
실시예 15: (R)-3-메틸헥산의 합성(황산 첨가)
질소분위기하에서, (R)-(1-메틸부틸)말론산 2.00g(11.5mmol), 황산 113mg (1.15mmol)을 15ml의 차단 시험관에 넣고 승온시켰다. 130℃에서부터 반응을 시작하여, 180℃까지 100분에 걸쳐서 승온시키고, 추가로 20분간 교반하고 실온에서 냉각하였다. HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 100.0%이었다.
실시예 16: (R)-3-메틸헥산의 합성(Fe3O4 첨가)
질소분위기하에서, (R)-(1-메틸부틸)말론산 2.00g(11.5mmol), 산화철(Fe3O4 첨가) 40mg(2wt%)을 15ml의 차단 시험관에 넣고 승온시켰다. 130℃에서부터 반응을 시작하여, 180℃까지 100분에 걸쳐서 승온시키고, 추가로 20분간 교반하고 실온에서 냉각하였다. HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 100.0%이었다.
실시예 17: (R)-3-메틸헥산의 합성(산화동(I) 첨가)
질소분위기하에서, (R)-(1-메틸부틸)말론산 2.00g(11.5mmol), 산화동(I) 82.8mg(0.58mmol), 아세토니트릴 20ml를 100ml의 플라스크에 넣어 가온환류시켰다. 6시간 반응한 후, 실온에서 냉각시키고, HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 64.3%이었다.
실시예 18: (R)-3-메틸헥산의 합성(첨가제 없음)
질소분위기하에서, (R)-(1-메틸부틸)말론산 3.00g(17.2mmol)을 가지형 플라스크에 넣어 승온시켰다. 130℃에서부터 반응을 시작하여, 180℃까지 75분에 걸쳐서 승온시키고, 추가로 15분간 교반하고 실온에서 냉각하였다. HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 100.0%이었다.
상술한 실시예 9 내지 18의 결과를, 이하 표 5에 나타내었다.
실시예 첨가제 양 용매 양 반응온도/℃ 시간 전화율
9 - - 피리딘 2VR 90 내지 130 2.4h 100%
10 - - DMSO 2VR 100 내지 140 1.6h 100%
11 피리딘 0.2MR - - 100 내지 150 1.8h 100%
12 DABCO 0.2MR - - 100 내지 140 1.6h 100%
13 DBU 0.2MR - - 100 내지 140 1.2h 100%
14 Ac2O 0.5MR 피리딘 2VR rt 내지 40 3h 100%
15 H2SO4 0.1MR - - 130 내지 180 2h 100%
16 Fe3O4 2wt% - - 130 내지 180 2h 100%
17 Cu2O 0.05MR CH3CN 10VR 80 6h 64%
18 - - - - 130 내지 180 1.5h 100%
실시예 19: (S)-2-메탄술포닐옥시펜탄의 합성
2L의 분별 플라스크(separable flask)에 (S)-2-펜탄올 100g(1.13mol, 100%ee)를 함유하는 초산에틸 용액 417g과 트리에틸아민 149g(1.47mol)을 넣었다. 이 용액을 5℃로 냉각시키고, 메탄술포닐클로라이드 156ml(1.36mol)을 한방울씩 가하였다. 그런 다음, 실온에서 1시간 교반하고, 물 440g을 가하여 반응을 정지시켰다. 수층을 제거하고 유기층에 10% 식염수 267g을 가한 후, 5% 탄산수소나트륨수용액으로 수층의 pH를 중성으로 만들었다. 수층을 제거하여 용매를 제거한 후, 톨루엔 첨가, 농축을 2회 반복하여 조(S)-2-메탄설포닐옥시펜탄 191g(담갈색 유상물질, 화학순도 93.5%, 1.07mol, 수율 94.6%)을 수득하였다.
실시예 20: (R)-(1-메틸부틸)말론산디에틸의 합성
4000ml의 분별 플라스크에 60% 수소화나트륨(유성) 71.7g(1.79mol), THF 605g을 넣었다. 말론산디에틸 287g(1.79mol), THF 28.4g을 25 내지 40℃에서 반응액에 한방울씩 가하고 THF 28.4g으로 세척하였다. 65 내지 70℃로 승온시킨 후, 조(S)-2-메탄설포닐옥시펜탄 266g(순도 80.1%, 1.28mol)과 THF 28.4g을 가하였다. 그런 다음, 환류하에서 6시간 반응시키고 실온에서 물 638ml를 가한 후, 진한 염산을 가하여 pH를 6 내지 7로 조정하였다. 수층을 제거한 후, 용매를 제거하여 조(R)-(1-메틸부틸)말론산디에틸을 443g(무색 유상물질, 순도 59.9%, 1.15mol, 수율 90.5%)을 수득하였다.
실시예 21: (R)-(1-메틸부틸)말론산의 합성
조(R)-(1-메틸부틸)말론산디에틸을 439g(순도 59.9%, 1.14mol)과 25% 수산화나트륨수용액 6650g(4.04mol), 물 797ml을 4000ml의 분별 플라스크에 넣었다. 이 혼합액을 65 내지 70℃에서 6시간 반응시킨 후 냉각하였다. 반응액을 일단 빼내고, 진한 염산 421g(4.05mol)을 플라스크에 넣은 후, 반응액을 한방울씩 가하였다. 혼합액의 pH는 1.1이었다. 혼합액을 초산에틸 717g로 추출하였다. 유기층을 0.26M 염산 532ml로 세정하고 용매를 제거한 후, 톨루엔으로 치환하였다. 톨루엔 974g으로 결정화하고, (R)-(1-메틸부틸)말론산을 170g(백색의 판상결정, 순도 95.3%, 0.931mmol, 수율 81.7%)을 수득하였다. 키랄분석의 결과, 광학순도는 99.7%ee였다.
실시예 22: (R)-3-메틸헥산산의 합성
질소분위기하에서, 피리딘 89g을 1L의 가지형 플라스크에 넣어, 110℃에서 승온하고, (R)-(1-메틸부틸)말론산 140g(766mmol, 순도 95.4%fmf 피리딘 147g에 용해시킨 용액을 5시간 걸려 한방울씩 가하였다. 또한, 1시간 교반하고 냉각시킨 후, (R)-3-메틸헥산산의 피리딘 용액 329g을 수득하였다. HPLC로 분석하였는 바, 전화율은 100%, 수율은 정량적이었다.
반응에서 수득한 (R)-3-메틸헥산산 169g(1.29mmol)을 포함하는 피리딘 용액 754g을 약 50Torr로 감압증류하여 피리딘을 제거하고, 조(R)-3-메틸헥산산을 197g 수득하였다. 이 조(R)-3-메틸헥산산을 152g(무색 유상물질, 1.17mol, 수율 90%, 순도 99.3%)을 수득하였다. 키랄분석의 결과, 광학순도는 99.5%ee였다.
본 발명의 방법에 의하여, 의약, 농약 등의 중간체 원료로 산업상 유용한 화합물인 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 고광학순도 또는 고농도로 수득할 수 있다.
본 발명에 의하면, 저렴하고 고효율의 공업적 제조방법으로, 의농약 중간체로 유용한 광학활성 1-메틸알킬말론산 및 광학활성 3-메틸카본산을 높은 광학순도로 수득할 수 있다.
<110> API Corporation <120> A method for the production of optically active alcohols and carboxylic acids <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 345 <212> PRT <213> Issatchenkia scutulata <400> 1 Met Ser Asn Lys Thr Val Leu Val Thr Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala 1 5 10 15 Leu His Ile Ile Asp Asn Leu Leu Ser Lys Gly Tyr Ser Val Ile Gly 20 25 30 Thr Ala Arg Ser Gln Ser Lys Tyr Gln Pro Ile Leu Asp Ala Phe Lys 35 40 45 Lys Lys Tyr Pro Asp Ala Asn Leu Thr Phe Glu Val Val Pro Asp Ile 50 55 60 Ser Thr Glu Asn Ala Phe Asp Asp Val Leu Lys Lys His Pro Glu Ile 65 70 75 80 Thr Ala Val Leu His Thr Ala Ser Pro Phe Ser Phe Gly Leu Asn Lys 85 90 95 Asp Leu Lys Glu Ala Tyr Leu Lys Pro Ala Val Asp Gly Thr Leu Asn 100 105 110 Ile Leu Lys Ala Ile Glu Lys Tyr Ala Pro Gln Val Thr Lys Val Val 115 120 125 Ile Thr Ser Ser Tyr Ala Ala Ile Met Thr Gly Asn Pro Ser His Val 130 135 140 His Thr Ser Glu Thr Trp Asn Pro Ile Asn Trp Glu Asn Asp Val Lys 145 150 155 160 Asn Glu Tyr Phe Ala Tyr Ile Ala Ser Lys Thr Tyr Ala Glu Lys Ala 165 170 175 Ala Arg Asp Phe Val Lys Glu His Lys Val Asn Phe Lys Leu Ala Thr 180 185 190 Val Asn Pro Pro Tyr Val Leu Gly Pro Gln Leu Phe Asp Phe Ser Val 195 200 205 Gly Pro Val Leu Asn Thr Ser Asn Gln Leu Ile Thr Asp Ala Thr Lys 210 215 220 Ile Asp Lys Asn Ser Thr Lys Pro Glu Leu Gly Thr Pro Ala Leu Ala 225 230 235 240 Val Asp Val Arg Asp Val Ala Ala Phe His Val Leu Pro Leu Glu Asp 245 250 255 Asp Lys Val Ala Ser Glu Arg Leu Phe Ile Val Ala Gly Pro Ala Val 260 265 270 Val Gln Thr Phe Leu Asn Ile Ile Asn Glu Asn Ile Pro Glu Leu Lys 275 280 285 Gly Lys Val Ala Leu Gly Asp Pro Ala Ser Glu Lys Glu Leu Ile Glu 290 295 300 Lys His Thr Asp Lys Tyr Asp Leu Thr Asn Leu His Asn Val Ile Gly 305 310 315 320 Lys Tyr Asp Phe Ile Pro Val Glu Lys Ser Val Val Asp Val Leu Glu 325 330 335 Gln Tyr Tyr Lys Ile Asn Lys Ile Asp 340 345 <210> 2 <211> 1038 <212> DNA <213> Issatchenkia scutulata <400> 2 atgtcgaaca aaacagttct agtcaccggg gctaccggtt ttattgcact acacatcatt 60 gataatttat tgtctaaggg ttattccgtt attggtacag ctagatccca atctaaatat 120 caaccaatcc ttgatgcttt caagaaaaaa taccctgatg caaatttgac ttttgaagtt 180 gtccctgaca tctccactga aaacgcattc gatgatgttt tgaagaagca tccagaaatt 240 actgctgtcc ttcacacagc atctccattc tcttttggtt tgaacaagga tctgaaggaa 300 gcatatttga agcctgccgt tgatggtact ttgaatattc tcaaggcaat tgagaagtat 360 gcaccacagg ttactaaagt tgttatcaca tcttcttatg ctgcaattat gacaggtaat 420 ccaagtcatg tccacaccag tgaaacctgg aacccaatta attgggaaaa cgatgtgaag 480 aatgaatact ttgcatatat tgcctccaag acgtatgctg aaaaagctgc gagagatttt 540 gtcaaggagc ataaggtcaa tttcaagtta gcaactgtta acccaccata cgttctgggt 600 ccacaattat ttgacttctc agttggtcca gtcttgaaca cttccaacca attgatcacg 660 gatgcgacta aaattgataa gaactctact aagccggaat taggtacacc agctttagca 720 gtcgatgtta gagatgttgc tgcgttccat gttttaccat tggaagatga taaagttgca 780 agtgaaagat tatttattgt tgctggtcca gcagttgttc aaacattctt aaacatcatc 840 aacgagaaca ttccagaact taaaggtaag gttgccctag gagatccagc ttcagagaag 900 gagttgattg aaaagcacac agataagtat gatttgacaa atcttcacaa cgttattggt 960 aaatatgatt tcattccagt tgaaaagtcc gttgtcgacg tcttagaaca atattacaaa 1020 atcaataaaa ttgattag 1038 <210> 3 <211> 344 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 Met Ser Asn Thr Val Leu Val Ser Gly Ala Ser Gly Phe Ile Ala Leu 1 5 10 15 His Ile Leu Ser Gln Leu Leu Lys Gln Asp Tyr Lys Val Ile Gly Thr 20 25 30 Val Arg Ser His Glu Lys Glu Ala Lys Leu Leu Arg Gln Phe Gln His 35 40 45 Asn Pro Asn Leu Thr Leu Glu Ile Val Pro Asp Ile Ser His Pro Asn 50 55 60 Ala Phe Asp Lys Val Leu Gln Lys Arg Gly Arg Glu Ile Arg Tyr Val 65 70 75 80 Leu His Thr Ala Ser Pro Phe His Tyr Asp Thr Thr Glu Tyr Glu Lys 85 90 95 Asp Leu Leu Ile Pro Ala Leu Glu Gly Thr Lys Asn Ile Leu Asn Ser 100 105 110 Ile Lys Lys Tyr Ala Ala Asp Thr Val Glu Arg Val Val Val Thr Ser 115 120 125 Ser Cys Thr Ala Ile Ile Thr Leu Ala Lys Met Asp Asp Pro Ser Val 130 135 140 Val Phe Thr Glu Glu Ser Trp Asn Glu Ala Thr Trp Glu Ser Cys Gln 145 150 155 160 Ile Asp Gly Ile Asn Ala Tyr Phe Ala Ser Lys Lys Phe Ala Glu Lys 165 170 175 Ala Ala Trp Glu Phe Thr Lys Glu Asn Glu Asp His Ile Lys Phe Lys 180 185 190 Leu Thr Thr Val Asn Pro Ser Leu Leu Phe Gly Pro Gln Leu Phe Asp 195 200 205 Glu Asp Val His Gly His Leu Asn Thr Ser Cys Glu Met Ile Asn Gly 210 215 220 Leu Ile His Thr Pro Val Asn Ala Ser Val Pro Asp Phe His Ser Ile 225 230 235 240 Phe Ile Asp Val Arg Asp Val Ala Leu Ala His Leu Tyr Ala Phe Gln 245 250 255 Lys Glu Asn Thr Ala Gly Lys Arg Leu Val Val Thr Asn Gly Lys Phe 260 265 270 Gly Asn Gln Asp Ile Leu Asp Ile Leu Asn Glu Asp Phe Pro Gln Leu 275 280 285 Arg Gly Leu Ile Pro Leu Gly Lys Pro Gly Thr Gly Asp Gln Val Ile 290 295 300 Asp Arg Gly Ser Thr Thr Asp Asn Ser Ala Thr Arg Lys Ile Leu Gly 305 310 315 320 Phe Glu Phe Arg Ser Leu His Glu Ser Val His Asp Thr Ala Ala Gln 325 330 335 Ile Leu Lys Lys Glu Asn Arg Leu 340 <210> 4 <211> 18 <212> PRT <213> Issatchenkia scutulata <400> 4 Arg Asn Lys Thr Val Leu Val Thr Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala Leu 1 5 10 15 Asp Ile <210> 5 <211> 15 <212> PRT <213> Issatchenkia scutulata <400> 5 Val Val Ile Thr Ser Ser Tyr Ala Ala Ile Met Thr Gly Asn Pro 1 5 10 15 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> n; inosine <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n; inosine <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> n; inosine <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n; inosine <400> 6 acnggnttya thgcnytnga yat 23 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> n; inosine <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> n; inosine <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> n; inosine <220> <221> misc_feature <222> (21) <223> n; inosine <400> 7 ggrttnccng tcatdatngc ngcrta 26 <210> 8 <211> 341 <212> DNA <213> Issatchenkia scutulata <400> 8 cattgataat ttattgtcta agggttattc cgttattggt acagctagat cccaatctaa 60 atatcaacca atccttgatg ctttcaagaa aaaataccct gatgcaaatt tgacttttga 120 agttgtccct gacatctcca ctgaaaacgc attcgatgat gttttgaaga agcatccaga 180 aattactgct gtccttcaca cagcatctcc attctctttt ggtttgaaca aggatctgaa 240 ggaagcatat ttgaagcctg ccgttgatgg tactttgaat attctcaagg caattgagaa 300 gtatgcacca caggttacta aagttgttat cacatcttct t 341 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 agggttattc cgttattggt acagctag 28 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 gagaatggag atgctgtgtg aaggacagca g 31 <210> 11 <211> 1212 <212> DNA <213> Issatchenkia scutulata <220> <221> CDS <222> (55)..(1089) <400> 11 tcatgacctg tccactgata gcatcatacc aaacatattc agtatattgt aaca 54 atg tcg aac aaa aca gtt cta gtc acc ggg gct acc ggt ttt att gca 102 Met Ser Asn Lys Thr Val Leu Val Thr Gly Ala Thr Gly Phe Ile Ala 1 5 10 15 cta cac atc att gat aat tta ttg tct aag ggt tat tcc gtt att ggt 150 Leu His Ile Ile Asp Asn Leu Leu Ser Lys Gly Tyr Ser Val Ile Gly 20 25 30 aca gct aga tcc caa tct aaa tat caa cca atc ctt gat gct ttc aag 198 Thr Ala Arg Ser Gln Ser Lys Tyr Gln Pro Ile Leu Asp Ala Phe Lys 35 40 45 aaa aaa tac cct gat gca aat ttg act ttt gaa gtt gtc cct gac atc 246 Lys Lys Tyr Pro Asp Ala Asn Leu Thr Phe Glu Val Val Pro Asp Ile 50 55 60 tcc act gaa aac gca ttc gat gat gtt ttg aag aag cat cca gaa att 294 Ser Thr Glu Asn Ala Phe Asp Asp Val Leu Lys Lys His Pro Glu Ile 65 70 75 80 act gct gtc ctt cac aca gca tct cca ttc tct ttt ggt ttg aac aag 342 Thr Ala Val Leu His Thr Ala Ser Pro Phe Ser Phe Gly Leu Asn Lys 85 90 95 gat ctg aag gaa gca tat ttg aag cct gcc gtt gat ggt act ttg aat 390 Asp Leu Lys Glu Ala Tyr Leu Lys Pro Ala Val Asp Gly Thr Leu Asn 100 105 110 att ctc aag gca att gag aag tat gca cca cag gtt act aaa gtt gtt 438 Ile Leu Lys Ala Ile Glu Lys Tyr Ala Pro Gln Val Thr Lys Val Val 115 120 125 atc aca tct tct tat gct gca att atg aca ggt aat cca agt cat gtc 486 Ile Thr Ser Ser Tyr Ala Ala Ile Met Thr Gly Asn Pro Ser His Val 130 135 140 cac acc agt gaa acc tgg aac cca att aat tgg gaa aac gat gtg aag 534 His Thr Ser Glu Thr Trp Asn Pro Ile Asn Trp Glu Asn Asp Val Lys 145 150 155 160 aat gaa tac ttt gca tat att gcc tcc aag acg tat gct gaa aaa gct 582 Asn Glu Tyr Phe Ala Tyr Ile Ala Ser Lys Thr Tyr Ala Glu Lys Ala 165 170 175 gcg aga gat ttt gtc aag gag cat aag gtc aat ttc aag tta gca act 630 Ala Arg Asp Phe Val Lys Glu His Lys Val Asn Phe Lys Leu Ala Thr 180 185 190 gtt aac cca cca tac gtt ctg ggt cca caa tta ttt gac ttc tca gtt 678 Val Asn Pro Pro Tyr Val Leu Gly Pro Gln Leu Phe Asp Phe Ser Val 195 200 205 ggt cca gtc ttg aac act tcc aac caa ttg atc acg gat gcg act aaa 726 Gly Pro Val Leu Asn Thr Ser Asn Gln Leu Ile Thr Asp Ala Thr Lys 210 215 220 att gat aag aac tct act aag ccg gaa tta ggt aca cca gct tta gca 774 Ile Asp Lys Asn Ser Thr Lys Pro Glu Leu Gly Thr Pro Ala Leu Ala 225 230 235 240 gtc gat gtt aga gat gtt gct gcg ttc cat gtt tta cca ttg gaa gat 822 Val Asp Val Arg Asp Val Ala Ala Phe His Val Leu Pro Leu Glu Asp 245 250 255 gat aaa gtt gca agt gaa aga tta ttt att gtt gct ggt cca gca gtt 870 Asp Lys Val Ala Ser Glu Arg Leu Phe Ile Val Ala Gly Pro Ala Val 260 265 270 gtt caa aca ttc tta aac atc atc aac gag aac att cca gaa ctt aaa 918 Val Gln Thr Phe Leu Asn Ile Ile Asn Glu Asn Ile Pro Glu Leu Lys 275 280 285 ggt aag gtt gcc cta gga gat cca gct tca gag aag gag ttg att gaa 966 Gly Lys Val Ala Leu Gly Asp Pro Ala Ser Glu Lys Glu Leu Ile Glu 290 295 300 aag cac aca gat aag tat gat ttg aca aat ctt cac aac gtt att ggt 1014 Lys His Thr Asp Lys Tyr Asp Leu Thr Asn Leu His Asn Val Ile Gly 305 310 315 320 aaa tat gat ttc att cca gtt gaa aag tcc gtt gtc gac gtc tta gaa 1062 Lys Tyr Asp Phe Ile Pro Val Glu Lys Ser Val Val Asp Val Leu Glu 325 330 335 caa tat tac aaa atc aat aaa att gat t agtttatata gaaaatttta 1110 Gln Tyr Tyr Lys Ile Asn Lys Ile Asp 340 345 tagctaaagg ccgaatcaac ttctttcttc ctcttcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1170 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1212 <210> 12 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 cggaattcat gtcgaacaaa acagttctag tcacc 35 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 gctctagatt aatcaatttt attgattttg taatattg 38

Claims (15)

  1. 미생물 또는 형질전환체 세포, 전기 미생물 또는 세포처리물, 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 2-펜탄온에 작용시켜, (S)-2-펜탄올을 제조하는 방법에 있어서, 전기 미생물 또는 형질전환체 세포가, 용매에 의한 전처리를 하지 않은 생균체를 2-펜탄온에 작용시켰을 때, 95% e.e. 이상의 광학순도를 가지는 (S)-2-펜탄올을 생성할 수 있고, 그 생산성이 1mg (S)-2-펜탄올/g 건조균체중량/시간 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 미생물 또는 형질전환체 세포, 전기 미생물 또는 세포처리물, 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 2-헥산온에 작용시켜, (S)-2-헥산올을 제조하는 방법에 있어서, 전기 미생물 또는 형질전환체 세포가, 용매에 의한 전처리를 하지 않은 생균체를 2-헥산온에 작용시켰을 때, 95% e.e. 이상의 광학순도를 가지는 (S)-2-헥산올을 생성할 수 있고, 그 생산성이 1mg (S)-2-헥산올/g 건조균체중량/시간 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 2-펜탄온 또는 2-헥산온에, 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 호르테아(Hortaea)속, 이사첸키아(Issatchenkia)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 피치아(Pichia)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 아트로박터(Arthrobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 크루토박테리움(Crutobacterium)속, 지오바실러스(Geobacillus)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 오크로박트럼(Ochrobactrum)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 로도코커스(Rhodococcus)속으로 구성된 군에서 선택된 미생물, 전기 미생물 처리물, 전기 미생물 배양액 및/또는 전기 미생물로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 작용시켜, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 고광학순도 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 제조방법.
  4. 2-펜탄온 또는 2-헥산온에, 브레타노마이세스(Brettanomyces)속, 캔디다(Candida)속, 호르테아(Hortaea)속, 이사첸키아(Issatchenkia)속, 로데로마이세스(Lodderomyces)속, 피치아(Pichia)속, 로도토룰라(Rhodotorula)속, 아트로박터(Arthrobacter)속, 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 크루토박테리움(Crutobacterium)속, 지오바실러스(Geobacillus)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속, 오크로박트럼(Ochrobactrum)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 리조비움(Rhizobium)속, 로도코커스(Rhodococcus)속으로 구성된 군에서 선택된 미 생물로부터 얻어진 카보닐 환원효소를 암호화하는 DNA를 발현시킨 형질전환체 세포, 전기 세포처리물, 전기 세포배양액 및/또는 전기 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 작용시켜, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 고광학순도 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 제조방법.
  5. 제 3항 또는 제 4항에 있어서,
    미생물이 브레타노마이세스 브룩셀렌시스(Brettanomyces bruxellensis), 브레타노마이세스 아노말러스(Brettanomyces anomalus), 캔디다 파마타(Candida famata), 캔디다 크루세이(Candida krusei), 캔디다 말토사(Candida maltosa), 캔디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 캔디다 제이라노이데스(Candida zeylanoides), 호르테아 워르네키(Hortaea werneckii), 이사첸키아 스크툴라타(Issatchenkia scutulata), 로데로마이세스 엘롱기스포러스(Lodderomyces elongisporus), 피치아 앙구스타(Pichia angusta), 피치아 벳세이(Pichia besseyi), 피치아 카토필라(Pichia cactophila), 피치아 세고비엔시스(Pichia segobiensis), 피치아 스파르티나(Pichia spartinae), 피치아 트레할로필라(Pichia trehalophila), 로도토룰라 미누타(Rhodotorula minuta), 아트로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 아트로박터 폴리크로모게네스(Arthrobacter polychromogenes), 아트로박터 속(Arthrobacter sp.), 아트로박터 설퍼로 스(Arthrobacter sulfurous), 브레비박테리움 부타니큠(Brevibacterium butanicum), 크루토박테리움 플라큠파시엔스(Curtobacterium flaccumfaciens), 지오바실러스 스테아로써모필러스(Geobacillus stearothermophilus), 마이크로박테리움 케라타놀리티큠(Microbacterium keratanolyticum), 마이크로박테리움 사페르데(Microbacterium saperdae), 마이크로박테리움 속(Microbacterium sp.), 마이크로박테리움 테스타세움(Microbacterium testaceum), 오크로박트럼 안트로피(Ochrobactrum anthropi), 오크로박트럼 속(Ochrobactrum sp.)(슈도모나스 오발리스(Pseudomonas ovalis)), 파라코커스 디니트리피컨스(Pracoccus denitrificans), 리조비움 라디오박터(Rhizobium radiobacter) 및 로도코커스 속(Rhodococcus sp.)(코리네박테리움 히드로카보클라스튬(Corynebacterium hydrocarboclastum))으로 구성된 군에서 선택된 미생물인 것을 특징으로 하는
    제조방법.
  6. 2-펜탄온 또는 2-헥산온에, 하기 (A) 내지 (F) 중 어느 하나의 DNA를 발현시킨 형질전환체 세포, 전기 세포처리물 및/또는 전기 세포배양액을 작용시키고, (S)-2-펜탄올 또는 (S)-헥산올을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 고광학순도 (S)-2-펜탄올 또는 (S)-2-헥산올의 제조방법:
    (A) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열을 가지는 단백질을 암호화하는 DNA;
    (B) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열에 있어서, 1개 내지 여러개의 아미 노산이 결실, 부가 또는 치환된 아미노산 서열을 가지고, 카보닐을 환원시켜 광학활성 알콜을 합성하는 단백질을 암호화하는 DNA;
    (C) 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열과 50% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 가지고, 카보닐을 환원시켜 광학활성 알콜을 합성하는 단백질을 암호화하는 DNA;
    (D) 서열번호 2에 기재된 염기서열을 가지는 DNA;
    (E) 서열번호 2에 기재된 염기서열에 있어서, 1개 내지 여러개의 염기가 결실, 부가 또는 치환된 염기서열을 가지고, 카보닐을 환원시켜 광학활성 알콜을 합성하는 단백질을 암호화하는 염기서열을 가지는 DNA; 및,
    (F) 서열번호 2에 기재된 염기서열 또는 그 상보서열과 엄격한 조건하에서 혼성화하는 염기서열을 가지고, 카보닐을 환원시켜 광학활성 알콜을 합성하는 단백질을 암호화하는 염기서열을 가지는 DNA.
  7. 하기 일반식(1)로 표시되는 광학활성을 가지는 (R) 또는 (S)-1-메틸알킬말론산을 고극성 용매 및/또는 탈탄산을 촉진하는 첨가제의 존재하에서 탈탄산시키는 것을 특징으로 하는, 하기 일반식(5)로 표시되는 (R) 또는 (S)-3-메틸카본산의 제조방법:
    Figure 112006063947436-PCT00025
    Figure 112006063947436-PCT00026
    상기 식에서,
    R1은 탄소수 3 내지 5의 알킬기이고; 및,
    *는 부제탄소이다.
  8. 하기 일반식(2)로 표시되는 광학활성 알콜을 술포닐화제(sulfonylation agent)와 반응시켜, 하기 일반식(3)으로 표시되는 광학활성 화합물을 수득한 후, 염기존재하에서, 하기 일반식(9)로 표시되는 탄소구핵제(carbon nucleophile)와 반응시켜, 하기 일반식(4)로 표시되는 광학활성 화합물로 제조한 후, 가수분해하는 것을 특징으로 하는, 하기 일반식(1)로 표시되는 (R) 또는 (S)-1-메틸알킬말론산의 제조방법:
    Figure 112006063947436-PCT00027
    Figure 112006063947436-PCT00028
    Figure 112006063947436-PCT00029
    Figure 112006063947436-PCT00030
    Figure 112006063947436-PCT00031
    상기 식에서,
    R1은 탄소수 3 내지 5의 알킬기이고;
    R2 및 R3는 각각 독립적으로, 에스테르기, 카르복실기 또는 시아
    노기이며(이 때, R2와 R3는 일체가 되어 환상구조를 형성
    하여도 무방하다);
    X는 술포닐옥시기이고; 및,
    *는 부제탄소이다.
  9. 하기 일반식(1)로 표시되는 광학순도가 90%e.e. 이상인 (R)-1-메틸알킬말론산 또는 (S)-1-메틸알킬말론산:
    Figure 112006063947436-PCT00032
    상기 식에서,
    R1은 탄소수 3 내지 5의 알킬기이고; 및,
    *는 부제탄소이다.
  10. 제 9항에 있어서,
    R1은 n-프로필기 또는 n-부틸기인 것을 특징으로 하는
    (R)-1-메틸알킬말론산 또는 (S)-1-메틸알킬말론산.
  11. 2-펜탄온과 반응하여 (S)-2-펜탄올을 생성하는 활성을 가지는 카보닐 환원효소를 함유하는 미생물 또는 형질전환체 세포로서, 용매에 의한 전처리를 하지 않은 생균체를 2-펜탄온에 작용시켰을 때, 95%e.e. 이상의 광학순도를 가지는 (S)-2-펜탄올을 생성할 수 있고, 그 생산성이 10mg (S)-2-펜탄올/g건조균체중량/시간 이상인 것을 특징으로 하는 상기 미생물 또는 형질전환체 세포, 전기 미생물 또는 세포처리물, 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포처리물 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포에서 수득된 카보닐 환원효소분획의 조정제물 또는 정제물을 2-펜탄온에 작용시켜, (S)-2-펜탄올로 변환하여 얻어진 (S)-2-펜탄올을 술포닐화제와 반응시켜, 하기 일반식 (6)으로 표시되는 광학활성체로 변환시키는 것을 포함하는, 일반식 (6)으로 표시되는 광학활성체의 제 조방법:
    Figure 112006063947436-PCT00033
    상기 식에서,
    R4는 n-프로필기이고; 및,
    X는 술포닐옥시기이다.
  12. 2-헥산온과 반응하여 (S)-2-헥산올을 생성하는 활성을 가지는 카보닐 환원효소를 함유하는 미생물 또는 형질전환체 세포로서, 용매에 의한 전처리를 하지 않는 생균체를 2-헥산온에 작용시켰을 때, 95%e.e. 이상의 광학순도를 가지는 (S)-2-헥산올을 생성할 수 있고, 그 생산성이 10mg (S)-2-헥산올/g건조균체중량/시간 이상인 것을 특징으로 하는 상기의 미생물 또는 형질전환체 세포, 전기 미생물 또는 세포처리물, 전기 미생물 또는 세포배양액 및/또는 전기 미생물 또는 세포로부터 얻어진 카보닐 환원효소 분획의 조정제물 또는 정제물을 2-헥산온에 작용시켜 (S)-2-헥산올로 변환하여 얻어진 (S)-2-헥산올을 술포닐화제와 반응시켜 하기 일반식(6)으로 표시되는 광학활성체로 변환시키는 것을 포함하는, 일반식(6)으로 표시되는 광학활성체의 제조방법:
    Figure 112006063947436-PCT00034
    상기 식에서,
    R4는 n-부틸기이고; 및,
    X는 술포닐옥시기이다.
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서,
    수득된 일반식(6)으로 표시되는 광학활성체를 염기존재하에서 하기 일
    반식(9)로 표시되는 탄소구핵제와 반응시켜, 하기 일반식(7)로 표시되
    는 광학활성 화합물로 변환하는 공정을 추가로 포함하는
    방법:
    Figure 112006063947436-PCT00035
    Figure 112006063947436-PCT00036
    상기 식에서,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로, 에스테르기, 카르복실기 또는 시아
    노기이고(이 때, R2와 R3는 일체가 되어 환상구조를 형성
    하여도 무방하다); 및,
    R4는 n-프로필기 또는 n-부틸기이다.
  14. 제 11항 또는 제 12항에 기재된 방법에 의하여 수득된 일반식(6)으로 표시되는 광학활성체를 염기존재하에서 하기 일반식(9)로 표시되는 탄소구핵제로 반응시켜, 하기 일반식(7)로 표시되는 광학활성 화합물로 변환시키고,
    수득된 광학활성 화합물을 가수분해하여, 하기 일반식(8)로 표시되는 (R)-1-메틸펜틸말론산의 제조방법:
    Figure 112006063947436-PCT00037
    Figure 112006063947436-PCT00038
    Figure 112006063947436-PCT00039
    상기 식에서,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로, 에스테르기, 카르복실기 또는 시아
    노기이고(이 때, R2와 R3는 일체가 되어 환상구조를 형성하
    여도 무방하다); 및,
    R4는 n-프로필기 또는 n-부틸기이다.
  15. 제 11항 또는 제 12항에 기재된 방법에 의하여 수득된 일반식(6)으로 표시되는 광학활성체를 염기존재하에서 하기 일반식(9)로 표시되는 탄소구핵제와 반응시켜 하기 일반식(7)로 표시되는 광학활성 화합물로 변환시키고,
    수득된 광학활성 화합물을 가수분해하여 하기 일반식(8)로 표시되는 (R)-1-메틸부틸말론산 또는 (R)-1-메틸펜틸말론산으로 변환시키며,
    수득된 (R)-1-메틸부틸말론산 또는 (R)-1-메틸펜틸말론산을 탈탄산시키는 것을 특징으로 하는, (R)-3-메틸헥산산 또는 (R)-3-메틸헵탄산의 제조방법:
    Figure 112006063947436-PCT00040
    Figure 112006063947436-PCT00041
    Figure 112006063947436-PCT00042
    상기 식에서,
    R2 및 R3는 각각 독립적으로, 에스테르기, 카르복실기 또는 시아
    노기이고(이 때, R2와 R3는 일체가 되어 환상구조를 형성
    하여도 무방하다); 및,
    R4는 n-프로필기 또는 n-부틸기이다.
KR1020067018010A 2004-02-04 2005-02-04 광학활성을 가지는 알콜 또는 카본산의 제조방법 KR20070013269A (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004027815 2004-02-04
JPJP-P-2004-00027815 2004-02-04
JPJP-P-2004-00147023 2004-04-13
JP2004147023 2004-04-13

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070013269A true KR20070013269A (ko) 2007-01-30

Family

ID=34840138

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067018010A KR20070013269A (ko) 2004-02-04 2005-02-04 광학활성을 가지는 알콜 또는 카본산의 제조방법

Country Status (7)

Country Link
US (2) US20080233621A1 (ko)
EP (3) EP1712630A4 (ko)
JP (2) JP4763462B2 (ko)
KR (1) KR20070013269A (ko)
CA (1) CA2555317A1 (ko)
SG (1) SG150495A1 (ko)
WO (1) WO2005075651A1 (ko)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009149591A (ja) * 2007-05-28 2009-07-09 Daikin Ind Ltd フルオロアルキルアルコールの製造方法
CN102803233B (zh) * 2009-06-22 2017-03-01 爱思开生物制药株式会社 制备氨基甲酸(r)‑1‑芳基‑2‑四唑基‑乙酯的方法
US8404461B2 (en) 2009-10-15 2013-03-26 SK Biopharmaceutical Co. Ltd. Method for preparation of carbamic acid (R)-1-aryl-2-tetrazolyl-ethyl ester
WO2012029819A1 (ja) 2010-08-31 2012-03-08 株式会社エーピーアイ コーポレーション 新規加水分解酵素タンパク質
DE102011108373A1 (de) * 2011-07-22 2013-01-24 Tyco Electronics Services Gmbh Anschlussleiste und Schilderrahmen
CN103114054B (zh) * 2012-12-31 2014-05-14 浙江工业大学 节杆菌zjb-09277及其在制备(s)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用
US10294461B2 (en) 2013-03-28 2019-05-21 Kaneka Corporation Modified carbonyl reducing enzyme and gene
WO2017002353A1 (ja) * 2015-06-30 2017-01-05 備前化成株式会社 化学的炭素鎖延長反応による長鎖不飽和脂肪酸の合成
US10062979B2 (en) * 2015-08-21 2018-08-28 Panduit Corp. Terminal block marker
CN111004742B (zh) * 2019-12-16 2021-11-05 浙江工业大学 具有二氯甲烷降解性能的微杆菌zy及其应用
CN113502302A (zh) * 2021-07-30 2021-10-15 江西科苑生物股份有限公司 一种（s）-2-氯-1-（3，4-二氟苯基）乙醇的生物合成方法

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2945204A (en) * 1957-06-05 1960-07-12 Western Electric Co Designation strips for apparatus
US4424627A (en) * 1980-08-04 1984-01-10 Tarbox John W Wiring harness construction means and method
JPS57183799A (en) 1981-04-17 1982-11-12 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Novel plasmid
EP0232776B1 (en) * 1986-01-24 1990-10-24 Toray Industries, Inc. 2,5,6,7-tetranor-4,8-inter-m-phenylene pgi2 derivatives
JPH075582B2 (ja) 1986-01-24 1995-01-25 東レ株式会社 ２，５，６，７−テトラノル−４，８−インタ−ｍ−フエニレンＰＧＩ▲下２▼誘導体
DE3615854A1 (de) * 1986-05-10 1987-11-12 Basf Ag Verfahren und mittel zur bekaempfung der fleckenminiermotte leucoptera scitella
JP2566977B2 (ja) * 1987-08-25 1996-12-25 日本カーバイド工業株式会社 ２，４，５−トリフルオロ安息香酸の製造方法
JP2701061B2 (ja) * 1988-12-23 1998-01-21 日本カーバイド工業株式会社 ２，４―ジフルオロ―５―クロロ安息香酸の製造方法
US5248820A (en) * 1989-02-21 1993-09-28 Pfizer Inc. Crystalline N-(S-3-methylheptanoyl)-D-gamma-glutamyl-glycyl-D-alanine, and processes and intermediates therefor
US5136020A (en) 1989-02-21 1992-08-04 Pfizer Inc. Crystalline n-(s-3-methylheptanoyl)-D-gamma-glutamyl-glycyl-D-alanine, and processes and intermediates therefor
JPH0395138A (ja) * 1989-09-07 1991-04-19 Nissan Chem Ind Ltd ３―メチルヘプタン酸の光学分割法
JPH03279348A (ja) * 1990-03-28 1991-12-10 Kyorin Pharmaceut Co Ltd ２，４，５―トリフルオロ―３―アルコキシ安息香酸の製造方法
US5533917A (en) * 1994-07-19 1996-07-09 Schmitz; David P. Cable coordinating apparatus and method
JP3874035B2 (ja) 1996-06-26 2007-01-31 三菱瓦斯化学株式会社 光学活性２級アルコールの製造法
US5822182A (en) * 1997-01-24 1998-10-13 Dell U.S.A. L.P. Flexible I/O port configuration and connector labeling scheme for computer chassis
RU2182908C2 (ru) * 1997-09-05 2002-05-27 Лид Кемикал Ко., Лтд. Стереоизомерные индольные соединения, способ их получения и их использование
JP4258788B2 (ja) 1997-10-31 2009-04-30 宏 樫原 光学活性ボロン化合物
AUPP663898A0 (en) 1998-10-22 1998-11-12 University Of Sydney, The Synthesis and uses of thiopentone enantiomers
DE10210382C1 (de) * 2002-03-08 2003-10-30 Krone Gmbh Zugriffsicherung für Verteilermodule
JP4213524B2 (ja) * 2003-04-17 2009-01-21 ダイセル化学工業株式会社 新規なカルボニル還元酵素、その酵素をコードするｄｎａを含むポリヌクレオチド、その製造方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法
JP4205496B2 (ja) * 2003-06-19 2009-01-07 三菱化学株式会社 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするｄｎａ、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
DE102004007029A1 (de) * 2004-02-12 2005-09-08 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur enantioselektiven Reduktion von Ketoverbindungen durch Enzyme
DE102004025901A1 (de) * 2004-05-27 2005-12-22 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Verfahren zur Herstellung optisch aktiver 3-Alkylcarbonsäuren
DE102004054533B4 (de) * 2004-11-05 2006-08-10 Adc Gmbh Verteileranschlussmodul
DE102004054534B4 (de) * 2004-11-05 2007-05-24 Adc Gmbh Verteileranschlußmodul
AU2007229834B2 (en) * 2006-03-22 2011-02-03 Adc Gmbh Intelligent patching identification system and method
US7740282B2 (en) * 2006-05-05 2010-06-22 Leviton Manufacturing Co., Inc. Port identification system and method

Also Published As

Publication number Publication date
EP2270178A2 (en) 2011-01-05
EP2278014A2 (en) 2011-01-26
EP2270178A3 (en) 2011-02-23
JPWO2005075651A1 (ja) 2007-10-11
EP2278014A3 (en) 2011-03-09
JP2010280712A (ja) 2010-12-16
CA2555317A1 (en) 2005-08-18
EP1712630A4 (en) 2008-04-16
WO2005075651A1 (ja) 2005-08-18
US20080233621A1 (en) 2008-09-25
EP1712630A1 (en) 2006-10-18
US20100221948A1 (en) 2010-09-02
SG150495A1 (en) 2009-03-30
JP4763462B2 (ja) 2011-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20070013269A (ko) 광학활성을 가지는 알콜 또는 카본산의 제조방법
Hanson et al. Preparation of (R)‐amines from racemic amines with an (S)‐amine transaminase from Bacillus megaterium
JP4757804B2 (ja) 新規カルボニル還元酵素、その遺伝子、およびその利用法
JP2002532099A (ja) ３，５−ジオキソカルボン酸、その塩およびそのエステルのｒ−選択還元法
JP6476110B2 (ja) Ｌ−リジン水酸化酵素およびそれを利用したヒドロキシ−ｌ−リジンの製造法およびヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の製造法
CN1322129C (zh) 新型羰基还原酶及其编码基因、以及利用它们制备光学活性醇的方法
WO2005073388A1 (ja) 光学活性１−置換—２—メチルピロリジンおよびその中間体の製造法
CN113528592B (zh) 酶催化的(2s,3r)-2-取代氨基甲基-3-羟基丁酸酯的合成方法
WO2007040238A1 (ja) 光学活性４－ヒドロキシ－１，２，３，４－テトラヒドロキノリン化合物の製法
EP2576803B1 (en) PREPARATION OF (3aS,7aR)-HEXAHYDROISOBENZOFURAN-1(3H)-ONE BY CATALYZED BIOLOGICAL RESOLUTION OF DIMETHYL CYCLOHEXANE-1,2-DICARBOXYLATE
WO2017022846A1 (ja) ピタバスタチンカルシウムの製造方法
EP2128258B1 (en) Novel amidase, gene for the same, vector, transformant, and method for production of optically active carboxylic acid amide and optically active carboxylic acid by using any one of those items
JP2005006552A (ja) 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードするｄｎａ、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
WO2004022764A9 (en) Use of malate dehydrogenase for nadh regeneration
WO2009066975A1 (en) A method for producing adipate ester
WO2007097336A1 (ja) （２ｒ，３ｒ）および（２ｓ，３ｓ）－３－フェニルイソセリン誘導体の製造法
JP5506658B2 (ja) 好熱性古細菌由来エステラーゼを用いた光学活性カルボン酸の製造方法
JPWO2003040382A1 (ja) 光学活性クロマン誘導体の製造法および中間体
JP2003339387A (ja) 新規カルボニル還元酵素及びこれをコードする遺伝子、ならびにこれらを利用した光学活性アルコールの製造方法
JP4000263B2 (ja) （３ｒ，５ｓ）−（ｅ）−７−［２−シクロプロピル−４−（４−フルオロフェニル）−キノリン−３−イル］−３，５−ジヒドロキシヘプト−６−エン酸エステル類の製造方法
JP2005027552A (ja) 新規な光学活性２−ヒドロキシメチル−３−アリールプロピオン酸の製造方法
JP2007274901A (ja) 光学活性プロパルギルアルコールの製造方法
JPWO2005044973A1 (ja) 新規アセトアセチルＣｏＡ還元酵素および光学活性アルコールの製造方法
JPWO2005005648A1 (ja) 新規な光学活性カルボン酸の製造法
JP2002209592A (ja) （ｓ）−４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの製造に有用な酵素をコードする遺伝子、その取得方法、およびこれを利用した光学活性アルコールの製造方法

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid