KR20070010041A - 금-결합성 단백질 및 그 용도 - Google Patents

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Abstract

항-금 항체 및 항-금 항체의 일부인 금-결합 측을 이용하는 단백질이 구성되어 있다. 이 단백질은 금과 특이적으로 결합할 수 있다. 이 단백질 또는 이러한 단백질을 함유하는 복합체 단백질은 표적 물질의 검출에 이용될 수 있다.

Description

금-결합성 단백질 및 그 용도{GOLD-BINDING PROTEIN AND USE THEREOF}
본 발명은 금-결합성 단백질, 금-결합성 단백질을 함유하는 복합 단백질 및 이들의 표적 물질 검출을 위한 용도에 관한 것이다.
근년의 반도체 미세가공기술의 향상에 따른 디바이스의 소형화에 의해, 반도체 산업은 현저하게 발전되어 왔다. 리소그래피로 대표되는 미세가공기술은 최근 수백 나노미터의 가공정밀도를 실현하고 있다. 상기 기술을 응용한 재료 및 디바이스는 많은 현장에서 활발하게 관여하고 있고, 광 통신, 전기 통신 등뿐만 아니라, 바이오 기술, 에너지 등의 폭넓은 분야에서 응용될 것으로 기대되고 있다. 그러나, 현재의 미세가공기술의 연장으로서 100 나노미터 이하의 규모에서의 가공을 고려한 경우, 기술적인 과제에 가해서, 가공에 내포되는 시간 및 비용을 포함해서 산업상 이용에 많은 과제가 남아 있다. 또한, 적용가능한 분야의 수의 증가에 따라서, 상기의 대체로서 새로운 정밀구조제작기술이 강하게 요망되고 있다.
이와 같은 상황하에서, 종래의 탑-다운(top-down) 가공 기술 대신에, 원자나 분자 레벨에서 제어된 소망의 구조와 특성을 만드는 버텀-업(bottom-up) 방식에 의한 신규 재료에 대한 연구 개발이 활발하게 진행되고 있다. 버텀-업 방식의 정밀구조제작기술의 일례로서는, 금속 표면상에 분자배열이 제어된 분자 디바이스의 개 발 등을 들 수 있고, 그와 같은 분자배열 제어 기술의 하나로서, 물질의 자기 조직화(self-assembly)를 이용하는 방법의 이용이 연구되어 왔다. 최근의 연구 예로서, 린드세이(Lindsay) 등(Science, 300: p 1413, 2003)은 그들 각각의 분자 말단에 티올기를 갖는 알칸티올 및 알칸디티올을 금 기판상에 배향시킨 자기 조직화 단일 막을 이용해서 분자 스위칭 기능을 검토하고 있다.
핵산 및 단백질로 대표되는 생체 분자는 그들의 기능을 발휘하기 위하여 원자 레벨에서의 제어하에 정밀한 구조를 구축하는 것이 알려져 있다. 그와 같은 생체분자의 특성을 이용해서, 생체 분자를 금속, 금속 산화물 또는 반도체의 기판상에 배치한 각종 디바이스에 생체 분자를 응용하는 것도 검토하에 있다. 이와 같은 디바이스의 개발의 제 1단계로서, 생체 분자를 기판상에 배치한 미소한 구조체를 제조하는 기술이 중요해진다. 예를 들면, 금 기판상에 데옥시리보핵산(DNA)의 고정화나, 각종 기능을 지닌 아미노산 서열을 갖는 펩타이드의 금 기판 위에의 고정화를 고려한 경우, DNA 또는 펩타이드는 화학적으로 합성하는 것이 가능하고, 또, 이들 물질의 말단을 티올기(-SH)로 화학적 수식(chemical modification)함으로써, S-Au 표면 흡착을 이용해서 금 기판상에 이들 물질을 배위시키는 것이 널리 알려져 있다. 이 사실을 이용해서, DNA 또는 펩타이드를 금 위에 고정화한 실험계 및 디바이스로의 전환에 대한 연구가 행해지고 있다.
한편, 효소, 항체 등의 기능을 지닌 단백질은 고분자량을 지닌다. 따라서, 이와 같은 고분자량을 지닌 화합물을 고차 구조를 형성하는 동시에 그들의 기능을 발휘하는 능력을 유지하도록 화학적으로 합성하는 것은 매우 곤란하다. 현재 각 종 연구가 행해지고 있지만, 대부분의 경우 소망의 기능과 고차구조를 겸비한 기능성 단백질은 아직 합성하지 못하고 있는 것이 현실정이다(Science, 300: p 1413, 2003). 기능성 단백질을 기판 재료에 고정화할 경우, 기판과의 결합에는 기판 쪽을 실란 커플링제로 대표되는 각종 표면처리제로 처리하고, 단백질 쪽에 상기 기판의 표면처리된 면과 결합할 수 있는 작용기를 도입하는 것이 일반적으로 행해지고 있다(Proteomics, 3: p 254, 2003). 그러나, 이와 같은 기능성 단백질에의 반응성 작용기의 도입은 화학적 수식에 의해서 행해지고 있는 것이 일반적이고, 비선택적으로 도입부위가 결정되고 있다. 그러므로, 기능성 단백질의 기능발현부위를 수식함으로써 기능하기 곤란한 형상으로 기판 상에 고정화되어, 얻어지는 활성이 저하할 가능성이 있는 것이 지적되고 있다.
유전공학적 수법에 의해 결합부위를 단백질에 도입해서 융합 단백질을 제작하는 것도 가능하다. 일례로서는, 저분자 화합물인 비오틴과 결합하는 것이 알려져 있는 (스트렙토)아비딘의 모든 부위 혹은 비오틴 결합부위를 소망의 단백질의 N-말단 또는 C-말단에 유전자공학적으로 도입하여, 그 소망의 단백질을 융합 단백질로서 발현시켜, 소망의 기판 표면에 배치한 비오틴을 통해 고정화시키는 방법이 알려져 있다.
또, 최근에는 다른 기술도 개시되어 있다. 이 경우, 펩타이드는 고정화용의 기판 재료와 결합할 수 있는 5개 이상의 아미노산으로 이루어져 있었다. 펩타이드는 소망의 단백질과 융합하여 융합 단백질을 제조하고, 기재("기판"이라고도 칭함: substrate)에 결합 및 고정화시키는 기술이 개시되어 있다. 벨처(Belcher) 등은 파지 디스플레이법에 의해 GaAs를 함유하는 어느 결정면을 특이적으로 인식시킬 수 있는 12개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 개시하고(Nature, 405: p 665, 2000), 생체 재료의 자기 조직화능을 이용한 디바이스의 연구의 새로운 가능성을 만들어내었다. 또한, 벨처(Belcher) 등은 다른 반도체(PbS, CdS)에 대한 7 내지 14개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드의 아미노산 서열을 개시하고 있다(WO 03/029432). 또, 브라운(Brown) 등은 14개의 잔기로 이루어진 아미노산 서열 단위를 지닌 반복구조를 갖는 펩타이드가 금에 대해서 친화성을 나타내는 몇 개의 아미노산 서열을 개시하고 있다(Nature Biotechnology 15: p269, 1997). 이제까지, 금속(Au, Pt, Pd, Ag), 금속산화물(SiO2, ZnO, Cr2O3, Fe2O3) 또는 반도체에 대한 친화성을 지닌 또 다른 다수의 펩타이드는 상기 파지 디스플레이법에 의해 얻어지고 있었다.
이와 같은 기판 재료에 대한 친화성을 지닌 펩타이드를 개재해서, 소망의 생체 분자를 기판상에 고정화함으로써, 생체분자간 또는 다른 물질에 대한 상호작용에 의해 자기조직화적으로 소망의 기능 및 형상을 주기적으로 지닌 구조체를 구축하는 것도 가능하다. 예를 들면, 상기 벨처(Belcher) 등은 ZnS 입자와 결합한 ZnS-친화성 펩타이드를 나타내는 M13 파지가 자기 조직화에 의해 배위됨으로써, 액정형상 필름을 제작하는 기술을 개시하고 있다(Science, 296: 892, 2002).
또, 상기와 같이, 유전자공학적으로 기판-결합성 부위를 융합한 소망의 기능성 단백질을 제작함으로써, 기능성 단백질이 기판상에 기능부위 이외의 소망의 부 위에 고정될 수 있도록 하는 것이 몇 가지 예로서 제시되어 있다. 그러나, 기판 재료에 대한 친화성을 지닌 펩타이드를 직접 혹은 수개의 아미노산으로 이루어진 링커를 개재해서 기능성 단백질 말단에 연쇄해서, 고상(예를 들어, 기판)에 결합시켜, 단백질의 고정화를 시도할 경우, 기능성 단백질의 활성 부위(예를 들면, 항체의 항원결합부위를 구성하는 몇 개의 아미노산 잔기)가 기판에 근접하고, 기판 표면으로부터의 어떠한 상호작용(예를 들어, 정전작용 등)을 받아 구조변화 등이 생겨, 충분히 소망의 기능을 발휘할 수 없는 염려가 있다. 또, 링커를 더욱 길게 설계한 경우에 있어서도, 링커로서의 펩타이드의 분자운동의 자유도가 높으면 기능성 부위에 근접하게 배치되어, 그 기능을 저해할 수도 있다.
상기의 문제점으로부터, 본 발명자들은 기능성 단백질 링커를 포함하는 기능성 고분자 재료를 고정화하는 기판-결합 부위가 고정화된 단백질의 소망의 활성을 저해하는 일 없이, 기판으로부터 일정 거리를 유지하는 스페이서로서 부여되는 구조 부분(발판 구조(scaffold))과 기판과 결합하는 부위를 지니는 것이 필요하다는 생각에 이르렀다.
이러한 발판 구조를 지닌 분자-인식 분자로서, 항체가 가장 잘 알려져 있다. 항체는 동물의 체액 중에 침입하는 이물의 표면상의 각종 구조를 특이적으로 인식해서 결합시키고, 이어서 그 면역계에 의해 무독성화시키는 자기방어기구에서 기능하는 단백질의 하나이다. 그 항체의 다양성(다양한 이물에 결합하기 위한 다른 아미노산 서열을 지닌 항체수)은 동물 개체당 107 내지 108 종으로 추정되고 있다. 그 구조는 2개의 장쇄와 2개의 단쇄를 지닌 폴리펩타이드 사슬로 형성되고, 긴 폴리펩타이드사슬(중쇄)과 짧은 폴리펩타이드 사슬(경쇄)을 각각 중쇄 및 경쇄라 칭한다.
이들 중쇄 및 경쇄는 각각 가변영역과 정상 영역을 지니고 있다. 경쇄는 1개의 가변영역(VL) 및 1개의 정상영역(CL)의 두 도메인으로 구성되는 폴리펩타이드 사슬인 한편, 중쇄는 1개의 가변영역(VH)과 3개의 정상영역(CH1 내지 CH3)의 네 도메인으로 구성되는 폴리펩타이드 사슬이다. 상기 각 도메인은 대략 110개의 아미노산으로 이루어져 통형상의 구조를 취하여, 역평행 방향으로 배치된 β시트들의 층형상 구조를 형성하고, 이 층형상 구조를 1개의 SS 결합에 의해 결합시켜, 매우 안정한 구조체를 형성하고 있다. 또, 항체의 다양한 항원종에의 결합은 상기 가변영역(VH 또는 VL)이 각각 지닌 3개의 상보적 결정 영역(complementarity determining region: CDR)의 아미노산 서열의 다양성에 기인하는 것이 알려져 있다. 상기 CDR은 VH에 대해 3개 그리고 VL에 대해 3개가 프레임 워크 영역에 의해 분리되어 배치되고, 대상으로 되는 인식부위의 작용기의 공간배치를 인식함으로써, 보다 고도의 특이적인 분자인식을 가능하게 하고 있다.
상기 CDR의 다양성은 골격간 세포가 항체 생산 세포로서의 B 림프구로 분화할 때에, 항체 유전자 자리에서 생기는 DNA 재편성에 기여된다. 중쇄에서는 VH 유전자 단편, D 유전자 단편 및 JH 유전자 단편으로 구성되는 부분, 경쇄에서는 Vλ 또는 Vκ유전자 단편 및 Jλ 또는 Jκ유전자 단편으로 구성되는 부분에서 DNA 재편성을 일으킴으로써 항체가 생기는 것이 알려져 있다. 이와 같은 DNA 재편성 은 B 세포마다 독립적으로 일어나므로 하나의 B 세포는 1종류의 항체밖에 생산하지 못한다. 그러나, 개체 내에 있어서의 B 세포 전체에서는 다양한 항체의 생산이 가능해진다.
상기와 같은 특정 물질에 결합하는 것이 가능한 항체는 종래 상기와 같이 동물이 지닌 면역계에 있어서의 항체 형성 기구를 이용해서 인위적으로 제작되어, 다양한 산업분야에서 이용되고 있다. 제작 방법의 일례로서는, 목적의 항원 물질을 애쥬번트(ajuvant)와 함께 피면역동물(예를 들어, 토끼, 염소 또는 마우스)에 일정 간격으로 면역시키고, 그 혈청 중에 존재하는 항체를 회수하는 방법이 있다. 이와 같이 해서 얻어진 항체는 면역에 이용한 항원 물질의 표면에는 다양한 구조를 인식하는 복수의 항체의 항체 혼합물이 있다. 이와 같이 하나의 항원에 결합하는 몇몇 개의 항체를 함유하는 혈청은 폴리클로날 항체라 불린다.
한편, 피면역 동물의 비장에는 목적의 항원과 결합하는 항체를 생산하는 다종의 B림프구가 존재하고 있다. 이와 같은 항체-형성 B 림프구를 확립된 종양세포와 융합하고, 이것에 의해 하이브리도마(hybridoma) 세포의 제작이 허용된다. 상기와 같이 1개의 B 림프구는 1종류의 항체를 산출하고, 1종류의 항체를 하이브리도마로서 산출하는 B 림프구를 계대배양할 수 있는 계가 확립되어 있다. 이와 같이 제작된 항체는 모노클로날 항체라 칭한다.
상기 항체의 구조를 고정(anchorage)으로서 이용한 분자인식구조체로서, 일본국 공개특허 평 05-055534호 공보에는 2개의 다른 항원을 인식하는 다중 결합성 항체 및 그것을 이용한 다중 막 형성방법이 개시되어 있다. 이 기술에 의하면, 제 1항원과 제 2항원을 인식하는 융합 항체를 얻는 것이 가능하다. 또, 기판 표면에 상기 제 1항원, 상기 융합 항체 및 상기 제 2항원을 순차 배치함으로써, 화학적 수식 없이도 다층막을 형성할 수 있다. 그러나, 개시되어 있는 융합 단백질을 얻기 위해서는 동물 세포를 이용할 필요가 있고, 비용면 및 작업 번잡성의 점에서 문제가 있다. 그 밖에, 다층막을 형성할 경우에는 기판 표면상에 미리 상기 융합 단백질에 의해 인식가능한 항체를 배치하는 공정을 설치해야만 한다.
상기 항체를 어떤 종류의 단백질 분해효소로 처리해서 얻어지는 항체 단편 Fab, Fab' 또는 F(ab')2는 친 항체(parent antibody)와 마찬가지의 항원에 대해서 결합능을 지니는 것이 알려져 있다.
마찬가지로, 상기 VH, VL 또는 그들의 복합체로서의 Fv에 대해서, 또는 상기 VH 또는 VL로 이루어진 복합체에 대해서도, 한쪽 영역의 카복시 말단과 다른 쪽 영역의 아미노말단을 수개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 통해서 연결한 1본쇄 Fv(single chain Fv: scFｖ) 등도 친항체와 마찬가지의 항원에 대해서 결합성을 나타내는 것이 알려져 있다.
스케라(Skerra) 및 베터(Better)는 유전공학적인 방법에 의해서 분비 시그널 서열을 N 말단에 부가한 Fab형과 Fv형 항체 단편이 대장균에 의한 항체 유전자의 발현으로서 생산되는 방법을 개시하고 있다(Science, 240: p. 1038, 1988; Science, 240: p. 1041, 1988). 또는, 일본국 공개특허 평 07-501451호 공보에서는 다가 항원-결합 항체 및 그 제조방법이 개시되어 있고, 일본국 공개특허 평 08- 504100호 공보에서는 다가 및 다중 결합 항체 및 그 제조방법이 개시되어 있다. 이 두 기술에 있어서, 결합성 단백질은 1개 이상의 항원에 결합하는 항체 가변 영역부(VH 및/또는 VL)를 함유하는 단백질인 것을 개시하고 있다. 일본국 특허 공표 평 07-501451호에서는 판카르시노마(pancarcinoma) 항원 TAG-72 및 플루오레세인을 각각 인식하는 결합 단백질과 이들 양쪽을 인식하는 이중특이성 항체의 구조 및 아미노산 서열, 나아가서는 이들을 부호화하는 염기서열이 개시되어 있다. 일본국 공개특허 평 08-504100호 공보에는 실시예에 있어서 공지의 단백질(세포막 단백질, 암항원 CEA, FcRY1 등) 또는 저분자 화합물에 대한 항체 단편 복합체로 이루어진 2가 및 이중 특이성 결합 단백질에 대해서 개시하고 있다.
그러나, 상기 개시된 기술에서는 무기 물질로 대표되는 기판 재료 표면을 직접적으로 인식하여 결합하는 결합 단백질에 관한 기술이 개시되어 있지 않다. 따라서, 상기 결합 단백질을 기판상에 배치한 구조체를 제작할 경우에는, 종래 공지의 방법, 예를 들면, 기판 또는 상기 결합 단백질을 화학적 수식하고, 공유결합에 의해 기판상에 배치하는 등의 방법에 의해서 배치해야만 한다. 마찬가지로, 결합 단백질을 금속이나 반도체 물질의 미립자에 결합시킬 때에도, 결합 대상인 미립자 또는 결합 단백질을 화학적으로 수식할 필요가 있었다. 이와 같은 화학적 수식은 단백질의 분자내에 다수 지닌 아미노 잔기나 카복실기를 표적으로 하는 경우가 많고, 그 반응에 관련된 부위는 비선택적이다. 그러므로, 소망의 활성을 발휘하는 부위도 기판-결합 또는 표지화 부위로 될 수도 있고, 그 결과로서, 단백질의 소망 의 활성을 저하시킬 수도 있다. 게다가, 이러한 문제는 마이크로디바이스화 기술뿐만 아니라, 바이오센서 등의 센싱 소자를 제작하는 데에도 일어나기 쉽다. 따라서, 항체 등의 표적 물질을 포착하는 분자를 그 포착 기능을 충분히 발휘시킬 수 있는 분자 배향성을 유지하면서 기판상에 고정화하는 것은 중요하다.
또, 상기 항체와 마찬가지의 발판 구조를 지닌 단백질에 다양한 분자 인식능을 부여하는 연구도 진행되고 있다. 그 예로는, 안티콜린(anticolin)(Review in Molecular Biotechnology, 74: p. 257, 2001) 및 피브로넥틴 타입 III 도메인(J. Mol. Biol, 284: p. 11411, 1998)이 포함된다. 안티콜린은 리포칼린을 기초로 해서 개변된 포착 단백질이다. 리포칼린은 160 내지 180개의 아미노 잔기로 이루어진 단백질로 저수용성 물질을 전송 및 저장하는 기능을 행하는 단백질이다. 구조에 관해서는, 리포칼린은 8개의 β시트로 구성된 경통 구조체이다. 리포칼린은 β시트를 연결하는 4개의 루프구조에 의해 대상물질을 인식하고 결합하는 것이 가능하다. 피브로넥틴은 일반적으로 100개 이하의 잔기의 아미노산으로 이루어진 단백질로, 세포외 매트릭스와 세포와의 접합이나 세포 접합에 있어서 중요한 역할을 담당한다. 상기 2개의 단백질과 마찬가지로, 피브로넥틴은 β시트 구조를 지니고 β시트간의 루프 구조에 의해 표적 물질을 인식하는 단백질이다. 상기 안티콜린 또는 피브로넥틴의 β시트 간의 루프구조에 랜덤한 아미노산 서열을 도입해서, 신규한 결합 단백질을 구축하는 것이 행해지고 있다. 이들 분자는 분자인식부위 이외에도 β시트로 이루어진 강고한 분자구조를 지니고 있으므로, 소망의 기능성 고분자 재료와의 융합에 의해, 기판을 특이적으로 인식하여, 결합함으로써 기 판상에 고분자 재료를 고정화하는 것이 가능하다. 또한, 상기 분자는 고정화된 고분자 재료의 소망의 활성을 저해하는 일없이, 기판으로부터 일정 거리를 확보하는 스페이서 기능도 겸하는 것도 기대된다. 그러나, 상기 항체로 대표되는 상기와 같은 구조적으로 안정한 발판구조를 지니는 분자인식 단백질에 있어서, 금속 또는 반도체 재료로 대표되는 무기 물질을 특이적으로 인식하여 결합하는 경우는 보고된 바 없었다.
한편, 각종 물질(표적 물질)의 검출 분야에 있어서는 , 표적 물질의 검출 및/또는 정량 등의 몇몇 방법은 특히 항원 및 항체와 같은 단백질, 및 당, 렉틴 및 핵산에 관해서 이제까지 확립되어 있다. 예를 들면, 표적 물질로서의 당이나 렉틴을 특이적으로 인식하여 결합하는 항체에 표지제를 결합함으로써, 표지제를 개재한 표적 물질의 검출 또는 정량이 가능해지는 것이 알려져 있다. 표지제로서는, 금 등의 금속 또는 라텍스 등의 유기 재료로 이루어진 미립자, 특정 파장역의 여기광에 의해서 형광을 발하는 형광물질, 또는 그 형광물질을 반응 산물로서 지니는 효소(예를 들면, HRP 등)를 이용하는 것이 일반적이다. 항체 등의 단백질을 표지화하는 방법으로서는 물리흡착에 의한 방법과 반응성 작용기를 표지제 혹은 피표지물질에 도입하여, 그것을 가교점으로서 이용해서 화학 결합을 형성하는 화학결합법을 들 수 있다.
이하, 검출에 이용되는 항체를 일례로 해서 종래 기술에 관해서 설명한다. 일본국 공고특허 제 03-108115호 공보에는 항체에 금 미립자를 물리적으로 흡착시킴으로써 항체를 금으로 표지하는 방법의 일례가 개시되어 있다. 이 방법에 의하 면, 미리 조정한 금 콜로이드 분산액에 모노클로날 항체를 가하여, 원심침강 처리해서 상청액을 제거하고, 얻어진 용액을 수회의 세정공정을 거쳐서 금으로 표지된 항체를 제조하는 것이 가능하다.
다음에, 항체를 화학결합법에 의해 표지하는 방법에 대해서 설명한다. 항체는 단백질의 아미노기 또는 SH기를 지닌다. 이들 기에 대해서 반응성을 지닌 작용기를 표지제측에 미리 제공해둠으로써, 형광물질 등의 표지제와 항체 등의 피표지물질과의 화학적인 결합이 가능해진다. 이 방법의 예로는, 아미노기와 반응하는 N-하이드록시숙신이미드기, 이소티오시아네이트기, 니트로아릴할라이드기 또는 산클로라이드기를 지닌 표지물질을 도입하는 방법을 포함한다. 단백질을 표지하기 위한 가교제로서 널리 이용되고 있는 N-하이드록시숙신이미드는 아미노기와 pH 7 이상의 환경하에서 효율적으로 반응하여, 매우 안정한 아미드결합을 형성하는 것이 알려져 있다(Biochemicstry, Vol. 11, pp. 2291, 1972). 단백질상의 α위치와 리신쪽 사슬의 ε위치의 아미노기들이 반응시 숙신이미드기에 의해 표적화될 수 있다. 특히, ε위치의 아미노기가 일반적인 숙신이미드의 표적으로 여겨지고 있다. 예를 들면, 금 미립자를 표지제로서 화학적으로 항체 등의 단백질에 결합시킬 경우, 먼저 금 미립자를 적어도 일단부에 SH기를 지니고, 다른쪽 단부에 전술한 단백질의 측쇄잔기와의 반응성이 높은 작용기를 지닌 화합물로 수식한다. 이어서, 단백질을 상기 반응성 작용기와 가교함으로써 이들을 결합시키는 것이 가능하다. 그러나, 이들 방법에서는 리신이나 유리(free) α-아미노기를 지닌 잔기가 비선택적으로 반응대상 물질로 되므로, 표지 대상으로 되는 항체 등의 단백질의 기 능을 저해할 염려가 있다. 또, 이소티오시아네이트기를 지닌 형광물질로서 FITC가 알려져 있으나, 숙신이미드와 마찬가지로 아미노기에 대한 비특이적인 반응에 의해 피표지 단백질의 소망의 특성이 저하될 수도 있다.
또는, -SH기를 가교점으로서 부여하는 것이 가능하다. SH기를 이용하는 방법은 말레이미드법과 피리딜디설파이드법으로 크게 나뉠 수 있다. 말레이미드법은 SH기와 선택적으로 반응하는 기로서 말레이미드를 지닌 가교제를 이용하는 방법으로, 온화한 조건에서 선택적인 가교가 가능한 것으로 알려져 있다. 예를 들면, 피결합대상이 항체인 경우, 항체 분자의 힌지부(hinge portion)의 디설파이드기를 개열시킨 SH기는 항원 인식부분과는 무관하므로, SH기를 수식해도 항체의 특이성이 손상되지 않을 것으로 기대된다. 이 SH기를 가교점으로 사용함으로써 소망의 기능을 해치는 일없이 표지제를 결합하는 것이 가능하다. 그러나, 항체는 전체 분자내에 16개의 SS 결합을 지니며, 그중에는 항원 인식부위로서 상보적 결정영역(CDR)을 지닌 중쇄가변영역(VH)과 경쇄가변영역(VL)의 구조를 유지하기 위한 SS결합도 포함되어 있다. 따라서, SS결합의 환원이 부위 특이적으로 행해지지 않으면, 그 기능을 해칠 수도 있다.
일본국 공고특허 평 04-070320호 공보에는 광범위한 각종 금속 이온과 높은 친화성을 지닌 킬레이트화 가능한 저분자량 단백질인 메탈로티오네인(metallothionein) 또는 그 단편(fragment)을 이용한 단백질 표지기술에 대해서 개시되어 있다. 이 공보의 명세서에 있어서는, 메탈로티오네인이 설프히드릴 부분에서 표지제로서의 금속이온과 결합하고, 아미노기, 수산기 또는 카복실기 등의 가교점으로서 부여되는 그 외의 작용기에서 항체 등과 결합되는 기술이 개시되어 있다. 메탈로티오네인 내에 있어서는 금속이온과의 결합부위와 피표지물질과의 결합부위가 구별되어서, 각각의 피결합물질이 결합하는 일이 가능하지만, 피표지물질의 결합부위는 다른 가교방법과 마찬가지로 일정치 않아, 전술한 바와 같은 문제점이 여전히 남아 있기 쉽다.
또, 상기와 같은 화학 가교에 의한 표지제에 고정화 방법에 의한 비선택적인 수식을 해결하는 수단으로서, 유전자공학에 의한 수식법을 들 수 있다. 유전공학적 수법에 의해 결합 부위를 단백질에 도입한 융합 단백질을 제작하는 것도 가능하다. 일례로서는 형광물질 등의 표지제의 말단에 저분자 화합물인 비오틴을 화학적으로 도입하여, 상기 비오틴과 결합하는 것이 알려져 있는 (스트렙트)아비틴의 전부 혹은 비오틴 결합부위를 소망의 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 유전자 공학적으로 도입하여, 융합 단백질로서 발현시키고, 상기 비오틴-아비딘 결합을 개재함으로써 표지물질에 결합시키는 방법이 알려져 있다. 이와 같이 형광물질과 같은 표지제에 저분자 화합물을 도입하고, 해당 저분자 화합물을 인식하여 결합할 수 있는 단백질을 목적의 단백질에 도입한 융합 단백질을 유전자공학적으로 제작하여, 선택적인 결합부위를 도입하는 것이 가능하다.
그러나, 상기 개시된 기술에서는 무기물질로 대표되는 기판 재료 표면이나 표지제를 분자선택적으로 인식하여 결합하는 결합 단백질에 관한 기술에 관해서는 개시되어 있지 않다. 그 때문에, 상기 결합 단백질 또는 복합 단백질을 기판상에 배치한 구조체를 제작하는 경우에는 종래 공지의 방법, 예를 들어, 기판 또는 상기 결합 단백질을 화학적 수식하여, 공유결합에 의해서 기판상에 배치하는 등의 방법에 의해서 배치해야만 한다. 또, 금속이나 반도체 물질의 미립자, 및 표지제에 결합 단백질을 결합시킬 때에도, 마찬가지로, 결합 대상인 미립자 또는 결합 단백질을 화학적으로 수식할 필요가 있었다. 이와 같은 화학적 수식은 단백질 분자 내에 다수개 함유된 아미노 잔기나 카복실기를 표적으로 하는 경우가 많고, 그 반응에 관련된 부위는 비선택적이다. 따라서, 소망의 활성을 발휘하는 부위도 기판-결합 또는 표지화 부위로 될 수 있고, 그 결과, 단백질의 소망의 활성을 저하시킬 수도 있다.
게다가, 이러한 문제는 마이크로디바이스화 기술뿐만 아니라, 바이오센서 등의 센싱 소자를 제작하는 데에도 일어나기 쉽다. 따라서, 항체 등의 표적 물질을 포착하는 분자를 그 포착 기능을 충분히 발휘시킬 수 있는 분자 배향성을 유지하면서 기판상에 고정화하는 것은 중요하다.
본 발명에 의한 금과 결합할 수 있는 단백질은, 금에 대해서 친화성(affinity)을 지니는 단백질로서, 금에 대한 항체의 적어도 일부를 함유하는 금-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일측면에 의하면,
(1) 금에 대해서 친화성을 가지는 단백질을 함유하는 제 1 도메인; 및
(2) 특정의 물질에 대한 결합 부위를 지닌 단백질을 함유하는 제 2 도메인을 포함하는 금-결합성 복합 단백질이 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면, 기재(substrate)와 단백질을 포함하고, 상기 기재가 표면의 적어도 일부에 금을 포함하고, 상기 단백질이 상기 구성을 지닌 금-결합성 복합 단백질인 것을 특징으로 하는 구조체가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 구성을 지닌 금-결합성 복합 단백질을 부호화하는 핵산이 제공된다. 본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 핵산을 포함하는 벡터가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면,
(1) 기재를 준비하는 공정;
(2) 금-결합성 복합 단백질을 생성하는 공정; 및
(3) 상기 기재에 상기 금-결합성 복합 단백질을 배치하는 공정
을 포함하는, 상기 구성을 지닌 구조체의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 상기 구성을 지닌 구조체를 형성하기 위한 기재 및 금-결합성 복합 단백질과, 상기 구조체에의 표적 물질의 결합을 검출하기 위한 검출 수단을 포함하는, 표적 물질의 검출용 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 측면에 의하면,
표적 물질에 결합하는 1개 이상의 부위와 표지제에 결합하는 1개 이상의 부위를 포함하고;
표적 물질에 결합하는 부위와 표지제에 결합하는 부위는 각각 독립적으로 피결합 물질과 결합하고;
상기 표지제에 결합하는 부위 및 상기 표적 물질에 결합하는 부위의 적어도 하나가 상기 구성을 지닌 단백질을 함유하는, 표지제에 의해 표적 물질을 표지하기 위한 접속 부재가 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 표지제를 상기 구성을 지닌 접속 부재를 개재해서 표적물질에 결합시키는 공정을 포함하는, 표적 물질을 표지 물질에 결합해서 표지화하여, 해당 표지제가 결합한 표적 물질을 검출하는 것에 의한 표적 물질의 검출 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 측면에 의하면, 표지제; 상기 구성을 지닌 접속 부재; 및 표적 물질에 접속 부재를 개입시켜 표지제를 결합한 상태를 검출하기 위한 검출 수단을 포함하는, 표적 물질의 검출용 키트가 제공된다.
본 발명에 의한 금-결합성 복합 단백질은 금-결합 부위와 구조체 부분을 포함한다. 따라서, 금-결합성 복합 단백질과 연결해서 결합하는 기능성 물질이 금 기재 표면에 고정화될 때에, 고정화는 기능성 물질의 본래의 기능에 영향을 미치지 않는다. 게다가, 고정화할 때에 아무런 시약도 이용하고 있지 않으므로, 기능성 물질은 그의 기능에 영향을 미치는 어떠한 화학 반응도 받지 않는다. 더욱이, 금 기재로부터의 거리를 유지함으로써, 기능성 물질이 그 기능에 영향을 미치는 기판으로부터 상호 작용을 받는 일도 없다.
또, 본 발명의 금-결합성 복합 단백질은 적어도 금과, 특정 물질에 대한 복수의 결합부위를 지닌다. 이것에 의해 적어도 (i) 표면의 적어도 일부에 금을 지닌 기재, (ii) 본 발명의 금-결합성 복합 단백질 및 (iii) 본 발명의 금-결합성 복합 단백질에 결합할 수 있는 특정의 물질로 구성되는 다층체를 형성하는 구조체로 하는 것이 가능하다. 이 경우, 본 발명에 의한 금-결합성 복합 단백질은 항체 가변 영역 도메인의 입체적으로 안정한 β시트 구조를 지니므로, 금 기재와 특정 물질 사이에 공간을 유지하는 것이 가능하며, 금 또 금 이외의 물질(예를 들어, 표지제)을 결합하는 금-결합성 단백질의 도메인(예를 들어, 제 2 도메인)이 금을 함유하는 기재로부터 어떠한 상호작용을 받는 일 없고, 결합능을 유지하는 것이 가능하다. 또, 이것에 의해 극히 박형의 미세한 다층구조체를 형성하는 것이 가능하다. 본 발명의 금-결합성 단백질에 의한 이들 특성을 이용해서, 검출장치를 얻는 것이 가능하다. 예를 들어, 얇은 금 층에 소망의 물질과 결합가능한 본 발명의 금-결합성 복합 단백질을 설치함으로써, 소망의 물질용의 센싱 소자로 하는 것이 가능하다. 그 검출방법으로서는, 광학적인 수단, 예를 들어, 표면 플라스몬 공명 등을 이용한 수단을 제공하는 것이 가능하다.
한편, 본 발명의 금-결합성 복합 단백질은, 금을 함유하는 물질을 표지제로 부여할 경우, 표적 물질에 금을 함유하는 표지제를 결합하기 위한 접속부재로서 이용할 수 있다. 접속부재로서의 이 형태에 의하면, 이하에 표시한 대표적인 효과를 얻을 수 있다.
제 1 효과로서, 금-결합성 단백질이 표적물질에 결합하는 부위와 표지제에 결합하는 부위를 각각 1개 이상 지니고, 각각의 결합 부위는 서로 독립적으로 피결합물질과 결합하는 것에 의해서, 종래의 표지방법에서 문제로 되고 있던 표지제를 결합함으로써 생기는 피표지물질의 표적물질에의 결합능의 저하가 보이지 않는, 표적물질을 표지가능한 우수한 접속부재를 제공하는 것이 가능하다. 제 2 효과로서, 접속 부재가 생체 고분자, 특히 단백질이고, 이것에 의해 단백질의 수개의 아미노 잔기와 표적물질 표면의 상호작용에 기인하는 높은 결합성이 기대된다. 제 3 효과로서, 접속부재는 항체 가변영역이고, 결합 부위가 고차 구조에 의해 규정된 입체 배치로 규정되기 때문에 높은 결합특이성이 기대된다. 제 4 효과로서, 표지제가 금을 함유하는 물질이어서, 시료에 대한 산란 광량의 측정뿐만 아니라, 증강 라만이나 국제 플라스몬의 원리를 응용한 광학적 측정에 가해서 그 전기특성을 이용한 전기측정도 가능하다. 제 5 효과로서, 본 발명에 관한 접속부재를 이용함으로써, 표적 물질/접속부재/표지제가 동시 또는 임의로 가해진 검출방법 및 검출 키트를 제공하는 것이 가능하다.
발명을 실시하기 위한 최량의 형태
이하, 본 발명에 의한 금-결합성 단백질, 그것을 이용한 복합 단백질 및 이들의 용도에 대해서 설명한다.
(1) 금-결합성 단백질
- 항체
본 발명의 금-결합성 단백질은 항체의 적어도 일부를 포함한다. 본 발명에 표시된 바와 같은 금과의 결합을 위해 이용되는 항체의 예로는 모든 척추동물의 림프계 세포에 의해 산출되는 금에 대한 친화성을 지니는 항체, 및 이들의 아미노산 서열에 있어서의 아미노산의 1개 또는 수개가 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 지니고, 그 구조 및 기능에 있어서 항체와 연관을 지니는, 즉 목적으로 하는 금에 대한 치환성을 유지하는 단백질이 포함된다. 항체는 그 특성(면역학적 또는 물리학적인)의 분류에 있어서, IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE로 분류되지만, 어떠한 분류의 항체라도 본 발명에 이용될 수 있다. 또한, 이들 항체는 다량체를 형성하고 있어도 된다. 예를 들어, IgA는 이량체를 형성하고, IgM은 오량체를 형성하지만, 금에 결합할 수 있는 형상이면 어떠한 문제도 없다. 또, 그 사용용도가 시험관내(in vitro)인 경우에는, 항체는 포유류에 제한되지 않고, IgW 및 IgY이어도 문제없다.
본 발명의 금-결합성 항체를 취득하는 방법으로서는 종래 행해지고 있던 항혈청 제조 기술 및 세포융합에 의한 모노클론 항체 제작기술을 적절하게 선택해서 행하는 것이 가능하다. 예를 들어, 본 발명의 결합대상으로 되는 금 미립자를 적당한 면역동물에 면역시키고, 항체 역가의 상승을 확인한 후에 혈청으로부터 항체를 회수한다. 상기 면역은, 항원으로서의 금 미립자를 적당한 용매, 예를 들어, 생리식염용액에 의해 적당한 농도로 희석하고, 이 용액을 정맥내 혹은 복강내에 투여하고, 이것에 필요에 따라서, 프로인트 완전 애쥬번트와 함께 동물에게 1 내지 2주 간격으로 3 내지 4회 투여하는 방법이 일반적으로 수행된다. 이와 같이 해서 면역된 동물을 최종 면역후 3일째에 해부하고, 잘라낸 비장으로부터 얻어진 비장 세포를 면역세포로서 사용한다. 면역하는 금 미립자의 크기는 10 ㎚ 이하인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 2 ㎚ 이하이다. 또한, 금 미립자는 혈청 알부민 등의 단백질에 공유 결합시켜서 합텐을 부여하는 것이 더욱 바람직하다. 종래 면역 반응을 일으키기 어려운 항원에 있어서도, 이 항원과 어떤 단백질 항원과의 복합체를 형성함으로써 해당 어떤 단백질 항원의 일부로서 인식되어 그의 산출이 유도되는 것이 예상된다.
얻어진 항체는 폴리클로날일 수도 있지만, 모노클로날 항체로서 부여됨으로써, 금에 대한 특이성이 높은 클론을 선택하는 것이 가능해진다. 모노클로날 항체는 그것을 생산하는 세포를 클로닝함으로써 얻어지는 것이 가능하다. 일반적으로는 면역 동물로부터 회수한 비장 등의 면역글로불린생산 세포를 종양 세포와 융합시킴으로써 하이브리도머를 형성하는 것이 가능하다(Gulfre G., Nature 266. 550-552, 1977). 예를 들어, 종양 세포는 마우스 유래 골수종(myeloma) P3/X63-AG8. 653(ATCC No. CRL-1580), P3/NSI/1-Ag4-1(NS-1), P3/X63-Ag8. U1(P3U1), SP2/0-Agl4(Sp2/0, Sp2), NSO, PAI, F0 또는 BW5147, 래트 유래의 골수종 210RCY3-Ag. 2.3. 및 인간 유래의 골수종 U-266AR1, GM1500-6TG-A1-2, UC729-6, CEM-AGR, DIR11 또는 CEM-T15 등의 골수종 세포를 포함한다.
모노클로날 항체를 생산하는 세포의 스크리닝은 상기 세포를 역가판(titer plate) 중에서 배양하고, 증식이 관찰된 웰의 배양 상청액의 상기 금 미립자에 대한 반응성을 예를 들어, RIA(radio immunoassay) 또는 ELISA(enzyme-linked immuno-solvent assay) 등의 효소면역 측정법, 또는 면역침강 등에 의해서 측정하는 것이 가능하다. 또는, 표면 플라스몬 공명(SPR: surface plasmon resonance) 장치를 이용한 금-결합성을 정량적으로 측정하는 것도 가능하다.
- 항체 단편
본 발명에 있어서 설명되는 항체 단편이란 모노클로날 항체의 일부분의 영역을 의미하고, 그의 구체예에는 F(ab')2, Fab', Fab, Fd, 항체의 가변 단편(Fv), 단일쇄 Fv (scFｖ), 디설파이드 안정화 scFｖ(dsFv), 및 중쇄 가변영역(VH) 혹은 경쇄 가변영역(VL)으로 이루어진 싱글 도메인 항체(dAv)가 포함된다.
본 명세서에서 이용되는 바와 같은 "F(ab')2" 및 "Fab'"는 항체를 예를 들어 단백분해효소로서의 펩신 혹은 파파인에 의해 처리함으로써 얻어질 수 있다. 이들은 항체의 힌지 영역에서 2본의 중쇄(H쇄) 간에 존재하는 디설파이드 결합 근방에서의 소화에 의해 생성된 항체 단편을 의미한다. 예를 들어, IgG를 파파인으로 처리하면, 힌지 영역 중의 2본의 H쇄 사이에 존재하는 디설파이드 결합의 상류에서 절단되어서 경쇄가변영역(VL)과 경쇄정상영역(CL)으로 이루어진 경쇄(L쇄) 및 중쇄가변영역(VH)과 중쇄정상영역 1(CH1)로 이루어진 중쇄(H쇄)가 C 말단 영역에서 디설파이드 결합에 의해 결합한 상동의 2개의 단편이 얻어진다. 이들 2개의 상동인 항체 단편을 각각 Fab'라 한다. 대안적으로, IgG를 펩신으로 처리하면, 힌지 영역 중의 2본의 H쇄 사이에 존재하는 디설파이드 결합의 하류에서 절단되어서 상기 2개의 Fab'가 힌지 영역에서 연결된 것보다 약간 큰 항체 단편을 제조하는 것이 가능하다. 이 항체 단편을 F(ab')2라 칭한다.
이와 같은 본 발명의 금-결합성 단백질은 상기 Fab' 또는 F(ab')2일 수도 있다. 또, 금-결합성 단백질은 VH와 상기 CH1을 결합한 Fd 단편이어도 된다.
또한, 금-결합성 단백질은 항체의 가변 단편(Fv) 또는 그 일부, 예를 들어, Fv를 구성하는 중쇄가변영역(VH)이나 경쇄가변영역(VL) 또는 그 일부이어도 된다. 한편, 상기 VH 또는 VL로 이루어진 복합체에 있어서, 한쪽 영역의 카복시말단과 다른쪽 영역의 아미노 말단을 수개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 통해 연결한 1본쇄 Fv(scFｖ)를 이용하는 것도 가능하다. 상기 scFｖ를 형성하는 VH/VL(특히 순서는 없음)에는 1개 이상의 아미노산으로 이루어진 링커를 설치하는 것이 바람직하다. 아미노산 링커의 잔기 길이에 대해서는, VH 또는 VL과 항원과의 결합에 필요한 구조형성을 방해하는 바와 같은 구속력을 지니지 않도록 설계하는 것이 중요하다. 구체적인 예로서는, 아미노산 링커 길이는 5 내지 18개의 잔기가 일반적이고, 15개의 잔기가 가장 많이 이용되고 검토되고 있다. 이들 단편은 유전공학적인 수법에 의해 얻어지는 것이 가능하다.
또한, VH 또는 VL의 어느 쪽이 단일 도메인 dAb이어도 되지만, 상기 단일 도메인 구조는 일반적으로 불안정한 것이 많으므로, PEG 수식 등의 화학적 수식에 의한 안정화를 실시해도 된다. 또, 중쇄 항체로서 생체내에 있어서도 존재하여 기능할 수 있는 것이 알려져 있는 낙타 중쇄의 가변영역 VHH(J. Mol. Biol, 311: p123, 2001) 및 Nurse Shark의 면역 글로불린형상 분자의 가변 영역 IgNAR을 사용할 수 있다. 또한, 사람 및 마우스의 것으로 대표되는 중쇄와 경쇄로 이루어진 항체의 VH 혹은 VL을 도 1 내지 도 4에 표시한 바와 같이 도메인 유닛으로 사용할 때에 VH/VL 계면 등을 중쇄 항체의 상당 부분을 참고로 변이도입함으로써 안정성을 향상시켜도 된다.
금-결합 부위는 (1) 항체 중쇄가변영역(VH), 그 변이체 및 이들의 일부, 그리고 (2) 항체 경쇄 가변영역(VL), 그 변이체 및 이들의 일부로부터 선택된 적어도 1종을 포함할 수 있다. 항체 중쇄 가변영역(VH)의 바람직한 예로는 서열번호: 1 내지 48의 아미노산 서열의 적어도 1개를 포함하는 단백질을 포함하고, 항체 경쇄가변영역(VL)의 바람직한 예로는 서열번호: 49 내지 57의 아미노산 서열의 적어도 1개를 포함하는 단백질을 포함한다. 이들 서열번호: 1 내지 57의 아미노산 서열의 각각의 1개 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 1개 이상 포함하는 금에 대한 친화성을 지니고 있는 단백질도 마찬가지로 이용될 수 있다.
- 금에 대한 친화성을 지닌 항체 단편의 취득
-- 효소처리에 의한 취득
상기 항체를 어떤 종의 효소에 의해 처리함으로써, 상기 항체의 항원-결합부위 및 항원-결합능을 어느 정도 지닌 항체 단편의 획득도 가능하다. 예를 들어, 상기 얻어진 항체를 파파인에 의해 처리함으로써 Fab 단편 또는 그 유사체를 얻는 것이 가능하다. 또, 얻어진 항체를 펩신에 의해 처리함으로써 F(ab')2 단편 또는 그 유사체를 얻을 수 있다. 상기 항체 단편은 상기 효소적 수법 외에 화학적 분해법에 의해서 제작된다. 이들 항체 단편도 금에 대해서 결합능을 지니는 한 아무런 문제 없이 사용될 수 있다.
본 발명에 관한 상기 Fab', Fv, 혹은 VH 또는 VL의 dAb를 얻는 방법은 유전공학적인 수법을 이용해서 획득하는 것도 가능하다. 그 예로는, 상기 VH 또는 VL의 유전자 라이브러리를 제작하고, 그들을 단백질로서 포괄적으로 발현시켜서, 금 또는 표적 물질에 대한 친화성에 의거해서 대응하는 유전자를 선택하는 방법이 있다. 상기 유전자 라이브러리는 예를 들어, 제대혈, 편도, 골수, 또는 말초 혈세포 혹은 비 세포(splenocytes)로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, mRNA는 인간 말초 혈세포로부터 추출되어, cDNA가 합성된다. 다음에, 인간 VH 또는 VL을 부호화하는 서열을 프로브로서 사용해서 인간 VH 또는 VL의 cDNA 라이브러리를 제작한다. 예를 들어, 인간 VH 패밀리(VH1 내지 7)를 패밀리마다 광범위하게 증폭하는 것이 가능한 프라이머 및 인간 VL을 증폭시킬 수 있는 프라이머는 당업계에 있어서 공지이다. 이들 VH 혹은 VL 마다 프라이머를 조합시켜서 RT-PCR을 행하여, VH 또는 VL을 부호화한 유전자를 취득하였다. 또는, 파지 디스플레이법을 이용하는 것도 가능하다. 파지 디스플레이법은 VH, VL 또는 이들을 함유하는 복합체(예를 들어, Fab, scFｖ)를 부호화한 유전자 라이브러리를 파지 외피 단백질을 부호화한 유전자와 조합해서 파지미드 라이브러리를 제작하고, 이들을 대장균으로 형질전환하고, 각종 VH 또는 VL을 외피 단백질의 일부로서 지니는 파지로서 발현시킨다. 이들 파지를 이용해서, 상기와 마찬가지로 해서 금 또는 표적 물질에 대한 친화성에 의거해서 선택하는 것이 가능하다. 파지에 의해 융합 단백으로서 제시된 VH 또는 VL을 부호화하는 유전자는 파지 내에 파지미드에 의해 부호화되어 있으므로 DNA 서열해석을 함으로써 특정되는 것이 가능하다.
본 발명은 상기 금-결합성 단백질을 부호화하는 핵산도 포함한다. 또, 본 발명은 이들을 단백질로서 숙주세포(예를 들어, 대장균, 효모, 마우스, 사람 등으로부터 유래되는 종래 공지의 단백발현용 세포)를 형질전환하여, 상기 금-결합성 단백질을 발현시킬 수 있는 유전자 벡터로서 부여되는 핵산으로 이루어진 구성물도 포함한다. 1개의 상기 발현 벡터에 의해 발현될 수 있는 본 발명의 금-결합성 단백질은 항체 전체 분자, 또는 그 항체 단편인 F(ab')2, Fab, Fv(scFｖ), VH 혹은 VL, 또는 이들 복합체로부터 선택해서 설계하는 것이 가능하다. 하나의 발현용 벡터에 의해 복수의 상기 항체 단편을 부호화할 경우, 각각의 항체 단편은 독립한 개개의 폴리펩타이드쇄로서 독립적으로 발현시키는 것이 가능하다. 또, 도메인 간을 연속해서 또는 아미노산을 개재해서 결합시킨 1개의 폴리펩타이드쇄로서 발현하는 벡터를 구성하는 것도 가능하다.
본 발명의 금-결합성 단백질 발현용 벡터의 구성에 있어서, 벡터는 선택된 숙주세포에 따라서 기지의 프로모터 등의 도입유전자를 발현시키는 데 필요한 구성 등에 통합시킴으로써, 설계 및 구축될 수 있다. 또, 벡터는 선택된 숙주세포에 따라서 기지의 프로모터 등의 구성 등을 참조해서 구축될 수 있다. 또, 대장균 등을 숙주 세포로서 이용할 경우, 외래 유전자 산물로서의 본 발명의 금-결합성 단백질 또는 그 구성물을 즉시 세포질 밖으로 제거함으로써, 프로테아제에 의한 분해를 적게 하는 것이 가능하다. 또, 이 외래 유전자 산물이 균체에 대해서 독성이 있는 경우에도, 균체 밖으로 이 외래 유전자 산물을 분비함으로써 그 영향을 작게 하는 것이 가능한 것이 알려져 있다. 통상, 기지의 세포질 막 혹은 내막을 통과해서 분비되는 대부분의 단백질은 그들 전구체의 N 말단에 시그널 펩타이드를 지니고, 분비과정에 있어서 시그널 펩티다제에 의해 절단되어, 그 전구체가 성숙 단백질로 전환된다. 많은 시그널 펩타이드는 그들의 N 말단에 염기성의 아미노산, 소수성 아미노산 및 시그널 펩티다제에 의한 절단 부위가 배치되어 있다.
본 발명의 금-결합성 단백질은 해당 금-결합성 단백질을 부호화하는 핵산의 5'측에 pe1B로 대표되는 종래 공지의 시그널 펩타이드를 부호화하는 핵산을 배치함으로써 분비·발현시키는 것이 가능하다.
또, 하나의 벡터 중에 본 발명의 수개의 금-결합성 단백질 또는 각각 복수의 항체 단편으로 구성되는 수개의 폴리펩타이드쇄를 각각 독립적으로 삽입하는 것도 가능하다. 이 경우, 폴리펩타이드쇄를 부호화하는 핵산 또는 각 도메인의 5'측에 pe1B를 부호화하는 핵산을 배치하여, 분비를 촉진하는 것이 가능하다. 또는, 금-결합성 단백질을 1개 이상의 도메인으로 이루어진 폴리펩타이드쇄로서 발현시킬 경우, 상기 폴리펩타이드쇄의 5'측에 전술한 바와 같이 pe1B를 부호화하는 핵산을 배치함으로써 분비를 촉진하는 것이 가능하다. 상기 설명한 바와 같이 시그널 펩타이드를 N 말단에 융합한 본 발명의 금-결합성 단백질은 페리플라슴(periplasm) 분획 및 배지 상청액으로부터 정제될 수 있다.
또, 발현시킨 단백질을 정제하는 작업의 간편성을 고려해서, 항체 분자, 또는 독립한 각 항체 단편 혹은 복수의 항체 단편이 연속해서 결합해서 형성된 폴리펩타이드쇄의 N 또는 C 말단에 정제용의 태그를 유전자 공학적으로 배치하는 것이 가능하다. 상기 정제용 태그의 예로는 6개 연속한 히스티딘 잔기로 이루어진 히스티딘 태그(이하, His×6) 및 글루타티온-S-트랜스페라제의 글루타티온-결합부위가 포함된다. 상기 태그의 도입방법의 예로는 상기 발현용 벡터에 있어서의 금-결합성 단백질을 부호화하는 핵산의 5' 또는 3'말단에 정제용 태그를 부호화하는 핵산을 삽입하는 방법; 및 시판의 정제태그 도입용 벡터를 사용하는 방법 등이 포함된다.
이하에, 상기 발현벡터를 이용한 본 발명의 금-결합성 단백질의 제조방법에 대해서 설명한다. 종래 기지의 단백발현용의 숙주세포는, 해당 숙주 세포에 따라서 설계된 상기 금-결합성 단백질 발현용 벡터를 형질전환하고, 숙주 세포 내의 단백합성시스템을 이용해서, 숙주 세포 내에 본 발명의 금-결합성 단백질 또는 그 구성 요소로 되는 폴리펩타이드쇄를 합성한다. 그 후, 숙주 세포 내외에 축적 또는 분비된 목적 단백질을 세포 내부 또는 세포 배양 상청액으로부터 정제함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 대장균을 숙주세포로서 이용할 경우, 본 발명의 금-결합성 단백질을 부호화하는 핵산의 5'측에 pe1B로 대표되는 종래 공지의 시그널 펩타이드를 부호화하는 핵산을 배치함으로써 세포질 밖으로 분비·발현을 용이하도록 구축할 수 있다.
하나의 본 발명의 발현용 벡터에 있어서 본 발명의 금-결합성 단백질을 구성하는 수개의 폴리펩타이드쇄를 발현시킬 경우, 각 폴리펩타이드쇄를 부호화하는 핵산의 5'측에 pe1B를 부호화하는 핵산을 배치하고, 그의 발현시 세포질 밖으로의 분비를 촉진시키는 것이 가능하다. 이와 같이 해서 시그널 펩타이드를 N 말단에 융합한 본 발명의 금-결합성 단백질은 페리플라슴 분획 및 배지 상청액으로부터 정제하는 것이 가능하다. 정제방법으로서는, 상기 정제용 태그가 His-태그인 경우, 니켈 킬레이트 컬럼을 이용해서 정제할 수 있고, 또한, 상기 정제용 태그가 GST인 경우, 글루타티온고정화 컬럼을 사용함으로써 정제하는 것이 가능하다.
또, 균체 내에 발현된 본 발명의 금-결합성 단백질은 불용성 과립 형태로 얻어질 수 있다. 이 경우, 배양액으로부터 얻어진 균체를 프렌치 프레스나 초음파에 의해 균질화한 세포 균질화 용액으로부터 상기 불용성 과립을 원심분리하는 것이 가능하다. 얻어진 불용성 과립 분획을 요소 및 염산 구아니딘염을 지닌 종래 공지의 변성제를 함유한 완충용액에 의해 가용화한 후에, 변성조건하에서 전술한 바와 같은 컬럼에 의한 정제를 행하는 것이 가능하다. 얻어진 컬럼 용출 분획은 리폴딩(refolding) 작업에 의해, 변성제 제거와 활성 구조재의 재구축을 행하는 것이 가능하다. 리폴딩 방법으로서는 종래 공지된 어떠한 방법이라도 적절하게 이용할 수 있다. 특히, 단계 투석법이나 희석법을 목적의 단백에 따라서 이용하는 것이 가능하다.
본 발명의 금-결합성 단백질의 각 도메인 혹은 각 폴리펩타이드쇄는 동일 숙주세포내에서 발현시키는 것도 가능하거나, 또는 별도의 숙주세포를 사용해서 발현시킨 후에 서로 공존시킨 상태에서 복합체화하는 것도 가능하다.
또, 본 발명의 금-결합성 단백질을 부호화하는 벡터를 이용해서, 세포추출액을 이용해서 시험관내에서 단백질을 발현시키는 것도 가능하다. 바람직하게 이용되는 세포추출액의 예로는 대장균, 밀배아 응집소 및 토끼 망상 적혈구가 포함된다. 그러나, 상기 세포 추출액에 의한 단백질의 합성은 일반적으로는 환원조건하에서 행해진다. 그 때문에, 항체 단편 중의 디설파이드 결합을 형성시키기 위해서 어떠한 처리를 행하는 쪽이 보다 바람직하다.
본 발명의 금-결합성 단백질의 바람직한 해리 상수(KD)는 0.1% 트윈(Tween) 20의 존재 중 버퍼 조건하에서 10-6M 이하이며, 더욱 바람직하게는 10-8M 이하이다. 본 발명자들은, 단백질 재료는 상기 조건에 있어서, BSA 등의 비교적 금에 대한 비특이적인 흡착이 많아지는 단백질 재료이더라도 금에 흡착될 수 없는 것을 연구에 의해 확인하였다. KD값이 10-6M 이하이면, 상기와 같은 비특이 흡착성의 단백질의 흡착거동과 충분히 구별될 수 있다. 또한, KD값을 10-8M 이하로 할 경우, 금-결합성 단백질은 고정화용의 앵커(anchor) 분자로서 충분히 기능할 수 있다.
- 항체 단편 단백질의 발현
금-결합성 단백질을, 소망의 제한 효소, 예를 들어, 상기 경우에서는 NcoI/NheI에 의해 절단해서 금-결합성 항체 단편을 부호화하는 DNA를 얻는다. 이것을 숙주세포에 따른 종래 공지의 단백질 발현용 플라스미드에 도입함으로써 항체 단편을 얻는 것이 가능하다. 예를 들어, 대장균을 숙주세포로 사용해서, 균체외 발현 또는 페리플라슴 분획으로부터 목적의 항체 단편을 회수하고자 할 경우, 상기 항체 단편을 부호화하는 유전자의 상류에 종래 공지의 시그널 펩타이드를 도입하는 것이 가능하다. 시그널 펩타이드에는 pe1B가 포함된다. 또, 발현 후, 배양 상청액 또는 균체 분획으로부터 목적 단백질의 정제를 용이하게 하기 위해, 종래 공지된 정제용 태그를 융합해도 된다. 구체적으로는, 6개의 히스티딘 잔기(His × 6) 혹은 글루타티온-S-트랜스페라제의 글루타티온-결합부위를 도입해서, 융합 단백질을 부여할 수 있다. His-태그의 경우, 이 융합 단백질은 니켈 등의 금속 킬레이트 컬럼 등에 의한 정제를 용이하게 할 수 있다. GST 태그의 경우에는 글루타티온을 세파로스 등의 담체에 고정화한 컬럼에 의해 정제하는 것이 가능하다.
또는, 균체 내에 발현한 목적의 단백질이 불용성 과립에 의해서 얻어질 수 없는 경우, 이들 불용성 과립을 요소 및 염산 구아니딘염을 함유하는 종래 공지의 완충용액에 의해서 가용화한 후에, 리폴딩을 행하는 것도 가능하다. 리폴딩 절차로서는 종래 공지의 방법의 어느 것이라도 적절하게 사용할 수 있다. 특히, 단계 투석법이나 희석법을 목적의 단백에 따라서 이용하는 것이 가능하다.
상기에 의해 얻어진 항체 및 이들의 단편, 예를 들어, Fab, (Fab')2, Fc, VH 또는 VL 또는 상기 이들의 복합체 등의 아미노산 서열에 있어서, 1개 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열이어도 이들이 금에 대한 친화성을 나타내는 것이면 본 발명의 범위로부터 벗어나는 것은 아니다.
본 발명의 금-결합성 단백질의 바람직한 해리 상수(KD)는 0.1% 트윈 20의 존재 중 버퍼 조건하에서 10-6M 이하이며, 더욱 바람직하게는 10-8M 이하이다. 본 발명자들은, 단백질 재료가 상기 조건하에서 BSA 등의 비교적 금에 대한 비특이적인 흡착이 많아지는 단백질 재료이더라도 금에 흡착될 수 없는 것을 연구에 의해 확인하였다.
KD값이 10-6M 이하이면, 상기와 같은 비특이 흡착성 단백질의 흡착거동과 충분히 구별될 수 있다. 또한, KD값을 10-8M 이하로 할 경우, 금-결합성 단백질은 고정화용의 앵커 분자로서 충분히 기능할 수 있다.
- 금을 지닌 피결합 대상물
금을 지닌 피결합 대상물은 적어도 그들 표면의 일부에 금을 지닌 각종 물질로부터 선택해서 이용할 수 있다. 면역, 패닝(panning) 등에 의해 금-결합성 단백질을 선택할 때는, 금 이외의 물질에 대해서 흡착하는 단백질의 혼입을 제거하기 위하여 피결합 대상물 표면은 금만으로 구성되어 있다. 표면 이외의 내부 코어 기재용의 재료는, 금은 물론 그 외 공지의 각종 재료로부터 선택해서 이용할 수 있다. 또한, 피결합 대상물은 입자형상, 더욱 바람직하게는 1 내지 100 ㎛φ의 미립자로서 부여함으로써, 결합과 관련해서 비표면적의 증가를 가능하게 하고, 또, 패닝 종료시의 회수에 대해서도 원심분리에 의해서 용이하게 회수하는 것이 가능하다. 또, 피결합 대상물은 하기와 같이 시판의 각종 플라스틱 판, 예를 들어, 배양 접시, 96-웰(well) 역가판에 금을 증착해서 얻어진 것이어도 된다. 이 경우, 금 표면의 젖은 면적 및 교반에 의한 분자확산 효과를 감안해서, 그 크기 및 웰 수를 결정하는 것이 바람직하다.
피결합 대상물의 형상으로서는, 평판, 구형, 침형상, 다공형상 등 공지의 형상으로부터 적절하게 선택해서 이용할 수 있다. 형성방법으로서는 물리적 혹은 화학적 증착 방법이나 염화금을 이용한 화학적인 제조방법으로부터 적절하게 선택할 수 있다. 얻어진 금을 함유하는 표면은 산화층이나 부생성물, 오염물 등의 불순물을 제거하기 위해, 산성 용액, 알칼리성 용액, 유기용매 등에 의해서 미리 세정해서 소망의 금의 노출 상태를 지니도록 해도 된다.
- 기재
금-결합성 단백질과 표면의 적어도 일부가 금으로 형성되어 있는 기재로부터 각종 용도에 사용될 수 있는 구조체를 얻을 수 있다. 이 기재는 그 표면의 적어도 일부에 금을 배치해서, 본 발명의 구조체를 형성할 수 있는 것이면 어떠한 형상 및 재질의 것도 이용가능하다. 본 발명에 이용되는 기재의 재질은 본 발명의 구조체를 형성할 수 있는 것이면 어떠한 재질이어도 되고, 금속, 금속산화물, 무기반도체, 유기반도체, 유리류, 세라믹스, 천연 고분자, 합성 고분자 및 플라스틱으로부터 선택된 어떠한 1종 이상 혹은 그 복합체를 포함하는 재질이다. 본 발명에 이용되는 기재의 형상은 본 발명의 구조체를 형성할 수 있는 것이면 어떠한 형상이어도 되고, 판형상, 입자형상, 다공체형상, 돌기형상, 섬유형상, 통형상 및 망형상으로부터 선택되는 어떠한 하나 이상의 형상을 포함하는 형상이다.
기재 형성용의 유기고분자화합물로서는, 스티렌, α-메틸스티렌, β-메틸스티렌, o-메틸스티렌, m-메틸스티렌, p-메틸스티렌, 2,4-디메틸스티렌, p-n-부틸스티렌, p-tert-부틸스티렌, p-n-헥실스티렌, p-n-옥틸스티렌, p-n-노닐스티렌, p-n-데실스티렌, p-n-도데실스티렌, p-메톡시스티렌 및 p-페닐스티렌 등의 스티렌계 중합성 단량체; 메틸 아크릴레이트, 에틸 아크릴레이트, n-프로필 아크릴레이트, 이소프로필 아크릴레이트, n-부틸 아크릴레이트, 이소부틸 아크릴레이트, tert-부틸 아크릴레이트, n-아밀 아크릴레이트, n-헥실 아크릴레이트, 2-에틸헥실 아크릴레이트, n-옥틸 아크릴레이트, n-노닐 아크릴레이트, 사이클로헥실 아크릴레이트, 벤질 아크릴레이트, 디메틸 포스페이트 에틸 아크릴레이트, 디에틸 포스페이트 에틸 아크릴레이트, 디부틸 포스페이트 에틸 아크릴레이트 및 2-벤조일옥시 에틸 아크릴레이트 등의 아크릴계 중합성 단량체; 메틸 메타크릴레이트, 에틸 메타크릴레이트, n-프로필 메타크릴레이트, 이소프로필 메타크릴레이트, n-부틸 메타크릴레이트, 이소부틸 메타크릴레이트, tert-부틸 메타크릴레이트, n-아밀 메타크릴레이트, n-헥실 메타크릴레이트, 2-에틸헥실 메타크릴레이트, n-옥틸 메타크릴레이트, n-노닐 메타크릴레이트, 디메틸 포스페이트 에틸 메타크릴레이트 및 디부틸 포스페이트 에틸 메타크릴레이트 등의 메타크릴계 중합성 단량체; 메틸렌 지방족 모노카복시산 에스테르류; 아세트산 비닐, 프로피온산 비닐, 벤조산 비닐, 부티르산 비닐, 안식향산 비닐, 포름산 비닐 등의 비닐 에스테르류; 메틸비닐 에테르, 에틸비닐 에테르 및 이소부틸 비닐 에테르 등의 비닐 에테르류; 비닐메틸케톤, 비닐헥실케톤 및 비닐이소프로필케톤 등의 비닐 케톤류 등의 비닐계 중합성 단량체로 이루어진 군으로부터 선택된 중합성 단량체를 중합시켜 제제된 유기 고분자화합물을 들 수 있다.
또한, 무기 고분자의 예로서는, 카올리나이트, 벤토나이트, 탤크, 운모 등의 점토광물; 알루미나, 이산화티탄, 산화아연, 마그네타이트, 페라이트, NbTa 복합산화물, WO3, In2O3, MoO3, V2O5, SnO2 등의 금속산화물; 실리카겔, 하이드록시아파타이트, 인산칼슘겔 등의 불용성 무기염; 금, 은, 백금 및 구리 등의 금속; GaAs, GaP, ZnS, CdS, CdSe 등의 반도체화합물; 유리; 실리콘; 혹은 이들의 복합체 등을 이용하는 것이 가능하지만, 물론 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 기재는 폴리에틸렌테레프탈레이트(PET), 디아세테이트, 트리아세테이트, 셀로판, 셀룰로이드, 폴리카보네이트, 폴리이미드, 폴리염화비닐, 폴리염화비닐리덴, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌 및 폴리에스테르 등의 플라스틱으로 이루어진 필름; 폴리염화비닐, 폴리비닐알코올, 아세틸셀룰로오스, 폴리카보네이트, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 및 테플론 등의 다공성 고분자막; 목판; 유리판; 실리콘 기판; 목면, 레이온, 아크릴, 견 및 폴리에스테르 등의 직물; 상질지, 중질지, 아트지, 본드지, 재생지, 바라이타지, 캐스트코트지, 골판지 및 수지코트지 등의 종이를 이용해서 막형상이나 시트 형상으로 하는 것도 가능하지만, 물론 기재의 재질은 이들로 한정되는 것은 아니다. 또, 이들 막형상이나 시트형상의 재료는 평활한 것이어도 요철이 있는 것이어도 된다.
기재의 예로서는 실리콘, 실리카, 유리, 석영 유리 등의 기판; 이들 기판에 포토리소그래피, 에칭, 샌드 블라스트 등의 수법으로 형성된 미소유로나 홀(구멍), 혹은 이들 표면에 금이나 은, 백금 등의 박막이 형성된 기재; PDMS(폴리디메틸실록산)나 PMMA(폴리메틸메타크릴레이트), PET(폴리에틸렌테레프탈레이트), 폴리카보네이트(PC), 폴리스티렌(PS) 등의 기판 및 성형기술에 의해서 형성된 미소유로나 홀(구멍)을 지닌 기판; 카본나노튜브, 카본나노혼, 풀러렌, 다이아몬드 또는 이들의 집합체; 알루미나, 카본, 풀러렌, ZnO 등의 나노 위스커; SiO2, 알루미노실리케이트, 그 밖의 메탈로실리케이트, TiO2, SnO2, Ta2O5 등으로 이루어진 메소포러스 박막, 미립자 및 모노리쓰(monolith) 구조체; 금, 은, 구리, 백금 등의 미립자; 마그네타이트, 페라이트, 헤마타이트, 감마 헤마타이트, 마그헤마이트 등의 철산화물 미립자; 알루미늄/실리콘 혼합막 및 이들을 양극산화함으로써 얻어진 실리콘산화물 나노구조체; 다공성 알루미나 박막; 알루미나 나노홀 구조체; 및 실리콘 나노와이어 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다.
또, 본 발명의 기재의 치수는 사용용도에 따라 다양하게 선택할 수 있다.
- 표적물질 검출용 키트
본 발명의 금-결합성 단백질에 표적물질과의 친화성을 부가한 구성을 이용해서, 표적물질 검출용의 키트를 얻는 것이 가능하다. 예를 들어, 상기 구조체를 형성하기 위한 기재 및 금-결합성 복합단백질과; 해당 구조체에의 표적 물질의 결합을 검출하기 위한 검출수단을 지닌 표적물질 검출용 키트를 구성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 표적물질에 대한 금-결합성 단백질을 함유하는 단백질의 결합은, 금-결합성 단백질을 함유하는 단백질에 결합한 상태의 표적물질에 대해서 금 또는 금을 함유하는 표지제를 부가해서, 물리적 혹은 화학적인 수법을 행하여 상기 금 또는 표적물질을 검출함으로써 검출될 수 있다. 혹은, 표적물질이 금을 함유하는 것이면, 금-결합성 단백질의 금에 대한 결합성을 이용해서, 금-결합성 단백질을 금을 함유하는 표적제에 결합시키고, 표지를 이용하여 이 결합상태를 검출한다. 이 경우에 이용되는 표지로서는 접속부재의 설명에 있어서 후술하는 것을 이용할 수 있다. 또, 예를 들어, 광학적, 전기적 혹은 열적 변화 등의 물리량의 변화에 의해서 표지제와 금-결합성 단백질과의 결합을 검출하는 것이 가능하다.
또한, 이러한 표지제에 대한 친화성을 부가한 구성으로서는, 후술하는 금-결합성 복합 단백질이나, 금-결합성 단백질을 표적물질과 표지제와의 결합부재로서 이용할 경우를 바람직한 것으로 들 수 있다.
- 표면 플라스몬 공명장치
또, 금에 대한 금-결합성 단백질을 함유하는 단백질의 결합은 예를 들어, 종래 공지의 표면 플라스몬 공명측정장치에 의해서 정량적으로 측정하는 것이 가능하다. 표면 플라스몬 공명은 일반적으로 유리기판상에 형성된 금 박막 상의 굴절률 변화를 전반사각 이하의 입사각으로 유리쪽으로부터 입사시킨 광에 의해서 유리와 금 사이의 계면에서 생긴 소실파(evanescence wave)와 금 박막 상의 자유전자의 공명에 의해서 생기는 공명각 변화로부터 측정하는 방법이다. 측정된 굴절률 변화를, 피대상 단백질의 금에 대한 결합량으로서 환산하여 평가할 수 있다.
- 해리상수(KD)
"해리상수(KD)"란 "해리속도(kd)"값을 "결합속도(ka)"값으로 나누어서 얻어진 값을 의미한다. 이들 속도는 상기 모노클로날 항체 또는 그들의 단편이 금에 대한 친화성을 나타내는 지표로서 이용된다. 상기 속도는 각종 방법에 따라서 해석할 수 있지만, 본 발명에 있어서는 측정 기기인 Biacore 2000(아머샴 파마시아사(Aamersham Pharmacia Biotech, Co., Ltd.) 제품)을 이용해서, 상기 장치에 첨부된 해석 소포트웨어에 따라서 얻어진 결합곡선으로부터 결정한다.
(2) 금-결합성 복합 단백질
본 발명에 의한 금-결합성 복합 단백질은 2개 이상의 도메인을 포함한다. 이들 도메인 중, 적어도 하나의 도메인은 상기 구성된 바와 같은 금-결합성 단백질을 포함한다. 예시된 복합 단백질에는 이하의 것과 같이 구성된 것이 포함된다:
(a) 상기 구성의 금-결합성 단백질을 포함하는 제 1 도메인과, 특정의 물질에 특이적인 결합 부위를 지니는 단백질을 포함하는 제 2 도메인을 지닌 복합 단백질.
(b) 상기 제 1 도메인과 제 2 도메인에 더해서, 제 1 도메인과 복합체를 형성하는 제 3 도메인 및 상기 제 2 도메인과 복합체를 형성하는 제 4 도메인의 적어도 한 쪽을 더 포함하는 복합 단백질.
또, 상기 제 2 내지 제 4 도메인 중 적어도 하나는 금에 대한 친화성을 지닌 단백질을 적어도 하나 포함할 수 있다. 이 경우, 이들 도메인은 각각 전술한 바와 같이 구성된 금-결합성 단백질을 편입시킴으로써 구성될 수 있다. 또, 제 1 내지 제 4 도메인은 피결합 물질에 대한 친화성을 지닐 수 있고, 그들의 친화성은 서로 독립적으로 조정될 수 있다. 또는, 2개 이상의 도메인은 유사한 친화성을 지닐 수도 있다. 이들 도메인은 상이한 친화성을 지닌 도메인으로부터 구성될 수도 있다.
또한, 상기 제 1 내지 제 4 도메인으로부터 선택된 적어도 2개는 동일한 폴리펩타이드 쇄에 함유되어 있을 수 있다. 금-결합성 복합 단백질의 이러한 구성은 이하의 구조를 포함한다.
(1) 제 1 도메인과 제 2 도메인이 하나의 폴리펩타이드쇄를 형성하고 있는 구성.
(2) 제 1 도메인과 제 2 도메인이 1개 이상의 아미노산을 통해서 결합되어 있는 구성.
(3) 제 3 도메인과 제 4 도메인이 하나의 폴리펩타이드쇄를 형성하는 구성.
(4) 제 3 도메인과 제 4 도메인이 1개 이상의 아미노산을 통해서 결합되어 있는 구성.
(5) 제 1 도메인과 제 2 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩타이드쇄와, 제 3 도메인과 제 4 도메인을 포함하는 제 2 폴리펩타이드쇄로 이루어진 구성.
(6) 제 1 도메인과 제 2 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩타이드쇄와, 제 3 도메인과 제 2 도메인을 포함하는 제 3 폴리펩타이드쇄로 이루어진 구성.
(7) 제 1 도메인과 제 2 도메인을 포함하는 제 1 폴리펩타이드쇄와, 제 1 도메인과 제 4 도메인을 포함하는 제 4 폴리펩타이드쇄로 이루어진 구성.
(8) 적어도 제 1 도메인, 제 2 도메인 및 제 3 도메인을 포함하는 하나의 폴리펩타이드쇄로 이루어진 구성.
(9) 적어도 제 1 도메인, 제 2 도메인 및 제 4 도메인을 포함하는 하나의 폴리펩타이드쇄로 이루어진 구성.
(10) 제 1 도메인 내지 제 4 도메인을 포함하는 하나의 폴리펩타이드쇄로 이루어진 구성.
- 금-결합성 복합 단백질
금-결합성 복합 단백질의 구성요소로서 제공되는 단백질은 적어도 2개의 아미노산이 함께 결합해서 형성되는 폴리펩타이드쇄를 적어도 1개 포함하고, 이들 폴리펩타이드쇄가 중첩되어 특정의 3차원 구조로 되어서, 고유의 기능(예를 들어, 변환 및 분자인식)을 발휘할 수 있는 분자를 말한다. 또, 본 발명의 금-결합성 복합 단백질은 금에 대한 결합부위를 적어도 1개 지니고, 또한, 금 혹은 금 이외의 물질과의 결합 부위를 적어도 1개 지녀 다가 혹은 다중 특이성을 가진 친화성을 나타내는 복합 단백질이다. 예를 들어, 복합 단백질은 금에 대한 결합부위를 지니고, 적어도 항체의 경쇄 가변영역(VL) 또는 중쇄가변영역(VH)의 일부를 포함하는 제 1 도메인과, 특정 물질(이하, 표적 물질)에 대한 결합부위를 지니고, 적어도 VH 또는 VL의 일부를 포함하는 제 2 도메인을 포함하는 것이 바람직하다. 이하, 금에 결합하는 VH 및 VL을 각각 VH(G) 및 VH(G), 표적물질에 결합하는 VH 및 VL을 각각 VH(T) 및 VL(T)라 칭한다.
항체 중쇄가변영역(VH) 및 항체 경쇄가변영역(VL)은 각각 항체 중쇄 및 항체 경쇄에 속한 가변영역이다. 항체 중쇄가변영역(VH) 및 항체 경쇄가변영역(VL)은 일반적으로는 각각 약 110개의 아미노산으로 이루어져 통형상의 구조를 취하고, 반대 방향으로 배치된 β시트군에 의해 층형상 구조가 형성되는 한편, 이 층형상 구조를 하나의 S-S 결합을 이용해서 접속하여, 매우 안정한 구조체를 형성하고 있다. 또, 상기 가변영역(VH 또는 VL)은 항체의 다양한 항원에의 결합을 결정하는 상보적 결정영역(CDR)이라 칭하는 부분을 지닌 것이 알려져 있다. 상기 CDR은 VH 또는 VL에 각각 3개 있고, 비교적 다양성이 적은 아미노산 서열을 지닌 프레임워크 영역에 의해 서로 분리되어 배치되고, 이것에 의해, 대상으로 되는 인식부위의 작용기의 공간 배치를 인식함으로써, 보다 고도의 특이적인 분자인식을 가능하게 하고 있다.
이하에, 본 발명의 금-결합성 복합 단백질의 일례에 대해서 설명한다. 상기 금-결합성 복합 단백질의 최소 단위는 도 1에 모식적으로 표시된 바와 같이 상기 제 1 도메인과 제 2 도메인으로 구성되어 있다. 도메인의 조합예로서는, (a)에 표시된 바와 같이 VH(G)-VH(T), (b)에 표시된 바와 같이 VH(G)-VL(T), (c)에 표시된 바와 같이 VL(G)-VH((T), (d)에 표시된 바와 같이 VL(G)-VL(T)가 포함된다. 이 예에서는 제 1 도메인과 제 2 도메인 사이에 상보적인 결합부위를 형성하는 일없이, 독립적으로 제 1 도메인은 금에 결합하고, 제 2 도메인은 표적 물질에 결합한다. 제 1 도메인과 제 2 도메인은 각각 독립한 폴리펩타이드쇄이어도 되고, 또는 이들이 서로 연속적으로 정렬되어 결합되어 있어도 된다. 제조공정의 간략화 및 그 기능발현의 관점에서, 폴리펩타이드쇄가 연속해서 결합된 폴리펩타이드쇄를 형성하는 것이 더욱 바람직한 형태이다. 제 1 도메인과 데 2 도메인을 연속적으로 연결함으로써 제조된 폴리펩타이드쇄의 경우, 제 1 도메인과 제 2 도메인을 서로 직접 연결해도 되고, 1개 이상의 아미노산으로 이루어진 링커(5)를 통해서 연결해도 된다. 아미노산으로 이루어진 링커는 1 내지 10개의 아미노산으로 이루어진 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개의 아미노산으로 이루어진 것이다. 링커의 아미노산 길이가 11 내지 15개인 경우, 제 1 도메인과 제 2 도메인은 그들의 배치에 의한 제한이 적기 때문에, 상기 제 1 도메인과 제 2 도메인 사이에 상보적인 결합이 형성(scFｖ화)될 수도 있다. 이 VH와 VL간의 상보적인 복합체 형성을 방지하기 위해, 링커 길이를 짧게 함으로써, 도메인 간에 구조적인 제약을 부하하는 일이 효과적인 것으로 알려져 있다. 제 1 도메인 및 제 2 도메인의 각각이 표적 물질에 결합한 경우에 초래되는 구조 변화가 소망하는 표적 물질에 대한 결합능에 영향을 미치지 않는 것이 바람직하다. 따라서, α-헬릭스 등의 2차 구조로 이루어진 링커를 설정하거나, 요구되는 결합특성과 무관한 폴리펩타이드를 삽입하는 것도 소망의 특성이나 생산성에 현저한 영향을 주지 않는 한 가능하다.
또, 본 발명의 금-결합성 복합 단백질은 제 1도메인과 복합체를 형성한다. 이것은 VH 또는 VL의 일부를 적어도 포함하는 제 3 도메인 또는/및 제 2 도메인과 복합체를 형성하는, VL 또는 VH의 적어도 일부를 포함하는 제 4 도메인을 포함할 수도 있다. 또, 제 3 도메인은 제 1도메인과 복합체를 형성함으로써, 제 1 도메인과 상보적인 금-결합 부위를 형성하는 것이 더욱 바람직하다.
예를 들어, 도 2A 및 도 2B의 모식도에 표시한 바와 같이 제 1 도메인이 VH(G)인 경우, 제 3 도메인은 제 1도메인과 Fv를 형성할 수 있는 VL인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 제 1 도메인과 제 3 도메인을 연결해서 금-결합 부위를 형성하여 이루어진 구성이다.
전술한 바와 같이 제 1 도메인과 제 3 도메인이 Fv를 형성해서 구조적인 안정화를 달성하고 또한 구조적인 변화에 의한 기능저하를 억제하는 것이 기대된다. 또한, 제 3 도메인이 제 1 도메인과 연결되어 금-결합 부위를 형성하고, 더욱 결합능(예를 들어, 결합률의 증대, 해리속도의 억제)을 증대시키는 것도 기대된다.
또, 도 2A에 표시된 바와 같이, 제 1 도메인과 제 3 도메인은 각각 독립한 폴리펩타이드쇄로서 설치해도 되고, 서로 연쇄해서 폴리펩타이드쇄를 형성하고 있어도 된다(예를 들어, 도 2B의 모식도에 표시된 바와 같이 제 3 도메인 - 제 1 도메인 - 제 2 도메인. 이 구성은 금 및 표적에 대해서 결합능이 발휘되도록 적절하게 결정될 수 있다). 또, 다른 예로서, 도 3의 모식도에 표시한 바와 같은 구성이 가능하다. 즉, 제 1 도메인과 제 2 도메인으로 이루어진 폴리펩타이드쇄와 제 3 도메인과 제 2 도메인으로 이루어진 폴리펩타이드쇄로 이루어진 복합체이다. 이 경우, 제 1 도메인과 제 3 도메인으로 형성되는 Fv 또는 Fv 모양 복합체에 의해 금과 결합하고, 상기 제 2 도메인에 의해 표적 물질에 대해서 결합하는 앵커로서 제 1 도메인이 기능하는 것이다.
또, 본 발명의 금-결합성 단백질은 제 2 도메인과 복합체를 형성하는 적어도 VH 또는 VL의 일부로 이루어진 제 4 도메인을 포함할 수 있다. 제 4도메인은, 제 2 도메인과 함께 표적물질에 대한 결합 부위를 상보적으로 형성하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 도 4A의 모식도에 표시한 바와 같이, 제 2 도메인이 VL인 경우, 제 4 도메인은 제 2 도메인과 Fv를 형성하는 것이 가능한 VH인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 제 2 도메인과 제 4 도메인은 함께 연합해서 상기 표적물질에 대한 결합부위를 형성한다. 또, 도 4B의 모식도에 표시한 바와 같이, 제 1 도메인, 제 2 도메인 및 제 4 도메인이 함께 연쇄한 폴리펩타이드쇄를 형성해도 된다.
특히, 단백질이 제 1 도메인의 표면의 적어도 일부를 통해 금 기재와 결합하는 한편, 제 2 도메인 및 제 4 도메인을 통해 표적물질과 결합하는 경우, 그리고, 제 1 도메인이 기재와 결합한 때에 있어서 불가역적인 구조변화를 한 경우에 있어서도, 링커를 설정함으로써 제 2 및 제 4 도메인의 결합능에의 영향을 최소한으로 하는 것이 가능하다.
또, 본 발명의 금-결합성 단백질은 도 5의 모식도에 표시한 바와 같이 구성하는 것도 가능하다. 즉, 상기 제 1 도메인과 제 2 도메인으로 이루어진 폴리펩타이드쇄와 제 1 도메인과 제 4 도메인으로 이루어진 폴리펩타이드쇄로 이루어진 복합체이다. 이 경우, 상기 복합체는 제 2 도메인과 제 4 도메인으로 형성되는 Fv 또는 Fv 모양 복합체에 의해 표적물질에 결합하고, 상기 양 폴리펩타이드쇄를 금에 대해서 결합하는 앵커로서 제 1 도메인을 기능시키는 것이 가능하다.
또, 본 발명의 금-결합성 단백질은 제 3 및 제 4 도메인을 함께 구성 재료로 포함할 수도 있다. 도 6의 모식도에 표시한 바와 같이, 제 3 및 제 4 도메인은 각각 독립한 폴리펩타이드쇄이어도 된다. 또는, 도 7의 모식도에 표시한 바와 같이, 폴리펩타이드쇄 사이의 연쇄에 의해 얻어진 폴리펩타이드쇄이어도 된다. 금-결합성 단백질이 연쇄된 폴리펩타이드쇄로서 제공되는 경우, 제 3 도메인과 제 4 도메인을 직접 함께 연쇄하고 있어도 되고, 또는 도 7에 표시한 바와 같이 1개 이상의 아미노산으로 이루어진 링커를 통해서 연쇄하고 있어도 된다. 링커의 길이는, 상기와 마찬가지로 아미노산으로 이루어진 링커가 바람직하게는 1 내지 10개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 1 내지 5개의 아노산의 아미노산 길이를 지니도록 규정하면 된다.
또, 도 8의 모식도에 표시한 바와 같이, 상기 제 1 내지 제 4 도메인이 1개의 폴리펩타이드쇄 내에 함께 연쇄되어 있는 것이어도 된다. 이 경우, 이들 도메인은 제 1 도메인과 제 3 도메인이 복합체를 형성하고, 이 복합체를 금과 결합할 수 있는 한편, 제 2 도메인과 제 4 도메인이 복합체를 형성하고, 이 복합체를 금 및 금 이외의 물질에 결합할 수 있도록 배치되어 있다. 따라서, 상기 링커를 도메인 사이에 설치하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제 1 도메인과 제 2 도메인 사이, 또는 제 3 도메인과 제 4 도메인 사이에는 1 내지 5개의 아미노산을 배치하고, 아미노산으로 이루어진 제 2 및 제 4 도메인 사이에는 15 내지 25개의 아미노산을 배치한다. 마찬가지 구성에 있어서, 제 1 도메인과 제 2 도메인, 제 3 도메인과 제 4 도메인을 각각/쌍방 모두 서로 교체하는 것도 가능하다.
이들 1본쇄 폴리펩타이드 내에 있어서의 각 도메인의 서열은 금 또는 표적에 대한 친화성 및 금-결합성 단백질의 장기 안정성 등 소망의 특성에 따라서 적절하게 선택해서 결정하는 것이 가능하다.
제 1 도메인은 예를 들어, 서열번호: 1 내지 서열번호: 57 중의 적어도 1개의 서열을 포함하는 것이며, 이들 아미노산 서열에 있어서, 1개 혹은 수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열인 것이어도 아미노산이 금에 대한 친화성을 유지하면 하등 문제는 없다. 또한, 상기 아미노산 서열이 아미노산 서열의 일부를 형성하는 것으로서 제공되거나 또는 그들을 포함하는 복합체로서 제공되어도 금에 대한 친화성을 나타내는 것인 한 하등 문제없이 본 발명의 금-결합성 단백질로서 사용하는 것이 가능하다. 서열번호: 1 내지 서열번호: 57을 지니는 본 발명의 VH의 구체적인 예는 서열번호: 58 내지 서열번호: 74에 나타내고, 본 발명의 VL의 구체예는 서열번호: 75 내지 서열번호: 77에 나타낸다.
제 3 도메인은 서열번호: 1 내지 서열번호: 57로부터 선택되는 아미노산을 1개 이상 포함하고 있는 것이 바람직하고, 또한, 서열번호: 58 내지 서열번호: 77로부터 제 1 도메인에 따라서 적절하게 선택해서 규정하는 것이 보다 바람직하다.
본 발명은 상기 금-결합성 복합 단백질을 부호화하는 핵산도 포함한다. 또, 본 발명은 숙주세포(예를 들어, 대장균, 효모, 마우스, 사람 등에서 유래하는 종래 공지의 단백발현용 세포)를 형질전환하기 위한 발현 벡터로서 제공되는 핵산으로 이루어진 구성물도 포함한다. 본 발명의 금-결합성 단백질을 구성할 수 있는 제 1 및 제 3 도메인을 부호화하는 핵산의 서열예를 서열번호: 98 내지 서열번호: 116에 나타낸다.
1개의 상기 발현 벡터에 의해 발현될 수 있는 본 발명의 금-결합성 단백질의 각 도메인은 1 내지 4개로부터 선택해서 설계하는 것이 가능하다. 하나의 발현용 벡터에 의해 본 발명의 금-결합성 단백질의 복수의 도메인을 부호화할 경우, 각각의 도메인은 독립한 폴리펩타이드쇄로서 발현시키는 것이 가능하다. 또, 도메인을 직접 또는 아미노산을 개재해서 결합시킨 1개의 폴리펩타이드쇄로서 발현되는 벡터 구성도 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 금-결합성 단백질 발현용 벡터의 구성은, 선택된 숙주세포에 의거해서 기지의 프로모터 등의 도입유전자를 발현시키는 데 필요한 구성 등에 편입시킴으로써, 설계 및 구축될 수 있다. 또, 벡터의 구성은 선택된 숙주세포에 의거해서 기지의 프로모터 등의 구성 등을 참조해서 구축될 수 있다. 또, 대장균 등을 숙주 세포로서 이용할 경우, 외래 유전자 산물로서의 본 발명의 금-결합성 단백질을 신속하게 세포질 밖으로 제거함으로써, 프로테아제의 분해를 감소시키는 것이 가능하다. 또, 이 유전자 산물이 균체에 대해서 독성이 있는 경우에도, 균체 밖으로 분비함으로써 그 영향을 작게 하는 것이 가능하다. 통상, 기지의 세포질 막 혹은 내막을 통과해서 분비되는 대부분의 단백질은 그들 펩티다제의 N 말단에 시그널 펩타이드를 지닌다. 분비과정에 있어서 시그널 펩티다제에 의해 단백질이 절단되어, 성숙 단백질로 된다. 많은 시그널 펩타이드는 그들의 N 말단에 염기성의 아미노산, 소수성 아미노산, 시그널 펩티다제에 의한 절단 부위가 배치되어 있다.
본 발명의 금-결합성 복합 단백질을 부호화하는 핵산의 5'측에 시그널 펩타이드 pe1B로 대표되는 종래 공지의 시그널 펩타이드를 부호화하는 핵산을 배치함으로써, 펩타이드쇄를 발현 및 분비시키는 것이 가능하다. 또, 하나의 벡터 중에 본 발명의 금-결합성 복합 단백질을 구성하는 각 도메인 또는 2개 이상의 도메인으로 구성된 폴리펩타이드쇄를 독립적으로 삽입하는 것도 가능하다. 이 경우, pe1B를 부호화하는 핵산을 각 도메인 또는 폴리펩타이드쇄를 부호화하는 핵산의 5' 말단에 배치하여, 분비를 촉진하는 것이 가능하다. 마찬가지로, 1개 이상의 도메인으로 이루어진 것으로서 폴리펩타이드쇄를 발현시키기 위해서, 상기 폴리펩타이드쇄의 5'말단에 pe1B를 부호화하는 핵산을 배치함으로써 분비를 촉진하는 것이 가능하다. 이와 같이 해서, 시그널 펩타이드를 N 말단에 융합한 본 발명의 금-결합성 단백질 또는 그의 구성으로서 사용된 도메인은 페리플라슴 분획 및 배지 상청액으로부터 정제될 수 있다. 또, 발현시킨 단백질의 정제시 작업의 간편성을 고려해서, 독립한 각 도메인 또는 2개 이상의 도메인을 조합해서 형성된 폴리펩타이드쇄의 N 또는 C 말단에 정제용의 태그를 유전자 공학적으로 배치하는 것이 가능하다. 상기 정제용 태그는 연속적으로 배치된 6개의 히스티딘 잔기로 이루어진 히스티딘 태그(이하, His×6) 및 글루타티온-S-트랜스페라제의 글루타티온-결합부위 등일 수 있다. 상기 태그의 도입방법으로서는, 예를 들어, 상기 발현용 벡터에 있어서의 금-결합성 단백질을 부호화하는 핵산의 5' 또는 3'말단에 정제용 태그를 부호화하는 핵산을 삽입하는 방법 또는 시판의 정제태그 도입용 벡터를 사용하는 방법이 있다.
이하에, 상기 발현벡터를 이용한 본 발명의 금-결합성 복합 단백질의 제조방법에 대해서 설명한다.
본 발명의 금-결합성 복합 단백질 또는 그 구성 요소로 제공되는 폴리펩타이드쇄는, 종래 기지의 단백발현용의 숙주세포에, 숙주 세포에 따라서 설계된 상기 금-결합성 복합 단백질 발현용 벡터를 형질전환하고; 숙주 세포 내의 단백합성시스템을 이용해서, 숙주 세포 내에 소망의 단백질을 제조함으로써 합성된다. 그 후, 숙주 세포 내외에 축적 또는 분비된 목적 단백질을 세포 내부 또는 세포 배양 상청액으로부터 정제함으로써 얻을 수 있다.
예를 들어, 대장균을 숙주세포로서 이용할 경우, 본 발명의 금-결합성 복합 단백질을 부호화하는 핵산의 5'측에 pe1B로 대표되는 종래 공지의 시그널 펩타이드를 부호화하는 핵산을 배치함으로써 분비·발현을 용이하도록 구축할 수 있다. 하나의 발현용 벡터에 의해 본 발명의 금-결합성 복합 단백질을 구성하는 각 도메인을 얻기 위한 2개 이상의 폴리펩타이드쇄를 발현시키기 위해, 각 폴리펩타이드쇄를 부호화하는 핵산의 5' 말단에 pe1B를 부호화하는 핵산을 배치하여 세포질 밖으로의 분비를 촉진시킨다. 이와 같이 해서 시그널 펩타이드를 그의 N 말단에 융합한 본 발명의 금-결합성 단백질은 페리플라슴 분획 및 배지 상청액으로부터 정제하는 것이 가능하다. 정제방법으로서는, 상기 정제용 태그가 His-태그인 경우, 니켈 킬레이트 컬럼을 이용해서 정제할 수 있고, 또는, 상기 정제용 태그가 GST인 경우, 글루타티온고정화 컬럼을 사용함으로써 정제하는 것이 가능하다.
또, 균체 내에 발현된 본 발명의 금-결합성 복합 단백질은 불용성 과립에 의해서 얻어지는 것도 가능하다. 이 경우, 배양액으로부터 얻어진 균체를 프렌치 프레스나 초음파에 의해 파쇄한 세포 균질화 용액으로부터 상기 불용성 과립을 원심분리하는 것이 가능하다. 얻어진 불용성 과립분획을 요소 및 염산 구아니딘염을 지닌 종래 공지의 변성제를 함유한 완충용액에 의해 가용화한 후에, 변성조건하에서 전술한 바와 같은 컬럼에 의한 정제를 행하는 것이 가능하다. 얻어진 컬럼 용출 분획은 리폴딩 작업에 의해, 변성제 제거와 활성 구조재의 재구축을 행하는 것이 가능하다. 이용되는 리폴딩 방법은 종래 공지된 어떠한 방법이라도 적절하게 선택할 수 있다. 특히, 단계 투석법이나 희석법 등을 목적의 단백에 따라서 이용하는 것이 가능하다.
본 발명의 금-결합성 단백질의 각 도메인 혹은 각 폴리펩타이드쇄는 동일 숙주세포 내에서 발현시키고 나서 복합체화하는 것도 가능하거나, 또는 별도의 숙주세포를 사용해서 발현시킨 후에 서로 공존시킨 상태에서 복합체화하는 것도 가능하다.
또, 본 발명의 금-결합성 단백질을 부호화하는 벡터를 이용해서, 세포추출액으로부터 시험관내에서 단백질을 발현시키는 것도 가능하다. 여기에서 적절하게 이용되는 세포추출액의 예로는 대장균, 밀배아 응집소 및 토끼 망상 적혈구가 포함된다. 그러나, 무세포 추출액 중에서의 단백질의 합성은 일반적으로는 환원조건하에서 행해진다. 그 때문에, 항체 단편 중의 디설파이드 결합을 형성시키기 위해서 어떠한 처리를 행하는 쪽이 보다 바람직하다.
본 발명의 금-결합성 복합 단백질의 바람직한 해리 상수(KD)는 0.1% 트윈 20의 존재 중 버퍼 조건하에서 10-6M 이하이며, 더욱 바람직하게는 10-8M 이하이다. 본 발명자들은, 상기 조건하에 있어서, 비교적 금에 대한 높은 흡착을 보이는 것으로 간주되는 단백질 재료가 금에 흡착될 수 없는 것을 연구에 의해 확인하였다. KD값이 10-6M 이하이면, 상기와 같은 비특이 흡착성의 단백질의 흡착거동과 충분히 구별될 수 있다. 그 밖에, 10-8M 이하이면 고정화용의 앵커 분자로서 충분히 기능할 수 있다.
본 발명의 금을 지닌 표적 물질에 대해서 결합능을 지니는 항체중쇄가변영역(VH) 또는 항체 경쇄가변영역(VL)을 취득하는 방법의 하나로서, 상기 VH 또는 VL 유전자 라이브러리를 제작하고; 이들을 단백질로서 포괄적으로 발현시켜서; 금 또는 표적 물질에 대한 친화성에 의거해서 단백질과 유전자 간의 대응관계에 의해서 대응하는 것을 선택하는 방법이 있다. 상기 유전자 라이브러리는 예를 들어, 제대혈, 편도, 골수, 또는 말초 혈세포 혹은 비 세포로부터 얻어질 수 있다. 예를 들어, mRNA는 인간 말초 혈세포로부터 추출되어, cDNA가 제조된다. 다음에, 인간 VH- 또는 VL-부호화 서열을 프로브로서 사용해서 인간 VH 또는 VL의 cDNA 라이브러리를 제작한다. 예를 들어, 인간 VH 패밀리(VH1 내지 VH7)를 패밀리마다 광범위하게 증폭하는 것이 가능한 프라이머 및 인간 VL을 증폭시킬 수 있는 프라이머는 당업계에 있어서 공지이다. 이들 VH 혹은 VL 마다 프라이머를 함께 조합시켜서 RT-PCR을 행하여, VH- 또는 VL-부호화 유전자를 취득하였다. 대안적으로, 파지 디스플레이법을 이용하는 것도 가능하다. 파지 디스플레이법은 VH, VL 또는 VH 혹은 VL을 함유하는 복합체(예를 들어, Fab, scFｖ)를 부호화하기 위한 유전자 라이브러리를 파지 외피 단백질을 부호화하는 유전자와 조합하고; 파지미드 라이브러리를 제작하고; 이들 파지미드 라이브러리를 대장균으로 형질전환하고; 각종 VH 또는 VL을 외피 단백질의 일부로서 지니는 파지로서 발현시킨다. 이들 파지를 이용해서, 상기와 마찬가지로 해서 금 또는 표적 물질에 대한 친화성에 의해 선택하는 것이 가능하다. 파지에 의해 융합 단백으로서 제시된 VH 또는 VL을 부호화하는 유전자는 파지의 파지미드에 의해 부호화되어 있으므로 DNA 서열해석을 함으로써 특정될 수 있다.
또한, 금 또는 표적물질에 의해서 면역된 동물로부터 목적의 항체를 산출하는 세포를 채취하고, 상기와 마찬가지 프라이머를 사용하여, VH 또는 VL의 염기서열 및 아미노산 서열을 특정할 수 있다.
또, 본 발명의 제 3 도메인 및 제 4 도메인은 표적물질에 대해서 기지의 항체 또는 그의 단편의 가변영역의 아미노산 서열에 의거해서 설계하는 것이 가능하다. 또, 표적 물질에 대한 항체 또는 그의 단편이 취득되지 않은 경우, 이것에 대한 항체를 취득한 후에 아미노산 서열을 해석함으로써, 상기와 마찬가지로 해서 설계하는 것도 가능하다. 상기 제 3 도메인과 상기 제 4 도메인이 함께 본 발명의 금-결합성 단백질을 구성하는 도메인이어도 된다. 이와 같이 해서, 얻어진 VH 또는 VL의 염기서열을 이용해서, 본 발명의 금-결합성 복합 단백질을 제작하는 것이 가능하다.
- 금을 지닌 피결합 대상물
면역, 패닝 등에 의해 금-결합성 단백질을 선택할 때 이용되는 피결합 대상물로서는 앞서 금-결합성 단백질의 경우에 예시된 것을 이용할 수 있다.
- 기재
본 발명의 금-결합성 복합 단백질은 기재와 조합시킴으로써 각종 용도에 이용될 수 있는 구조체를 얻는 것이 가능하다. 이 용도에 이용될 수 있는 기재로서는 앞서 금-결합성 단백질의 경우에 예시한 것을 이용할 수 있다.
- 표적 물질
본 발명에 의한 금-결합성 복합 단백질은 금에 대한 친화성을 지니는 도메인과, 표적 물질에 대해서 친화성을 지닌 도메인으로 구성함으로써, 단백질을 표적 물질 검출용 복합 단백질로서 이용하는 것이 가능해진다. 이 검출대상으로서 제공되는 표적물질로서는 항원/항체 반응을 이용한 각 수법에 있어서 항원으로 제공될 수 있는 분자라면 어떠한 것이라도 이용될 수 있다. 예를 들어, 표적 물질은 비생체물질과 생체물질로 크게 분류될 수 있다.
산업상 이용가치가 큰 비생체물질의 예로서는, 염소치환수와 위치가 다른 환경오염물질인 PCB류 및 다이옥신류, 소위 환경호르몬이라 불리는 내분비교란물질(예를 들어, 헥사클로로벤젠, 펜타클로로페놀, 2,4,5-트리클로로아세트산, 2,4-디클로로페녹시 아세트산, 아미트롤, 아트라진, 알라클로르, 헥사클로로사이클로헥산, 에틸파라티온, 클로르단, 옥시클로르단, 나노클로르, 1,2-디브로모-3-클로로프로판, DDT, 켈센(kelthane), 알드린, 엔드린, 디엘드린, 엔도설판(벤조에핀), 헵타클로르, 헵타클로르 에폭사이드, 말라티온, 메토밀, 메톡시클로르, 미렉스, 니트로펜, 톡사펜, 트리플루랄린, 알킬페놀(탄소수 5 내지 9개를 지님), 노닐페놀, 옥티노닐페놀, 4-옥틸페놀, 비스페놀 A, 프탈산 디-2-에틸헥실, 프탈산 부틸벤질, 프탈산 디-n-부틸, 프탈산 디사이클로헥실, 프탈산 디에틸, 벤조(a)피렌, 2,4-디클로로페놀, 아디프산 디-2-에틸헥실, 벤조페논, 4-니트로톨루엔, 옥타클로로스티렌, 알디카브, 베노밀, 케폰(클로르데콘), 만제브(만코베즈), 마네브, 메티람, 메트리부진, 시페르메트린, 에스펜발레렐이트, 펜발레레이트, 퍼메트린, 빈클로졸린, 지네브, 지람, 프탈산 디페틸, 프탈산 디헥실 및 프탈산 디프로필) 등을 들 수 있다.
생체 물질로는 핵산, 단백질, 당쇄(sugar chain), 지질 및 이들의 복합체로부터 선택된 생체물질이 포함되고, 특히, 핵산, 단백질, 당쇄 및 지질로부터 선택된 생체 물질이 포함된다. 구체적으로는 DNA, RNA, 아파타머(apatamer), 유전자, 염색체, 세포막, 바이러스, 항원, 항체, 렉틴, 합텐, 호르몬, 수용체, 효소, 펩타이드, 스핑고당지질 및 스핑고지질의 어느 것으로부터 선택된 물질을 함유하는 물질이면 어떠한 것이라도 본 발명을 적용할 수 있다. 또한, 상기 "생체 물질"을 생산하는 세균이나 세포 자체도, 본 발명이 대상으로 하는 "생체 물질"로서 표적물질로 될 수 있다.
단백질의 구체적인 예로는, 소위 질병 표지자가 포함된다. 그 예로서는, 태아기에 간세포에서 생산되는 태아혈액중에 존재하는 산성 당단백으로, 간세포암(원발성 간암), 간모세포종, 전이성 간암, 난황낭 종양의 표지자로서의 α-태아단백(AFP); 간실질장애시에 출현하는 이상 프로트롬빈으로, 간세포암에서 특이적으로 출현하는 것이 확인된 PIVKA-II; 면역조직화학적으로 유방암에 특이적인 항원인 당단백으로, 원발성 진행 유방암 및 재발·전이유방암의 표지자로서의 BCA225; 사람 태아의 혈청, 장 및 뇌세포 추출액에서 발견되는 염기성 태아단백으로, 난소암, 고환종양, 전립선암, 췌장암종, 담도암, 간세포암, 신장암, 폐암, 위암, 방광암 및 대장암의 표지자로서의 염기성 태아단백(BFP); 진행 유방암, 재발 유방암, 원발성 유방암 및 난소암의 표지자로서의 당쇄 항원인 CA15-3; 췌장암종, 담도암, 위암, 간암, 대장암 및 난소암의 표지자로서의 당쇄항원인 CA19-9; 난소암, 유방암, 결장·직장암, 위암 및 췌장암종의 표지자로서의 당쇄 항원인 CA72-4; 난소암(특히 장액성 낭샘암종), 자궁체부 선암종, 난관암, 자궁경부 선암종, 췌장암종, 폐암 및 대장암의 표지자로서의 당쇄 항원인 CA125; 상피성 난소암, 난관암, 폐암, 간세포암 및 췌장암종의 표지자로서의 당단백인 CA130; 난소암(특히 장액성 낭샘암종), 자궁체부 선암종, 자궁경부 선암종의 표지자로 되는 코어단백항원인 CA602; 난소암(특히 점액성 낭샘암종), 자궁체부 선암종 및 자궁경부 선암종의 표지자로서의 모세포핵산당쇄관련 항원인 CA54/61(CA546); 대장암, 위암, 직장암, 담도암, 췌장암종, 폐암, 유방암, 자궁암 및 비뇨계 암종 등의 종양관련 표지자 항원으로서 현재 암 진단의 보조에 가장 널리 이용되고 있는 암배아성 항원(CEA); 췌장암종, 담도암, 간세포암종, 위암, 난소암 및 대장암의 표지자로서의 당쇄 항원인 DUPAN-2; 췌장에 존재하고 결합 조직의 탄성 섬유 엘라스틴(동맥벽, 힘줄 등을 구성함)을 특이적으로 가수분해하는 외분비 이자 단백분해효소로, 췌장암종, 췌장낭암(pancreatic cisterna) 및 담도암의 표지자로서의 엘라스타제 1; 인간 암환자의 복수나 혈청 중에 고농도로 존재하는 당단백으로, 폐암, 백혈병, 식도암, 췌장암종, 난소암, 직장암, 담관암, 위암, 방광암종, 대장암, 갑상선 암종 및 악성 림프종의 표지자로서의 면역억제 산성 단백(IAP); 췌장암종, 담도암, 유방암, 대장암, 간세포암종, 폐 선암종 및 위암의 표지자로서의 당쇄 항원인 NCC-ST-439; 전립선 암의 표지자로서의 당단백인 γ-세미프로테인(γ-Sm); 사람 전립선 조직으로부터 추출되는 당단백으로, 전립선 조직에만 존재하고, 소위 전립선암의 표지자로서의 전립선특이 항원(PSA); 전립선으로부터 분비되는 산성 pH하에서 인산에스테르를 가수분해하는 효소이며, 전립선암의 종양 표지자로서 사용되는 전립선 산성 인산효소(PAP); 신경 조직 및 신경내 분비세포에 특이적으로 존재하는 해당계 효소이며, 폐암(특히 폐소세포암종), 신경모세포종, 신경계 신생물, 이자섬 암, 식도 소세포 암종, 위암, 직장암 및 유방암의 표지자로서 신경특이 에놀라제(NSE); 자궁 경부 평편상피암의 간전이 병소로부터 추출 · 정제된 단백질로, 자궁암(경부편평 상피암), 폐암, 식도암, 두경부 암 및 피부 암종의 표지자로서의 평편상피암관련 항원(SCC 항원); 폐 선암종, 식도암, 위암, 대장암, 직장암, 췌장암종, 난소암 및 자궁암의 표지자로서의 당쇄 항원인 시알릴 LeX-i항원(SLX); 췌장암종, 담도암, 간암, 위암 및 대장암의 표지자로서의 당쇄 항원인 SPan-1; 식도암, 위암, 직장·결장암, 유방암, 간세포암종, 담도암, 췌장암종, 폐암 및 자궁암의 표지자로서, 특히 다른 종양 표지자와 조합시켜 진행성 암을 추측하고, 재발 예지·치료경과관찰로서 유용한 단일쇄 폴리펩타이드인 조직 폴리펩타이드 항원(TPA); 난소암, 전이성 난소암, 위암, 대장암, 담도계 암, 췌장암종 및 폐암의 표지자로서의 모세포 핵 탄수화물 항원인 시알릴 Tn항원(STN); 폐의 비소세포암종, 특히 폐의 편평 상피암의 검출에 유용한 종양 표지자로서의 사이토케라틴(CYFRA); 위액 중에 분비되는 단백소화효소인 펩신의 2종(PG I, PG II)의 불활성 전구체로, 위궤양(특히, 저위 위궤양), 십이장 궤양(특히, 재발 및 난치의 경우), 브루너샘(Brunner's gland)종, 드조 링거 엘리슨 증후군(Dzo ringer Ellison syndrome) 및 급성 위염의 표지자로서의 펩시노겐(PG); 조직 장애 및 감염에 의해 혈장 중에서 변화하는 급성 상반응단백으로, 급성심근경색증 등에 의해 심근에 괴사가 일어나면 높은 수치를 표시하는 C-반응성 단백(CRP); 조직 장애 및 감염에 의해 혈장 중에서 변화하는 급성 상반응 단백인 혈청 아밀로이드 A 단백(SAA); 주로 심근 및 골격근에 존재하는 분자량 약 17,500인 헤모 단백질로, 급성 심근경색증, 근육퇴행위축, 다발근육염 및 피부근육염의 표지자로서의 미오글로빈; 골격근 혹은 심근의 가용성 분획에 주로 존재하고, 세포 병변에 의해서 혈액 중에 유출하는 효소로, 급성 심근경색증, 갑상선기능저하증, 진행근육퇴행위축 및 다발근육염의 표지자로서의 크레아틴 키나제 (CK)(골격근 유래의 CK-MM형, 뇌 및 평활근 유래의 CK-BB형 및 심근 유래의 CK-MB형의 3종의 동종 효소(isozyme) 및 미토콘드리아 동종효소 또는 면역글루부린-결합형 CK(매크로 CK)); 횡문근의 얇은 필라멘트상에서 트로포닌 I 및 C와 함께 트로포닌 복합체를 형성하고, 근수축의 조절에 관여하고 있는 분자량 39,000의 단백질로, 횡문근융해증, 심근염, 심근경색증 및 신부전의 표지자로서의 트로포닌 T; 골격근 및 심근의 양쪽에 포함된 단백질로, 측정 결과의 상승은 골격근 및 심군의 장해나 괴사를 의미하므로, 급성 심근 경색증, 근육퇴행 위축 및 신부전의 표지자로서의 심근 미오신 경쇄 I; 또는 최근 스트레스 표지자로서 주목되고 있는 크로모그라닌 A, 타이오레독신 및 8-OhdG 등을 들 수 있다.
- 표적 물질 검출용 키트
본 발명에 의한 금-결합성 복합 단백질을 이용해서 표적물질 검출용 키트를 구성하는 것이 가능하다. 예를 들어, 제 2 도메인 및 필요에 따라서 임의로 이용되는 제 4 도메인에 표적 물질에 대해서 특이적으로 결합하는 항체 및 그 변이체를 이용한 금-결합성 복합 단백질; 금을 포함하는 표면을 지닌 기재; 및 이 기재상에 금-결합성 복합 단백질을 개재해서 고정한 표적물질을 검출하기 위한 검출수단을 포함하는 표적물질검출용 키트를 구성하는 것이 가능하다. 금 기재상에 금-결합성 복합 단백질을 통해서 고정된 표적 물질의 검출에는 전술한 표면 플라스몬 공명측정장치에 의해서 측정하는 것이 가능하다. 또, 금을 일부 함유하는 기재를 표지제로서 이용해서 표적물질을 검출하는 방법을 이용할 수 있다. 전술한 금-결합성 복합 단백질은 이와 같은 금 기재, 표지제 및 표적물질을 중개하는 물질로서 이용될 수 있다. 이들 표적물질을 인식하여 결합하는 항체 단편을 이용해서 형성된 금-결합성 복합단백질을 발명에 사용하는 것이 가능하다.
도 1은 본 발명에 의한 복합 단백질의 일례에 있어서의 구조체의 구성을 모식적으로 표시한 도면
도 2A 및 도 2B는 각각 본 발명에 의한 복합 단백질의 일례에 있어서의 구조체의 구성을 모식적으로 표시한 도면
도 3은 본 발명에 의한 복합 단백질의 일례에 있어서의 구조체의 구성을 모식적으로 표시한 도면
도 4A 및 도 4B는 각각 본 발명에 의한 복합 단백질의 일례에 있어서의 구조체의 구성을 모식적으로 표시한 도면
도 5는 본 발명에 의한 복합 단백질의 일례에 있어서의 구조체의 구성을 모식적으로 표시한 도면
도 6은 본 발명에 의한 복합 단백질의 일례에 있어서의 구조체의 구성을 모식적으로 표시한 도면
도 7은 본 발명에 의한 복합 단백질의 일례에 있어서의 구조체의 구성을 모식적으로 표시한 도면
도 8은 본 발명에 의한 복합 단백질의 일례에 있어서의 구조체의 구성을 모식적으로 표시한 도면
도 9는 본 발명에 의해 얻어진 VL의 SPR 평가의 일례를 표시한 도면
도 10은 본 발명에 의해 얻어진 VH의 SPR 평가의 일례를 표시한 도면
도 11은 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 벡터의 모식도
도 12A 및 도 12B는 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 벡터의 모식도
도 13은 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 벡터의 모식도
도 14는 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 벡터의 모식도
도 15는 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 벡터의 모식도
도 16은 본 발명의 실시예를 설명하기 위한 벡터의 모식도
도 17은 본 발명에 의해 얻어진 scFｖ의 SPR 평가의 일례를 표시한 도면
도 18은 실시예 21에 있어서의 SPR 차트
도 19는 실시예 31에 있어서의 GPC 차트
도 20은 실시예 32에 있어서의 SPR 차트
도 21은 실시예 34에 있어서의 SPR 차트
도 22는 실시예 36에 있어서의 SPR 차트
도 23은 실시예 37에 있어서의 GPC 차트
도 24는 실시예 38에 있어서의 SPR 차트
도 25는 실시예 40에 있어서의 GPC 차트
도 26은 실시예 42에 있어서의 금 미립자를 함유하는 용액의 흡광곡선
도 27은 비교예 3에 있어서의 SPR 차트
도 28은 비교예 4에 있어서의 SPR 차트
이하, 본 발명의 실시예로서 금에 대해서 결합을 나타내는 단백질의 취득과 그 평가에 대해 상세하게 말한다. 본 발명은, 본 실시예의 기재 내용으로 제한되는 것은 아니다.
실시예 1(항체 중쇄 가변 영역 VH 라이브러리의 제작)
사람 성인 말초 혈액 B 림프구로부터 유래된 Fab 라이브러리를 주형으로서 이용함으로써, VH 부호화 유전자를 이하의 프라이머에 의해 PCR(타카라 바이오사, LA 키트)에서 권장되는 방법에 따라 DNA 복제를 실시하였다. 프라이머는 다음과 같이 설정하였다.
· 백 프라이머
(서열 번호：78)
5'－TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG－3'
(서열 번호：79)
5'－TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGRTYCAGCTGGTGCAGTCTGG－3'
(서열 번호：80)
5'－TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGSTRCAGCTGCAGSAGTCRGG－3'
(서열 번호：81)
5'－TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCSARGTGCAGKTGGTGGAGTCTGG－3'
(서열 번호：82)
5'－TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCCAGTGTGAGGTGCAGCTGGTGG－3'
(서열 번호：83)
5'－TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGSAGTGGGG－3'
· 포워드 프라이머
(서열 번호：84)
5'－ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCC－3'
(서열 번호：85)
5'－ATTCTCGACTGCTAGCTGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC－3'
(서열 번호：86)
5'－ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC－3'
(서열 번호：87)
5'－ATTCTCGACTGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC－3'
(1) 상기 Fab 라이브러리를 주형으로 이용함으로써, 상기 프라이머를 이용해서 PCR에 의해 VH 부호화 유전자를 증폭시켰다. PCR 조건： 95 ℃×10 분(94℃×1 분, 60℃×2 분, 72℃×2 분)×35 사이클, 72℃×6 분).
(2) 단백 발현용 벡터로서 pLUCK(Biochem Biophys Res Commun. 218, pp682, 1996)의 멀티 클로닝 사이트를 도 11에 나타낸 바와 같이 개량한 플라스미드 pRA－XX를 준비하였다(HindIII에 이어서, 시그널 펩타이드로서의 pe1B를 부호화하는 뉴클레오타이드 서열을 배치하였다. 계속해서, NcoI와 EcoRI 사이에, NheI/SacII/SpeI의 순서로 제한 효소 부위를 배치하고, SacII/SpeI 사이에 His×6을 부호화하는 뉴클레오타이드 서열을 배치하였다. 또, 암피실린 내성 유전자, T7 프로모터, lac 오퍼레이터, T7 터미네이터 서열은 플럭(pluck)과 같은 것이었 다).
(3) 상기 PCR 산물 및 상기 플라스미드를 NcoI/NheI(각각 New England Biolabs사 제품)에서 권장하는 방법에 따라 제한 효소를 이용해서 절단하였다.
상기 제한 효소에 의해 절단한 플라스미드 용액을 스핀 컬럼 400 HR(아머샴 사이언스사 제품)에 걸었다.
(4) 제한 효소에 의해 절단한 PCR 단편 용액을 시판의 겔 정제 키트(SV Gel and PCR Clean－up system： Promega사 제품)를 사용해서 정제하였다.
(5) 상기 2개의 단편을, 시판의 T4 리가제 키트(Roche사)를 공급업자가 권장하는 방법에 따라 혼합해서 라이게이션을 실시하였다. 그 결과 도 12A에 나타낸 VH부호화 유전자 삽입 벡터를 얻었다.
(6) 라이게이션 산물을 이용해서 전기충격법(electropolation)을 통해 대장균 DS12S주의 형질 전환을 실시했다. 플라스미드가 대규모로 제조되었다.
(7) 이들 플라스미드 용액을 계열 희석해서, 각각의 용액을 전기충격을 통해서 대장균 BL21(DE3)의 형질 전환을 실시하였다. 이 용액에 LB 배지 700 ㎕를 첨가한 후에, 전체를 37℃에서 1시간 진탕 배양했다. 배양액을 6,000 rpm으로 5분간 원심분리한 후에, 상청액 650 ㎕를 폐기했다.
(8) 나머지 상청액과 침전분획을 현탁시키고, 이 현탁액을 LB/Amp. 판에 접종하였다. 이어서, 전체를 37℃에서 하룻밤 정치시켰다. 그 결과, 최종적으로 대략 5×105 클론을 함유하는 항체 VH 라이브러리를 얻었다.
(9) 다음에, 상기 103배 희석 판 3매로부터 임의로 1000개의 콜로니를 선택해서, 이하의 공정에 따라 단백 조제 추출액을 제조하였다. 각 콜로니를 LB/amp. 배지 3 ㎖ 중에서 더욱 배양하고, 전체를 28℃에서 6시간 진탕 배양하였다. 다음에, IPTG를 최종농도가 1 mM이 되도록 첨가하고, 전체를 더욱 12시간 진탕 배양하였다.
(10) 이어서, 원심분리(10, 500 rpm×5 분)에 의해, 배양분획 및 상청 균체 분획을 얻었다.
(11) 얻어진 균체 분획을 얼음 속에서 냉각한 삼투 용액(0.5 M 슈크로오스, 1 M Tris－HCl(pH 8.0), 0.5 mM EDTA) 200 ㎕를 가해 현탁시키고, 전체를 얼음 속에서 10분간 정치시켰다. 다음에, 냉각시킨 멸균수 1 ㎖를 가해서, 전체를 얼음 속에서 1시간 정치시켰다. 얻어진 것을 원심분리(6,000 rpm×30 분)한 후, 상청액을 투석 백(MWCO 10,000)에 넣고, 외부용액으로서 Tris＋0.1% 트윈 20 용액(20 mM Tris, 500 mM NaCl)을 이용해서 6 시간마다 외부용액을 교환하면서 18시간 투석하였다.
상기 공정에서 얻어진 투석 내부용액을 금-결합성 항체중쇄가변 영역(VH)의 스크리닝용 샘플로 이용하였다.
실시예 2(금-결합성 항체중쇄가변 영역( VH )의 스크리닝)
금-결합성 항체중쇄가변 영역(VH)의 스크리닝용 기판으로서 금을 증착(두께 100 nm)한 96웰 역가판을 준비했다. 실시예 1에서 얻어진 1000개의 샘플 용액 250 ㎕를 각 웰에 분주하고, 1시간 서서히 흔들었다. 상청액을 폐기한 후, 판을 뒤집어, 종이 타월 상에서 10회 두드려, 수분을 없앴다. 세정 공정으로서 Tris＋0.1% 트윈 20 200 ㎕를 각 웰에 가하고; 10분간 서서히 흔드는 공정을 실시하였으며, 이 작업은 3회 반복하였다. HRP-결합 항His항체(인비트로젠(Invitrogen)사 제품)를 1：10000으로 Tris＋0.1% 트윈 20 용액으로 희석한 항체 용액 200 ㎕를 각 웰이 분주해서, 1시간 서서히 흔들었다. 계속해서, 상기 세정 공정과 같은 작업을 실시하였다. HRP 기질 및 발색재가 되는 디텍트 리에이젠트(Detect Reagent) 1 및 2(아머샴 사이언스사 제품)를 각각 100 ㎕씩 각 웰에 분주하고, 상기 판을 1분간 서서히 흔들었다. 루미놀의 화학 발광량을 정량하였다.
상기한 바와 같이 화학 발광이 관찰된 15개의 샘플 콜로니를, LB/amp. 1.5 ㎖에서 더욱 배양하고, 전체를 37℃에서 하룻밤 진탕 배양하였다. 얻어진 균체로부터 SV MiniPrep DNA purification system(프로 메가사)에 의해, 플라스미드를 정제하였다. 상기 설명한 바와 같이 얻어진 17개의 VL-제시 파지미드의 DNA 서열을 이하의 방법에 따라 결정하였다. 서열결정용 프라이머는 발현용 벡터의 VH 부호화 유전자의 상류에 위치하는 pe1B 서열부에 설정되었다. 서열결정용의 프라이머는 다음과 같았다.
pe1B－back
(서열 번호：88) 5'－ccgct ggatt gttat tactc gc－3'
상기 프라이머, 및 공급자가 권장하는 서열결정용 반응 키트와 반응액 조성을 이용해서 BigDye－PCR 반응을 실시했다. 온도 사이클은 96℃×3분→(94℃×1 분→50℃×1분→68℃×4 분)×30 사이클이었다. 다음에, 에탄올 침전에 의해 정제한 상기 PCR 산물의 염기 서열을 서열분석기(ABI사 제품; 377)에 의해 결정하였다. 그 결과, 서열 번호：58 내지 서열 번호：74의 각 서열을 얻었다.
실시예 3(항체 경쇄가변 영역 VL 라이브러리의 제작)
실시예 1과 같은 방법에 의해, 사람 말초 혈액세포의 Fab 라이브러리로부터 VL 유전자 라이브러리를 제작하였다. 프라이머는 다음과 같았다.
· 백(back) 프라이머
(서열 번호：89)
5'－TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGMCATYCAGWTGACCCAGTCTCC－3'
(서열 번호：90)
5'－TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGATRTTGTGATGACYCAGWCTCC－3'
(서열 번호：91)
5'－TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAAATTGTGWTGACGCAGTCTCC－3'
(서열 번호：92)
5'－TCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGACATCGWGHTGACCCAGTCTCC－3'
· 포워드(forward) 프라이머
(서열 번호：93)
5'－TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATTTCCACCTT GGTCCC－3'
(서열 번호：94)
5'－TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCAGCTTGGTCCC－3'
(서열 번호：95)
5'－TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATATCCACTTT GGTCCC－3'
(서열 번호：96)
5'－TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTGATCTCCACCTT GGTCCC－3'
(서열 번호：97)
5'－TTCTCGACTTGCGGCCGCACGTTTAATCTCCAGTCG TGTCCC－3'
또, 실시예 1의 (2)에 있어서의 단백 발현용 플라스미드의 제작시, NcoI/SacII간의 NheI를 NotI로 변경한 이외에는 마찬가지로 해서 플라스미드를 제작하여, 이용하였다. 또한, 실시예 1의 (11)의 공정 종료시에 얻어진 VL단백 투석 내부용액을 금-결합성 항체 경쇄가변영역(VL)의 스크리닝의 샘플로서 사용하였다
실시예 4(금-결합성 항체 경쇄가변 영역( VL )의 스크리닝)
스크리닝 샘플로서 실시예 3에서 얻어진 샘플을 이용한 이외에는 실시예 2와 마찬가지 방식으로 금-결합성 VL의 스크리닝을 수행하였다. 그 결과, 서열 번호： 75 내지 서열 번호： 77의 각 서열을 얻었다.
이하, 실시예 1의 사람 말초 혈액세포 Fab 유전자 라이브러리로부터 파지미드를 제작해서, 금-결합성 VL 또는 VH를 스크리닝하였다.
실시예 5(금 친화성 VL -제시 파지군의 스크리닝)
이하의 순서에 의해, VL-제시 파지 라이브러리를 제작해서, 금에 결합가능한 파지군을 선택하였다.
(1) VL 제시용 파지미드
사람 성인 말초 혈액 B 림프구 유래 Fab 라이브러리를 주형으로서 이용해서, 서열 번호： 89 내지 97의 프라이머에 의해 VL 부호화 유전자를 복제하였다. 더욱이, M13 파지의 외피 단백으로서 역할하는 PIII 단백의 N 말단의 일부를 결손시켜, VL 단백이 융합되어 발현되도록 제작된 VL-제시 파지미드(도 12B)의 라이브러리를 사용하였다(Biochem Biophys Res Commun. 1996, 218, pp682).
(2) VL 단편 제시 파지 라이브러리 제작
1) 형질 전환
상기 VL 부호화 유전자 라이브러리(350 ng/㎕) 1 ㎕를 대장균 DH 12S 40 ㎕에 전기 충격(인가 전압： 1.5 KV, 저항： 186 Ω, 용량： 50 μF)에 의해 형질 전환시켰다. 다음에, 이하의 순서에 따라 VL-제시 파지 라이브러리를 제조하였다.
2) 배양
(i) 형질 전환 후의 DH 12S 용액에 LB 배지 800 ㎕를 가하고, 이들 전체를 37℃에서 1시간 진탕 배양(140 rpm)하였다.
(ii) 상기 배양액 20 ㎖를 LB배지＋최종농도 암피실린 100 μg/㎖(LB/amp.) 에 가하고, 전체를 37℃에서 3 내지 4시간 배양하였다.
(iii) 헬퍼 파지로서의 M13KO7 40 ㎕를 가하고, 전체를 더욱 1시간, 100 rpm에서 진탕 배양하였다.
(iv) 50 mg/㎖ 카나마이신 용액을 최종 농도 50μg/㎖가 되도록 가하고, 전 체를 37℃에서 진탕 배양(100 rpm)하였다.
3) VL-제시 파지 라이브러리의 회수
(i) 상기 배양액에 20% PEG/500 mM NaCl을 5 ㎖ 가하고, 전체를 얼음 속에서 1시간 이상 방치하였다.
(ii) 원심분리(6,500 rpm×35 분)에 의해서 상청액을 조심스럽게 제거하였다.
(iii) 침전을 PBS 버퍼 500 ㎕에 현탁시키고, VL-제시 파지 용액을 준비하였다.
4) VL-제시 파지 라이브러리의 역가 평가
(i) JM109 글리세롤 스톡 10 ㎕를 LB에 가하고, 전체를 37℃에서 진탕 배양하였다.
(ii) 상기 3)에서 준비한 VL-제시 파지 용액을 LB배지에 의해 계열 희석하였다.
(iii) OD600이 약 0.5인 (a) 배양액 750 ㎕에 계열 희석(×10-6 내지 10-10) 용액 10 ㎕를 가하고, 전체를 37℃에서 1시간 진탕 배양하였다.
(iv) 원심분리(6,000 rpm×5 분)를 실시해서, 배양 상청액 700 ㎕를 제거하였다.
(ｖ) 남은 배지 상청액과 침전을 피펫팅에 의해 현탁하고, 이어서, 이 현탁액을 LB/amp. 판에 접종하고, 전체를 37℃에서 하룻밤 정치시켰다.
(ｖi) 콜로니가 100 이하가 되는 희석 농도 판 상에 생긴 콜로니의 수를 계수해서, VL-제시 파지 라이브러리의 역가값으로 정의하였다.
얻어진 VL-제시 파지 라이브라이리 용액： 5×109 cfu/㎕.
(3) 금 미립자를 이용한 VL 패닝
상기에서 설명한 바와 같이 제작한 파지 라이브러리 용액과 금 미립자(1.5 ㎛φ： 시그마-알드리치사 제품)를 이용해서 이하의 방법에 따른 패닝 작업을 5 라운드 반복해서, 금-결합성 VL을 제시하는 파지군을 선택하는 것을 목적으로 했다.
1) 결합 실험
(i) 멸균 에펜도르프 튜브(Eppendorf tube)(1.5 ㎖)에 상기 파지 용액(용액 중의 전체 파지수가 1,010 cfu가 되는 체적)에 대해서, 상기 금 미립자 용액(50 mg/PBS 1 ㎖) 10 ㎕, 그리고 PBS＋0.1% 트윈 20(PBST)을, 전체 체적이 1000 ㎕가 되도록 가해서, 얻어진 것을 결합 반응 용액으로 준비하였다.
(ii) 상기 결합 반응 용액을 실온에서 서서히 회전시키면서 30분간 유지했다.
(iii) 상기 (ii)에서 얻어진 것을 원심분리(10, 000 rpm×5 분)해서, 상청 용액을 조심스럽게 폐기하였다.
2) 세정(비특이 흡착물의 세정)
(i) 상기 에펜도르프 튜브 중의 금 미립자에 PBST 500 ㎕를 가하고, 전체를 실온에서 서서히 회전시키면서 10분간 유지하였다.
(ii) 원심분리(10, 000 rpm×5 분)를 행하여, 세정용 상청액을 조심스럽게 폐기하였다.
(iii) 상기 (i) 및 (ii)의 각각을 10회 반복한다.
3) 산 용출과 산 용출화 분획의 역가 평가
상기 2)에서 얻어진 금 미립자에 흡착한 파지 역가를 이하의 순서에 따라 평가하였다.
3)－1 산용출
(i) 세정 후의 금 미립자에 대해서, 0.2M Gly－HCl(pH 2.2) 115 ㎕를 가하고, 전체를 1분간 서서히 상하로 회전시키면서 유지하였다.
(ii) 원심분리(10, 000 rpm×5 분)를 행하여, 상청액을 산 용출 분획으로서 회수하였다.
(iii) 회수한 산 용출 분획을 1 M Tris－HCl 15 ㎕를 가하여 중화하였다.
(iv) 중화 후의 산 용출액 1 ㎕를 계열 희석해서, 상기 역가 평가법에 따라 역가치를 측정하였다.
(ｖ) 나머지의 산 용출 분획을 신속하게 금 미립자 분획과 합하고, 이 혼합물을 재차 현탁하였다.
3)－2 역가 평가
(2)―3), 4)와 마찬가지로 해서, 역가 평가를 실시해서, 이하와 같은 결과를 얻었다.
제 1 라운드： 9.8×102 cfu
제 2 라운드： 1.0×103 cfu
제 3 라운드： 7.8×102 cfu
제 4 라운드： 1.3×103 cfu
제 5 라운드： 1.1×104 cfu
4) 재감염 및 파지 증폭
제 4 라운드까지는, 3)에서 얻어진 금 미립자에 흡착한 파지군을 대장균에 재감염시켜서 파지수를 증폭시켜, 다음 패닝용의 파지 용액을 준비하였다.
(i) 재감염 및 파지 증폭용으로 대장균 JM109를 LB배지 20 ㎖에 37℃에서 진탕 배양(140 rpm)하였다.
(ii) OD600이 0.3 내지 0.5가 되는 (a)의 대장균 배양액에 상기 3)에서 얻어진 금 미립자 현탁액을 가하고, 전체를 37℃에서 1시간 진탕 배양(140 rpm)하였다.
(iii) 최종 농도가 100 μg/㎖가 되도록 암피실린을 가하고, 전체를 37℃에서 2시간 진탕배양하였다.
(iv) 헬퍼 파지 M13KO7 40 ㎕를 가하고, 진탕 속도를 100 rpm으로 떨어뜨려 전체를 37℃에서 배양을 1시간 행하였다.
(ｖ) 최종 농도가 50 μg/㎖가 되도록 카나마이신을 가하고, 전체를 37℃에서 하룻밤 진탕배양하였다.
(ｖi) (2)―3), 4)와 같은 조작에 의해 배양 상청액 중의 파지를 회수해서, 파지 용액을 제작하였다. 게다가 역가치를 평가해서, 파지가 증폭된 것을 확인하였다.
증폭 후에 얻어진 역가치를 이하에 나타낸다.
제 1 라운드： 2.4×109 cfu
제 2 라운드： 8.1×108 cfu
제 3 라운드： 1.8×109 cfu
제 4 라운드： 1.1×1010 cfu
(4) 파지 ELISA
1) ELISA용 금 증착 기재의 제작
실시예 2와 같이 금 증착(두께 100 nm)을 실시한 96-웰 역가판(BD사 제품, 폴리스티렌)을 파지 ELISA용의 기재로 사용하였다.
2) VL-제시 파지 단클론의 제조
상기 (3)­4)의 제 5 라운드의 역가 평가에서의 104배의 희석 판 상에 발현한 11개의 콜로니로부터 파지미드를 이하의 순서에 의해 회수하였다.
(i) 각 콜로니를 LB/amp. 20 ㎖에서 37℃에서 배양하였다.
(ii) 헬퍼 파지 M13KO7 40 ㎕를 가하고, 진탕 속도를 100 rpm으로 떨어뜨려 37℃에서 1시간 배양하였다.
(iii) 최종 농도가 50 μg/㎖가 되도록 카나마이신을 가하고, 전체를 37℃에서 하룻밤 진탕배양하였다.
(iv) (2)－3), 4)와 같은 조작에 의해 배양 상청액 중의 파지를 회수해서, 파지 용액을 제작하였다. 또한, 파지 용액의 역가치를 평가해서, 파지가 증폭된 것을 확인하였다.
증폭 후에 얻어진 역가치를 이하에 나타낸다
No. 1： 3.8×109 cfu
No. 2： 9.0×108 cfu
No. 3： 2.4×109 cfu
No. 4： 1.0×109 cfu
No. 5： 9.7×107 cfu
No. 6： 4.4×108 cfu
No. 7： 6.2×109 cfu
No. 8： 8.9×107 cfu
No. 9： 1.4×109 cfu
No. 10： 1.1×1010 cfu
No. 11： 4.9×109 cfu
3) 파지 용액의 조정
2)에서 얻어진 각 파지 용액을 역가치가 109 cfu로부터 순차 1/10이 되도록 각 희석 계열 200 ㎕를 이하의 조성에 따라 제조하였다.
VL-제시 파지 용액： × ㎕
슈퍼 블로킹 버퍼(PIERCE사 제품)： 20 ㎕
0.5% 트윈 20/PBS： ×/5 ㎕
PBS：180－(6 ×/5) ㎕
4) ELISA
(i) 금 증착된 역가판에 계열 희석된 VL-제시 파지 용액을 각각 80 ㎕ 분주하고, 해당 판을 진탕기에서 서서히 1시간 진탕하였다.
(ii) 파지 용액을 제거하고, 각 웰에 PBST 90 ㎕를 분주하고, 전체를 10분간 교반하고 나서, 세정용 상청액을 제거하였다. 이 작업을 3회 반복하였다.
(iii) HRP－항 M13 면역글로불린/SBB/PBS(1/1000：1：10) 용액 75 ㎕를 각 웰에 분주하고, 해당 판을 진탕기에서 1시간 서서히 진탕하였다.
(iv) 상기 면역 글로불린 용액의 상청액을 폐기하였다. 다음에, PBST를 90 ㎕/웰의 체적으로 분주하고, 전체를 10분간 교반하였다. 이 세정 작업을 3회 반복하였다.
(ｖ) 검출 시약 1 및 2(Amasham BIOSIENCE사 제품)를 각 35 ㎕/웰의 체적으 로 분주하고, 전체를 1분간 서서히 교반하면서 반응시켰다.
(ｖi) 루미놀의 발광 강도를 측정하였다. 발광 강도가 높은 No.1, No.2, No.3을 금-결합성 VL-제시 파지 클론으로서 제공하였다.
상기 4개의 파지 클론으로부터 파지미드를 분리하여, 금-결합성 VL의 염기 및 아미노산 서열을 해명하였다. 다음에, 발현 벡터를 제작해서, 단백을 발현시켜, 표면 프라즈몬 공명(SPR) 금 기재상에의 결합 친화성을 확인하였다.
실시예 6(금 친화성 VL 단백의 취득)
(1) 파지미드의 회수
실시예 5의 (3)­4)의 제 5 라운드에서의 역가 평가에서의 104배의 희석 판 상에 발현한 상기 No.7에 상당하는 콜로니로부터 파지미드를 이하의 순서에 의해 회수했다.
(i) 각 콜로니를 LB/amp. 1.6 ㎖로 37℃에서 하룻밤 배양하였다.
(ii) Minipreps SV plus DNA Purification system(promega사 제품)을 이용해서 공급업자가 권장하는 방법에 따라서 파지미드를 회수하였다.
(2) 발현 벡터 제작
상기 3종의 VL 단백을 발현하는 발현 벡터를 이하의 구성으로 구축하였다. 실시예 1의 도 11에 나타낸 pRA－XX 및 상기 (1)에서 얻어진 파지미드를 그들 각각의 NcoI 및 NotI를 이용해서 제한 효소 반응에 의해 절단하였다. 얻어진 VL 단편을 pRA－XX에 삽입해서, VL 부호 핵산을 융합 단백으로서 발현하는 플라스미드 pRA －VLNo, n(n：클론 번호)을 제작하였다(도 13).
(3) 단백 발현 및 정제
상기에서 얻어진 3개의 VL단백 발현용 벡터를 이용해서 VL 단백을 발현시켰다.
1) 형질 전환
상기 발현 벡터를 이용해서, BL21(DE3) 적격 세포(competent cell) 용액 40 ㎕를 형질전환하였다. 형질 전환은 열충격을 얼음 속→42℃×90 초→얼음 속에서 행하는 조건하에서 수행하였다. 열충격에 의해 형질 전환된 상기 BL21 용액에 LB배지 750 ㎕를 가하고, 전체를 37℃에서 1시간 진탕 배양하였다. 그 후, 6,000 rpm×5분간 원심분리를 실시하고, 배양 상청액 650 ㎕를 폐기하였다. 남은 배양 상청액과 침전으로서의 세포분획을 교반해서, LB/amp. 판에 접종하고, 전체를 37℃에서 하룻밤 정치시켰다.
2) 예비 배양
판 상의 콜로니를 무작위로 선택해서, 3.0 ㎖ LB/amp. 배지에서 28℃에서 하룻밤 진탕배양하였다.
3) 본배양
상기 예비 배양 용액을 2×YT배지 750 ㎖에서 더욱 배양하고, 더욱 배양을 28℃에서 계속하였다. OD600이 0.8을 넘은 시점에서, 최종 농도가 1 mM가 되도록 IPTG를 가하고, 더욱 28℃에서 하룻밤 배양을 행하였다.
4) 정제
(i) 황산 암모늄 침전
3)에서 얻어진 배양액을 6,000 rpm×30 분에서 원심분리하여, 배양 상청액을 얻었다. 얻어진 배양 상청액의 중량을 계측하였다. 다음에, 배양 상청액의 중량 60%의 중량의 황산암모늄을 서서히 첨가하였다. 이어서, 얻어진 것을 4℃에서 하룻밤교반하였다.
(ii) 탈염
(i)에서 얻어진 용액을 8,000 rpm×20 분에서 원심분리해서, 상청액을 폐기하였다. 얻어진 침전을 20 mM Tris/500mM NaCl(이하, "Tris 용액"이라 칭함) 15 ㎖에 가하여, 4℃에서 하룻밤 담그어, 용해시켰다. 다음에, 얻어진 용액을 투석용 셀룰로오스 튜브(산코 쥰야쿠사 제품)에 넣어 외부용액을 Tris 용액으로서 이용해서 4℃에서 투석을 실시하여, 탈염을 행하였다(외부용액은 6 시간마다 교환했다).
(iii) 금속 킬레이트 컬럼
금속 킬레이트 컬럼 담체로서 His－Bind(Novagen사 제품)를 이용하였다. 컬럼 조정이나 샘플 부하 및 세정 공정은, 상기 업자가 권장하는 방법에 준거해서, 4℃에서 수행하였다. 목적인 His 태그 융합된 VL 단백용출은 500 mM 이미다졸/Tris 용액에 의해서 수행하였다.
용출액의 SDS－PAGE(아크릴 아미드 15%)의 결과, 용출액은 단일 밴드이며, 정제되어 있는 것을 확인하였다. 상기 용출액에 대해서, 외부용액을 Tris 용액으 로서 이용해서 다시 투석을 실시하여, 용출액 중의 이미다졸을 제거하였다. 또한, 외부용액을 인산 버퍼(이하, "PBS"라 약칭함)로 바꾸어 버퍼 치환을 실시해서, SPR용 VL 단백 용액을 제조하였다.
실시예 7( SPR 측정)
실시예 6에서 얻어진 VL 단백질의 금에 대한 결합 친화성을 SPR에 의해 측정하였다. SPR 측정 장치로서 BIAcore 2000(BIAcore사 제품)을 사용해서, 단백질이 결합하는 금 기재로서는 상기와 동일한 회사의 SIA－kit Au의 금 증착 유리 기판을 사용하였다.
이하의 조건하에서 측정을 행하였다.
런닝 버퍼：PBST
온도：25℃
유속：20 ㎕/분
샘플：VL 단백/PBST
주입량：20 ㎕
결합 친화성이 확인되는 결합 커브를 얻었다(도 9).
실시예 8( VL 단백의 염기 및 아미노산 서열의 결정)
상기에서 얻어진 VL No, 7의 DNA 서열을 이하의 방법에서 서열을 결정했다.
서열결정용 프라이머는 VL 부호화 유전자 상류에 위치하는 pelB 서열부로 설정했다. 서열결정용의 프라이머는 다음과 같이 실시예 2와 마찬가지였다.
pelB－back
(서열 번호：88)
5'－ccgct ggatt gttat tactc gc－3'
상기 프라이머를 사용해서, 공급업자가 권장한 서열결정용 반응 키트와 반응액 조성에 의해 BigDye－PCR 반응을 실시했다. 온도 사이클은 96℃×3분→(94℃×1분→50℃×1분→68℃×4 분)×30사이클→4℃였다. 다음에, 에탄올 침전에 의해 정제한 상기 PCR 산물의 염기 서열을 서열분석기(ABI사 제품; 377)에 의해 결정하였다. 이하의 결과가 얻어졌다. No.7은 실시예 12의 서열 번호：76과 같은 염기 서열을 지녔다.
실시예 9(금 친화성 VH -제시 파지군의 스크리닝)
이하의 순서에 따라 VH-제시 파지 라이브러리를 제작해서, 금에 대한 결합친화성을 나타내는 파지군을 선택하였다.
(1) VH 제시용 파지미드
실시예 1과 마찬가지로 사람 성인 말초 혈액 B 림프구 유래 Fab 라이브러리를 주형으로서 이용하고, 실시예 1과 마찬가지로 서열 번호：80 내지 서열 번호：89의 프라이머를 사용하였다. 이와 같이 해서, VH 부호화 유전자를 복제했다. 더욱, M13 파지의 외피 단백질로서 작용하는 PIII 단백의 N 말단의 일부를 결손시켜, VH 단백이 융합되어 발현되도록 제작된 VH-제시 파지미드(도 12A)의 라이브러리를 사용한다.
(2) VH-제시 파지 라이브러리 제작
상기 (1)에서 얻어진 것을 이용한 이외에는 실시예 5의 (2)와 마찬가지로 해 서 VH-제시 파지 라이브러리를 제작하였다. 얻어진 VH-제시 파지 라이브라이리 용액： 1×109 cfu/㎕
(3) 금 미립자를 이용한 VH 패닝
상기 (2)에서 제작한 파지 라이브러리 용액을 이용한 이외에는, 실시예 5의 (3)과 마찬가지로 금-결합성 VH를 제시하는 파지군을 선택하는 패닝을 행하였다.
1) 결합 실험
이하, 실시예 5와 마찬가지로 2) 세정, 및 3) 산 용출 및 역가 평가를 실시했다.
제 1 라운드： 9.8×102 cfu
제 2 라운드： 1.0×103 cfu
제 3 라운드： 7.8×102 cfu
4) 재감염 및 파지 증폭
실시예 5와 마찬가지 방법으로 재감염 및 파지 증폭을 행하였다. 증폭 후에 얻어진 역가치를 이하에 나타낸다.
제 1 라운드： 2.4×109 cfu
제 2 라운드： 8.1×108 cfu
(4) 파지 ELISA
1) EISA용 금 증착 기판의 제작
실시예 5의 것과 마찬가지의 기판을 파지 ELISA용의 기판으로 사용하였다.
2) VL-제시 파지 단클론 조정
상기 VH 패닝 작업의 제 3 라운드의 역가 평가에서의 104배의 희석 판 상에 발현한 20개의 콜로니로부터 파지미드를 실시예 1과 마찬가지로 해서 회수했다. 얻어진 VH-제시 파지 단클론 용액의 역가치를 이하에 나타낸다.
No.1： 3.8×109 cfu
No.2： 9.0×108 cfu
No.3： 2.4×109 cfu
No.4： 1.0×109 cfu
No.5： 9.7×107 cfu
No.6： 4.4×108 cfu
No.7： 6.2×109 cfu
No.8： 8.9×107 cfu
No.9： 1.4×109 cfu
No.10： 1.1×1010 cfu
No.11： 4.9×109 cfu
No.12： 9.0×108 cfu
No.13： 2.4×109 cfu
No.14： 1.0×109 cfu
No.15： 9.7×107 cfu
No.16： 4.4×108 cfu
No.17： 6.2×109 cfu
No.18： 8.9×107 cfu
No.19： 1.4×109 cfu
No.20： 1.1×1010 cfu
3) 파지 용액의 조정
2)에서 얻어진 각 파지 용액을 역가치가 109 cfu로부터 순차 1/10이 되도록 각 희석 계열 200 ㎕를 이하의 조성으로 제작했다.
VH-제시 파지 용액：x ㎕
가용화 VL용액(50 ng)：1 ㎕
슈퍼 블로킹 버퍼(PIERCE사 제품)：20 ㎕
0.5% 트윈 20/PBS： ×/5 ㎕
PBS：179－(6 ×/5) ㎕
4) 파지 ELISA
실시예 1과 같은 작업에 의해 파지 ELISA를 수행하였다. 비교용의 VH 라이브러리 용액보다 발광 강도의 높은 3개의 클론을 금-결합성 VH-제시 파지 클론으로 제공하였다(No. 2, 4 및 6).
실시예 10(금-친화성 VH 단백의 취득)
상기 3개의 파지 클론으로부터 파지미드를 분리하고 나서, 그들의 발현 벡터를 제작한 후에 단백을 발현시켜, 표면 플라스몬 공명(SPR) 금 기판에 대한 결합친화성을 확인하였다. 또한, 그들 금-결합성 VH의 염기 및 아미노산 서열을 해명하였다.
(1) 파지미드의 회수
제 3 라운드의 역가 평가에서의 104배의 희석 판 상에 발현한 15개의 클론에 대응하는 콜로니로부터 파지미드를 이하의 순서에 따라 회수했다.
(a) 각 콜로니를 LB/amp. 1.6 ㎖에서 37℃에서 하룻밤 배양했다.
(b) Minipreps SV plus DNA Purification system(promega사 제품)을 이용해서 공급업자가 권장하는 방법에 따라 파지미드를 회수했다.
(2) 발현 벡터 제작
상기 3종의 VH 단백을 발현하는 발현 벡터를 이하의 구성으로 구축한다.
PET－15b(Novagen사 제품)의 멀티 클로닝 사이트를 변경해서, pUT－XX를 제조하였다. 상기 pUT－XX 및 상기 (1)에서 얻어진 파지미드를 그들 각각의 NcoI 및 NotI를 이용해서 제한 효소 반응에 의해 절단하였다. 얻어진 VH단편을 pUT－XX에 삽입해서, VH 부호화 핵산을 융합 단백으로서 발현하는 플라스미드 pRA－7sn(n： 상기 파지 클론 번호)을 제작하였다(도 14).
(3) 단백의 발현 및 정제
상기 절차(발현 벡터를 개별의 계에 대해 이하에 기재된 단백 발현 및 정제 공정으로 처리)를 수행해서 3 종류의 VH(7s2, 7s4 및 7s6)를 취득하였다.
1) 형질 전환
상기 2개의 발현 벡터를 이용해서, 각각 다른 BL21(DE3) 적격 세포 용액 40 ㎕를 형질 형질전환하였다. 형질 전환은 열충격을 얼음 속→42℃×90 초→얼음 속의 조건으로 행한다. 열충격에 의해 형질 전환한 상기 BL21 용액에 LB배지 750 ㎕를 가하고, 37℃에서 1시간 진탕 배양하였다. 그 후, 6,000 rpm×5분간 원심분리를 실시하여, 배양 상청액 650 ㎕를 폐기하고, 남은 배양 상청액과 침전으로서의 세포분획을 교반해서, LB/amp. 판에 접종하고, 전체를 37℃에서 하룻밤 정치시켰다.
2) 예비 배양
판상의 콜로니를 무작위로 선택해서, 3.0 ㎖ LB/amp. 배지에서 28℃에서 하룻밤 진탕 배양을 실시하였다.
3) 본 배양
상기 예비 배양 용액을 2×YT배지 750 ㎖에 접종하고, 더욱 배양을 28℃에서 계속했다. OD600이 0.8을 넘은 시점에서, 최종 농도가 1 mM이 되도록 IPTG를 가하고, 더욱 28℃에서 하룻밤 배양을 실시하였다.
4) 정제
목적의 폴리펩타이드쇄를 불용성 과립 분획으로부터 이하의 공정에 의해 정제하였다.
(i) 불용성 과립의 회수
상기 3)에서 얻어진 배양액을 6,000 rpm×30 분에서 원심분리해서, 침전을 균체 분획으로서 얻었다. 얻어진 균체를 얼음 속의 Tris 용액(20 mM Tris/500mM NaCl)에 현탁시켰다. 얻어진 현탁액을 프렌치 프레스로 파쇄해서, 균질액을 얻었다. 다음에, 이 균질액을 12, 000 rpm×15 분에서 원심분리를 실시해서, 상청액을 제외하고, 침전을 불용성 과립분획으로서 얻었다.
(ii) 불용성 과립화 분획의 가용화
(i)에서 얻어진 불용성 분획을 6 M 염산 구아니딘/Tris 용액 10 ㎖를 가해서, 하룻밤 침지하였다. 다음에, 12,000 rpm×10 분에서 원심분리해서, 상청액을 가용화 용액으로서 얻었다.
(iii) 금속 킬레이트 컬럼
금속 킬레이트 컬럼 담체로서 His－Bind(Novagen사 제품)를 이용하였다. 컬럼 조정, 샘플 부하 및 세정 공정은, 상기 공급업자가 추천하는 방법에 따라, 실 온(20℃)에서 실시하였다. 목적으로서의 His 태그-융합된 폴리펩타이드의 용출은 60 mM 이미다졸/Tris 용액에서 실시하였다. 용출액의 SDS－PAGE(아크릴 아미드 15%)의 결과, 용출액은 단일 밴드이며, 정제되어 있는 것을 확인하였다.
(iv) 투석
상기 용출액을 외부용액으로서 6 M 염산 구아니딘/Tris 용액을 이용해서 4℃에서 투석을 실시해서, 용출액 중의 이미다졸을 제거하고, 이에 따라, 상기 폴리펩타이드쇄 용액을 얻었다.
(ｖ) 리폴딩
상기와 마찬가지 방법으로 해서, VHg－VLh 및 VHh－VLg의 각각의 폴리펩타이드쇄 용액을 이하의 공정에 의해 별도로 탈염산 구아니딘을 투석(4℃)하여 단백질의 리폴딩를 실시하였다.
a) 6M 염산 구아니딘/Tris 용액을 이용해서 각각의 폴리펩타이드쇄의 몰 흡수계수와 ΔO.D.(280 nm－320 nm) 레벨을 기준으로 하여 농도 7.5μM의 샘플(희석 후 체적 10 ㎖)을 제조하였다. 다음에, β－메르캅토 에탄올(환원제)을 최종 농도 375μM(단백 농도 50배)이 되도록 첨가하고, 실온의 어두운 곳에서 4시간 환원을 실시하였다. 이 샘플 용액을 투석 백(MWCO：14, 000)에 넣어 투석용 샘플로 제공하였다.
b) 외부용액으로서의 6 M 염산 구아니딘/Tris 용액중에 투석용 샘플을 침지해서, 서서히 교반하면서 6시간 투석하였다.
c) 외부용액의 염산 구아니딘 용액의 농도를 3 M로, 이어서 2 M로 단계적으 로 내렸다. 각각의 외부용액 농도에서, 샘플을 6시간 투석하였다.
d) 산화형 글루타티온(GSSG)을 최종 농도 375μM, L－Arg을 최종 농도 0.4 M이 되도록 Tris 용액에 가하고 나서, 상기 3)의 2 M의 투석 외부용액을 가하여 염산 구아니딘 농도를 1 M로 하였다. pH를 NaOH에 의해 pH 8.0(4℃)으로 조정한 외부용액에서 샘플을 12시간 서서히 교반하면서 투석하였다.
e) 상기 d)와 같은 작업에 의해서 염산 구아니딘 농도 0.5 M을 지닌 L－Arg Tris 용액을 제조하고, 더욱 12시간 투석하였다.
f) 마지막에 Tris 용액에서 12시간 투석을 실시하였다. 투석 종료후, 10000 rpm에서 약 20분 원심분리를 실시해서 응집체와 상청액을 분리하였다.
상기에서 얻어진 3종의 VH용액에 대해서, 더욱 외부용액을 인산 버퍼(이하, PBS)로 바꾸어 버퍼 치환을 실시해서, SPR용 VH단백질 용액을 제조하였다.
실시예 11( SPR 측정)
실시예 10에서 얻어진 VH 단백질의 금에 대한 결합 친화성을 실시예 7과 마찬가지 방법으로 SPR에서 측정했다. 7s2, 7s4 및 7s6 각각에 대해서 결합 친화성이 확인되는 결합 커브를 얻었다. 도 10에 대표예를 나타낸다. 커브 적합성에 의해 이하의 KD를 얻었다.
7s2： KD = 5.0×10M-8
7s4： KD = 8.0×10M-9
7s6： KD = 3.0×10M-7
실시예 12( VH 단백질의 염기 및 아미노산 서열의 결정)
상기에서 얻어진 3개의 VH-제시 파지미드의 DNA 서열을 실시예 2와 같은 방법에서 결정했다. 서열결정용 프라이머는, VH 부호화 유전자 상류에 위치하는 pelB 서열부로 설정했다. 실시예 2와 같은 서열결정용 프라이머를 이용해서 같은 순서에 따라 해석을 행해서, 다른 3 서열을 얻었다. 실시예 10에서 얻어진 서열은 서열 번호：59 내지 61에 대응하였다.
실시예 13( SPR 에 의한 VH / VL 복합체에 대한 금-결합성 실험)
실시예 6에서 얻어진 VL 클론 No. 7과 실시예 10에서 얻어진 VH 클론： 7s2를 각 50 nM 함유하는 PBST 용액을 제조하고, 4℃에서 하루간 보존했다. 상기 혼합 용액을 이용해서, 실시예 7과 마찬가지로 해서 SPR 측정을 행하였다. 그 결과, 실시예 7 또는 실시예 11에 비해 저농도에서 금에 대한 결합 친화성을 확인할 수 있었다. 이 결과는, 클론의 혼합에 의해 복합체(Fｖ)가 형성되어 구조 안정화에 의한 결합 친화성이 증대하는 것을 시사한다(도 3).
실시예 14(금-결합성 scF ｖ의 취득)
실시예 6에서 얻어진 VL 클론：No.7과 실시예 10에서 얻어진 VH 클론：7s2로 이루어진 scFｖ를 이하의 순서에 따라 제작했다.
(1) 발현 벡터 제작
VL(No.7) 부호화 유전자, 링커(GGGGS)×3, VH(7s4) 부호화 유전자 및 His× 6(이하, "His 태그"라고 칭함)로부터 연속해서 번역될 수 있는 융합 단백을 발현할 수 있는 발현 벡터를 제작했다.
구체적인 제작 방법에 대해서는 도 15에 표시하였다.
프라이머로서는 다음과 같은 것을 이용하였다.
scFｖ－B(서열 번호：117)
5'－NNNNNCCATGGCCGGGGGCGGGGGCAGCGGGGGCGGGGGCAGCGGGGGCGGGGGCAGCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT－3'
scFｖ－F(서열 번호：118)
5'－NNNNNCCGCGGAACCATTCAGATCCTCTTCT－3'
(2) 단백 발현 및 정제
이하, 상기에서 얻어진 scFｖ단백 발현용 벡터를 이용해 scFｖ단백을 발현?정제하였다.
1) 단백 발현
상기 발현 벡터를 대장균 BL21(DE3)을 형질 전환하고, 2 xYT 배지를 이용해서 28℃에서 배양을 실시하였다. O.D.600 = 약 0.8에서 최종 농도 1 mM의 IPTG에 의해 발현을 유도하고, 얻어진 산물을 하룻밤 진탕 배양하였다. 균체를 6,000 rpm×20 분에서 원심분리해서, 배양 상청액 분획과 균체 분획을 얻었다. 이들 샘플을 기존의 방법에 의해 SDS－PAGE에 의해 전기 영동을 실시해서, 목적의 단백의 발현량을 확인했다. 그 결과, 배양 상청액 분획에의 분비는 매우 적은 것을 알 수 있었다. 상기 내용을 감안해서, 목적 단백을 균체 분획으로부터 정제하기 위해, 이하의 순서에 따라 샘플을 조제했다. 우선, 균체를 PBS 15 ㎖로 재현탁하고, 이 현탁액에 더욱 PBS 25 ㎖를 가하고, 이 혼합물을 프렌치 프레스에 의해 균질화하였다. 얻어진 균질액을 12,000 rpm×15 분에서 원심분리하여, 침전분획을 불용성 과립으로서 얻었다. 얻어진 불용성 과립을 6 M 염산 구아니딘/Tris 용액에 하룻밤 침지하고, 가용화하여, 금속 킬레이트 컬럼용 샘플을 얻었다.
2) 금속 킬레이트 컬럼에 의한 정제
런닝 버퍼로서 6 M 염산 구아니딘/5 mM이미다졸/Tris 용액을 이용해서, 용출시의 이미다졸 농도를 100 mM, 전개 온도를 실온(20℃)으로 설정한 이외에는 실시예 2와 마찬가지 방식으로 정제를 실시했다.
3) 투석
상기 2)에서 얻어진 용출분획을 투석용 셀룰로오스 튜브(산코 순약제)에 넣고, 외부용액으로서 6 M 염산 구아니딘/1mM EDTA/Tris 용액을 이용해서 4℃에서 투석을 실시하였다(외부용액은 6 시간마다 교환했다).
4) 단백질의 재구축
상기 3)에서 얻어진 scFｖ용액을 Tris 용액으로 7.5 μM로 조정해서, 샘플로서 제공하였다. 상기 용액에 대해서, 외부용액 중의 염산 글리신 농도를 단계적으로 내림으로써, 내부 용액 중의 염산 구아니딘 농도를 점차로 내리는 것과 동시에 scFｖ구조의 재구축을 실시했다.
(a) 6M 염산 구아니딘/Tris 용액을 이용해서 목적 단백의 아미노산 서열로부 터 추정되는 몰 흡광 계수와 O.D.(280 nm)를 지닌 농도 7.5μM의 샘플을 조제했다.
(b) 다음에 β－메르캅토에탄올(환원제)을 최종 농도 375μM이 되도록 첨가하고, 실온의 어두운 곳에서 4시간 환원시켰다.
(c) 샘플을 상기와 같은 투석백에 넣고, 이 전체를 외부용액(6 M 염산 구아니딘/Tris 용액) 중에 놓고, 4℃에서 약 6시간 투석하였다.
(d) 이후, 6 시간마다 외부용액을 2회 교환했다. 이러한 교환시, 외부용액의 염산 구아니딘 농도는 3 M→2 M와 단계적으로 내리면서 샘풀을 투석하였다.
(e) 다음에, 산화형 글루타티온(GSSG)을 최종 농도 375μM, L－Arg을 최종 농도 0.4 M이 되도록 Tris 용액에 가하고, 더욱 상기 (d)의 투석 외부용액(2 M)을 가함으로써, 염산 구아니딘 농도를 1 M로 하였다. pH를 NaOH에 의해 pH 8.0(4℃에서)으로 조정한 외부용액 중에 상기 샘플을 약 12시간 투석하였다.
(f) 상기 (e)와 같은 작업에 의해서 0.5 M 염산 구아니딘/Tris 용액을 제작해서, 4℃에서 약 12시간 투석을 수행하였다.
(g) 마지막으로, 외부용액을 Tris 용액으로 교체해서 4℃에서 약 12시간 투석을 수행하였다.
(h) 투석 종료후, 얻어진 산물을 10,000 rpm에서 약 20분 원심분리해서, 응집체 분획과 상청액 분획을 분리하였다. 상청액 분획을 SDS－PAGE 전기 영동에 걸어, 상청액 분획에 목적의 단백이 가용화되어 있는 것을 확인했다. 그 결과, VL에 상기 No.7 클론, VH에 7s2를 지닌 scFｖ를 취득했다.
실시예 15( SPR 에 의한 scF ｖ의 금-결합 친화성 평가)
실시예 14에서 얻어진 scFｖ단백질의 금에 대한 결합 친화성을 실시예 8과 마찬가지로 해서 SPR에 의해서 측정했다. 금에 대한 결합 친화성을 나타내는 결합 곡선을 얻을 수 있었다(도 17).
실시예 16(Au 특이성의 확인)
실시예 15에서 얻어진 scFｖ단백질의 금 특이성을 확인했다. 확인용의 기판으로서 3 mm×5 mm의 실리콘 기판상에 70μmφ의 크기의 원형 패턴으로 금을 증착(두께 50 nm)하였다. 상기 기판 표면을 이소프로필 알코올, 아세톤 및 염산에 차례차례 10분간 침지해서 각 용액으로 표면을 세정하였다(용액을 바꿀 때마다 표면을 탈이온수로 세정하고 건조하였다). 상기 기판을 실시예 6에서 얻어진 scFｖ용액을 1μM로 조정한 용액에 1시간 침지하였다. 계속해서, 기판을 PBST 중에서 10분간 서서히 교반하면서 세정하였다. 이 작업을 3회 반복하고 나서, 세정액을 버렸다. 다음에, 상기 기판을 100 nM 항 His 태그 항체/PBST 용액 중에 1시간 서서히 교반하면서 침지하였다. 이어서, 기판을 PBST 중에서 10분간 서서히 교반하면서 세정하였다. 이 작업을 3회 반복하고 나서, 세정액을 버렸다. 더욱, 상기 기판을 100μM 로돕신 결합 항IGg 항체/PBST 용액에 1시간 서서히 교반하면서 침지하였다. 이어서, 기판을 PBST 중에서 10분간 서서히 교반하면서 세정하였다. 이 작업을 3회 반복하고 나서, 세정액을 버렸다. 그 후, 형광 현미경으로 기판을 관찰했다. 그 결과, 금이 증착된 원형부에서는 형광이 관찰되었고, 실리콘부에서는 형광은 관찰되지 않았다. 실시예 15에서 얻어진 scFｖ의 금 특이성을 확인할 수 있었다.
비교예 1
실시예 16에 있어서의 1μM scFｖ로 금 증착 실리콘 기판을 처리한 이외에는, 같은 작업에 의해 상기 기판을 처리했다. 해당 기판을 형광 현미경에 의해 관찰한 결과, 실리콘부 및 금 증착된 원형부의 각각에 있어서 형광은 확인할 수 없었다.
실시예 17(산화 규소 친화성 펩타이드 융합금 -결합성 단백의 제작)
산화 규소 친화성 펩타이드 IPHVHHKHPHV를 상기 실시예의 scFｖ의 C 말단에 지닌 단백질을 이하의 공정에 의해 제작하였다.
(1) 발현 벡터 제작
(a) 상기 실시예(실시예 14)에서 얻어진 pUT－scFｖ(VL#No, 7 × 7s4)를 템플릿하여, 이하의 프라이머를 이용해서 PCR을 실시하였다.
SiscFｖ－B(서열 번호：119)
5'－NNNNNCCATGGCCCAGGTGCAGTTGGTGGAGT－3'
SiscFｖ－F(서열 번호：120)
5'－NNNNNCCGCGGCACGTGGGGGTGCTTGTGGTGCACGTGCATGGGGATAACCATTCAGATCCTCTTCT－3'
또, PCR은 시판의 PCR 키트(다카라 바이오사 제품, LA－Taq 키트)를 사용해서, 공급업자가 추천하는 프로토콜에 따라 실시하였다.
(b) 그 결과 얻어진 PCR 산물에 대해 2% 한천 전기 영동(agarose electrophoresis)을 실시하였다. 다음에, 겔 추출 키트(Promega사 제품)를 사용 해서 겔로부터 대강 정제를 실시해서, 약 400 bp의 PCR 단편을 얻었다. 서열을 확인한 바, 그 단편은 목적의 염기 서열을 가졌다.
(c) pUT－scFｖ(7s4) 및 상기 (b)에서 얻어진 PCR 단편을, NotI/SacII를 이용해서 절단하였다. 그 다음에, 한천 전기 영동을 실시해서, Vector측 및 Insert측에서 각각 목적의 단편을 정제하였다.
(d) 상기 (c)에서 얻어진 정제한 핵산 단편을, Vector：Insert = 1：5의 비가 되도록 혼합하고 나서, 실시예 1과 마찬가지로 해서 라이게이션 반응을 실시하였다.
이하, 형질 전환, 플라스미드 회수 및 삽입 단편의 확인에 대해서는 실시예 6과 마찬가지로 실시하였다.
(3) 단백 발현 및 정제
상기 얻어진 발현용 플라스미드를 이용해서, 실시예 10과 같은 방법에서 단백 발현 및 정제를 실시해서, 목적인 단백질을 얻었다.
실시예 18(금- 및 HEL - 결합성 단백질의 취득)
(1) 금-결합성 VH 부호 핵산 단편의 조정
금-결합성 VH(서열 번호：61)의 5' 말단 측에 제한 효소 NcoI 절단 부위, 그의 3'말단 측에 제한 효소 NheI를 배치한 벡터 도입용의 금-결합성 VH(이하, "VHg"라 칭함)를 제작하기 위해서, 이하의 프라이머
gVH－B(서열 번호：121)
5'－NNNNN CCATGG CCGAC CAGG TGCAG TTGGT GGAGT CT－3'
gVH－F(서열 번호：122)
5'NNNNN GCTAG C GGAGA CGG TGACCAGGGT－3'
를 사용였다. 이어서, 시판의 PCR 키트를 공급업자가 추천하는 비율로 사용해서 PCR을 실시하여, 약 350 bp의 염기쌍을 얻었다. 상기 VHB－F를 사용해서, 시판의 시열결정 반응 키트와 반응액 조성에 의해 BigDye－PCR 반응을 실시했다. 온도 사이클은 96℃×3분→(94℃×1분→50℃×1분→68℃×4 분)×30사이클→4℃로 설정해서, 목적의 VH를 부호화하는 염기 서열을 각각 갖는 단편이 얻어진 것을 확인하였다.
(2) 금-결합성 VL 부호 핵산 단편의 조정
금-결합성 VL(서열 번호：76)의 5' 말단 측에 제한 효소 NheI 절단 부위 및 링커(GGGGS)를 부호화하는 핵산을, 그리고 그의 3'말단 측에 His×6 및 제한 효소 SacII 절단 부위를 배치한 벡터 삽입용의 금-결합성 VL(이하, "VLg"라 칭함)(서열 번호：99)을 제작하기 위해서, 이하의 프라이머:
gVL－B(서열 번호： 123)
NNNNN GCTAGC GGTGGCGGTGGCTCT GAAATTGTGTTGACGCAGTCT, 및
gVL－F(서열 번호： 124)
NNNNN CCGCG GCACG TTTAA TCTCC AGTCG TGT
를 사용한 이외에는, 상기 (1)에서와 마찬가지로 해서 핵산 단편을 얻음으로써, 목적의 VL의 염기 서열을 각각 갖는 것을 확인하였다.
(3) HEL 결합성 VH 부호 핵산 단편의 조정
HEL-결합성 VH(서열 번호：125)의 5' 말단 측에 제한 효소 NcoI 절단 부위를, 그리고 그의 3'말단 측에 제한 효소 NheI를 배치한 벡터 도입용의 HEL-결합성 VH(이하, "VHh"라 칭함)를 제작하기 위해서, 이하의 프라이머:
hVH－B(서열 번호：126)
5'－NNNNN CCATGG CCGAC GATATCCAGCTGCAGGAGTCGGGCCC－3 및
hVH－F(서열 번호：127)
5'NNNNN GCTAG C GGAGA CGG TGACGTCTGT－3
를 사용한 이외에는, 상기 (1)과 마찬가지로 해서 핵산 단편을 얻음으로써, 목적의 VH의 염기 서열을 갖는 것을 확인하였다.
(4) HEL-결합성 VL 부호 핵산 단편의 조정
HEL-결합성 VL(서열 번호：128)의 5' 말단 측에 제한 효소 NheI 절단 부위 및 링커(GGGGS)를 부호화하는 핵산을, 그리고, 그의 3'말단 측에 His×6 및 제한 효소 SacII 절단 부위를 배치한 벡터 삽입용의 HEL-결합성 VL(이하, "VLh"라 칭함)을 제작하기 위해서, 이하의 프라이머:
hVL－B(서열 번호：129)
NNNNNGCTAGCGGTGGCGGTGGCTCTGATATCGTCCTGAC CCAGAG 및
hVL－F(서열 번호：130)
NNNNN CCGCG GCCTT GATCT CCAGC TTGGT GC
를 사용한 이외에는, 상기 (1)과 마찬가지로 해서 핵산 단편을 얻음으로써, 목적의 VL의 염기 서열을 갖는 것을 확인하였다.
실시예 19(발현 벡터 제작)
상기 4종의 핵산 단편을 이용해서, 2개의 발현 벡터를 이하의 구성으로 구축하였다.
(1) VHg－VLh 발현용 벡터(pGHEL)의 제작 (도 15)
(i) VHg의 삽입
상기 플라스미드 pUT－XX를 제한 효소 NcoI/NheI(각각 New England Biolabs사 제품)로 절단해서, 스핀 컬럼 400 HR(아머샴 사이언스사 제품)에 걸었다. 다음에, 마찬가지로 제한 효소 NcoI/NheI에 의해서 VHg를 절단하고, 이 절단 단편을 시판의 겔 정제 키트(SV Gel and PCR Clean－up system： Promega사 제품)를 사용해서 정제하였다. 상기 2개의 단편을, 시판의 T4 리가제 키트(Roche사 제품)를 공급업자가 권장하는 방법에 따라서 혼합해서 라이게이션을 실시하였다.
상기 라이게이션 용액을 JM109 적격 세포(Promega사 제품) 40 ㎕에 열충격법에 의해 형질 전환한 후에, LB/암피실린(amp.) 판에 접종하고, 전체를 37℃에서 하룻밤 정치시켰다.
다음에, 판 상의 임의의 콜로니를 액체 배지 3 ㎖에 접종하고, 이 전체를 37℃에서 하룻밤 진탕 배양을 실시하였다. 그 후, 시판의 MiniPreps 키트(Plus Minipreps DNA Purification System：Promega사 제품)을 사용해서, 플라스미드를 회수하였다.
얻어진 플라스미드의 염기서열을, gVH－F를 사용해서 상기 서열결정 방법에 의해서 확인하였다. 따라서, 목적의 단편이 삽입되어 있는 것을 확인하였다.
(ii) VLH의 삽입
상기 1)에서 얻어진 플라스미드 pUT-VHg를 제한 효소 NheI/SacII에 의해 절단해서, 스핀 컬럼 400 HR(아머샴 사이언스사 제품)에 걸었다. 다음에, 마찬가지로 제한 효소 NheI/SacII에 의해 VLh를 절단하였다. 다음에, 상기 (a)와 마찬가지 방법으로, 라이게이션을 행하여, VHg－VLH 발현용 플라스미드가 얻어진 것을 확인하였다(확인용 프라이머는 hVL－F였다).
(2) VHh－VLg 발현용 벡터(pHGOLD)의 제작(도 16)
(iii) VHh의 삽입
상기 (i)과 마찬가지 방법에서 VHh를 플라스미드 pUT에 삽입해서, 얻어진 플라스미드가 목적의 플라스미드인 것을 확인하였다(확인용 프라이머는 hVH－F였다).
(iv) VLg의 삽입
VLg를 상기 (iii)에서 얻어진 플라스미드에 상기 (b)와 마찬가지 방법으로 삽입해서, 얻어진 플라스미드가 목적의 VHH－VLg 발현용 벡터 pHGOLD인 것을 상기 1)과 마찬가지 방법으로 확인하였다(확인용 프라이머는 gVL－F였다).
실시예 20(단백 발현 및 정제)
상기 실시예 19의 (ii)에서 얻어진 VHg－VLh 및 실시예 19의 (iv)에서 얻어진 VHh－VLg의 폴리펩타이드를 발현하는 발현 벡터를, 개별의 계에 대해 이하에 기재된 단백 발현 및 정제 공정으로 처리를 실시해서, 각각 폴리펩타이드쇄 VHg－VLh 및 VHh－VLg로서 취득하였다.
1) 형질 전환
상기 발현 벡터를 이용해서 각각 다른 BL21(DE3) 적격 세포 용액 40 ㎕를 형질 형질전환하였다. 형질 전환은 열충격을 얼음 속→42℃×90sec→얼음 속에서 행하는 조건하에서 수행하였다. 열충격에 의해 형질 전환된 상기 BL21 용액에 LB배지 750 ㎕를 가하고, 전체를 37℃에서 1시간 진탕 배양을 실시했다. 그 후, 6,000 rpm×5분간 원심분리를 실시하여, 배양 상청액 650 ㎕를 폐기하였다. 남은 배양 상청액과 침전으로서의 세포분획을 교반해서, LB/amp. 판에 접종하고, 이 전체를 하룻밤 37℃에서 정치시켰다.
2) 예비 배양
판상의 콜로니를 무작위로 선택해서, 3.0 ㎖ LB/amp. 배지에서 28℃에서 하룻밤 진탕 배양을 실시하였다.
3) 본 배양
상기 예비 배양 용액을 2×YT 배지 750 ㎖에 접종하고, 더욱 배양을 28℃에서 계속했다. O.D.600이 0.8을 넘은 시점에서, 최종 농도가 1 mM이 되도록 IPTG를 가하고, 더욱 28℃에서 하룻밤 배양을 실시하였다.
4) 정제
목적의 폴리펩타이드쇄를 불용성 과립 분획으로부터 이하의 공정에 의해 정제하였다.
(i) 불용성 과립의 회수
상기 3)에서 얻어진 배양액을 6,000 rpm×30 분에서 원심분리해서, 침전을 균체 분획으로서 얻었다. 얻어진 균체를 Tris 용액(20 mM Tris/500mM NaCl) 15 ㎖에 얼음 속에서 현탁하였다. 얻어진 현탁액을 프렌치 프레스로 균질화하였다. 다음에, 이 균체 균질액을 12, 000 rpm×15 분에서 원심분리해서, 상청액을 제외해서, 침전을 불용성 과립 분획으로서 얻었다.
(ii) 불용성 과립 분획의 가용화
상기 (i)에서 얻어진 불용성 분획을 6 M 염산 구아니딘/Tris 용액 10 ㎖를 가하고, 하룻밤 침지하였다. 다음에, 얻어진 산물을 12, 000 rpm×10 분에서 원심하여, 상청액을 가용화 용액으로서 얻었다.
(iii) 금속 킬레이트 컬럼
금속 킬레이트 컬럼 담체로서 His－Bind(Novagen사 제품)를 이용하였다. 컬럼 조정, 샘플 부하 및 세정 공정은 공급업자가 추천하는 방법에 따라서, 실온(20℃)에서 실시하였다. 목적으로서의 His 태그-융합된 폴리펩타이드의 용출은 60 mM 이미다졸/Tris 용액에서 실시하였다. 용출액의 SDS－PAGE(아크릴 아미드 15%)의 결과, 용출액은 단일 밴드를 지니고, 정제되어 있는 것을 확인하였다.
(iv) 투석
상기 용출액에 대해서, 외부용액으로서 6 M 염산 구아니딘/Tris 용액을 이용해서 4℃에서 투석을 실시해서, 용출액 중의 이미다졸의 제거를 실시해서, 상기 각각의 폴리펩타이드쇄 용액을 얻었다.
(ｖ) 리폴딩
상기와 같이 해서, VHg－VLh 및 VHh－VLg의 각각의 폴리펩타이드쇄 용액을 이하의 공정에 의해 별도로 탈염산 구아니딘에 의해 투석(4℃)해서 단백질의 리폴딩을 실시하였다.
(a) 6M 염산 구아니딘/Tris 용액을 이용해서 각각의 폴리펩타이드쇄의 몰 흡수 계수와 ΔO.D.(280 nm－320 nm)에 의거해서 농도 7.5μM의 샘플(희석 후 체적 10 ㎖)을 제조하였다. 다음에 β－메르캅토 에탄올(환원제)을 최종 농도 375μM(단백 농도 50배)이 되도록 첨가하고 나서, 실온의 어두운 곳에서 4시간 환원을 실시하였다. 이 샘플 용액을 투석 백(MWCO：14, 000)에 넣어 투석용 샘플로서 제공하였다.
(b) 외부용액으로서의 6 M 염산 구아니딘/Tris 용액 중에 투석 샘플을 침지해서, 서서히 교반하면서 6시간 투석하였다.
(c) 외부용액의 염산 구아니딘 농도를 3 M로, 이어서, 2 M로 단계적으로 내렸다. 각각의 외부용액 농도에 대해서, 샘플을 6시간 투석하였다.
(d) 산화형 글루타티온(GSSG)을 최종 농도 375μM, L－Arg을 최종 농도 0.4 M이 되도록 Tris 용액에 가하고 나서, 상기 (c)의 2 M의 투석 외부용액을 가하고 염산 구아니딘 농도가 1 M로 해서, pH를 NaOH에 의해 pH 8.0(4℃)으로 조정한 용액에서, 샘플을 12시간 서서히 교반하면서 투석하였다.
(e) 상기 (d)와 같은 작업에 의해 염산 구아니딘 농도 0.5 M의 L－Arg Tris 용액을 제조해서, 더욱 12시간 투석을 수행하였다.
(f) 마지막으로, Tris 용액 중에서 12시간 투석을 수행하였다.
(g) 투석 종료후, 10,000 rpm에서 약 20분 원심분리를 수행하여 응집체와 상 청액을 분리하였다.
(ｖi) 이량화 분획의 정제
상기 (ｖ)에서 얻어진 개개의 5μM 폴리펩타이드(VHg－VLh, VHh－VLg) 용액을 혼합해서, 4℃에서 하룻밤 정치하였다. 다음에, 세파덱스 75 컬럼(컬럼：버퍼 20mM Tris, 500 mM NaCl, 유속 1 ㎖/분)에서 이량체화한 60 kDa에 상당하는(주입으로부터 약 18분) 분획을 얻었다. 이것을 SPR 측정용 샘플로서 제공하였다.
실시예 21( SPR 측정에 의한 금-결합 친화성 평가)
실시예 20에서 얻어진 이량화 단백질 분획의 결합 친화성을 SPR에서 측정하였다. SPR 측정 장치로서 BIAcore 2000(BIAcore사 제품)을 사용하였다. 금 기판으로서는 동일 회사의 금-증착 유리 기판 SIA－kit Au를 사용했다. 이하의 조건에 대해 측정을 실시하였다. 샘플로서 실시예 15에서 얻어진 이량화 단백질 분획 500 nM(상기와 같이 해서 흡광도로부터 산출)을 사용하였다.
런닝 버퍼： 0.1% 트윈 20/Tris 용액：TBST
온도： 25℃
유속： 20 ㎕/분
샘플 주입량： 40 ㎕
금에 대한 결합 친화성을 나타내는 결합 곡선을 얻었다(도 18).
실시예 22( SPR 측정에 의한 HEL 에 대한 결합 친화성 평가)
실시예 21에 있어서 금에 대한 결합 친화성을 SPR 평가한 샘플에 계속해서, 연속해서 1μM HEL 용액을 주입해서, 금에 결합한 이량화 단백질 분획의 HEL에 대 한 결합 친화성을 SPR에 의해서 측정하였다. HEL에 대한 결합 친화성을 나타내는 결합 곡선을 얻었다(도 18).
실시예 23(Au 특이성의 확인)
실시예 22에서 얻어진 금-결합성 단백질 및 HEL가 결합한 SPR 팁의 금 기판을 이용해서 이하의 실험을 계속해서 수행하였다. 상기 금 기판에 1μM 항-HEL 항체/PBST 용액을 주입하였다. 그 후, 기판을 PBST에 의해서 세정하였다. 더욱, 상기 기판에 1μM 로돕신-결합 항-IGg 항체/PBST 용액을 주입한 후에, PBST에 의해 세정하였다. 그 후, SPR 장치로부터 상기 SPR 칩을 꺼내, 형광 현미경으로 기판을 관찰하였다. 그 결과, 금 기판상의 SPR의 유로상에 형광이 관찰되었다.
비교예 2
미사용의 금-증착 기판을 이용해서, 실시예 23과 같은 작업을 행하였다. 그 결과, 금 기판상에 형광이 관찰되지 않았다.
실시예 24
실시예 20에 있어서의 (i) 내지(ｖ)와 같은 공정을 통해 얻어진 되감은 폴리펩타이드쇄 VHg－VLh를 제작해서, 5μM VHg－VLh/Tris 용액을 얻었다.
실시예 25
실시예 24에서 얻어진 VHg－VLh/Tris 용액을 500 nM로 Tris 용액으로 희석해서, 실시예 20과 마찬가지로 해서 금 기판에 대한 결합 친화성을 평가하였다. 더욱, 연속해서 1μM HEL 용액을 주입해서, 금-결합한 이량화 단백질 분획의 HEL에 대한 결합 친화성을 측정하였다. 금 및 HEL에 대한 결합 친화성을 나타내는 결합 곡선을 얻었다.
실시예 26
실시예 25에 있어서, 0.5μM 항-HEL 항체 VL/Tris 용액을 공존시켜, 하룻밤 정치해서 샘플을 조제하였다.
실시예 27
실시예 26에서 조제한 샘플에 대해서, 실시예 15와 마찬가지로 해서 금 기판에 대한 결합 친화성을 SPR에 의해 평가하였다. 더욱, 실시예 16과 마찬가지로 해서, 연속해서 1μM HEL을 주입하여 샘플에 대한 결합 친화성을 SPR에 의해서 측정하였다. 결합 친화성을 나타내는 결합 곡선을 얻었다.
실시예 28( HEL 검출 면역크로마토그래피 장치의 제작)
본 발명의 검출 방법예로서 HEL을 검출하는 면역크로마토그래피 장치를 제작하였다.
1) 항-HEL 항체를 고상화한 면역크로마토그래피용 다공질 담체의 제작
니트로셀룰로오스 시트(BAS－85, Schleicher & Schuell사 제품)를 5 mm×30 mm 크기의 조각으로 절단하였다. 그 조각의 단부에서부터 10 mm 떨어진 위치에 항-HEL 항체 용액 0.5 mg/㎖(일본 바이오 테스트(Nippon Biotest Labo)사 제품)를 직선형상으로 도포해서, 검출 부위를 제작하였다. 이 시트를 실온에서 2시간 정치시켜, 액체를 건조해서, 항체를 시트 상에 고착하였다. 1% 스킴 밀크(디프코사 제품)/PBST 용액 중에 상기 시트를 2시간 진탕하여, 블로킹을 실시하였다. 그 후, 상기 시트를 실온에서 정치해서 면역크로마토그래피용 담체를 준비하였다.
2) 금-표지된 항-HEL 항체 단편 및 보유 담체의 제작
(i) 금-표지된 항-HEL 항체 단편의 제작
실시예 20에서 제작한 금/HEL 이중 특이성 항체 단편을 이용해서 이하의 공정에 따라 제작하였다.
금 미립자 분산 용액(입자 지름 50 nm, 타나카 귀금속사 제품)에 실시예 20에서 제작한 금/HEL 이중 특이성 항체 단편을 가하고 충분히 혼합해서, 실온에서 3시간 반응을 실시하였다. 미반응의 금/HEL 이중 특이성 항체 단편을 제거하기 위해, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리를 실시해서, 상청액을 제거하여 침강물을 얻었다. 얻어진 침강물을 PBST 1.0 ㎖ 중에 현탁하하고, 또한, 상기 조건하에서 원심분리를 실시하였다. 얻어진 침강물을 1% BSA/PBST 1.0 ㎖ 중에 현탁하였다.
(ii) 금-표지화된 항-HEL 항체 단편-보유 담체의 제작
상기 금-표지된 항-HEL 항체 단편 용액 5 ㎕ 및 각종 염기의 10% 수용액 5 ㎕를 벰리제(Bemliese) 부직포(아사히 화성사 제품) 5 mm×5 mm에 함침시키고, 바람건조하여, 금-표지된 항-HEL 항체 단편 보유 담체를 제작했다.
3) 시험편형 면역크로마토그래피 장치의 제작
상기 1)에서 제작한 상기 면역크로마토그래피용 담체의 한쪽 구석으로부터 2.5 mm 떨어진 위치까지 상기 면역크로마토그래피용 담체에 상기 2) (ii)에서 제작한 금-표지 항-HEL 항체 단편 보유 담체를 중첩시켰다. 또한, 상기 항체 단편 보유 담체 상에 액체 시료 흡수용 담체(여과지 No. 526, 아드반택 토요사 제품)를 중첩시켰다. 또, 면역 크로마토그래피용 담체의 한쪽 구석으로부터 5 mm 떨어진 위 치까지 해당 면역 크로마토그래피용 담체에 과잉 시료 흡수부용 담체(여과지 No. 526)를 충접시켰다. 마지막으로, 뒤쪽에 테이프를 붙여, 전체를 안정화시킴으로써, 시험편형 면역 크로마토그래피 장치를 제작했다. 표준 HEL 용액을 이용한 시험 결과, 항HEL 항체-고정화 부분이 적색으로 표시되는 것이 확인되었다.
실시예 29(전기 측정 장치의 제작)
금 전극을 이용한 단백질 검출법의 일례를 나타낸다.
1) 유리 기판상에 2개의 금 전극을 놓았다. 전극 간의 거리는 20μm로 설정하였다. 상기 전극 사이의 공간에, 0.1% 폴리-L－리신(시그마-알드리치사) 수용액 20 ㎕를 적하하고, 전체를 3시간 정치시켰다.
다음에, 기판을 물로 세정하였다. 그 후에, 기판을 에탄올로 3회 세정하고 건조하였다.
2) 다음에, 항-HEL 폴리클로날 항체(ROCKLAND사)를 Proteomics, 3, pp254 (2003)에 근거해서 상기 (a)에서 얻어진 유리 기판상에 고정화시켰다.
3) 실시예 20에서 제작한 금/HEL 이중 특이성 항체 단편의 PBST 용액과 20 nm금 나노 입자(타나카 귀금속사 제품)를 서로 반응시켰다(비교용의 PBST 용액).
4) 상기 1)에서 얻어진 항-HEL 항체-고정화 기판에, 1μM HEL/PBS 용액을 부가하였다.
5) 다음에, 상기 3)에서 얻어진 산물에 상기 2)에서 얻어진 금-결합 단백질 용액을 부가하였다.
6) 상기 4)에서 얻어진 기판을 PBS 용액으로 3회 세정하였다. 그 후, 은증 폭용액(Silver Enhanceer Solution: 시그마-케미컬사 제품) 중에 5분간 침지하고 나서, 물로 세정했다. 전극 간의 전기 저항은 비교 샘플로서의 PBST 단독의 것과 비교한 바 저하한 것이 확인되었다.
실시예 30(효모 중 VHg － VHh 단백을 발현하는 벡터의 제작)
(1) NheI－VHh－SacII 단편의 제작
실시예 19에서 제작한 pHGold를 주형으로서 이용해서, 말단에 각각 NheI/SacII를 갖는 VHh 단편을 PCR에 의해서 제작하였다.
프라이머로서 이하의 것을 이용하였다.
NheI－VHh＿f(서열 번호 131)
NNNNNGCTAGCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT
VHh－SacII＿r(서열 번호 132)
NNNNNCCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT
상기 프라이머를 사용해서, pfu－turbo를 공급업자가 추천하는 방법에 따라 PCR을 실시하였다. 얻어진 PCR 반응액을 한천 겔(2%) 전기 영동에 걸어, 약 350 bp의 단편이 얻어진 것을 확인하였다.
(2) VHg―VHh DNA 단편 제작
상기 실시예 19에서 작성한 pGHEL의 VLh 부분에 상기 (1)에서 얻어진 VHh 단편을 도입하였다.
상기 (1)에서 얻어진 PCR 단편 및 pGHEL을 NheI/SacII(모두 다카라 바이오 주식회사 제품)에 의해서 절단하였다. 제한 효소 반응은 공급업자가 추천하는 방 법에 따라서 실시하였다. 얻어진 반응 용액에 대해 한천 전기 영동을 실시하고 나서, 겔 정제를 실시하였다(PCR 단편： 한천 2%, pGHEL： 한천 1%로 하였다). 상기 겔 정제에는 상술한 겔 정제 키트를 이용하였다.
상기 제한 효소 반응 후에 얻어진 PCR 단편이 약 350 bp의 PCR 단편 및 3000 bp의 플라스미드 단편을 지닌 것을 확인해서, 이하, 실시예 19와 마찬가지 방법으로 신규 플라스미드를 얻을 수 있다.
얻어진 플라스미드의 염기서열을 서열분석기에 의해 구하여, 그 염기 서열이 목적의 염기 서열인 것을 확인하였다(이 플라스미드를 pHgHh로 정의하였다).
(3) 효모 발현 플라스미드의 삽입
PCR은 공급업자가 추천하는 방법에 따라 수행하였다.
효모(Pichia pastris) 발현 플라스미드로서는, pPCIZαA(인비트로젠사 제품)를 사용한다. 상기 플라스미드의 멀티 클로닝 부위에 있는 EcoRI 및 SacII를 이용해서, 목적의 유전자를 도입하였다.
도입하는 유전자는 상기 (2)에서 얻어진 pHgHh를 주형으로서 이용해서 PCR에 의해 제작하였다.
프라이머로서 이하의 것을 이용하였다:
7s4－fw－EcoR1s(서열 번호 133)
AAGCTGAATTCCAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT
HELVH―SacII―r(서열 번호 134)
NNNNNCCGCGGAGACGGTGACGAGGGT.
얻어진 PCR 단편과 상기 pPCIZαA를 EcoRI 및 SacII에 의해서 차례차례 절단해서, 전술한 바와 마찬가지 방법으로 겔 정제에서 목적의 단편을 각각 얻었다.
라이게이션은 상술한 방법에 따라 수행하였다. 상기와 마찬가지로 해서 라이게이션 반응액을 형질 전환해서, 한천 판 상에 접종하였다. 이 경우의 한천 판은 트립토판 10 g/효모 엑기스 5 g/NaCl 5g/한천 15 g/L에 Zeocin을 농도 25μg/L가 되도록 첨가한 것이었다. 이 조건에 의해 선택된 콜로니를 액체 배지(트립토판 10 g/효모 엑기스 5 g/NaCl 5g, Zeocin 25μg/L) 중 37℃에서 하룻밤 배양하였다. 플라스미드의 회수 후, 서열분석기를 이용해서 서열을 확인해서, 본 실시예의 목적인 VHg－VHh：VH_금-링커(GGGGS)―VH_HEL을 발현하는 플라스미드를 얻었다(pPCIZ－αHH로서 제공되었다).
실시예 31( VHg － VHh 단백의 발현/정제)
VHg－VHh의 발현은 Easy Select Pichia Expression Kit Ver. G(인비트로젠사 제품)를 이용해서 실시하였다. 형질 전환체의 제작과, 단백질의 제작 및 정제(금속 킬레이트 컬럼)는 각각 당업자가 추천하는 방법에 의해서 실시하였다. 금속 킬레이트 컬럼에 의해 얻어진 1 M 이미다졸 용출분획 5 ㎖는, Tris 버퍼(20 mM Tris/200mM NaCl, 1 mM EGTA： pH 7.9)를 외부용액으로서 이용해서 4℃에서 투석하였다. 외부용액은 6 시간마다 총 3회 교환하였다.
계속해서, 세파덱스 75(Sephadex 75)(아머샴 바이오사이언스사 제품)를 이용해서, 겔 여과에 의한 정제(버퍼 조건： 50mM Tris－HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8.0, 유속：0.7 ㎖/분)를 4℃에서 실시하였다. 얻어진 분획을 농축한 후, SDS －PAGE(아크릴 아미드 17.5%) 및 HRP-융합된 항-His 항체를 이용해서, 상술과 같은 웨스턴 블롯팅(western Blotting)을 실시하였다. 이것에 의해서, 목적의 단백질의 분획을 특정해서, 단일 밴드로 정제되었다. 그 분획이 약 25 kDa의 단량체 단백질인 것을 시사하는 피크를 분취해서, 이하의 평가를 실시하였다(도 19).
실시예 32( SPR 측정에 의한 금-결합 친화성의 평가)
실시예 31에서 얻어진 단백질 분획의 금에 대한 결합 친화성을 SPR에 의해서 측정하였다. SPR 측정 장치로서 BIAcore 2000(BIAcore사 제품)을 사용하였다. 또, 분획이 결합하게 되는 금 기판으로서는 상기와 동일한 회사의 금 증착 유리 기판 SIA－kit Au를 사용하였다. 이하의 조건하에서 측정을 실시하였다. 샘플로서 실시예 20에서 얻어진 단백질 분획 500 nM(상기와 마찬가지로 해서, 흡광도로부터 산출됨)을 사용하였다. 이 실시예의 조건은 실시예 21과 마찬가지로 하였다. 금에 대한 결합 친화성을 나타내는 결합 곡선을 얻었다(도 20).
실시예 33( VHg － VHh 단백 변이체의 제작-1)
실시예 30에서 얻어진 금-결합성 VH의 V37L, G44E 및 L45R로서 기능하는 VHg 변이체(서열 번호：135 또는 136)를 얻도록 실시예 30에서 얻어진 플라스미드 pPCIZ-α7s4를 주형으로 해서 QC키트(STRATAGENE사 제품)를 사용하였다. 이하의 프라이머를 사용해서 3번의 작업을 통해 목적의 플라스미드를 얻었다. 각 작업마다 한 부위에 변이를 차례차례 도입하였다.
첫번째 부위에 변이 도입을 위한 PCR 프라이머
V37F―f(서열 번호：137)
TTACTGGATCAACTGGTTCCGCCAGATGCCCGG
V37F－r(서열 번호：138)
CCGGGCATCTGGCGGAACCAGTTGATCCAGTAA
두번째 부위에 변이 도입을 위한 PCR 프라이머
G44E－f(서열 번호：139)
CAGATGCCCGGCAAAGAACTGGAATGGATGGGG
G44E－r(서열 번호：140)
CCCCATCCATTCCAGTTCTTTGCCGGGCATCTG
세번째 부위에 변이 도입을 위한 PCR 프라이머
L45F－f(서열 번호：141)
GCCCGGCAAAGAAAGGGAATGGATGGGGATG
L45F－r(서열 번호：142)
CATCCCCATCCATTCCCTTTCTTTGCCGGGC
변이 도입은 서열에 의해서 확인하였다. 형질 전환에서부터 단백질 발현까지의 절차는 실시예 31과 같았다. 약 25 kDa의 단량체 단백질의 피크를 이용해서 이하의 평가를 실시하였다.
실시예 34( SPR 측정에 의한 금에 대한 결합 친화성 평가)
실시예 33에서 얻어진 단백질 분획의 금에 대한 결합 친화성을 SPR에 의해서 측정하였다. SPR 측정 장치로서 BIAcore 2000(BIAcore사 제품)을 사용하였다. 그 분획이 결합되는 금 기판으로서는 상기와 동일한 회사의 금 증착 유리 기판 SIA －kit Au를 사용했다. 이하의 조건하에서 측정을 실시하였다. 샘플로서 실시예 33에서 얻어진 단백질 분획 500 nM(상기와 마찬가지로 해서, 흡광도로부터 산출됨)을 사용하였다. 이 실시예의 조건은 실시예 21의 것과 마찬가지였다. 금에 대한 결합 친화성을 나타내는 결합 곡선을 얻었다(도 21).
실시예 35( VHg － HEL scF ｖ단백 변이체의 제작)
실시예 31의 HEL-결합성 VH 대신에 HEL-결합성 scFｖ(서열 번호：143 또는 144)가 융합된 단백질이 얻어지도록 치환을 수행하였다. HEL-결합성 scFｖ는 Journal of Biological chemistry, 2003, 279, pp8979에 개시된 HEL 결합 scFｖ 부호화 유전자가 도입된 플라스미드를 주형으로 해서 PCR에 의해 HEL-결합성 scFｖ를 부호화하는 DNA 단편을 얻었다. PCR은 당업자가 추천하는 전술한 방법에 의해 수행하고, 이하의 프라이머를 사용하였다.
scFｖ－f(서열 번호： 145)
NNNNCCATGCCCGATATCGTCCTGACCCAG
scFｖ－r(서열 번호： 146)
AGCTACCGCGGAGACGGTGACGAGGGT
제한 효소 반응 이후의 절차는 실시예 30에서와 같았고, 이에 따라 목적의 플라스미드를 얻었다.
얻어진 플라스미드를 서열에 의해 목적으로 한 유전자 서열을 지닌 것을 확인하였다. 또, 형질 전환에서부터 단백질 발현까지의 절차는 실시예 31과 같았다. 이와 같이 해서, 약 39 kDa의 단량체 단백질을 얻었다.
실시예 36( SPR 측정에 의한 금 및 HEL 에 대한 이중-결합 친화성 평가)
실시예 35에서 얻어진 단백질 분획의 금에 대한 결합 친화성을 SPR에 의해서 측정하였다. SPR 측정 장치로서 BIAcore 2000(BIAcore사 제품)을 사용하였다. 또, 상기 분획이 결합하게 되는 금 기판으로서는 상기와 동일한 회사의 금 증착 유리 기판 SIA－kit Au를 사용했다. 이하의 조건하에서 측정을 실시하였다. 샘플로서 실시예 31에서 얻어진 단백질분획 500 nM(상기와 마찬가지로 해서, 흡광도로부터 산출됨)을 사용하였다. 이 실시예의 조건은 실시예 21 및 22와 마찬가지로 하였다. 금에 대한 결합 친화성을 나타내는 결합 곡선을 얻었다(도 22).
실시예 37( VHg 변이체 - VLh 발현 플라스미드 제작)
실시예 19에서 얻어진 발현용 플라스미드(pGHEL)의 금-결합성 VH 부호 서열에 서열 번호： 147 및 148로 표현되는 DNA 서열을 삽입하였다. 삽입 방법은 상기 pGHEL를 주형으로 하는 상술의 Quick Change kit(Stratagene사 제품)를 이용하는 것을 포함한다. 얻어진 플라스미드가 목적 서열인 것을 확인하였다. 다음에, 얻어진 플라스미드를 이용해서 실시예 20과 마찬가지로 해서 단백질의 발현과 정제, 및 VHh－VLg와의 이량화를 실시하였다.
세파덱스 G75를 이용해서, 분자량 약 50 kDa의 단백질 분획을 분획하였다(도 23).
A14P－f(서열 번호：147)
GAGCAGAGGTGAAAAAGCCAGGGGAGTCTCTGAAG
A14P－r(서열 번호：148)
CTTCAGAGACTCCCCTGGCTTTTTCACCTCTGCTC
실시예 38( SPR 에 의한 금 및 HEL 의 이중-결합 친화성의 평가)
실시예 37에서 얻어진 단백질 분획의 금에 대한 결합 친화성을 SPR에 의해서 측정하였다. SPR 측정 장치로서 BIAcore 2000(BIAcore사 제품)을 사용하였다. 또, 상기 분획이 결합하게 되는 금 기판으로서는 상기와 동일 회사의 금 증착 유리 기판 SIA－kit Au를 사용했다. 이하의 조건 하에서 측정을 실시하였다. 샘플로서 실시예 37에서 얻어진 단백질 분획 500 nM(상기와 마찬가지로 해서, 흡광도로부터 산출됨)를 사용하였다. 이 실시예의 조건은 실시예 21과 마찬가지였다. 금에 대한 결합 친화성을 나타내는 결합 곡선을 얻었다(도 24).
실시예 39( VHg － VHg 사량체를 발현하는 플라스미드의 제작)
실시예 30의 VHh 대신에 VHg를 부호화하는 DNA 단편을 이용한 이외에는 실시예 30에서와 같은 방법에 의해 pPCIZ－αVHg2를 제작하였다.
상기 작업에 사용하는 VHg를 부호화하는 DNA 단편을 제작하기 위한 주형으로서는 실시예 10에서 얻어진 pRA2－7s4를 이용하였고, 프라이머로서는 이하의 프라이머:
VHg－f(서열 번호： 149)
NNNNNGCTAGC GGCGGGGGCGGTAGC CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT
VHg－r(서열 번호： 150)
NNNNNCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT
를 이용하였다.
목적의 플라스미드가 얻어진 것을 서열에 의해서 확인하였다.
실시예 40( VHg － VLg 단백의 제작)
실시예 31과 같은 수법에 의해 목적 단백질을 정제하였다. 분자량 약 25 kDa을 지닌 VHg－VHg의 이량체로 이루어진 단백질을 정제하였다(도 25).
실시예 41( VHg － VLg 사량체를 발현하는 플라스미드의 제작)
실시예 39의 VHg－VHg를 연결하는 링커 GGGGS를 GS로 변경한 이외에는 실시예 30과 마찬가지 방법에 의해 pPCIZ－αVHg4를 제작하였다.
상기 작업에서 사용하는 VHg를 부호화하는 DNA 단편을 제작하기 위한 주형으로서는 실시예 10에서 얻어진 pRA2－7s4를 이용하였고, 프라이머로서는 이하의 프라이머:
VHg4－f(서열 번호：151)
NNNNNGCTAGC GGCAGC CAGGTGCAGTTGGTGGAGTCT
VHg4－r(서열 번호：152)
NNNNNCCGCGGATGAGGAGACGGTGACCAGGGTT
를 이용하였다.
목적의 플라스미드가 얻어진 것을 서열에 의해 확인하였다.
실시예 42(금 미립자 응집 반응)
실시예 40 및 44에서 얻어진 단백질의 각각의 500μM/PBST 용액에, 금 미립 자(20 nmφ： 타나카 귀금속사 제품)를 실온에서 인큐베이트하였다. 어느 단백질을 이용했는가와 관계없이, 금 미립자의 응집이 관찰되었다. 또, 금 미립자/단백질의 혼합물의 스펙트럼(λmax)이 시간 경과에 따라 변화하는 것이 관찰되었고, 반값 밴드 폭도 확대된 것이 관찰되었다. 금 미립자간의 거리가 단축된 것을 시사하는 결과가 얻어졌다(도 26).
비교예 3
500 nM HEL 대신에 500 nM BSA를 이용한 이외에는 실시예 36과 마찬가지 조작을 행하였다. BSA에 대한 결합은 확인할 수 없었다. 실시예 35에서 얻어진 금에 대한 단백질은 특이적인 방법으로 HEL에 결합하는 것을 나타내었다(도 27).
비교예 4
항-HEL 항체(Rockland사 제품)를 이용해서 금 기판상에 직접 고정화된 단백질의 결합능은 SPR 측정을 이용해서 평가하였다.
(1) PBS 중의 10μM HEL을 제작하였다.
(2) 상기 (1)에서 얻어진 용액 100 ㎕를 1 ㎕/분으로 주입하였다. 흡착한 항체의 시그널은 1907 R.U.였다.
(3) PBS 중의 1% 카제인을 상기 (2)와 마찬가지 방법으로 주입하였다.
(4) 또한, PBS 중의 1% 카제인 40 ㎕를 20 ㎕/분으로 주입해서, 금 기판이 블록킹되어 있는 것을 확인하였다.
(5) 그 다음에, 1μM HEL 40 ㎕를 20 ㎕/분에서 주입해서, 도 28의 결과를 얻었다.
그 결과, 금 기판에 고정된 항체의 시그널은 1907 R.U.인 한편, 결합한 HEL 분자의 시그널은 11 R.U.였다. 고정시의 공간 배치를 고려해서, 하나의 항체 분자가 하나의 항원을 기판상에 포착한 것으로 가정하면, 표적 물질을 포착한 항체의 비율은 약 6%로 산출되었다.
한편, 상기 개시된 실시예에 의하면 본 발명의 단백질의 약 20 내지 40 %가 항원을 포착한 것으로 나타났다. 더욱이, 센서의 포착 분자가 되는 단백질을 고정하기 위해, 본 발명의 상기 실시예에서는 어떤 특수한 시약이나 공정을 필요로 하지 않아, 종래의 물리 흡착법에 비해서 본 발명의 고정화 방법이 우수한 것임을 시사하였다.
이상 본 발명에 의하면, 금에 대해서 1개 이상의 결합 부위를 지니는 금-결합성 단백질; 상기 금-결합성 단백질이 고정화된 금 기재를 포함하는 구조체; 및 이들을 이용한 검출 장치가 제공된다.
본 발명을 적용함으로써 얻어진 금-결합성 단백질이 고정화되어 있는 구조체로 이루어진 검출장치에 있어서는, 기판(즉, 기재)으로서 역할하는 금을 특이적으로 인식하는 결합 부위에 단백질이 고정되어 있다. 따라서, 특이 물질(표적 물질)을 인식하는 단백질의 결합 부위는 기판상에 고정되지 않고, 기판으로부터의 거리를 확보하면서 단백질이 배향된다. 그 결과, 표적물질 결합 부위는 그의 결합능에 대한 기판에의 영향을 최소로 함으로써, 단백질은 기판상에 효율적으로 또한, 높은 배향으로 고정된다.
즉, 본 발명은 기재 표면상에 생체 물질 등의 유기 물질을 고정하는 각종 생체 물질의 기능을 적용하는 산물의 성능을 개선하여, 유기 물질의 각종 생리적 기능을 활용하는 데 이용될 수 있고, 여기서, 산물은 바이오센서 및 바이오리액터로 대표된다.
한편, 본 발명은, 표적 물질에 결합하는 1개 이상의 부위와 표지제에 결합하는 1개 이상의 부위를 포함하고; 이들 각각의 결합 부위가 서로 독립적으로 피결합 물질과 결합하는 것을 특징으로 하는 접속부재를 제공한다. 본 발명의 이 적용에 의하면, 종래의 화학적 가교 방법을 사용하는 일없이 표적 단백질을 표지화하는 것이 가능해진다. 그 결과, 표적 물질에 대한 각종 단백질의 표지화시에 관련되는 결합 친화성의 영향을 최소화할 수 있어, 생산 효율을 증대시킬 수 있다. 즉, 본 발명은 기재 표면상에 접속부재를 고정화하여, 접속부재의 각종 생리적 기능을 활용하는 바이오 센서 등의 각종 생체 물질의 기능을 적용하는 산물의 성능을 향상시키는 데 이용될 수 있다.
본 출원은 2004년 3월 31일자로 출원된 일본국 특허출원 제 2004-108388호로부터의 우선권을 주장하며, 상기 일본국 출원 명세서의 내용은 참고로 본 명세서에 병합되어 있다.
<110> CANON KABUSHIKI KAISHA <120> GOLD-BONDING PROTEIN AND USE THEREOF <150> JP2004-108388 <151> 2004-03-31 <160> 152 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> human <400> 1 Asp Tyr Tyr Met Asp 1 5 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> human <400> 2 Ser Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Thr Arg Tyr Gly Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> human <400> 3 Glu Leu Asp Gly Gly Phe Phe Asp Phe 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> human <400> 4 Gly His Trp Met His 1 5 <210> 5 <211> 17 <212> PRT <213> human <400> 5 Arg Ile Asp Glu His Gly Ser Ser Ala Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Asn 1 5 10 15 Gly <210> 6 <211> 15 <212> PRT <213> human <400> 6 Leu Gly Phe Ile Thr Pro Glu Val Val His Trp Ser Ser Asp Ile 1 5 10 15 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> human <400> 7 Arg Phe Tyr Trp Asn 1 5 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> human <400> 8 Arg Ile Phe Thr Asn Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Gly Ser 1 5 10 15 <210> 9 <211> 13 <212> PRT <213> human <400> 9 Gly Gly Asp Tyr Gly Pro Ala 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gttactgtgc gagagggtcc 300 cgatataaca gtggctggta ttactttgac tactggagcc ggggaaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 113 <211> 360 <212> DNA <213> human <400> 113 caggtgcagc tacaggagtg gggcccagga ctggtgaagc cttcggggac cctgtccctc 60 acctgcgctg tctctggtgg caccatcagc agtcctacct ggtggaattg ggtccgccag 120 cccccaggga aggggctgga gtggattggc gaaatctatc atagtggaac ctcccaccac 180 aacccgtccc tcaagaatcg agtcacctta tcagtagaca agtccaagaa ccagttctcc 240 ctgaagctga actctatgac cgccgcggac acggccgtgt atttctgtac gagactggat 300 ttcgattccc cactcggtat ggacgcctgg ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca 360 360 <210> 114 <211> 327 <212> DNA <213> human <400> 114 gacatcgtga tgacccggtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc acctatttaa attggtatca gcagaaagca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccctca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta cccctcgaac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgtgcg 327 <210> 115 <211> 330 <212> DNA <213> human <400> 115 gaaattgtgt tgacgcagtc tccatcttct gtgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtga ggatgttaac agctggttag cctggtatca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt tcaaccaatt tgcaaggtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gacgtggatc tgggacacac tttactttca ccatcaacgg cctgcagcct 240 gaagatattg caacatatta ctgtaaatat tttgatgctc tccctccggt caccttcggc 300 caagggacac gactggagat taaacgtgcg 330 <210> 116 <211> 345 <212> DNA <213> human <400> 116 gacatcgtgc tgacccagtc tccagactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagggccacc 60 atcaactgca cgtccagcca gagtctttta tacacctcca acaataagaa ctacttaact 120 tggtaccaac agaaaccagg gcagcctcct aaactcctca tttactgggc atctacccgg 180 gaattcggcg tccctgaccg attcagtggc agcgggtctg ggacagattt cactctcacc 240 atcaacagcc tgcaggctga agatgtggcg acttattact gtcagcaata ttctgatcct 300 cctcccactt tcggcggagg gaccaagctg gagatcaaac gtgcg 345 <210> 117 <211> 79 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 117 nnnnnccatg gccgggggcg ggggcagcgg gggcgggggc agcgggggcg ggggcagcca 60 ggtgcagttg gtggagtct 79 <210> 118 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 118 nnnnnccgcg gaaccattca gatcctcttc t 31 <210> 119 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 119 nnnnnccatg gcccaggtgc agttggtgga gt 32 <210> 120 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 120 nnnnnccgcg gcacgtgggg gtgcttgtgg tgcacgtgca tggggataac cattcagatc 60 ctcttct 67 <210> 121 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gVH-B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 121 nnnnnccatg gccgaccagg tgcagttggt ggagtct 37 <210> 122 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gVH-Phe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 122 nnnnncggcc gtgacggtga ccagggtgcc 30 <210> 123 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gVL-B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 123 nnnnngctag cggtggcggt ggctctgaaa ttgtgttgac gcagtct 47 <210> 124 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gVL-Phe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 124 nnnnnccgcg gcacgtttaa tctccagtcg tgt 33 <210> 125 <211> 112 <212> PRT <213> chicken <400> 125 Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Thr Thr Ser Asp 20 25 30 Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Tyr Met 35 40 45 Gly Tyr Val Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu 65 70 75 80 Asp Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Asn Trp Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 <210> 126 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVH-B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 126 nnnnnccatg gccgacgata tccagctgca ggagtcgggc cc 42 <210> 127 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVH-Phe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 127 nnnnngctag cggagacggt gacgtctgt 29 <210> 128 <211> 108 <212> PRT <213> chicken <400> 128 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asn Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Thr 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Thr Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Ala 100 105 <210> 129 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVL-B <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 129 nnnnngctag cggtggcggt ggctctgata tcgtcctgac ccagag 46 <210> 130 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hVL-Phe <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 130 nnnnnccgcg gccttgatct ccagcttggt gc 32 <210> 131 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NheI-VHh_f <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 131 nnnnngctag ccaggtgcag ttggtggagt ct 32 <210> 132 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHh-SacII_r <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 132 nnnnncccgc ggatgaggag acggtgacca gggtt 35 <210> 133 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 7s4-fw-EcoR1s <400> 133 aagctgaatt ccaggtgcag ttggtggagt ct 32 <210> 134 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HELVH-SacII-r <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 134 nnnnnccgcg gagacggtga cgagggt 27 <210> 135 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FER-7s4 coding DNA <400> 135 caggtgcagt tggtggagtc tggagcagag gtgaaaaagg ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gatctggata cagctttccc agttactgga tcaactggtt ccgccagatg 120 cccggcaaag aaagggaatg gatggggatg atctatcctg ctgactctga taccagatat 180 agcccgtcct tccaaggcca cgtcaccatc tcagccgaca agtccatcaa caccgcctac 240 ctgcaatggg ccggcctgaa ggcctcggac accgccatat attactgtgc gagacttgga 300 attggtggga ggtacatgtc tagatggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctca 357 <210> 136 <211> 119 <212> PRT <213> recombinant protein <400> 136 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Ala Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile Asn Trp Phe Arg Gln Met Pro Gly Lys Glu Arg Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile Tyr Pro Ala Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ala Gly Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly Ile Gly Gly Arg Tyr Met Ser Arg Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 137 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V37F-f <400> 137 ttactggatc aactggttcc gccagatgcc cgg 33 <210> 138 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V37F-r <400> 138 ccgggcatct ggcggaacca gttgatccag taa 33 <210> 139 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G44E-f <400> 139 cagatgcccg gcaaagaact ggaatggatg ggg 33 <210> 140 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> G44E-r <400> 140 ccccatccat tccagttctt tgccgggcat ctg 33 <210> 141 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 45F-f <400> 141 gcccggcaaa gaaagggaat ggatggggat g 31 <210> 142 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 45F-r <400> 142 catccccatc cattcccttt ctttgccggg c 31 <210> 143 <211> 708 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HEL binding single chain-Fv coding DNA <400> 143 gatatcgtcc tgacccagag cccggcgacc ctctcggtca cccccggcaa ctcggtgtcc 60 ctctcgtgcc gcgcctcgca gtcgatcggc aacaacctcc actggtatca gcagaagtcg 120 cacgagagcc cgcgcctcct gatcaagtac gccagccagt cgatctcggg gatcccgtcg 180 cgcttcagcg gctcgggctc gggcaccgac ttcaccctgt cgatcaacag cgtcgagacg 240 gaggacttcg gcatgtactt ctgccagcag tcgaacagct ggccgtacac cttcggcggc 300 ggtaccaagc tgatcatcac ggccggcggg ggcggtagcg gcggtggcgg gtcgggcggt 360 ggcggatcgg atatccagct gcaggagtcg ggcccgagcc tcgtcaagcc gtcgcagacc 420 ctgtcgctca cctgcagcgt caccggcgac tcgatcacct cggactactg gtcgtggatc 480 cgcaagttcc ccggcaaccg cctcgagtac atgggctacg tcagctactc gggcagcacc 540 tactacaacc cctcgctgaa gagccgcatc tcgatcaccc gcgacacctc caagaaccag 600 tactacctgg acctcaactc ggtcaccacc gaggacaccg ccacctacta ctgcgcgaac 660 tgggacggcg actactgggg ccagggcacc ctcgtcaccg tctccgcg 708 <210> 144 <211> 236 <212> PRT <213> recombinant protein <400> 144 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Asn Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr 65 70 75 80 Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Ile Ile Thr Ala Gly Gly Gly Gly 100 105 110 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Gln 115 120 125 Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr 130 135 140 Cys Ser Val Thr Gly Asp Ser Ile Thr Ser Asp Tyr Trp Ser Trp Ile 145 150 155 160 Arg Lys Phe Pro Gly Asn Arg Leu Glu Tyr Met Gly Tyr Val Ser Tyr 165 170 175 Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Ile Ser Ile 180 185 190 Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Tyr Tyr Leu Asp Leu Asn Ser Val 195 200 205 Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Asn Trp Asp Gly Asp 210 215 220 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 225 230 235 <210> 145 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-f <220> <221> misc_feature <222> (1)..(4) <223> n is a, c, g, or t <400> 145 nnnnccatgc ccgatatcgt cctgacccag 30 <210> 146 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv-f <400> 146 agctaccgcg gagacggtga cgagggt 27 <210> 147 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A14P-f <400> 147 gagcagaggt gaaaaagcca ggggagtctc tgaag 35 <210> 148 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A14P-r <400> 148 cttcagagac tcccctggct ttttcacctc tgctc 35 <210> 149 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHg-f <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 149 nnnnngctag cggcgggggc ggtagccagg tgcagttggt ggagtct 47 <210> 150 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHg-r <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 150 nnnnnccgcg gatgaggaga cggtgaccag ggtt 34 <210> 151 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHg4-f <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 151 nnnnngctag cggcagccag gtgcagttgg tggagtct 38 <210> 152 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VHg4-r <220> <221> misc_feature <222> (1)..(5) <223> n is a, c, g, or t <400> 152 nnnnnccgcg gatgaggaga cggtgaccag ggtt 34

Claims (35)

  1. 금에 대해서 친화성을 지니며, 항체의 적어도 일부를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항체의 적어도 일부를 함유하는 금-결합 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 금-결합 부위는 F(ab')2, Fab', Fab 및 그 일부로부터 선택된 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 금-결합 부위는 항체 가변 영역(Fｖ) 및 그 일부로부터 선택된 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 금-결합 부위는
    (1) 항체 중쇄 가변 영역(VH), 그 변이체 및 그 일부; 및
    (2) 항체 경쇄 가변 영역(VL), 그 변이체 및 그 일부
    로부터 선택된 적어도 1종을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 항체 중쇄 가변 영역(VH)은 서열 번호：1 내지 48의 아미노산 서열의 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 항체 중쇄 가변 영역(VH)의 변이체는 서열 번호：1 내지 48의 아미노산 서열의 하나 또는 수개의 아미노산의 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 하나 이상 포함하고, 금에 대한 친화성을 지니는 것을 특징으로 하는 단백질.
  8. 제 5항에 있어서, 상기 항체 경쇄 가변 영역(VL)은 서열 번호： 49 내지 57의 아미노산 서열의 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
  9. 제 5항에 있어서, 상기 항체 경쇄 가변 영역(VL)의 변이체는 서열 번호： 49 내지 57의 아미노산 서열의 한 개 혹은 수개의 아미노산의 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열을 하나 이상 포함하고, 금에 대한 친화성을 지니는 것을 특징으로 하는 단백질.
  10. 제 1항에 있어서, 해리 상수가 10-6M 이하인 것을 특징으로 하는 단백질.
  11. (1) 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 의한 금에 대해서 친화성을 지니는 단백질을 함유하는 제 1 도메인; 및
    (2) 특정의 물질에 대한 결합 부위를 지닌 단백질을 함유하는 제 2 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 금-결합성 복합 단백질.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 제 1 도메인과 복합체를 형성하는 제 3 도메인 및 상기 제 2 도메인과 복합체를 형성하는 제 ４ 도메인의 적어도 하나를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 금-결합성 복합 단백질.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 제 3 도메인은 금에 대한 친화성을 지니는 것을 특징으로 하는 금-결합성 복합 단백질.
  14. 제 12항에 있어서,
    (1) 제 1 도메인과 제 2 도메인이 1개의 폴리펩타이드쇄를 형성하고 있는 구조체;
    (2) 제 1 도메인과 제 2 도메인이 1개 이상의 아미노산을 개입시켜 결합되어 있는 구조체;
    (3) 제 3 도메인과 제 4 도메인이 1개의 폴리펩타이드쇄를 형성하고 있는 구조체;
    (4) 제 1 도메인과 제 2 도메인이 1개 이상의 아미노산을 개입시켜 결합되어 있는 구조체;
    (5) 적어도 제 1 도메인, 제 2 도메인 및 제 3 도메인이 하나의 폴리펩타이 드쇄를 형성하고 있는 구조체;
    (6) 적어도 제 1 도메인, 제 2 도메인 및 제 4 도메인이 하나의 폴리펩타이드쇄를 형성하고 있는 구조체; 및
    (7) 제 1 내지 제 4 도메인의 모두가 하나의 폴리펩타이드쇄를 형성하고 있는 구조체
    중의 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 금-결합성 복합 단백질.
  15. 기재(substrate)와 단백질을 포함하고, 상기 기재가 표면의 적어도 일부에 금을 포함하고, 상기 단백질이 제 11항에 의한 금-결합성 복합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
  16. 기재와 단백질을 포함하고, 상기 기재가 표면의 적어도 일부에 금을 포함하고, 상기 단백질이 제 12항에 의한 금-결합성 복합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 구조체.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 제 2 도메인이 표적 물질에 대한 친화성을 지니는 것을 특징으로 하는 구조체.
  18. 제 16항에 있어서, 제 2 도메인 및 제 4 도메인 중 적어도 한쪽이 표적 물질에 대한 친화성을 지니는 것을 특징으로 하는 구조체.
  19. 제 11 항에 의한 금-결합성 복합 단백질을 부호화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  20. 제 12 항에 의한 금-결합성 복합 단백질을 부호화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  21. 제 13 항에 의한 금-결합성 복합 단백질을 부호화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  22. 제 14 항에 의한 금-결합성 복합 단백질을 부호화하는 것을 특징으로 하는 핵산.
  23. 제 19항에 의한 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  24. 제 20항에 의한 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  25. 제 21항에 의한 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  26. 제 22항에 의한 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  27. (1) 기재를 준비하는 공정;
    (2) 금-결합성 복합 단백질을 생성하는 공정; 및
    (3) 상기 기재에 상기 금-결합성 복합 단백질을 배치하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 제 15항에 의한 구조체의 제조 방법.
  28. (1) 기재를 준비하는 공정;
    (2) 금-결합성 복합 단백질을 생성하는 공정; 및
    (3) 상기 기재에 상기 금-결합성 복합 단백질을 배치하는 공정
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 제 16항에 의한 구조체의 제조 방법.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 금-결합성 단백질의 생성은 금-결합성 복합 단백질을 부호화하는 핵산을 함유하는 벡터를 숙주 세포에 도입함으로써 상기 금-결합성 복합 단백질을 함유하는 폴리펩타이드쇄를 발현시키는 것에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 구조체의 제조 방법.
  30. 제 15항에 의한 구조체를 형성하기 위한 기재 및 금-결합성 복합 단백질과, 상기 구조체에의 표적 물질의 결합을 검출하기 위한 검출 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출용 키트.
  31. 제 16항에 의한 구조체를 형성하기 위한 기재 및 금-결합성 복합 단백질과, 상기 구조체에의 표적 물질의 결합을 검출하기 위한 검출 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출용 키트.
  32. 표지제에 의해 표적 물질을 표지하기 위한 접속 부재로서,
    표적 물질에 결합하는 1개 이상의 부위와 표지제에 결합하는 1개 이상의 부위를 포함하고;
    표적 물질에 결합하는 부위와 표지제에 결합하는 부위는 각각 독립적으로 피결합 물질과 결합하고;
    상기 표지제에 결합하는 부위 및 상기 표적 물질에 결합하는 부위의 적어도 하나가 제 1항 내지 제 11항 중의 어느 한 항에 의한 단백질을 함유하는, 것을 특징으로 하는 접속 부재.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 표지제 또는 상기 표적 물질은 금을 각각 함유하는 금속, 금속 산화물 및 반도체 화합물 중의 적어도 하나 이상을 지니는 것을 특징으로 하는 접속 부재.
  34. 표적 물질을 표지 물질에 결합해서 표지화하여, 해당 표지제가 결합한 표적 물질을 검출하는 것에 의한 표적 물질의 검출 방법으로서, 표지제를 제 32항에 의한 접속 부재를 개재해서 표적물질에 결합시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출 방법.
  35. 금을 함유하는 표지제; 제 31항에 의한 접속 부재; 및 표적 물질에 접속 부재를 개입시켜 표지제를 결합한 상태를 검출하기 위한 검출 수단을 포함하는 것을 특징으로 하는 표적 물질의 검출용 키트.
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